JPS6163698A - 生理活性物質に対するモノクロ−ナル抗体とそれを用いる生理活性物質の精製方法 - Google Patents
生理活性物質に対するモノクロ−ナル抗体とそれを用いる生理活性物質の精製方法Info
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- JPS6163698A JPS6163698A JP59184379A JP18437984A JPS6163698A JP S6163698 A JPS6163698 A JP S6163698A JP 59184379 A JP59184379 A JP 59184379A JP 18437984 A JP18437984 A JP 18437984A JP S6163698 A JPS6163698 A JP S6163698A
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- dna
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対
して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ ＡＳａｒｃｏｍ
ａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与し。
して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ ＡＳａｒｃｏｍ
ａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与し。
た場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性
質を有する生理活性物質に対するモノクローナル抗体、
その抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞、およびその抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる処
理工程を含むことを特徴とする該生理活性物質の精製方
法に関する。
質を有する生理活性物質に対するモノクローナル抗体、
その抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞、およびその抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる処
理工程を含むことを特徴とする該生理活性物質の精製方
法に関する。
本発明における生理活性物質とは、遺伝子組換体より得
られる蛋白質であって、後述のように、Ｌ−Ｍ、ｉ胞に
対して細胞障害活性を有し、ＭｅｔｈＡＳａｒｃｏｍａ
癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合、
腫瘍部位に出血性の壊死反応を起こさせる性質を有する
。また、上記の性質の外に、１ｎＶｉｔｒＯで正常細胞
にはほとんど有害な作用をおよぼさないという特徴をも
つ。さらに、本文中に示されるように該生理活性物質は
、ウサギの腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと略す。）のアミ
ノ酸配列をもとにし選ばれた、ヒト遺伝子に由来するも
のである。このと） ＴＮＦ様物質と考えられる該生理
活性物質は、本来ヒトが備えている蛋白質であることか
ら考えて、安全性があり効果も高い制癌剤として期待の
もてる物質である。
られる蛋白質であって、後述のように、Ｌ−Ｍ、ｉ胞に
対して細胞障害活性を有し、ＭｅｔｈＡＳａｒｃｏｍａ
癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合、
腫瘍部位に出血性の壊死反応を起こさせる性質を有する
。また、上記の性質の外に、１ｎＶｉｔｒＯで正常細胞
にはほとんど有害な作用をおよぼさないという特徴をも
つ。さらに、本文中に示されるように該生理活性物質は
、ウサギの腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと略す。）のアミ
ノ酸配列をもとにし選ばれた、ヒト遺伝子に由来するも
のである。このと） ＴＮＦ様物質と考えられる該生理
活性物質は、本来ヒトが備えている蛋白質であることか
ら考えて、安全性があり効果も高い制癌剤として期待の
もてる物質である。
一方、近年細胞融合法を用いてモノクローナル抗体を産
生ずる技術が開発されてきているＣ Ｋｏｈｌｅｒ。
生ずる技術が開発されてきているＣ Ｋｏｈｌｅｒ。
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６（
１９７５） ４９５）。
１９７５） ４９５）。
一般にモノクローナル抗体は、ある抗原で免疫されｆｃ
補補動動物り得られた牌臓細胞と腫瘍細胞とを融合させ
てハイブリドーマ細胞を形成させ、目的とする抗体を産
生ずる組胞株を単一細胞由来として（モノクローナルに
）選択単離して培養することで産生される。このように
して得られたモノクローナル抗体は、単一の抗原決定基
のみを認識する単一な抗体であり、該ハイブリドーマ細
胞を用いれば常に同一の抗体を多重に産生できるなどの
利点をもっている。そのため種々の科学的研究の之めに
、あるいは診断治療等の応用面でモノクローナル抗体を
使用する多数の試みがなされている。
補補動動物り得られた牌臓細胞と腫瘍細胞とを融合させ
てハイブリドーマ細胞を形成させ、目的とする抗体を産
生ずる組胞株を単一細胞由来として（モノクローナルに
）選択単離して培養することで産生される。このように
して得られたモノクローナル抗体は、単一の抗原決定基
のみを認識する単一な抗体であり、該ハイブリドーマ細
胞を用いれば常に同一の抗体を多重に産生できるなどの
利点をもっている。そのため種々の科学的研究の之めに
、あるいは診断治療等の応用面でモノクローナル抗体を
使用する多数の試みがなされている。
このようにモノクローナル抗体が種々利用されているが
、本発明が最終的に目的とする生理活性物質に対するモ
ノクローナル抗体の産生については、従来全く手がつけ
られていなかった。本発明者らは、同抗体産生のため鋭
意研究を重ねた結果、該生理活性物質を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を
得ることに成功し、該モノクローナル抗体の産生技術を
確立した。さらに同抗体を用いたアフィニティクロマト
グラフィーによる処理工程を得ることによって該生理活
性物質の精製効率が飛躍的に向上することを見い出した
。本発明はこのような知見に基づいてなされたものであ
る。本発明による同抗体は、上記の用途の他に、該生理
活性物質の免疫化学的な定量法、細胞および組織中にお
ける該物質の検出法などに応用できるものである。
、本発明が最終的に目的とする生理活性物質に対するモ
ノクローナル抗体の産生については、従来全く手がつけ
られていなかった。本発明者らは、同抗体産生のため鋭
意研究を重ねた結果、該生理活性物質を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を
得ることに成功し、該モノクローナル抗体の産生技術を
確立した。さらに同抗体を用いたアフィニティクロマト
グラフィーによる処理工程を得ることによって該生理活
性物質の精製効率が飛躍的に向上することを見い出した
。本発明はこのような知見に基づいてなされたものであ
る。本発明による同抗体は、上記の用途の他に、該生理
活性物質の免疫化学的な定量法、細胞および組織中にお
ける該物質の検出法などに応用できるものである。
即ち、本発明によれば、遺伝子組換体より生産され、Ｌ
−Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ
Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ −ｒ
ウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を
起こさせる性質を有する生理活性物質に対するモノクロ
ーナル抗体が提供される。
−Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ
Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ −ｒ
ウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を
起こさせる性質を有する生理活性物質に対するモノクロ
ーナル抗体が提供される。
更に本発明によれば、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−
Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ
Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ ？ウス
に投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起こ
させる性質を有する生理活性物質に対するモノクローナ
ル抗体を製造する方法であって、該生理活性物質で免疫
した哺乳動物から得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の融合にょシ生成したハイブリドーマ細胞を抗体産生細
胞として用いて、これをクローン培養することを特徴と
する方法が提供される。
Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ
Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ ？ウス
に投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起こ
させる性質を有する生理活性物質に対するモノクローナ
ル抗体を製造する方法であって、該生理活性物質で免疫
した哺乳動物から得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の融合にょシ生成したハイブリドーマ細胞を抗体産生細
胞として用いて、これをクローン培養することを特徴と
する方法が提供される。
更にまた本発明によれば、遺伝子組換体より生産され、
Ｌ−Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ
Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ マ
ウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を
起こさせる性質を有する生理活性物質で免疫した哺乳動
物から得られた抗体産生Ｍ胞と骨髄腫細胞との融合にょ
シ生成した該生理活性物質に対するモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ画胞が提供される。
Ｌ−Ｍ細胞に対して細胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ
Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ マ
ウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を
起こさせる性質を有する生理活性物質で免疫した哺乳動
物から得られた抗体産生Ｍ胞と骨髄腫細胞との融合にょ
シ生成した該生理活性物質に対するモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ画胞が提供される。
更にまた本発明によれば、遺伝子組換体より生産され、
Ｌ−Ｍ細胞に対して細□胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ
Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ
マウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応
を起こさせる性質を有する生理活性物質に対するモノク
ローナル抗体の少なくとも１種以上を担体に固定させて
得られる親和性吸着体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーに粗製の該生理活性物質を付す工程を含むこ
とを特徴とする該生理活性物質の精製方法が提供される
。
Ｌ−Ｍ細胞に対して細□胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ
Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃ
マウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応
を起こさせる性質を有する生理活性物質に対するモノク
ローナル抗体の少なくとも１種以上を担体に固定させて
得られる親和性吸着体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーに粗製の該生理活性物質を付す工程を含むこ
とを特徴とする該生理活性物質の精製方法が提供される
。
本発明でいう生理活性物質は少なくとも下記のアミノ酸
配列を含む蛋白質である。
配列を含む蛋白質である。
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＶａｌＡｌａ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ（）Ｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔ
ｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓ
ｎ ＡｌａＬｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＧｉ
ｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕｌｌｅ Ｔｙｒ Ｓ
ｅｒ （）Ｉｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｉｎ （）ｌｙＣｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈ
ｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ
Ｔｈｒｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＬｙｓＶａｌ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ ＩＩ
ｓ Ｌｙｓ ’Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ（）Ｉｎ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｃ）ｌｕ
ＧＬｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＬｙｓＰｒｏ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ 工１ｅ Ｔ
ｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （）ｌｙ ＶａｌＰｈｅ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃ）ｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌｕ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ −Ａｓｐ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ （）Ｉｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｉｌｅ ＡｌａＬｅｕ なお、上記配列は下記の略号のＬ−アミノ酸からなり、
配列の左から右への方向はＮ末端からＣ末端への方向を
示すものである。
ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＶａｌＡｌａ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ（）Ｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔ
ｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓ
ｎ ＡｌａＬｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＧｉ
ｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕｌｌｅ Ｔｙｒ Ｓ
ｅｒ （）Ｉｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｉｎ （）ｌｙＣｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈ
ｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ
Ｔｈｒｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＬｙｓＶａｌ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ ＩＩ
ｓ Ｌｙｓ ’Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ（）Ｉｎ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｃ）ｌｕ
ＧＬｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＬｙｓＰｒｏ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ 工１ｅ Ｔ
ｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （）ｌｙ ＶａｌＰｈｅ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃ）ｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌｕ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ −Ａｓｐ Ｐｈｅ ＡｌａＧｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ （）Ｉｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｉｌｅ ＡｌａＬｅｕ なお、上記配列は下記の略号のＬ−アミノ酸からなり、
配列の左から右への方向はＮ末端からＣ末端への方向を
示すものである。
Ｃｙｓ ニジスティン残基
Ｇｉｎ ：グルタミン残基
Ａｓｐ ：アスパラギン駿残基
Ｐｒｏ ニゲロリン残基
Ｔｙｒ ：チロシン残基
Ｖａｌ ：バリン残基
Ｌｙｓ ：リジン残基
Ｇｌｕｌダニタミン酸残基
Ａｌａ ：アラニン残基
Ａｓｎ ：アスパラギン残基
Ｌｅｕ ：ロイシン残基
Ｐｈｅ ニフェニルアラニン残基
Ｇｌｙ ニゲリシン残基
Ｈｌｓ ：ヒスチノン残基
Ｓｅｒ ：セリン残基
Ｔｈｒ ：スレオニン残基
１１ｅ ：イノロイシン残基
Ｔｒｐ ： ）リプトファン残基
Ａｒｇ ：アルギニン残基
本発明でいう遺伝子組換体は少なくとも下記のＤＮＡ配
列を含むものである。
列を含むものである。
ＴＣＡ ＴＣＴ ’Ｉ’ＣＴ ＣＣ）Ａ ＡＣＣＣＣＧ
ＡＣ）Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡ
Ｔ ＧＴＴ （）ＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ
（）ＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧＣＡＧ ＣＴＣＣＡ（）
ＴＣ）Ｇ ＣＴＣ） ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡ
Ｔ ＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＡＴ ＧＣ）ＣＣ）Ｔ
Ｇ ＧＡ（） ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ
ＣＴＧ ＧＴＧ （）ＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ
ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡ
Ｇ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣ
ＴＧ（） ＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣ
ＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧ ＡＧＣＣＯＣＡＴＣ
ＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ（）Ｔ
ＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ （）ＣＣＡＴＣＡＡＣ）
ＡＧＣＣＯＣＴＧＣＣＡ（） ＡＧＧ ＧＡＣ）
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧ（） ＧＣＴ ＧＡ
Ｃ） ＧＣＣＡＡ（）ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｃ）
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ
Ｃ）ＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ
ＡＴＣＡＡＴ Ｃ（）（） ＣＣＣ（）ＡＣＴＡＴ
ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣ（）ＡＧ ＴＣＴ
Ｇ（）Ｇ ＣＡ（：） ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ （）ＧＧＣＴＧ なお、上記ＤＮＡ配列は下記の略号を使用し、配列の左
から右への方向は５′から３′への方向を示すものであ
る。
ＡＣ）Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡ
Ｔ ＧＴＴ （）ＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ
（）ＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧＣＡＧ ＣＴＣＣＡ（）
ＴＣ）Ｇ ＣＴＣ） ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡ
Ｔ ＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＡＴ ＧＣ）ＣＣ）Ｔ
Ｇ ＧＡ（） ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ
ＣＴＧ ＧＴＧ （）ＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ
ＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡ
Ｇ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣ
ＴＧ（） ＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣ
ＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧ ＡＧＣＣＯＣＡＴＣ
ＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ（）Ｔ
ＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ （）ＣＣＡＴＣＡＡＣ）
ＡＧＣＣＯＣＴＧＣＣＡ（） ＡＧＧ ＧＡＣ）
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧ（） ＧＣＴ ＧＡ
Ｃ） ＧＣＣＡＡ（）ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｃ）
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ
Ｃ）ＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ
ＡＴＣＡＡＴ Ｃ（）（） ＣＣＣ（）ＡＣＴＡＴ
ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣ（）ＡＧ ＴＣＴ
Ｇ（）Ｇ ＣＡ（：） ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ （）ＧＧＣＴＧ なお、上記ＤＮＡ配列は下記の略号を使用し、配列の左
から右への方向は５′から３′への方向を示すものであ
る。
Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基
Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基
Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基
Ｔ：チミジル酸残基
この遺伝子組換体は以下のように作製するものである。
すなわち、ウサギのＴＮＦのアミノ酸配列構造をもとに
ヒト染色体遺伝子より、通常の遺伝子組換操作の手法を
使って取り出したＤＮＡ ｆ用いて、人工的に新規のＤ
ＮＡを構築し、該ＤＮＡを組み込んで目的の遺伝子組換
体を作製する。この製法の詳細は、本発明者らによって
、特願昭５９−１１５・１９（５号および特１願昭５９
−１１５４９７号明細書に記載しである。その概略は１
次の通りである。
ヒト染色体遺伝子より、通常の遺伝子組換操作の手法を
使って取り出したＤＮＡ ｆ用いて、人工的に新規のＤ
ＮＡを構築し、該ＤＮＡを組み込んで目的の遺伝子組換
体を作製する。この製法の詳細は、本発明者らによって
、特願昭５９−１１５・１９（５号および特１願昭５９
−１１５４９７号明細書に記載しである。その概略は１
次の通りである。
■ バクテリオファーノλ／ウサギ染色体遺伝子ライブ
ラリーとバクテリオファーノλ／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
（７Ｄｉｖｉｎｌｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ。
ラリーとバクテリオファーノλ／ヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学部
（７Ｄｉｖｉｎｌｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３８． Ｕ−３，
Ａ、 ）のＴ−Ｍａｎｘａｔｉｓ教授より得ることがで
きる。これらのライブラリーは次の方法によって作るこ
とができる。［Ｃｅ１ｌ。
Ａ、 ）のＴ−Ｍａｎｘａｔｉｓ教授より得ることがで
きる。これらのライブラリーは次の方法によって作るこ
とができる。［Ｃｅ１ｌ。
１５、ｐ、６８７（１９７８）参照〕
（１） ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギ
あるいはヒトのすい臓、を凍結粉末にし、Ｒ１’＝ｌＡ
の蛋白成分を分解処理し、沈澱によってウサギあるいは
ヒトの高分子ＤＮＡを得る。
あるいはヒトのすい臓、を凍結粉末にし、Ｒ１’＝ｌＡ
の蛋白成分を分解処理し、沈澱によってウサギあるいは
ヒトの高分子ＤＮＡを得る。
（２） この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに
切るために、部分的に分解する。
切るために、部分的に分解する。
（３） 得られたＤＮＡ断片から分子量分画によって
、１５から２０キロ塩基対（ｋｂ）の大きさの断片を得
る。
、１５から２０キロ塩基対（ｋｂ）の大きさの断片を得
る。
（４）得られたＤＮＡ断片をλＣｈａｒｏｎ ３０フア
ージベクター全用いてクローン化する。
ージベクター全用いてクローン化する。
（５） 得られたベクターを、ｒＤＮＡを含む感染性
のファーノ粒子にｉＨｖｉｔｒｏで組み入れ、上記のウ
サギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得る。
のファーノ粒子にｉＨｖｉｔｒｏで組み入れ、上記のウ
サギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得る。
２、参考例１で得られたウサギＴＮＦのｃ ＤＮＡは、
ｐ、Ｗ、Ｊ、Ｒｉｇｂ’／ ラのニックトランスレーシ
ョン法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１３．ｐ、２３７（
１９７７） 参照〕（でよって、 Ｐでラベル化す
る。
ｐ、Ｗ、Ｊ、Ｒｉｇｂ’／ ラのニックトランスレーシ
ョン法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１３．ｐ、２３７（
１９７７） 参照〕（でよって、 Ｐでラベル化す
る。
３、 バクテリオファージス／ウサギ染色体遺伝子ライ
ブラリーとバクテリオファーノλ／ヒト染色体遺伝子ラ
イブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に蜜
にグラークができるように植えつけ、３２Ｐでラベルし
たウサギＴＮＦのｃＤＮＡと・・イブリダイズさせてス
クリーニングした。
ブラリーとバクテリオファーノλ／ヒト染色体遺伝子ラ
イブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に蜜
にグラークができるように植えつけ、３２Ｐでラベルし
たウサギＴＮＦのｃＤＮＡと・・イブリダイズさせてス
クリーニングした。
４、 適当なりローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、５ｏｕｔｈｅｒｎ ｚ・イブリダ
イズ法［Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ−、９８、ｐ、５０３（１９５７）参照］によっ
て解析する。
制限酵素地図を作り、５ｏｕｔｈｅｒｎ ｚ・イブリダ
イズ法［Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ−、９８、ｐ、５０３（１９５７）参照］によっ
て解析する。
ウサギＴｌと該生理活性物質の遺伝子を含む制限酵素分
解された断片を、プラスミドベクター中に導入し塩基配
列を解析する。
解された断片を、プラスミドベクター中に導入し塩基配
列を解析する。
５、 ウサギＴＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝子の
塩 ゛茎配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエク
ソン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配
列）とイントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコー
ドしない塩基配列）を決定する。
塩 ゛茎配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエク
