JPS61219388A - Ｄｎａセグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、食糧や飼料として有用なサツマイモ蛋白質の
一種であるスポラミンまたはその前である。

〔従来技術〕

サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ）には、
固形分中、約！チの蛋白質が含まれていることが知られ
ている（、Ｔ、Ａｇｒｉｃ、　ＦＯＯ（ｌ　Ｃ！ｈｅｍ
、、　Ｖｏｌ、　３２，４１１１゜≦２！−ｔタタ（ｉ
ｙｔａ））。

本発明者らの一部は、先に、サツマイモの塊根に含まれ
る可溶性蛋白質の中の主要蛋白質を精製し、それをスポ
ラミンと命名した（昭和！り年度日本農芸化学会講演要
旨集第ｓｉｔ頁（ｊＢ−２０））。

即ち、スポラミンは、サツマイモの塊根に含まれる構造
蛋白質であシ、塊根の可溶性蛋白質の１０％以上を占め
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に２種類（スポラ
ミンＡおよびスボラミｙＢ）存在し、これらは、分子量
、免疫学的性質等において類似している。

また、スポラミンは、下記第１表に示すようにアミノ酸
バランスが良く、食糧や飼料の蛋白質源として有用であ
る。

第１表 アミノ酸　　スポラミンＡ　　　スポラミンＢ組　　成
　　　（ｍ０１％）　　　　　（ｍｏｂ％）Ｃｙｓ　　
　　　　　　２．／、　　　　　　　　　　／、りＡｓ
ｐ　　　　　　／ｉ／　　　　　　　／ｉλ第１表つづ
き Ｔｈｒ　　　　　　　　７．ＯＡ、ｒ Ｓｅｒ　　　　　　　　ＩＬＪ　　　　　　　　　１．
ｒＧｌｕ　　　　　　　Ａ、０　　　　　　　７．りＰ
ｒｏ　　　　　　　　Ｊ、Ａ　　　　　　　　　Ｊ、Ｊ
Ｇｌｙ　　　　　ｒ、６　　　　　７．７Ａｌａ　　　
　　　　＆　、タ　　　　　　　４．／Ｖａｎ　　　　
　　　ｒ　、ｊ　　　　　　　　タ、１Ｍｅｔ　　　　
　　　　　コ、コ　　　　　　　　　／、２工１ｅ　　
　　　　４′・ｌｒ！・り Ｌｅｕ　　　　　　　　７．Ｏｊ、＆ Ｔｙｒ　　　　　Ｊ、４　　　　　３．１ｐｈθ　　　
　　　　　！、Ｊ　　　　　　　　　　ｊ、７Ｈ１ｇ　
　　　　　　／、２　　　　　　０．７Ｌｙｓ　　　　
　ＩＩ　、λ　　　　　参、ｌＡｒｇ　　　　　Ｊ、Ｊ
　　　　　　参、！Ｔｒｐ　　　　　Ｏ，？　　　　　
　０．７計　　　　ｔｏｏ、ｏ　　　　　ｉｏｏ、。

そこで、本発明者らは、遺伝子工学的手法によりスポラ
ミンをクローニングする事に着目し、かかるクローニン
グに必要なスポラミンまたはその前駆体をコードするＤ
ＮＡセグメントを得るに至り本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、スポラミンまたはその前駆
体をコードするＤＮＡセグメントおよび該ＤＮＡセグメ
ントを含むプラスミドで形質転換された宿主に存する。

〔発明の構成〕

本発明において、原料として使用し得るサツマイモ（工
ｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ　）としては種々のもの
が使用できるが、具体的には、例えば、高系ｌ１号、農
林１号、金時等が挙げられる。スポラミン生合成の盛ん
な肥大時期の塊根を使用するのが好ましい。

