JPS61155330A - 蛋白質標品 - Google Patents
蛋白質標品Info
- Publication number
- JPS61155330A JPS61155330A JP59274573A JP27457384A JPS61155330A JP S61155330 A JPS61155330 A JP S61155330A JP 59274573 A JP59274573 A JP 59274573A JP 27457384 A JP27457384 A JP 27457384A JP S61155330 A JPS61155330 A JP S61155330A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tnf
- cells
- protein
- cell
- malignant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野〕
本発明は蛋白質標高に関し、詳しくはヒト腫瘍細胞を壊
死せしめる作用を有する蛋白質標高(ヒト腫瘍壊死因子
、以下rh−TNFJと記ず。)に関する。
死せしめる作用を有する蛋白質標高(ヒト腫瘍壊死因子
、以下rh−TNFJと記ず。)に関する。
h−TNFはヒト正常細胞には壊死作用を示さず、ヒト
腫瘍細胞のみを壊死せしめる。したがって、このh−T
NFは抗腫瘍剤として使用できる可能性がある。
腫瘍細胞のみを壊死せしめる。したがって、このh−T
NFは抗腫瘍剤として使用できる可能性がある。
腫瘍壊死因子(TNF)としては、マウス由来のJ77
4.1細胞を用いて各種蛋白性レクチン。
4.1細胞を用いて各種蛋白性レクチン。
リポポリサッカライド等の刺激剤と接触させて産生せし
めたマウスTNFが報告されている(J。
めたマウスTNFが報告されている(J。
IMNOL、Vo 1.l 22.N115.1785
(1979))が、ヒト細胞由来のh−TN Fについ
ては未だその存在すら知られていない。
(1979))が、ヒト細胞由来のh−TN Fについ
ては未だその存在すら知られていない。
(問題点を解決するための手段)
本発明者らは、ヒト悪性化卓球性細胞を分化誘導物質と
接触せしめた際に特異的に生産される蛋白質標高の1つ
にh−TNFが存在することを見出した。
接触せしめた際に特異的に生産される蛋白質標高の1つ
にh−TNFが存在することを見出した。
卓球性細胞としてはマクロファージが代表的なものであ
り、本発明の悪性化卓球性細胞としては、このような卓
球性細胞が自然にまたは人為的に悪性化されたもの及び
未分化の卓球性細胞が含まれる。より具体的には白血病
細胞及び骨髄細胞を人為的に悪性化したもの等がある。
り、本発明の悪性化卓球性細胞としては、このような卓
球性細胞が自然にまたは人為的に悪性化されたもの及び
未分化の卓球性細胞が含まれる。より具体的には白血病
細胞及び骨髄細胞を人為的に悪性化したもの等がある。
より具体的に例示すれば以下のものがある。ヒト前骨髄
性白血病細胞(HL−60ATCCCCL240゜Na
ture 270,347 (1977))、ヒト慢
性骨髄性白血病細胞(K 562 、 Blood↓]
。
性白血病細胞(HL−60ATCCCCL240゜Na
ture 270,347 (1977))、ヒト慢
性骨髄性白血病細胞(K 562 、 Blood↓]
。
321 (1975))、U−937ATCCCR,
L 1593.Int、J、Cancer 17゜5
65 (1976))、 ヒト急性骨髄性白血病細胞
(KGL、5cience 200.1153(19
78) ) 、 ML −1,Cancer Ras、
±2.5152 (1983))、CCRF−CEM
ATCCCCL 119.Cancer、18,5
52〜529゜(1965))、HPB−MLT、I
n t、J。
L 1593.Int、J、Cancer 17゜5
65 (1976))、 ヒト急性骨髄性白血病細胞
(KGL、5cience 200.1153(19
78) ) 、 ML −1,Cancer Ras、
±2.5152 (1983))、CCRF−CEM
ATCCCCL 119.Cancer、18,5
52〜529゜(1965))、HPB−MLT、I
n t、J。
Cancer、21,166 (197B)、HPB−
