JPS6011890B2 - ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ッモア ネクロシス フアクターの製造方法
に関する。

ツモア ネクロシス フアクター（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ」以下、ＴＮＦと略称する）は、
Ｅ．Ａ，ＣａｎＷｅｌｌ ｅｔ ａｌ，、Ｐｒ，Ｎａｔ
．ＡＣａｄ，ＳＣｊ，ＵＳＡ、Ｖｏｌ．７２、ＮＯ．９
３６６６−３６７０頁（１９７３王）及び、Ｅ．Ｐｉ
ｃｋ 編 Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｌｓ Ｆａｃ
ｂｒ ｍ“Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ”ＶｏＵ１、ｐｐ
２３５−２７２、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、（１９
８１年）などにも記載されているように、例えば、ウサ
ギに母ｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ‐Ｃｕｅｒｉｎ（
ＢＣＧ）、Ｃｏｒ肌ｅ船ｃｔｅｎ肌ｍＰａｒｖｕｍ、エ
ンドトキシンなどを非経口的に投与することによって、
その血清中に誘導生成する糠蛋白物質であつて、Ｍｅｔ
ｈＡ肉自重出血性壊死能を持つ物質に与えられた名称で
あり、特に腫場細胞に対して細胞障害機能を持っている
ことは公知である。

ＴＮＦの持つこのような機能から、ＴＮＦはその発見の
当初より悪性腫場治療剤として期待されて来た。

ＴＮＦは、ウサギ、ラツトなどのヒト以外の動物血清か
ら調製され、種特異性はないとされているけれども、ヒ
トの治療に供するには、ヒトの生細胞由来であることが
、治療上に生ずる抗原性などの副作用面において極めて
安全であり、優れている。

本発明者らは、工業的規模で容易に実施し得るヒトのＴ
ＮＦの製造方法を検討し、そのＴＮＦが悪性種湯の治療
剤として有用であるか否かを鋭意研究して来た。

その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生体外（ｉ
ｎｖｉｔｒｏ）の栄養塔地に接種し増殖させるのではな
く、ヒト以外の溢血動物体内に移植し、または、拡散チ
ャンバー内に接種してその動物体から栄養物を含有する
体液の供給を受けつつ増殖させ、得られる細胞に生体内
または生体外でＴＮＦ誘導剤を作用させることによって
、ＴＮＦが高活性で誘導生成され、これを精製採取する
ことによってＴＮＦが多量容易に製造し得ることを見い
だし、そのＴＮＦが悪性腫場の治療剤として優れている
ことを確認して本発明を完成した。

本発明において使用されるＴＮＦの製造方は、生細胞を
生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で増殖させる合とは違って、
高価な血清などを含む栄養塔地が不要または大幅に節約
できるばかりでなく、細増殖中の維持管理も極めて容易
であり、その上−導生成されるＴＮＦ活性が高い特徴を
有している。

即ち、培養株化されたヒト由釆の細胞をヒト以外の溢血
動物体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給を
受けることのできる拡散チャンバー内に収容し、このチ
ャンバーを動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、溢血
動物体から供給される栄養物を含有する体液を利用して
その細胞が容易に増殖しうるのである。更に生体外（ｉ
ｎｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合と比較して、この細胞
の増殖が安定していること、その増殖速度が大きいこと
、得られる細胞量が多いこと、更には細胞当りのＴＮＦ
の収量が著増することも大きな特徴である。本発明で使
用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒト以外の温
皿動物体内に移植して容易に増殖し得てしかもＴＮＦ産
生能を有するものであればよい。例えばＵｏｕｒｎａｌ
ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＶｏｉ
．１」１１６〜１１刀頁（１９７５年）に記載されてい
るＮａｍａｌｖａ細胞、１、Ｍｉｙｏｓｈｉ著「Ｎａｔ
ｍｅＶｏｌ．２６７」８４３〜８４４頁（１９７７年）
に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞
、ＮＡＬＬ−１細胞、「Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ ｌｍｍｕ
ｎｏｌｏ鋤Ｖｏｌ．１１３」１３３４〜１３４５頁（１
９７４年）記載のＭ−７００２細胞、Ｂ−７１０１細胞
などの株化細胞や、また、正常な単核細胞、顎粒性白血
球細胞などを各種ウイルス、薬剤、放射線などで処理し
培養株化させた細胞などが自由に使用される。また、こ
れら細胞のＴＮＦ産生能を持つ遺伝子を、例えばポリエ
チレングリコールやセンダイウイルスなどを利用する細
胞融合の手段や、ＤＮＡリガーゼ、制限酵素（ヌクレア
−ゼ）、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を利用する遺伝
子組み換えの手段などによって、より容易に継代培養し
うる培養株化されたりンパ芽球様細胞などに導入し、そ
の増殖速度を。めたり、細胞当りのＴＮＦ産生能を高め
たりし使用してもよく、本明細書に記載する株化紬砲み
に限定されるものではない。これらの細胞は、後に述べ
るＴＮＦを誘導生成させるまでの週で、単独で又は２種
以上を混合して自由に使用される。必要ならば、これに
、例えばヒトの新鮮血から調製される白血球を使用する
こともできる。本発明で使用する溢血動物は、ヒト由来
の細胞が増殖し得るものであればよく、例えばニワトリ
、ハトなどの鳥類、ィヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、
ブタ、ウマ、ウシ、モルモット、ラツト、ハムスター、
普通マウス、ヌードマウスなどの０甫乳類が使用できる
。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状態
、即ち卵、月率、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好ましい。