本発明のスポラミンまたはその前駆体をコードするＤＮ
Ａセグメントは、上記原料から対応するｍＲＮＡを取シ
出し、これを用いて岡山−Ｂｅｒｇのベクター・プライ
マー法（Ｍｏ１ｅｃｕ＃１ａｒａｎｌ　　Ｃｅｌ’１ｕ
ｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｊ、　　／Ａ／　　−／
７０．　　／りｒコ）によりｃＤＮＡとして得られる。

まず、塊根をワーリングプレ／グー等で磨砕（、、ＢＤ
８−フェノール抽出、エタノール沈殿等によって全ＲＮ
メを得る。次いで、　Ｌｉ０１　処理によってＤＮＡや
低分子ＲＮＡを除去する。

スポラミンｍＲＮＡは、　ｐｏ１７Ａ部分を有すること
が知られているので、常法によυこれをオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムにかけてｐｏｌｙＡ　ＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）を得る。

このｍＲＮＡ原料より、岡山−Ｂｅｒｇのベクター・プ
ライマー法によって、ｃＤＮＡライブラリーを得る。

例えば、図１に示すように、大湯菌１ａｃ遺伝子のプロ
モーターとアンピシリン耐性遺伝子を有する発現ベクタ
ーであるｐＵｃｒ　（Ｇｅｎｅ、　／り。

２１９−４ｔｒ（／り１２））をＰｓｔ工処理、ｄＧテ
ーリング、　　ＥｃＯＲ工処理してテールリンカ−を得
る。

一方、　　ｐＵｃｌをＰａｔＩ処理、ａＴ　ｆ　−＋Ｊ
　ンク、Ｈｌｎｃ　エエ処理してベクタープライマーを
得、これに上記ｍＲＮＡをアニールさせ、逆転写酵素を
作用させてｃＤＮＡを合成させる。

次いで、ｄＣテーリング、ＫＯＯＲ工処理し、これに先
に調製したテールリンカ−を組み込みＤＮＡ！Ｊガーゼ
を作用させて環化させる。と乙−ｍＲＮＡの部分をＲＮ
ａｓｅ　Ｈで除去し、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて
ＤＮＡを合成させることによってλ重鎖ｃ　ＤＮＡセグ
メントを含有するプラスミドを得ることができる。

このようにして調製したｃ　ＤＮＡ含有プラスミドを、
常法、例えば、Ｄ、　Ｈａｎａｈａｎ　　の方法（Ｊ。

Ｍｏｂ　Ｂｉｏｌ、△ｔｔ、　１１７　（１５Ｐ１３）
）　Ｋよシ大腸菌等に形質転換し、アンピシリン耐性株
を取得（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、
　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　１０．３／（ｌりｒ３））に準じて
スポラミンの抗体を使用し、免疫学的手法によシ、目的
のスポラミンまたはその前駆体をコードするＤＮＡセグ
メントを含むコロニーを得る。

その際、予め上記で得られた形質転換体について、前記
ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴ　をブライマーとして
８ｔ、　Ｊｏｈｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓの方法（Ｃｅ１
１／＆、　！４Ｕ　（／タック））により作成り、　タ
１ｌｐ−ｃＤＮＡをプローブとしてコロニーノ１イプリ
ダイゼーションを行い、強い陽性のシグナルを示ス目的
コロニーをスクリーニングしておいてもよい。即ち、こ
の方法によれば、サツマイモ塊根に由来するｍＲＮＡか
らのｃ　ＤＮＡを有するコロニーのみが、ハイブリダイ
ゼーションされ、しかも、　　ｍＲＮＡ中の大部分はス
ポラミンｍＲＮＡであるので、組み込まれたｃＤＮＡお
よびプローブ”Ｐ　−ｃＤＮＡ中にハｘホラミンｍＲＮ
Ａ　カラノものが多く含まれる。従って、これらがハイ
ブリダイゼーションすると強い陽性のシグナルを示すの
で、目的のコロニーをスクリーニングするＡｃ１ｄｅ　
Ｒｅｓ、、　７．　／！／Ｊ　（／り７り））に従って
プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｔ％製する。そして、前記サツ
マイモ塊根由来ｍＲＮＡのうち、このグラスミドＤＮＡ
と特異的に結合するｍＲＮＡを取得し、小麦胚芽無細胞
蛋白質合成系（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
。