ソン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコードする塩基配
列）とイントロン（ウサギＴＮＦのアミノ酸配列をコー
ドしない塩基配列）を決定する。
６ そして、ウサギＴＮＦ遺伝子と該生理活性物質の遺
伝子を比較して、該生理活性物質のエクソンとイントロ
ンを決定する。
伝子を比較して、該生理活性物質のエクソンとイントロ
ンを決定する。
７ ウサｉ ＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソ
ンを結合することによって得られた塩基配列より決めら
れるウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサギＴＮＦの（
ＤＮＡの塩基配列より決められる同アミノ酸配列と一致
することで確認される。
ンを結合することによって得られた塩基配列より決めら
れるウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサギＴＮＦの（
ＤＮＡの塩基配列より決められる同アミノ酸配列と一致
することで確認される。
８ 次に、該生理活性物質遺伝子のイントロンを削除し
エクソンを結合することによって得られた塩基配列より
該生理活性物質のアミノ酸配列が決められる。該生理活
性物質のアミノ酸配列は、ウサギＴＩＪＦのアミノ酸配
列と部分的に一致することで確認される。
エクソンを結合することによって得られた塩基配列より
該生理活性物質のアミノ酸配列が決められる。該生理活
性物質のアミノ酸配列は、ウサギＴＩＪＦのアミノ酸配
列と部分的に一致することで確認される。
９、 その後、該生理活性物質をコードするＤＮＡをｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで修飾し、適当な表現ベヒクルに導入し
、そのＤＮＡを含む組換ＤＮＡを作成する。
ｎ ｖｉｔｒｏで修飾し、適当な表現ベヒクルに導入し
、そのＤＮＡを含む組換ＤＮＡを作成する。
１０、このようにして得られた該生理活性物質はその成
熟型で、セリンから始まる１５５酒のアミノ酸残基を持
つ。一方、その前配列としてシグナルベグチドを持つ。
熟型で、セリンから始まる１５５酒のアミノ酸残基を持
つ。一方、その前配列としてシグナルベグチドを持つ。
各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸量シ１１ヲ変えることな
く、塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成さ
れた人工のＤＮＡに置換えることも可能である。
異る等の理由により、アミノ酸量シ１１ヲ変えることな
く、塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成さ
れた人工のＤＮＡに置換えることも可能である。
該生理活性物質はまた、細胞内で未成熟形態（ブレまた
はプレグロベプチド）で産生された成熟過８（プロセシ
ング）により中間体を経由して成熟した該生理活性物質
となることが推定される。
はプレグロベプチド）で産生された成熟過８（プロセシ
ング）により中間体を経由して成熟した該生理活性物質
となることが推定される。
該生理活性物質のこのような未成熟形態は、該生理活性
物質遺伝子の塩基配列から推定することができる。未成
熟形態及び中間体の該生理活性物質をコードする遺伝子
を含む該生理活性物質遺伝子もまた、天然のまたは人工
的ＤＮＡを用いて組換を行うことができる。
物質遺伝子の塩基配列から推定することができる。未成
熟形態及び中間体の該生理活性物質をコードする遺伝子
を含む該生理活性物質遺伝子もまた、天然のまたは人工
的ＤＮＡを用いて組換を行うことができる。
これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコド°ン
（ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＩ−
ＪＦ遺伝子の５′端に導入することである。このように
することにより、適当なプロモータによって合成される
ｍ ＲＮＡから成熟あるいは未成熟あるいは中間体の生
理活性物質が産生される。この様にＮ末端に付加された
メチオニン残基は宿主によっては自然に除去される。
（ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＩ−
ＪＦ遺伝子の５′端に導入することである。このように
することにより、適当なプロモータによって合成される
ｍ ＲＮＡから成熟あるいは未成熟あるいは中間体の生
理活性物質が産生される。この様にＮ末端に付加された
メチオニン残基は宿主によっては自然に除去される。
また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外また
はダラム陰性細菌に寂いては、ベリゾラズムと呼ばれる
部分へ、分泌させることも可能である。
に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外また
はダラム陰性細菌に寂いては、ベリゾラズムと呼ばれる
部分へ、分泌させることも可能である。
また、開始コド／を組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペノチドと該生理活性物質との融合
ペグチドを形成するが、この場合：ｉ化学的または酵素
的に切断するか、もしくは該生理活性物質の主たる活性
に変化がなければ、そのまま用いることができる。
クターから由来するペノチドと該生理活性物質との融合
ペグチドを形成するが、この場合：ｉ化学的または酵素
的に切断するか、もしくは該生理活性物質の主たる活性
に変化がなければ、そのまま用いることができる。
このように得られた該生理活性物質遺伝子を、正しく転
写、翻訳が行われるような配列においてプロモーター等
の５′領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物
細胞中で複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得
、この組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を形
質転換し、この形質転換体を増殖せしめ、該生理活性物
質遺伝子を発現せしめることにより該生理活性物質を得
ることができる。
写、翻訳が行われるような配列においてプロモーター等
の５′領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物
細胞中で複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得
、この組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を形
質転換し、この形質転換体を増殖せしめ、該生理活性物
質遺伝子を発現せしめることにより該生理活性物質を得
ることができる。
宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ。
ｃｏ１ｉＫ１２株の種々の変異株、例えばＨＢＩＯＩ（
ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ’６００Ｋ（ＡＴＣＣ３３９
５５）、Ｄ１２１０、ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）、
ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３１２４４）、Ｊ
ＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３８７６）、ＪＭ８３、ＪＭ１０
３、χ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられ
る。
ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ’６００Ｋ（ＡＴＣＣ３３９
５５）、Ｄ１２１０、ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３）、
ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３１２４４）、Ｊ
ＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３８７６）、ＪＭ８３、ＪＭ１０
３、χ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられ
る。
大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＭＢ ９（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ８（Ａ
ＴＣＣ３７０７４）、ｐＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０８４）
等のプラスミドあるいはλｇｔ１ λＢ１シャロン４Ａ
のようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用いられる
。
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＭＢ ９（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ８（Ａ
ＴＣＣ３７０７４）、ｐＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０８４）
等のプラスミドあるいはλｇｔ１ λＢ１シャロン４Ａ
のようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用いられる
。
大腸菌の国体中に該生理活性物質を産生させるために、
大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーターが
使用される。このようなプロモーターとして、好適には
ラクトース分解酵素（ＬＡＣ）のプロモーター及びその
ＵＶ５変異、ペニシリナービ（ＢＬＡ）、トリシトファ
ン合°成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λファージの
ＰＬ７’ロモーターあるいはトリプトファン合成酵素と
、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであるＴＡＣ
プロモーター等が用いられる。
大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーターが
使用される。このようなプロモーターとして、好適には
ラクトース分解酵素（ＬＡＣ）のプロモーター及びその
ＵＶ５変異、ペニシリナービ（ＢＬＡ）、トリシトファ
ン合°成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λファージの
ＰＬ７’ロモーターあるいはトリプトファン合成酵素と
、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであるＴＡＣ
プロモーター等が用いられる。
枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３
３６０８）、ＢＲ１５１株（ＡＴＣＣ３３６７７）、Ｍ
１１１２株（ＡＴＣＣ３３７１２）などが用いられ、ベ
クターとしてはｐｃ１９．４ （ＡＴＣＣ７０１４）、
ｐＵＢｌｌｏ（ＡＴＣＣ３７０１５）、ｐｓＡ２１００
（ＡＴＣＣ３７０１４）、ｐＥ１９４などのプラスミド
などが用いられる。
３６０８）、ＢＲ１５１株（ＡＴＣＣ３３６７７）、Ｍ
１１１２株（ＡＴＣＣ３３７１２）などが用いられ、ベ
クターとしてはｐｃ１９．４ （ＡＴＣＣ７０１４）、
ｐＵＢｌｌｏ（ＡＴＣＣ３７０１５）、ｐｓＡ２１００
（ＡＴＣＣ３７０１４）、ｐＥ１９４などのプラスミド
などが用いられる。
枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとじては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵ｉ （ＣＡＴ）やベニシ
リナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモー
ターが用、いられる。
ラムフェニコールアセチル化酵ｉ （ＣＡＴ）やベニシ
リナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモー
ターが用、いられる。
酵母を宿主とする場合は、サツカロマ・イセス・セレビ
シェ（ｓＭｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ
）のＲＨ２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、ＳＨＹ
１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、ＳＨＹ ３抹（ＡＴＣＣ
４４７７１）、Ｄｉ３１Ａ株、４８３株、８３０医など
が用いられ、そのベクターとしてはｙｇｐ １３ （Ａ
ＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ ５、ＹＲｐ ７、ＹＩｐ
５などのプラスミドが用いられる。
シェ（ｓＭｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ
）のＲＨ２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、ＳＨＹ
１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、ＳＨＹ ３抹（ＡＴＣＣ
４４７７１）、Ｄｉ３１Ａ株、４８３株、８３０医など
が用いられ、そのベクターとしてはｙｇｐ １３ （Ａ
ＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ ５、ＹＲｐ ７、ＹＩｐ
５などのプラスミドが用いられる。
酵母を宿主とする場合、プロモーターとして・は酸性ホ
スファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１
）、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ’（ＰＣ）Ｋ）、チトクロームＢ（ＣＯ
Ｄ）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる
。
スファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１
）、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ’（ＰＣ）Ｋ）、チトクロームＢ（ＣＯ
Ｄ）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる
。
以上のようにして作製した遺伝子組換体で形質転換した
微生物を通常の方法で大量に培養した後、目的とする該
生理活性物質を産生させる。次いで該生理活性物質を含
む微生物菌体の培養上清もしくは、菌体破砕抽出液を原
液として、通常の生化学的分離精製方法を組み合わせて
部分精製する。
微生物を通常の方法で大量に培養した後、目的とする該
生理活性物質を産生させる。次いで該生理活性物質を含
む微生物菌体の培養上清もしくは、菌体破砕抽出液を原
液として、通常の生化学的分離精製方法を組み合わせて
部分精製する。
精製方法としそは、たとえば、硫酸アンモニウム（てよ
る塩析法、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過
去、電気泳動法などがあげられる。
る塩析法、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過
去、電気泳動法などがあげられる。
次に、上記の部分精製した該生理活性物質を抗原とした
モノクローナル抗体取得の一般的な方法：・こついて述
べる。
モノクローナル抗体取得の一般的な方法：・こついて述
べる。
（ａ） 抗体産生細胞の調製
抗体産生＋Ｆａ胞の調製は常法に準じて行えばよい。
すなわち、抗原である部分精製した該生理活性物質で動
物を免疫し、その動物の抗体産生細胞を取得する方法に
よればよい。
物を免疫し、その動物の抗体産生細胞を取得する方法に
よればよい。
動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、
ヒツゾ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体派生細胞とし
ては牌細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などが使用され
る。
ヒツゾ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体派生細胞とし
ては牌細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などが使用され
る。
（切 骨髄腫細胞の調製
細胞融合方法において使用される骨髄腫細胞には特に限
定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの
動物の細胞株が適用できる。使用する細胞株は好ましく
は薬剤抵抗性のものであって、未融合の骨髄腫細胞が選
択培地で生存できず、ハイプリドーマ細胞のみが増殖す
るようにすべきである。最も普通に用いられるものは、
８−アザグアニ／抵抗比の細胞株で、これはヒポ千す／
チン・グアニン・ホスホリゾシル・トランスフェラーゼ
を欠損し、ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミノン
（ＨＡＴ）培地中では生育できない性質を有する。また
、使用する細胞株はいわゆる「非分泌型」のものである
ことが好ましい。たとえば、マウス骨髄腫（ミエローマ
）株ＭＯＰＣ−２１由来のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１
（Ｐ、Ｕｌ）、Ｐ、／Ｘ６３−Ａｇ −６・５ ・３、
Ｐ３／ＮＳＩ −１−Ａｇ４−１、ｓｐ ２１０−Ａｇ
１４、ラット骨髄腫細胞２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・
２・３などが好適に用いることができる。
定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの
動物の細胞株が適用できる。使用する細胞株は好ましく
は薬剤抵抗性のものであって、未融合の骨髄腫細胞が選
択培地で生存できず、ハイプリドーマ細胞のみが増殖す
るようにすべきである。最も普通に用いられるものは、
８−アザグアニ／抵抗比の細胞株で、これはヒポ千す／
チン・グアニン・ホスホリゾシル・トランスフェラーゼ
を欠損し、ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミノン
（ＨＡＴ）培地中では生育できない性質を有する。また
、使用する細胞株はいわゆる「非分泌型」のものである
ことが好ましい。たとえば、マウス骨髄腫（ミエローマ
）株ＭＯＰＣ−２１由来のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１
（Ｐ、Ｕｌ）、Ｐ、／Ｘ６３−Ａｇ −６・５ ・３、
Ｐ３／ＮＳＩ −１−Ａｇ４−１、ｓｐ ２１０−Ａｇ
１４、ラット骨髄腫細胞２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・
２・３などが好適に用いることができる。
（Ｃ） 細胞融合
通常、イークルのミニマムエッセンシャル培地、ロズウ
ェル・ノ９−り・メモリアル・インスティチュート（Ｒ
ＰＭＩ） １６４０培地などの培地中でｌＸ１０７〜５
ｘｔｏ 個の骨髄腫細胞と抗体産生細胞０．５×１０
８〜２Ｘ１０ 個を混合（混合比は通常１：２〜１：１
０）細胞融合が行われる。融合促進剤としては、平均分
子量が１，０００〜６，０００のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＣ））が好ましいが、他にウィルスなども使用
できる。培地中のＰＥＧの使用濃度は通常３゜〜ｓ ｏ
ｗ／ｗ％である。
ェル・ノ９−り・メモリアル・インスティチュート（Ｒ
ＰＭＩ） １６４０培地などの培地中でｌＸ１０７〜５
ｘｔｏ 個の骨髄腫細胞と抗体産生細胞０．５×１０
８〜２Ｘ１０ 個を混合（混合比は通常１：２〜１：１
０）細胞融合が行われる。融合促進剤としては、平均分
子量が１，０００〜６，０００のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＣ））が好ましいが、他にウィルスなども使用
できる。培地中のＰＥＧの使用濃度は通常３゜〜ｓ ｏ
ｗ／ｗ％である。
（ｄ） ハイブリドーマ細胞の選択的増殖細胞融合を
終えた細胞は、２０チ９シ胎児血清含有ＲＰＭＥ １６
４０培地などで適当に希釈し、９６穴マイクロプレート
に１ウエル当たり １−０５〜１０６個程度に植えつけ
る。各ウェルに選択培地（たとえばＨＡＴ培地）を加え
、以後適当に選択培地の交換を行ない、培養する。骨髄
腫細胞として８−アゾグアニン抵抗性株を用いれば、未
融合の骨髄腫細胞はＨＡＴ培地中ではｌＯ日目ぐらいま
でに全部死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので１
ｎ ｖｉｔｒ。
終えた細胞は、２０チ９シ胎児血清含有ＲＰＭＥ １６
４０培地などで適当に希釈し、９６穴マイクロプレート
に１ウエル当たり １−０５〜１０６個程度に植えつけ
る。各ウェルに選択培地（たとえばＨＡＴ培地）を加え
、以後適当に選択培地の交換を行ない、培養する。骨髄
腫細胞として８−アゾグアニン抵抗性株を用いれば、未
融合の骨髄腫細胞はＨＡＴ培地中ではｌＯ日目ぐらいま
でに全部死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので１
ｎ ｖｉｔｒ。
では長時間生育できない。したがって、培養１０〜１４
日ぐらいから生育してくるものはすべてハイブリドーマ
細胞である。
日ぐらいから生育してくるものはすべてハイブリドーマ
細胞である。
（ｅ） 抗体産生ハイブリドーマ細胞の検索ハイプリ
ドーマ細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に
限定はない。たとえば、ハイブリドーマ細胞の増殖した
ウェルの上清の一部を採取し、該生理活性物質又は固定
化該生理活性物質と反応させたのち、酵素、ラジオアイ
ソドーグ、螢光物質、発光物質で標識した第２抗体との
反応によって、標識量を測定し、抗該生理活性物質抗体
の存在を検定することができる。
ドーマ細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に
限定はない。たとえば、ハイブリドーマ細胞の増殖した
ウェルの上清の一部を採取し、該生理活性物質又は固定
化該生理活性物質と反応させたのち、酵素、ラジオアイ
ソドーグ、螢光物質、発光物質で標識した第２抗体との
反応によって、標識量を測定し、抗該生理活性物質抗体
の存在を検定することができる。
（ｒ） クローニング
各ウェル中には２種以上のハイブリドーマ細胞が生育し
ている可能性があるので、クローニングを行ないモノク
ローナル抗体産生ハイプリドーマ細胞を取得する。クロ
ーニングの方法としては、限界希釈法、あるいは顕微鏡
下でガラス細管を用いてクローンを吸い出す方法などが
おる。
ている可能性があるので、クローニングを行ないモノク
ローナル抗体産生ハイプリドーマ細胞を取得する。クロ
ーニングの方法としては、限界希釈法、あるいは顕微鏡
下でガラス細管を用いてクローンを吸い出す方法などが
おる。
（ｇ） モノクローナル抗体取得
モノクローナル抗体は、所望のハイプリドーマ、釧胞を
１０％程度のウシ袷児血清を含むＲＰＭＩＩ６４０培地
などの適当な培養液で培養し、その培養上清（夜から得
ることができる。
１０％程度のウシ袷児血清を含むＲＰＭＩＩ６４０培地
などの適当な培養液で培養し、その培養上清（夜から得
ることができる。
一方、さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄腫袋
田胞の由来動物と同系の動物にブリスタン（２，６’、
１０．１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油
を腹腔内投与し、その後ハイブリドーマ細胞を投与する
ことにより、ｉｎ ｖｉｖｏでハイブリドーマ細胞を大
量に増殖させればよい。この場合、１０〜１８日位で腹
水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体が生
ずる。
田胞の由来動物と同系の動物にブリスタン（２，６’、
１０．１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油
を腹腔内投与し、その後ハイブリドーマ細胞を投与する
ことにより、ｉｎ ｖｉｖｏでハイブリドーマ細胞を大
量に増殖させればよい。この場合、１０〜１８日位で腹
水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体が生
ずる。
（ｈ） モノクローナル抗体の精製
培養上清あるいは腹水中に含まれるモノクローナル抗体
は、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー等の通常
の生化学的方法で精製することができる。
は、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー等の通常
の生化学的方法で精製することができる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、該生理
活性物質を特異的に認識する純粋な抗体である。またハ
イブリドーマ細胞は液体チッ素中などで半永久的に保存
でき、必要な時はいつでも上記の方法により同一の抗体
を大量に生産することができる。
活性物質を特異的に認識する純粋な抗体である。またハ
イブリドーマ細胞は液体チッ素中などで半永久的に保存
でき、必要な時はいつでも上記の方法により同一の抗体
を大量に生産することができる。
該モノクローナル抗体は、該生理活性物質の免疫化学的
な定量法、細胞および組織中における同物質の検出法な
どに応用できる。
な定量法、細胞および組織中における同物質の検出法な
どに応用できる。
また、該モノクローナル抗体を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを該生理活性物質の精製に利用するこ
とができる。すなわち該モノクローナル抗体の少なくと
も１種以上を不溶性担体に化学的に結合し、カラムに充
填する。該生理活性物質を含む培養上清、菌体破砕抽出
液あるいは部分精製液を同カラムに通すことにより、該
生理活性物質は該不溶性担体に吸着されてカラム中に保
持される。次に洗浄液にて同カラムを洗浄することで未
吸着不純物質を除去する。続いて溶離液にて同カラムか
ら該生理活性物質を溶離する。ここで用いられる不溶性
担体、モノクローナル抗体の結合方法、吸着・洗浄・溶
離条件等は通常のアフィニティークロマトグラフィーに
用いられるものならどのようなものでも適用することが
できる。
ロマトグラフィーを該生理活性物質の精製に利用するこ
とができる。すなわち該モノクローナル抗体の少なくと
も１種以上を不溶性担体に化学的に結合し、カラムに充
填する。該生理活性物質を含む培養上清、菌体破砕抽出
液あるいは部分精製液を同カラムに通すことにより、該
生理活性物質は該不溶性担体に吸着されてカラム中に保
持される。次に洗浄液にて同カラムを洗浄することで未
吸着不純物質を除去する。続いて溶離液にて同カラムか
ら該生理活性物質を溶離する。ここで用いられる不溶性
担体、モノクローナル抗体の結合方法、吸着・洗浄・溶
離条件等は通常のアフィニティークロマトグラフィーに
用いられるものならどのようなものでも適用することが
できる。
このようなアフィニティークロマトグラフィーを該生理
活性物質の精製工程に組み込むことによって精製効率は
飛躍的に向上する。すなわち、極めて高い純度の該生理
活性物質を高回収率で得ることができる。このアフィニ
ティクロマトグラフィーの工程は該生理活性物質の精製
工程におけるどの段階ででも行なうことができるが、一
般的には精製工程の最終工程で行なうか、あるいは最終
工程としてゲル濾過を行ないその前工程として行なうの
が有利でちる。
活性物質の精製工程に組み込むことによって精製効率は
飛躍的に向上する。すなわち、極めて高い純度の該生理
活性物質を高回収率で得ることができる。このアフィニ
ティクロマトグラフィーの工程は該生理活性物質の精製
工程におけるどの段階ででも行なうことができるが、一
般的には精製工程の最終工程で行なうか、あるいは最終
工程としてゲル濾過を行ないその前工程として行なうの
が有利でちる。
このようにして精製された該生理活性物質の約３００単
位（°゛単位″については後述する）は、後述のＭｅｔ
ｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ担癌マウスを用いる生理活性評
価において（→の活性を示した。更に、マウス結腸癌Ｃ
ｏ１ｏｎ ２６で担癌させたＢＡＬＢ／ｃマウスに本生
理活性物質の精製物を投与した場合、対照群（生理食塩
水投与群）に比して有意の差を持って、癌増殖抑制およ
び退縮効果が認められた。また培養を３７℃で７２時間
で行なう以外は、後述のし−Ｍ細胞に対する細胞障害活
性評価と同様な実験方法で、各種ヒト癌細胞に対する活
性の評価をおこなった。用いた細胞は、ＫＢ細胞（鼻咽
喉癌）、ＰＣ−８細胞（肺癌）、比較対照細胞として正
常細胞（ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児包皮細胞）であった
。その結果、正常細胞には、はとんど細胞障害活性が認
められなかったにもかかわらず、癌細胞には強い細胞障
害活性が認められた。
位（°゛単位″については後述する）は、後述のＭｅｔ
ｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ担癌マウスを用いる生理活性評
価において（→の活性を示した。更に、マウス結腸癌Ｃ
ｏ１ｏｎ ２６で担癌させたＢＡＬＢ／ｃマウスに本生
理活性物質の精製物を投与した場合、対照群（生理食塩
水投与群）に比して有意の差を持って、癌増殖抑制およ
び退縮効果が認められた。また培養を３７℃で７２時間
で行なう以外は、後述のし−Ｍ細胞に対する細胞障害活
性評価と同様な実験方法で、各種ヒト癌細胞に対する活
性の評価をおこなった。用いた細胞は、ＫＢ細胞（鼻咽
喉癌）、ＰＣ−８細胞（肺癌）、比較対照細胞として正
常細胞（ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児包皮細胞）であった
。その結果、正常細胞には、はとんど細胞障害活性が認
められなかったにもかかわらず、癌細胞には強い細胞障
害活性が認められた。
本発明のアフィニティクロマトグラフィーによって精製
された該生理活性物質は以下の特徴を持つ。１）極めて
すぐれた制癌活性を持つ。２）正常細胞にほとんど作用
しないことから副作用の無いことが予想される。３）高
純度であるので微生物由来の不純物をほとんど含まない
。４）ヒト由来の蛋白質に相当するので人体に投与して
も安全である。
された該生理活性物質は以下の特徴を持つ。１）極めて
すぐれた制癌活性を持つ。２）正常細胞にほとんど作用
しないことから副作用の無いことが予想される。３）高
純度であるので微生物由来の不純物をほとんど含まない
。４）ヒト由来の蛋白質に相当するので人体に投与して
も安全である。
このように同物質は今後有用な制癌剤・とじて期待でき
るものである。
るものである。
さらに、本発明の精製方法は工業的規模で大量精製を行
なう上でも有用である。従来の動物に抗原を免疫して抗
