JPH088873B2 - ヒト癌壊死因子の製造法 - Google Patents
ヒト癌壊死因子の製造法Info
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- JPH088873B2 JPH088873B2 JP58139228A JP13922883A JPH088873B2 JP H088873 B2 JPH088873 B2 JP H088873B2 JP 58139228 A JP58139228 A JP 58139228A JP 13922883 A JP13922883 A JP 13922883A JP H088873 B2 JPH088873 B2 JP H088873B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト癌壊死因子（Human Tumor Necrosis F
actor;以下HuTNFと略記する）の製造法に関する。
actor;以下HuTNFと略記する）の製造法に関する。
Carswellらは、あらかじめbacillus Calmette−Gu
rin（BCG）で感染させ、次いでエンドトキシンで処理し
たマウスの血清中には、移植したMeth A肉腫による癌を
壊死させる物質が含まれていることを見いだし、この物
質を癌壊死因子（Tumor Necrosis Factor;以下TNFと略
記する）と名づけた〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA.72,3666
（1975）〕。
rin（BCG）で感染させ、次いでエンドトキシンで処理し
たマウスの血清中には、移植したMeth A肉腫による癌を
壊死させる物質が含まれていることを見いだし、この物
質を癌壊死因子（Tumor Necrosis Factor;以下TNFと略
記する）と名づけた〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA.72,3666
（1975）〕。
TNFはマクロフアージから放出される生理活性物質と
考えられており、その特徴としては、（ｉ）担癌動物に
投与するとある種の癌を壊死させること、（ii）in vit
roである種の癌細胞（例 マウスの癌細胞であるＬ細
胞、ヒト癌由来のPC10細胞）を損害するが、正常細胞に
はほとんど有害な作用を及ぼさないこと、及び（iii）
その作用が種特異的でないことが知られている。このよ
うな特徴の故にTNFは制癌剤として期待されるものであ
る。
考えられており、その特徴としては、（ｉ）担癌動物に
投与するとある種の癌を壊死させること、（ii）in vit
roである種の癌細胞（例 マウスの癌細胞であるＬ細
胞、ヒト癌由来のPC10細胞）を損害するが、正常細胞に
はほとんど有害な作用を及ぼさないこと、及び（iii）
その作用が種特異的でないことが知られている。このよ
うな特徴の故にTNFは制癌剤として期待されるものであ
る。
TNFの製造は、通常、あらかじめBCG又はPropionibact
eriuu acnes（Coryne−bacteriumu pargum）を注射し、
次いでエンドトキシンを注射した哺乳動物（例 マウ
ス，ウサギ，ラツト）の血清からTNFを回収することに
より行われている。TNFを医薬として使用するために
は、抗原性等の副作用の観点からヒト由来のTNFがより
好ましいことは明らかであるが、上記方法はヒト由来の
TNF製造には採用できない。
eriuu acnes（Coryne−bacteriumu pargum）を注射し、
次いでエンドトキシンを注射した哺乳動物（例 マウ
ス，ウサギ，ラツト）の血清からTNFを回収することに
より行われている。TNFを医薬として使用するために
は、抗原性等の副作用の観点からヒト由来のTNFがより
好ましいことは明らかであるが、上記方法はヒト由来の
TNF製造には採用できない。
従来、ヒトマクロフアージ由来の癌細胞損害因子とし
ては、正常人の末梢単球細胞あるいは骨髄性単球性白血
病患者の白血病細胞からの因子（Anti−tumor cytotoxi
n）〔Immunology,44,135（1981）〕及びヒト末梢血中の
培養器壁付着細胞からの因子（Adherent cell toxin）
〔J.Immunol.,115,395（1975）〕が報告されている。し
かし、これらの因子については、in vitroである種の癌
細胞を損害することが知られているだけで、in vivo
系、すなわち担癌動物に投与したときに癌組織を壊死さ
せるかどうかは確認されていない。
ては、正常人の末梢単球細胞あるいは骨髄性単球性白血
病患者の白血病細胞からの因子（Anti−tumor cytotoxi
n）〔Immunology,44,135（1981）〕及びヒト末梢血中の
培養器壁付着細胞からの因子（Adherent cell toxin）
〔J.Immunol.,115,395（1975）〕が報告されている。し
かし、これらの因子については、in vitroである種の癌
細胞を損害することが知られているだけで、in vivo
系、すなわち担癌動物に投与したときに癌組織を壊死さ
せるかどうかは確認されていない。
本発明者らは、ヒト由来のTNFの大量生産法を確立す
るために、ヒト白血病細胞に着目し鋭意研究を行つた結
果、無限に増殖することのできるある種のヒト白血病株
細胞を分化誘導能を有する物質（以下、分化誘導物質と
略記する）の存在下に培養することにより、in vitro培
養系においてヒト由来のTNFを大量に生産できることを
見いだし、本発明を完成した。
るために、ヒト白血病細胞に着目し鋭意研究を行つた結
果、無限に増殖することのできるある種のヒト白血病株
細胞を分化誘導能を有する物質（以下、分化誘導物質と
略記する）の存在下に培養することにより、in vitro培
養系においてヒト由来のTNFを大量に生産できることを
見いだし、本発明を完成した。
本発明は、マクロフアージ様細胞に分化し得るヒト白
血病細胞を、分化誘導物質の存在下に培養することを特
徴とするHuTNFの製造法に関するものである。
血病細胞を、分化誘導物質の存在下に培養することを特
徴とするHuTNFの製造法に関するものである。
本発明において、HuTNFとはヒト由来のマクロフアー
ジ又はマクロフアージ様細胞が産生する物質であつて、
in vitroで少なくともＬ細胞を損害する能力及び少なく
とも移植したMeth A肉腫による癌を壊死させる能力を有
するものを意味する。
ジ又はマクロフアージ様細胞が産生する物質であつて、
in vitroで少なくともＬ細胞を損害する能力及び少なく
とも移植したMeth A肉腫による癌を壊死させる能力を有
するものを意味する。
本発明の方法によれば、培養規模を調節することによ
り任意の量のHuTNFを製造することができる。
り任意の量のHuTNFを製造することができる。
本発明で用いられるムクロフアージ様細胞に分化し得
るヒト白血病細胞とは、分化誘導物質の作用により初め
てマクロフアージ様細胞に分化する細胞又は本来マクロ
フアージの性質の一部を有しているが、分化誘導物質の
作用により更にムクロフアージの性質を有するように変
化する細胞を意味する。白血病患者から分離した初代細
胞及び株細胞のいずれも用いることができるが、株細胞
が好ましい。マクロフアージ様細胞への分化は、例え培
養容器面への付着を指標として確認することができる。
本発明で用いられるヒト白血病株細胞の具体例として
は、HL−60細胞（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンCCL240）,THP−１細胞,Mono−１−207細胞等
が挙げられる。これらの株細胞の樹立法及び特徴は、そ
れぞれNature,270,374（1977）,Int.J.Cancer,26,171
（1980）及びVirchows Arch.A path.Anat.and Histol.,
371,15（1976）に記載されている。
るヒト白血病細胞とは、分化誘導物質の作用により初め
てマクロフアージ様細胞に分化する細胞又は本来マクロ