また、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして「免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応か弱いので、これらの前処理を必要
とすることなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植
でき、急速に増殖できるので特に好都合である。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌ−ドマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の溢血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれらから誘導生成されるＴＮＦ量を増加させること
も自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同網間、同門
間移植であってもよい。

ヒト由来の細胞を移植する動物体内の部位は、移植した
細胞が増殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。また、直接動物体
内にヒト由来の細胞を移植することなく、動物細胞の通
過を阻止し得る多孔性の波過膜、例えば孔経約１０‐７
〜１０‐３肌を有するメンプランフイルター、限外猿過
膜またはフオローフアイバーなどを設けた公知の各種形
状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、例えば腹腔内
に埋設して「動物体からの栄養物を含む体液の供給を受
けつつ、そのチャンバ−内で前述の培養株化されたヒト
由来の細胞を何れも増殖させることができる。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、港流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバ−内の
ヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにすること
も、また、このチヤンバー部分のみを着脱交換できるよ
うにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、
動物個体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャソバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直懐接触しないので「ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種溢血動物を自由に利用できる特徴
を有している。移植した動物の維持管理は、その動物の
通常の飼育管理を続ければよく、移殖後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は、通常１〜Ｉ
Ｑ圏の期間で目的を達成することができる。このように
して得られるヒト由来の細胞数は、動物個体当り約１０
７〜１び２個、またはそれ以上に達することも見出した
。換言すれば、本発明で使用するＴＮＦの製造方法によ
り増殖させたヒト由来細胞数は、動物個体当り移植した
細胞数の約１ぴ〜１０７倍、またはそれ以上にも達し、
生体外の栄養塔地に接種して増殖させる場合の約１び〜
１ぴ倍、またはそれ以上にも達して、ＴＮＦの製造のた
めに極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からＴＮＦ
を誘導生成させる方法は自由である。

それが増殖した動物体内のままでＴＮＦ誘導剤を作用さ
せることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増
殖したヒト由来の細胞に、または皮下に生じた腫傷細胞
に、ＴＮＦ誘導剤を直接作用させてＴＮＦを誘導生成さ
せ、次いでその血清、腹水または腫場からＴＮＦを精製
採取すればよい。また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内
から取り出し、生体外でＴＮＦ誘導剤を作用させてＴＮ
Ｆを誘導生成させることもできる。例えば、腹水中で増
殖したヒト由釆の細胞を採取し、または皮下に生じたヒ
ト由来の細胞を含む腫湯を摘出、分散し、得られる細胞
を約２０〜４０℃に保った栄養培地に細胞濃度が約１び
〜１ぴ／泌になるように浮遊させ、これにＴＮＦ誘導剤
を作用させることによってＴＮＦを誘導生成させ、これ
を精製採取すればよい。更に、ヒト由来の細胞を拡散チ
ヤンバー内で増殖させた場合は、増殖させた細胞をチャ
ンバー内のままで、またはチヤンバーから取り出して、
ＴＮＦ譲導剤を作用させ、ＴＮＦを誘導生成させること
もできる。

また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体
内のままでＴＮＦを誘導生成させた後、次いで同一動物
個体の特定の部位または全体から採取したヒト由来の細
胞に動物体外でＴＮＦを譲導生成させる方法、または一
度ＴＮＦの誘導生成に使用した細胞を更に２度以上ＴＮ
Ｆの譲導生成に使用する方法、または動物体内に埋設、
若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数
を増加させる方法などによって、使用する動物個体当り
のＴＮＦ生成量を更に高めることも自由である。