体を取得する方法は、いくつかの欠点を持つ。すなわち
、抗体価および抗体の種類は免疫動物の種類・個体ごと
に異なり、一定の品質の抗体が得られない。したがって
、これを用いたアフィニティクロマトグラフィー力ラム
も、作製するたびに品質が異なり、精製条件・精製純度
・回収率も一定とはならない。これに対して、モノクロ
ーナル抗体を用いた本発明の方法によると、常に一定の
品質の抗体が安定的かつ大量に供給される利点を有する
。さらにこのモノクローナル抗体は化学的に単一の物質
であるので、これを用いてアクィニティクロマトグラフ
ィー力ラムの作製ｂ・よび該生理活性物質の精製も、常
に均一の条件で再現性良く行なうことができ、工業的生
産に適する。
なう上でも有用である。従来の動物に抗原を免疫して抗
体を取得する方法は、いくつかの欠点を持つ。すなわち
、抗体価および抗体の種類は免疫動物の種類・個体ごと
に異なり、一定の品質の抗体が得られない。したがって
、これを用いたアフィニティクロマトグラフィー力ラム
も、作製するたびに品質が異なり、精製条件・精製純度
・回収率も一定とはならない。これに対して、モノクロ
ーナル抗体を用いた本発明の方法によると、常に一定の
品質の抗体が安定的かつ大量に供給される利点を有する
。さらにこのモノクローナル抗体は化学的に単一の物質
であるので、これを用いてアクィニティクロマトグラフ
ィー力ラムの作製ｂ・よび該生理活性物質の精製も、常
に均一の条件で再現性良く行なうことができ、工業的生
産に適する。
次に、本発明を実施するにあたって、行なう評価方法に
ついて以下に詳細を述べる。
ついて以下に詳細を述べる。
１） １ｎｖｉｖｏ活性測定（Ｍｅｔｈ Ａ Ｓａｒ
ｃｏｍａ担癌マウスを用いる活性測定） ｉｎ ＶＬＶＱ法としては、たとえば、Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 ７２（１９７５）３６６６）があげら
れる。
ｃｏｍａ担癌マウスを用いる活性測定） ｉｎ ＶＬＶＱ法としては、たとえば、Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 ７２（１９７５）３６６６）があげら
れる。
本発明者らが用いている方法は、これを改良Ｉ７たもの
であり、移植したＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａによる
ｊ庄瘍を該生理活性物質が壊死きせる効果士、、ｕｌｌ
定するものである。すなわち、ＢＡＬＥＩ／ｃマウスの
下部皮肉に２Ｘ１０”個のＭｅｔｈＡ ５ａｒｃｏｒｎ
ａ ＩＩＡ胞を移植する。７日後、移植した腫瘍の大き
さが直径７〜ｓ ａｍとなり、出血性壊死などがなく良
好な血行状態にあるマウスを選び、尾静脈より生理食塩
水で希釈した０、５−の該生理活性物質試料を注射し、
２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。
であり、移植したＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａによる
ｊ庄瘍を該生理活性物質が壊死きせる効果士、、ｕｌｌ
定するものである。すなわち、ＢＡＬＥＩ／ｃマウスの
下部皮肉に２Ｘ１０”個のＭｅｔｈＡ ５ａｒｃｏｒｎ
ａ ＩＩＡ胞を移植する。７日後、移植した腫瘍の大き
さが直径７〜ｓ ａｍとなり、出血性壊死などがなく良
好な血行状態にあるマウスを選び、尾静脈より生理食塩
水で希釈した０、５−の該生理活性物質試料を注射し、
２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。
（→二変化なし
←）：かすかな出血性壊死
■二中程度の出血性壊死（移植ｆ）表面の真中から５０
％以上にわたって壊死） （＋Ｉ＋） ：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部が
重度に壊死し、周囲のガン組織がわずかに残った状態） ２） ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定（Ｌ−Ｍ細胞を用い
る活性測定） ｉｎ ｖｉｔｒｏ法による該生理活性物質活性測定（ま
、たとえば、Ｒｕｆｆら［Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、
Ｖｏｌ、 ２． Ｅ、Ｐｉｃｋ編集、 ＡｃａｃＬｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８０） ２３
５ ’］、あるいはＫｕｌｌら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、 １２６（１９８１）１２７９］の方法があげられる
。
％以上にわたって壊死） （＋Ｉ＋） ：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部が
重度に壊死し、周囲のガン組織がわずかに残った状態） ２） ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定（Ｌ−Ｍ細胞を用い
る活性測定） ｉｎ ｖｉｔｒｏ法による該生理活性物質活性測定（ま
、たとえば、Ｒｕｆｆら［Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、
Ｖｏｌ、 ２． Ｅ、Ｐｉｃｋ編集、 ＡｃａｃＬｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８０） ２３
５ ’］、あるいはＫｕｌｌら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、 １２６（１９８１）１２７９］の方法があげられる
。
本発明者らが用いている方法は、これらを改良したもの
であり、該生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクノヨン、ＣＣＬｌ、２）を殺
す効果を測定するものである。すなわち、順次培地で希
釈した該生理活性物質試料０．１−と１０ 個／ゴの濃
度のＬ−Ｍ副ｊ厄の培地芯濁液０．１ ｄを９６穴の組
織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ′ラトリー社
）に５卯える。培地は１０ Ｖ／Ｖ％のウシ胎児血清を
含ムイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（その組
成は、たとえば、「組織培養」中井順之助他偏棗、朝倉
書店、１９６７年に記載されている）を用いる。マイク
ログレートを５％の炭酸がス士含む空気中、３７℃で４
８時間培養する。培養、終了後、２０％グルタルアルデ
ヒド水（容を夜２０μＬを加え細胞を固定する。固定後
、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチ
レンブルー溶液を０．１−加え、生き残った細胞を染色
する。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残
ったメチレンブルーを３％塩酸溶液で抽出し、その６６
５ ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マルチスキ
ャン（フロー・ラボラ） ＩＪ−社）で測定する。この
吸光度は、生き残った細胞数に比例する。該生理活性物
質試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する
該生理活性物質の希釈率を、グラフあるいは計算によっ
て求め、その希釈率を単位０）／コと定義する。以下、
本発明における該生理活１生物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ活
性は、参考例１と２を除いては、すべてこの単位で表示
される。
であり、該生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクノヨン、ＣＣＬｌ、２）を殺
す効果を測定するものである。すなわち、順次培地で希
釈した該生理活性物質試料０．１−と１０ 個／ゴの濃
度のＬ−Ｍ副ｊ厄の培地芯濁液０．１ ｄを９６穴の組
織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ′ラトリー社
）に５卯える。培地は１０ Ｖ／Ｖ％のウシ胎児血清を
含ムイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（その組
成は、たとえば、「組織培養」中井順之助他偏棗、朝倉
書店、１９６７年に記載されている）を用いる。マイク
ログレートを５％の炭酸がス士含む空気中、３７℃で４
８時間培養する。培養、終了後、２０％グルタルアルデ
ヒド水（容を夜２０μＬを加え細胞を固定する。固定後
、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチ
レンブルー溶液を０．１−加え、生き残った細胞を染色
する。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残
ったメチレンブルーを３％塩酸溶液で抽出し、その６６
５ ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マルチスキ
ャン（フロー・ラボラ） ＩＪ−社）で測定する。この
吸光度は、生き残った細胞数に比例する。該生理活性物
質試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する
該生理活性物質の希釈率を、グラフあるいは計算によっ
て求め、その希釈率を単位０）／コと定義する。以下、
本発明における該生理活１生物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ活
性は、参考例１と２を除いては、すべてこの単位で表示
される。
なお、参考例１と２におけるＬ細胞障害活性の測定法は
、上記の方法と次の点で異なる。すなわち、Ｌ−Ｍｆａ
胞のかわりにＬ−９２９細胞を用いること、培地にｌ
Ｖ／Ｖ％のウシ胎児血清と５μ２／−のアクチノマイシ
ンＤを含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地を
用いること、培養時間を４８時間のかわりに２１時間と
すること、が異なる。
、上記の方法と次の点で異なる。すなわち、Ｌ−Ｍｆａ
胞のかわりにＬ−９２９細胞を用いること、培地にｌ
Ｖ／Ｖ％のウシ胎児血清と５μ２／−のアクチノマイシ
ンＤを含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地を
用いること、培養時間を４８時間のかわりに２１時間と
すること、が異なる。
以下に参考ｆｌｌおよび実施例によって本発明を詳ｒ佃
に１己す。
に１己す。
本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断わらない限シ下記の実験書に従
って実施した。
生物への導入は、特に断わらない限シ下記の実験書に従
って実施した。
（１）高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談社
（２）高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社ｉ、３
） Ｔ、１ｖｌａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）１：４）
Ｒａｙ Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ １０１巻ＡＣａｄｅｌｌｌｌＣＰｒｅｓｓ （
米国）刊参考例および実施例中で用いられる略号’Ｖ１
０ ＰＳ ニモルフォリノプロパン硫酸ＬＢ培地：ルリ
アーベルタニ培地 Ｄ１＼□ｔｓＯ：ノメチルスルフォキシドＰＦＵ ：グ
ラーク・フォーミング単位ＥＤＴＡ ：エチレンジアミ
ン四酢酸 ＳＤＳ ： ドデシルＫＦｆＲナトリウムＢＦｔＬ
：ベセスグ・リサーチ・ラボラトリ−ＤＭＴ ：ノメト
キシトリチル ｌａｃ ：ラクトース Ｔｒｉｓ ： ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ノＸＡＲ−５： ｘａフィルム（イーストマン・コダッ
ク社、米国） Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ２Ｘ ＳＳＣ１０，３０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０３０
Ｍクエン酸ナトリウム、Ｐ）（７ ３ＸＳＳＣ： ０．４５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０４５
Ｍクエン識ナトリウム、ｐＨ７ ５ＸＳＳＣ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０７５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ６ＸＳＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９０
Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ＋ ５ Ｘ Ｓ Ｓ ＰＥ
＋ Ｏ，ｉ％ＳＤＳ ＋ １００ ｐｇ７ｒｒｄｌ変性
ウシ胸腺ＤＮＡ ｆ／ハルト溶液＝１！中にフィコ−／ｌ／ （Ｆｉｃｏ
ｌｌ） ２００ｍ９、ポリビニルシロリドン２００ ”
？とウシ血清アルブミン２００・ηを含む水溶液 ５ＳＰＥ ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋１０ ｍＭ
リン酸二水素すトリウム＋ ｌ ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ、
ｐＨ７，４３Ｍ：ＩＡ中に塩化ナトリウム５．８５’、
硫酸マグネシウム・７水和物２ ｔ、 Ｉ ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）５０ ｍｅと２％ゼラチン
５−を含むファージ保存培地 ゛・ｌＺ７”ロス：ＩＡ中にＮＺアミン（フムコ・シェ
フイールド・ケミカル・デビイノヨン・オプ・クラフト
社、米国） １０ ？、塩化ナトリウム５ｆと硫酸マグ
ネシウム・７水和物２？を含む培地 ＩＰＴＣ：イソゾロビルチオガラクトシドｘ−ｇａｌ：
５−ジブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクトシ
ド ゛ｒ八へ： ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，
０） −０，００２ＭＤＴＡ ｂｐ＝塩基対 参考例１ 工程１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０ ｋｇ）にホルマリンニ
テ死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ−ｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍ 、 ウェルカム社、英国） ５０ ｍｙ
を耳静脈より注射した。該ウサギに８日後再度１００μ
？のエンドトキシン（大腸菌０２６：８６由来のりポポ
リサッカライド、ディフコ社、米国）を耳静脈より注射
し、２時間後に心臓より全採血した。採取した血液に１
００ｒｎｌ当り１００単位のへｔＲＩＪンナトリウムを
加えた後、５．ＯＯＯｒｐｍで３０分間冷却遠心操作を
行ない、血球および不溶固型物を除去した。４０羽のウ
サギより、血清ＴＮＦ３Ｘ１０単ｖｍｌの力価を有する
血漿２．４ｊが得られた。
） Ｔ、１ｖｌａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）１：４）
Ｒａｙ Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ １０１巻ＡＣａｄｅｌｌｌｌＣＰｒｅｓｓ （
米国）刊参考例および実施例中で用いられる略号’Ｖ１
０ ＰＳ ニモルフォリノプロパン硫酸ＬＢ培地：ルリ
アーベルタニ培地 Ｄ１＼□ｔｓＯ：ノメチルスルフォキシドＰＦＵ ：グ
ラーク・フォーミング単位ＥＤＴＡ ：エチレンジアミ
ン四酢酸 ＳＤＳ ： ドデシルＫＦｆＲナトリウムＢＦｔＬ
：ベセスグ・リサーチ・ラボラトリ−ＤＭＴ ：ノメト
キシトリチル ｌａｃ ：ラクトース Ｔｒｉｓ ： ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ノＸＡＲ−５： ｘａフィルム（イーストマン・コダッ
ク社、米国） Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ２Ｘ ＳＳＣ１０，３０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０３０
Ｍクエン酸ナトリウム、Ｐ）（７ ３ＸＳＳＣ： ０．４５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０４５
Ｍクエン識ナトリウム、ｐＨ７ ５ＸＳＳＣ： ０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０７５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ６ＸＳＳＣ： ０．９０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０９０
Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７ ＦＤＳＳ ： ５０％脱イオン化フォルムアミド＋５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ＋ ５ Ｘ Ｓ Ｓ ＰＥ
＋ Ｏ，ｉ％ＳＤＳ ＋ １００ ｐｇ７ｒｒｄｌ変性
ウシ胸腺ＤＮＡ ｆ／ハルト溶液＝１！中にフィコ−／ｌ／ （Ｆｉｃｏ
ｌｌ） ２００ｍ９、ポリビニルシロリドン２００ ”
？とウシ血清アルブミン２００・ηを含む水溶液 ５ＳＰＥ ： ０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋１０ ｍＭ
リン酸二水素すトリウム＋ ｌ ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ、
ｐＨ７，４３Ｍ：ＩＡ中に塩化ナトリウム５．８５’、
硫酸マグネシウム・７水和物２ ｔ、 Ｉ ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）５０ ｍｅと２％ゼラチン
５−を含むファージ保存培地 ゛・ｌＺ７”ロス：ＩＡ中にＮＺアミン（フムコ・シェ
フイールド・ケミカル・デビイノヨン・オプ・クラフト
社、米国） １０ ？、塩化ナトリウム５ｆと硫酸マグ
ネシウム・７水和物２？を含む培地 ＩＰＴＣ：イソゾロビルチオガラクトシドｘ−ｇａｌ：
５−ジブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクトシ
ド ゛ｒ八へ： ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，
０） −０，００２ＭＤＴＡ ｂｐ＝塩基対 参考例１ 工程１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０ ｋｇ）にホルマリンニ
テ死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ−ｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍ 、 ウェルカム社、英国） ５０ ｍｙ
を耳静脈より注射した。該ウサギに８日後再度１００μ
？のエンドトキシン（大腸菌０２６：８６由来のりポポ
リサッカライド、ディフコ社、米国）を耳静脈より注射
し、２時間後に心臓より全採血した。採取した血液に１
００ｒｎｌ当り１００単位のへｔＲＩＪンナトリウムを
加えた後、５．ＯＯＯｒｐｍで３０分間冷却遠心操作を
行ない、血球および不溶固型物を除去した。４０羽のウ
サギより、血清ＴＮＦ３Ｘ１０単ｖｍｌの力価を有する
血漿２．４ｊが得られた。
工程２（血清ＴＮＦの部分精製）
工程１で得た血漿２．４Ｊ！／にセライト２４１を加え
、１時間攪拌した後濾過した。戸液に１２〃の０．０４
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０、
１ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥセファ
ロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシア社、スウェーデン）
のカラムに添加した。０、Ｏｔ１Ｍｌスー塩酸３衝液で
洗滌後、Ｏ，１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍト
リス−塩酸緩衝１（ｐＨ７，２）を用いて流出した。Ｌ
細胞障害活性を示す両分を、限外濾過により濃縮した。
、１時間攪拌した後濾過した。戸液に１２〃の０．０４
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０、
１ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥセファ
ロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシア社、スウェーデン）
のカラムに添加した。０、Ｏｔ１Ｍｌスー塩酸３衝液で
洗滌後、Ｏ，１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍト
リス−塩酸緩衝１（ｐＨ７，２）を用いて流出した。Ｌ
細胞障害活性を示す両分を、限外濾過により濃縮した。
次いで０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸緩
衝１（ｐ）１７．４）で平衡化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社、スウェーデン）のカラムに該濃
縮液を添加し、同緩衝液にてゲルテ過を行った。活性区
分は限外濾過により濃縮し３．５×１０６単位を回収し
た。蛋白定量に基く比活性は１８Ｘ１０ 単位／〜で
あった。
衝１（ｐ）１７．４）で平衡化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社、スウェーデン）のカラムに該濃
縮液を添加し、同緩衝液にてゲルテ過を行った。活性区
分は限外濾過により濃縮し３．５×１０６単位を回収し
た。蛋白定量に基く比活性は１８Ｘ１０ 単位／〜で
あった。
工程３（抗ＴＮＦ抗体）
血清よυ得たＴＮＦを工程２の如く部分精製しフロイン
トの完全アジュバントを１：１で混合シ１２週令の雄Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注射した。
トの完全アジュバントを１：１で混合シ１２週令の雄Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注射した。
２週後、及び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に
全採血し、その血清を取得した。
全採血し、その血清を取得した。
この血清′ｆ、Ｌ細胞障害活性を測定する培地中に終濃
度５００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得
たＴＮＦのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障
害活性は認められなかった。ここに得たマウス血清は、
ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ抗体と称する
）を含むものと結論できた。
度５００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得
たＴＮＦのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障
害活性は認められなかった。ここに得たマウス血清は、
ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ抗体と称する
）を含むものと結論できた。
工程４ （ＴＮＦ産生細胞取得）
雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ。
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ。
ウェルカム社、英国）を静脈内投与し、７日後に気管切
開し、肺を生理食塩水で洗滌することにより浮遊性細胞
を得た。この細胞を生理食塩水で洗滌後、１０％牛脂児
血清（フロー・ラボラトリ−社、米国）を含むＲＰＭＩ
１６４０（フロー・ラビラトリー社、米国）を培地と
し、炭酸ガス５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスイン
キュベーターにて、３７℃で培養した。培養器を２コに
分け、一方には大腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０
２６：Ｂ６由来のりポポリサッカライド、ディフコ社、
米国）を１０μｆ／ｍｌとなるように添加し、一方には
同量の滅菌水を添加した。エンドトキシンを添加した培
養上清にＬ細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達し
た。この活性は、抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常マ
ウス血清では消去されなかった。
開し、肺を生理食塩水で洗滌することにより浮遊性細胞
を得た。この細胞を生理食塩水で洗滌後、１０％牛脂児
血清（フロー・ラボラトリ−社、米国）を含むＲＰＭＩ
１６４０（フロー・ラビラトリー社、米国）を培地と
し、炭酸ガス５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスイン
キュベーターにて、３７℃で培養した。培養器を２コに
分け、一方には大腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０
２６：Ｂ６由来のりポポリサッカライド、ディフコ社、
米国）を１０μｆ／ｍｌとなるように添加し、一方には
同量の滅菌水を添加した。エンドトキシンを添加した培
養上清にＬ細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達し
た。この活性は、抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常マ
ウス血清では消去されなかった。
一方、エンドトキシンを添加しなかった細胞培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められなかった。
はＬ細胞障害活性は認められなかった。
工程５ （ＴＮＦの分子量）
工程４における此胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性Ｌ−Ｃ３５Ｓ）メチオニン（１３００Ｃ’Ｖｍｍ
Ｏ４，アマージャム社、英国）を１ ｍＣｉ／ｆｎｔと
なるように添加して培養を行った。培養上清をＬａｅｍ
ｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、に、 （１９７
０年） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）２２７巻６８
０〜６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動により解析した。ゲル濃度は１２．５％となる
ように調製した。泳動後エンハンス（ニー−・イングラ
ンド・ヌクレアー社、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ
線フィルム（フッ朕。
放射性Ｌ−Ｃ３５Ｓ）メチオニン（１３００Ｃ’Ｖｍｍ
Ｏ４，アマージャム社、英国）を１ ｍＣｉ／ｆｎｔと
なるように添加して培養を行った。培養上清をＬａｅｍ
ｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、に、 （１９７
０年） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）２２７巻６８
０〜６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動により解析した。ゲル濃度は１２．５％となる
ように調製した。泳動後エンハンス（ニー−・イングラ
ンド・ヌクレアー社、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ
線フィルム（フッ朕。
富士写真フィルム）に密着露光せしめた。エンドトキシ
ン存在下に培養した培養上清に、分子量約１７５００の
物質の生成が認められた。
ン存在下に培養した培養上清に、分子量約１７５００の
物質の生成が認められた。
また工程４における細胞培養の上清を、上記と同様にＳ
ＤＳ 、ｔ？ ＩＪＪｌリルアミドゲル電気泳動に付し
た後、２５％ＮＰ４０（カルビオケム社、米国）で１時
間、水中で２時間振とう後、各泳動レーンを切断分離し
、泳動方向に直角に２ ｍｍ巾にスライスした。各スラ
イス断片をＬ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障
害性を調べた。エンドトキシン存在下に培養上清を展開
したレーンの分子量約１７５００の位置にＬ細胞障害性
が認められ、その他の位置には活性は認められなかった
。
ＤＳ 、ｔ？ ＩＪＪｌリルアミドゲル電気泳動に付し
た後、２５％ＮＰ４０（カルビオケム社、米国）で１時
間、水中で２時間振とう後、各泳動レーンを切断分離し
、泳動方向に直角に２ ｍｍ巾にスライスした。各スラ
イス断片をＬ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障
害性を調べた。エンドトキシン存在下に培養上清を展開
したレーンの分子量約１７５００の位置にＬ細胞障害性
が認められ、その他の位置には活性は認められなかった
。
工程６ （ｎｎＲＮＡの取得）
工程４と同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
滌細胞）を集めた。細胞質ＲＮＡおよびその中からのｍ
ＲＮＡの抽出は下記の如（Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの条件［
： Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌ ８巻５２９４頁（１９
７（Ｊｌ−）］に従って行った。細胞３ＸＩＯ個に対し
、４−の４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加え、ホ
モゾナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作所）にて破砕し
た。残渣を遠心除去後、２．４２の塩化セシウムを溶解
し、あらかじめ２５−の５．７Ｍ塩化セシウム、０．
Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，５）を入れであるポリ
アロマ−チューブへ静かに重層した。
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
滌細胞）を集めた。細胞質ＲＮＡおよびその中からのｍ
ＲＮＡの抽出は下記の如（Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの条件［
： Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、 Ｊ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌ ８巻５２９４頁（１９
７（Ｊｌ−）］に従って行った。細胞３ＸＩＯ個に対し
