JP2546820B2 - ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 - Google Patents
ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、組換えDNA技術によるヒトアポリポプロテ
インＥ（ApolipoproteinE）様蛋白の微生物学的産生方
法に関する。
インＥ（ApolipoproteinE）様蛋白の微生物学的産生方
法に関する。
（従来の技術） 血漿中に存在する主要な脂質としては、コレステロー
ル、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げら
れるが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。
水に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体は
リポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重
さのものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構
造をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレ
ステロールエステルが存在し、極性のあるリン脂質、遊
離コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考え
られている。
ル、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げら
れるが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。
水に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体は
リポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重
さのものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構
造をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレ
ステロールエステルが存在し、極性のあるリン脂質、遊
離コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考え
られている。
このリポ蛋白中に含まれる蛋白は、アポリポプロテイ
ンと呼ばれ、現在10種類以上が知られている。アポリポ
プロテインは、リポ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リポ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロテインのひとつとして、アポリポ
プロテインＥが知られている。そしてこのアポリポプロ
テインＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリポ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
ンと呼ばれ、現在10種類以上が知られている。アポリポ
プロテインは、リポ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リポ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。このアポリポプロテインのひとつとして、アポリポ
プロテインＥが知られている。そしてこのアポリポプロ
テインＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリポ蛋白
をとり込む場合に、認識標となることが知られている。
さらに、このアポリポプロテインＥの主要なサブクラ
スとしてE2、E3、E4が見出されており、E3が正常人由来
であるのに対し、E2及びE4はIII型高脂血症の患者から
見出され、非正常型であると考えられている（The Jour
nal of Biological Chemistry,Vol.255,No.5,1759−176
2,1980）。
スとしてE2、E3、E4が見出されており、E3が正常人由来
であるのに対し、E2及びE4はIII型高脂血症の患者から
見出され、非正常型であると考えられている（The Jour
nal of Biological Chemistry,Vol.255,No.5,1759−176
2,1980）。
このアポリポプロテインE3を欠損するか、又はE2もし
くはE4を有する人は、高脂血症になり、さらに動脈硬化
に至る場合が多い。
くはE4を有する人は、高脂血症になり、さらに動脈硬化
に至る場合が多い。
このような場合、患者に正常なE3を投与することによ
り、正常なアポリポプロテインＥの機能を回復させるこ
とができる。
り、正常なアポリポプロテインＥの機能を回復させるこ
とができる。
このアポリポプロテインＥを遺伝子工学的手法により
得るために、アポリポプロテインＥをコードするDNAが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロテインＥ
を得るために必要な完全長のcDNA断片は、いまだに得ら
れていなかつた。
得るために、アポリポプロテインＥをコードするDNAが