ALL、 T n t、 J、 Cancer、
21. 166(1977) 、 TALL
(Nature 267゜843、 (1977)
、 RPMI−8402゜J、 Natl、 Ca
ncer In5t、 55. 11 (1975
))及びTHP−1(Int、 J Cancer、
26. 171−176 (1980)) 。
ALL、 T n t、 J、 Cancer、
21. 166(1977) 、 TALL
(Nature 267゜843、 (1977)
、 RPMI−8402゜J、 Natl、 Ca
ncer In5t、 55. 11 (1975
))及びTHP−1(Int、 J Cancer、
26. 171−176 (1980)) 。
人為的に悪性化された骨髄細胞を得るには未成熟又は成
熟細胞を得る方法もまた通常の方法でよい(^ust、
J、 Exp、 Biol、 Med、 Sci、、
41 、287(1966))。
熟細胞を得る方法もまた通常の方法でよい(^ust、
J、 Exp、 Biol、 Med、 Sci、、
41 、287(1966))。
人為的に骨髄細胞を悪性化させる方法には、骨髄細胞を
N−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等
の変異物質に曝す方法あるいはX線、紫外線、T線等を
骨髄細胞に照射する方法、更にはレトロウィルス等によ
って骨髄細胞を形質転換する方法等がある。
N−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等
の変異物質に曝す方法あるいはX線、紫外線、T線等を
骨髄細胞に照射する方法、更にはレトロウィルス等によ
って骨髄細胞を形質転換する方法等がある。
分化誘導物質は、□悪性化卓球性細胞と接触した時、こ
の悪性化卓球性細胞をマクロファージ、顆粒球の卓球細
胞に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的
にはヘミン、アクチノマイシンD、ヘキサメチレンアク
ラミノマイシンA、テレオシジン、マイトマイシンC,
プレオマイシン。
の悪性化卓球性細胞をマクロファージ、顆粒球の卓球細
胞に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的
にはヘミン、アクチノマイシンD、ヘキサメチレンアク
ラミノマイシンA、テレオシジン、マイトマイシンC,
プレオマイシン。
プロピオン酸、酢酸ナトリウム、カダベリン、ツニカマ
イシン、12−0−テトラデカノイルフォルボール13
アセテート(TPA)、 γ−インターフェロン等の
リンフ才力イン、D−因子、アルギナーゼ、ヒストンH
1,リポポリサッカライド。
イシン、12−0−テトラデカノイルフォルボール13
アセテート(TPA)、 γ−インターフェロン等の
リンフ才力イン、D−因子、アルギナーゼ、ヒストンH
1,リポポリサッカライド。
脂質A、グルココルチコイド、1d−25−デバイドロ
オキシビタミンDz、ポリ (■)、ポリ(ADP−リ
ボース)、BCG、クロロキン等があげられる。
オキシビタミンDz、ポリ (■)、ポリ(ADP−リ
ボース)、BCG、クロロキン等があげられる。
分化8¥:、導物質により分化されたヒト悪性化卓球性
細胞とは上記のヒト悪性化卓球性細胞が上記分化誘導物
質と接触せしめられて生じた細胞であり、部分的卓球性
細胞に分化したもの及び実質的卓球性細胞に分化したも
のが含まれる。
細胞とは上記のヒト悪性化卓球性細胞が上記分化誘導物
質と接触せしめられて生じた細胞であり、部分的卓球性
細胞に分化したもの及び実質的卓球性細胞に分化したも
のが含まれる。
悪性化卓球性細胞を分化誘導物質に接触せしめる方法は
、たとえば悪性化卓球性細胞を分化誘導物質を含有する
培地に培養すればよい。悪性化卓球性細胞を培養してh
−TNFを生成せしめるには分化誘導物質が存在する条
件下で培養を続けてせしめた後、悪性化卓球性細胞を分
化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養してもよい
。後者の方法の場合、悪性化卓球性細胞を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加すればより良い結果が得
られることがある。
