JPS58107197A - ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ツモア　ネクロシス　ファクターの製造方法
に関する。

ツモア　ネクロシス　ファクター　（ＴｕｍｏｒＮｅｃ
ｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ、以下、ＴＮＦと略称する）
は、Ｅ、Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ。、　ｐ
ｒ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ。

Ｖｏｌ。７２．Ｎｏ。９．３６６６−３６７０頁（１９
７５年）及び、Ｅ、Ｐｉｃｋ編Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓ　ｐａｃｔｏｒ　ｉｎ’ＩＬｙｍｐｈｏｌ＜１ｎ
ｅｓ”Ｖｏｌ、　ＩＩ、　ｐｐ　２３５−２７２．　Ａ
ｃａｄｅｔｎｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　（１９８１年）など
にも記載されているように、例えば、ウサギにＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　（ＢＣ
Ｇ　）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕ
ｍ、エンドトキシンなどを非経口的に投与することによ
って、その血清中に誘導生成する糖蛋白物質であって、
Ｍｅｔｈ　Ａ肉腫出血性壊死能を持つ物質に与えられた
名称であり、特に腫瘍細胞に対して細胞障害機能を持っ
ていることは公知である。

ＴＮＦの持つこのような機能から、ＴＮＦはその発見の
当初より悪性腫瘍治療剤として期待されて来た。

ＴＮＦは、ウサギ、ラットなどのヒト以外の動物血清か
ら調製され、種特異性はないとされているけれども、ヒ
トの治療に供するには、ヒトの生細胞由来であることが
、治療上に生ずる抗原性などの副作用面において極めて
安全であり、優れている。

本発明者らは、工業的規模で容易に実施し得るヒトのＴ
ＮＦの製造方法を検討し、そのＴＮＦが悪性腫瘍の治療
剤として有用であるか否かを鋭意研究して来た。

その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生体外（ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ　）の栄養培地に接種し増殖させるので
はなく、ヒト以外の温血動物体内に移植し、または、拡
散チャンバー内に接種してその動物体から栄養物を含有
する体液の供給を受けつつ増殖させ、得られる細胞に生
体内または生体外でＴＮＦ誘導剤を作用させることによ
って、ＴＮＦが高活性で誘導生成され、これを精製採取
することによってＴＮＦが多量容易に製造し得ることを
見いだし、そのＴＮＦが悪性腫瘍の治療剤として優れて
いることを確認して本発明を完成した。

本発明において使用されるＴＮＦの製造方法は、生細胞
を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で増殖させる場合とは
違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要または大
幅に節約できるばかりで々く、細胞増殖中の維持管理も
極めて容易であり、その上誘導生成されるＴＮＦ活性が
高い特徴を有している。即ち、培養株化されたヒト由来
の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、あるいは、
その動物の体液の供給を受けることのできる拡散チャン
バー内に収容し、このチャンバーを動物体内に埋設し通
常の飼育をすれば、温血動物体から供給される栄養物を
含有する体液を利用してその細胞が容易に増殖しうるの
である。更に生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で増殖させ
る場合と比較して、この細胞の増殖が安定していること
、その増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこ
と、更には細胞尚シのＴＮＦの収量が著増することも大
きな特徴である。本発明で使用する培養株化されたヒト
由来の細胞は、ヒト以外の温血動物体内に移植して容易
に増殖し得てしかもＴＮＦ産生能を有するものであれば
よい。

例えば［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａＬ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１　ｊ１１６−１
１７頁（１９７５年）に記載されているＮａｍａｌｖａ
細胞、■、　Ｍｉｙｏｓｈｉ著ｒＮａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ
。２６７　Ｊ　８４３−８４４頁（１９７７年）に記載
されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＮＡ
ＬＬ−１細胞、ｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　ＶＯＩ。ｉｌｌ　Ｊ　１３３４−１８４５頁
（１９７４年）記載のＭ　−７００２細胞、１３−７１
０１細胞などの株化細胞や、また、正常な単核細胞、顆
粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬剤、放射線など
で処理し培養株化させた細胞などが自由に使用される。