フアージの性質の一部を有しているが、分化誘導物質の
作用により更にムクロフアージの性質を有するように変
化する細胞を意味する。白血病患者から分離した初代細
胞及び株細胞のいずれも用いることができるが、株細胞
が好ましい。マクロフアージ様細胞への分化は、例え培
養容器面への付着を指標として確認することができる。
本発明で用いられるヒト白血病株細胞の具体例として
は、HL−60細胞（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンCCL240）,THP−１細胞,Mono−１−207細胞等
が挙げられる。これらの株細胞の樹立法及び特徴は、そ
れぞれNature,270,374（1977）,Int.J.Cancer,26,171
（1980）及びVirchows Arch.A path.Anat.and Histol.,
371,15（1976）に記載されている。
本発明で用いられる分化誘導物質とは、マクロフアー
ジ様細胞に分化し得るヒト白血病細胞のマクロフアージ
様細胞への分化を誘導する物質を意味し、例えばホルボ
ールエステル類，メゼレイン（以下MEZと略記する）の
ようなジテルペン系化合物、テレオシジン（以下TCDと
略記する）が挙げられる。ホルボールエステル類は、４
β−ヒドロキシ体が好ましく、例えば12−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート（以下TPAと略記
する），ホルボール−12,13−ジデカノエート（以下PDD
と略記する），ホルボール−12,13−ジベンゾエート
（以下PDBzと略記する），ホルボール−12,13−ジアセ
テート（以下PDAと略記する），ホルボール−12,13−ジ
ブチレートが挙げられるが、TPA,PDD及びPDBzが特に好
ましい。ホルボールエステル類，メゼレイン，テレオシ
ジンについては、例えば「癌'80」（「代謝」第17巻臨
時増刊号）,1311（1980），「癌'81」（「代謝」第18巻
臨時増刊号）,785（1981）及び特表昭57−500961号にそ
の化学構造式及び生物学的性質が記載されている。
ジ様細胞に分化し得るヒト白血病細胞のマクロフアージ
様細胞への分化を誘導する物質を意味し、例えばホルボ
ールエステル類，メゼレイン（以下MEZと略記する）の
ようなジテルペン系化合物、テレオシジン（以下TCDと
略記する）が挙げられる。ホルボールエステル類は、４
β−ヒドロキシ体が好ましく、例えば12−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート（以下TPAと略記
する），ホルボール−12,13−ジデカノエート（以下PDD
と略記する），ホルボール−12,13−ジベンゾエート
（以下PDBzと略記する），ホルボール−12,13−ジアセ
テート（以下PDAと略記する），ホルボール−12,13−ジ
ブチレートが挙げられるが、TPA,PDD及びPDBzが特に好
ましい。ホルボールエステル類，メゼレイン，テレオシ
ジンについては、例えば「癌'80」（「代謝」第17巻臨
時増刊号）,1311（1980），「癌'81」（「代謝」第18巻
臨時増刊号）,785（1981）及び特表昭57−500961号にそ
の化学構造式及び生物学的性質が記載されている。
以下本発明の方法を詳細に説明する。
本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞の
培養に適した各種合成培地が用いられる。代表的な培地
としては、例えばRPMI−1640培地，イーグルのMEM培
地，ダルベツコ変法によるMEM培地,Alpha MEM培地,Ham
培地,199培地,McCoy5A培地（以上の培地の組成について
は、例えば宗村庚修編「細胞培養マニユアル」，講談
社,1982年に記載されている）,High GEM培地（ダルベツ
コ変法によるMEM培地中のグルコースをフルクトースに
変えたもの）,Iscove培地〔J.Exp.Med.,147,923（197
8）〕が挙げられるが、RPMI−1640培地,199培地,High G
EM培地とHam F12培地の等容量混合培地（以下High GEM
＋HamF12と略記することがある）が好ましい。これらの
培地には、アルブミン，インシユリン，トランスフエリ
ンなどのある種の蛋白質、ヒト血清，仔ウシ血清，ウシ
胎児血清などの動物血清を単独で、あるいは適宜組み合
わせて添加してもよい。血清の添加容量は、全培養液容
量の約１〜20％が好ましい。また必要に応じて、微生物
による汚染を防止するために、抗生物質、例えば20〜10
0単位/ml、好ましくは50単位/mlのペニシリン及び20〜1
00μg/ml、好ましくは50μg/mlのストレプトマイシン又
は20〜100μg/ml、好ましくは60μg/mlのサナマイシ
ン、更に５〜40μg/ml、好ましくは25μg/mlのアンホテ
リシンＢ又は５〜30単位/ml、好ましくは20単位/mlのナ
イスタチンを添加することもできる。培養容器の材質
は、プラスチツク，ガラスあるいは金属など細胞が付着
できるものであればいずれでもよい。
培養に適した各種合成培地が用いられる。代表的な培地
としては、例えばRPMI−1640培地，イーグルのMEM培
地，ダルベツコ変法によるMEM培地,Alpha MEM培地,Ham
培地,199培地,McCoy5A培地（以上の培地の組成について
は、例えば宗村庚修編「細胞培養マニユアル」，講談
社,1982年に記載されている）,High GEM培地（ダルベツ
コ変法によるMEM培地中のグルコースをフルクトースに
変えたもの）,Iscove培地〔J.Exp.Med.,147,923（197
8）〕が挙げられるが、RPMI−1640培地,199培地,High G
EM培地とHam F12培地の等容量混合培地（以下High GEM
＋HamF12と略記することがある）が好ましい。これらの
培地には、アルブミン，インシユリン，トランスフエリ
ンなどのある種の蛋白質、ヒト血清，仔ウシ血清，ウシ
胎児血清などの動物血清を単独で、あるいは適宜組み合
わせて添加してもよい。血清の添加容量は、全培養液容
量の約１〜20％が好ましい。また必要に応じて、微生物
による汚染を防止するために、抗生物質、例えば20〜10
0単位/ml、好ましくは50単位/mlのペニシリン及び20〜1
00μg/ml、好ましくは50μg/mlのストレプトマイシン又
は20〜100μg/ml、好ましくは60μg/mlのサナマイシ
ン、更に５〜40μg/ml、好ましくは25μg/mlのアンホテ
リシンＢ又は５〜30単位/ml、好ましくは20単位/mlのナ
イスタチンを添加することもできる。培養容器の材質
は、プラスチツク，ガラスあるいは金属など細胞が付着
できるものであればいずれでもよい。
HuTNFを産生させるためには、適当に培地に約１×105
〜５×106個/ml、好ましくは約５×105〜３×106個/ml
の割合で浮遊させたヒト白血病細胞を培養容器面1cm2当
り約２×104〜１×106個、好ましくは約１×105〜６×1
05個となるように植え込み、次いで、これらの細胞をマ
クロフアージ様細胞に分化させるのに有効な量の分化誘
導物質を添加する。なお、分化誘導物質は、細胞を植え
込み前にあらかじめ細胞浮遊液に添加しておいてもよ
い。分化誘導物質の有効量は、物質の種類、細胞の種
類、培養条件等により異なるが、一般に約５〜5000ng/m
l（培養液、以下同じ）、好ましくは約100〜2000ng/ml
である。細胞及び分化誘導物質も含む培養容器を約35〜
38℃、好ましくは約37℃、約５〜10％炭酸ガス含有空気
中、湿度約90〜100％で約24〜120時間培養することによ
り、HuTNFが産生され、培養上清中に放出される。培地
のpHは、培養期間中約6.5〜7.4に維持することが好まし
い。分化誘導物質は、培養期間中存在させていてもよい
が、細胞がマクロフアージ様細胞に分化した後、例えば
培養開始後約0.5〜48時間目に除去するのが望ましい。
また、マクロフアージ様細胞に分化した細胞は、細胞が
培養容器面に付着するような条件下で培養することが重
要で、細胞が付着しないような条件下では、HUTNFの産