、たとえば悪性化卓球性細胞を分化誘導物質を含有する
培地に培養すればよい。悪性化卓球性細胞を培養してh
−TNFを生成せしめるには分化誘導物質が存在する条
件下で培養を続けてせしめた後、悪性化卓球性細胞を分
化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養してもよい
。後者の方法の場合、悪性化卓球性細胞を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加すればより良い結果が得
られることがある。
生体外刺激物質とは、ヒト細胞の細胞膜またはライソゾ
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外各種レクチン、
ビタミンA等がある。
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外各種レクチン、
ビタミンA等がある。
このような悪性化卓球性細胞を培養する培地は動物細胞
を培養する通常の培地のいずれもが用いられる。具体的
にはローズウェル・パーク・メモリアル・インスティテ
ユート1640培地(Rosewell Park M
emorial In5titute −1640、以
下、RPMI−1640と略す。)が好適であるが、他
にダルベツコ変法イーグル培地(Dulb、ecco’
s Modified Eagle Medium
)、イーグル基礎培地(Eagle’s旧nimum
Es5ential Medium。
を培養する通常の培地のいずれもが用いられる。具体的
にはローズウェル・パーク・メモリアル・インスティテ
ユート1640培地(Rosewell Park M
emorial In5titute −1640、以
下、RPMI−1640と略す。)が好適であるが、他
にダルベツコ変法イーグル培地(Dulb、ecco’
s Modified Eagle Medium
)、イーグル基礎培地(Eagle’s旧nimum
Es5ential Medium。
以下、MEM培地と略す。)、クリック培地(C11c
k Medium )なども用いられる。これらの培地
には胎児ウシ血清(以下FBSと略す。)や新生児ウシ
血清、ウマ血清などを添加して用いるのが望ましい。
k Medium )なども用いられる。これらの培地
には胎児ウシ血清(以下FBSと略す。)や新生児ウシ
血清、ウマ血清などを添加して用いるのが望ましい。
悪性化華球性細胞の培養は通常1〜5xlOb個/mβ
の細胞密度で35〜38°Cにて4〜6%炭酸ガス気流
中で行なう。
の細胞密度で35〜38°Cにて4〜6%炭酸ガス気流
中で行なう。
分化誘導物質は、通常培養当初より培地に含有もよいが
、同細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめ
てもよい。
、同細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめ
てもよい。
TNFは以下のように定性及び定量分析できる。
即ち、標的細胞であるL−929細胞(Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 Ll、 S、 A
、 72. 3666−3670)をMEM培地に5
%仔牛脂児血清を加え育成し、8XIO’細胞が100
μlの同上培地に含まれる様にし、96大の平底プレー
トに育種する。育種条件は37℃、2時間、5%Cot
、100%H,oで通常細胞培養に用いられる方法でよ
い。その後、アクチノマイソンD培地中に終濃度1μg
/ m /!となる様に加え、培養液の液量を150
μ2とする。即座にh−TNFを含むと考えられる検体
を適当にMEM培地で稀釈したものを50μl加える。
、 72. 3666−3670)をMEM培地に5
%仔牛脂児血清を加え育成し、8XIO’細胞が100
μlの同上培地に含まれる様にし、96大の平底プレー
トに育種する。育種条件は37℃、2時間、5%Cot
、100%H,oで通常細胞培養に用いられる方法でよ
い。その後、アクチノマイソンD培地中に終濃度1μg
/ m /!となる様に加え、培養液の液量を150
μ2とする。即座にh−TNFを含むと考えられる検体
を適当にMEM培地で稀釈したものを50μl加える。