また、これら細胞のＴＮＦ産生能を持つ遺伝子を、例え
ばポリエチレングリコールやセンダイウィルスなどを利
用する細胞融合の手段や、ＤＮＡＩＪガーゼ、制限酵素
（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を利
用する遺伝子組み換えの手段などによって、より容易に
継代培養しうる培養株化されたリンパ芽球様細胞々どに
導入し、その増殖速度を高めたり、細胞当りのＴＮＦ産
生能を高めたりして使用してもよく、本明細書に記載す
る株化細胞のみに限定されるものではない。これらの細
胞は、後に述べるＴＮＦを誘導生成させるまでの過程で
、単独で又は２種以上を混合して自由に使５− 用される。必要ならば、これに、例えばヒトの新鮮面か
ら調整される白血球を併用することもできる。

本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニワ）ＩＪ、ハトなどの
鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、
ウシ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、
ヌードマウスなどのＩｌｌ。

類が使用できる。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状態
、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの方
が好首しい。

また、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長６一 したものであっても免疫反応が弱いので、これらの前処
置を必要とすることなく、培養株化されたヒト由来の細
胞が移植でき、急速に増殖できるので特如好都合である
。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれらから誘導生成されるＴＮＦ量を増加させること
も自由である。

この場合、同種間、同居間は勿論のこと、同線間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ば
れる。

捷だ、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約１１０−７−１Ｏ−３を有するメンブランフィ
ルタ−１限外濾過膜またはフォローファイバーなどを設
けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体
内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含
む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培
養株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることが
できる。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表て取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにすること
も、また、このチャンバ一部分のみを着脱交換できるよ
うにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、
動物個体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましく々い免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している３移植した動物の維持管理は、その動物の
通常の飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は、通常１〜１
０週の期間で目的を達成することができる。

このようにして得られるヒト由来の細胞数は、動物個体
当シ約１０〜１０個、またはそれ以上に達することも見
出した。

換言すれば、本発明で使用するＴＮＦの製造方法により
増殖させたヒト由来細胞数は、動物個体当り移植した細
胞数の約１０２〜１０７倍、またはそれ以上にも達し、
生体外の栄養培地に接種して増殖させる場合の約１０１
〜１０６倍、またはそれ以上にも達して、ＴＮＦの製造
のために極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からＴＮＦ
を誘導生成させる方法は自由である。それが増殖した動
物体内のままでＴＮＦ誘導剤を作用させることもできる
。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の
細胞に、または皮下に生じた腫瘍細胞に、ＴＮＦ誘導剤
を直接作用さ９− せてＴＮＦを誘導生成させ、次いでその血清、腹水また
は腫瘍からＴＮＦを精製採取すればよい。

また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内から取り出し、生
体外でＴＮＦ誘導剤を作用させてＴＮＦを誘導生成させ
ることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト由来の
細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由来の細胞を含
む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞を約２０〜４０℃
に保った栄養培地に細胞濃度が約ｌＯ５〜１０８／ｍｌ
になるように浮遊させ、これにＴＮＦ誘導剤を作用させ
ることによってＴＮＦを誘導生成させ、これを精製採取
すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、ＴＮＦ誘導剤を作用させ
、ＴＮＦを誘導生成させることもできる。−。

また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体
内のままでＴＮＦを誘導生成させた後、次いで同一動物
個体の特定の部位または全体から採取したヒト由来の細
胞に動物体外でＴＮＦを誘１０− 導生成させる方法、また一度ＴＮＦの誘導生成に使用し
た細胞を更に２度以上ＴＮＦの誘導生成に使用する方法
、または動物体内に埋設、若しくは接続するチャンバー
を交換して得られる細胞数を増加させる方法力どによっ
て、使用する動物個体尚りのＴＮＦ生成量を更に高める
ことも自由である。