生はほとんど認められない。細胞がマクロフアージ様細
胞に分化し、培養容器面に付着する期間中の培養液に
は、動物血清を添加するのが望ましい。
〜５×106個/ml、好ましくは約５×105〜３×106個/ml
の割合で浮遊させたヒト白血病細胞を培養容器面1cm2当
り約２×104〜１×106個、好ましくは約１×105〜６×1
05個となるように植え込み、次いで、これらの細胞をマ
クロフアージ様細胞に分化させるのに有効な量の分化誘
導物質を添加する。なお、分化誘導物質は、細胞を植え
込み前にあらかじめ細胞浮遊液に添加しておいてもよ
い。分化誘導物質の有効量は、物質の種類、細胞の種
類、培養条件等により異なるが、一般に約５〜5000ng/m
l（培養液、以下同じ）、好ましくは約100〜2000ng/ml
である。細胞及び分化誘導物質も含む培養容器を約35〜
38℃、好ましくは約37℃、約５〜10％炭酸ガス含有空気
中、湿度約90〜100％で約24〜120時間培養することによ
り、HuTNFが産生され、培養上清中に放出される。培地
のpHは、培養期間中約6.5〜7.4に維持することが好まし
い。分化誘導物質は、培養期間中存在させていてもよい
が、細胞がマクロフアージ様細胞に分化した後、例えば
培養開始後約0.5〜48時間目に除去するのが望ましい。
また、マクロフアージ様細胞に分化した細胞は、細胞が
培養容器面に付着するような条件下で培養することが重
要で、細胞が付着しないような条件下では、HUTNFの産
生はほとんど認められない。細胞がマクロフアージ様細
胞に分化し、培養容器面に付着する期間中の培養液に
は、動物血清を添加するのが望ましい。
HuTNFの産生を増強するために、細胞の培養に際して
各種の物質を添加することができる。例えば、約１〜10
00μg/ml、好ましくは約10〜200μg/mlのグラムの陰性
菌由来のリポポリサツカライド（以下LPSと略記す
る）、約0.5〜5000ng/ml、好ましくは約50〜3000ng/ml
のビタミンＡ誘導体（例 ビタミンＡ酸，ビタミンＡア
ルコール，ビタミンＡアルデヒド，ビタミンＡアセテー
ト，ビタミンＡパルミテート）、約0.3〜2v/v％、好ま
しくは約1v/v％のジメチルスルホキシド（以下DMSOと略
記する）、約0.1〜5w/v％、好ましくは約1w/v％のペプ
トン〔例 プロテオース・ペプトン（デイフコ社，米
国），ポリペプトン（大五栄養）〕又はカゼイン加水分
分解物（例 カザミノ酸）、約２〜20mMの酪酸塩（例
ナトリウム塩），約0.1〜５μg/mlのインシユリン、約
0.1〜2nMのヒドロコーチゾンをそれぞれ単独で、あるい
は適宜組み合わせて添加することにより、HuTNFの産生
を増強することができる。これらHuTNF酸産増強物質の
うちでは、LPS、ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルコー
ル，ビタミンＡアルデビド、特にビタミンＡ酸のような
ビタミンＡ誘導体、DMSO、ペプトン、カゼイン加水分解
物が特に好ましい。
各種の物質を添加することができる。例えば、約１〜10
00μg/ml、好ましくは約10〜200μg/mlのグラムの陰性
菌由来のリポポリサツカライド（以下LPSと略記す
る）、約0.5〜5000ng/ml、好ましくは約50〜3000ng/ml
のビタミンＡ誘導体（例 ビタミンＡ酸，ビタミンＡア
ルコール，ビタミンＡアルデヒド，ビタミンＡアセテー
ト，ビタミンＡパルミテート）、約0.3〜2v/v％、好ま
しくは約1v/v％のジメチルスルホキシド（以下DMSOと略
記する）、約0.1〜5w/v％、好ましくは約1w/v％のペプ
トン〔例 プロテオース・ペプトン（デイフコ社，米
国），ポリペプトン（大五栄養）〕又はカゼイン加水分
分解物（例 カザミノ酸）、約２〜20mMの酪酸塩（例
ナトリウム塩），約0.1〜５μg/mlのインシユリン、約
0.1〜2nMのヒドロコーチゾンをそれぞれ単独で、あるい
は適宜組み合わせて添加することにより、HuTNFの産生
を増強することができる。これらHuTNF酸産増強物質の
うちでは、LPS、ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルコー
ル，ビタミンＡアルデビド、特にビタミンＡ酸のような
ビタミンＡ誘導体、DMSO、ペプトン、カゼイン加水分解
物が特に好ましい。
これらの物質の好ましい添加時期は次の通りである。
LPSは、細胞の全培養期間中存在させていてもよいが、
細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着した後に、添加するのが望ましい。ビタミンＡ誘導体
は、細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面
に付着しつつある期間中存在させるのが望ましい。DMSO
は、特にHL−60細胞によるHuTNF産生に対して有効で、
ビタミンＡ誘導体の場合と同様の時期に添加するのが望
ましいが、分化誘導物質を作用させる前にHL−60細胞を
DMSOで処理してもよい。ペプトン及びカゼイン加水分解
物の添加時期は、細胞がマクロフアージ様細胞に分化
し、培養容器面に付着しつつある期間中であつても、そ
の後であつてもよい。酪酸塩は、HL−60及びMono−１−
207細胞によるHuTNF産生に対して有効で、細胞がマクロ
フアージ様細胞に分化し、培養容器面に付着した後に、
添加するのが望ましい。インシユリン及びヒドロコーチ
ゾンは、HL−60細胞によるHuTNF産生に対して有効で、
細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着しつつある期間中存在させるのが望ましい。
LPSは、細胞の全培養期間中存在させていてもよいが、
細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着した後に、添加するのが望ましい。ビタミンＡ誘導体
は、細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面
に付着しつつある期間中存在させるのが望ましい。DMSO
は、特にHL−60細胞によるHuTNF産生に対して有効で、
ビタミンＡ誘導体の場合と同様の時期に添加するのが望
ましいが、分化誘導物質を作用させる前にHL−60細胞を
DMSOで処理してもよい。ペプトン及びカゼイン加水分解
物の添加時期は、細胞がマクロフアージ様細胞に分化
し、培養容器面に付着しつつある期間中であつても、そ
の後であつてもよい。酪酸塩は、HL−60及びMono−１−
207細胞によるHuTNF産生に対して有効で、細胞がマクロ
フアージ様細胞に分化し、培養容器面に付着した後に、
添加するのが望ましい。インシユリン及びヒドロコーチ
ゾンは、HL−60細胞によるHuTNF産生に対して有効で、
細胞がマクロフアージ様細胞に分化し、培養容器面に付
着しつつある期間中存在させるのが望ましい。
HuTNF産生増強物質の特に好ましい組み合わせは、ビ
タミンＡ酸とLPSあるいはビタミンＡ酸，ペプトンとLPS
である。
タミンＡ酸とLPSあるいはビタミンＡ酸，ペプトンとLPS
である。
HuTNF産生に充分な期間培養した後、培養上清を収集
し、遠心分離により細胞屑を除去すれば、HuTNFを含む
溶液が得られる。このHuTNFを含む溶液を生化学的分離
操作における常法、例えば限外過による濃縮，透析脱
塩，陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフイ
ー，ゲル過，電気泳動等を適宜組み合わせて精製する
ことにより、精製HuTNFを得ることができる。
し、遠心分離により細胞屑を除去すれば、HuTNFを含む
溶液が得られる。このHuTNFを含む溶液を生化学的分離
操作における常法、例えば限外過による濃縮，透析脱
塩，陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフイ
ー，ゲル過，電気泳動等を適宜組み合わせて精製する
ことにより、精製HuTNFを得ることができる。
HuTNF活性の測定は、in vitroで癌細胞を損害する効
