JPH0653071B2 - 発現ベクター及び形質転換細胞 - Google Patents
発現ベクター及び形質転換細胞Info
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- JPH0653071B2 JPH0653071B2 JP60126989A JP12698985A JPH0653071B2 JP H0653071 B2 JPH0653071 B2 JP H0653071B2 JP 60126989 A JP60126989 A JP 60126989A JP 12698985 A JP12698985 A JP 12698985A JP H0653071 B2 JPH0653071 B2 JP H0653071B2
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- dna
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- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description
【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、組換えＤＮＡ技術による動物細胞中でのアポ
リポプロテインの産生方法使用される発現ベクター及び
これで形質転換された動物細胞に関する。
リポプロテインの産生方法使用される発現ベクター及び
これで形質転換された動物細胞に関する。
〈従来の技術〉 血漿中に存在する主要な脂質としては、コレステロー
ル、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げら
れるが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。
水に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体は
リポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重
さのものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構
造をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレ
ステロールエステルが存在し、極性のあるリン脂質、遊
離コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考え
られている。
ル、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げら
れるが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する。
水に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体は
リポ蛋白と呼ばれ、脂質と蛋白の割合により、種々の重
さのものを形成する。このリポ蛋白は、球形粒子状の構
造をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、コレ
ステロールエステルが存在し、極性のあるリン脂質、遊
離コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると考え
られている。
このリポ蛋白中に含まれる蛋白は、アポリポプロテイン
と呼ばれ、現在１０種類以上が知られている。アポリポ
プロテインは、リポ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リポ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。
と呼ばれ、現在１０種類以上が知られている。アポリポ
プロテインは、リポ蛋白を構成するのに必要であるばか
りでなく、リポ蛋白の代謝においても重要な役割を果た
す。
このアポリポプロテインのひとつとして、アポリポプロ
テインＥが知られている。そしてこのアポリポプロテイ
ンＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリポ蛋白をと
り込む場合に、認識標となることが知られている。
テインＥが知られている。そしてこのアポリポプロテイ
ンＥは体内の諸細胞がレセプターを介してリポ蛋白をと
り込む場合に、認識標となることが知られている。
さらに、このアポリポプロテインＥの主要なサブクラス
としてＥ２、Ｅ３、Ｅ４が見出されており、Ｅ３が正常
人由来であるのに対し、Ｅ２及びＥ４はIII型高脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
（The Journal of Biological Chemistry,Vol.255,No.
5,1759-1762,1980）。
としてＥ２、Ｅ３、Ｅ４が見出されており、Ｅ３が正常
人由来であるのに対し、Ｅ２及びＥ４はIII型高脂血症
の患者から見出され、非正常型であると考えられている
（The Journal of Biological Chemistry,Vol.255,No.
5,1759-1762,1980）。
このアポリポプロテインＥ３を欠損するか、又はＥ２も
しくはＥ４を有する人は、高脂血症になり、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
しくはＥ４を有する人は、高脂血症になり、さらに動脈
硬化に至る場合が多い。
このような場合、患者に正常なＥ３を投与することによ
り、正常なアポリポプロテインＥの機能を回復させるこ
とができる。
り、正常なアポリポプロテインＥの機能を回復させるこ
とができる。
さらに、このアポリポプロテインのひとつとして、アポ
リポプロテインＡ−Ｉが知られている。そしてこのアポ
リポプロテインＡ−Ｉは、レシチンのβ位の脂肪酸を遊
離コレステロールに運んでこれをコレステロールエステ
ルに変える酵素であるＬＣＡＴ（レシチン・コレステロ
ール・アシル・トランスフエラーゼ）を活性化する働き