必要となる。しかしながら完全なアポリポプロテインＥ
を得るために必要な完全長のcDNA断片は、いまだに得ら
れていなかつた。
本発明者らは、先に、上記完全長cDNA断片を得（特願
昭58−224980参照）、今般、これを用いてアポリポプロ
テインＥを産生する本発明方法に到達した。
昭58−224980参照）、今般、これを用いてアポリポプロ
テインＥを産生する本発明方法に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、第２図の塩基配列で表わ
されるヒトアポリポプロテインE3をコードするDNAを含
有するDNA断片を、発現用ベクターのプロモータの下流
に存在するクローニング部位に導入し、ついで上記DNA
断片を導入したベクターを宿主微生物に導入して同宿主
を培養し、産生する蛋白を取得することを特徴とするヒ
トアポリポプロテインＥ様蛋白の産生方法に存する。
されるヒトアポリポプロテインE3をコードするDNAを含
有するDNA断片を、発現用ベクターのプロモータの下流
に存在するクローニング部位に導入し、ついで上記DNA
断片を導入したベクターを宿主微生物に導入して同宿主
を培養し、産生する蛋白を取得することを特徴とするヒ
トアポリポプロテインＥ様蛋白の産生方法に存する。
（発明の構成） 以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明において用いるDNA断片のヒトアポリポ
プロテインE3をコードするDNAを含有するDNA断片は、次
のような方法によつて調製される。すなわち、ヒト肝臓
切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロフアージ又は腎臓
切片等をグアジニルチオシアネートとともにホモジナイ
ズし、CsCl平衡密度勾配超遠心によつて全RNAを分離す
る（Chirgwinら、Biochemistry,18,5294−5299,197
9）。
プロテインE3をコードするDNAを含有するDNA断片は、次
のような方法によつて調製される。すなわち、ヒト肝臓
切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロフアージ又は腎臓
切片等をグアジニルチオシアネートとともにホモジナイ
ズし、CsCl平衡密度勾配超遠心によつて全RNAを分離す
る（Chirgwinら、Biochemistry,18,5294−5299,197
9）。
ついで、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカ
ラムクロマトグラフイーで精製し、ポリ（Ａ）含有RNA
を単離する（mRNA原料）。
ラムクロマトグラフイーで精製し、ポリ（Ａ）含有RNA
を単離する（mRNA原料）。
このmRNA原料より、岡山とバーグ（Berg）の方法（Mo
lecular and Cellular Biology,2,161−170,1982）によ
つて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pBR322とSV
40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライ
マーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。このベクタ
ープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用させ
てcDNAを合成し、その後制限酵素Hind IIIで消化し、つ
いで上記リンカーを用いて環化させる。その後、mRNA部
分をDNAで置換して、cDNA断片含有プラスミドを得る。
lecular and Cellular Biology,2,161−170,1982）によ
つて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pBR322とSV
40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライ
マーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。このベクタ
ープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用させ
てcDNAを合成し、その後制限酵素Hind IIIで消化し、つ
いで上記リンカーを用いて環化させる。その後、mRNA部
分をDNAで置換して、cDNA断片含有プラスミドを得る。
ついで、常法により、これを用いて大腸菌（Escheric
hia coli）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その
後、プローブとして、アポリポプロテインＥのアミノ酸
配列218−222位 Met−Glu−Glu−Met−Gly に対応する塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリ
ゴヌクレオチド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、これと相補性のある配列を含
むクローンを選択する。こうして得られるクローン中よ
り、適切な制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入さ
れているプラスミドを有するクローンを選択する。