果を測定するin vitro法とin vivoで癌組織を壊死させ
る効果を測定するin vivo法の両方法により行つた。
果を測定するin vitro法とin vivoで癌組織を壊死させ
る効果を測定するin vivo法の両方法により行つた。
本発明者らが用いているin vitro法は、RUffらの方法
〔J.Immunol.,125,1671（1980）〕を改良したものであ
り、HuTNFがＬ細胞の亜株であるＬ−Ｍ細胞（アメリカ
ン・タイプ・カルチヤーコレクシヨンCCL1.2）を傷害す
る効果を測定するものである。すなわち、順次培地で希
釈したHuTNF試料0.1ml,4μg/mlのアクチノマイシンＤ溶
液0.05ml及び１×106個/mlの濃度のＬ−Ｍ細胞浮遊液0.
05mlを96穴の平底型組織培養用マイクロプレート（フロ
ウ社，米国）の各穴に加える。培地には1v/v％のウシ胎
児血清（以下FBSと略記する）を含むイーグルのMEM培地
を用いる。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空
気中、37℃で24時間培養する。培養終了後、25％グルタ
ルアルデヒド水溶液20μｌを加えて生き残つた細胞を固
定し、次いで0.05％メチレンブルー水溶液0.1mlを加え
て染色する。マイクロプレートを水で充分に洗い、乾燥
後、0.36N塩酸0.2mlを加えて細胞からメチレンブルーを
抽出する。この抽出液の665nmにおける吸光度をタイタ
ーテツク・マルチスキヤン（フロウ社）で測定する。こ
の吸光度は、生き残つた細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞
の50％を傷害するために必要な生理活性量を１単位
（Ｕ）/mlと定義し、試料を加えない対照の吸光度の50
％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算
によつて求め、その希釈率の逆数を試料の生理活性量
（単位/ml又はU/mlで表記）とする。以下、本発明にお
けるHuTNFのin vitro活性は、すべてこの単位で表示さ
れる。
〔J.Immunol.,125,1671（1980）〕を改良したものであ
り、HuTNFがＬ細胞の亜株であるＬ−Ｍ細胞（アメリカ
ン・タイプ・カルチヤーコレクシヨンCCL1.2）を傷害す
る効果を測定するものである。すなわち、順次培地で希
釈したHuTNF試料0.1ml,4μg/mlのアクチノマイシンＤ溶
液0.05ml及び１×106個/mlの濃度のＬ−Ｍ細胞浮遊液0.
05mlを96穴の平底型組織培養用マイクロプレート（フロ
ウ社，米国）の各穴に加える。培地には1v/v％のウシ胎
児血清（以下FBSと略記する）を含むイーグルのMEM培地
を用いる。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空
気中、37℃で24時間培養する。培養終了後、25％グルタ
ルアルデヒド水溶液20μｌを加えて生き残つた細胞を固
定し、次いで0.05％メチレンブルー水溶液0.1mlを加え
て染色する。マイクロプレートを水で充分に洗い、乾燥
後、0.36N塩酸0.2mlを加えて細胞からメチレンブルーを
抽出する。この抽出液の665nmにおける吸光度をタイタ
ーテツク・マルチスキヤン（フロウ社）で測定する。こ
の吸光度は、生き残つた細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞
の50％を傷害するために必要な生理活性量を１単位
（Ｕ）/mlと定義し、試料を加えない対照の吸光度の50
％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算
によつて求め、その希釈率の逆数を試料の生理活性量
（単位/ml又はU/mlで表記）とする。以下、本発明にお
けるHuTNFのin vitro活性は、すべてこの単位で表示さ
れる。
in vivoでのHuTNF活性の測定は、Carswullらの方法
〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA.72,3666（1975）〕に準じて
行つた。この方法は、移植したMeth A肉腫細胞による癌
をHuTNFが壊死させる効果を測定するものである。すな
わち、BALB/cマウスの腹部皮内に２×105個のMeth A肉
腫細胞を移植し、７日後、形成された癌の大きさが直径
７〜8mmとなり、自然発生的な出血性壊死などがなく、
良好な血行状態にある癌を有するマウスを選び、尾静脈
あるいは癌組織内にHuTNF試料を注射し、24時間後に次
の判定基準により試料のHuTNF活性を測定する。
〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA.72,3666（1975）〕に準じて
行つた。この方法は、移植したMeth A肉腫細胞による癌
をHuTNFが壊死させる効果を測定するものである。すな
わち、BALB/cマウスの腹部皮内に２×105個のMeth A肉
腫細胞を移植し、７日後、形成された癌の大きさが直径
７〜8mmとなり、自然発生的な出血性壊死などがなく、
良好な血行状態にある癌を有するマウスを選び、尾静脈
あるいは癌組織内にHuTNF試料を注射し、24時間後に次
の判定基準により試料のHuTNF活性を測定する。
（−）：変化なし （＋）：かすかな出血性壊死 （）：中程度の出血性壊死（移植癌表面の真中から50
％以上にわたつて壊死） （）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度に壊
死し、周囲の癌組織がなずかに残つた状態） 次に実験例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお以下の記載において、「％」は特に記載しない
限り容量パーセント（v/v％）を表す。また、特に記載
しない限り、培養は37℃、湿度90〜100％、５％炭酸ガ
ス含有空気中で行い、HuTNF活性の測定はin vitro法で
行つた。
％以上にわたつて壊死） （）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度に壊
死し、周囲の癌組織がなずかに残つた状態） 次に実験例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお以下の記載において、「％」は特に記載しない
限り容量パーセント（v/v％）を表す。また、特に記載
しない限り、培養は37℃、湿度90〜100％、５％炭酸ガ
ス含有空気中で行い、HuTNF活性の測定はin vitro法で
行つた。
実験例１ HuTNF産生に及ぼす各種培地の影響 10％のFBS（フロウ社）を含む各種培地（いずれもフ
ロウ社製）に、HL−60細胞を１×106個/mlとなるように
浮遊された。この細胞浮遊液10mlを直径8cmのプラスチ
ツク製ペトデイツシユ（コーニング社，米国）に植え込
み、TPA（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社，米国）を100ng/m
lとなるように添加したデイツシユと添加しないデイツ
シユをつくり、37℃、５％炭酸ガス含有空気中で48時間
培養しない。次いで、TPAを含まない新鮮培地10mlと置
き換え、10μg/mlのLPS（大腸菌026:B6由来，デイフユ
社）の存在下あるいは非存在下で更に24時間培養を続け
た後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表１
に示す。
ロウ社製）に、HL−60細胞を１×106個/mlとなるように
浮遊された。この細胞浮遊液10mlを直径8cmのプラスチ
ツク製ペトデイツシユ（コーニング社，米国）に植え込
み、TPA（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社，米国）を100ng/m
lとなるように添加したデイツシユと添加しないデイツ
シユをつくり、37℃、５％炭酸ガス含有空気中で48時間
培養しない。次いで、TPAを含まない新鮮培地10mlと置