があることが知られている。
リポプロテインＡ−Ｉが知られている。そしてこのアポ
リポプロテインＡ−Ｉは、レシチンのβ位の脂肪酸を遊
離コレステロールに運んでこれをコレステロールエステ
ルに変える酵素であるＬＣＡＴ（レシチン・コレステロ
ール・アシル・トランスフエラーゼ）を活性化する働き
があることが知られている。
このアポリポプロテインＡ−Ｉに異常がある場合、種々
のリポ蛋白代謝異常をきたし、たとえば、高脂血症にな
り、さらに動脈硬化に至る場合が多い。
のリポ蛋白代謝異常をきたし、たとえば、高脂血症にな
り、さらに動脈硬化に至る場合が多い。
このような場合、患者に正常なＡ−Ｉを投与することに
より、正常なアポリポプロテインＡ−Ｉの機能を回復さ
せることができる。
より、正常なアポリポプロテインＡ−Ｉの機能を回復さ
せることができる。
〈発明の目的〉 本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術により動物細胞中で
アポリポプロテインを効率よく産生する方法を提供する
ことにある。
アポリポプロテインを効率よく産生する方法を提供する
ことにある。
〈発明の構成〉 本発明の要旨は、真核プロモータ、アポリポプロテイン
又はアポリポプロテイン様物質をコードする遺伝子；ポ
リアデニル化部位並びに５′スプライス部位、イントロ
ン及び３′スプライス部位からなるスプライス配列ＤＮ
Ａを含有する発現ベクター及び同ベクターで形質転換し
たＣＨＯ細胞にある。
又はアポリポプロテイン様物質をコードする遺伝子；ポ
リアデニル化部位並びに５′スプライス部位、イントロ
ン及び３′スプライス部位からなるスプライス配列ＤＮ
Ａを含有する発現ベクター及び同ベクターで形質転換し
たＣＨＯ細胞にある。
本発明を詳細に説明すると、本発明の発現ベクターは、
真核プロモータ；アポリポプロテイン又はアポリポプロ
テイン様物質をコードする遺伝子；ポリアデニル化部位
並びに５′スプライス部位、イントロン及び３′スプラ
イス部位からなるスプライス配列ＤＮＡを含有する。
真核プロモータ；アポリポプロテイン又はアポリポプロ
テイン様物質をコードする遺伝子；ポリアデニル化部位
並びに５′スプライス部位、イントロン及び３′スプラ
イス部位からなるスプライス配列ＤＮＡを含有する。
アポリポプロテインＥをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片は、以上のようにして分離できる。
ＮＡ断片は、以上のようにして分離できる。
(A)たとえば、本発明において用いるＤＮＡ断片のヒト
アポリポプロテインＥ３をコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡ断片は、次のような方法によつて調製される。す
なわち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロ
フアージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートと
ともにホモジナイズし、CsCl平衡密度勾配超遠心によつ
て全ＲＮＡを分離する（Chirgwinら、Biochemistry,18,
5294-5299,1979）。
アポリポプロテインＥ３をコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡ断片は、次のような方法によつて調製される。す
なわち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中のマクロ
フアージ又は腎臓切片等をグアジニルチオシアネートと
ともにホモジナイズし、CsCl平衡密度勾配超遠心によつ
て全ＲＮＡを分離する（Chirgwinら、Biochemistry,18,
5294-5299,1979）。
ついで、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラ
ムクロマトグラフイーで精製し、ポリ(A)含有ＲＮＡを
単離する（mRNA原料）。
ムクロマトグラフイーで精製し、ポリ(A)含有ＲＮＡを
単離する（mRNA原料）。
このmRNA原料より、岡山とバーグ（Ｂｅｒｇ）の方法
（Molecular and Cellular Biology，２，161−170，19
82）によつて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pB
R322とSV40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。こ
のベクタープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を
作用させてcDNAを合成し、その後制限酵素HinｄIIIで消
化し、ついで上記リンカーを用いて環化させる。その
後、mRNA部分をＤＮＡで置換して、cDNA断片含有プラス
ミドを得る。
（Molecular and Cellular Biology，２，161−170，19
82）によつて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pB
R322とSV40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。こ
のベクタープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を
作用させてcDNAを合成し、その後制限酵素HinｄIIIで消
化し、ついで上記リンカーを用いて環化させる。その
後、mRNA部分をＤＮＡで置換して、cDNA断片含有プラス
ミドを得る。
ついで、常法により、これを用いて大腸菌（Escherichi
a coli）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その
後、プローブとして、アポリポプロテインＥのアミノ酸
配列218−222位 Met-Glu-Glu-Met-Gly に対応する塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリ
ゴヌクレオチド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、これと相補性のある配列を含
むクローンを選択する。こうして得られるクローン中よ
り、適切な制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入さ
れているプラスミドを有するクローンを選択する。
a coli）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その
後、プローブとして、アポリポプロテインＥのアミノ酸
配列218−222位 Met-Glu-Glu-Met-Gly に対応する塩基配列の一部もしくは全部を含む合成オリ
ゴヌクレオチド又は少くとも該塩基配列を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、これと相補性のある配列を含
むクローンを選択する。こうして得られるクローン中よ
り、適切な制限酵素で切断して、最も長いcDNAが挿入さ
れているプラスミドを有するクローンを選択する。
そのクローンより得られるcDNA断片は、MaxamとGilbert
の方法（Methods in Enzymology，65，499−560，198
0）によつて塩基配列が決定される。
の方法（Methods in Enzymology，65，499−560，198
0）によつて塩基配列が決定される。
本発明において、用いられるＤＮＡ断片の一例としてア
ポリポプロテインＥ３をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ断片の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配
列を第１図に示すが、このＤＮＡ断片は必ずしもこれと
同一の塩基配列を有することを要求されず、該ＤＮＡ断
片に含まれるＤＮＡによつてコードされる物質が、アポ
リポプロテインＥと同様の生理活性を有するアポリポプ
ロテインＥ様物質であれば、オリゴヌクレオチド部位特
異的変異誘起、制限酵素処理、合成ＤＮＡ断片の使用等
により該塩基配列の一部が置換もしくは削除され、又は
塩基が付加された塩基配列であつてもよい。
ポリポプロテインＥ３をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ断片の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配
列を第１図に示すが、このＤＮＡ断片は必ずしもこれと
同一の塩基配列を有することを要求されず、該ＤＮＡ断
片に含まれるＤＮＡによつてコードされる物質が、アポ
リポプロテインＥと同様の生理活性を有するアポリポプ
ロテインＥ様物質であれば、オリゴヌクレオチド部位特
異的変異誘起、制限酵素処理、合成ＤＮＡ断片の使用等
により該塩基配列の一部が置換もしくは削除され、又は
塩基が付加された塩基配列であつてもよい。
なお、非正常型サブクラスＥ２又はＥ４に対応するＤＮ
Ａ断片は、Ｅ２又はＥ４を有する患者由来の肝臓切片等
を用いることにより、得ることができる。
Ａ断片は、Ｅ２又はＥ４を有する患者由来の肝臓切片等
を用いることにより、得ることができる。
(B)アポリポプロテインＡ−ＩをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ断片は、次のような方法によつて調製され
る。すなわち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中の
マクロフアージ又は腎臓切片等をグアジニンイソチオシ
アネートとともにホモジナイズし、CsCl平衡密度勾配超
遠心によつて全ＲＮＡを分離する（Chirgwinら、Bioche
mistry,18,5294-5299,1979）。
有するＤＮＡ断片は、次のような方法によつて調製され
る。すなわち、ヒト肝臓切片、小腸上皮細胞、血液中の
マクロフアージ又は腎臓切片等をグアジニンイソチオシ
アネートとともにホモジナイズし、CsCl平衡密度勾配超
遠心によつて全ＲＮＡを分離する（Chirgwinら、Bioche
mistry,18,5294-5299,1979）。
ついで、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラ
ムクロマトグラフイーで精製し、ポり(A)含有ＲＮＡを
単離する（mRNA原料）。
ムクロマトグラフイーで精製し、ポり(A)含有ＲＮＡを
単離する（mRNA原料）。
このmRNA原料より、岡山とバーグ（Ｂｅｒｇ）の方法
（Molecular and Cellular Biology，２，161−170，19
82）によつて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pB
R322とSV40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。こ
のベクタープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を
作用させてcDNAを合成し、その後制限酵素HinｄIIIで消
化し、ついで上記リンカーを用いて環化させる。その
後、mRNA部分をＤＮＡで置換して、cDNA断片含有プラス
ミドを得る。
（Molecular and Cellular Biology，２，161−170，19
82）によつて、cDNAライブラリーを得る。すなわち、pB
R322とSV40のハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（dG）テールリンカーを得る。こ
のベクタープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を
作用させてcDNAを合成し、その後制限酵素HinｄIIIで消
化し、ついで上記リンカーを用いて環化させる。その
後、mRNA部分をＤＮＡで置換して、cDNA断片含有プラス
ミドを得る。
ついで、常法により、これを大腸菌（Escherichia col
i）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その後、プ