ＴＮＦ誘導剤としては、ヒト以外の温血動物の体液の供
給を受けながら増殖させて得られるヒト由来の株化細胞
からＴＮＦを誘導生成できるものであればよく、例えば
、ＢＣＧ、コリネバクテリウム　パルバムなどの細菌、
センダイウィルス、ニューカッスル病ウィルスなどのウ
ィルス、Ｄ　Ｎ　Ａ　％ＲＮＡ、ポリヌクレオチド々ど
の核酸類、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、
、Ｉ−’−クウイードミトーゲン、リポホ５リサツカリ
ド、エンドトキシン、多糖類などのミトーゲンシどから
選らばれる一種または二種以上の物質が適宜もちいられ
る。

これら誘導剤が、インターフェロン誘導能を有している
場合には、ＴＮＦが産生されるだけでなく、種特異性の
高いヒトインターフェロンも同１１に産生されることが
判明した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
産生を可能にし、更に増殖させたヒト由来の株化細胞の
高度利用を可能にし、ヒ）ＴＮＦ及びヒトインターフェ
ロンを大量に安価に供給する点からきわめて好都合であ
る。

このようにして誘導生成されたＴＮＦは、公知の精製分
離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、凍
結乾燥などを行うことによって容易に精製分離し、採取
することができる。更に高度の精製を必要とする場合に
は例えばイオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過および
等電点分画、電気泳動などの公知の方法を組合せれば、
最高純度のＴＮＦｅ採取することも可能である。

更に、抗体を用いたアフィニテイクロマトグラフィやフ
ィトヘマグルチニン−セファロースナトを用いたアフ・
１′ニテイクロマトグラフイーを利用し７て高純度のＴ
ＮＦｅ簡便、迅速に製造するととも自由である。

ＴＮＦの活性は、ｌｉｄ、ｐｉｃｋ編Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅ
ｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　ｉｎ　”Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ”ＶＯＩ。ＩＩ、　ｐｐ　２３５−２７２゜Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ　（１９８１年）に報告され
ているＴＮＦ感受性Ｌ−９２９細胞を使用して、一定時
間培養後の生残細胞数を測定する公知の方法を用いた。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は、「蛋
白質　核酸　酵素」■０１゜２０．Ｎｏ。６．６１６〜
６４３頁（１９７５年）に報告されているヒト羊膜由来
のＦＬ細胞を使用して公知のプラーク半減法で測定した
。

赤血球凝集価は、Ｊ、Ｅ、５ａｌｋ著ｒ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ。４９．８
７頁（１９４４年）の方法に準じて測定した。

以下、本発明のＴＮＦの有効性、毒性、用法および用量
について実験で説明する。

実験例　Ｉ Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を
背部皮下に移植する。腫瘍体積が約２００−の時期から
実施例１で得られたＴＮＦを１００お１３− よび１０００単位／　Ｋｙずつ毎日１回静注し、１５５
日目マウスを殺し、腫瘍重量を測定した。その結果を第
１表に示した。なお、対照はＴＮＦ無含有生理食塩水を
静注した。

第　　１　　表 ※　危険率５チ以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。

実験例　２ 体重２５２前後のＢＤＦ□雄マウスを１群１０匹とし、
２門角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移植した。移
植後８日目から実施例１で得られたＴＮＦをそれぞれ１
００および１，０００単位／　Ｋｇずつ毎日１回静注し
、２１１日目マウスを殺して腫瘍重量を測定した。

１４− その結果を第２表に示した。なお、対照はＴＮＦ無含有
生理食塩水を静注した。

※　危険率５チ以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。

実験例　３　　急性毒性 生後２０日のマウスを使用して、実施例１で得られたＴ
ＮＦの急性毒性試験をしたところ、ＴＮＦの毒性は極め
て低く、腹腔内に注射した時のＬＤ５ｏは２００，００
０単位／　Ｋｑ以上であることが判明した。