き換え、10μg/mlのLPS（大腸菌026:B6由来，デイフユ
社）の存在下あるいは非存在下で更に24時間培養を続け
た後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表１
に示す。
表１から明らかなように、TPAを添加しない場合にはH
uTNFは全く産生されず、TPAが存在する場合にはいずれ
の培地中でもHuTNFは産生されたが、RPMR−1640培地,19
9培地,High GEM培地とHam F12培地の等容量混合培地で
のHuTNF産生が多かつた。また、いずれの培地において
もLPS添加によりHuTNF産生が増強された。
uTNFは全く産生されず、TPAが存在する場合にはいずれ
の培地中でもHuTNFは産生されたが、RPMR−1640培地,19
9培地,High GEM培地とHam F12培地の等容量混合培地で
のHuTNF産生が多かつた。また、いずれの培地において
もLPS添加によりHuTNF産生が増強された。
実験例２ HuTNF産生に及ぼす細胞密度の影響 HL−60,THP−１あるいはMono−１−207細胞を直径8cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユに２〜30×106個植
え込み、TPAで48時間処理後LPSを添加して培養した後の
培養上清中のHuTNF活性を測定した。培地として、10％F
BSを含むRPMI−1640培地（デイツシユ当り10ml）を用
い、TPA,LPSの濃度及びその他の条件は実験例１の場合
と同じであつた。結果を表２に示す。
のプラスチツク製ペトリデイツシユに２〜30×106個植
え込み、TPAで48時間処理後LPSを添加して培養した後の
培養上清中のHuTNF活性を測定した。培地として、10％F
BSを含むRPMI−1640培地（デイツシユ当り10ml）を用
い、TPA,LPSの濃度及びその他の条件は実験例１の場合
と同じであつた。結果を表２に示す。
表２から明らかなように、HuTNF産生量はデイツシユ
当り10〜30×106個の細胞数のときが最も多かつた。
当り10〜30×106個の細胞数のときが最も多かつた。
実施例３ HuTNF産生に及ぼすTPA処理時間の影響 HL−60,THM−１あるいはMono−１−207細胞を直径8cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、100ng/mlのTPAを添加して1,6,24及び48時間培養し
た後、TPAを含まない新鮮培地と置き換えた。培養開始
後48時間目にすべてのデイツシユの培地を除去し、１μ
g/mlのLPS含有あるいは非含有新鮮培地と再び置き換
え、その24時間後の培養上清中のHuTNF活性を測定し
た。結果を表３に示す。
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、100ng/mlのTPAを添加して1,6,24及び48時間培養し
た後、TPAを含まない新鮮培地と置き換えた。培養開始
後48時間目にすべてのデイツシユの培地を除去し、１μ
g/mlのLPS含有あるいは非含有新鮮培地と再び置き換
え、その24時間後の培養上清中のHuTNF活性を測定し
た。結果を表３に示す。
表３から明らなように、各細胞とも１〜48時間のいず
れのTPA処理時間でもHuTNFを産生したが、HL−60細胞で
は24時間、THP−１細胞では48時間、Mono−１−207細胞
では１〜24時間のTPA処理が最も多量のHuTNFを産生させ
た。
れのTPA処理時間でもHuTNFを産生したが、HL−60細胞で
は24時間、THP−１細胞では48時間、Mono−１−207細胞
では１〜24時間のTPA処理が最も多量のHuTNFを産生させ
た。
実験例４ HuTNF産生に及ぼすTPA濃度の影響 HL−60,THP−１あるいはMono−１−207細胞を直径8cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、５〜2000ng/mlのTPAを添加して48時間培養した後、
TPAを含まない新鮮培地と置き換えた。10μg/mlのLPS存
在下あるいは非存在下でHL−60及びMono−１−207細胞
についてはその後24時間、THP−１細胞についてはその
後48時間培養を続けた後培養上清中のHuTNF活性を測定
した。なお、培地としてHigh GEM培地とHam F12培地の
等容量混合培地を使用した。結果を表４に示す。
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、５〜2000ng/mlのTPAを添加して48時間培養した後、
TPAを含まない新鮮培地と置き換えた。10μg/mlのLPS存
在下あるいは非存在下でHL−60及びMono−１−207細胞
についてはその後24時間、THP−１細胞についてはその
後48時間培養を続けた後培養上清中のHuTNF活性を測定
した。なお、培地としてHigh GEM培地とHam F12培地の
等容量混合培地を使用した。結果を表４に示す。
表４から明らかなように、各細胞とも５〜2000ng/ml
のいずれのTPA濃度でもHuTNFを産生したが、HL−60細胞
では100〜2000ng/ml,THP−１細胞では2000ng/ml,Mono−
１−207細胞では20〜100ng/mlのTPA濃度が最も多量のHu
TNFを産生させた。
のいずれのTPA濃度でもHuTNFを産生したが、HL−60細胞
では100〜2000ng/ml,THP−１細胞では2000ng/ml,Mono−
１−207細胞では20〜100ng/mlのTPA濃度が最も多量のHu
TNFを産生させた。
実験例５ 種々の化合物のHuTNF産生誘導効果 HL−60,THP−１あるいはMono−１−207細胞を直径8cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、表５に示す各種化合物100ng/ml及びLPS10μg/mlを
添加して培養した。HL−60細胞については72時間後、TH
P−１細胞については96時間後、Mono−１−207細胞につ
いては48時間後に、培養上清中のHuTNF活性を測定し
た。同時に顕微鏡で細胞を観察し、細胞が培養器壁に付
着しているか否かでマクロフアージへの分化誘導能の有
無を調べた。結果を表５に示す。
のプラスチツク製ペトリデイツシユに１×107個植え込
み、表５に示す各種化合物100ng/ml及びLPS10μg/mlを
添加して培養した。HL−60細胞については72時間後、TH
P−１細胞については96時間後、Mono−１−207細胞につ
いては48時間後に、培養上清中のHuTNF活性を測定し
た。同時に顕微鏡で細胞を観察し、細胞が培養器壁に付
着しているか否かでマクロフアージへの分化誘導能の有
無を調べた。結果を表５に示す。
なお、表５中の略号のうちで前出以外のものは次の通
りである。
りである。
PHR:ホルボール MPMA:4−Ｏ−メチルホルボール−12−ミリステート−13
−アセテート ４αPDD:4α−ホルボール−12,13−ジデカノエート 表５から明らかなように、HL−60及びTHP−１細胞に
関しては、TPA,PDD,PDBz,PDA,MEZ,TCDにHuTNF産生誘導
効果が認められ、Mono−１−207細胞に関しては、PHR及
び４αPDDを除くすべての化合物にHuTNF産生誘導効果が
認められた。各細胞ともTPA,PDD及びPDBzに強いHuTNF産
生誘導効果が認められたが、Mono−１−207細胞に関し
てはMEZにも強いHuTNF産生誘導効果が認められた。な
お、分化誘導能の有無とHuTNF産生誘導能の有無とは完
全に一致していた。
−アセテート ４αPDD:4α−ホルボール−12,13−ジデカノエート 表５から明らかなように、HL−60及びTHP−１細胞に
関しては、TPA,PDD,PDBz,PDA,MEZ,TCDにHuTNF産生誘導
効果が認められ、Mono−１−207細胞に関しては、PHR及
び４αPDDを除くすべての化合物にHuTNF産生誘導効果が
認められた。各細胞ともTPA,PDD及びPDBzに強いHuTNF産