ＴＮＦ誘導剤としては、ヒト以外の温皿動物の体液の供
給を受けながら増殖させて得られるヒト由来の株化細胞
からＴＮＦを誘導生成できるものであればよく、例えば
、ＢＣＧ、コリネバクテリウム、パルバムなどの細菌、
センダィウィルス、ニューカッスル病ウイルスなどのウ
イルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドなどの後酸
類、フイトヘマグルチニソ、コンカナバリンＡ、ポーク
ウイードミトーゲン「リポポリサツカリド、エンドトキ
シン、多糖類などのミトーゲンなどから選ばれる一種ま
たは二種以上の物質が適宜もちいられる。

これら誘導剤が、インターフェロン誘導能を有している
場合には、ＴＮＦが産生されるだけでなく、ヒトに種特
異性の高いＱ−、８一、ｙーィンターフェロンなども同
時に産生されることが判明した。

このことは「貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
産生を可能にし、更に増殖させたヒト由来の株化細胞の
高度利用を可能にし、ヒトＴＮＦ及びヒトィンターフェ
ロンを大量に安価に供給する点からきわめて好都合であ
る。

このようにして誘導生成されたＴＮＦは、公知の精製分
離法、例えば、塩折、透析、櫨過、遠心分離、濃縮、凍
結乾燥などを行うことによって容易に精製分離し、採取
することができる。

更に高度の精製を必要とする場合には例えばイオン交換
体への吸着−溶出、ゲル炉過、等電点分画、電気泳動、
イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フイー、カラムクロマトグラフイーなどの公知の方法を
組合せれば、最高純度のＴＮＦを採取することも可能で
ある。更に、抗体を用いたアフィニティクロマトグラフ
イやフイトヘマグルチニンーセフアロースなどを用いた
アフイニティクロマトグラフイーを利用して高純度のＴ
ＮＦを簡便、迅速に製造することも自由である。

ＴＮＦの活性は、Ｅ．Ｐｉｃｋ編 Ｔ山ｍｏｒ Ｎｅｃ
ｒｏＳＩＳＦａｃｔｏｒ ｉｎ“Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ
ｓ’’Ｖｏｌ．１１「 ｐｐ２３５−２７２、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃｐｒｅｓｓ（１９８１年）に報告されているＴ
ＮＦ感受性Ｌ−９２餅曲胞を使用して、一定時間培養後
の生残細胞数を測定する公知の方法を用いた。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は「蛋白
質、核酸、酵素」Ｖｏｌ．２０、ＮＯ．６、６１６〜６
４３頁（１９７３手）に報告されているヒト羊膜由来の
ＦＬ細胞を使用して公知のプラーク半減法で測定した。

インターフェロンのうち、ｙ−インターフェロンの活性
は、公知の方法、すなわち、ゲル炉過法で分子量分画し
得られる分子量約５００００の画分のインターフェロン
活性を測定した。赤血球凝集価は、Ｊ．Ｅ．Ｓａｌｋ著
「ＪｏｍＭ１ｏｆｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．４９
、８７頁（１９４４年）の方法に準じて測定した。

以下、本発明のＴＮＦの有効性、毒性、用法および用量
について実験で説明する。

実験例 １ ＢＡＬＢノＣ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を背部皮
下に移植する。

腫傷体積が約２００柳３ の時期から実施例１で得られ
たＴＮＦを１００および１０００単位／ｋｇずつ毎日１
回静注し、１５日目にマウスを殺し、腫湯重量を測定し
た。その結果を第１表に示した。なお、対照はＴＮＦ無
含有生理食塩水を静注した。第１表 ※ 危険率５孫以下で対照の値に比し、 推計学的に有意差あり。

実験例 ２ 体重２５タ前後のＢＤＦ，雄マウスを１群１０匹とし、
２仰角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移植した。

移植後８日目から実施例１で得られたＴＮＦをそれぞれ
１００および１００■単位／Ｘ９ずつ毎日１回静注し、
２１日目にマウスを殺して自重湯重量を測定した。その
結果を第２表に示した。

なお、対照はＴＮＦ無含有生理食塩水を静注した。

２ ※ 危険率５％以下で対照の値に比し、 推計学的に有意差あり。

実験例 ３ 急性毒性 生後２０日のマウスを使用して、実施例１で得られたＴ
ＮＦの急性毒性試験をしたところ、ＴＮＦの毒性は極め
て低く、腹腔内に注射した時のＬＤｓｏは２００００の
単位以上／ｋ９であることが判明した。