ローブとして、アポリポプロテインＡ−Ｉのアミノ酸配
列108−112位 Trp-Gln-Glu-Glu-Met に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて、これと相
補性のある配列を含むクローンを選択する。こうして得
られるクローン中より、適切な制限酵素で切断して、最
も長いcDNAが挿入されているプラスミドを有するクロー
ンを選択する。
i）等をアンピシリン耐性に形質転換する。その後、プ
ローブとして、アポリポプロテインＡ−Ｉのアミノ酸配
列108−112位 Trp-Gln-Glu-Glu-Met に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて、これと相
補性のある配列を含むクローンを選択する。こうして得
られるクローン中より、適切な制限酵素で切断して、最
も長いcDNAが挿入されているプラスミドを有するクロー
ンを選択する。
そのクローンより得られるcDNA断片は、MaxamとGilbert
の方法（Methods in Enzymology，65，499−560，198
0）によつて塩基配列が決定される。
の方法（Methods in Enzymology，65，499−560，198
0）によつて塩基配列が決定される。
本発明において用いられるＤＮＡ断片の一例を特願昭59
−216988ｎい示すが、本発明に用いられるＤＮＡ断片は
必ずしもこれと同一の塩基配列を有することを要求され
ず、該ＤＮＡ断片に含まれるＤＮＡによつてコードされ
る物質が、アポリポプロテインＡ−Ｉと同様の生理活性
を有するアポリポプロテインＡ−Ｉ様物質であれば、ア
ポリポプロテインＥ様物質について述べたと同様な方法
で該塩基配列の一部が置換もしくは削除され、又は塩基
が付加された塩基配列であつてもよい。
−216988ｎい示すが、本発明に用いられるＤＮＡ断片は
必ずしもこれと同一の塩基配列を有することを要求され
ず、該ＤＮＡ断片に含まれるＤＮＡによつてコードされ
る物質が、アポリポプロテインＡ−Ｉと同様の生理活性
を有するアポリポプロテインＡ−Ｉ様物質であれば、ア
ポリポプロテインＥ様物質について述べたと同様な方法
で該塩基配列の一部が置換もしくは削除され、又は塩基
が付加された塩基配列であつてもよい。
本発明の発現ベクターは、上記のようにして得られたア
ポリポプロテイン遺伝子（以下アポリポプロテイン又は
アポリポプロテイン様物質をコードする遺伝子を「アポ
リポプロテイン構造遺伝子」と称することがある。）を
転写制御できる位置に真核プロモータを含有する。
ポリポプロテイン遺伝子（以下アポリポプロテイン又は
アポリポプロテイン様物質をコードする遺伝子を「アポ
リポプロテイン構造遺伝子」と称することがある。）を
転写制御できる位置に真核プロモータを含有する。
このようなプロモータとしては、SV40初期プロモータ、
SV40後期プロモータ、アポリポプロテインＥ遺伝子のプ
ロモータ、アポリポプロテインＡ−Ｉ遺伝子のプロモー
タ、熱シヨツク遺伝子のプロモータ（Proc.Natl.Sci.US
A，78 7038−7042（1981），メタロチオネイン遺伝子
のプロモータ（Proc.Natl.Sci.USA，77 6511−6515（1
980）），HSV TKプロモータ、アデノウイルスのプロモ
ータ（Ad２主要後期プロモータ（Ad２MLPプロモー
タ））、レトロウイルスのLTR（Long Terminal Repea
t）等が挙げられるが、SV40プロモータ及びメタロチオ
ネイン遺伝子のプロモータが好ましい。
SV40後期プロモータ、アポリポプロテインＥ遺伝子のプ
ロモータ、アポリポプロテインＡ−Ｉ遺伝子のプロモー
タ、熱シヨツク遺伝子のプロモータ（Proc.Natl.Sci.US
A，78 7038−7042（1981），メタロチオネイン遺伝子
のプロモータ（Proc.Natl.Sci.USA，77 6511−6515（1
980）），HSV TKプロモータ、アデノウイルスのプロモ
ータ（Ad２主要後期プロモータ（Ad２MLPプロモー
タ））、レトロウイルスのLTR（Long Terminal Repea
t）等が挙げられるが、SV40プロモータ及びメタロチオ
ネイン遺伝子のプロモータが好ましい。
また、本発明の発現ベクターは５′スプライス部位
（５′splice junction donor site）、イントロン及び
３′スプライス部位（３′splice junction acceptor s
ite）からなるスプライス配列ＤＮＡ（エキソン−イン
トロン接合部位、同接合部位周辺には共通の塩基配列が
見出されており、イントロン領域が常にＧＴの２塩基
（ドナー部位）で始まり、そしてＡＧの２塩基（アクセ
プター部位）で終了するといういわゆるＧＴ／ＡＧ則が
成立する。）を含有する。
（５′splice junction donor site）、イントロン及び
３′スプライス部位（３′splice junction acceptor s
ite）からなるスプライス配列ＤＮＡ（エキソン−イン
トロン接合部位、同接合部位周辺には共通の塩基配列が
見出されており、イントロン領域が常にＧＴの２塩基
（ドナー部位）で始まり、そしてＡＧの２塩基（アクセ
プター部位）で終了するといういわゆるＧＴ／ＡＧ則が
成立する。）を含有する。
このようなスプライス配列ＤＮＡは、本発明の発現ベク
ター中に１以上存在してもよく、またその位置は、アポ
リポプロテイン構造遺伝子の上流であつても、また下流
であつてもよい。
ター中に１以上存在してもよく、またその位置は、アポ
リポプロテイン構造遺伝子の上流であつても、また下流
であつてもよい。
上記スプライス配列ＤＮＡの具体例としては、ウサギβ
−グロビン遺伝子のエクソン２及びエクソン３を含むBa
mＨＩ−Pvu II断片から得られるエクソン２中のBamＨＩ
部位からエクソン３のEcoＲＩ部位までのＤＮＡ断片（S
cience，26 339（1979）参照）、メタロチオネイン遺
伝子のプロモータ、エクソン１、２及び３並びにイント
ロンＡ及びＢを含有するマウスメタロチオネイン−Ｉ遺
伝子の3.8kbＤＮＡ断片（Proc.Natl.Acad.Sci,USA77 65