、４−の４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加え、ホ
モゾナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作所）にて破砕し
た。残渣を遠心除去後、２．４２の塩化セシウムを溶解
し、あらかじめ２５−の５．７Ｍ塩化セシウム、０．
Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，５）を入れであるポリ
アロマ−チューブへ静かに重層した。
ペックマン５Ｗ４１０−ター（ヘックマン社、米国）を
用いて２０℃３００００回転にて１２時間、超遠心分離
を行った後、上清を除き、ペレットを１０ ｍＭ ）リ
ス−塩酸緩衝１夜（５ｍＭＥＤＴＡ、 １％ＳＤＳを含
有する）１ｍｌにて溶解した。この溶液を１ｒｎｔのク
ロロホルム−１−ブタノール（４：１）混液で抽出し、
水層に０．０５容積の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５容
積のエタノールを加え、−２０℃で２時間以上放置して
ＲＮＡを沈澱させた。遠心にて沈澱を集め、乾燥させた
のち滅菌水５００μ！に溶解して、細胞質ＲＮＡ溶液を
得た。
用いて２０℃３００００回転にて１２時間、超遠心分離
を行った後、上清を除き、ペレットを１０ ｍＭ ）リ
ス−塩酸緩衝１夜（５ｍＭＥＤＴＡ、 １％ＳＤＳを含
有する）１ｍｌにて溶解した。この溶液を１ｒｎｔのク
ロロホルム−１−ブタノール（４：１）混液で抽出し、
水層に０．０５容積の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５容
積のエタノールを加え、−２０℃で２時間以上放置して
ＲＮＡを沈澱させた。遠心にて沈澱を集め、乾燥させた
のち滅菌水５００μ！に溶解して、細胞質ＲＮＡ溶液を
得た。
上記細胞質ＲＮＡ溶液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００ μｔの２倍濃度のｌ Ｑ ｍＭ トリスＥＤＴ
Ａ緩衝ｉｆＸ声７．４ （１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１
％ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２
００ηのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＢＲＬ社、米国
）カラムに展開、１倍濃度の上記バッファー１０ゴで洗
浄、溶出緩衝−夜 （１０ｍＭ ト リ ス 一塩酸
ｐＨ７，４１、１ｍＭ ＥＤＴＡ 。
５００ μｔの２倍濃度のｌ Ｑ ｍＭ トリスＥＤＴ
Ａ緩衝ｉｆＸ声７．４ （１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１
％ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２
００ηのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＢＲＬ社、米国
）カラムに展開、１倍濃度の上記バッファー１０ゴで洗
浄、溶出緩衝−夜 （１０ｍＭ ト リ ス 一塩酸
ｐＨ７，４１、１ｍＭ ＥＤＴＡ 。
０．１％ＳＤＳを含む）２−で溶出した。溶出液に０．
０５容積の酢酸す） ｌ）ラム、２．５容積のエタノー
ルを加えて一２０℃冷却にて沈澱せしめた。沈澱を遠心
にて集め、再度同様にオリが（ｄＴ）セルロースカラム
に吸着する両分を集めた。紫外吸収スペクトル分析によ
り、８５μ２のｍＲＮＡを回収した。
０５容積の酢酸す） ｌ）ラム、２．５容積のエタノー
ルを加えて一２０℃冷却にて沈澱せしめた。沈澱を遠心
にて集め、再度同様にオリが（ｄＴ）セルロースカラム
に吸着する両分を集めた。紫外吸収スペクトル分析によ
り、８５μ２のｍＲＮＡを回収した。
工程７ （ｍＲＮＡのサイズ分画）
工程６と同様にして得たＱｌＲＮＡ ８８０μ？を２５
０μｔの水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度勾配置
０−に重層した。ショ糖密度勾配は、５および２５％の
ショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸ｐ
Ｈ７，２，２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １ ％ ＳＤＳを含
有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエンター（イス
コ社、米国）により作製した。
０μｔの水に溶解し、５−２５％直線シヨ糖密度勾配置
０−に重層した。ショ糖密度勾配は、５および２５％の
ショ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸ｐ
Ｈ７，２，２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １ ％ ＳＤＳを含
有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエンター（イス
コ社、米国）により作製した。
ペックマンＳＷ４１ Ｔｉを用い、４℃４００００回転
、１２時間の超遠心を行ったのち、分画回収装置（ペッ
クマン社、米国）により各４００μｔの分画を回収した
。各分画はエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶解した
。
、１２時間の超遠心を行ったのち、分画回収装置（ペッ
クマン社、米国）により各４００μｔの分画を回収した
。各分画はエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶解した
。
工程８（ｍＲＮＡの翻訳実験）
アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、田中兼゛太部、蛋白
質、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９
８１年）に依った。アフリカッメガエルは、浜松生物教
材より得た。Ｍで得た分画ｒｎＲＮＡを１μｔ／μｔに
なるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５０
μｔずつを微量注入し、１ｍ７／−の牛血清アルブミン
を含有するＢａｒ ｔｈ浴溶液 ７．５ ｍＭ ）リス
塩酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１鮨塩化カリ、０．３
３ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１ｍＭ塩化カル７ウム、
０．８２ｍＭ硫酸マグネシウム、２．４ｍＭ重炭酸ナト
リウム、１８Ｕ／ｍ／ペニシリン０１１８μυ賃ストレ
プトマイシンを含有する）中で２４時間培養した。培養
液のまま卵母細胞をつぶし、遠心後、上清のし細胞障害
性を測定した。沈降定数１６３付近において、Ｌ細胞障
害活性が最高値を与えた。またこの活性は工程３で得た
抗ＴＮＦ抗体により消去されたが正常マウス血清ではＣ
消去されなかった。
実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、田中兼゛太部、蛋白
質、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９
８１年）に依った。アフリカッメガエルは、浜松生物教
材より得た。Ｍで得た分画ｒｎＲＮＡを１μｔ／μｔに
なるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５０
μｔずつを微量注入し、１ｍ７／−の牛血清アルブミン
を含有するＢａｒ ｔｈ浴溶液 ７．５ ｍＭ ）リス
塩酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１鮨塩化カリ、０．３
３ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１ｍＭ塩化カル７ウム、
０．８２ｍＭ硫酸マグネシウム、２．４ｍＭ重炭酸ナト
リウム、１８Ｕ／ｍ／ペニシリン０１１８μυ賃ストレ
プトマイシンを含有する）中で２４時間培養した。培養
液のまま卵母細胞をつぶし、遠心後、上清のし細胞障害
性を測定した。沈降定数１６３付近において、Ｌ細胞障
害活性が最高値を与えた。またこの活性は工程３で得た
抗ＴＮＦ抗体により消去されたが正常マウス血清ではＣ
消去されなかった。
工程９（形質転換体の取得）
工程７で得／ヒ分画＋ｎＲＮＡを５μ？を用い、実験書
（１） ９７頁以降に従って二重鎖ＤＮＡを調製した。
（１） ９７頁以降に従って二重鎖ＤＮＡを調製した。
逆転写酵素はライフサイエンス社（米国）のものを使用
した。二重鎖ＤＮＡを、３．５％ゲル濃度のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００〜２
０００塩基対（以下塩基対をｂｐと略す）の画分３３０
１を得た。この両分７ ｎｒを用い同上の実験書に従い
、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（ＢＲＬ社）を用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様に
Ｐｓｔ １部位にデオキンＧ鎖をつないだプラスミドｐ
ＢＲ３２２５６ｎＰとアニールせしめた。アニール後の
混合物を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＨＢ
ＩＯＩ 、 ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換し、１２
０００株の形質転換体を得た。
した。二重鎖ＤＮＡを、３．５％ゲル濃度のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００〜２
０００塩基対（以下塩基対をｂｐと略す）の画分３３０
１を得た。この両分７ ｎｒを用い同上の実験書に従い
、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（ＢＲＬ社）を用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様に
Ｐｓｔ １部位にデオキンＧ鎖をつないだプラスミドｐ
ＢＲ３２２５６ｎＰとアニールせしめた。アニール後の
混合物を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＨＢ
ＩＯＩ 、 ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換し、１２
０００株の形質転換体を得た。
工程Ｉ Ｑ （ＴＮＦの部分アミノ酸配列）工程２で部
分精製したＴＮＦ’ｉ、工程５におけると同様にＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。一部
をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約１
７０００の位置にある。＜ンドをゲルから切出し、１％
重炭酸アンモニウムにより抽出した。５Ｘ１０’単位の
ＴＮＦを使用し、蛋白として約１８０μｍを回収した。
分精製したＴＮＦ’ｉ、工程５におけると同様にＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。一部
をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約１
７０００の位置にある。＜ンドをゲルから切出し、１％
重炭酸アンモニウムにより抽出した。５Ｘ１０’単位の
ＴＮＦを使用し、蛋白として約１８０μｍを回収した。
このうち１５０μ２を１％重炭酸アンモニウム７５μグ
に溶解、ＴＰＣＫトリプシン（ワーシントン・バイオケ
ミカル社、米国）を３μグを添加し、３７℃、４時間イ
ンキュベートした。反応液をコスモシール５Ｃ８（牛丼
化学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより
分画し、トリプンン消化断片を得た・ 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトＩＪ
ｆ ／ン消化断片は、次に、セフアゾ、クスＣ）２５の
カラムで脱塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスア
ナライザー・モデル４７０Ａ（アノライトバイオンステ
ム社、米国）を用いＲ＝Ｍ、 Ｈｅｗｉｃｋらの方法（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５６巻７９９０−７９
９７頁、１９８１年）に準じて、Ｎ末端よりエドマン分
解を行った。各ステ、プにおいて遊離してくるフェニル
チオヒグントインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフ
ィーモデル５Ｐ８１００（スペクトラフィシ２クス社、
米国）を用い、ゾル／’Ｆ ツクスＯＤＳ （デュ・ボ
ン社、米国）ヲカラムとして、常法により分析した。こ
の結果、ＴＮＦのＮ末端側からのアミノ酸配列は下記の
通シであった。
に溶解、ＴＰＣＫトリプシン（ワーシントン・バイオケ
ミカル社、米国）を３μグを添加し、３７℃、４時間イ
ンキュベートした。反応液をコスモシール５Ｃ８（牛丼
化学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより
分画し、トリプンン消化断片を得た・ 上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトＩＪ
ｆ ／ン消化断片は、次に、セフアゾ、クスＣ）２５の
カラムで脱塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスア
ナライザー・モデル４７０Ａ（アノライトバイオンステ
ム社、米国）を用いＲ＝Ｍ、 Ｈｅｗｉｃｋらの方法（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５６巻７９９０−７９
９７頁、１９８１年）に準じて、Ｎ末端よりエドマン分
解を行った。各ステ、プにおいて遊離してくるフェニル
チオヒグントインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフ
ィーモデル５Ｐ８１００（スペクトラフィシ２クス社、
米国）を用い、ゾル／’Ｆ ツクスＯＤＳ （デュ・ボ
ン社、米国）ヲカラムとして、常法により分析した。こ
の結果、ＴＮＦのＮ末端側からのアミノ酸配列は下記の
通シであった。
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓ
’ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒ。
’ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒ。
Ｌｓｕ Ａｈａ Ｈｌｓ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｉ、′１ ＶａｌＧ
ｌｕ Ｇｌｙ Ｃ）ｉｎ ＬｅｕＧｌｎまたトリプ７／
消化断片のうちの１つは、そのＮ末端より下記のアミノ
酸配列であった。
Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｉ、′１ ＶａｌＧ
ｌｕ Ｇｌｙ Ｃ）ｉｎ ＬｅｕＧｌｎまたトリプ７／
消化断片のうちの１つは、そのＮ末端より下記のアミノ
酸配列であった。
（）ｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｃ）ｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ａｌａ
工程１１（オリゴ’ ＤＮＡプローブの合成）工程１０
で得たＴＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡの
塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮＡを合成した。
Ａｌａ Ｃ）ｌｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ａｌａ
工程１１（オリゴ’ ＤＮＡプローブの合成）工程１０
で得たＴＮＦのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡの
塩基配列に対し、相補的な、オリゴＤＮＡを合成した。
合成方法は、Ｉｔｏらが既に発表している改良リン酸ト
リエステル法（Ｈ，Ｉｔｏ ｅｔ ａｎ。
リエステル法（Ｈ，Ｉｔｏ ｅｔ ａｎ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０巻 １７
５５〜１７６９頁、１９８２年）により行った。
５５〜１７６９頁、１９８２年）により行った。
アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴＤＮＡ
を５グループに別け、各々１６． １６，３２゜３２．
３２種類の混合物として合成した。
を５グループに別け、各々１６． １６，３２゜３２．
３２種類の混合物として合成した。
表１に本発明の新規生理活性物質のアミノ酸配列の一部
と、これに基く５種類の合成オリゴＤＮＡ。
と、これに基く５種類の合成オリゴＤＮＡ。
のグローブの塩基配列を示す。各々を常法に従って脱保
護し、０−５０（ファルマシア社、スウェーデン）ヲ用
いるカラムクロマトグラフィー、７Ｍ尿素金含む２０％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び、ＤＥ５２（ワッ
トマン社、米国）カラムクロマトグラフィーにより精製
し、０．１ ｍＭ ）リスＥＤＴＡ緩衝液に対し透析し
た。
護し、０−５０（ファルマシア社、スウェーデン）ヲ用
いるカラムクロマトグラフィー、７Ｍ尿素金含む２０％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び、ＤＥ５２（ワッ
トマン社、米国）カラムクロマトグラフィーにより精製
し、０．１ ｍＭ ）リスＥＤＴＡ緩衝液に対し透析し
た。
各々の精製オリゴ” ＤＮ八を常法によりＴ４醪リヌク
レオチドキナーゼ（バイオラッドラボラトリーズ社、米
国）およびγ−３２Ｐ−アゾ／シントリリン酸を用いて
放射性ラベルし、ＤＥ５２カラムにより精製した。各々
、約３ ×１０ ｃｐｍ／μ２の放射能が導入された。
レオチドキナーゼ（バイオラッドラボラトリーズ社、米
国）およびγ−３２Ｐ−アゾ／シントリリン酸を用いて
放射性ラベルし、ＤＥ５２カラムにより精製した。各々
、約３ ×１０ ｃｐｍ／μ２の放射能が導入された。
工程１２（オリゴヌクレオチドの検定）工程６に従って
得たＴＮＦ注生副生細胞ＲＮＡをグリオキザール及びツ
メチルスルホキシドの存在下に５０℃６０分間処理した
のち、１１％アガロースゲル電気泳動により分画した。
得たＴＮＦ注生副生細胞ＲＮＡをグリオキザール及びツ
メチルスルホキシドの存在下に５０℃６０分間処理した
のち、１１％アガロースゲル電気泳動により分画した。
分画されたｍＲＮＡｔ１電気泳動式トランスファープロ
ティング装置（バイオラッドラボラトリーズ社、米国）
を用いて、メーカーのマニュアルに従い、移動せしめた
。
ティング装置（バイオラッドラボラトリーズ社、米国）
を用いて、メーカーのマニュアルに従い、移動せしめた
。
次いで、この膜上のｍＲＮＡと、５ Ｘ ＳＳＣ及び１
５０μＬ？／Ｔｎ１．の変性サケ精子ＤＮＡを含む５×
デンノ・ルト溶液で６５℃、２時間処理したのち、放射
註環識したオリがＤＮＡをＩ Ｘ １０７ｃｐｍＡｎｌ
、 ５ Ｘ ＳＳＣ溶７夜を含む５×デン・・ルト溶
液で５０℃、２時間処理した。次いでこの膜を６ ｘ
ｓｓｃで室温、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗滌し、
Ｘ線フィルムｘＡＢ−５に対し露光せしめた。この結果
、ｍＲＮＡと最も強く−へイブリグイズするオリゴＤＮ
Ａは、ＭＪであって、ＭＪ混合中にｍＲＮＡと完全に相
補的な配列を有するオリゴＤＮＡが含まれていることが
判明した。
５０μＬ？／Ｔｎ１．の変性サケ精子ＤＮＡを含む５×
デンノ・ルト溶液で６５℃、２時間処理したのち、放射
註環識したオリがＤＮＡをＩ Ｘ １０７ｃｐｍＡｎｌ
、 ５ Ｘ ＳＳＣ溶７夜を含む５×デン・・ルト溶
液で５０℃、２時間処理した。次いでこの膜を６ ｘ
ｓｓｃで室温、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗滌し、
Ｘ線フィルムｘＡＢ−５に対し露光せしめた。この結果
、ｍＲＮＡと最も強く−へイブリグイズするオリゴＤＮ
Ａは、ＭＪであって、ＭＪ混合中にｍＲＮＡと完全に相
補的な配列を有するオリゴＤＮＡが含まれていることが
判明した。
（メｒ余白）
リ〆 ニ
ド ：
セ′Ｊｆ、セト
工程１３ （ＴＮＦ遺伝子のクローニング）工程９で得
た形質転換体を実験書（２） １６２頁の方法に従って
セルロースフィルター上に移し、そのＤＮＡと、工程１
２で選択された放射性標識オリゴＤＮＡ （ＭＪ）とを
工程１２と同様の条件で・・イブリダイズせしめた（コ
ロニー・ハイブリグイゼーノヨン）。強く・・イブリグ
イズする味４９個を選び更にフィルター上に固定して再
度コロニー・・イブリダイゼーションを実施し、９Ｉ（
ｌ！ｌを選んだ。
た形質転換体を実験書（２） １６２頁の方法に従って
セルロースフィルター上に移し、そのＤＮＡと、工程１
２で選択された放射性標識オリゴＤＮＡ （ＭＪ）とを
工程１２と同様の条件で・・イブリダイズせしめた（コ
ロニー・ハイブリグイゼーノヨン）。強く・・イブリグ
イズする味４９個を選び更にフィルター上に固定して再
度コロニー・・イブリダイゼーションを実施し、９Ｉ（
ｌ！ｌを選んだ。
この９個の株から、実験書（１）６頁の迅速グラスミド
分離法に従って各々約５μｔのプラスミドを取得した。
分離法に従って各々約５μｔのプラスミドを取得した。
このプラスミドを制限酵素Ｐｓｔ １ 、 Ｔａｑｌ
＋ Ｒｓａ ［＋ Ｐｖｕ Ｕ （いずれもＢＲＬ社）
を用い、メーカーのマニュアルに従って切断し、１％ア
ガロースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長
さを比較した。
＋ Ｒｓａ ［＋ Ｐｖｕ Ｕ （いずれもＢＲＬ社）
を用い、メーカーのマニュアルに従って切断し、１％ア
ガロースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長
さを比較した。
この結果、９株すべてが、約５０ ｂｐのＰｖｕ■とＲ
ｓａ ｌによる断片を有し、８株がＲｓａ Ｉによるｔ
ワ２００ ｂｐの断片を有し、共通の配列を有すること
が示唆された。第１図に制限酵素による解析結果を図示
する。
ｓａ ｌによる断片を有し、８株がＲｓａ Ｉによるｔ
ワ２００ ｂｐの断片を有し、共通の配列を有すること
が示唆された。第１図に制限酵素による解析結果を図示
する。
また、このうち７株′！１−１０μｒ／ｒｎｔのテトラ
サイクリンを含む２ｒｎｔのＬ培地中で培養し、遠心に
て渠めた菌体を２−の生理食塩水中で超音波により仮枠
し、遠・Ｌ・上清のＬ細胞障害活性を測定したところ、
表２に示す如く、Ｌ細胞障害活性を示した。
サイクリンを含む２ｒｎｔのＬ培地中で培養し、遠心に
て渠めた菌体を２−の生理食塩水中で超音波により仮枠
し、遠・Ｌ・上清のＬ細胞障害活性を測定したところ、
表２に示す如く、Ｌ細胞障害活性を示した。
またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されなかった。従ってこの９株すべてが
’ＴＴｈｌＦ遺伝子を含むプラスミドを有していること
が示され念。
ス血清では消去されなかった。従ってこの９株すべてが
’ＴＴｈｌＦ遺伝子を含むプラスミドを有していること
が示され念。
表２ 各種形質転換体によるＬ細胞障害活性ｐＢ２−２
１４００ １．３６９ ３５ｐＢ２−３
ｓｏｏ １．６’０５ ＜１０ｐＢ２−
７ １０５０ １．３６４ ＜１０１１）Ｒ
９１５５０１，６１８＜１０ ｐＲ１２１４００１，４５８１５ ＤＲ１８１８５０１，４３８＜１０ ｐＲ２５１３５０１，５１４＜１０ ｐＢＲ３２２０１６７７＜１０ 工程１４ （ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラスミ
ドｐＢ２−７、およびｐＲ１８を含有する大腸菌株２１
１０μｍ／−のテトラサイクリンを含有するＭ９培地〔
実験書（３）４４０頁〕１！中で培養し７た後、実験書
（３） ９０頁の方法に従ってプラスミドを単離し、各
々約１５０μグを得た。
１４００ １．３６９ ３５ｐＢ２−３
ｓｏｏ １．６’０５ ＜１０ｐＢ２−
７ １０５０ １．３６４ ＜１０１１）Ｒ
９１５５０１，６１８＜１０ ｐＲ１２１４００１，４５８１５ ＤＲ１８１８５０１，４３８＜１０ ｐＲ２５１３５０１，５１４＜１０ ｐＢＲ３２２０１６７７＜１０ 工程１４ （ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラスミ
ドｐＢ２−７、およびｐＲ１８を含有する大腸菌株２１
１０μｍ／−のテトラサイクリンを含有するＭ９培地〔
実験書（３）４４０頁〕１！中で培養し７た後、実験書
（３） ９０頁の方法に従ってプラスミドを単離し、各
々約１５０μグを得た。
各々の塩基配列をマキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ
ｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、 ５５巻４９０頁１９８０年、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ ）に従って決定した０また、この塩基
配列と工８９で決定された部分アミノ酸配列の一致によ
り、ＴＮＦ蛋白の全構造が解明された。
ｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、 ５５巻４９０頁１９８０年、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ ）に従って決定した０また、この塩基
配列と工８９で決定された部分アミノ酸配列の一致によ
り、ＴＮＦ蛋白の全構造が解明された。
工程１５
プラスミ５ｐＲ１２の組み換え体を用いてＥ、 ｃｏｉ
ｉ内でｌａｃをブロモ−ターとして’Ｌ’ＮＦを発現さ
せることを目的にプラスミドの構築を行った。第２図に
示す様に１０μｍのグラスミドｐＲ１２をＩＯユニット
のＡｐａ ［（’ＢＲＬ社）で３７℃で２時間消化し、
４％のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で示り６３
０ ｂｐ断片を単離した。約１μｍの断片がゲルから電
気泳動溶出した。工程１０と同様の方法によって図示の
２＠のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、 ５′−（）
ＡＴＣＣＡＴＣ）ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣ）ＧＣ）ＣＣ
−３’と５′−Ｃ（）Ａ（）ＡＡ（）ＣＴＧＡＣＡＴＧ
−３’ （第２図）とを合成し、実、験書（３） １
２２頁に従って約１” ＯＯｐｍｏｌｅの各デオキシオ
リゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化した。反応終了液をフェノール
を用いて抽出し、さらにクロロフォルム抽出した後、オ
リゴマー１ｃＯ，５μＶの約６３０塩基対のＡｐａ ｌ
断片と合せてエタノール沈澱した。
ｉ内でｌａｃをブロモ−ターとして’Ｌ’ＮＦを発現さ
せることを目的にプラスミドの構築を行った。第２図に
示す様に１０μｍのグラスミドｐＲ１２をＩＯユニット
のＡｐａ ［（’ＢＲＬ社）で３７℃で２時間消化し、
４％のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で示り６３
０ ｂｐ断片を単離した。約１μｍの断片がゲルから電
気泳動溶出した。工程１０と同様の方法によって図示の
２＠のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、 ５′−（）
ＡＴＣＣＡＴＣ）ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣ）ＧＣ）ＣＣ
−３’と５′−Ｃ（）Ａ（）ＡＡ（）ＣＴＧＡＣＡＴＧ
−３’ （第２図）とを合成し、実、験書（３） １
２２頁に従って約１” ＯＯｐｍｏｌｅの各デオキシオ
リゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化した。反応終了液をフェノール
を用いて抽出し、さらにクロロフォルム抽出した後、オ
リゴマー１ｃＯ，５μＶの約６３０塩基対のＡｐａ ｌ
断片と合せてエタノール沈澱した。
実験書（１）３７頁に従って１０ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合した。
リガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合した。
反応終了液をエタノール沈澱後、２０：３−ニットのＢ
ａｍＨｌで３７℃３時間消化し、４チのポリアクリルア
ミド上の電気泳動にかけ、約６７０ ｂｐの断片を電気
泳動溶出により回収した。市販のグラスミドｐＵＣ−８
（Ｐ−Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６、米
国）１μ２をＢａｍＨ［で消化してフェノール抽出、ク
ロロフォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベク
ター０．５μｔに約６７０ ｂｐ■ＴＮＦの全構造遺伝
子を含む両端がＢａｍＨｌサイトを持った断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合した。
ａｍＨｌで３７℃３時間消化し、４チのポリアクリルア
ミド上の電気泳動にかけ、約６７０ ｂｐの断片を電気
泳動溶出により回収した。市販のグラスミドｐＵＣ−８
（Ｐ−Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６、米
国）１μ２をＢａｍＨ［で消化してフェノール抽出、ク
ロロフォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベク
ター０．５μｔに約６７０ ｂｐ■ＴＮＦの全構造遺伝
子を含む両端がＢａｍＨｌサイトを持った断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合した。
実旅書（４）、２０頁に・従がって、Ｅ、 ｃｏｌｉ
ＪＭＩ ０１（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換してＩ
ＰＴＣ）及びｘ−ｇａｌを含む寒天培地が約２００個の
白色コロニーを得た。これらのトランスフォーマント１
００個からグラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩで消
化したところ、１５個が目的の約６７０ ｂｐのＢａｍ
Ｈｌ断片を含んでいた。さらに、挿入の方向を調べるた
めに、上記１５個のプラスミドをそれぞれ１ケ所しか認
識部位がないＥｃｏＲＩ （ｐｕｃ −８上に認識部位
がある）とｐｖｕ ｎ （約６７０ ｂｐの断片上に認
識部位がある）を用いて消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べたところ、７個のプラスミ
ドから目的の約１４０ ｂｐの断片が確認され、ｐＵｃ
−８上のｌａｃプロモーターから順方向であることが
判明した。
ＪＭＩ ０１（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換してＩ
ＰＴＣ）及びｘ−ｇａｌを含む寒天培地が約２００個の
白色コロニーを得た。これらのトランスフォーマント１