／、　／ＪＩＪｒ−／３り７　（／り７≠））で翻訳し
、生成した蛋白質の電気泳動パターンをスポラミンのパ
ター／と比較することによって形質転換体に組み込まれ
たプラスミドＤＮＡ中のｃＤＮＡがスポラミンまたはそ
の前駆体をコードするＤＮＡセグメントであることを確
認することができる。

上記のようにして同定された目的ｃＤＮＡクローンを含
むコロニーを培養し、上述のＢｉｒｎｂＯｌｍらの方法
に従ってプラスミドＤＮＡを得、適切（ｌりｒＯ））Ｋ
よって又は、制限酵素で切断後、−更にＭｔ３ｙｌｌフ
ァージにクローンし、　　ｓ４ｎｇｅｒ　　らのジデオ
キシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ
。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、−乙！、　　ｊ４Ａｔ３　　（／り７７
））によって目的ｃＤＮＡセグメントの塩基配列が決定
できる・離・ （１）　　ｇ嗜噂・・・・・・・・・・・−サツマイモ
高系ｌ弘号（工ｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ。

ＫＯｋｅｉ　Ａ　／弘）の肥大途上にある塊根を収穫し
た。その柔組織ｔｏｏｔを約３爛角に細断し、１ｚｏ−
の抽出用緩衝液 （０，／　Ｍ　ＮａＣ１，／（７ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　
／％５ＤＥｌ　。

０、／　Ｍ　Ｔｒｉｓ　：　ＨＯＩ　（ｐＨり、０））
、　　／！０ＩＩＬ／！のフェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２１：２≠：／）、３０−のβ
−メルカプトエタノールを加えてＦ℃でワーリング・ブ
レンダーで磨砕した。磨砕液を７千回転ｉｏ分間遠心し
、上層の水層にほぼ等量のフェノール：クロロホルム：
インアミルアルコール （２！”、２≠；／）を加え、良く混合した後、遠心に
よって再度水層を回収した。

終濃度がＯ，コ！Ｍになるように加え、更に一１！倍量
のエタノールを加え良く混合し。

−２０′Ｃ忙−晩装置した。を千回転２０分間の遠心で
得られた沈殿を、７０％エタノールに懸濁し、再度遠心
によって回収した後、減圧下乾燥させた。

（２）得られた乾燥全核酸標品を／ｊｔｍｌのＥＴ緩衝
液（／　ＯｍＭ　Ｔｒｉ８：　ＨＯＩ　（ｐＨ７ｊ）、
／　ＯｍＭ　ＫＤＴＡ）に溶かし、ｊＭ　Ｌｉａｌを１
０−加えて、最終濃度を２Ｍとし弘℃で一晩放置した。

／２　、０００回転２０分間の遠心分離によって、上清
に残るＤＮＡや低分子量ＲＮＡを除いた全ＲＮＡ画分を
沈殿として回収した。２Ｍ　Ｌｉ０１による沈殿を再度
繰シ返し、７０％エタノールで洗浄した後、減圧下で乾
燥させ、全ＲＮＡ標品を得た。

（３）　　乾燥全ＲＮＡ標品を弘、！−の／　ＯｍＭＴ
７”ｉｓ：　ＨＯｌ（ｐＨ７，１）　、／　ＯｒｎＭ　
Ｆ！ＤＴＡ、　０．２％８Ｄ８に溶解し、ｔ１℃３分間
処理してから氷水中で急冷した。Ｏ０！−のｊＭ　Ｌｉ
（１！１を加え、遠心によって不溶物を除去した上清を
、０．１Ｍ　Ｌｉｏｌ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ：　Ｈｃ
ｌ（ｐＨ７，ｊ）　、１０ｍＭ　ＫＤＴＡｌｏ、、１％
ｓＤｓで平衡化した約／ｌｄの０１１ｇ０−　ｄＴ　　
セルロース・カラム（０ｏｌｌａｂｏｙａｔｉｖｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＩｎｃ、、）　にかけた。カラムを約！
倍量の０、ｊＭ　Ｌｉｃｌ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ：　
ＨＯＩ　（ｐＨ７Ｊ）。