hia coli）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その
後、プローブとして、アポリポプロテインＥのアミノ酸
配列218−222位 Met−Glu−Glu−Met−Gly に対応する塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリ
ゴヌクレオチド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、これと相補性のある配列を含
むクローンを選択する。こうして得られるクローン中よ
り、適切な制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入さ
れているプラスミドを有するクローンを選択する。
そのクローンより得られるcDNA断片は、MaxamとGilbe
rtの方法（Methods in Enzymology,65,499−560,1980）
によつて塩基配列が決定される。
rtの方法（Methods in Enzymology,65,499−560,1980）
によつて塩基配列が決定される。
本発明方法において発現用ベクターのクローニング部
位に導入されるDNA断片は、アポリポプロテインE3をコ
ードするDNAを含有するDNA断片である。アポリポプロテ
インE3をコードするDNAを含有するDNA断片の塩基配列及
びそれから推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。
位に導入されるDNA断片は、アポリポプロテインE3をコ
ードするDNAを含有するDNA断片である。アポリポプロテ
インE3をコードするDNAを含有するDNA断片の塩基配列及
びそれから推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。
本発明方法において、上記DNA断片は、発現ベクター
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによつて、これを鋳型とする転写及び翻訳によ
りアポリポプロテインＥ又はアポリポプロテインＥ様物
質、あるいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
のプロモータの下流に存在するクローニング部位に導入
することによつて、これを鋳型とする転写及び翻訳によ
りアポリポプロテインＥ又はアポリポプロテインＥ様物
質、あるいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。
クローニング部位としては、目的とする異種遺伝子の
直接発現を可能とする制限酵素認識部位が挙げられる。
具体的には、翻訳開始コドンの直前にあるBamH I部位が
好ましく、プロモータ下流にBamH I部位が存在しないと
きには、合成リンカーにより同部位を形成する。プロモ
ータとしては、lac Iにより調節可能なものが好まし
く、このようなプロモータとしては、大腸菌の外膜蛋白
の１つであるリポプロテインをコードする遺伝子（lp
p）のプロモータあるいはtrpプロモータとlacプロモー
タとの融合型プロモータであるtacプロモータ（Proceed
ing of National Academy Science 80 21（1983）及び
特開昭57−193497号公報参照））が好ましい。
直接発現を可能とする制限酵素認識部位が挙げられる。
具体的には、翻訳開始コドンの直前にあるBamH I部位が
好ましく、プロモータ下流にBamH I部位が存在しないと
きには、合成リンカーにより同部位を形成する。プロモ
ータとしては、lac Iにより調節可能なものが好まし
く、このようなプロモータとしては、大腸菌の外膜蛋白
の１つであるリポプロテインをコードする遺伝子（lp
p）のプロモータあるいはtrpプロモータとlacプロモー
タとの融合型プロモータであるtacプロモータ（Proceed
ing of National Academy Science 80 21（1983）及び
特開昭57−193497号公報参照））が好ましい。
宿主微生物としては、通常大腸菌例えばHB101、JM105
等を用いることができ、培養、蛋白の取得は常法により
行うことができる。
等を用いることができ、培養、蛋白の取得は常法により
行うことができる。
（発明の効果） 本発明方法によれば、ヒトアポリポプロテインＥ様蛋
白を効率よく表現させることができ、得られる蛋白（ア
ポリポプロテインE2、E3又はE4など）を抗原として、常
法により抗血清を得、これを用いてアポリポプロテイン
正常型E3の欠損又は非正常型（E2、E4）の存在を検出で
きる。
白を効率よく表現させることができ、得られる蛋白（ア
ポリポプロテインE2、E3又はE4など）を抗原として、常
法により抗血清を得、これを用いてアポリポプロテイン
正常型E3の欠損又は非正常型（E2、E4）の存在を検出で
きる。
さらに、得られるアポリポプロテインE3を、抗高脂血
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
（実施例） 以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例
により限定されない。
が、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例
により限定されない。
実施例１ A.原料DNA断片の調製 （１） ヒト肝臓切片を液体窒素存在下で破砕した後グ
アニジンイソチオシアネート水溶液を添加しホモジナイ