生誘導効果が認められたが、Mono−１−207細胞に関し
てはMEZにも強いHuTNF産生誘導効果が認められた。な
お、分化誘導能の有無とHuTNF産生誘導能の有無とは完
全に一致していた。
実験例６ HuTNF産生に及ぼす各種分化誘導物質の濃度の影響 HL−60細胞を直径8cmのプラスチツク製ペトリデイツ
シユに１×107個植え込み、PDBz,PDD,MEZあるいはTCDを
種々の濃度で添加し48時間培養した。次いで、分化誘導
物質を含まない新鮮培地と置き換え、10μg/mlのLPSの
存在下あるいは非存在下で更に24時間培養を続けた後、
培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表６に示
す。
シユに１×107個植え込み、PDBz,PDD,MEZあるいはTCDを
種々の濃度で添加し48時間培養した。次いで、分化誘導
物質を含まない新鮮培地と置き換え、10μg/mlのLPSの
存在下あるいは非存在下で更に24時間培養を続けた後、
培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表６に示
す。
表６から明らかなように、PDBz及びTCDは100ng/ml以
上の濃度で、PDD及びMEZは20ng/ml以上の濃度でHuTNF産
生を誘導した。PDBzは2000ng/ml,PDDは500〜2000ng/ml,
MEZ及びTCDは500ng/mlの濃度で最も多量のHuTNFを産生
させた。
上の濃度で、PDD及びMEZは20ng/ml以上の濃度でHuTNF産
生を誘導した。PDBzは2000ng/ml,PDDは500〜2000ng/ml,
MEZ及びTCDは500ng/mlの濃度で最も多量のHuTNFを産生
させた。
実験例７ HL−60細胞によるHuTNF産生に対するDMSO及びビタミン
Ａ酸の増強効果 １％DMSOで３日間前処理したHL−60細胞あるいは非前
処理HL−60細胞を直径8cmのプラスチツク製ペトリデイ
ツシユに１×107個植え込み、500ng/mlのTPAを添加し、
更に0.1〜１％のDSMOあるいは50〜1000ng/mlのビタミン
Ａ酸を添加して48時間培養した。次いで、10μg/mlのLP
Sを含む新鮮培地と置き換え、更に24時間培養を続けた
後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表７に
示す。
Ａ酸の増強効果 １％DMSOで３日間前処理したHL−60細胞あるいは非前
処理HL−60細胞を直径8cmのプラスチツク製ペトリデイ
ツシユに１×107個植え込み、500ng/mlのTPAを添加し、
更に0.1〜１％のDSMOあるいは50〜1000ng/mlのビタミン
Ａ酸を添加して48時間培養した。次いで、10μg/mlのLP
Sを含む新鮮培地と置き換え、更に24時間培養を続けた
後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表７に
示す。
表７から明らかなように、DMSOは0.3〜１％の濃度
で、DMSO前処理あるいは非前処理HL−60細胞によるHuTN
F産生に対して増強効果を示したが、１％のときがより
強い増強効果を示した。一方、ビタミンＡ酸は50〜1000
ng/mlの濃度で、両細胞によるHuTNF産生に対して著しい
増強効果を示した。また、DMSO前処理HL−60細胞は、DM
SO又はビタミンＡ酸を添加しないとき、あるいはこれら
の濃度が低いときに、DMSO非前処理HL−60細胞よりも多
量のHuTNFを産生した。
で、DMSO前処理あるいは非前処理HL−60細胞によるHuTN
F産生に対して増強効果を示したが、１％のときがより
強い増強効果を示した。一方、ビタミンＡ酸は50〜1000
ng/mlの濃度で、両細胞によるHuTNF産生に対して著しい
増強効果を示した。また、DMSO前処理HL−60細胞は、DM
SO又はビタミンＡ酸を添加しないとき、あるいはこれら
の濃度が低いときに、DMSO非前処理HL−60細胞よりも多
量のHuTNFを産生した。
実験例８ HuTNF産生に対するビタミンＡの増強効果 HL−60あるいはTHP−１細胞を直結8cmのプラスチツク
製ペトリデイツシユに１×107個植え込み、TPA又はPDBz
を表８に示す濃度で添加し、更に各種濃度のビタミンＡ
酸を添加して48時間培養した。次いで、10μg/mlのLPS
を含む新鮮培地と置き換え、HL−60細胞ではその後24時
間、またTHP−１細胞ではその後48時間培養を続けた
後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表８に
示す。
製ペトリデイツシユに１×107個植え込み、TPA又はPDBz
を表８に示す濃度で添加し、更に各種濃度のビタミンＡ
酸を添加して48時間培養した。次いで、10μg/mlのLPS
を含む新鮮培地と置き換え、HL−60細胞ではその後24時
間、またTHP−１細胞ではその後48時間培養を続けた
後、培養上清中のHuTNF活性を測定した。結果を表８に
示す。
表８から明らかなように、ビタミンＡ酸は、HL−60及
びTHP−１細胞によるHuTNF産生に対して、分化誘導物質
の種類に関係なく５〜1000ng/mlではその濃度に依存し
て増強効果を示した。
びTHP−１細胞によるHuTNF産生に対して、分化誘導物質
の種類に関係なく５〜1000ng/mlではその濃度に依存し
て増強効果を示した。
実験例９ HuTNFの移植Meth A肉腫に対する効果 後記実施例1,4及び６でLPSを添加しなかつたデイツシ
ユから得られた培養上清を、それぞれ限外過膜PM10
（アミコン社，米国）を用いて濃縮した後、in vivo法
でHuTNFの活性を測定した。試料は癌組織内に投与し、
付与24時間後の癌壊死効果を調べた。また、投与15日目
までに移植した癌が完全に消失したかどうかも調べた。
結果を表９に示す。
ユから得られた培養上清を、それぞれ限外過膜PM10
（アミコン社，米国）を用いて濃縮した後、in vivo法
でHuTNFの活性を測定した。試料は癌組織内に投与し、
付与24時間後の癌壊死効果を調べた。また、投与15日目
までに移植した癌が完全に消失したかどうかも調べた。
結果を表９に示す。
表９から明らかなように、いずれの細胞から産生され
るHuTNFも2000単位／マウスの投与量で、癌組織を24時
間以内に壊死させ、その後宿主動物に何ら影響を及ぼす
ことなく癌組織を完全に消失させた。なお、実施例1,4
及び６でLPSを添加したデイツシユから得られた培養上
清をゲル過に付してLPSを除いたもほについても、同
様の効果が認められた。
るHuTNFも2000単位／マウスの投与量で、癌組織を24時
間以内に壊死させ、その後宿主動物に何ら影響を及ぼす
ことなく癌組織を完全に消失させた。なお、実施例1,4
及び６でLPSを添加したデイツシユから得られた培養上
清をゲル過に付してLPSを除いたもほについても、同
様の効果が認められた。
実施例１ 培養容器として、50枚の直径8cmのプラスチツク製ペ
トリデイツシユを用いた。また培地として、High GEM培
地とHam F12培地の等容量混合培地に10％のFBS,50単位/
mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシンを添
加して調製したものを用いた。
トリデイツシユを用いた。また培地として、High GEM培
地とHam F12培地の等容量混合培地に10％のFBS,50単位/
mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシンを添
加して調製したものを用いた。
１×106個/mlの細胞密度のHL−60細胞浮遊液を上記培
地で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、TPA
を500ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有
空気中で24時間培養した。培養液を除去し、TPAを含ま
ない血清不含の新鮮培地10mlと置き換えた。更に24時間
培養した後、LPSを10μg/mlとなるように添加したデイ