００個からグラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩで消
化したところ、１５個が目的の約６７０ ｂｐのＢａｍ
Ｈｌ断片を含んでいた。さらに、挿入の方向を調べるた
めに、上記１５個のプラスミドをそれぞれ１ケ所しか認
識部位がないＥｃｏＲＩ （ｐｕｃ −８上に認識部位
がある）とｐｖｕ ｎ （約６７０ ｂｐの断片上に認
識部位がある）を用いて消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて調べたところ、７個のプラスミ
ドから目的の約１４０ ｂｐの断片が確認され、ｐＵｃ
−８上のｌａｃプロモーターから順方向であることが
判明した。
塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びＣＤＮＡ間の結
合部に所望のヌクレチオド配列を有することが確認され
た。
、ｌａｃプロモーター、合成りＮＡ及びＣＤＮＡ間の結
合部に所望のヌクレチオド配列を有することが確認され
た。
工程１６
プラスミドｐＲ１７を用いて、Ｅ、 ｃｏｌｉ内で１ａ
ｃＵＶ５プロモーターとしてＴＮＦを直接発現させるこ
とを目的にプラスミドの構築を行った。第３図に示す様
に１０μｍのプラスミドｐＥｉ１７を１０ユニツトのＡ
ｐａ Ｉ （ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４チの
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６３０ｂｐの断片
を単離した。約１μ２の断片がゲルから電気泳動溶出し
た。工程１０と同様の方法によって図示の２個のデオキ
ンオ“リボヌクレオチド即チ、５′ＡＡＴＴＣＡＴＯＴ
ＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’と５７−ＣＯＡ（
）ＡＡＧＣＴ、ＧＡＣＡＴ（） −３’とを合成し、実
験書（３）１２２頁に従って約１００ ｐｍｏｌｅの上
記２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。反応
終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロフォ
ルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のＡｐａ Ｉ消化断
片（約６３０ｂｐ）０．５μｍと合わせてエタノール沈
澱した。実験書（１）３７頁に従って１０ユニ、ットの
Ｔ４リガーぜで４℃１夜反応させ、結合せしめた。
ｃＵＶ５プロモーターとしてＴＮＦを直接発現させるこ
とを目的にプラスミドの構築を行った。第３図に示す様
に１０μｍのプラスミドｐＥｉ１７を１０ユニツトのＡ
ｐａ Ｉ （ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４チの
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６３０ｂｐの断片
を単離した。約１μ２の断片がゲルから電気泳動溶出し
た。工程１０と同様の方法によって図示の２個のデオキ
ンオ“リボヌクレオチド即チ、５′ＡＡＴＴＣＡＴＯＴ
ＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’と５７−ＣＯＡ（
）ＡＡＧＣＴ、ＧＡＣＡＴ（） −３’とを合成し、実
験書（３）１２２頁に従って約１００ ｐｍｏｌｅの上
記２種のデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。反応
終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロフォ
ルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のＡｐａ Ｉ消化断
片（約６３０ｂｐ）０．５μｍと合わせてエタノール沈
澱した。実験書（１）３７頁に従って１０ユニ、ットの
Ｔ４リガーぜで４℃１夜反応させ、結合せしめた。
反応後、反応液をエタノール沈澱し、２０ユニ。
トのＥｃｏＲＩで３７℃３時間消化し、４チのポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動により約６７０ ｂｐの断
片を電気泳動により回収した。
リルアミドゲル上の電気泳動により約６７０ ｂｐの断
片を電気泳動により回収した。
プラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法（Ｆ。
Ｆｕｌｌｅｒ、 Ｇｅｔｎｅ＋ １９巻４２頁〜５４頁
１９８２年）に従って調製した。
１９８２年）に従って調製した。
ｐＯＰ９５−１５の１ ｔｔｆ ｆ ＥｃｏＲＩで消化
してフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈
澱をして調製したベクター０．５μ２と、上記の如く合
成デオキシオリゴ８ヌクレオチドと、ＴＮＦ遣云遺伝結
合して得た約６７０ ｂｐの断片を、Ｔ４ ＤＮＡ ’
）ガーゼを用いて結合した。実験書（４）、２０頁に従
って、左ｃｏｌ−ｉ ＪＭｌｏｌ （ＡＴＣＣ３３８７
６）を形質転換してＬＰＴｔ：。
してフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈
澱をして調製したベクター０．５μ２と、上記の如く合
成デオキシオリゴ８ヌクレオチドと、ＴＮＦ遣云遺伝結
合して得た約６７０ ｂｐの断片を、Ｔ４ ＤＮＡ ’
）ガーゼを用いて結合した。実験書（４）、２０頁に従
って、左ｃｏｌ−ｉ ＪＭｌｏｌ （ＡＴＣＣ３３８７
６）を形質転換してＬＰＴｔ：。
及びｘ −ｇａｌを含む寒天培地上に約１５０個の白色
コロニーを得た。
コロニーを得た。
これらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲｌで消化したところ１２個が、目的の約６
７０ ｂｐのＥｃｏＲｌ断片を有してい之。さらに挿入
の方向を調べるために上記１２個のプラスミドをＰｖｕ
■とＰｓｔ Ｉを用いてン肖化し、１５％アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、４個のプラスミドか
ら目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂｐの断片が確認
され、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターカラ順方向してＴＮ
Ｆ遺伝子が接続されていることが判明した。
し、ＥｃｏＲｌで消化したところ１２個が、目的の約６
７０ ｂｐのＥｃｏＲｌ断片を有してい之。さらに挿入
の方向を調べるために上記１２個のプラスミドをＰｖｕ
■とＰｓｔ Ｉを用いてン肖化し、１５％アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、４個のプラスミドか
ら目的の約１２８０ｂｐ及び２６００ｂｐの断片が確認
され、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターカラ順方向してＴＮ
Ｆ遺伝子が接続されていることが判明した。
塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一で
、ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌ
クレオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていること
が確認された（ ｐＴＮＦ −１ａｃＵＶ５−１と命名
する）。
、ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌ
クレオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていること
が確認された（ ｐＴＮＦ −１ａｃＵＶ５−１と命名
する）。
工程１７（大腸菌の生産するＴＮＦの精製）工程１６で
得られたグラスミドを含有する大腸Ｍ 株’ｆ： １０
０μｆ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ培地５０−で
１夜培養し、５！の同上の培地に移して更に３時間培養
した。イングロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）を終濃度
１ ｍＭになる様に添加し、更に６時間培養を続けたの
ち冷却し、遠心分離により菌株を集めた。工程１３にお
けると同様に菌体を０．０４Ｍ ） リス−塩酸緩衝１
（ＰＨ７，８） ５ Ａ中で超音波破砕し、菌体蛋白
溶液を得た。この溶液は５Ｘ１０単位／！のＬ細胞障害
活性を示した。
得られたグラスミドを含有する大腸Ｍ 株’ｆ： １０
０μｆ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ培地５０−で
１夜培養し、５！の同上の培地に移して更に３時間培養
した。イングロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）を終濃度
１ ｍＭになる様に添加し、更に６時間培養を続けたの
ち冷却し、遠心分離により菌株を集めた。工程１３にお
けると同様に菌体を０．０４Ｍ ） リス−塩酸緩衝１
（ＰＨ７，８） ５ Ａ中で超音波破砕し、菌体蛋白
溶液を得た。この溶液は５Ｘ１０単位／！のＬ細胞障害
活性を示した。
この溶液を工程２と同様に精製を行った結果１．２ＸＩ
Ｏ６単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６．８Ｘ
１０ 単位／ｍｙであった。
Ｏ６単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６．８Ｘ
１０ 単位／ｍｙであった。
工程１８ （Ｍｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ担癌マウス
を用いる活性評価） 工程１７で得られたＴＮＦを、本文中記載の二二二法に
よってその活性を評価した。
を用いる活性評価） 工程１７で得られたＴＮＦを、本文中記載の二二二法に
よってその活性を評価した。
また、試料投与後２０日目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率を求めた。
かを観察し完治率を求めた。
以上の方法により測定した、大腸菌の生産するＴＮＦの
活性を表３に示す。
活性を表３に示す。
（双下衆冑）
表 ３
２Ｘ１０５ ５００１４ ５１５対照 ５５
００００１５ 生理食塩水 完治率：完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数参
考例２ 工程１（プラスミドｐＲ１８，ｐＢ２−７．ｐＢ２−２
のＥ、 Ｃｏ１１ Ｋ ｌ ２ 、ＭＣ１０６１株への
形質転換）参考例１で得た、上記３種のプラスミドを常
法に従ってＥ、 Ｃｏ１１ Ｋｌ ２ 、 ＭＣ１０６
１株へ形質転換した。
００００１５ 生理食塩水 完治率：完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数参
考例２ 工程１（プラスミドｐＲ１８，ｐＢ２−７．ｐＢ２−２
のＥ、 Ｃｏ１１ Ｋ ｌ ２ 、ＭＣ１０６１株への
形質転換）参考例１で得た、上記３種のプラスミドを常
法に従ってＥ、 Ｃｏ１１ Ｋｌ ２ 、 ＭＣ１０６
１株へ形質転換した。
詳しくはＥ、Ｃ０１Ｉ Ｋ １２ 、 ＭＣ１，０６１
株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍの吸光度
が０．３になるまで培養した。該培養液５０ｒｎｌを集
菌した後、２５−の１０ ｍＭ ＲｂＣ１を含む１０
ｍＭ ＭＯＰＳ （ｐＨ７，０）溶液で洗浄し、次いで
５０ ｍＭ ＣａＣｌ２． ｌ ＯｍＭ ＲｂＣｔを含
む０、１ Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５）に再び懸濁し
た。
株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍの吸光度
が０．３になるまで培養した。該培養液５０ｒｎｌを集
菌した後、２５−の１０ ｍＭ ＲｂＣ１を含む１０
ｍＭ ＭＯＰＳ （ｐＨ７，０）溶液で洗浄し、次いで
５０ ｍＭ ＣａＣｌ２． ｌ ＯｍＭ ＲｂＣｔを含
む０、１ Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５）に再び懸濁し
た。
該懸、濁液を３０分間氷冷し、遠心した後、上清を除去
し、３０ ｔｔＬのＤＭＳＯおよび５０ ｍＭ ＣａＣ
６２と１０吐ＲｂＣ４を含む０．１ Ｍ ＭＯＰＳ （
ｐＨ６，５）の混合液中に懸濁させた。該懸濁液を２０
３μｔずつ分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μ
ｔをそれぞれに加えた。
し、３０ ｔｔＬのＤＭＳＯおよび５０ ｍＭ ＣａＣ
６２と１０吐ＲｂＣ４を含む０．１ Ｍ ＭＯＰＳ （
ｐＨ６，５）の混合液中に懸濁させた。該懸濁液を２０
３μｔずつ分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μ
ｔをそれぞれに加えた。
該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あ ・らかしめ３
７℃に温めておいた５−のＬＢ培地を加えた。この溶液
を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心し
、上清を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ベレット
にＬＢ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とした。該懸濁
液を、３０μグ／ｒｎｔのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なった。そ
の結果プラスミドｐＲ１８，ｐＢ２−７とｐＢ２−２か
らそれぞれテトラサイクリノ耐性形質転換菌のコロニー
が得られた。
秒ヒートショックを与え、ただちに、あ ・らかしめ３
７℃に温めておいた５−のＬＢ培地を加えた。この溶液
を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心し
、上清を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ベレット
にＬＢ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とした。該懸濁
液を、３０μグ／ｒｎｔのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なった。そ
の結果プラスミドｐＲ１８，ｐＢ２−７とｐＢ２−２か
らそれぞれテトラサイクリノ耐性形質転換菌のコロニー
が得られた。
工程２ （ｐＢ２−７とｐＢ１８シラスミドＤＮＡの調
製）工程１で得られたグラスミドｐＢ２−７とｐＨ１８
の形質転換体を、下記の報文の方法に従って培養し、プ
ラスミドを増幅させた。次いで得られた形質転換体を集
菌し、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製した。〔
実装置（３）、８８−９６頁〕即ち、ＬＢ培地に、それ
ぞれの形質転換体を植菌し、激しく振とうしながら３７
℃で培養した。
製）工程１で得られたグラスミドｐＢ２−７とｐＨ１８
の形質転換体を、下記の報文の方法に従って培養し、プ
ラスミドを増幅させた。次いで得られた形質転換体を集
菌し、破砕したのち、プラスミドＤＮＡを精製した。〔
実装置（３）、８８−９６頁〕即ち、ＬＢ培地に、それ
ぞれの形質転換体を植菌し、激しく振とうしながら３７
℃で培養した。
次いで、この工程をくりかえして形質転換体を増殖させ
更にプラスミドを増幅させた。次に得られた形質転換体
の培養液を４℃に冷却しながら、４．０ＯＯＧで１０分
間遠心を行ない、上清を除去した。
更にプラスミドを増幅させた。次に得られた形質転換体
の培養液を４℃に冷却しながら、４．０ＯＯＧで１０分
間遠心を行ない、上清を除去した。
氷冷ＳＴＥ ［： ０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ８，０）と１ ｍＭ
、 ＥＤＴＡ ）の１００ｒｎｔを用いて洗浄し、続い
て１０ｍＭ）ＩＪスス−酸緩衝液（ＰＨ８，０）中に２
０η／−のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を破壊
した。得られた粘性液体を超遠心チューブに移し入れ、
２５．００Ｏｒｐｍ ３０分間＝１ ℃で遠心を行なっ
てＤＮＡ溶液を得た。
）リス−塩酸緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ８，０）と１ ｍＭ
、 ＥＤＴＡ ）の１００ｒｎｔを用いて洗浄し、続い
て１０ｍＭ）ＩＪスス−酸緩衝液（ＰＨ８，０）中に２
０η／−のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を破壊
した。得られた粘性液体を超遠心チューブに移し入れ、
２５．００Ｏｒｐｍ ３０分間＝１ ℃で遠心を行なっ
てＤＮＡ溶液を得た。
該ＤＮＡ ＠液の容量を測った後、該溶液１−当りに、
固体の塩化セシウム１ｆを加え、塩化セシウムが完全に
溶けるまで、ゆつく９と注意深く攪拌した。該塩化セシ
ウム水溶液の１〇−毎に、１０■／７！のエチジウムブ
ロマイド水溶液０．８−を加えた。この結果、該溶液の
最終比重は１．５５ ？／ｒｎｔ。
固体の塩化セシウム１ｆを加え、塩化セシウムが完全に
溶けるまで、ゆつく９と注意深く攪拌した。該塩化セシ
ウム水溶液の１〇−毎に、１０■／７！のエチジウムブ
ロマイド水溶液０．８−を加えた。この結果、該溶液の
最終比重は１．５５ ？／ｒｎｔ。
エチジウムブロマイドの最終濃度は約６００μυ賃とな
った。
った。
該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽・ぐラフインオイルを加え、２０℃で３６時間、
４５．ＯＯＯｒｐｍの遠心を続けると上層に線“状の微
生物由来ＤＮＡと環状プラスミドＤＮＡの開環したもの
、下層に閉環状のプラスミドＤＮＡがくる。下部のＤＮ
Ａのバンドをチューブの横に注射針をさしこんで採取し
ガラスチューブに移した。エチジウムブロマイドを除去
し、水層をＴＥ緩衝液に透析した。プラスミドＤＮＡ溶
液をＲＮａ Ｓ ｅ処理し、等量の飽和フェノール溶液
で抽出した。水層；とあらかじめ０．１％ＳＤＳを含む
ＴＥ緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ ） Ａ −１５０（バイオラッド社、米国
）に付した。ＤＮＡを洗い込み、活性区分を取得する為
に０．１％５ＤＳｆ、含むＴＥ緩衝液で溶出した。分画
液をエタノールで沈澱させ、精製したプラスミドＤＮＡ
を得た。
隙に軽・ぐラフインオイルを加え、２０℃で３６時間、
４５．ＯＯＯｒｐｍの遠心を続けると上層に線“状の微
生物由来ＤＮＡと環状プラスミドＤＮＡの開環したもの
、下層に閉環状のプラスミドＤＮＡがくる。下部のＤＮ
Ａのバンドをチューブの横に注射針をさしこんで採取し
ガラスチューブに移した。エチジウムブロマイドを除去
し、水層をＴＥ緩衝液に透析した。プラスミドＤＮＡ溶
液をＲＮａ Ｓ ｅ処理し、等量の飽和フェノール溶液
で抽出した。水層；とあらかじめ０．１％ＳＤＳを含む
ＴＥ緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ ） Ａ −１５０（バイオラッド社、米国
）に付した。ＤＮＡを洗い込み、活性区分を取得する為
に０．１％５ＤＳｆ、含むＴＥ緩衝液で溶出した。分画
液をエタノールで沈澱させ、精製したプラスミドＤＮＡ
を得た。
上記の方法により、精製ｐＢ ２−７プラスミドＤＮＡ
が２５０μ２、ｐＢ１８グラスミドＤＮＡが１３４μを
得られた。
が２５０μ２、ｐＢ１８グラスミドＤＮＡが１３４μを
得られた。
工程３（精製ｐＢ ２−７とｐＨ１８プラスミドＤＮＡ
のニックトランスレーション） 工程２で得られた精製プラスミドＤＮＡ４０μｔを制限
酵素Ｐｓｔ ｌで消化分解し、次いで４％アクリルアミ
ドゲルを用いる電気泳動にかけた。
のニックトランスレーション） 工程２で得られた精製プラスミドＤＮＡ４０μｔを制限
酵素Ｐｓｔ ｌで消化分解し、次いで４％アクリルアミ
ドゲルを用いる電気泳動にかけた。
電気泳動後、染色を行ない２，６μ？（計算値６μｔの
４３％）の目的とするバンドを切出した。２．６μ２の
中の５００ ｎｆの該切出断片を用いて、Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 ５ｃｉ−ＵＳＡ 、 ７２，１１８４（１９７４
）１ Ｋ従ってニックトランスレーションを行なった。
４３％）の目的とするバンドを切出した。２．６μ２の
中の５００ ｎｆの該切出断片を用いて、Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 ５ｃｉ−ＵＳＡ 、 ７２，１１８４（１９７４
）１ Ｋ従ってニックトランスレーションを行なった。
ニックトランスレーションは市販キラ） （ＢＲＬ社、
米国）を用いた。２５μｔの反応で放射化したｄＣＴＰ
を８Ｑ ｐｍｏｌｅ用いた。（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ
の場合） まず下記混合溶液を調製した。
米国）を用いた。２５μｔの反応で放射化したｄＣＴＰ
を８Ｑ ｐｍｏｌｅ用いた。（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ
の場合） まず下記混合溶液を調製した。
２．５μｔ 溶液Ａ（αＮＴＰ浴ｉ）
２、５ μｔ 溶１Ｂ（５００ｎＳＦのＤＮＡ 、す
なわちｐｓｔｌインサート） ５ ｔｔｔ α−”Ｐ −ｄｃＴＰ （３２００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌｅ）１．３μｔ ｄＣＴＰ（６５ｐｍｏ
ｌｅ、５０ｐｍｏｌｅ／μｆｄＣＴＰ ） １１．２μｔ 溶液Ｅ（Ｈ２Ｏ） 計２２．５μｔ この２２．５μｔの溶液に、２．５μｔの溶液Ｃ（ＤＮ
ａｓｅｌ 、 ＤＮＡイリメラーゼＩ）を加え、１５℃
６０分反応させた。
なわちｐｓｔｌインサート） ５ ｔｔｔ α−”Ｐ −ｄｃＴＰ （３２００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌｅ）１．３μｔ ｄＣＴＰ（６５ｐｍｏ
ｌｅ、５０ｐｍｏｌｅ／μｆｄＣＴＰ ） １１．２μｔ 溶液Ｅ（Ｈ２Ｏ） 計２２．５μｔ この２２．５μｔの溶液に、２．５μｔの溶液Ｃ（ＤＮ
ａｓｅｌ 、 ＤＮＡイリメラーゼＩ）を加え、１５℃
６０分反応させた。
次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え反応を停止させた
。更に、キャリヤーｔ ＲＮＡを加えエタノール沈澱を
２回行ない、次いで５００μｔの水に溶解した。比活性
は、９．３ ｘ ｌ Ｏ７ｃｐｍ／μグＤＮＡであった
。工程２で得られた精製ｐＲ１８を用いて、同様に上記
の方法に従ってニックトランスレーションを行なった。
。更に、キャリヤーｔ ＲＮＡを加えエタノール沈澱を
２回行ない、次いで５００μｔの水に溶解した。比活性
は、９．３ ｘ ｌ Ｏ７ｃｐｍ／μグＤＮＡであった
。工程２で得られた精製ｐＲ１８を用いて、同様に上記
の方法に従ってニックトランスレーションを行なった。
比活性は７ Ｘ １０’ ｃｐｍ／μｆ ＤＮＡであっ
た。
た。
工程４（ｐＨ１８のＲｓａ Ｉ断片取得）８０μ２のｐ
Ｈ１８グラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐ、ｓａＩで消化し
、４％アクリルアミド電気泳動に付した。下記の目的と
するインサートのバンドを切出しＢＮＤカラムを用いて
精製した。
Ｈ１８グラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐ、ｓａＩで消化し
、４％アクリルアミド電気泳動に付した。下記の目的と
するインサートのバンドを切出しＢＮＤカラムを用いて
精製した。
約６４０ｂｐ ３．７７μ？ （回収率５２％）約１
７５ｂｐ １．７７μ？ （回収率５０％）この約
６４０ ｂｐのインサートをｐＲ１８の３′断片（ｐＲ
１８の３′側の翻訳されない部分を意味する）、４勺１
７５ ｉ：＋ｐのインサートをｐＲ１８ｃｆｒ ｃｐ
Ｒ１８のコード部分）と命名した。
７５ｂｐ １．７７μ？ （回収率５０％）この約
６４０ ｂｐのインサートをｐＲ１８の３′断片（ｐＲ
１８の３′側の翻訳されない部分を意味する）、４勺１
７５ ｉ：＋ｐのインサートをｐＲ１８ｃｆｒ ｃｐ
Ｒ１８のコード部分）と命名した。
更に上記方法に於いてＲｓａ ＩＯ代わりにＰｓｔ ｌ
と１ｖｉｓｔＩｌを用いて消化したところ、約４５０ｂ
ｐ。
と１ｖｉｓｔＩｌを用いて消化したところ、約４５０ｂ
ｐ。
３６５μｍ （回収率６０チ）を得た。このインサート
はｐＲ１８の５′断片と命名した。
はｐＲ１８の５′断片と命名した。
工程５（染色体膣生理活性物質遺伝子の単離）工程３で
得られた Ｐフペル化グラスミドｐＢ２−フィンサート
をハイブリダイズ用グローブとして用い、Ｃｈａｒｏｎ
４ＡのＥｃｏＲ１切断サイト（Ｂｌａｔｔｎｅｒらの
方法５ｃ１ｅｎｃｅ、１９６．１６１ （１９７７）
）にヒトＤＮＡとＥＣ０ＲＩで切断した断片［： Ｍａ
ｎｌａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ、旦６８．７
（１９７８）］ ｆ組込んで作成したバクテリオ７アー
ノＣ’ｈａｒｏｎ ４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーの１０１固のプラーク乞スクリーニングした。その方
法としてＢｅｎｔｏｎと［）ａｖｉＳ らのプラーク
ハイブリダイズ法（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ
、 ５ｃ１ｅｎｃｅ＋旦Ｌ１８０（１９７７）〕 を用
いた。
得られた Ｐフペル化グラスミドｐＢ２−フィンサート
をハイブリダイズ用グローブとして用い、Ｃｈａｒｏｎ
４ＡのＥｃｏＲ１切断サイト（Ｂｌａｔｔｎｅｒらの
方法５ｃ１ｅｎｃｅ、１９６．１６１ （１９７７）
）にヒトＤＮＡとＥＣ０ＲＩで切断した断片［： Ｍａ
ｎｌａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ、旦６８．７
（１９７８）］ ｆ組込んで作成したバクテリオ７アー
ノＣ’ｈａｒｏｎ ４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーの１０１固のプラーク乞スクリーニングした。その方
法としてＢｅｎｔｏｎと［）ａｖｉＳ らのプラーク
ハイブリダイズ法（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ
、 ５ｃ１ｅｎｃｅ＋旦Ｌ１８０（１９７７）〕 を用
いた。
出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つグローブを用いた。
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配列
を持つグローブを用いた。
目的とする遺伝子を含むファーノグラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズすることにより、そ
の放射能活性を測定することによって見つけることが、
出来る。このようにして９つのハイブリダイズプラーク
が、該ライブラリーから得られた・ 方法と条件は次の通り、 １）プラーク数：〜ｌＸ１０６プラーク（〜４×１０４
プラーク／φ１５０顛プレート×２５）２）ニトロセル
ロースフィルターへの転写：（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ
Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６．１８０（１
９７７）参照〕 ３）ハイブリダイズ： １．２５ Ｘ １０５ｃｐｍ／
−の参考例１工程３で得たｐＢ ２− フィンサートグ
ローブを加え、４２℃、１９．５時間 ４）洗イ： ２ ｘ ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用イテ
室温テ１゜分間洗いを４回、続いてＩ Ｘ ＳＳＣ”
−０，１％Ｓ’ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２
回 ５）露光： ＸＡＲ−Ｒ，−８０ｔ：、２枚の増感紙、
３９時間 上記スクリーニングで１２の候補法が得られた。
を有するプローブとハイブリダイズすることにより、そ
の放射能活性を測定することによって見つけることが、
出来る。このようにして９つのハイブリダイズプラーク
が、該ライブラリーから得られた・ 方法と条件は次の通り、 １）プラーク数：〜ｌＸ１０６プラーク（〜４×１０４
プラーク／φ１５０顛プレート×２５）２）ニトロセル
ロースフィルターへの転写：（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ
Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６．１８０（１
９７７）参照〕 ３）ハイブリダイズ： １．２５ Ｘ １０５ｃｐｍ／
−の参考例１工程３で得たｐＢ ２− フィンサートグ
ローブを加え、４２℃、１９．５時間 ４）洗イ： ２ ｘ ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳを用イテ
室温テ１゜分間洗いを４回、続いてＩ Ｘ ＳＳＣ”
−０，１％Ｓ’ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２
回 ５）露光： ＸＡＲ−Ｒ，−８０ｔ：、２枚の増感紙、
３９時間 上記スクリーニングで１２の候補法が得られた。
°二次スクリーニングを行なった結果、９個がポジティ
ブのクローンを含み、１個はまだポジティブの可能性が
あった。二次スクリーニングプレートからポノティブゾ
ラークおよび可能性のあるプラークをひろい、三次スク
リーニングを行った結果９個がボッチイブであった。こ
の９個のプラークについて４次スクリーニングを行ない
、目的の断片を含む９つのバクテリオファージ９つを、
それぞれＨＯｉ ＝ ＨＧ９と命名した。
ブのクローンを含み、１個はまだポジティブの可能性が
あった。二次スクリーニングプレートからポノティブゾ
ラークおよび可能性のあるプラークをひろい、三次スク
リーニングを行った結果９個がボッチイブであった。こ
の９個のプラークについて４次スクリーニングを行ない
、目的の断片を含む９つのバクテリオファージ９つを、
それぞれＨＯｉ ＝ ＨＧ９と命名した。
工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）本質的には
、工程５に述べた方法と同様に行なった。すなわちＥｃ
ｏＲＩで切断したＤＮＡを用いて作成した１０ 個のＣ
ｈａｒｏｎ ４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーバ
クテリオファーノのプラークを検索した。
、工程５に述べた方法と同様に行なった。すなわちＥｃ
ｏＲＩで切断したＤＮＡを用いて作成した１０ 個のＣ
ｈａｒｏｎ ４Ａ／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーバ
クテリオファーノのプラークを検索した。
ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ株
（ＲＧ−ｔ 、ＲＧ−２）が得られた。
（ＲＧ−ｔ 、ＲＧ−２）が得られた。
工程７（ヒトクローンのサザンブロ、ト解析）工程５で
得られたＨ（：、−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７のバクテリ
オファージを用いて、それぞれＤＮＡを次の方法に従っ
て得た。