この際、稀釈率を適宜調製してED50を求めることが
できる。更に、最終液量が200μrとなったL−92
9細胞を上記条件で18時間培養を′m続する。細胞壊
死活性は、まず全培地を除去し、ここに0.2%クリス
タルバイオレットの2%メチルアルコール溶液を加え固
定染色する。クリスタルバイオレットは全付核細胞を染
色し、h−TNFにより壊死し、フラスコ底面より遊離
した細胞は染色しないので、h−TNF活性を直接測定
できる。゛この染色度をOD590nmの吸収で測定し
、対照群に対する染色度と比較することによりh−TN
F活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。L−9
29細胞が50%生存できる検体原液の稀釈率のキ←〜
ヤ逆数に10−’を乗じた値を原液の1mlあたりの活
性とする。即ち、原液の1000分の1稀釈でED50
を与える検体の活性は1単位/ m I!、である。通
常の方法によりウサギ生体内でTNFを産生せしため場
合の活性は上述の定義によると、40単位/ m Rと
なる。また、マウス卓球性白血病細胞J774.1を種
々の方法によりTNF産生せしため場合、巳D50で上
限4〜5単位/ m 1の活性を培養上清中に示す。
できる。更に、最終液量が200μrとなったL−92
9細胞を上記条件で18時間培養を′m続する。細胞壊
死活性は、まず全培地を除去し、ここに0.2%クリス
タルバイオレットの2%メチルアルコール溶液を加え固
定染色する。クリスタルバイオレットは全付核細胞を染
色し、h−TNFにより壊死し、フラスコ底面より遊離
した細胞は染色しないので、h−TNF活性を直接測定
できる。゛この染色度をOD590nmの吸収で測定し
、対照群に対する染色度と比較することによりh−TN
F活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。L−9
29細胞が50%生存できる検体原液の稀釈率のキ←〜
ヤ逆数に10−’を乗じた値を原液の1mlあたりの活
性とする。即ち、原液の1000分の1稀釈でED50
を与える検体の活性は1単位/ m I!、である。通
常の方法によりウサギ生体内でTNFを産生せしため場
合の活性は上述の定義によると、40単位/ m Rと
なる。また、マウス卓球性白血病細胞J774.1を種
々の方法によりTNF産生せしため場合、巳D50で上
限4〜5単位/ m 1の活性を培養上清中に示す。
このようにして得られるh−TNF培養液は通常の蛋白
質の精製法に準じて精製され、本発明のh−TNFが精
製される。即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交
換クロマトグラフィー、塩析法5透析法、ゲル濾過法、
高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法等を順次又
は適宜組み合せることによって精製される。以下、更に
具体的に説明する。
質の精製法に準じて精製され、本発明のh−TNFが精
製される。即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交
換クロマトグラフィー、塩析法5透析法、ゲル濾過法、
高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法等を順次又
は適宜組み合せることによって精製される。以下、更に
具体的に説明する。
塩基性陰イオン交換体としてはDEAE−セファデック
スA−25,A−50,DEAE−セファロースCL−
68,DEAE−セファミル(以上、ファルマシア社製
)が好ましく、その他ジエチルアミノ基、アミノエチル
基又は四級化アミノエチル基含有陰イオン交換体等も使
用される。使用される緩衝液としてはpH6,0〜9.
0のトリス−塩酸塩又はリン酸緩衝液が望ましく、これ
ら0.05M程度の希薄な緩衝液でh−TNF培養液を
稀釈し、塩濃度0.1 M以下の溶液として陰イオン交
換体と接触せしめてh−TNFを吸着させる。
スA−25,A−50,DEAE−セファロースCL−
68,DEAE−セファミル(以上、ファルマシア社製
)が好ましく、その他ジエチルアミノ基、アミノエチル
基又は四級化アミノエチル基含有陰イオン交換体等も使
用される。使用される緩衝液としてはpH6,0〜9.