以上の実験からも明らかガよう圧、本発明のＴＮＦは、
その有効用量からも極めて安全であり、各種悪性腫瘍の
治療に有利に用いることができる。

本発明でいう悪性腫瘍とは、ＴＮＦによって予防され、
若しくは治療される疾患であり、例えば乳癌、肺癌、肝
癌、膀胱癌、子宮癌、胃癌、大腸癌、白血病、リンパ腫
、皮膚癌、神経芽腫などの悪性腫瘍である。

本発明のＴＮＦの成人１日当りの用量は１〜５０．００
０，０００単位であり、好ましくは局所注射および点眼
などの局所適用用量は１〜１，０００，０００単位、軟
膏の場合１０〜５，０００，０００単位、静注および筋
注など全身注射の場合１００〜１０，０００，０００単
位、経口投与の場合１００〜５０，０００，０００単位
であるが用法あるいは症状に応じて適宜増減することが
できる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤あ
るいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製す
ることができる。

本発明のＴＮＦを含有する悪性腫瘍治療剤は、その目的
に応じてその形状を自由に選択できる。

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの腸溶
製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射剤としては
、例えば用量に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍結乾
燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として用い
ることもできる。

以下、２〜３の実施例を述べる。

実施例　１ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、ＳＶ、−４０ウイルスで処理し培養株化さ
れたヒト由来の単核細胞を移植し、通常の方法で１週間
飼育した後、ＢＣＧの生細胞を腹腔内に１０個注入し、
更に２週間飼育した。皮下に生じた約１５１の腫瘍を摘
出し細切した後、トリプシン含有の生理食塩水に懸濁し
て細胞を分散分取した。この細胞をヒト血清５　ｖ　／
　ｖ　％含有するｐＨ７２のＥａｇｌｅの最小基本培地
で洗浄し３７℃に保った同じ組成の培地に細胞濃度が約
５Ｘ１０／ｍＪになるよう希釈し、これにＥ、　ｃｏｌ
ｉ由来のエンドトキシンを約１０μ棒の割合で加えて１
６時間保ってＴＮＦを誘導生成１７− せしめた。これを４℃、約１，０ＯＯ１ｉ’で遠心分離
し、沈澱物を除去し、得られた上清をｐＨ７２，０，０
１Ｍリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透
析し、更に精密濾過して得た濾液を濃縮し、凍結乾燥し
てＴＮＦ活性を含有する粉末を得た。

得られた粉末をＧ、Ｂｏｄｏの報告（Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ　ｏｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、　５ｔａｎｄａｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ｏ
ｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　１１ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　ＪｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ　８　＆　９　Ｊｕｎｅ　１９７７　、
　Ｚａｇｒｅｂ、Ｙｕｇｏｓｌａｖｉａ　）に準じてイ
オン交換への吸脱着、ゲル濾過による分子量分画、濃縮
および精密濾過の手段によりインターフェロンを除去し
、更に硫安塩析、Ｃｏｎ　Ａ−セファロース　アフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製し、Ｍｅｔｈ　Ａ肉
腫出血性壊死能を有し、かつ正常細胞に何らの悪影響も
及ぼさないことを特徴とする高純度ＴＮＦを約１００万
単位得た。

このようにして得られたＴＮＦば、用いた誘導剤の混入
もなく、比活性約８５０，０００単位／ｍｇを有する糖
蛋白質であった。

１８− 実施例　２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下にヒト由来の株化細胞ＢＡＬＬ−１細胞を移植
し、その後通常のぐした。得られた細胞を血清無添加の
ＲＰＭ１１６４０培地（ｐＨ７２）で洗浄し、同培地に
約１×１０７／ｍｌに懸濁した。この懸濁液に、センダ
イウィルスをｍｌ”ｈり約１，０００赤血球凝集価及び
ｐ、ｃｏｌｉ由来のエンドトキシンをｔｎｅ当り約２０
μ７を添加し、３７℃で２日間保ってＴＮＦを誘導生成
させた。