１０ｍＭ　ＫＤＴＡ、　０．コ％ｓＤｓで洗った後、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ：　Ｈ６１（ｐＨ７，７）、　／ｍＭ
　ＫＤＴＡ。

０．０Ｊ％　　ＢＤＢでカラムに吸着したｐｏｌｙＡ＋
ＲＮＡを溶出した。ｐｏｌｙＡ”　　ＲＮ　Ａ溶出液に
コ、！倍容のｊＭ　Ｌｉ０１：エタノール（ｌ：コ弘）
を加え、−２０℃で一晩放置した。

３０．０００　回転３０分間の遠心で得られた沈殿を、
７０％エタノールで洗浄後減圧下乾燥させ、ｐｏｌｙＡ
”　ＨＭ　Ａを得た。

Ｆｉｃ　ｏＲニリンカーの調製 （１）３λ０ＩＪＰのプラスミド・ベクターｐＵｃ！１
（１）をμｏｏユニットのＰｓｔ工で３７℃３時間処理
して完全分解した。／／２０容のｏ、ｒＭ　ＥＤＴＡと
ｌＯ％ＢＤＢを加え、フェノール抽出を行なった後にＤ
ＮＡをエタノール沈殿によって回収した。λ！μＶのＰ
ｓｔ工処理したｐＵＯＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ　′１ｒＩＯｔｉ
１（Ｄ　Ｏ，１４１Ｍカコジル酸ナトリウム　（ｐＨ７
，０）　、　　０．ＩｒｎＭＤＴＴ、弘ＯＡＭ　ｄＴＴ
Ｐ％２ｍＭ　Ｍｎ０１１中で３０℃λ分間温め、ターミ
ナル・ヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（宝［ｉ　
）をＡ　Ｏｕｎｉｔ加え、更にｔ分間反応させた。

この条件下でベクターＤＮ’Ａのｐｓｔ工３′東端に平
均ｔ！ヌクレオチドのｄＴが付加された。／／２０容の
０．１Ｍ　ｌｌ１ＤＴＡと１０％　　ＢＤＢを加えて、
７Ｊ℃で３分間処理して反応を停止し、フェノール抽出
を３回、エーテル抽出を３回行なった後に、　ｐＵＯｒ
Ｐｓｔ工（ｄＴ）ｓ藝Ｄ　Ｎ　Ａをエタノール沈殿で回
収し。

減圧乾燥後水に溶かした。

（２）　ｐＵＯｒ　Ｐａｔ工（ｄＴ）ａｓより、１ａｃ
　　プロモーター側に付いた（ｄＴ）ｓｓをＨｌｎｃ　
ｌ切断によって除去した。即ち、ｐＵＯｆｆ　Ｐａｔ工
（ｄＴ）＠、　／ｊμｇｔ−２００μｍの反応液中で／
ｊ０ユニットのＨｌｎｃｌ　　にツボンジーン社製）で
３７℃３時間処理した。処理後３Ｊ％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって、（ｄＴ）ａｓを一方のＰ８を
工末端にのみもツｐｔｙｏｒ　Ｐｓｔ工（ｄＴ）ａｓ　
Ｈｌｎｃｌ　　（約２．７　ｋｂ　）を短いフラグメン
トよシ分離した。