13（1980）参照）中に存在するスプライス配列ＤＮＡが
挙げられる。また、５′及び３′スプライス部位は同一
の遺伝子に由来する必要はなく、たとえば、アデノウイ
ルスＤＮＡ中に含まれる５′スプライス部位とIg可変領
域遺伝子に由来する３′スプライス部位を連結した配列
を使用できる。
−グロビン遺伝子のエクソン２及びエクソン３を含むBa
mＨＩ−Pvu II断片から得られるエクソン２中のBamＨＩ
部位からエクソン３のEcoＲＩ部位までのＤＮＡ断片（S
cience，26 339（1979）参照）、メタロチオネイン遺
伝子のプロモータ、エクソン１、２及び３並びにイント
ロンＡ及びＢを含有するマウスメタロチオネイン−Ｉ遺
伝子の3.8kbＤＮＡ断片（Proc.Natl.Acad.Sci,USA77 65
13（1980）参照）中に存在するスプライス配列ＤＮＡが
挙げられる。また、５′及び３′スプライス部位は同一
の遺伝子に由来する必要はなく、たとえば、アデノウイ
ルスＤＮＡ中に含まれる５′スプライス部位とIg可変領
域遺伝子に由来する３′スプライス部位を連結した配列
を使用できる。
なお、アポリポプロテイン構造遺伝子のクローニング部
位としては、上記β−グロビン遺伝子中のBamＨＩ部位
及びマウスメタロチオネイン遺伝子のエキソン１中のBg
l II部位を使用できる。
位としては、上記β−グロビン遺伝子中のBamＨＩ部位
及びマウスメタロチオネイン遺伝子のエキソン１中のBg
l II部位を使用できる。
本発明の発現ベクターは、さらにポリアデニル化部位を
含有する。ポリアデニル化部位は、アポリポプロテイン
構造遺伝子の下流に存在する。ポリアデニル化部位の具
体例としては、SV40ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子又はメ
タロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。ま
た、β−グロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びSV40
ＤＮＡのポリアデニル化部位が連結したものであつても
よい。
含有する。ポリアデニル化部位は、アポリポプロテイン
構造遺伝子の下流に存在する。ポリアデニル化部位の具
体例としては、SV40ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子又はメ
タロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。ま
た、β−グロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びSV40
ＤＮＡのポリアデニル化部位が連結したものであつても
よい。
本発明の発現ベクターは、形質転換体の選択を可能とす
る優性な選択マーカを有していてもよい。発現ベクター
中に選択マーカがなくても、二重形質転換法（cotransf
ormation）により、形質転換された本発明の動物細胞を
選択できる。このような選択マーカとしては、MTX（メ
ソトレキセート）耐性を与えるDHFR遺伝子、HAT媒地中
での形質転換tk-株の選択を可能とするヘルペス・シン
プレツクスウイルス（HSV）のtk遺伝子、３′−デオキ
シストレプタミン抗生物質G418に対する耐性を付与する
大腸菌のトランスポゾンTn5からのアミノグリコシド
３′−ホスフオトランスフエラーゼ遺伝子、重層増殖に
よる形態的区別を可能にするウシパピローマウイルス遺
伝子、aprt遺伝子等が挙げられる。
る優性な選択マーカを有していてもよい。発現ベクター
中に選択マーカがなくても、二重形質転換法（cotransf
ormation）により、形質転換された本発明の動物細胞を
選択できる。このような選択マーカとしては、MTX（メ
ソトレキセート）耐性を与えるDHFR遺伝子、HAT媒地中
での形質転換tk-株の選択を可能とするヘルペス・シン
プレツクスウイルス（HSV）のtk遺伝子、３′−デオキ
シストレプタミン抗生物質G418に対する耐性を付与する
大腸菌のトランスポゾンTn5からのアミノグリコシド
３′−ホスフオトランスフエラーゼ遺伝子、重層増殖に
よる形態的区別を可能にするウシパピローマウイルス遺
伝子、aprt遺伝子等が挙げられる。
また、二重形質転換法により、本発明の発現ベクターで
形質転換した動物細胞を選択するには、上記した選択マ
ーカとなる遺伝子を含有するプラスミドその他のＤＮＡ
を発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択で
きる。
形質転換した動物細胞を選択するには、上記した選択マ
ーカとなる遺伝子を含有するプラスミドその他のＤＮＡ
を発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択で
きる。
本発明の発現ベクターは、大腸菌等の細菌由来の複製起
点を有するプラスミド断片を含有すると、細菌中でのク
ローニングが可能となり有利である。このようなプラス
ミドとしてはpBR322、pBR327、ｐＭＬ等が挙げられる。
点を有するプラスミド断片を含有すると、細菌中でのク
ローニングが可能となり有利である。このようなプラス
ミドとしてはpBR322、pBR327、ｐＭＬ等が挙げられる。
本発明の発現ベクターに使用されるプラスミドベクター
の具体例としては、SV40初期プロモータ、クローニング
部位としてのBamＨＩ部位、ウサギのβ−グロビン遺伝
子に由来するスプライス配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロ
ビン遺伝子からのポリアデニル化部位、SV40初期領域か
らのポリアデニル化部位並びにpBR322からの複製起点及
びアンピシリン耐性遺性子を含有するpKCR（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 78，1528（1981）参照）、pKCRのpBR322
部分をpBR327部分で置換し、ウサギβ−グロビン遺伝子
のエクソン３中に存在するEcoＲＩ部位にHinｄIII部位
を導入したpKCRH2（Nature 307、605参照）、BPV遺伝子