0のトリス−塩酸塩又はリン酸緩衝液が望ましく、これ
ら0.05M程度の希薄な緩衝液でh−TNF培養液を
稀釈し、塩濃度0.1 M以下の溶液として陰イオン交
換体と接触せしめてh−TNFを吸着させる。
h−TN Fの溶出はO11〜0.2Mの食塩又は塩化
カリウム等の塩類溶液で行われ、h−TN Fは1ン 0.2M付近の塩濃度で溶出される。該陰イオン交換体
との接触は刀ラム法が望ましが、大量の場合にはバッチ
法も採用される。
カリウム等の塩類溶液で行われ、h−TN Fは1ン 0.2M付近の塩濃度で溶出される。該陰イオン交換体
との接触は刀ラム法が望ましが、大量の場合にはバッチ
法も採用される。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたh−TNF
活性溶液は透析後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル
濾適用の担体としてはセファデックスG−75,G−1
00(ファルマシア社製)。
活性溶液は透析後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル
濾適用の担体としてはセファデックスG−75,G−1
00(ファルマシア社製)。
セファクリルS−200(ファルマシア社製)。
バイオゲルP−100(バイオラット社製)及びトーヨ
ーバールHW−50,HW−55(東洋曹達工業社製)
等が使用される6 ゛ −°−゛ ゲル濾過に使用する緩衝液はpH6,0〜9.0のトリ
ス−塩酸又はリン酸緩衝液が使用され、吸着を防ぐ目的
で0.2〜0.5Mの食塩等の塩類を添加して使用する
ことが望ましい。この工程による精製度は2〜10倍で
ある。
ーバールHW−50,HW−55(東洋曹達工業社製)
等が使用される6 ゛ −°−゛ ゲル濾過に使用する緩衝液はpH6,0〜9.0のトリ
ス−塩酸又はリン酸緩衝液が使用され、吸着を防ぐ目的
で0.2〜0.5Mの食塩等の塩類を添加して使用する
ことが望ましい。この工程による精製度は2〜10倍で
ある。
ゲル濾過で精製したh−TNF含有液は、次いでMon
o Q HR515カラム(ファルマシア社製高性
能陰イオン交換体カラム)を使用するファルマシアF
P L C(Fast Protein+ Pepti
de。
o Q HR515カラム(ファルマシア社製高性
能陰イオン交換体カラム)を使用するファルマシアF
P L C(Fast Protein+ Pepti
de。
Po1ynucleotide、 Liquid Ch
romatography)システムによる高性能陰イ
オン交換クロマトグラフィーによって更に精製される。
romatography)システムによる高性能陰イ
オン交換クロマトグラフィーによって更に精製される。
精製度は5〜10倍で活性の回収率は70〜90%であ
る。
る。
この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
最初のDEAE−セファロース等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下である
。
最初のDEAE−セファロース等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下である
。
FPLCにより精製されたh−TN F溶液は高速分子
篩クロマトグラフィーで更に精製される。
篩クロマトグラフィーで更に精製される。
この際に使用する担体としてはTSK−Ge lG30
00SW(東洋曹達工業社製)が特に望ましく、この高
速分子篩クロマトグラフィーによる精製度は5〜10倍
であり、蛋白に対する比活性4〜8X103単位/+n
g蛋白質を有する精製標高が得られる。
00SW(東洋曹達工業社製)が特に望ましく、この高
速分子篩クロマトグラフィーによる精製度は5〜10倍
であり、蛋白に対する比活性4〜8X103単位/+n
g蛋白質を有する精製標高が得られる。
このようにして精製された蛋白漂白h−TNFは以下の
理化学的性質を有する。
理化学的性質を有する。
(11分子量: 30.000±5,000 (ゲル
濾過法)−′−°゛。
濾過法)−′−°゛。
(2)pH安定性:pH6,0〜9.0で安定(第1図
に示す) (3)温度安定性:pH7,0,65°C,1時間の加
熱により60〜70%失活 する (4)蛋白分解酵素(プロナーゼ、トリプシン)処理に