これを約４℃、約１，０００ｆで遠心分離し、沈澱物を
除去し、得られた上清をｐＨ７２，０，０１Ｍ　！Ｊン
酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透析し、更
に精密濾過して得た濾液を濃縮し、凍結乾燥してＴＮＦ
活性を含有する粉末を得た。得られたＴＮＦ活性は、ハ
ムスター１匹当シ約ａ３００万単位であった。なお、本
市には、ヒトインターフェロン約４，１００万単位含有
していた。

実施例　３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、ヒト由来の株化細胞
Ｔ　Ａ　Ｌ　Ｌ−１細胞を移植後、通常の方法で５週間
飼育した。この腹腔内へ、約３０００赤血球凝集価のニ
ューカッスル病ウィルスを紫外線によって予めほとんど
失活させて注入し、２４時間後に屠殺して腹水を採取し
た。以後、実施例２と同様に精製し濃縮乾燥してＴＮＦ
活性を有する粉末を得た。得られたＴＮＦ活性は、ヌー
ドマウス１匹当り約６２０万単位であった。

なお、本市にはヒトインターフェロン約４５０万単位を
含有していた。

実施例　４ 成長した普通マウスに約４００レムのエックス線を予め
照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下
に培養株化されたヒト由来の株化細胞Ｍｏｎｏ−Ｌ細胞
を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下に
生じた約１０２の腫瘤を摘出した後、実施例１と同様に
して細胞を分散させた。この細胞を実施例１と同様に懸
濁した後、この懸濁液に、センダイウィルスをｍｌ当り
約５００赤血球凝集価及びコンカナバリンＡをｍｌ当り
０８μグを添加し、３７℃で１日間保ってＴＮＦを誘導
生成させた。以後、実施例２と同様に精製濃縮乾燥して
ＴＮＦ活性を有する粉末を得た。得られたＴＮＦ活性は
、マウス１匹当りｑ８００８００万単った。なお、本市
にはヒトインターフェロン約１，３００万単位含有して
いた。

実施例　５ 新生児のハムスターに実施例１と同様にしてヒト由来の
株化細胞Ｎａｍａ１ｖａ細胞を移植し、その後通常の方
法で４週間飼育した。皮下に生じた約２０２の腫瘤を実
施例２と同様にほぐして約３Ｘ１０／ｍ１！の細胞懸濁
液を得た。本懸濁液にセンダイウィルスをｍ１当り約１
，０００赤血球凝集価を添加し３６℃で２日間保ってＴ
ＮＦを誘導生成させ次いで実施例２と同様に精製濃縮し
てＴＮＦ活性を有する濃縮液を得た。得られたＴＮＦ活
性は、ハムスター１匹当シ約４．３００万単位であつ２
１− た。なお水液にはハムスター１匹当り約８２０万単位の
ヒトインターフェロンを含有していた。

実施例　６ 孔径０５ミクロンのメンブランフィルタ−に設けた内容
量約１０−のプラスチック製円筒型拡散チャンバー内に
、培養株化されたヒト由来の株化細胞ＮＡＬＬ−１細胞
を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラットの腹腔
内に埋設した。

このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出したつこれにより得られたヒト由来
のＢリンパ芽球様細胞の濃度は約５　Ｘ　１０　／ｍｌ
であって、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキュベータ
ー中で増殖させる場合の約１０倍以上にも達することが
わかった。この細胞を実施例１と同様に懸濁し、この懸
濁液に、ｒｎｅ当り約５００赤血球凝集価のニューカッ
スル病ウィルスを紫外線で予めほとんど失活させて加え
、さらにフィトヘマグルチニンを一当シ約１００μグ加
え３７℃で２日間保ってＴＮＦを誘導生成させた。以後
、実施例２と同様に精製し濃２２− 縮乾燥してＴＮＦ活性を有する粉末を得た。得られたＴ
ＮＦはラット１匹当り約２，６００万単位であった。な
お、本旨にはヒトインターフェロン約９４０万単位を含
有していた。