得られたＨ（：、−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７のバクテリ
オファージを用いて、それぞれＤＮＡを次の方法に従っ
て得た。
６×１０ 個のＥ、 Ｃ０ＩＩ ＬＥ３９２を１８−の
８Ｍ中に懸濁し、そこにバクテリオファージＨＧ−３の
３ＸＩＯ９ＰＦＵ ｔ−加え、３７０℃で２０分間吸着
を行なった。
８Ｍ中に懸濁し、そこにバクテリオファージＨＧ−３の
３ＸＩＯ９ＰＦＵ ｔ−加え、３７０℃で２０分間吸着
を行なった。
次いで得られた混合液を３！のＮＺブロスに加え、３７
℃、２３時間攪拌培養した。次いで６０’ｍｇのクロロ
ホルムを該混合液に加えて、３０分間攪拌した。最終濃
度ＩＭとなるように混合液中に塩化ナトリウムを加えた
後１５分間放置した。次いで遠心操作を行なった。次い
で、分子量約６０００のポリエチレングリコールをポリ
エチレングリコールの濃度１０％（Ｗ／′ｖ）になるよ
うに加えて、４℃、２２時間放置した。次いでバクテリ
オファーノは遠心操作を行なって採取した。得られたバ
クテリオファーノｉ Ｓ Ｍの２８ｒｎ１．に懸濁し、
次いでクロロホルムを等量論えた。ゴルテ、クスミキサ
ーで３０秒間混合した後、遠心して水層を集め、その全
量を５ｌｖｌで３０−にした。これに２６．４５’の塩
化セ／ウムを加え、静かに溶解した後、超遠心（４５０
００ｒｐｍ ２０時間）でファージのバンドを採取した
。１０ｍＭ Ｉｉ化ナナトリウム塩化マグネシウム１０
ｍＭを含む５０ｍＭ）’Ｊス緩衝液（ｐＨ８，０）に透
析した後、それぞれの最終濃度が２０ ｍＭ、 ５０
ｔｔｆ／ｍｌ、０．５％となるようにＥＤＴＡ 、プロ
テイナーゼＫＸＳＤＳを加え、６５℃で１時間処理した
。次にフェノール、フェノール：クロロホルム＝１：１
、クロロホルムで各１回ずつ抽出し、得られた水層をｌ
ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌｏｍＭ）’Ｊス緩衝１（ｐＨ
８，０）で透析した。この溶ｊ’＆の紫外線吸光度測定
した結果、バクテリオファーノＨＧ−３の純粋なりＮＡ
が得られたことが確認された。
℃、２３時間攪拌培養した。次いで６０’ｍｇのクロロ
ホルムを該混合液に加えて、３０分間攪拌した。最終濃
度ＩＭとなるように混合液中に塩化ナトリウムを加えた
後１５分間放置した。次いで遠心操作を行なった。次い
で、分子量約６０００のポリエチレングリコールをポリ
エチレングリコールの濃度１０％（Ｗ／′ｖ）になるよ
うに加えて、４℃、２２時間放置した。次いでバクテリ
オファーノは遠心操作を行なって採取した。得られたバ
クテリオファーノｉ Ｓ Ｍの２８ｒｎ１．に懸濁し、
次いでクロロホルムを等量論えた。ゴルテ、クスミキサ
ーで３０秒間混合した後、遠心して水層を集め、その全
量を５ｌｖｌで３０−にした。これに２６．４５’の塩
化セ／ウムを加え、静かに溶解した後、超遠心（４５０
００ｒｐｍ ２０時間）でファージのバンドを採取した
。１０ｍＭ Ｉｉ化ナナトリウム塩化マグネシウム１０
ｍＭを含む５０ｍＭ）’Ｊス緩衝液（ｐＨ８，０）に透
析した後、それぞれの最終濃度が２０ ｍＭ、 ５０
ｔｔｆ／ｍｌ、０．５％となるようにＥＤＴＡ 、プロ
テイナーゼＫＸＳＤＳを加え、６５℃で１時間処理した
。次にフェノール、フェノール：クロロホルム＝１：１
、クロロホルムで各１回ずつ抽出し、得られた水層をｌ
ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌｏｍＭ）’Ｊス緩衝１（ｐＨ
８，０）で透析した。この溶ｊ’＆の紫外線吸光度測定
した結果、バクテリオファーノＨＧ−３の純粋なりＮＡ
が得られたことが確認された。
バクプリオファーノＨＧ−３のＤＮＡを調製するために
用いられた方法と本質的に同じ方法を応用することによ
り、バクテリオファーノＨＧ−６とＨＯ−７のＤＮＡを
得た。
用いられた方法と本質的に同じ方法を応用することによ
り、バクテリオファーノＨＧ−６とＨＯ−７のＤＮＡを
得た。
このようにしてＨＣ）−３、ＨＧ−６、Ｈ（）−７、Ｄ
ＮＡを各々２９２０μｆ、１１００μｆＦ、８１９μグ
を得た。次いでサザン法（Ｅ、Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ
、 Ｊ、ＭＯｌ、 Ｂｉｏｌ、＋ ９８．５０３（１９
７５）） に従って、以下の実験条件でこれらのＤＮ
Ａのサザンブロッティングを行なった。
ＮＡを各々２９２０μｆ、１１００μｆＦ、８１９μグ
を得た。次いでサザン法（Ｅ、Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ
、 Ｊ、ＭＯｌ、 Ｂｉｏｌ、＋ ９８．５０３（１９
７５）） に従って、以下の実験条件でこれらのＤＮ
Ａのサザンブロッティングを行なった。
１）ＤＮＡ：
ＨＧ−３８２５ｎｌｉ’
ＨＧ−６９３５ｎｆ
ＨＧ−７６８５ｎｆ
２）各種制限酵素による分解：
ＢａｍＨＩ １０単位、ＥｃｏＲ１１０単位。
ＢａｍＨｌ １０単位十ＥｃｏＲＩ １０単位Ｈ
ｉｎｄ ［１１０単位 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ １０単立＋ＥｃｏＲＩ １０
単立Ｐｖｕ ［１１０単位、３７℃ ３時間３）電気泳
動： ０．８チアガロースゲル ＡＥ ２８Ｖ、１５．５時間 １１） ニトロセルロースフィルターへノ転写：（Ｅ
、Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、、 ９８，５０３（１９７５）参照〕 ５）プレハイブリダイズ： ３０ｄ ＦＤＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ｐＲ１８の５′−断片（Ｉ Ｘ １０ ｃｐｍ／ｄ、
工程・１にて調製したもの）を含む３０ ｄ ＦＤＳ
Ｓ４２℃、１４時間 ７）洗い： ２ Ｘ ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ ’ｉ用いて室温で１
０分間洗いｆ：４回、続いてｌＸ５ｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓ ｉ用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ８）露光： ＡＲ−５ 一８０℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズ
の結果は、表４に示す。
ｉｎｄ ［１１０単位 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ １０単立＋ＥｃｏＲＩ １０
単立Ｐｖｕ ［１１０単位、３７℃ ３時間３）電気泳
動： ０．８チアガロースゲル ＡＥ ２８Ｖ、１５．５時間 １１） ニトロセルロースフィルターへノ転写：（Ｅ
、Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、、 ９８，５０３（１９７５）参照〕 ５）プレハイブリダイズ： ３０ｄ ＦＤＳＳ ４２℃ ６時間 ６）ハイブリダイズ： ｐＲ１８の５′−断片（Ｉ Ｘ １０ ｃｐｍ／ｄ、
工程・１にて調製したもの）を含む３０ ｄ ＦＤＳ
Ｓ４２℃、１４時間 ７）洗い： ２ Ｘ ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ ’ｉ用いて室温で１
０分間洗いｆ：４回、続いてｌＸ５ｓｃ−０，１％ＳＤ
Ｓ ｉ用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ８）露光： ＡＲ−５ 一８０℃、２枚の増感紙 １４時間ハイブリダイズ
の結果は、表４に示す。
Ｈ（）−３
ＢａｍＨＩ ６ １
ＢａｍＨｌ ” ＨＧ−３ ＋−６ ＥｃｏＲｌ −７ Ｇ−３ ＥｃｏＲｌ −６’ Ｈｉｎｄ［［ＨＧ−３ ＋−６ ＥｃｏＲＩ ７ ’Ｈ（）−
３ ＨｌｎｄＩ［［６ ＨＧ−３ ＰｖｕＩ［−６ ←は左と同じ断片が・・イ グローブ（ｐＲ１８） １．２ｋｂ（） ・ ← 〃 ９−２ ｋｂ （ｔｔ ） ｉ ←□−□ ２．９ｋｂ”（− 〃
←〃
←〃
・ ←〃
１ ′ ：〃
□ ← １ｔｔｊ＜−゛ 〃１イー□ 〃 １
←９．７ｋｂ（＋ベクター ５．３ｋｌ＝＋） −〜
← □４．１ ｋｂ （＋ベクター１９゜９ｋｂ）
←９．７ｋｂ（＋ベクター ５．３ｋｂ） １
←２．２ ｋｂ
Ｏ，９ｋｂｌ、９ ｋｂ
Ｏ，９ｋｂ２、ｚｋｂ
ｊ ｏ、９ｋｂ１−□ １ ブリダイズし友ことを示す 工程８（ウサギクローンのサザンプロット解析）工程７
において、ＨＧ−３、ＨＣ）−６、、ＨＧ−７のかわり
にＲＧ−１、ＲＧ−２のバクテリオ７アーノのそれぞれ
を用いる以外は、同様の操作によってサデンプロット解
析を行なった。その結果、ＲＣ）−１およびＲＧ−２を
ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＩ 、 Ｂｇｌ Ｉｆ 、
Ｈｉｎｄ ｎｌおよびＢａｎｏＨＩ ＋ ＥｃｏＲｌの
それぞれで分解して得られた断片と、ｐＲ１８の５′断
片およびｐＢ２−フィンサートとはいずれも単一バンド
にハイブリダイズした。
ＢａｍＨｌ ” ＨＧ−３ ＋−６ ＥｃｏＲｌ −７ Ｇ−３ ＥｃｏＲｌ −６’ Ｈｉｎｄ［［ＨＧ−３ ＋−６ ＥｃｏＲＩ ７ ’Ｈ（）−
３ ＨｌｎｄＩ［［６ ＨＧ−３ ＰｖｕＩ［−６ ←は左と同じ断片が・・イ グローブ（ｐＲ１８） １．２ｋｂ（） ・ ← 〃 ９−２ ｋｂ （ｔｔ ） ｉ ←□−□ ２．９ｋｂ”（− 〃
←〃
←〃
・ ←〃
１ ′ ：〃
□ ← １ｔｔｊ＜−゛ 〃１イー□ 〃 １
←９．７ｋｂ（＋ベクター ５．３ｋｌ＝＋） −〜
← □４．１ ｋｂ （＋ベクター１９゜９ｋｂ）
←９．７ｋｂ（＋ベクター ５．３ｋｂ） １
←２．２ ｋｂ
Ｏ，９ｋｂｌ、９ ｋｂ
Ｏ，９ｋｂ２、ｚｋｂ
ｊ ｏ、９ｋｂ１−□ １ ブリダイズし友ことを示す 工程８（ウサギクローンのサザンプロット解析）工程７
において、ＨＧ−３、ＨＣ）−６、、ＨＧ−７のかわり
にＲＧ−１、ＲＧ−２のバクテリオ７アーノのそれぞれ
を用いる以外は、同様の操作によってサデンプロット解
析を行なった。その結果、ＲＣ）−１およびＲＧ−２を
ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＩ 、 Ｂｇｌ Ｉｆ 、
Ｈｉｎｄ ｎｌおよびＢａｎｏＨＩ ＋ ＥｃｏＲｌの
それぞれで分解して得られた断片と、ｐＲ１８の５′断
片およびｐＢ２−フィンサートとはいずれも単一バンド
にハイブリダイズした。
これは、ｐＲ１８の５′断片およびｐＢ２−フィンサー
トと・・イブリダイズしたどちらの断片もＴＮＦをコー
ドする全塩基配列を含むことを示す。
トと・・イブリダイズしたどちらの断片もＴＮＦをコー
ドする全塩基配列を含むことを示す。
工程９（ヒト染色体の該生理活性物質を含むバクテリア
クローンの構築） 工程５において得られたＨＧ−３のＤＮＡを、 Ｌａｎ
ｄｙらの方法（Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒ １３
＋ ｐ 、２１３４（１９７４）：）によって得た。こ
のＨ（）−３のＤＮＡ ３３μｇをＥＣ０Ｒ１の８０単
位によって３７℃で３時間分解した。分解物は１％低融
点アガロースケ゛ル（条件： ＩＸＴＡＥ。
クローンの構築） 工程５において得られたＨＧ−３のＤＮＡを、 Ｌａｎ
ｄｙらの方法（Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｒ １３
＋ ｐ 、２１３４（１９７４）：）によって得た。こ
のＨ（）−３のＤＮＡ ３３μｇをＥＣ０Ｒ１の８０単
位によって３７℃で３時間分解した。分解物は１％低融
点アガロースケ゛ル（条件： ＩＸＴＡＥ。
２０Ｖ、１４．５時間）にて電気泳動した。２．９ｋｂ
のバンドをアがロース）ｆ ／ｌ／より、Ｔ、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ（Ｍｏｌｅ、ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 ｐ、 ３７７ （１９８２））の方法で単離
した。
のバンドをアがロース）ｆ ／ｌ／より、Ｔ、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ（Ｍｏｌｅ、ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 ｐ、 ３７７ （１９８２））の方法で単離
した。
詳しくは、２．９ｋｂのバンド部位を切り出したケ゛ル
を６５℃で１５分間加熱した。さらに、この２．９ｋｂ
の長さを持つＥＣＯＲＩ分解Ｈ（）−：３断片（以後、
これをｒ ＨＧ −３／Ｅｃｏ’ＲＩ ２．９ ｋｂ断
片」と略することが多い）を、とけたグルよりフェノー
ルで３回、エーテルで３回抽出、酢酸アンモニウムを含
むエタノールで沈澱して回収する。このようにして、６
３７ ｔｔｆｊ （収率３０）のＨＣ） −３／Ｅｃｏ
ＲＩ ２．９ ｋｂ断片を得た。
を６５℃で１５分間加熱した。さらに、この２．９ｋｂ
の長さを持つＥＣＯＲＩ分解Ｈ（）−：３断片（以後、
これをｒ ＨＧ −３／Ｅｃｏ’ＲＩ ２．９ ｋｂ断
片」と略することが多い）を、とけたグルよりフェノー
ルで３回、エーテルで３回抽出、酢酸アンモニウムを含
むエタノールで沈澱して回収する。このようにして、６
３７ ｔｔｆｊ （収率３０）のＨＣ） −３／Ｅｃｏ
ＲＩ ２．９ ｋｂ断片を得た。
上記断片２２５八ＩとＥｃｏＲＩ分解ｐＵＣ１３（Ｊ−
Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、 １０１ ＋ ｐ、 ２０（１９８３）］
を、２．５単位のＴ４リガーゼを用いて結合した。
Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、 １０１ ＋ ｐ、 ２０（１９８３）］
を、２．５単位のＴ４リガーゼを用いて結合した。
Ｅ、 ｃ○１ｉＫ１２のＪＭ８３株に上で得られた結合
ＤＮＡを形質転換した。詳しくは、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ
１２のＪＭ８３株をＬＢ培地中で、培養ブロスの５５
０ ｎｍにおける吸光度が０．３になるまで培養した。
ＤＮＡを形質転換した。詳しくは、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ
１２のＪＭ８３株をＬＢ培地中で、培養ブロスの５５
０ ｎｍにおける吸光度が０．３になるまで培養した。
５０ ｒｎｌの増殖したＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２のＪ
Ｍ８３株を集め２５ｍ１の１０７ ＭＯＰＳ （ｐＨ７
，０） −１０ｍＭ Ｒ’ｏＣ１で洗い、２５ｒｎｌの
０．１ Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５） ５０ ｍＭ
ＣａＣｔ２−１０ ｍＡ Ｒ１）Ｃ４中に懸濁した。こ
の懸濁液２０３μｌに、１０量ｇの上記結合ＤＮＡを含
むｌＯμ！の水溶液を加えた。この混合物を水中にて３
０分分間中し、４０℃で６０分間加熱した。その後すぐ
に、あらかじめ３７℃にしておいたＬＢプロスの５ ｒ
ｕｇに、加熱した混合物を加え、３７℃で１時間培養し
た。
Ｍ８３株を集め２５ｍ１の１０７ ＭＯＰＳ （ｐＨ７
，０） −１０ｍＭ Ｒ’ｏＣ１で洗い、２５ｒｎｌの
０．１ Ｍ ＭＯＰＳ （ｐＨ６，５） ５０ ｍＭ
ＣａＣｔ２−１０ ｍＡ Ｒ１）Ｃ４中に懸濁した。こ
の懸濁液２０３μｌに、１０量ｇの上記結合ＤＮＡを含
むｌＯμ！の水溶液を加えた。この混合物を水中にて３
０分分間中し、４０℃で６０分間加熱した。その後すぐ
に、あらかじめ３７℃にしておいたＬＢプロスの５ ｒ
ｕｇに、加熱した混合物を加え、３７℃で１時間培養し
た。
得られた培養ブロスを遠心し上清を除去した。遠沈した
細胞にＬＢ培地を加えてほぐし、３０μｆｉ／ｌｎｌの
アンビンリンと４０μｇ〜のＸ−ｇａｌを含むＬＢプレ
ートに植菌した。インサートを含むプラスミドが導入さ
れたＥ、 ｃｏｌｉ Ｋｌ ２のＪＭ ８３株のコロニ
ーは白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコ
ロニーは緑色であった。得られた白色コロニーは再び、
３０μｇ／ｍｌのアンピシリンと４０μＶｍｌのＸ−ｇ
ａｌを含むＬＢプレートに確認のため植菌した。
細胞にＬＢ培地を加えてほぐし、３０μｆｉ／ｌｎｌの
アンビンリンと４０μｇ〜のＸ−ｇａｌを含むＬＢプレ
ートに植菌した。インサートを含むプラスミドが導入さ
れたＥ、 ｃｏｌｉ Ｋｌ ２のＪＭ ８３株のコロニ
ーは白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコ
ロニーは緑色であった。得られた白色コロニーは再び、
３０μｇ／ｍｌのアンピシリンと４０μＶｍｌのＸ−ｇ
ａｌを含むＬＢプレートに確認のため植菌した。
上で得られた白色コロニーより、１０個のコロニーを選
び、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇｌｅｙの迅速解析法［Ａｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １１４．ｐ、１９３（１
９８１）〕を用いてスクリーニングした。
び、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇｌｅｙの迅速解析法［Ａｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １１４．ｐ、１９３（１
９８１）〕を用いてスクリーニングした。
詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ７ｔｎｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地で一夜培養する。増殖した細
胞を集め、２ｍ９７ｍ１リゾチーム−５０ｍＭグルコー
ス−１０ｍＭＥＤＴＡ −２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ８，０）中に懸濁した。この懸濁液を室温で５
分間おき、２００μｌの０．２ Ｎ ＮａＯＨ−Ｉ Ｔ
ｏ Ｓｎ２を加えた。ゆ・ッくシ攪拌したのち、この懸
濁液を２分間室温においた。続いて、１５０μ！の３Ｍ
酢酸ナトリウム（Ｐ）［５，２）を加え、１０分間−２
０℃におき、１５分間遠心してその上清を得た。この上
清に９００ ｒｘｌの冷たいエタノールを加え、５分間
遠心してその沈澱を得た。得られた沈澱を７０チエタノ
ールで洗い、乾燥してシラスミドＤＮＡを得た。この方
法を用いて、１０種のプラスミドを得た。
ンピシリンを含むＬＢ培地で一夜培養する。増殖した細
胞を集め、２ｍ９７ｍ１リゾチーム−５０ｍＭグルコー
ス−１０ｍＭＥＤＴＡ −２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ８，０）中に懸濁した。この懸濁液を室温で５
分間おき、２００μｌの０．２ Ｎ ＮａＯＨ−Ｉ Ｔ
ｏ Ｓｎ２を加えた。ゆ・ッくシ攪拌したのち、この懸
濁液を２分間室温においた。続いて、１５０μ！の３Ｍ
酢酸ナトリウム（Ｐ）［５，２）を加え、１０分間−２
０℃におき、１５分間遠心してその上清を得た。この上
清に９００ ｒｘｌの冷たいエタノールを加え、５分間
遠心してその沈澱を得た。得られた沈澱を７０チエタノ
ールで洗い、乾燥してシラスミドＤＮＡを得た。この方
法を用いて、１０種のプラスミドを得た。
それぞれのシラスミドＤＮＡは、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶かし、
ＥｃｏＲＩで分解し、制限酵素解析のために電気泳動に
供した。制限酵素分解と電気泳動の条件は以下の通シで
ある。制のの５分の１量、３単位のＥｃｏＲＩ ３７℃
、１．５時間。
−ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶かし、
ＥｃｏＲＩで分解し、制限酵素解析のために電気泳動に
供した。制限酵素分解と電気泳動の条件は以下の通シで
ある。制のの５分の１量、３単位のＥｃｏＲＩ ３７℃
、１．５時間。
電気泳動：１％アガロースゲル、ｌ Ｘ ＴＡＥ 、
１２０ｖ、２時間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示された。
１２０ｖ、２時間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示された。
すなわち、この８種のクローンは２．９ｋｔ）の断片を
持っていた。８種の目的のクローンのうち、１つを選び
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株
（ＡＴＣＣ３９６５６）と名づけた。
持っていた。８種の目的のクローンのうち、１つを選び
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＭ８３ （ｐＨＧＥ）株
（ＡＴＣＣ３９６５６）と名づけた。
続いて、工程２と同じ操作（ただしｐＢ ２−７とｐＲ
１８のかわりにＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２のＪＭ ８３
（１）ＨＧＥ ）株を用いた）によって、１．８９ｒ
ｎｇのｐＨＧＥ ＤＮＡを得た。
１８のかわりにＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２のＪＭ ８３
（１）ＨＧＥ ）株を用いた）によって、１．８９ｒ
ｎｇのｐＨＧＥ ＤＮＡを得た。
工程１０ （ＥｃｏＲＩ分解ＲＧ−１のサブクローニン
グ）工程６において得られた３０μｙのＲ（） −１を
ＥｃｏＲＩによって分解した。得られた各種断片の混合
物より、工程９と同じ操作（ただし上記各種断片の混合
物と０．８チの低融点アガロースゲルを用いた）によっ
て、約３．５ｋｂの長さを持つ断片を調製した。この断
片とＥｃｏＲｌで分解したｐＵｃ１３を、工程９と同じ
操作（ただしＥｃｏＲＩ分解ＨＣ）−３断片（２，９ｋ
ｂ）のかわりに上記ＥｃｏＲＩ分解断片（３，５ｋｂ）
を用いた）によって、結合した。
グ）工程６において得られた３０μｙのＲ（） −１を
ＥｃｏＲＩによって分解した。得られた各種断片の混合
物より、工程９と同じ操作（ただし上記各種断片の混合
物と０．８チの低融点アガロースゲルを用いた）によっ
て、約３．５ｋｂの長さを持つ断片を調製した。この断
片とＥｃｏＲｌで分解したｐＵｃ１３を、工程９と同じ
操作（ただしＥｃｏＲＩ分解ＨＣ）−３断片（２，９ｋ
ｂ）のかわりに上記ＥｃｏＲＩ分解断片（３，５ｋｂ）
を用いた）によって、結合した。
Ｅ、 ｃｏｌｉＫ １２のＪＭ８３株への形質転換、バ
クテリアクローンのスクリーニング、クローンＤＮＡの
分解と電気泳動け、工程９と同じ操作（ただし上記結合
ＤＮＡ断片を用いた）によって行った。得られたクロー
ンはＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２のＪＭ８３ （ｐＲＯＥ
）株（ＡＴＣＣ３９６５５）と名づけた。
クテリアクローンのスクリーニング、クローンＤＮＡの
分解と電気泳動け、工程９と同じ操作（ただし上記結合
ＤＮＡ断片を用いた）によって行った。得られたクロー
ンはＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２のＪＭ８３ （ｐＲＯＥ
）株（ＡＴＣＣ３９６５５）と名づけた。
続いて、工程２と同じ操作（ただしＥ、 ｃｏｌｉＫ
１２量Ｍ８３ （ｐＲＧＥ ）株をｐＢ２−７とｐＲ−
１８のかわシに用いた）によって、ｐＲＧＥ ＤＮＡを
１．７０ｍ９調製した。
１２量Ｍ８３ （ｐＲＧＥ ）株をｐＢ２−７とｐＲ−
１８のかわシに用いた）によって、ｐＲＧＥ ＤＮＡを
１．７０ｍ９調製した。
工程１１ （ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素地図
）工程９で得られたｐＨＧＥ ＤＮＡの制限酵素地図を
、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ９８ （１９８２） ］によ
って行った。
）工程９で得られたｐＨＧＥ ＤＮＡの制限酵素地図を
、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ９８ （１９８２） ］によ
って行った。
その方法と条件は以下の通りである。
１） ＥｃｏＲｌによるｐＨＧＥ ＤＮＡの分解：１
８．６μｓのｐＨ（）Ｅ、 ６４単位のＥｃｏＲＩ ＋
３７℃、２時間２）エタノール沈澱 ３）溶解： ＥｃＯＲＩ分解ｐＨＧＢが１ ａｇ／ｒｎ
ｌの溶液になるように蒸留水を加える。
８．６μｓのｐＨ（）Ｅ、 ６４単位のＥｃｏＲＩ ＋
３７℃、２時間２）エタノール沈澱 ３）溶解： ＥｃＯＲＩ分解ｐＨＧＢが１ ａｇ／ｒｎ
ｌの溶液になるように蒸留水を加える。
４）各種制限酵素による分解：１μｇの上記ＥＣｏＲＩ
分解ｐＨＧＥ 、制限酵素：５単位のＰｖｕ ＩＩ ＋
５単位のＰｖａｎ＋１０単位のＲｓａｌ ＋ １０単
位のＲｓａｌ、４単位のＭｓｔＩＩ 、 ３単位のＡｖ
ａ（、９単位のｐｓｔ＋１ ＋３７℃、２時間 ５）電気泳動：２％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ。
分解ｐＨＧＥ 、制限酵素：５単位のＰｖｕ ＩＩ ＋
５単位のＰｖａｎ＋１０単位のＲｓａｌ ＋ １０単
位のＲｓａｌ、４単位のＭｓｔＩＩ 、 ３単位のＡｖ
ａ（、９単位のｐｓｔ＋１ ＋３７℃、２時間 ５）電気泳動：２％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ。
２８Ｖ、１４．５時間
６）ニトロセルロースフィルターへＯ転写：Ｅ、Ｍ。
５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ＋
９８ ｒ ｐ、 ５０３（１９７５）参照 ７）第一回グレハイプリダイズ： ３０ ｒｕｌＦＤｓ
Ｂ 。
９８ ｒ ｐ、 ５０３（１９７５）参照 ７）第一回グレハイプリダイズ： ３０ ｒｕｌＦＤｓ
Ｂ 。
４２℃、６時間
８）第一回ハイブリダイズ：ｐＲ１８（工程４で得られ
たもの）の５′断片（５Ｘ １０’ ＣｐｒｒＶｆｒ（
１’）を含む３０ 扉Ｉ ＦＤＳＳ 、 ４２℃、６時
間 。
たもの）の５′断片（５Ｘ １０’ ＣｐｒｒＶｆｒ（
１’）を含む３０ 扉Ｉ ＦＤＳＳ 、 ４２℃、６時
間 。
９）洗い： ２ＸＳＳＣ−０，１チＳＤＳを用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてＩ Ｘ ＳＳｃ −０，
１％ＳＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０）露光： ＸＡＲ−５、−８０℃、２枚の増感紙１
７５時間 １１）洗い： ０．５ Ｍ ＮａＯＨ−１，５Ｍ Ｎａ
Ｃ６’で１分間、０．５ＭＴｒｉｓ −１，５Ｍ Ｎａ
ＣＬで１分間、３ Ｘ ＳＳｃで１分間１２）露光：露
光時間を１９時間とした以外は、上記１０）と同じ操作 １３）第３回プレハイブリダイズ：フ）と同じ１４）第
２回ハイブリダイズ：ｐＲ２−フィンサート（工程３で
得られたもの）、４２℃、１６．５時間１５）洗い：９
）と同じ １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操作 １７）洗い：１１）と同じ １８）露光：露光時間を２０時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １９）第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ２０）第
３回ハイブリダイズ：ｐＲ１８（工程４で得られたもの
）の３′断片（４，５Ｘ １０５ｃｐ戦’ｍｌ ） 、
４２℃、１５時間 ２１）洗い：９）と同じ ２２）露光：１０）と同じ 更に第４図に示したような制限酵素で切断し、制限酵素
地図を作製した。
で１０分間洗いを４回、続いてＩ Ｘ ＳＳｃ −０，
１％ＳＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 １０）露光： ＸＡＲ−５、−８０℃、２枚の増感紙１
７５時間 １１）洗い： ０．５ Ｍ ＮａＯＨ−１，５Ｍ Ｎａ
Ｃ６’で１分間、０．５ＭＴｒｉｓ −１，５Ｍ Ｎａ
ＣＬで１分間、３ Ｘ ＳＳｃで１分間１２）露光：露
光時間を１９時間とした以外は、上記１０）と同じ操作 １３）第３回プレハイブリダイズ：フ）と同じ１４）第
２回ハイブリダイズ：ｐＲ２−フィンサート（工程３で
得られたもの）、４２℃、１６．５時間１５）洗い：９
）と同じ １６）露光：露光時間を１９．５時間とした以外は、上
記１０）と同じ操作 １７）洗い：１１）と同じ １８）露光：露光時間を２０時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １９）第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ２０）第
３回ハイブリダイズ：ｐＲ１８（工程４で得られたもの
）の３′断片（４，５Ｘ １０５ｃｐ戦’ｍｌ ） 、
４２℃、１５時間 ２１）洗い：９）と同じ ２２）露光：１０）と同じ 更に第４図に示したような制限酵素で切断し、制限酵素
地図を作製した。
制限酵素地図解析の結果を第４図に示した。
工程１２ （ｐＲ（）Ｅ ７’ラスミドＤＮＡ制制限酵
素図）工程１１と同じ方法をｐＨＧＢプラスミドＤＮＡ
のかわ９にｐＲ（）Ｅ ７’ラスミドＤＮＡを用いて、
工程１１で得られたｐＲｃ）Ｅの制限酵素解析を行った
。得られたｐＲ（）Ｅ ＤＮＡの制限酵素地図を第５図
に示した。
素図）工程１１と同じ方法をｐＨＧＢプラスミドＤＮＡ
のかわ９にｐＲ（）Ｅ ７’ラスミドＤＮＡを用いて、
工程１１で得られたｐＲｃ）Ｅの制限酵素解析を行った
。得られたｐＲ（）Ｅ ＤＮＡの制限酵素地図を第５図
に示した。
工程１３（ウサギＴＮＦ遺伝子と該生理活性物質遺伝子
の塩基配列の決定） 工程９で得られたＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＭ ８
３ （ｐＨｃ）Ｅ）株と工程１０で得られたＬ ｃｏｌ
ｉ Ｋ １２ ＪＭ８３（ｐＲＯＥ）株に工程２と同様
の操作を行なった。そして、それぞれ１５０μｇのｐＲ
（）Ｅ７°ラスミドＤＮＡとｐＨＧＥシラスミドＤＮＡ
を得た。
の塩基配列の決定） 工程９で得られたＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＪＭ ８
３ （ｐＨｃ）Ｅ）株と工程１０で得られたＬ ｃｏｌ
ｉ Ｋ １２ ＪＭ８３（ｐＲＯＥ）株に工程２と同様
の操作を行なった。そして、それぞれ１５０μｇのｐＲ
（）Ｅ７°ラスミドＤＮＡとｐＨＧＥシラスミドＤＮＡ
を得た。
ｐＲａＥとｐＨＧＥの塩基配列はＭａｘａｍ −Ｇ１１
ｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ５５ 、 ｐ・４
９０ （１９８０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ〕
によって決定した。
ｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ５５ 、 ｐ・４
９０ （１９８０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ〕
によって決定した。
参考例１で決定したｐＲ−１８の塩基配列と、上で決し
たｐＲ（）Ｅの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝
子の構造（エクソンとイントロン等）を解明した。ｐＲ
ＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示した。続い
て、ｐＲＧＥとｐＨＧＥの塩基配列を比較して、相同性
とイントロン・エクソン境界付近の配列の相同性と類似
性を調べた。その結果該生理活性物質遺伝子の構造（エ
クソンとイントロン等）を解明した。該生理活性物質遺
伝子の構造を第４図に示した。
たｐＲ（）Ｅの塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝
子の構造（エクソンとイントロン等）を解明した。ｐＲ