より完全に失活する (51SDS・ポリアクリルアミド電気泳動(Lamm
l iの方法、ゲル濃度12.5%):分子量260
00dと14000−18000dの位置に移動した。
に示す) (3)温度安定性:pH7,0,65°C,1時間の加
熱により60〜70%失活 する (4)蛋白分解酵素(プロナーゼ、トリプシン)処理に
より完全に失活する (51SDS・ポリアクリルアミド電気泳動(Lamm
l iの方法、ゲル濃度12.5%):分子量260
00dと14000−18000dの位置に移動した。
〔作用2発明の効果〕
本発明の蛋白質標高h−TNFはヒトに投与したときに
副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死せしめるものと考え
られる。得られたh−TNFは、マウスに2000単位
/マウス静注投与したとき急性および亜急性毒性を示さ
ない。したがって、たとえば腎原発肺転移を有する末期
癌患者に250単位静注投与すれば病巣は消失、縮退ま
たは拡大を停止し、治病するものと思われる。以下にh
−TNFのガン細胞系に対する細胞毒性を示す。なお、
正常細胞(ネズミW138)に対する細胞毒性は200
0単位で5%以下である。
副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死せしめるものと考え
られる。得られたh−TNFは、マウスに2000単位
/マウス静注投与したとき急性および亜急性毒性を示さ
ない。したがって、たとえば腎原発肺転移を有する末期
癌患者に250単位静注投与すれば病巣は消失、縮退ま
たは拡大を停止し、治病するものと思われる。以下にh
−TNFのガン細胞系に対する細胞毒性を示す。なお、
正常細胞(ネズミW138)に対する細胞毒性は200
0単位で5%以下である。
学/
第 1 表
50%細胞毒 (゛パ位)
ネズミ悪性化腫瘍細胞
サルコーマ180 250
L−1210500
ヒト悪性化腫瘍細胞
ヘラ (He la) 500〜1000KB
500〜1000次に、本発明を
実施例により詳しく説明する。
500〜1000次に、本発明を
実施例により詳しく説明する。
実施例1
5%牛脂児性血清を有するRPMI−1640無IMj
f3地5. Opを201容スピンナーフラスコに張り
込み、この培地に実施例1の方法で培養して得られたT
HP−1細胞を2X105個7m1lになるように懸濁
した。これを37℃で4日間培養し、得られた培養液を
遠心分離してTHP−1細胞を無菌的に採取した。この
細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含まない
上記RPMI−1640培地5.(H!に移し、これに
TPAを100n g / m R添カロし、ゆるやか
に7夜を攪(牢(100r、p、m、)しつつ無菌的条
件下370℃で5時間培養(誘導)を行った。このよう
にして得られた培養液を遠心分離して細胞を分離、除去
して0.125車位/’mllのh−TNF活性を有す
る培養液を得た。このようにして得た培養液201に2
01の0.05Mトリス−塩酸緩衝液を加えて希釈し、
これをあらかじめ同緩衝液で十分平衡化したDEAE−
セファデックスカラム(7X70cm)に負荷した。こ
のカラムを同緩衝液5.OAで洗浄した後、0.2Mの
食塩を含有する同緩衝液で溶出した。
f3地5. Opを201容スピンナーフラスコに張り
込み、この培地に実施例1の方法で培養して得られたT
HP−1細胞を2X105個7m1lになるように懸濁
した。これを37℃で4日間培養し、得られた培養液を
遠心分離してTHP−1細胞を無菌的に採取した。この
細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含まない
上記RPMI−1640培地5.(H!に移し、これに
TPAを100n g / m R添カロし、ゆるやか
に7夜を攪(牢(100r、p、m、)しつつ無菌的条
件下370℃で5時間培養(誘導)を行った。このよう
にして得られた培養液を遠心分離して細胞を分離、除去
して0.125車位/’mllのh−TNF活性を有す
る培養液を得た。このようにして得た培養液201に2
01の0.05Mトリス−塩酸緩衝液を加えて希釈し、
これをあらかじめ同緩衝液で十分平衡化したDEAE−