ズした。得られたホモジネートを、Chirgwinらの方法
（Biochemistry,18,5294−5299,1979）に従つて、塩化
セシウム平衡密度勾配超遠心によつて全RNAを分離し
た。ついで、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロース
カラムクロマトグラフイーで精製し、ポリ（Ａ）含有RN
Aを単離し、mRNA原料とした。
アニジンイソチオシアネート水溶液を添加しホモジナイ
ズした。得られたホモジネートを、Chirgwinらの方法
（Biochemistry,18,5294−5299,1979）に従つて、塩化
セシウム平衡密度勾配超遠心によつて全RNAを分離し
た。ついで、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロース
カラムクロマトグラフイーで精製し、ポリ（Ａ）含有RN
Aを単離し、mRNA原料とした。
（２） 一方、岡山とBergの方法（Molecular and Cell
ular Biology 2,161−170,1982）により、pBR322とSV40
のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライマ
ーとオリゴ（dG）テールリンカーを得た。すなわち、pB
R322とSV40（マツプユニツト0.71−0.86）のハイブリツ
ドプラスミド400μｇを、ウシ血清アルブミンを含む緩
衝液中制限酵素Kpn Iで37℃、４時間消化した。
ular Biology 2,161−170,1982）により、pBR322とSV40
のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライマ
ーとオリゴ（dG）テールリンカーを得た。すなわち、pB
R322とSV40（マツプユニツト0.71−0.86）のハイブリツ
ドプラスミド400μｇを、ウシ血清アルブミンを含む緩
衝液中制限酵素Kpn Iで37℃、４時間消化した。
ついで、常法によりエタノール沈澱によつてDNAを回
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加して、
37℃で30分間反応させて、制限酵素Kpn Iの消化末端に
約60個のdTテールを付加させた後、エタノール沈澱によ
りDNAを回収した。ついで、このDNAをウシ血清アルブミ
ンを含む緩衝液中で、制限酵素Hpa Iにより消化した（3
7℃、５時間）。大きい方のDNA断片を、アガロースゲル
電気泳動により精製し、ガラスパウダー法（Vogelstein
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,615−619,1979）に
よつて回収した。その後、このDNAを０℃でオリゴ（d
A）セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エタ
ノールで回収し、オリゴ（dT）テールを有するベクター
プライマーを得た。
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加して、
37℃で30分間反応させて、制限酵素Kpn Iの消化末端に
約60個のdTテールを付加させた後、エタノール沈澱によ
りDNAを回収した。ついで、このDNAをウシ血清アルブミ
ンを含む緩衝液中で、制限酵素Hpa Iにより消化した（3
7℃、５時間）。大きい方のDNA断片を、アガロースゲル
電気泳動により精製し、ガラスパウダー法（Vogelstein
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,615−619,1979）に
よつて回収した。その後、このDNAを０℃でオリゴ（d
A）セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エタ
ノールで回収し、オリゴ（dT）テールを有するベクター
プライマーを得た。
他方、pBR322とSV40（マツプユニツト0.19〜0.32）と
のハイブリツドプラスミド100μｇをウシ血清アルブミ
ンを含む緩衝液中で、制限酵素Pst Iにより消化した（3
7℃、１時間半）。ついで、DNAを回収し、dGTPを含む緩
衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼを添加して、37℃で20分間反応させ、約
10〜15のdGテールを付加させた。回収したDNAを、ウシ
血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵素Hind IIIによ
り消化させ（37℃、１時間）、ついでアガロースゲル
（1.8％）電気泳動に付し、小さいオリゴ（dG）テール
リンカーDNAを抽出、回収した。
のハイブリツドプラスミド100μｇをウシ血清アルブミ
ンを含む緩衝液中で、制限酵素Pst Iにより消化した（3
7℃、１時間半）。ついで、DNAを回収し、dGTPを含む緩
衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼを添加して、37℃で20分間反応させ、約
10〜15のdGテールを付加させた。回収したDNAを、ウシ
血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵素Hind IIIによ
り消化させ（37℃、１時間）、ついでアガロースゲル