このＤＮＡはゲルよシミ気泳動法によって透析チューブ
中へ溶出した。溶出したＤＮＡはフェノール抽出、エー
テル抽出の後、後このＤＮＡを（６Ｔ　）＠　＠　ｐ　
ＴＴ　Ｏｒ　ヘクタープライマーと呼ぶ。

（３）先に得たＰｓｔ工処理したｐ［ＴＯｒのコｔＯｔ
ｔｇを弘ＱＯμｍの０．１４１Ｍカコジル酸ナトリウム
（ｐＨ７，０）、　０．１ｍＭ　ＤＴ？、　　７４．７
／ＪＭｄＧＴＰ。

／　ｍＭ　Ｃｏｇｌｌを含む反応液で３７℃でＩ分間温
めてから、１００ユニツトのターミナルｅヌクレオチジ
ル・トランスフェラーゼを加えて、更にμ分間反応させ
た。この条件下でＰｓｔエフラグメントの３′末端に平
均コ！ヌクレオチドのｄＧが付加された。

先の（ｄＴ）付加反応の場合と同様にして、反応を停止
しＩ）ＩＪＡをエタノール沈殿によって回収した。得ら
れたｐＵｃｒ　Ｐｅｔ工（ｄＧλＳＤ　Ｎ　Ａ　２ｔＯ
μｇをｚｏｏμｍの反応液中で７１０ユニツトのＥｃ　
ｏＲ工で３７℃で３時付加したＪ　ｊ　ｂｐのＥｃｏＲ
ニーＰａｔエフラグメントを分離した。以後このＤＮＡ
を（ｄＧ）Ｂ　ＫｃｏＲニリンカーと呼ぶ。

ブラリー （１）　　上記〔ｌ〕で得られたサツマイモ塊根よ）調
製したｐｏｌｙＡ＋ＲＮ　Ａ　（Ｊμｇ）をりμｍの！
　ｍＭ　Ｔｒｌｓ：　ＨＱｌ（ＴＩＨ♂、３）中でＪ７
℃で５分間加熱処理した後にす３℃に降温しｄｔＪＴＰ
、　　１０ｍＭ　ＤＴＴ、（α−”Ｐ）ｄＯＴＰ（約Ｉ
Ｉ　００　ｃｉ／　ｍｍｏｌ　）、りｕｎｉｔ　Ｈｕｍ
ａｎｐｌａｃｅｎｔａ　ＲＮａｅｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ（和光補薬）。

この反応液１ｃ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｅｃｒｉｐ
　ｔａｓｅ（生化学工学）２≦ｕｎｉｔを加え≠３℃で
４！！分間反応させて一本鎖ｃＤＮＡを合成させた。反
応は１μｍづつの０．１　Ｍ　！！！ＤＴＡ　。

１０％ＢＤＢ１に加えて停止し、フェノール抽出、エー
テル抽出、の後に％コ！μｍのグＭ酢酸アンモニウムと
７００μｌのエタノールを加えて混合して一７０℃で２
０分間冷却し、遠心によってＤＮＡを回収した。

（２）　　上の反応で得られた一本鎖ｃＤＮＡを、コＯ
μｌの反応液（０，／　＄　Ｍ　　カコジル酸ナトリク
Ａ　（ｐＨ７，０）、　０．／　ｍＭ　ＤＴＴ　、　７
０ｔｔＭ　ｄｃＴＰ。

／　ｍＭ　ＯｏＯ］４　）に溶かし、３７℃で２分間温
めた後に、／ｊｕｎｉｔのｔｅｒｍｉｎｉｌ　ｎｕｃ：
Ｌｏｏｔ−１ｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを加え、
更に４分間反応させた。反応の停止、ＤＮＡの回収は先
に記した方法で行なった。