ツシユと添加しないデイツシユをつくり培養を続けた。
24時間後に各デイツシユの培養上清を収集し、3000回転
／分で10分間遠心した後、上清中のHuTNF活性を測定し
た。その結果、各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを添加
したものでは289単位/m,LPSを添加しなかつたものでは2
20単位/mlであつた。
地で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、TPA
を500ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有
空気中で24時間培養した。培養液を除去し、TPAを含ま
ない血清不含の新鮮培地10mlと置き換えた。更に24時間
培養した後、LPSを10μg/mlとなるように添加したデイ
ツシユと添加しないデイツシユをつくり培養を続けた。
24時間後に各デイツシユの培養上清を収集し、3000回転
／分で10分間遠心した後、上清中のHuTNF活性を測定し
た。その結果、各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを添加
したものでは289単位/m,LPSを添加しなかつたものでは2
20単位/mlであつた。
実施例２ 培養容器として、数枚の直径8cmのプラスチツク製ペ
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
１×106個/mlの細胞密度のHL−60細胞浮遊液を上記培
地で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、PDBz
及びビタミンＡ酸をそれぞれ2000ng/ml及び1000ng/mlと
なるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有空気中で48時
間培養した。培養液を除去し、PDBzを含まない新鮮培地
（FBSの添加量を１％に減じたもの）10mlと置き換え、L
PSを10μg/mlとなるように添加いたデイツシユと添加し
ないデイツシユをつくり培養を続けた。24時間後に各デ
イツシユの培養上清を収集し、3000回転／分で10分間遠
心した後、上清中のHuTNF活性を測定した。その結果、
各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを添加したものでは16
83単位/ml,LPSを添加しなかつたものでは1076単位/mlで
あつた。
地で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、PDBz
及びビタミンＡ酸をそれぞれ2000ng/ml及び1000ng/mlと
なるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有空気中で48時
間培養した。培養液を除去し、PDBzを含まない新鮮培地
（FBSの添加量を１％に減じたもの）10mlと置き換え、L
PSを10μg/mlとなるように添加いたデイツシユと添加し
ないデイツシユをつくり培養を続けた。24時間後に各デ
イツシユの培養上清を収集し、3000回転／分で10分間遠
心した後、上清中のHuTNF活性を測定した。その結果、
各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを添加したものでは16
83単位/ml,LPSを添加しなかつたものでは1076単位/mlで
あつた。
実施例３ 培養容器として、数枚の直径8cmのプラスチツク製ペ
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
ものと同じものを用いた。
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
ものと同じものを用いた。
１×106個/mlの細胞密度のMono−１−207細胞浮遊液
を培地して調製し、その10mlを各デイツシユに植え込
み、TPAを100ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸
ガス含有空気中で24時間培養した。培養液を除去し、TP
Aを含まない血清不含の新鮮培地10mlと置き換えLPSを10
μg/mlとなるように添加したデイツシユと添加しないデ
イツシユをつくり培養を続けた。24時間後に各デイツシ
ユの培養上清を収集し、3000回転／分で10分間遠心した
後、上清中のHuTNF活性を測定した。その結果、各培養
上清中のHuTNF活性は、LPSを添加したものでは348単位/
ml、LPSを添加しなかつたものでは290単位/mlであつ
た。
を培地して調製し、その10mlを各デイツシユに植え込
み、TPAを100ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸
ガス含有空気中で24時間培養した。培養液を除去し、TP
Aを含まない血清不含の新鮮培地10mlと置き換えLPSを10
μg/mlとなるように添加したデイツシユと添加しないデ
イツシユをつくり培養を続けた。24時間後に各デイツシ
ユの培養上清を収集し、3000回転／分で10分間遠心した
後、上清中のHuTNF活性を測定した。その結果、各培養
上清中のHuTNF活性は、LPSを添加したものでは348単位/
ml、LPSを添加しなかつたものでは290単位/mlであつ
た。
実施例４ 培養容器として、50枚の直径8cmのプラスチツク製ペ
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
トリデイツシユを用い、培地として実施例１で使用した
のと同じものを用いた。
１×106個/mlの細胞密度のTHP−１細胞浮遊液を培地
で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、TPA及
びビタミンＡ酸をそれぞれ1000ng/mlとなるように添加
し、37℃,5％炭酸ガス含有空気中で48時間培養した。培
養液を除去し、TPAを含まない新鮮培地（FBSの添加量を
１％に減じたもの）10mlと置き換え、LPSを10μg/mlと
なるように添加したデイツシユと添加しないデイツシユ
をつくり培養を続けた。48時間後に各デイツシユの培養
上清を収集し、3000回転／分で10分間遠心した後、上清
中のHuTNF活性を測定した。その結果、各培養上清中のH
uTNF活性は、LPSを添加したものでは3814単位/ml、LPS
を添加しなかつたものでは2141単位/mlであつた。
で調製し、その10mlを各デイツシユに植え込み、TPA及
びビタミンＡ酸をそれぞれ1000ng/mlとなるように添加
し、37℃,5％炭酸ガス含有空気中で48時間培養した。培
養液を除去し、TPAを含まない新鮮培地（FBSの添加量を
１％に減じたもの）10mlと置き換え、LPSを10μg/mlと
なるように添加したデイツシユと添加しないデイツシユ
をつくり培養を続けた。48時間後に各デイツシユの培養
上清を収集し、3000回転／分で10分間遠心した後、上清
中のHuTNF活性を測定した。その結果、各培養上清中のH
uTNF活性は、LPSを添加したものでは3814単位/ml、LPS
を添加しなかつたものでは2141単位/mlであつた。
実施例５ 培養容器としては、数枚の直径8cmのプラスチツク製
ペトリデイツシユを用い、培地として10％FBSを含むRPM
I−1640培地を用いた。
ペトリデイツシユを用い、培地として10％FBSを含むRPM
I−1640培地を用いた。
５×105個/mlの細胞密度のTHP−１細胞浮遊液を培地
で調製し、その20mlを各デイツシユに植え込み、TPAを2
00ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有空
気中で１時間培養した。培養液を除去し、TPAを含まな
い新鮮培地20mlと置き換え、ポリペプトン及びビタミン
Ａ酸をそれぞれ1w/v％及び3000ng/mlになるように添加
し、48時間培養を続けた。培養液の半量を除去し、新鮮