及びメタロチオネイン遺伝子を含有するpBPVMT1（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 80 398（1983）参照）等が挙げられ
る。
の具体例としては、SV40初期プロモータ、クローニング
部位としてのBamＨＩ部位、ウサギのβ−グロビン遺伝
子に由来するスプライス配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロ
ビン遺伝子からのポリアデニル化部位、SV40初期領域か
らのポリアデニル化部位並びにpBR322からの複製起点及
びアンピシリン耐性遺性子を含有するpKCR（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 78，1528（1981）参照）、pKCRのpBR322
部分をpBR327部分で置換し、ウサギβ−グロビン遺伝子
のエクソン３中に存在するEcoＲＩ部位にHinｄIII部位
を導入したpKCRH2（Nature 307、605参照）、BPV遺伝子
及びメタロチオネイン遺伝子を含有するpBPVMT1（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 80 398（1983）参照）等が挙げられ
る。
なお、上記したプラスミド中でのアポリポプロテイン遺
伝子のクローニング部位としては、pKCRのBamＨＩ部
位、pKCRH2のHinｄIII部位、pBPVMT1のメタロチオネイ
ン−Ｉ遺伝子のエキソン１中のBglII部位が挙げられ
る。
伝子のクローニング部位としては、pKCRのBamＨＩ部
位、pKCRH2のHinｄIII部位、pBPVMT1のメタロチオネイ
ン−Ｉ遺伝子のエキソン１中のBglII部位が挙げられ
る。
本発明の発現ベクターで形質転換される動物細胞として
は、CHO細胞が挙げられる。
は、CHO細胞が挙げられる。
本発明の発現ベクターの動物細胞への移入はトランスフ
エクシヨン法、マイクロインジエクシヨン法等によるこ
とができ、トランスフエクシヨン法としては、Ca−PO4
（Virology 52,456−467（1973））が最も一般的であ
る。
エクシヨン法、マイクロインジエクシヨン法等によるこ
とができ、トランスフエクシヨン法としては、Ca−PO4
（Virology 52,456−467（1973））が最も一般的であ
る。
移入により形質転換された動物細胞の培養は、常法によ
り浮遊培地又は固着培地中で行なうことができる。
り浮遊培地又は固着培地中で行なうことができる。
培地としては、MEM、RPMI1640等が一般的である。
産生された蛋白の分離も常法によることができる。
〈実施例〉 以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例により限
定されるものではない。
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例により限
定されるものではない。
なお、実施例において、制限酵素、修飾酵素等の処理
は、これらの試薬の製造・販売者（宝酒造株式会社、Ne
w England Biolabs）の指示書に従つて行なつた。
は、これらの試薬の製造・販売者（宝酒造株式会社、Ne
w England Biolabs）の指示書に従つて行なつた。
参考例１（アポリポプロテインＥをコードする構造遺伝
子を含むＤＮＡ断片の調製） (1)ヒト肝臓切片を液体窒素で破砕した後グアニジンイ
ソチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズした。得
られたホモジネートを、Chirgwinらの方法（Biochemist
ry，18，5294−5299，1979）に従つて、塩化セシウム平
衡密度勾配超遠心によつて全ＲＮＡを分離した。つい
で、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラムク
ロマトグラフイーで精製し、ポリ(A)含有ＲＮＡを単離
し、mRNA原料とした。
子を含むＤＮＡ断片の調製） (1)ヒト肝臓切片を液体窒素で破砕した後グアニジンイ
ソチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズした。得
られたホモジネートを、Chirgwinらの方法（Biochemist
ry，18，5294−5299，1979）に従つて、塩化セシウム平
衡密度勾配超遠心によつて全ＲＮＡを分離した。つい
で、常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラムク
ロマトグラフイーで精製し、ポリ(A)含有ＲＮＡを単離
し、mRNA原料とした。
(2)一方、岡山とBergの方法（Molecular and Cellular
Biology２，161−170，1982）により、pBR322とSV40の
ハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライマー
とオリゴ（dG）テールリンカーを得た。すなわち、pBR3
22とSV40（マツプユニツト0.71−0.86）のハイブリツド
プラスミド400μｇを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中制限酵素KpnＩで３７℃、４時間消化した。
Biology２，161−170，1982）により、pBR322とSV40の
ハイブリツドプラスミドを用いて、ベクタープライマー
とオリゴ（dG）テールリンカーを得た。すなわち、pBR3
22とSV40（マツプユニツト0.71−0.86）のハイブリツド
プラスミド400μｇを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝
液中制限酵素KpnＩで３７℃、４時間消化した。
ついで、常法によりエタノール沈澱によつてＤＮＡを回
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加して、
３７℃で３０分間反応させて、制限酵素KpnＩの消化末