ＧＥ ＤＮＡインサートの構造は第５図に示した。続い
て、ｐＲＧＥとｐＨＧＥの塩基配列を比較して、相同性
とイントロン・エクソン境界付近の配列の相同性と類似
性を調べた。その結果該生理活性物質遺伝子の構造（エ
クソンとイントロン等）を解明した。該生理活性物質遺
伝子の構造を第４図に示した。
このようにして得られた、ウサギＴＮＦと該生理活性物
質をコードする塩基配列を下に示す。この塩基配列にお
いて、上の行はウサギＴＮＦ ’ｉコードする塩基配列
（Ｒ）を、下の行は該生理活性物質をコードする塩基配
列（Ｈ）を示す。
質をコードする塩基配列を下に示す。この塩基配列にお
いて、上の行はウサギＴＮＦ ’ｉコードする塩基配列
（Ｒ）を、下の行は該生理活性物質をコードする塩基配
列（Ｈ）を示す。
ＲＴＣＡ Ｃ）ＣＴ ＴＣＴ ＣＧＧ
Ｃ）ＣＣＣＴ（） ＡＣ）Ｔ ＧＡＣＨＴＣ
Ａ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣ
ＣＣＧ Ａ（）Ｔ ＧＡＣＲＣ）ＣＡ Ａ
ＡＣ，ＣＣＧ ＣＡＡ ＧＴＣ） ＧＡＧ
（）Ｃ）ＣＣＡＧＨＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ
ＣＡＡ （）ＣＴ Ｃ）ＡＣ） ＧＧ
Ｇ ＣＡ（）ＲＧＣＧ ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ
ＣＴＧ’ Ｃ（）ＣＡＡＣＣ）（）ＣＨＧＣＣ
ＡＡＴ （）ＣＣＣＴＣＣＴＣ） ＧＣＣＡＡ
Ｔ ＧＧＣＲＣＴＧ （）ＴＣ） ＧＴＧ
ＣＣＧ ＩＩｃｃ ＧＡＣ−４（）Ｇ
ＣＴ（）ＨＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ’ （）（）ＣＣＴ
ＧＲＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴ’ ＣＡＡ ＧＧ
ＣＴ（）ＣＣ（）ＣＨＣＴＣＴＴＣＡＡＧ、ＧＧＣＣＡ
Ａ ＧＧＣＴＣ）ＣＣＣＣＲＣＡＣＡＣＴ Ｃ
）ＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＨＣＡＣＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＣ’ ＣＣ）ＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＲＣ
ＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧ
ＣＣＣＣＨＣＴＣＣＴＣ、’Ｉ’ＣＴ ＧＣＣＡＴ
ＣＡＡＣ） ＡＣ）ＣＣＣＣＲＧＡ（） Ｃ）
ＣＴ Ｃ）ＡＣ） ＣＣＣＡＴＧ ＧＣＣ
ＴＧＧ ＴＡＣＨＧＧＣ） ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴｏＧ ＴＡＴＲ
ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ ＴＴＧ ＧＡＧ Ａ
ＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＨＧＴＣＴＴＣＣＡＧ
ＣＴＧ Ｃ）ＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＧＡＣＲＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ Ｔ
ＡＣＣＴＣ） ＧＡＣＣＴＴ ＧＣＣＨＣＯＧ
ＣＣＣＧＡ、ＣＴＡＴ ＣＴＣ＜）ＡＣＴＴ
Ｔ ＧＣＣＲＧＣ）（） ＡＴＣＡＴＴ
ＧＣＣＣＴ（）ＨＧ（）ＯＡＴＯＡＴＴ ＧＣＣＣ
ＴＧＡＡＧ ＣＣＴ ＣＴＡ ＧＣＣＣＡ
ＣＧＴＡ ＧＴＡＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ０ＴＡＣＴＣＣ
ＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ Ａ（）ＣＣＡＧ
ＣＣ）ＴＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣ（）（）ＡＴＣ） ＡＡ（）
ＣＴＣＡＣ（） ＧＡＣ’ ＡＡＣＣＡＧ
（）ＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＡ
ＧＡＴ ＡＡＣ、ＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣ
ＴＣＣＣＡＧ ＧＴＴＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴ
ＣＣ−ＣＡ（） ＧＴＣＴＣＣ−−・ ＴＡＣＧ
Ｔ（） ’ＣＴＣｃＴｃ ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣ
ＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣ’［’ＣＣ
ＴＡＣＣＣＧ ＡＡＣＡＡＧ （）ＴＣＡＡＣ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ ＧＴＣＡ
ＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣＣＣ
ＣＣ）ＡＧＴＧＣＣＡ（） ＡＣ）Ｇ Ｃ）Ａ
Ｇ ＡＣＣ，ＣＣＡ （）ＡＧＧＡＧ Ｃ
ＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＯＣＧＧＣＧＡＧ
ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴ（） （）Ｃ）Ａ
ＧＧＧＣＧＣ） ＣＴＣＡＣ）ＣＡＣＣＧＡ
Ｇ ＧＴＣＡＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴ
（）ＡＣ） ＡＴＣＡＡＴＣ）ＡＧ Ｔ
ＣＣＧ（）Ｇ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧ
ＡＧ ＴＣＴ （）Ｃ）Ｇ ＣＡＣ）
ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ工程１４（オリゴデオキシヌクレ
オチドの合成）コハク酸残基を介して約２μＭのデオキ
シヌクレオチドが結合しているポリスチレン樹脂２０ｒ
ｎ９を、上下にステンレススチール製のフィルターのつ
いた５ ００ ’ｍｌ容量の反応容器に装填した。樹脂
はＩＭ臭臭化亜鉛ジクロルメタン−イソコロパノール溶
液８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（ＤＭＴ
）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロ・ぐノール
（８５：１５Ｌ次いでジメチルフォルムアミド、ピリジ
ン更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で乾燥した。
Ｃ）ＣＣＣＴ（） ＡＣ）Ｔ ＧＡＣＨＴＣ
Ａ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣ
ＣＣＧ Ａ（）Ｔ ＧＡＣＲＣ）ＣＡ Ａ
ＡＣ，ＣＣＧ ＣＡＡ ＧＴＣ） ＧＡＧ
（）Ｃ）ＣＣＡＧＨＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ
ＣＡＡ （）ＣＴ Ｃ）ＡＣ） ＧＧ
Ｇ ＣＡ（）ＲＧＣＧ ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ
ＣＴＧ’ Ｃ（）ＣＡＡＣＣ）（）ＣＨＧＣＣ
ＡＡＴ （）ＣＣＣＴＣＣＴＣ） ＧＣＣＡＡ
Ｔ ＧＧＣＲＣＴＧ （）ＴＣ） ＧＴＧ
ＣＣＧ ＩＩｃｃ ＧＡＣ−４（）Ｇ
ＣＴ（）ＨＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ’ （）（）ＣＣＴ
ＧＲＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴ’ ＣＡＡ ＧＧ
ＣＴ（）ＣＣ（）ＣＨＣＴＣＴＴＣＡＡＧ、ＧＧＣＣＡ
Ａ ＧＧＣＴＣ）ＣＣＣＣＲＣＡＣＡＣＴ Ｃ
）ＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＨＣＡＣＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＣ’ ＣＣ）ＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＲＣ
ＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧ
ＣＣＣＣＨＣＴＣＣＴＣ、’Ｉ’ＣＴ ＧＣＣＡＴ
ＣＡＡＣ） ＡＣ）ＣＣＣＣＲＧＡ（） Ｃ）
ＣＴ Ｃ）ＡＣ） ＣＣＣＡＴＧ ＧＣＣ
ＴＧＧ ＴＡＣＨＧＧＣ） ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴｏＧ ＴＡＴＲ
ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ ＴＴＧ ＧＡＧ Ａ
ＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＨＧＴＣＴＴＣＣＡＧ
ＣＴＧ Ｃ）ＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＧＡＣＲＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ Ｔ
ＡＣＣＴＣ） ＧＡＣＣＴＴ ＧＣＣＨＣＯＧ
ＣＣＣＧＡ、ＣＴＡＴ ＣＴＣ＜）ＡＣＴＴ
Ｔ ＧＣＣＲＧＣ）（） ＡＴＣＡＴＴ
ＧＣＣＣＴ（）ＨＧ（）ＯＡＴＯＡＴＴ ＧＣＣＣ
ＴＧＡＡＧ ＣＣＴ ＣＴＡ ＧＣＣＣＡ
ＣＧＴＡ ＧＴＡＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＧＣＣＣＡＴ ＧＴＴ ０ＴＡＣＴＣＣ
ＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ Ａ（）ＣＣＡＧ
ＣＣ）ＴＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣ（）（）ＡＴＣ） ＡＡ（）
ＣＴＣＡＣ（） ＧＡＣ’ ＡＡＣＣＡＧ
（）ＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＡ
ＧＡＴ ＡＡＣ、ＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣ
ＴＣＣＣＡＧ ＧＴＴＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴ
ＣＣ−ＣＡ（） ＧＴＣＴＣＣ−−・ ＴＡＣＧ
Ｔ（） ’ＣＴＣｃＴｃ ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣ
ＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣ’［’ＣＣ
ＴＡＣＣＣＧ ＡＡＣＡＡＧ （）ＴＣＡＡＣ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ ＧＴＣＡ
ＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣＣＣ
ＣＣ）ＡＧＴＧＣＣＡ（） ＡＣ）Ｇ Ｃ）Ａ
Ｇ ＡＣＣ，ＣＣＡ （）ＡＧＧＡＧ Ｃ
ＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＯＣＧＧＣＧＡＧ
ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴ（） （）Ｃ）Ａ
ＧＧＧＣＧＣ） ＣＴＣＡＣ）ＣＡＣＣＧＡ
Ｇ ＧＴＣＡＡＣＣＧＡ ＣＴＣＡＧＣＧＣＴ
（）ＡＣ） ＡＴＣＡＡＴＣ）ＡＧ Ｔ
ＣＣＧ（）Ｇ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧ
ＡＧ ＴＣＴ （）Ｃ）Ｇ ＣＡＣ）
ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ工程１４（オリゴデオキシヌクレ
オチドの合成）コハク酸残基を介して約２μＭのデオキ
シヌクレオチドが結合しているポリスチレン樹脂２０ｒ
ｎ９を、上下にステンレススチール製のフィルターのつ
いた５ ００ ’ｍｌ容量の反応容器に装填した。樹脂
はＩＭ臭臭化亜鉛ジクロルメタン−イソコロパノール溶
液８５：１５）で処理してジメトキシトリチル（ＤＭＴ
）保護基を除き、ジクロルメタン−イソプロ・ぐノール
（８５：１５Ｌ次いでジメチルフォルムアミド、ピリジ
ン更にアセトニトリルで洗浄し、窒素気流で乾燥した。
次いで保護ヌクレオチドジエステル（２０ＬＭ）およヒ
、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾール（６０Ｌ
Ｍ）の乾燥ヒリノン溶１２００μｌを加えた。４５０℃
で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾燥ピリ
ジンで樹脂洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未反応の残
基を保護した。この、脱保護及び縮合のサイクルを繰り
返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した
。合成終了後、樹脂をとり出し、保護基除去および樹脂
からの切断反応、樹脂との分離処理をしたのち、精製を
行った。上記のオリゴデオキシヌクレオチドの合成およ
び精製は伊東らｌ：Ｎｕｃ、 Ａｃ、 Ｒｅｓ、 １０
巻１７５５頁（１９８２）］の方法に従って実施した。
、メシチレンスルフォニルニトロトリアゾール（６０Ｌ
Ｍ）の乾燥ヒリノン溶１２００μｌを加えた。４５０℃
で２０分間反応せしめた後、反応液を除去し、乾燥ピリ
ジンで樹脂洗浄後、ピリジン中の無水酢酸で未反応の残
基を保護した。この、脱保護及び縮合のサイクルを繰り
返して、所望のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した
。合成終了後、樹脂をとり出し、保護基除去および樹脂
からの切断反応、樹脂との分離処理をしたのち、精製を
行った。上記のオリゴデオキシヌクレオチドの合成およ
び精製は伊東らｌ：Ｎｕｃ、 Ａｃ、 Ｒｅｓ、 １０
巻１７５５頁（１９８２）］の方法に従って実施した。
このようにして下記の如きオリゴデオキシヌクレオチド
が得られた。
が得られた。
１）５′−ＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡ
ＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡ−３′２ ） ３ ’ −
ＧＴＡＣＡ（）ＴＡＣ）ＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＯ（）Ｃ
ＴＣＡＣＴＧＴＴＣＧＣ）−５’３） ５’ −ＧＣＣ
ＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＣ）ＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣ
ＴＣＡＡ（） −３’４）３′−ＡＣＡＴｄＧＧＧＴＡ
ＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴｃＧＡｃＴ−５
′工程１５（該生理活性物質の遺伝子を含むＭ１３ｍｐ
９− ＨＯＥの調製） グラスミドｐＨＧＥ （１０μ９ ）をＥｃｏＲＩ （
２０Ｕ）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気泳
動の後’２．９ｋｂのフラグメントを切出し溶出した。
ＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡ−３′２ ） ３ ’ −
ＧＴＡＣＡ（）ＴＡＣ）ＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＯ（）Ｃ
ＴＣＡＣＴＧＴＴＣＧＣ）−５’３） ５’ −ＧＣＣ
ＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＣ）ＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣ
ＴＣＡＡ（） −３’４）３′−ＡＣＡＴｄＧＧＧＴＡ
ＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴｃＧＡｃＴ−５
′工程１５（該生理活性物質の遺伝子を含むＭ１３ｍｐ
９− ＨＯＥの調製） グラスミドｐＨＧＥ （１０μ９ ）をＥｃｏＲＩ （
２０Ｕ）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気泳
動の後’２．９ｋｂのフラグメントを切出し溶出した。
このフラグメントをＭ１３ｍｐ９ファーノの複製型（ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＥｃｏＲＩフラグ
メント中へ挿入した。ＥｃｏＲ１フラグメントを挿入さ
れたＤＮＡはＢＲＬ社の手引書（Ｕｓｅｒ ｍａｎｕａ
ｌ ／ Ｍ １３ ｍｐ ’７ ｃｌｏｎｉｎｇ／’Ｄ
ｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＋ １９８０
）に従いＥ、 Ｃ０ＩＩ ’ＪＭ１０３を形質転
換した。生成物をＭ １３ ｍｐ ９−ＨＧＥと命名し
た。
ｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＥｃｏＲＩフラグ
メント中へ挿入した。ＥｃｏＲ１フラグメントを挿入さ
れたＤＮＡはＢＲＬ社の手引書（Ｕｓｅｒ ｍａｎｕａ
ｌ ／ Ｍ １３ ｍｐ ’７ ｃｌｏｎｉｎｇ／’Ｄ
ｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＋ １９８０
）に従いＥ、 Ｃ０ＩＩ ’ＪＭ１０３を形質転
換した。生成物をＭ １３ ｍｐ ９−ＨＧＥと命名し
た。
工程１６ （Ｍ１３ｒｎｐ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮＡとプ
リーターＥ３−４を用いる、イントロン３の除去）ｌｖ
１１３ｍｐ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮＡはＢＲＬ ［ｎ用者
の手引書（Ｕｓｅｒ ｍａｎｕａｌ ／ Ｍ １３ ｍ
ｐ ７ Ｃ１ｏｎｉｎν恒ｄｅｏｘｙ’ＳｅｑｕｅｎＣ
１ｎｇｌ １９８０）に従って調製された。工程１４で
調製されたオリゴデオキシヌクレオシド４）３ ’ −
ＡＣＡＴＣＣ）ＧＯＴＡＣＡＡＣＡＴＣ（）ＴＴＴ（）
ＧＧＡＣ，ＴＴＣＧＡＣＴ−５’をイントロン３のプリ
ーターとして用いた。イントロン３のプリーターをＥ３
−４と命名した。
リーターＥ３−４を用いる、イントロン３の除去）ｌｖ
１１３ｍｐ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮＡはＢＲＬ ［ｎ用者
の手引書（Ｕｓｅｒ ｍａｎｕａｌ ／ Ｍ １３ ｍ
ｐ ７ Ｃ１ｏｎｉｎν恒ｄｅｏｘｙ’ＳｅｑｕｅｎＣ
１ｎｇｌ １９８０）に従って調製された。工程１４で
調製されたオリゴデオキシヌクレオシド４）３ ’ −
ＡＣＡＴＣＣ）ＧＯＴＡＣＡＡＣＡＴＣ（）ＴＴＴ（）
ＧＧＡＣ，ＴＴＣＧＡＣＴ−５’をイントロン３のプリ
ーターとして用いた。イントロン３のプリーターをＥ３
−４と命名した。
プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
前方（即ちエキソン３）、及び後方（即ちエキソン４）
に対し相補的な配列を有している。
前方（即ちエキソン３）、及び後方（即ちエキソン４）
に対し相補的な配列を有している。
イントロン３の除去はＷａｌｌａｃｅらの方法（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ。
ｅｎｃｅ。
２０９；１３９６（１９８０））に従い、次の如く行っ
た。
た。
Ｅ ３−４ （１１０４ｎ、 １５ｐｍｏｌｅ）は、Ｔ
４キナーゼ（１０８単位）およびＡＴＰ （３ｍＭ ）
を用いてリン酸化され、鋳型Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ（１
，６５μ５＋、 ０．５ｐｍｏｌｅ）に加えられた。反
応混合物は６５℃、６５分間加熱し、５分間室温に冷却
し、更に氷水中で冷却した。各０．４ｍＭのｄＡＴＰ
、 ｄＣＴＰ 、 、ｄ（）ＴＰ 、 ｄＴＴＰおよび
ＡＴＰ溶液に対し、クレノーフラグメント（Ｋ １ ｅ
ｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ４リガーゼ１０
単位を含むＨｉｍ緩衝液（：Ｗａ ｌ ｌａ ｃ ｅら
、Ｎｕｃ、 Ａｃ、Ｒｅｓ、 ９巻３６４７頁（１９８
１年）〕、１０ ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ７，２）、
２ｒｎＭＭｇＣｔ２及び１ｍＭメルカ７’ｌ−エタノー
ルを含む溶液を加えた。反応混合物（最終容量５ｏμｌ
）を４℃で３０分間及び室温で３０分間、インキ−ベー
トした。オリゴヌクレオチドをゾライマーとして二重鎖
合成されたＤＮＡはＢＲＬ社の使用者の手引（Ｕｓｅｒ
ｍａｎｕａｌ／Ｍ １３ ｍｐ ７ ｐｌｏｎｉｎｇ
／’Ｄｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＋ １９
８０ ）に従って、Ｅ、、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０３に感
染せしめた。このようにして得られたプラークを、ＹＴ
プレー） ［Ｊ、Ｈ，、Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒ、
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ （１９７２年）４３３頁〕に移した。得
られたコロニーを、３２ｐラベルされたＥ３−４と５５
℃、２時間の条件でハイブリダイズさせた。
４キナーゼ（１０８単位）およびＡＴＰ （３ｍＭ ）
を用いてリン酸化され、鋳型Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ（１
，６５μ５＋、 ０．５ｐｍｏｌｅ）に加えられた。反
応混合物は６５℃、６５分間加熱し、５分間室温に冷却
し、更に氷水中で冷却した。各０．４ｍＭのｄＡＴＰ
、 ｄＣＴＰ 、 、ｄ（）ＴＰ 、 ｄＴＴＰおよび
ＡＴＰ溶液に対し、クレノーフラグメント（Ｋ １ ｅ
ｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ） ５単位、Ｔ４リガーゼ１０
単位を含むＨｉｍ緩衝液（：Ｗａ ｌ ｌａ ｃ ｅら
、Ｎｕｃ、 Ａｃ、Ｒｅｓ、 ９巻３６４７頁（１９８
１年）〕、１０ ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ７，２）、
２ｒｎＭＭｇＣｔ２及び１ｍＭメルカ７’ｌ−エタノー
ルを含む溶液を加えた。反応混合物（最終容量５ｏμｌ
）を４℃で３０分間及び室温で３０分間、インキ−ベー
トした。オリゴヌクレオチドをゾライマーとして二重鎖
合成されたＤＮＡはＢＲＬ社の使用者の手引（Ｕｓｅｒ
ｍａｎｕａｌ／Ｍ １３ ｍｐ ７ ｐｌｏｎｉｎｇ
／’Ｄｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＋ １９
８０ ）に従って、Ｅ、、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０３に感
染せしめた。このようにして得られたプラークを、ＹＴ
プレー） ［Ｊ、Ｈ，、Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒ、
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ （１９７２年）４３３頁〕に移した。得
られたコロニーを、３２ｐラベルされたＥ３−４と５５
℃、２時間の条件でハイブリダイズさせた。
イントロン除去工程の結果得られる各種生成物の内から
、所望の配列を有するＤＮＡを得るためのグローブとし
て、ここでは、プリーターＥ３−４それ自身を利用した
。かくしてプリーターＥ３−４がハイブリダイズするコ
ロニーを得、更ニファーノを取得した。
、所望の配列を有するＤＮＡを得るためのグローブとし
て、ここでは、プリーターＥ３−４それ自身を利用した
。かくしてプリーターＥ３−４がハイブリダイズするコ
ロニーを得、更ニファーノを取得した。
得られたファージをグレートにまき、得られたプラーク
をＹＴプレートに移した。ここで再び３２ｐで放射ラベ
ルしたＥ３−４と５５℃、２時間ハイブリダイズせしめ
た。強くハイブリダイズするクローンから、ファージＤ
ＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完全
に除去されているファージを選択した。このようなファ
ージの１つをｍｐ ９− ＨＧＥ△３−１と命名した。
をＹＴプレートに移した。ここで再び３２ｐで放射ラベ
ルしたＥ３−４と５５℃、２時間ハイブリダイズせしめ
た。強くハイブリダイズするクローンから、ファージＤ
ＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完全
に除去されているファージを選択した。このようなファ
ージの１つをｍｐ ９− ＨＧＥ△３−１と命名した。
工程１７ （ｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２の構
築）ｍｐ ９− ＨＧＥΔ３−１の複製型（ｒｅｐｌｉ
ｃａｔｌｖｅ ｆｏｒｍ）をＥｃｏＲ［で切断し、電気
泳動により単離した。こ・の断片をＥｃｏＲｌで切断し
たｐＢＲ３２７に挿入し、プラスミドｐＨＧＥΔ３−１
を得た。
築）ｍｐ ９− ＨＧＥΔ３−１の複製型（ｒｅｐｌｉ
ｃａｔｌｖｅ ｆｏｒｍ）をＥｃｏＲ［で切断し、電気
泳動により単離した。こ・の断片をＥｃｏＲｌで切断し
たｐＢＲ３２７に挿入し、プラスミドｐＨＧＥΔ３−１
を得た。
以下にグラスミドｐＨＧＥ△３−１を用い、ｌａｃ Ｕ
ＶＳをプロモーターとして該生理活性物質を大腸菌中で
、直接発現させることのできるプラスミドの構築を示す
。この構築方法は第７図に示される。
ＶＳをプロモーターとして該生理活性物質を大腸菌中で
、直接発現させることのできるプラスミドの構築を示す
。この構築方法は第７図に示される。
まず１０μｇのプラスミドｐＨＧＥΔ３−１を１０単位
のＡｖａ ＩとＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ社、米国）と３７
℃、２時間切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動゛
で目的フラグメントを単離した。約１μＩの断片がケ゛
ルより回収された。工程１４と同じように第７図に示さ
れる２種のオリゴデオキシ１ヌクレオチド即ち５ ’−
ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣ−３
’ 及び５′Ａ”ｒＣＧＧ（）Ｇ’ｒＴＣ（）ＡＧＡＡ
ＧＡＴｃＡＣＡＴＧ−３’番 を合成した。次いで １２２頁の方法に従いこの２
本のオリゴヌクレオチド（約１００ ｐｍｏｌｓ）の５
′端をリン酸化した。反応後、フェノール・クロロホル
ムで抽出した。かくして得られた合成オリゴマーと、上
記で得られたｐＨＧＥΔ３−１のＡｖａ ｌ −ゼを用
い４℃１夜で結合せしめた。反応終了後、混合物はエタ
ノール沈澱し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
目的断片を単離した。
のＡｖａ ＩとＥｃｏＲＩ （ＢＲＬ社、米国）と３７
℃、２時間切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動゛
で目的フラグメントを単離した。約１μＩの断片がケ゛
ルより回収された。工程１４と同じように第７図に示さ
れる２種のオリゴデオキシ１ヌクレオチド即ち５ ’−
ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣ−３
’ 及び５′Ａ”ｒＣＧＧ（）Ｇ’ｒＴＣ（）ＡＧＡＡ
ＧＡＴｃＡＣＡＴＧ−３’番 を合成した。次いで １２２頁の方法に従いこの２
本のオリゴヌクレオチド（約１００ ｐｍｏｌｓ）の５
′端をリン酸化した。反応後、フェノール・クロロホル
ムで抽出した。かくして得られた合成オリゴマーと、上
記で得られたｐＨＧＥΔ３−１のＡｖａ ｌ −ゼを用
い４℃１夜で結合せしめた。反応終了後、混合物はエタ
ノール沈澱し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
目的断片を単離した。
プラスミドｐＯＰ９５−１５はＦ、 Ｆｕｌｌｅｒの方
法（Ｇｅｎｅ １９巻４２〜５４頁（１９８２年）〕に
より調製した。
法（Ｇｅｎｅ １９巻４２〜５４頁（１９８２年）〕に
より調製した。
ｐＯＰ９５−１５ ＋７） １ ｔｔ／ｉ ｔ−Ｅｃｏ
ＲＩテ消化シテ消化シーフェノール抽出ホルム抽出、エ
タノール沈澱をして調製したベクター０．５μｇと、上
記の如く得た断片を、Ｔ４ＤＮＡ ｌが一ゼを用いて結
合した。実験書（４）、２０頁に従って、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ １０１ （ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換
して１ ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ ）
ｘ−ｇａｌを含む寒天培地上に約１００個の白色コロ
ニーを得た。
ＲＩテ消化シテ消化シーフェノール抽出ホルム抽出、エ
タノール沈澱をして調製したベクター０．５μｇと、上
記の如く得た断片を、Ｔ４ＤＮＡ ｌが一ゼを用いて結
合した。実験書（４）、２０頁に従って、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ １０１ （ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換
して１ ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．００４％（ｗ／ｖ ）
ｘ−ｇａｌを含む寒天培地上に約１００個の白色コロ
ニーを得た。
これらの形質転換体からプラスミドＤＮＡを調整し、Ｅ
ｃｏＲｌで消化し、目的のＥＣｏＲＩ断片を有するプラ
スミドを同定した。更にこれらのプラスミドをＰｖｕｌ
とＰｓｔｌで消化して１．５アガロースｒル電気泳動を
行った結果約１０８０ｋｂ及び約２６００’ｋｂの断片
を有し、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの下流に正しく該
生理活性物質遺伝子が接続されているプラスミドを選択
した。
ｃｏＲｌで消化し、目的のＥＣｏＲＩ断片を有するプラ
スミドを同定した。更にこれらのプラスミドをＰｖｕｌ
とＰｓｔｌで消化して１．５アガロースｒル電気泳動を
行った結果約１０８０ｋｂ及び約２６００’ｋｂの断片
を有し、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの下流に正しく該
生理活性物質遺伝子が接続されているプラスミドを選択
した。
塩基配列を決定したところ、２コのグラスミドにおいて
、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のＤＮＡが正
しく接続されていることが示され念 ・得られたプラス
ミドをｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２と命名した
。
、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のＤＮＡが正
しく接続されていることが示され念 ・得られたプラス
ミドをｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２と命名した