実施例　７ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、培養株化さ
れたヒト由来の株化細胞ＪＢＬ細胞を移植した後、３７
℃で１週間保った。この卵を割卵した後、増殖細胞を採
取した。この細胞を実施例１と同様に５　Ｘ　１０　／
ｌｒｉ、に懸濁した。この懸濁液にｍｅ当り約１，００
０赤血球凝集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で
１日間保ってＴＮＦを誘導生成させ、次いで実施例２と
同様に精製濃縮してＴＮＦ活性を有する濃縮液を得た。

得られたＴＮＦ活性は、受精卵１０個当シ約１５０万単
位であった。なお、水液には、受精卵１０個光り約４０
万単位のヒトインターフェロンを含有していた。

特許出願人 手続補正書 昭第１５７年１１月４日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、　事件の表示 昭和５６年特許願第２０５１．１５号 ２　発明の名称 ツモア　ネクロシス　ファクターの製造方法ａ　補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 岡山県岡山市下石井１丁目２番３号 代表者　林　原　　　健 （ほか１名） 屯代理人 東京都港区新橋６丁目５＠４号 ＤＩＫマンション新倫　２１９号 明細書における「発明の詳細な説明」の項Ｇ　補正の内
容 （１）　　明細書第１２頁第２行記載の「種特異性の高
いヒトインターフェロン」を「ヒトに種特異性の高いα
−１β−１γ−インターフェロンナト」に補正し寸す。

（２）　　明細書第１３頁第１１行記載の「した。」の
後に、次文を挿入します。

「インターフェロンのうチ、γ−インターフェロンの活
性は、公知の方法、すなわち、ゲル沢過法で分子量分画
し得られる分子量約５０，０００の両分のインターフェ
ロン活性を測定した。」（３）　　明細書第２０頁第１
行記載の「約４，１００万単位含有していた。」ヲ「約
４，１００万単位含有し、うチ、γ−インターフェロン
の活性は約３０％含捷れでいた８　」に補正し才す。

（４）　明細書第２０頁第１２〜１３行記載の「約４５
０万単位を含有していた。」を「約４５０万単位含有し
、ウチ、γ−インターフェロンの活性は約１０％含まれ
ていた。」に補正し１す。

（５）　　明細書第２１頁第９行記載の［約１，３００
万単位含−２＝ 有していた。」ヲ「約１，３００万単位含有し、うち、
γ−インターフェロンの活性は約３５％含−１ｆＬでい
た。」に補正し１す。

（６）　　明細書第２３頁第４行記載の「約９４０万単
位全含有していた。」を「約９４０万単位含有し、うち
、γ−インターフェロンの活性は約５０％含まれていた
。」に補正します。

（７）　　明細書第２３頁第１７〜１８行記載の「約４
０万単位のヒトインターフェロンを含有していた。」を
「ヒトインターフェロンを約４０万単位含有し、うち、
γ−インターフェロンは約１０％含まれていた。」に補
正します。

３−

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ツモア　ネクロシス　ファクター産生能を有
   する培養株化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血
   動物体内に移植し、その温血動物の体液の供給を受け々
   から増殖させて得られる細胞に、生体内または生体外で
   ツモア　ネクロシスファクター誘導剤を作用させ、生成
   したツモアネクロシス　ファクターを採取することを特
   徴とするツモア　ネクロシス　ファクターの製造方法。
2. （２）　　ツモア　ネクロシス　ファクターをヒトイン
   ターフェロンとともに生成せしめることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）項記載のツモア　ネクロシス　フ
   ァクターの製造方法。