以上の実験からも明らかなように、本発明のＴＮＦは、
その有効用量からも極めて安全であり、各種悪性腫傷の
治療に有利に用いることができる。本発明でいう悪性種
湯とは、ＴＮＦによって予防され、若しくは治療される
疾患であり、例えば乳癌、肺癌、腰勝癌、子宮癌、胃癌
、大腸癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌、神経芽腫などの
悪性腫場である。

本発明のＴＮＦの成人１日当りの用量は１〜５００００
００の単位であり、好ましくは局所注射および点眼など
の局所適用用量は１〜１００００００単位、軟膏の場合
１０〜５０００００山単位、静注および筋注など全身注
射の場合１００〜１００００００が単位、経口投与の場
合１００〜５０００００００単位であるが用法あるいは
症状に応じて適宜増減することができる。

必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤あるし、は
賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製すること
ができる。本発明のＴＮＦを含有する悪性腫擬治療剤は
、その目的に応じてその形状を自由に選択できる。

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの腸溶
製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射剤としては
、例えば用時に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍結乾
燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として用い
ることもできる。以下、２〜３の実施例を述べる。実施
例 １ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、ＳＶ−４０ウイルスで処理し培養株化され
たヒト由来の単核細胞を移植し、通常の方法で１週間飼
育した後、ＢＣＧの生細胞を腹腔内に１０７個注入し、
更に２週間飼育した。

皮下に生じた約１５夕の腫場を摘出し細切した後、トリ
プシン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散分取した
。この細胞をヒト血清５ｖ′ｖ％含有するｐＨ７．２の
Ｅａｇｌｅの最小基本培地で３７０に保った同じ組成の
培地に細胞濃度が約５〜１ぴ／羽になるよう希釈し、こ
れにＥ．ｃｏｌｉ由来のエンドトキシンを約１０ムタ／
の‘の割合で加えて１粥時間保ってＴＮＦを誘導生成せ
しめた。これを４℃、約１０００夕で遠心分離し、沈澱
物を除去し、得られた上清をｐＨ７．２、０．０１Ｍリ
ン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透析し、
更に精密櫨遇して得た猿液を濃縮し、凍結乾燥してＴＮ
Ｆ活性を含有する粉末を得た。得られた粉末を○．Ｂｏ
ｄｏの報告（Ｓｙｍｐｏｓｌ山ｍ ｏｎ ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ、ｓｔａｎ舷ｒｉＺａｔｉｏｎａｎｄ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ 瓜ｅ ｏｆ ｉｎｔｅｈｅｒｏ
ｎ 、 １１ｔｈＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌ ｌｍｍｕ
ｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａＩ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ８＆
９Ｊｕｎｅｌ９７７、Ｚａｇｅｂ．Ｙｕｇｏｓｌａｖｉ
ａ）に準じてイオン交換への吸脱着、ゲル櫨週による分
子量分画、濃縮および精密櫨過の手段によりインターフ
ェロンを除去し、更に硫安塩折、ＣｏｎＡーセファロー
ス アフイニテイクロマトグラフイーにより精製し、Ｍ
ｅｔｈＡ肉腫出血性壊死能を有し、かつ正常細胞に何ら
の悪影響も及ぼさないことを特徴とする高純度ＴＮＦを
約１００方単位得た。このようにして得られたＴＮＦは
、用いた誘導剤の混入もなく、比活性約３５００００単
位／雌を有する糠蛋白質であった。実施例 ２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免法で調製した抗血清
を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、その皮下
にヒト由来の株化細胞をＢＡＬＬ−１細胞を移植し、そ
の後通常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた約１５夕の腫癌を摘出し細切し、生理食塩
水中で分散させほぐした。得られた細胞を血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ？．２）で洗浄し、同培地
に約１×１０７／地に懸濁した。この懸濁液に、センダ
ィウィルスを叫当り約１００の赤、血球凝集価及びＥ．
ｃｏｌｉ由来のエンドトキシンを叫当り約２０仏夕を添
加し、３７０で２日間保ってＴＮＦを誘導生成させた。
これを約４００、約１０００夕で遠心分離し、沈澱物を
除去し、得られた上清をｐＨ７．２、０．０１Ｍリン酸
塩緩衝液を含有まる生理食塩水で２１時間透析し、更に
精密櫨遇して得た櫨液を濃縮し、凍結乾燥してＴＮＦ活
性を含有する粉末を得た。得られたＴＮＦ活性は、ハム
スター１匹当り約８３００万単位であった。なお、本品
には、ヒトィンターフェロン約４１００万単位含有し、
うち、ｙーィンターフェロンの活性は約３０％含まれて
いた。実施例 ３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、ヒト由来の株化細胞
ＴＡＬＬ−１細胞を移植後、通常の方法で５週間飼育し
た。