（３）　　（ａ　ａ　）付加した一本鎖ＣＤＮＡの半量
を、１０μｍの反応液中で！　ｕｎｉｔのＥｃ　ｏＲ工
　で３７℃で３０分間処理し、フェノール抽出。

エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。

回収したＤＮＡはベクターＤＮＡ濃度がλμｎｇ／μｍ
　となるように水に溶かした。

（４）　　（ｄｏ）付加した一本鎖ＣＤＮＡコ４（ｎｇ
を上記〔コ〕の（３）で得た（ｄＧ）冨Ｓ品エ　リンカ
−Ｊ、Ａｎｇ　　と共に、３μｍの０．１Ｍ　ＮａＣ１
，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ：　ＨＯｌ（ｐＨ７，７）、／　
ｍＭ　ＥＤＴＡ中で４　ｊ℃ｊ分間１次いで≠２℃で３
Ｑ分間インキュベートしてアニールさせた。このアニー
ル液に以下の成分を加えて全液量（ぶ０μｍ　とし、７
２℃で一晩反応させ環状化させた：　２０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉ−ｓ：　ＨＯＩ　（ｐＨ７，よ）。

４’　ｍＭ　／Ｗｆｇ、Ｃ３１ｚ　、　１０ｍＭ　（Ｎ
Ｈ４）ｚ　Ｅｉ０４　、０．／Ｍｘｃ１．　ｏ、ｉｍｙ
β−ＮＡＤ、　！Ｏｔｔｇ／ｒｄ　Ｂ８Ａ、　０．４４
μｇ　Ｋ−ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（Ｐ　Ｌ　　Ｂｉ
ｏｃｈｓｍｉ−ｃａｌθ工ｎｃ、）。このようにして環
状化した組み換え体のＲＮＡ鎖を除去して、ＤＮＡ鎖に
置換するために、上記反応液に弘種ｄＮＴＰ各ｕ　Ｏａ
Ｍ、　０．／！ｍＷβ−ＭＡＤ。

０．２μμｇ　！ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ、　ｌ
≠ｕｎｉｔ　Ｋ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼエ
、ｏ、ｔｕｎｉｔ　Ｅ、ｃｏ’ｌｉ　ＲＮａｓｓＨを追
加し、１２℃及び２０℃で１時間づつ反応させた。反応
終了後λμｍの０．１Ｍ　ＥＤＴＡと３μｍのｔＲＮＡ
。

（２ｔｒｑ／ｒｄ　）　ヲ加え、フェノール抽出、エー
テル抽出の後エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、
！μｍの水に溶かした。

（５）大陽菌：ＪＭｒ！　（ａｒａ、Δｌａｃ　−ｐｒ
ｏ、　ａｔｒＡ。

ｔｈｉ　、φ！（７ｄ　ｌａｃ　ＺΔＭ／Ｊｒ）　ｔ−
１Ｈａｎａｈａｎの方法に従って０．１Ｍ　ＲｂＣ１，
４’ｊｍＭ　ＭｎＣ１１。

／　ＯｍＭ　Ｃ＆０１Ｂ　、ｊｍＭ　　塩酸へキサコバ
ラミンを含む／　ＯｍＭ　ＭＫＢ：ＫＯＨ（ｐＨｉコ）
の緩衝液で０℃で処理し、更にＤＭ８０　（ｄｉｍｅｔ
ｈｌｌ”ｉｌ”ｒｏｘｔａｅ　）とＤ　Ｔ　Ｔ　（ｄｉ
ｔｈｉｏｔｈｒｅｏｔｏｌ）　　をそれぞれ最終濃度が
７％と３．！チになるように加えコンピテント・セルを
調製シタ。

上記（４）で得たＤＮＡ溶液を加え、水中で３０分靜装
してから、≠λ℃でり０秒間加熱処理を加え、ＳＯＣ培
地（トリプトン２ｏ　ｆ　／　ｌ　ｓ酵母エキストラク
ト！　ｔ　／　Ｚ　ｓピシリン（！ＯμｇＡ／）を含む
Ｌ寒天培地／りσθＱ にまき、３７℃で一晩培養し、約・う自愛五個のアンピ
シリン耐性コロニーヲ得り。