倍地10mlを加え、LPSを10μg/mlとなるように添加した
デイツシユと添加しないデイツシユをつくり培養を続け
た。16時間後に各デイツシユの培養上清を収集し、3000
回転／分で10分間遠心した後、上清中のHuTNF活性を測
定した。その結果、各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを
添加したものでは1607単位/ml、LPSを添加しなかつたも
のでは958単位/mlであつた。
で調製し、その20mlを各デイツシユに植え込み、TPAを2
00ng/mlとなるように添加し、37℃,5％炭酸ガス含有空
気中で１時間培養した。培養液を除去し、TPAを含まな
い新鮮培地20mlと置き換え、ポリペプトン及びビタミン
Ａ酸をそれぞれ1w/v％及び3000ng/mlになるように添加
し、48時間培養を続けた。培養液の半量を除去し、新鮮
倍地10mlを加え、LPSを10μg/mlとなるように添加した
デイツシユと添加しないデイツシユをつくり培養を続け
た。16時間後に各デイツシユの培養上清を収集し、3000
回転／分で10分間遠心した後、上清中のHuTNF活性を測
定した。その結果、各培養上清中のHuTNF活性は、LPSを
添加したものでは1607単位/ml、LPSを添加しなかつたも
のでは958単位/mlであつた。
実施例６ 培地として、実施例１で使用したものと同じものを用
いた。
いた。
１×106個/mlの細胞密度のMono−１−207細胞浮遊液5
00mlを培地で調製し、容量1000mlのスピンナーフラスコ
（ベルコ社，米国）に入れ、PDBzを500ng/mlとなるよう
に添加した後、密封状態で37℃で撹拌しながら培養し
た。培養開始３時間後に、遠心操作（1000回転／分,5分
間）により細胞を集め、PDBzを含まない新鮮培地500ml
に再び浮遊させた。その細胞浮遊液を35mlずつ直径15cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユ12枚に植え込み、37
℃、５％炭酸ガス含有空気中で培養した。培養48時間後
に、６枚のデイツシユに10μg/mlとなるようにLPSを添
加し、更に24時間培養した。各デイツシユの培養上清を
収集し、3000回転／分で10分間遠心した後、上清中のHu
TNF活性を測定した。その結果、培養上清中のHuTNF活性
は、LPSを添加したものでは平均386単位/ml、LPSを添加
しなかつたものでは平均275単位/mlであつた。
00mlを培地で調製し、容量1000mlのスピンナーフラスコ
（ベルコ社，米国）に入れ、PDBzを500ng/mlとなるよう
に添加した後、密封状態で37℃で撹拌しながら培養し
た。培養開始３時間後に、遠心操作（1000回転／分,5分
間）により細胞を集め、PDBzを含まない新鮮培地500ml
に再び浮遊させた。その細胞浮遊液を35mlずつ直径15cm
のプラスチツク製ペトリデイツシユ12枚に植え込み、37
℃、５％炭酸ガス含有空気中で培養した。培養48時間後
に、６枚のデイツシユに10μg/mlとなるようにLPSを添
加し、更に24時間培養した。各デイツシユの培養上清を
収集し、3000回転／分で10分間遠心した後、上清中のHu
TNF活性を測定した。その結果、培養上清中のHuTNF活性
は、LPSを添加したものでは平均386単位/ml、LPSを添加
しなかつたものでは平均275単位/mlであつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭58−107197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−140726（ＪＰ，Ａ) 特表 昭57−500961（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，122（５）, 1785−1790（1979)
Claims (1)
- 【請求項１】マクロファージ様細胞に分化し得るヒト白
血病細胞を、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13
−アセテート、ホルボール−12,13−ジデカノエート、
ホルボール−12,13−ジベンゾエート、ホルボール12,13
−ジアセテート、メゼレイン及びテレオシジンからなる
群より選ばれる１種以上の物質の存在下に培養すること
を特徴とするヒト癌壊死因子の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58139228A JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58139228A JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030688A JPS6030688A (ja) | 1985-02-16 |
| JPH088873B2 true JPH088873B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=15240469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58139228A Expired - Lifetime JPH088873B2 (ja) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | ヒト癌壊死因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH088873B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288852A (en) * | 1984-03-06 | 1994-02-22 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| JPS6127923A (ja) * | 1984-07-17 | 1986-02-07 | Denichi Mizuno | ヒト腫瘍壊死因子の製造法 |
| JP2860098B2 (ja) * | 1997-06-06 | 1999-02-24 | 三洋化成工業株式会社 | ポリウレタン樹脂系スラッシュ成形用材料 |
| JP3327840B2 (ja) | 1998-07-06 | 2002-09-24 | 三洋化成工業株式会社 | ポリウレタン樹脂系スラッシュ成形用材料 |
| JP3014094B1 (ja) | 1998-09-28 | 2000-02-28 | 三洋化成工業株式会社 | ポリウレタン樹脂系スラッシュ成形用材料 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6011890B2 (ja) * | 1981-12-21 | 1985-03-28 | 株式会社林原生物化学研究所 | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS57140726A (en) * | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Purification of physiologically active substance having carcinostatic action |
| JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
-
1983
- 1983-07-28 JP JP58139228A patent/JPH088873B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２２（５），１７８５−１７９０（１９７９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6030688A (ja) | 1985-02-16 |
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