（1.8％）電気泳動に付し、小さいオリゴ（dG）テール
リンカーDNAを抽出、回収した。
（３） 岡山とバーグ（Berg）の方法（Molecular and
Cellular Biology2,161−170,1982）により、cDNAライ
ブラリーを得た。
Cellular Biology2,161−170,1982）により、cDNAライ
ブラリーを得た。
すなわち、Tris−HCl（pH8.3）、MgCl2、KCl、ジチオ
スレイトール、dATP、dTTP、dGTP及び〔32P〕dCTPを含
む水溶液に上記（１）で得られたmRNA30μｇと上記
（２）で得られたベクタープライマー10μｇを添加し
て、逆転者酵素の存在下に37℃、20分間、反応させ、プ
ラスミドーcDNA:mRNAを合成し、これをエタノール沈澱
しペレツト状で回収した。このペレツトをCoCl2、ジチ
オスレイトール、ポリ（Ａ）、〔32P〕dCTP及びターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有
する緩衝液に溶解し、37℃、10分間反応させ、末端あた
りdCMPの10〜15の残基を付加させた。ついで、回収した
オリゴ（dC）テールプラスミドーcDNA:mRNAを含有する
ペレツトをウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、
制限酵素Hind IIIで37℃、１時間消化し、エタノール沈
澱により、Hind III消化オリゴ（dC）テールcDNA:mRNA
プラスミドを回収した。これを前記（２）で得られたオ
リゴ（dG）テールリンカーDNAを含む緩衝液に溶解し、6
5℃、２分間インキユベートし、さらに42℃、30分間保
持し、０℃に冷却した。ついで、β−NAD（ニコチンア
デニンジヌクレチド）存在下、大腸菌（E. coli）DNAリ
ガーゼを加えて、一夜インキユベートした。その後、dA
TP、dTTP、dGTP、dCTP、β−NAD、Ｅ．coli DNAリガー
ゼ、E.coli DNAポリメラーゼ及びＥ．coli RNase Hを添
加して、この混合物を12℃、１時間、次いで室温で１時
間インキユベートした後、冷却し、反応を停止させ目的
とするcDNA断片含有プラスミドを得た。
スレイトール、dATP、dTTP、dGTP及び〔32P〕dCTPを含
む水溶液に上記（１）で得られたmRNA30μｇと上記
（２）で得られたベクタープライマー10μｇを添加し
て、逆転者酵素の存在下に37℃、20分間、反応させ、プ
ラスミドーcDNA:mRNAを合成し、これをエタノール沈澱
しペレツト状で回収した。このペレツトをCoCl2、ジチ
オスレイトール、ポリ（Ａ）、〔32P〕dCTP及びターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有
する緩衝液に溶解し、37℃、10分間反応させ、末端あた
りdCMPの10〜15の残基を付加させた。ついで、回収した
オリゴ（dC）テールプラスミドーcDNA:mRNAを含有する
ペレツトをウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、
制限酵素Hind IIIで37℃、１時間消化し、エタノール沈
澱により、Hind III消化オリゴ（dC）テールcDNA:mRNA
プラスミドを回収した。これを前記（２）で得られたオ
リゴ（dG）テールリンカーDNAを含む緩衝液に溶解し、6
5℃、２分間インキユベートし、さらに42℃、30分間保
持し、０℃に冷却した。ついで、β−NAD（ニコチンア
デニンジヌクレチド）存在下、大腸菌（E. coli）DNAリ
ガーゼを加えて、一夜インキユベートした。その後、dA
TP、dTTP、dGTP、dCTP、β−NAD、Ｅ．coli DNAリガー
ゼ、E.coli DNAポリメラーゼ及びＥ．coli RNase Hを添
加して、この混合物を12℃、１時間、次いで室温で１時
間インキユベートした後、冷却し、反応を停止させ目的
とするcDNA断片含有プラスミドを得た。
（４） ついで、このプラスミドを用いて常法により、
大腸菌（Ｅ．coli）HB101を形質転換させた。
大腸菌（Ｅ．coli）HB101を形質転換させた。
その後、プローブとして、アポリポプロテインＥのア
ミノ酸配列218−222位 Met−Glu−Glu−Met−Gly に相当する４種類の合成オリゴヌクレオチド を用いて、ハナハン（Hanahan）らの方法（Gene,10,63
−67,1980）によつてスクリーニングを行ない、これと
相補性のある配列を含むクローンを選択した。約100,00
0の形質転換体中、約50個のクローンが選択され、この
うちの14個のクローンについて数種の制限酵素により処
理し、そのうちの３つのクローンが共通の制限酵素認識
部位をもつことが判明した。そのうちで最も大きなクロ
ーンpYAE10を選択し、このクローンの塩基配列をMaxam
とGilbertの方法により決定した。
ミノ酸配列218−222位 Met−Glu−Glu−Met−Gly に相当する４種類の合成オリゴヌクレオチド を用いて、ハナハン（Hanahan）らの方法（Gene,10,63
−67,1980）によつてスクリーニングを行ない、これと
相補性のある配列を含むクローンを選択した。約100,00
0の形質転換体中、約50個のクローンが選択され、この
うちの14個のクローンについて数種の制限酵素により処
理し、そのうちの３つのクローンが共通の制限酵素認識
部位をもつことが判明した。そのうちで最も大きなクロ