端に約６０個のｄＴテールを付加させた後、エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収した。ついで、このＤＮＡをウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素HpaＩに
より消化した（３７℃、５時間）。大きい方のＤＮＡ断
片を、アガロースゲル電気泳動により精製しガラスパウ
ダー法（Vogelsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，7
6，615−619、1979）によつて回収した。その後、この
ＤＮＡを０℃でオリゴ（dA）セルロースカラムに付し、
水で溶出させた後、エタノールで回収し、オリゴ（dT）
テールを有するベクタープライマーを得た。
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加して、
３７℃で３０分間反応させて、制限酵素KpnＩの消化末
端に約６０個のｄＴテールを付加させた後、エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収した。ついで、このＤＮＡをウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素HpaＩに
より消化した（３７℃、５時間）。大きい方のＤＮＡ断
片を、アガロースゲル電気泳動により精製しガラスパウ
ダー法（Vogelsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，7
6，615−619、1979）によつて回収した。その後、この
ＤＮＡを０℃でオリゴ（dA）セルロースカラムに付し、
水で溶出させた後、エタノールで回収し、オリゴ（dT）
テールを有するベクタープライマーを得た。
他方、pBR322とSV40（マツプユニツト0.19〜0.32）との
ハイブリツドプラスミド100μｇをウシ血清アルブミン
を含む緩衝液中で、制限酵素PstＩにより消化した（３
７℃、１時間半）。ついで、ＤＮＡを回収し、dGTPを含
む緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼを添加して、３７℃で２０分間反応
させ、約１０〜１５のdGテールを付加させた。回収した
ＤＮＡを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素HinｄIIIにより消化させ（３７℃、１時間）、ついで
アガロースゲル（1.8％）電気泳動に付し、小さいオリ
ゴ（dG）テールリンカーＤＮＡを抽出、回収した。
ハイブリツドプラスミド100μｇをウシ血清アルブミン
を含む緩衝液中で、制限酵素PstＩにより消化した（３
７℃、１時間半）。ついで、ＤＮＡを回収し、dGTPを含
む緩衝液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼを添加して、３７℃で２０分間反応
させ、約１０〜１５のdGテールを付加させた。回収した
ＤＮＡを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵
素HinｄIIIにより消化させ（３７℃、１時間）、ついで
アガロースゲル（1.8％）電気泳動に付し、小さいオリ
ゴ（dG）テールリンカーＤＮＡを抽出、回収した。
(3)岡山とバーグ（Ｂｅｒｇ）の方法（Molecular and C
ellular Biology２，161−170，1982）により、cDNAラ
イブラリーを得た。
ellular Biology２，161−170，1982）により、cDNAラ
イブラリーを得た。
すなわち、Tris-HCl（pH8.3）、MgCl2、KCl、ジチオス
レイトール、dATP、dTTP、dGTP及び〔32P〕dCTPを含む
水溶液に上記(1)で得られたmRNA30μｇと上記(2)で得ら
れたベクタープライマー１０μｇを添加して、逆転写酵
素の存在下に３７℃、２０分間、反応させ、プラスミド
−cDNA：mRNAを合成し、これをエタノール沈澱しペレツ
ト状で回収した。このペレツトをCoCl2、ジチオスレイ
トール、ポリ(A)、〔32P〕dCTP及びターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有する緩衝液に
溶解し、３７℃、１０分間反応させ、末端あたりdCMPの
１０〜１５の残基を付加させた。ついで、回収したオリ
ゴ（dC）テールプラスミド−cDNA：mRNAを含有するペレ
ツトをウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限
酵素HinｄIIIで３７℃、１時間消化し、エタノール沈澱
により、HinｄIII消化オリゴ（dC）テールcDNA：mRNAプ
ラスミドを回収した。これを前記(2)で得られたオリゴ
（dG）テールリンカーＤＮＡを含む緩衝液に溶解し、６
５℃、２分間インキユベートし、さらに４２℃、３０分
間保持し、０℃に冷却した。ついで、β−ＮＡＤ（ニコ
チンアデニンジヌクレチド）存在下、大腸菌（E.coli）
ＤＮＡリガーゼを加えて、一夜インキユベートした。そ
の後、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、β−ＮＡＤ、E.coli D
NAリガーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ及びE.coli RNase
Hを添加して、この混合物を１２℃、１時間、次いで室
温で１時間インキユベートした後、冷却し、反応を停止
させ目的とするcDNA断片含有プラスミドを得た。
レイトール、dATP、dTTP、dGTP及び〔32P〕dCTPを含む
水溶液に上記(1)で得られたmRNA30μｇと上記(2)で得ら
れたベクタープライマー１０μｇを添加して、逆転写酵
素の存在下に３７℃、２０分間、反応させ、プラスミド
−cDNA：mRNAを合成し、これをエタノール沈澱しペレツ
ト状で回収した。このペレツトをCoCl2、ジチオスレイ
トール、ポリ(A)、〔32P〕dCTP及びターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有する緩衝液に