（１）　　上記〔３〕の（５）で得られたコロニーのう
ち約ｌ、≠００個１にトロセルロースフィルターに移し
、常法に従い、これと”Ｐ　−ｃＤＮＡプローブを！Ｏ
％ホルムアミド、！ｘＰＪＥＣ。

！×デンハルト液、　！ＯｒｎＭ　　リ／酸ナトリウＡ
　（ｐＨ１ｊ）、０．／％ＢＤＢ、２ｊＯａｇ／−の超
音波処理した仔牛胸腺ＤＮＡ中で≠λ℃で７５〜１７時
間ハイブリダイズさせ、強い陽性のシグナルを与えた約
１００個のコロニーをスクリーニンクシタ。

”Ｐ−ｃＤＮＡ　　プローブは、前記〔ｌ〕で調製した
ｐｏｌｙＡ＋ＲＮ　Ａを鋳型とし、オリゴｄＴ、（Ｉ　
−３１ｐ−ａ　ＣＴ　Ｐ、逆転写酵素を用いてｓｔ、　
ＪｏｈｎとＤａｖｉｓ　　の方法に従って調製したもの
を使用した。

（２）　　上記（１）でスクリーニングしたコロニーに
ついてＨ１３１ｆｍａｎらの方法に準じて固相免疫学的
同定を行なった。

即ち、アンビシリ／を含むＬ寒天培地上に、ニトロセル
ロースフィルターヲ置キ、その上で大腸菌コロニーを生
育させた。菌の生育後、フィルターをクロロホルム蒸気
にさらし、更に！ＯｒｎＭ　ＴｒｉＢ：　ＨＯＩ（ｐＨ
７，’ｊ）。

１１０ｍＭ　Ｎａ（！１．１ｍＭ　Ｍｇ０１ｇ　、　　
ＪｌＢ８Ａ。

／　ｔｉｇ／ｌｎｌ　Ｊｌ’Ｎａ　ｓ　ｅ　、　　弘Ｏ
ｔｔ　ｇ、ｋｌ　　リゾチームを含む溶液中で一晩撮と
うし溶菌させた。３％Ｂ８Ａ；　　ｊＯｍＭ　Ｔｒｉｓ
：　ＨＣＩ　（ｐＨ７，ｊ）、／ｊＯｒｎＭ　Ｎａ（ｌ
で５０倍に希釈したウサギ抗スポラミンＡ抗血清に／／
１００　　容の大腸菌ＪＭｒＪの溶菌液を加え、弘℃で
コ時間反応させ遠心分離で残渣を除いた。

上清にフィルターを浸し、室温で１時間インキュベート
して、フィルター上に固定された抗原タンパク質と反応
させた。フィルターをよく洗浄した後に　１２１ニープ
ロテインＡ　（ＪＱｍＯｌ、乃ツ：アマーシャム社）を
含む３％８８　Ａ　、　！ＯｒｎＭ　Ｔｒｉｓｌ：ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ７，１）、　１１０ｍＭ　ＮａＣ！１溶液中
でインキユペートシた。フィルターを良く洗浄した後に
Ｘ−線フイルムに対してオートラジオグラフィーを行な
ったところ、λつの非常に強い陽性のシグナルを与えた
コロニーをスクリーニングした。

（３）　　これらのコロニーよシ夫々プラズミドＤＮ　
Ａ　ｆ　Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法に従って調製した。