ーンpYAE10を選択し、このクローンの塩基配列をMaxam
とGilbertの方法により決定した。
第１図は上記クローンの塩基配列決定のために作成し
た制限酵素切断地図を示す（ATG:翻訳開始コドン、TGA:
翻訳停止コドン）。また、第２図（その１〜その４）に
上記DNA断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ
酸配列を示す（アミノ酸残基数:317）。
た制限酵素切断地図を示す（ATG:翻訳開始コドン、TGA:
翻訳停止コドン）。また、第２図（その１〜その４）に
上記DNA断片の塩基配列及びそれより想定されるアミノ
酸配列を示す（アミノ酸残基数:317）。
このDNA断片は、正常人由来のアポリポプロテインE3
に相当する。
に相当する。
B.ヒトアポリポプロテインＥ様蛋白の産生 ａ） 発現プラスミドの構築 （ｉ） プラスミドphAPEの構築 上記Ａで得られたプラスミドpYAE10を制限酵素Hind I
II及びAcc Iで消化し（37℃、２時間）、1.7kbの断片を
得る。ついでBal31で処理し（37℃、15分）、ついでBam
H IリンカーをT4DNAポリメラーゼ存在下で連結させた後
（15℃、14時間）、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、
プラスミドpBR322をBamH I消化（37℃、２時間）及びB.
A.P処理（37℃、１時間）して得られる断片とT4DNAリガ
ーゼを用いて連結する（14℃、16時間）。ついで、大腸
菌HB101を形質転換し、形質転換株よりプラスミドphAPE
を得た（第３図）。
II及びAcc Iで消化し（37℃、２時間）、1.7kbの断片を
得る。ついでBal31で処理し（37℃、15分）、ついでBam
H IリンカーをT4DNAポリメラーゼ存在下で連結させた後
（15℃、14時間）、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、
プラスミドpBR322をBamH I消化（37℃、２時間）及びB.
A.P処理（37℃、１時間）して得られる断片とT4DNAリガ
ーゼを用いて連結する（14℃、16時間）。ついで、大腸
菌HB101を形質転換し、形質転換株よりプラスミドphAPE
を得た（第３図）。
（ii） プラスミドphAPE−１の構築（第４図） 上記プラスミドphAPEを、制限酵素Fok Iで消化し（37
℃、２時間）、512bp断片を得、合成DNAリンカー をT4DNAリガーゼの存在下に連結し（８℃、16時間）、
制限酵素BamH I、Sac IIで消化し（37℃、２時間）、37
7bp断片を得る。
℃、２時間）、512bp断片を得、合成DNAリンカー をT4DNAリガーゼの存在下に連結し（８℃、16時間）、
制限酵素BamH I、Sac IIで消化し（37℃、２時間）、37
7bp断片を得る。
一方、上記プラスミドphAPEを制限酵素Sac II、BamH
Iで消化し（37℃、２時間）、680bp断片を得る。つい
で、この２つの断片をT4DNAリガーゼで連結し（14℃、
８時間）、さらにBamH Iで消化して約1050bp断片を得
た。他方、プラスミドpBR322をBamH Iで消化し（37℃、
２時間）、B.A.P.で処理し、ついで上記約1050bp断片を
導入してプラスミドphAPE−１を得た。
Iで消化し（37℃、２時間）、680bp断片を得る。つい
で、この２つの断片をT4DNAリガーゼで連結し（14℃、
８時間）、さらにBamH Iで消化して約1050bp断片を得
た。他方、プラスミドpBR322をBamH Iで消化し（37℃、
２時間）、B.A.P.で処理し、ついで上記約1050bp断片を
導入してプラスミドphAPE−１を得た。
（iii） プラスミドpIN−tacの構築（第５図） プラスミドpIN−III−Ｃ（Experimental Manipulatio
n of Gene Expression,Edited by M.Inouye,1983,Acade
mic Press,p15参照、下記プラスミドpIN II Blも同様）
を制限酵素Aat II、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、
約7000bpの断片を得る。一方、プラスミドpDR540（P.−
L Biochemicalsより入手可能）を制限酵素Aat II、BamH
Iで消化し（37℃、２時間）約600bp断片を得る。つい
で、この二つの断片をT4DNAリガーゼで連結し（14℃、1
4時間）、プラスミドpIN−tacを得た。
n of Gene Expression,Edited by M.Inouye,1983,Acade
mic Press,p15参照、下記プラスミドpIN II Blも同様）
を制限酵素Aat II、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、
約7000bpの断片を得る。一方、プラスミドpDR540（P.−
L Biochemicalsより入手可能）を制限酵素Aat II、BamH
Iで消化し（37℃、２時間）約600bp断片を得る。つい
で、この二つの断片をT4DNAリガーゼで連結し（14℃、1
4時間）、プラスミドpIN−tacを得た。
（iv） プラスミドphAPE−２の構築（第６図） 上記プラスミドphAPE−１を制限酵素BamH Iで消化し
（37℃、２時間）、制限酵素BamH I消化及びB.A.P.処理
を行なつたPIN−tacとT4DNAリガーゼで連結して（14