。
ｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２ を含有する大腸
菌を、通常の培地で培養した。生成物の該生理活性物質
の活性を測定したところ、ｐＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ５
−１ （ウサギＴＮＦを発現する）を含有する大腸菌の
生産物と同様の活性を示すことが判明した。
菌を、通常の培地で培養した。生成物の該生理活性物質
の活性を測定したところ、ｐＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ５
−１ （ウサギＴＮＦを発現する）を含有する大腸菌の
生産物と同様の活性を示すことが判明した。
参考例３
参考例２における工程１から１４に従って調整されたプ
ラスミドｐＨｃ）Ｅとオリゴヌクレオチド１−４を用い
て、ｐＨＴＮＦ −１ａｃＵＶ５−１を調整する方法を
第６図に示した。
ラスミドｐＨｃ）Ｅとオリゴヌクレオチド１−４を用い
て、ｐＨＴＮＦ −１ａｃＵＶ５−１を調整する方法を
第６図に示した。
実施例
１）抗原の精製
参考例３で調製した遺伝子組換体ｐＨＴＮＦ−１ａｃ
ＵＶ５−１を含有する大腸菌を、通常の方法で培養した
。次いで目的とする該生理活性物質が生産されるよう１
ｍＭ ＩＰＴＧを加えて誘導操作を行ない、さらに培
養を行なって該生理活性物質を含有する大腸菌を得た。
ＵＶ５−１を含有する大腸菌を、通常の方法で培養した
。次いで目的とする該生理活性物質が生産されるよう１
ｍＭ ＩＰＴＧを加えて誘導操作を行ない、さらに培
養を行なって該生理活性物質を含有する大腸菌を得た。
遠心分離により菌体を集め、該菌体を０．０４Ｍ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）ＩＪ中で超音波破砕し、該
生理活性物質を含む菌体抽出溶液を得た。
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）ＩＪ中で超音波破砕し、該
生理活性物質を含む菌体抽出溶液を得た。
この溶液は、４．５ Ｘ １０５Ｕ／ｍｅの活性を示し
、比活性は３．０×１０４Ｕ／ｍ９であった。
、比活性は３．０×１０４Ｕ／ｍ９であった。
次いで該抽出溶液を、０．０４Ｍ ｌ−リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で十分平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーデン）のカ
ラムに添加した。０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（Ｐ）
Ｉ８８０）で洗浄後、０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）を用いて溶
出した。活性画分を限外ろ過により濃縮して、比活性４
．０Ｘ１０ Ｕ、Ｍ’の粗精製溶液を得た。
液（ｐＨ８，０）で十分平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーデン）のカ
ラムに添加した。０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（Ｐ）
Ｉ８８０）で洗浄後、０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）を用いて溶
出した。活性画分を限外ろ過により濃縮して、比活性４
．０Ｘ１０ Ｕ、Ｍ’の粗精製溶液を得た。
この粗精製溶液を、０．１５ Ｍ塩化ナトリウムを含む
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化した
セファクリルＳ−２００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに添加し、同緩衝液にてグルろ過を行なっ
た。活性画分を限外ろ過により濃縮して、濃度２．ＯＸ
１０５Ｕ／ｍｌ 、比活性７．５ Ｘ １０５Ｕ／ｍ
９の精製溶液を得た。
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化した
セファクリルＳ−２００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに添加し、同緩衝液にてグルろ過を行なっ
た。活性画分を限外ろ過により濃縮して、濃度２．ＯＸ
１０５Ｕ／ｍｌ 、比活性７．５ Ｘ １０５Ｕ／ｍ
９の精製溶液を得た。
２）マウスの免疫
上で得られた精製溶液と、フロイント・コンブリート・
アジ−パントを同量混合・乳濁化させ、ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの雄の皮下に２週間の間隔をあけて３回にわけて１
回当たり ０．２ ｍｌ！投与し、免疫を行なった。さ
らに４週間後、同マウスの腹腔内に該精製溶液Ｑ、 ５
ｍｌを投与し一最終免疫を行なった。
アジ−パントを同量混合・乳濁化させ、ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの雄の皮下に２週間の間隔をあけて３回にわけて１
回当たり ０．２ ｍｌ！投与し、免疫を行なった。さ
らに４週間後、同マウスの腹腔内に該精製溶液Ｑ、 ５
ｍｌを投与し一最終免疫を行なった。
３）細胞融合
最終免疫の３日後に同マウスを殺し、肺臓を取シ出した
。これを細断した後ステンレスメツ７−で圧迫・濾過し
、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ）
に浮遊させ、牌細胞浮遊液を得た。この牌細胞とマウス
ミエローマ細胞（Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１）をそれぞ
れＭＥＭで３回洗浄し、牌細胞とミエローマ細胞を４：
１で混合して遠心（ＳＯＯｒｐｍｌｓ分）した。得られ
た沈澱に４４％ポリエチレングリコール２０００／ＭＥ
Ｍ溶液２ｍｌを徐々に加え、３７℃温水中で１分間遠心
管をゆっくり回転させて細胞融合を行なった。次いでＭ
ＥＭ １ ｒｕｇを加えてゆっくり回転させ、さらに毎
分２ ｔｕｌの割合でＭＥＭを添加し計１０−とした後
遠心（６００ｒｐｍ。
。これを細断した後ステンレスメツ７−で圧迫・濾過し
、イーグルのミニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭ）
に浮遊させ、牌細胞浮遊液を得た。この牌細胞とマウス
ミエローマ細胞（Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１）をそれぞ
れＭＥＭで３回洗浄し、牌細胞とミエローマ細胞を４：
１で混合して遠心（ＳＯＯｒｐｍｌｓ分）した。得られ
た沈澱に４４％ポリエチレングリコール２０００／ＭＥ
Ｍ溶液２ｍｌを徐々に加え、３７℃温水中で１分間遠心
管をゆっくり回転させて細胞融合を行なった。次いでＭ
ＥＭ １ ｒｕｇを加えてゆっくり回転させ、さらに毎
分２ ｔｕｌの割合でＭＥＭを添加し計１０−とした後
遠心（６００ｒｐｍ。
５分）した。沈澱を、１０チウシ胎児血清（Ｆｅ２）含
有ロズウェル・ノ９−り・メモリアル・インステイチェ
ート（ＲＰＭＩ） ｔ ６４０培地にミエローマ細胞と
して７×１０５個／ ｍｌになるように懸濁し、９６穴
マイクログレートに１ウエルあたり ０．１ ｍｅ植え
つけた０ １日後、ＨＡＴ （ヒポキサンチンｌＸｌ０ Ｍ、ア
ミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．６ Ｘ １
０−５Ｍ）を含んだＲＰＭ工１６４０−１０％ＦＣ８培
地（ＨＡ’ｒ培地）を各ウェルにＱ、 １ ｍｌずつ添
加した。その後３〜４日毎に半分量をＨＡＴ培地で交換
したところ、７日目からいくつかのウェルでハイブリド
ーマ細胞の生育が認められ、２〜３週間後にはほぼ全ウ
ェルでハイブリドーマ細胞が増殖した。
有ロズウェル・ノ９−り・メモリアル・インステイチェ
ート（ＲＰＭＩ） ｔ ６４０培地にミエローマ細胞と
して７×１０５個／ ｍｌになるように懸濁し、９６穴
マイクログレートに１ウエルあたり ０．１ ｍｅ植え
つけた０ １日後、ＨＡＴ （ヒポキサンチンｌＸｌ０ Ｍ、ア
ミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．６ Ｘ １
０−５Ｍ）を含んだＲＰＭ工１６４０−１０％ＦＣ８培
地（ＨＡ’ｒ培地）を各ウェルにＱ、 １ ｍｌずつ添
加した。その後３〜４日毎に半分量をＨＡＴ培地で交換
したところ、７日目からいくつかのウェルでハイブリド
ーマ細胞の生育が認められ、２〜３週間後にはほぼ全ウ
ェルでハイブリドーマ細胞が増殖した。
、ｉ） 抗体産生細胞の検索とクローニングハイブリ
ドーマ細胞の生育してきたウェルの培養上清０．１ ｍ
ｅを、該生理活性物質が固定されている９６穴マイクロ
プレートのウェル内に入れて、室温で１時間おいた。０
．１％のウシ血清アルブミンを含む生理食塩水で洗浄後
、ペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇＧ（カッ
ペル社、米国）の１００００倍希釈液を０．１ ｍｌ
／ウェル加え、室温で１時間おいた。０．１％ウシ血清
アルブミ／を含む生理食塩液で洗浄後、基質液（３’Ｏ
ｍ９’ ｏ−フエニレンノアミン、７μ！過酸化水素水
、１０ ｍｌ ０．１Ｍクエン酸、１０ｍ１０．２Ｍリ
ン酸酸水素ナナトリウムを０．１５ｍ１／ウェル加えた
。３０分後４９２ｎｍの吸光度を測定し、抗体産生細胞
の存在するウェルを検索した。 “ 強い抗体活性を示すウェル中の各クローンを、ガラス細
管を用いて吸い出してクローニングを行なった。各クロ
ーンにつき、上記の方法で抗体活性を再検索して、強い
抗体活性を示すＨｙｂｒｉｄ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅＨ［７
Ｃ及びＨｙｂｒｉｄ Ｃｅ１ｌ Ｌｉｎｅ ＨＩ［Ｉ
２Ｆの２クローンを得た。
ドーマ細胞の生育してきたウェルの培養上清０．１ ｍ
ｅを、該生理活性物質が固定されている９６穴マイクロ
プレートのウェル内に入れて、室温で１時間おいた。０
．１％のウシ血清アルブミンを含む生理食塩水で洗浄後
、ペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇＧ（カッ
ペル社、米国）の１００００倍希釈液を０．１ ｍｌ
／ウェル加え、室温で１時間おいた。０．１％ウシ血清
アルブミ／を含む生理食塩液で洗浄後、基質液（３’Ｏ
ｍ９’ ｏ−フエニレンノアミン、７μ！過酸化水素水
、１０ ｍｌ ０．１Ｍクエン酸、１０ｍ１０．２Ｍリ
ン酸酸水素ナナトリウムを０．１５ｍ１／ウェル加えた
。３０分後４９２ｎｍの吸光度を測定し、抗体産生細胞
の存在するウェルを検索した。 “ 強い抗体活性を示すウェル中の各クローンを、ガラス細
管を用いて吸い出してクローニングを行なった。各クロ
ーンにつき、上記の方法で抗体活性を再検索して、強い
抗体活性を示すＨｙｂｒｉｄ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅＨ［７
Ｃ及びＨｙｂｒｉｄ Ｃｅ１ｌ Ｌｉｎｅ ＨＩ［Ｉ
２Ｆの２クローンを得た。
これらの細胞は、１０チＦＣ３含有ＲＰＭＩ−１６４０
培地を用いて培養を拡大し、細胞を集め、１５％ＦＣ８
及び１０％ツメチルスルホキシドを含有するＲＰＭＩ−
１６４０培地中で液体チッ素内に貯蔵した。
培地を用いて培養を拡大し、細胞を集め、１５％ＦＣ８
及び１０％ツメチルスルホキシドを含有するＲＰＭＩ−
１６４０培地中で液体チッ素内に貯蔵した。
５）ハイブリドーマ細胞の腹水化
上で得られた２種のノ・イブリドーマ細胞のそれぞれ１
ｘ１ｏ’個を、あらかじめ０．２ ｒｕｌのブリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を
腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に
接種することにより腹水化を行なった。１０日後３〜５
ｍｅ ７匹の腹水を採取した。
ｘ１ｏ’個を、あらかじめ０．２ ｒｕｌのブリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を
腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に
接種することにより腹水化を行なった。１０日後３〜５
ｍｅ ７匹の腹水を採取した。
６）モノクローナル抗体の精製
上記腹水のそれぞれ１０ｒｎｌに硫酸アンモニウムを２
．６６９加え（３５％飽和）、４℃で一晩攪拌した。生
じた沈澱を遠心分離し、０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐ
ｉ”１８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーテン）のカ
ラムに添加し、同緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃ１を含む０−０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８゜０）で溶
出シた。ポリアクリルアミドグル電気泳動によりモノク
ローナル抗体画分を決定し、最終的にＨｉｔ７Ｃモノク
ローナル抗体を９７ｍ９、ＨＩＩＩ２Ｆモノクローナル
抗体を１９９１ｎ９得た。
．６６９加え（３５％飽和）、４℃で一晩攪拌した。生
じた沈澱を遠心分離し、０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐ
ｉ”１８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーテン）のカ
ラムに添加し、同緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃ１を含む０−０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８゜０）で溶
出シた。ポリアクリルアミドグル電気泳動によりモノク
ローナル抗体画分を決定し、最終的にＨｉｔ７Ｃモノク
ローナル抗体を９７ｍ９、ＨＩＩＩ２Ｆモノクローナル
抗体を１９９１ｎ９得た。
７）モノクローナル抗体のサブクラス決定オフタロニー
免疫拡散法（その方法はたとえばＨｕａｓｏｎら著”Ｐ
ｒａｃｔ、ｉｃａ’Ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” 、
ＢｌａｃｋｖｒｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌ
ｘｃａｔｉｏｎｓ （，１９７６） １０７〜１１５頁
に記載しである）Ｋて、抗マウスＩｇＧ４． 、ＩｇＧ
２ａ。
免疫拡散法（その方法はたとえばＨｕａｓｏｎら著”Ｐ
ｒａｃｔ、ｉｃａ’Ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” 、
ＢｌａｃｋｖｒｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌ
ｘｃａｔｉｏｎｓ （，１９７６） １０７〜１１５頁
に記載しである）Ｋて、抗マウスＩｇＧ４． 、ＩｇＧ
２ａ。
ＩｇＧ２． （いずれもＭｉｌｅｓ社、米国）を用い、
サブクラスを決定した。その結果Ｈｎ７Ｃ，ＨＩ［Ｉ２
Ｆの両モノクローナル抗体ともＩｇＧ１であった。
サブクラスを決定した。その結果Ｈｎ７Ｃ，ＨＩ［Ｉ２
Ｆの両モノクローナル抗体ともＩｇＧ１であった。
８）モノクローナル抗体による該生理活性物質の活性の
消去 １）で得られた該生理活性物質の精製溶液を１０％ＦＣ
８含有ＭＥＭ培地で２０ Ｕ／ｍｅおよび２００ Ｕ／
ｍｅに希釈した。２種のモノクローナル抗体もそれぞれ
同培地で各濃度に希釈した。両液を１ウエルあたり０．
０５ ｍ７ｉずつ９６穴マイクログレートに加えた。３
７℃で１時間おいたあと、１０ 個／ ｒｎｌのＬ−
Ｍ細胞の同培地懸濁液を０．１ ｍｅ加えた。その後の
操作は前に記載したｉｎ Ｖｉｔｒｏ活性測定法に準じ
た。同時に該生理活性物質もモノクローナル抗体も加え
ない実験（Ａ）とモノクローナル抗体のみを加えない実
験（Ｂ）も行なった。
消去 １）で得られた該生理活性物質の精製溶液を１０％ＦＣ
８含有ＭＥＭ培地で２０ Ｕ／ｍｅおよび２００ Ｕ／
ｍｅに希釈した。２種のモノクローナル抗体もそれぞれ
同培地で各濃度に希釈した。両液を１ウエルあたり０．
０５ ｍ７ｉずつ９６穴マイクログレートに加えた。３
７℃で１時間おいたあと、１０ 個／ ｒｎｌのＬ−
Ｍ細胞の同培地懸濁液を０．１ ｍｅ加えた。その後の
操作は前に記載したｉｎ Ｖｉｔｒｏ活性測定法に準じ
た。同時に該生理活性物質もモノクローナル抗体も加え
ない実験（Ａ）とモノクローナル抗体のみを加えない実
験（Ｂ）も行なった。
表にその結果を示した。表中の活性の消去率は下記の式
で求めた。
で求めた。
両モノクローナル抗体とも高濃度であれば、該生理活性
物質の活性を完全に消去した。抗体の濃度が低い場合、
ＨＩＩ［２Ｆモノクロ一ナル抗体の方がＨｎ７Ｃモノク
ローナル抗体より′も消去率が高かった。
物質の活性を完全に消去した。抗体の濃度が低い場合、
ＨＩＩ［２Ｆモノクロ一ナル抗体の方がＨｎ７Ｃモノク
ローナル抗体より′も消去率が高かった。
９）モノクローナル抗体の等電点測定
薄層グル等電点電気泳動装置（ファルマ／ア社。
スウェーデン）を用い、両モノクローナル抗体の等電点
を測定した。キャリヤー・アンフオライトとしてファル
マライトＰＨ３〜１０（ファルマシア社、スウェーデン
）を用いて、Ａｗｄｅｈらの方法（Ｎａｔｕｒｅ 、２
１９（１９８０）６６）に従って実施した。
を測定した。キャリヤー・アンフオライトとしてファル
マライトＰＨ３〜１０（ファルマシア社、スウェーデン
）を用いて、Ａｗｄｅｈらの方法（Ｎａｔｕｒｅ 、２
１９（１９８０）６６）に従って実施した。
その結果、ＨＩＩ７Ｃモノクローナル抗体の等電点は６
．７〜７．０、ＨＩＩ［２Ｆモノクロ一ナル抗体の等電
点け６．２〜６．５であっ念。
．７〜７．０、ＨＩＩ［２Ｆモノクロ一ナル抗体の等電
点け６．２〜６．５であっ念。
１０）モノクローナル抗体結合樹脂の作成６）で得られ
たＨＩＩ ７Ｃモノクロ一ナル抗体の１５０ダを含む溶
液５０ｍ１を、０．５ Ｍ塩化すｌ−１７ウム〜０．１
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に透析した。あらかじめ臭化シ
アンで活性化したセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマノ
ア社、スウェーデン）の膨潤した樹脂５０ｒｎｌに、こ
の抗体溶液を加え、４℃でゆっくシ攪拌しながら一晩反
応させた。反応後、樹脂を０．５Ｍ塩化ナトリウム−０
，１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で良く洗浄した。次いでＩ
Ｍのエタノールアミン水溶液５０ｍ１と混合し、室温で
２時間ゆっくシ攪拌しながら未反応の活性基を保護した
。８Ｍ尿素、続いて生理食塩水で充分洗浄して、アフィ
ニティークロマトグラフィー用のＨ［１７Ｃモノクロ一
ナル抗体結合樹脂を作成した。
たＨＩＩ ７Ｃモノクロ一ナル抗体の１５０ダを含む溶
液５０ｍ１を、０．５ Ｍ塩化すｌ−１７ウム〜０．１
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に透析した。あらかじめ臭化シ
アンで活性化したセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマノ
ア社、スウェーデン）の膨潤した樹脂５０ｒｎｌに、こ
の抗体溶液を加え、４℃でゆっくシ攪拌しながら一晩反
応させた。反応後、樹脂を０．５Ｍ塩化ナトリウム−０
，１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で良く洗浄した。次いでＩ
Ｍのエタノールアミン水溶液５０ｍ１と混合し、室温で
２時間ゆっくシ攪拌しながら未反応の活性基を保護した
。８Ｍ尿素、続いて生理食塩水で充分洗浄して、アフィ
ニティークロマトグラフィー用のＨ［１７Ｃモノクロ一
ナル抗体結合樹脂を作成した。
ＨＩＩＩ２Ｆモノクローナル抗体についても同様に抗体
結合樹脂を作成した。
結合樹脂を作成した。
１１）アフィニティークロマトグラフィー１０）で作製
したモノクローナル抗体結合樹脂を用いて該生理活性物
質の精製を試みた。Ｈｎ７Ｃモ〉クローナル抗体結合樹
脂を２，５×８ｔ−ｒｎのカラムに充填した。０．１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）で充分洗浄後、ｌ）の粗精製溶：Ｑｉ、 １００
ｍｌＥを流速１０ｍ１／時間で流した。次いで同緩衝
液５００ ｍｌを用いて同じ流速で洗浄しり後、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０）で溶出し、活性画分を集めた。この両分は
比活性１．９０Ｘ１０ Ｕ／ｍ９を示し、回収率は８
０％であった。
したモノクローナル抗体結合樹脂を用いて該生理活性物
質の精製を試みた。Ｈｎ７Ｃモ〉クローナル抗体結合樹
脂を２，５×８ｔ−ｒｎのカラムに充填した。０．１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）で充分洗浄後、ｌ）の粗精製溶：Ｑｉ、 １００
ｍｌＥを流速１０ｍ１／時間で流した。次いで同緩衝
液５００ ｍｌを用いて同じ流速で洗浄しり後、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０）で溶出し、活性画分を集めた。この両分は
比活性１．９０Ｘ１０ Ｕ／ｍ９を示し、回収率は８
０％であった。
Ｈ［１２Ｆモノクロ一ナル抗体結合樹脂を用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーも上と同様に行ない、比活性
１．９５ ｘ １０ Ｕ／ｍ９の活性画分を回収率７
５％で得た。
ニティクロマトグラフィーも上と同様に行ない、比活性
１．９５ ｘ １０ Ｕ／ｍ９の活性画分を回収率７
５％で得た。
純度検定のために両活性画分のドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミド電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉ。
−ポリアクリルアミド電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉ。
Ｎａｔｕｒｅ 、 ２旦７（１９７０）６８０）を行な
ったところ、分子量約１７０００の位置のみに単一のバ
ンドを示した。
ったところ、分子量約１７０００の位置のみに単一のバ
ンドを示した。
以上水したように、本発明におけるモノクローナル抗体
は、該生理活性物質を特異的に認識する純粋な抗体であ
る。またハイブリドーマ細胞は液体チッ素中などで半永
久的に保存でき、必要な時にはいつでも同一の抗体を大
量に生産することができる。
は、該生理活性物質を特異的に認識する純粋な抗体であ
る。またハイブリドーマ細胞は液体チッ素中などで半永
久的に保存でき、必要な時にはいつでも同一の抗体を大
量に生産することができる。
さらに該モノクローナル抗体を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを該生理活性物質の精製に利用するこ
とで、極めて高純度な該生理活性物質を高回収率で得る
ことができる。したがって該生理活性物質を制癌剤とし
て用いるための精製方法として、本発明は非常に有効で
ある。
ロマトグラフィーを該生理活性物質の精製に利用するこ
とで、極めて高純度な該生理活性物質を高回収率で得る
ことができる。したがって該生理活性物質を制癌剤とし
て用いるための精製方法として、本発明は非常に有効で
ある。
第１図は、ウサギＴＮＦの遺伝子を含有するプラスミド
の制限酵素切断地図を示す。第２図は、ｐＴＮＦ −１
ａｃ −１１の調製方法を示すフローシートであり、第
３図は、ｐＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ５−１１の調製方法
を示すフｏ −／−）である。第４図は、本発明の生理
活性物質遺伝子の構造を示す。第５図は、ウサギＴＮＦ
遺伝子の構造を示す。第６図は、ｐＨＴＮＦ −１ａｃ
ＵＶ５−１の調製方法を示すフローシートであり、第７
図は、ｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２の調製方法
を示すフローノートである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 Ｐｓｔｌ Ｔａｑｌ ＰｖｕｌＩ Ｒｓａｌ手続補
正８（自発） 昭和６０年Ｑ月２日
の制限酵素切断地図を示す。第２図は、ｐＴＮＦ −１
ａｃ −１１の調製方法を示すフローシートであり、第
３図は、ｐＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ５−１１の調製方法
を示すフｏ −／−）である。第４図は、本発明の生理
活性物質遺伝子の構造を示す。第５図は、ウサギＴＮＦ
遺伝子の構造を示す。第６図は、ｐＨＴＮＦ −１ａｃ
ＵＶ５−１の調製方法を示すフローシートであり、第７
図は、ｐＨＴＮＦ −１ａｃ ＵＶ ５−２の調製方法
を示すフローノートである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 Ｐｓｔｌ Ｔａｑｌ ＰｖｕｌＩ Ｒｓａｌ手続補
正８（自発） 昭和６０年Ｑ月２日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対して細
胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌
細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合にそ
の腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有する
生理活性物質に対するモノクローナル抗体。 ２、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対して細
胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌
細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合にそ
の腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有する
生理活性物質に対するモノクローナル抗体を製造する方
法であって、該生理活性物質で免疫した哺乳動物から得
られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合により生成し
たハイブリドーマ細胞を抗体産生細胞として用いて、こ
れをクローン培養することを特徴とする方法。 ３、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対して細
胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌
細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合にそ
の腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有する
生理活性物質で免疫した哺乳動物から得られた抗体産生
細胞と骨髄腫細胞との融合により生成した該生理活性物
質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞。 ４、遺伝子組換体より生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対して細
胞障害性を有し、かつＭｅｔｈ Ａ Ｓａｒｃｏｍａ癌
細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合にそ
の腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有する
生理活性物質に対するモノクローナル抗体の少なくとも
１種以上を担体に固定させて得られる親和性吸着体を用
いるアフィニティークロマトグラフィーに粗製の該生理
活性物質を付す工程を含むことを特徴とする該生理活性
物質の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59184379A JPS6163698A (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | 生理活性物質に対するモノクロ−ナル抗体とそれを用いる生理活性物質の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59184379A JPS6163698A (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | 生理活性物質に対するモノクロ−ナル抗体とそれを用いる生理活性物質の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6163698A true JPS6163698A (ja) | 1986-04-01 |
Family
ID=16152168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59184379A Pending JPS6163698A (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | 生理活性物質に対するモノクロ−ナル抗体とそれを用いる生理活性物質の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6163698A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0260610A2 (de) * | 1986-09-13 | 1988-03-23 | BASF Aktiengesellschaft | Monoklonale Antikörper gegen humanen Tumonekrosefaktor (TNF) und deren Verwendung |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57140725A (en) * | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance having carcinostatic action |
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS60208924A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 |
-
1984
- 1984-09-05 JP JP59184379A patent/JPS6163698A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS57140725A (en) * | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance having carcinostatic action |
| JPS60208924A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0260610A2 (de) * | 1986-09-13 | 1988-03-23 | BASF Aktiengesellschaft | Monoklonale Antikörper gegen humanen Tumonekrosefaktor (TNF) und deren Verwendung |
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