セファデックスカラム(7X70cm)に負荷した。こ
のカラムを同緩衝液5.OAで洗浄した後、0.2Mの
食塩を含有する同緩衝液で溶出した。
h −TN F活性区分2.Ojl!を集め、硫安分画
(40%〜55%飽和画分)を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した(5℃、24時間)。
(40%〜55%飽和画分)を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した(5℃、24時間)。
透析内液を超遠心分離(60,00Or pm、 60
分)して不溶物を除去し、あらかじめ0.5Mの食塩を
含む0.05Mトリス−塩酸緩衝液で平衡化したトーヨ
ーパールHW−5OSカラ轟(5,0X70cm)を用
い流速10m+!/min、の条件でゲル濾過を行った
。次いで、TNF活性画分を集め、0.05M)リス−
塩酸緩衝液(pH7,8)で透析した。透析内液をあら
かしめ50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8,5)で平
衡化したMon。
分)して不溶物を除去し、あらかじめ0.5Mの食塩を
含む0.05Mトリス−塩酸緩衝液で平衡化したトーヨ
ーパールHW−5OSカラ轟(5,0X70cm)を用
い流速10m+!/min、の条件でゲル濾過を行った
。次いで、TNF活性画分を集め、0.05M)リス−
塩酸緩衝液(pH7,8)で透析した。透析内液をあら
かしめ50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8,5)で平
衡化したMon。
Q HR515カラムに負荷し、同緩衝液で洗浄した
後、0.1.0.15.0.2.0.3Mと順次食塩濃
度を上げる段階的溶出法によりh−TNF活性物質を溶
出した。h−TNF活性は0.2 Mの食塩で溶出され
、比活性5X10”U/mg蛋白質を有する精製溶液が
得られた。
後、0.1.0.15.0.2.0.3Mと順次食塩濃
度を上げる段階的溶出法によりh−TNF活性物質を溶
出した。h−TNF活性は0.2 Mの食塩で溶出され
、比活性5X10”U/mg蛋白質を有する精製溶液が
得られた。
この高性能陰イオン交換クロマトグラフィ一工程の活性
回収率は80%以上、精製度は約5倍であった。
回収率は80%以上、精製度は約5倍であった。
このようにしC得られた活性画分を限外濾過法(アミコ
ン社製、YM−5)で濃縮し、50mMリン酸緩衝液(
pH7,0)に透析後、0.2M食塩含有の該リン酸緩
衝液で平衡化したTSK−Gel G3000SWカ
ラム(0,7x 60cm)を使用して高速分子篩クロ
マトグラフィーを行なった。h−TNF活性の溶出時間
は19.75分であった(第2図)。同じG3000S
Wカラムを用い同条件で標準蛋白質(オボアルブミン、
ボビンゼーラムアルブミン、α−キモトリプシノーゲン
及びリボヌクレアーゼ)の溶出時間を求め、標準蛋白の
溶出時間に基づいてh−TN Fの分子量を30±5
K dと算出した。
ン社製、YM−5)で濃縮し、50mMリン酸緩衝液(
pH7,0)に透析後、0.2M食塩含有の該リン酸緩
衝液で平衡化したTSK−Gel G3000SWカ
ラム(0,7x 60cm)を使用して高速分子篩クロ
マトグラフィーを行なった。h−TNF活性の溶出時間
は19.75分であった(第2図)。同じG3000S
Wカラムを用い同条件で標準蛋白質(オボアルブミン、
ボビンゼーラムアルブミン、α−キモトリプシノーゲン
及びリボヌクレアーゼ)の溶出時間を求め、標準蛋白の
溶出時間に基づいてh−TN Fの分子量を30±5
K dと算出した。
この高速分子篩クロマトグラフィ一工程の精製度は約i
o倍であり、比活性4.5XlO’U/mg蛋白質のI
Ii製蛋白標高が得られた。
o倍であり、比活性4.5XlO’U/mg蛋白質のI
Ii製蛋白標高が得られた。
このようにして得られたh−TNFの理化学的性質は次
の通りである。
の通りである。
(1)分子量: 30,000±5,000 (ゲル
濾過法)(2)pH安定性:pH6,0〜9.0で安定
(第1図) (3)温度安定性:pH7,0,65℃、1時間の加熱
により60〜70%失活 する (4)蛋白分解酵素により完全に失活する。即ち、10
0U/mj!のTNF活性を有する溶液にトリプシンま
たはプロナーゼを0.1mg/mff1を加え、pH8