℃、14時間）プラスミドphAPE−２を得た。なお、第６
図中のlac I遺伝子はラクトースリプレッサーを生産す
る遺伝子である。
（37℃、２時間）、制限酵素BamH I消化及びB.A.P.処理
を行なつたPIN−tacとT4DNAリガーゼで連結して（14
℃、14時間）プラスミドphAPE−２を得た。なお、第６
図中のlac I遺伝子はラクトースリプレッサーを生産す
る遺伝子である。
（ｖ） プラスミドphAPE−３の構築（第７図） 上記プラスミドphAPE−１をBamH Iで消化（37℃、２
時間）して得られる1110bp断片をSlヌクレアーゼ処理し
（37℃、30分）て得られる断片とプラスミドpIN−tacを
BamH I、Slヌクレアーゼ、B.A.P.処理して得られる断片
とをT4DNAリガーゼで連結してphAPE−３を得る。
時間）して得られる1110bp断片をSlヌクレアーゼ処理し
（37℃、30分）て得られる断片とプラスミドpIN−tacを
BamH I、Slヌクレアーゼ、B.A.P.処理して得られる断片
とをT4DNAリガーゼで連結してphAPE−３を得る。
（vi） プラスミドphAPE−４の構築（第８図（その
１、その２）） プラスミドpUC8（Gene 19 259（1982）参照）を制限
酵素EcoR I、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、さらに
B.A.P.処理後、ついで、第８図に示す合成リンカーと、
T4DNAリガーゼの存在下で連結させ（37℃、14時間）pUC
8−Xbaを得る。ついでこれをBamH Iで消化し（37℃、２
時間）、B.A.P.処理して得られる断片と、BamH Iでプラ
スミドphAPE−１を消化して得られる1100bp断片とをT4D
NAリガーゼを用いて連結し、pUC−phAPE−１を得る。
１、その２）） プラスミドpUC8（Gene 19 259（1982）参照）を制限
酵素EcoR I、BamH Iで消化し（37℃、２時間）、さらに
B.A.P.処理後、ついで、第８図に示す合成リンカーと、
T4DNAリガーゼの存在下で連結させ（37℃、14時間）pUC
8−Xbaを得る。ついでこれをBamH Iで消化し（37℃、２
時間）、B.A.P.処理して得られる断片と、BamH Iでプラ
スミドphAPE−１を消化して得られる1100bp断片とをT4D
NAリガーゼを用いて連結し、pUC−phAPE−１を得る。
さらにこれを制限酵素Xba I、Hind IIIで消化し（37
℃、２時間）、約1100bpのフラグメントを得、これを、
プラスミドpIN II BlのXba I、Hind III部位間に挿入し
てphAPE−４を得た。
℃、２時間）、約1100bpのフラグメントを得、これを、
プラスミドpIN II BlのXba I、Hind III部位間に挿入し
てphAPE−４を得た。
ｂ） 蛋白の産生 本発明に係るDNA断片を含有する上記プラスミドphAPE
−２、phAPE−３及びphAPE−４を用いて大腸菌JM105を
形質転換し、得られる形質転換株をM9−CA培地で培養す
ることにより、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒト
アポリポプロテインＥ様蛋白の産生が確認された。
−２、phAPE−３及びphAPE−４を用いて大腸菌JM105を
形質転換し、得られる形質転換株をM9−CA培地で培養す
ることにより、蛋白を産生させた。電気泳動によりヒト
アポリポプロテインＥ様蛋白の産生が確認された。
第１図は本発明に係るDNA断片が挿入されているプラス
ミドを有するクローンの制限酵素切断地図を示し、第２
図（その１〜その４）は、本発明に係るDNA断片の塩基
配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を示す。 第３〜第７図および第８図（その１、その２）は、それ
ぞれプラスミドphAPE、phAPE−１、pIN−tac、phAPE−
２、phAPE−３、phAPE−４の構築工程の概略図である。
ミドを有するクローンの制限酵素切断地図を示し、第２
図（その１〜その４）は、本発明に係るDNA断片の塩基
配列及びそれより想定されるアミノ酸配列を示す。 第３〜第７図および第８図（その１、その２）は、それ
ぞれプラスミドphAPE、phAPE−１、pIN−tac、phAPE−
２、phAPE−３、phAPE−４の構築工程の概略図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 池田 康子 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 木村 昌子 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，257, 4171−4178（1982) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，161 −170（1982) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，257, 14639−14641（1982) Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈ ｅ ＵＳＡ，80，21−25（1983)
Claims (6)
- 【請求項１】 の塩基配列で表わされるヒトアポリポプロテインE3をコ