この腹腔内へ、約３００伍赤血球凝集価のニューカッス
ル病ウイルスを紫外線によって予めほとんど失活させて
注入し、２４時間後に屠殺して腹水を採取した。以後、
実施例２と同様に精製し濃縮乾燥してＴＮＦ活性を有す
る粉末を得た。得られたＴＮＦ活性は、ヌードマウス１
匹当り約６２０万単位であった。なお、本品にはヒトィ
ンターフェロン約４５０万単位含有し、うち、ｙーィン
ターフェロンの活性は約１０％含まれていた。実施例
４成長した普通マウスに約４００レムのヱックス線を予
め照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮
下に培養株化されたヒト由来の株化細胞Ｍｏｎｏ−１細
胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた約１０夕の腫檀を摘出した後、実施例１と
同様にして細胞を分散させた。この細胞を実施例１と同
様に懸濁した後、この懸濁液に、センダィウィルスを私
当り約５００赤血球凝集価及びコンカナバリンＡを肌当
り０．８Ａ夕を添加し、３７０で１日間保ってＴＮＦを
誘導生成させた。以後、実施例２と同様に精製濃縮乾燥
してＴＮＦ活性を有する粉末を得た。得られたＴＮＦ活
性は、マウス１匹当り、６８００万単位であった。なお
、本品にはヒトインターフェロン約１３００万単位含有
し、うち、ｙ−インターフェロンの活性は約３５％含ま
れていた。実施例 ５ 新生児のハムスターに実施例１と同様にしてヒト由来の
株化細胞Ｎａｍａｌｖａ細胞を移植し〜 その後通常の
方法で４週間飼育した。

皮下に生じた約２０夕の瞳癌を実施例２と同様にほぐし
て約３×１び／舷の細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセン
ダィウィルスをの【当り約１００花赤血球凝集価を添加
し３６００で２日間保ってＴＮＦを誘導生成させ次いで
実施例２と同様に精製濃縮してＴＮＦ活性を有する濃縮
液を得た。得られたＴＮＦ活性は、ハムスター１匹当り
約４３００万単位であった。なお本液にはハムスター１
匹当り約８２０万単位のヒトィンターフェロンを含有し
ていた。実施例 ６ 孔径０．５ミクロンのメンブランフィルターを設けた内
容量約１０Ｍのプラスチック製円筒型拡散チャンバー内
に、培養株化されたヒト由来の株化細胞ＮＡＬＬ−１細
胞を生理食塩水で浮遊させＬ これを成長したラツトの
腹腔内に埋設した。

このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバ−を取り出した。これにより得られたヒト由来
のリンパ芽球様細胞の濃度は約５×１ぴ／帆であって、
生体外の栄養塔地に炭酸ガスィンキュベーター中で増殖
させる場合の約１ぴ倍以上にも達することがわかった。
この細胞を実施例１と同様に懸濁し、この懸濁液に、地
当り約５０の赤血球凝集価のニューカッスル病ウイルス
を紫外線で予めほとんど失活ごせて加え、さらにフィト
ヘマグルチニンを私当り約１００仏夕加え３７℃で２日
間保ってＴＮＦを誘導生成させた。以後、実施例２と同
様に精製し濃縮乾燥してＴＮＦ活性を有する粉末を得た
。得られたＴＮＦはラット１匹当り約２６００万単位で
あった。なお、本品にはヒトィンターフェロン約９４０
万単位含有し、うち、ｙーィンターフェロンの活性は約
５０％含まれていた。実施例 ７３７００で５日間保っ
たニワトリの受精卵に、培養株化されたヒト由来の株化
細月蝕ＢＬ細胞を移植した後、３７０で１週間保つた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ツモア ネクロシス フアクター産生能を有する培
   養株化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体
   内に移植し、その温血動物の体液の供給を受けながら増
   殖させて得られる細胞に、生体内または生体外でツモア
   ネクロシス フアクター誘導剤を作用させ、生成した
   ツモア ネクロシス フアクターを採用することを特徴
   とするツモア ネクロシス フアクターの製造方法。 ２ ツモア ネクロシス フアクターをヒトインターフ
   エロンとともに生成せしめることを特徴とする特徴請求
   の範囲第１項記載のツモア ネクロシス フアクターの
   製造方法。