,0,37°c、 6時間の酵素反応によりいずれの
場合もTNF活性完全に失活した。
濾過法)(2)pH安定性:pH6,0〜9.0で安定
(第1図) (3)温度安定性:pH7,0,65℃、1時間の加熱
により60〜70%失活 する (4)蛋白分解酵素により完全に失活する。即ち、10
0U/mj!のTNF活性を有する溶液にトリプシンま
たはプロナーゼを0.1mg/mff1を加え、pH8
,0,37°c、 6時間の酵素反応によりいずれの
場合もTNF活性完全に失活した。
+513DS・ポリアクリルアミド電気泳動(Lamm
liの方法、ゲル濃度12.5%):分子量26000
dと14000−18000dの位置に移動した。
liの方法、ゲル濃度12.5%):分子量26000
dと14000−18000dの位置に移動した。
本発明に使用したTHP−1はInt、J。
Cancer、 2−、−6 171−176、 (1
980)に記載されているものであり、この礼文の箸材
より分与されたものである。T HP −1は他にもP
roc、 Natl、 八cad、 Sc、i、
lJ、s、八、 80. 5397−540
1 (1983)にも記載されていて、これらの研究
機関にも分与されている。また、本発明者らは権利を有
するいずれのものに対しても′「1IP−1を分与する
用意がある。
980)に記載されているものであり、この礼文の箸材
より分与されたものである。T HP −1は他にもP
roc、 Natl、 八cad、 Sc、i、
lJ、s、八、 80. 5397−540
1 (1983)にも記載されていて、これらの研究
機関にも分与されている。また、本発明者らは権利を有
するいずれのものに対しても′「1IP−1を分与する
用意がある。
第1図はh−TNFのpH安定性を示すグラフ、第2図
はh−TNFの高速分子篩クロマトグラフとh−TNF
活性を示すグラフである。 特許出願人 水 野 伝 − 町 柚 源 −部 代理人 弁理士 久保1)藤 部 第1図 H 手続主甫正書(自発) 昭和60年3月19日
はh−TNFの高速分子篩クロマトグラフとh−TNF
活性を示すグラフである。 特許出願人 水 野 伝 − 町 柚 源 −部 代理人 弁理士 久保1)藤 部 第1図 H 手続主甫正書(自発) 昭和60年3月19日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ヒト悪性化卓球性細胞が分化誘導物質と接触せしめられ
たときに特異的に産生され、かつ以下の性質を有する蛋
白質標高。 (1)L−929細胞に対する壊死活性が4×10^3
単位/mg・蛋白質以上である (2)分子量:30,000±50,000(ゲル濾過
法)(3)pH安定性:pH6.0〜9.0で安定(4
)温度安定性:pH7.0、65℃、1時間の加熱によ
り60〜70%失活する。 (5)蛋白質分解酵素により完全に失活する。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59274573A JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59274573A JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61155330A true JPS61155330A (ja) | 1986-07-15 |
Family
ID=17543620
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59274573A Pending JPS61155330A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 蛋白質標品 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61155330A (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP59274573A patent/JPS61155330A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
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