得られたプラスミドをｐ工ｒｎｏ２ＪおよびｐＩｍｏｊ
Ｊ４とした。このｐ工ｍｏＪｊ　　およびｐ工ｍｏＪＪ
４　ＤＮＡを夫々ＫｃｏＲ工で切断し、直鎖状にした。

これを０．１　ＮＮａＯＨ溶液中で一本鎖に変性させ、
Ｏ，ｊＮＨＣｌ、／ＭＮａＯ１を加え中和した後、ｔμ
ｇ　　ＤＮＡ分を３簡×３簡のニトロセルロースフィル
ターニ付着させた。これらのフィルターを夫々≦！チホ
ルムアミド、０．４ＬＭ　ＮａＣ！１．　０．２％８Ｄ
８゜２０ｒｎＭＰ工ＰＫ８緩衝液（ｐＨ１，ｌＩ）、　
１００μｇ／ＩＩＬｌ酵母ｔＦＩＮＡおよび／　Ａ　Ｏ
ｆｉｇ、／ｌｘＪの塊根ｐｏｌｙＡ”ＲＮＡを含む溶液
に加え、７０℃で７０分間加熱した後に５０℃で３時間
ハイプリフイズさせた。非特異的に吸着したＲＮＡを充
分洗い落した後に、ＤＮＡ−フィルターに特異的に吸着
したｐｏｌｙＡ”　ＲＮ　Ａ　１に／　００ｐｇ／ｌｅ
ｌの酵母ｔＲＮＡを含む２　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液中で１
００℃で７分間加熱することにより溶出し、エタノール
沈殿によって回収した。このＲＮＡを用い小麦胚芽無細
胞タンパク質合成系で翻訳させ、得られたタンパク質を
８ＤＢ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけたところ、
ｐ工ｍｏ２３　Ｄ　Ｎ　Ａと結合したｐｏ’ｌｙＡ　　
ＲＮＡ　　からのタンパク質の泳動位置はスポラミンＡ
の位置に相当し、また、ｐ工ｍｏＪｊ４ＤＮＡと結合し
たｐｏｌｙＡ”　ＲＮＡからのタンパク質の泳動位置は
スポラミンＢの位置く相当した。

このことから、上記（２）で得たコロニー（形質転換体
）は、スポラミンまたはその前駆体をコードするｃＤＮ
Ａが組み込まれたものであることが確認された。

されたｃＤＩＪＡ　　の大きさを常法により求めたとこ
ろ、夫々、約１０ｊＯｂｐであった。

図コに、ｐＩｍｏ２Ｊの制限酵素地図を示した。

また、　　Ｅｌａｎｇｅｒらのジデオキシ法によシ求め
たｐ工ｍｏコ３のｃＤＮＡ　　の全塩基配列を図３に示
した。図中アミノ酸で記載した部分はスポラミン前駆体
を赤し、２／り個のア（８ｅｒ）　　以降がスポラミン
Ａを示す。

【図面の簡単な説明】 図１は、本発明において、スポラミンまたはその前駆体
のｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローニングする方法の概略
説明図である。 図２は、実施例で得られたｐＩｍｏ２Ｊの部分制限酵素
地図を示している。図中、一本鎖部分はベクターｐＵＯ
Ｊ’由来の塩基配列部分を示し、φはｐＵｃＩ上の大腸
菌１ａＣ遺伝子プロモーターの位置と転写の方向を示し
ている。（ｐＵＯｆ上の制限酵素サイトの多くは省略し
た。）ｔた、二本鎖部分は組み込まれたｃＤＮＡセグメ
ントを示し、その下の太線はスポラミ７ム前駆体のコー
ド領域を示す。そして、（イ）はシグナルペプチド部分
を示し、（ロ）はスボラミ７ム細分を示す。 図３は、実施例で得られたｐ工Ｉｎｏ２３のｃＩ）ＨＡ
の全塩基配列を示す。図中、アミノ酸配列を記載し九部
分がスボラミ７人前駆体の部分を示し。 Ｈ）はシグナルペプチド部分を示し、仲）はスポラミン
ム部分を示す。 ばか１為 手続ネ１■正２す（方式） 昭和６０年　７月３日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）スポラミンまたはその前駆体をコードするＤＮＡ
   セグメント。
2. （２）スポラミンまたはその前駆体をコードするＤＮＡ
   セグメントを含有するＤＮＡプラスミドにより形質転換
   された宿主。