ードするDNAを含有するDNA断片を、発現用ベクターのプ
ロモータの下流に存在するクローニング部位に導入し、
ついで上記DNA断片を導入したベクターを宿主微生物に
導入して同宿主を培養し、産生する蛋白を取得すること
を特徴とするヒトアポリポプロテインＥ様蛋白の産生方
法。 - 【請求項２】プロモータがlac Iにより調節可能なもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】プロモータがリポプロテイン遺伝子のプロ
モータ又はtacプロモータであることを特徴とする特許
請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】クローニング部位が翻訳開始部位の直前に
存在するBamH I部位であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】宿主微生物が大腸菌であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】ヒトアポリポプロテインがヒトアポリポプ
ロテインE3であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
| AU47513/85A AU587989B2 (en) | 1984-10-16 | 1985-09-17 | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| CA000491878A CA1284774C (en) | 1984-10-16 | 1985-09-30 | Dna fragments, expression vectors, hosts and process for production of apolipoprotein e |
| DK467385A DK467385A (da) | 1984-10-16 | 1985-10-11 | Dna-fragmenter |
| DE8585402014T DE3585953D1 (de) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna-fragmente, expressionsvektoren, proteine, wirte und verfahren zur herstellung der proteine. |
| EP85402014A EP0205715B1 (en) | 1984-10-16 | 1985-10-16 | Dna fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| US07/288,470 US5116739A (en) | 1984-10-16 | 1988-12-22 | Process for the production of human apolipoprotein e, and transformed hosts and products thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59216987A JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6196997A JPS6196997A (ja) | 1986-05-15 |
| JP2546820B2 true JP2546820B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=16697038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59216987A Expired - Lifetime JP2546820B2 (ja) | 1984-10-16 | 1984-10-16 | ヒトアポリポプロテインｅ様蛋白の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2546820B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3191578B1 (en) * | 2014-09-12 | 2020-11-04 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Cells expressing apolipoprotein e and uses thereof |
-
1984
- 1984-10-16 JP JP59216987A patent/JP2546820B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７，１４６３９−１４６４１（１９８２） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７，４１７１−４１７８（１９８２） |
| ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２，１６１−１７０（１９８２） |
| ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，８０，２１−２５（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6196997A (ja) | 1986-05-15 |
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