溶解し、３７℃、１０分間反応させ、末端あたりdCMPの
１０〜１５の残基を付加させた。ついで、回収したオリ
ゴ（dC）テールプラスミド−cDNA：mRNAを含有するペレ
ツトをウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限
酵素HinｄIIIで３７℃、１時間消化し、エタノール沈澱
により、HinｄIII消化オリゴ（dC）テールcDNA：mRNAプ
ラスミドを回収した。これを前記(2)で得られたオリゴ
（dG）テールリンカーＤＮＡを含む緩衝液に溶解し、６
５℃、２分間インキユベートし、さらに４２℃、３０分
間保持し、０℃に冷却した。ついで、β−ＮＡＤ（ニコ
チンアデニンジヌクレチド）存在下、大腸菌（E.coli）
ＤＮＡリガーゼを加えて、一夜インキユベートした。そ
の後、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、β−ＮＡＤ、E.coli D
NAリガーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ及びE.coli RNase
Hを添加して、この混合物を１２℃、１時間、次いで室
温で１時間インキユベートした後、冷却し、反応を停止
させ目的とするcDNA断片含有プラスミドを得た。
(4)ついで、このプラスミドを用いて常法により、大腸
菌（E.Coli）HB101を形質転換させた。
菌（E.Coli）HB101を形質転換させた。
その後、プローブとして、アポリポプロテインＥのアミ
ノ酸配列218−222位 Met-Glu-Glu-Met-Gly に相当する４種類の合成オリゴヌクレオチド を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）らの方法（Gen
e,10,63−67，1980）によつてスクリーニングを行な
い、これと相補性のある配列を含むクローンを選択し
た。約100,000の形質転換体中、約５０個のクローンが
選択され、このうちの１４個のクローンについて数種の
制限酵素により処理し、そのうちの３つのクローンが共
通の制限酵素認識部位をもつことが判明した。そのうち
で最も大きなクローンpYAE10を選択し、このクローンの
塩基配列をMaxamとGilbertの方法により決定した。
ノ酸配列218−222位 Met-Glu-Glu-Met-Gly に相当する４種類の合成オリゴヌクレオチド を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）らの方法（Gen
e,10,63−67，1980）によつてスクリーニングを行な
い、これと相補性のある配列を含むクローンを選択し
た。約100,000の形質転換体中、約５０個のクローンが
選択され、このうちの１４個のクローンについて数種の
制限酵素により処理し、そのうちの３つのクローンが共
通の制限酵素認識部位をもつことが判明した。そのうち
で最も大きなクローンpYAE10を選択し、このクローンの
塩基配列をMaxamとGilbertの方法により決定した。
第１図は上記クローンの塩基配列決定のために作成した
制限酵素切断地図を示す（ATG：翻訳開始コドン、ＴＧ
Ａ：翻訳終結コドン）。また、第２図（その１〜４）に
上記ＤＮＡ断片の塩基配列及びそれより想定されるアミ
ノ酸配列を示す（アミノ酸残基数：３１７）。
制限酵素切断地図を示す（ATG：翻訳開始コドン、ＴＧ
Ａ：翻訳終結コドン）。また、第２図（その１〜４）に
上記ＤＮＡ断片の塩基配列及びそれより想定されるアミ
ノ酸配列を示す（アミノ酸残基数：３１７）。
このＤＮＡ断片は、正常人由来のアポリポプロテインＥ
３に相当する。
３に相当する。
実施例１（ＣＨＯ細胞におけるアポリポプロテインＥの
表現） (i)アポリポプロテインcDNAのpolyＧ及びpolyＡ部分の
除去（第３図） 参考例１で得られたプラスミドpYAE10をHinｄIII、Acc
Ｉで消化しアポリポプロテインＥをコードするＤＮＡを
含む1.7kbpのＤＮＡ断片を得た。ついで、このＤＮＡ断
片をBal31エキソヌクレアーゼで処理し、HinｆＩで消化
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑な末端とし、HinｄI
IIリンカーをT4DNAリガーゼの存在下に付加した。これ
をHinｄIIIで消化し、プラスミドpBR322のHinｄIII部位
に導入し、プラスミドpBR322HAPEを得た。
表現） (i)アポリポプロテインcDNAのpolyＧ及びpolyＡ部分の
除去（第３図） 参考例１で得られたプラスミドpYAE10をHinｄIII、Acc
Ｉで消化しアポリポプロテインＥをコードするＤＮＡを
含む1.7kbpのＤＮＡ断片を得た。ついで、このＤＮＡ断
片をBal31エキソヌクレアーゼで処理し、HinｆＩで消化
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑な末端とし、HinｄI
IIリンカーをT4DNAリガーゼの存在下に付加した。これ
をHinｄIIIで消化し、プラスミドpBR322のHinｄIII部位
に導入し、プラスミドpBR322HAPEを得た。
(ii)発現ベクターの再構築 SV40プロモータを含むプラスミドpKCRH2をHinｄIIIで消
化し、このHinｄIII部位に前記プラスミドpBR322HAPEを
HinｄIIIで消化して得られ、アポリポプロテインＥをコ
ードするＤＮＡを含むHinｄIII断片を導入し、プラスミ
ドpKCRHAPEを得た（第４図）。
化し、このHinｄIII部位に前記プラスミドpBR322HAPEを
HinｄIIIで消化して得られ、アポリポプロテインＥをコ
ードするＤＮＡを含むHinｄIII断片を導入し、プラスミ
ドpKCRHAPEを得た（第４図）。
(iii)ＣＨＯ（dhfr-）細胞（Proc.Natl.Acad.Sci.，7
7，4216、1980）への二重形質転換 上記プラスミドpKCRHAPEとdhfr遺伝子をもつプラスミド
pMTVdhfr（Nature，294，228，（1981，）を、ＤＮＡ−
リン酸カルシウム共沈物を用いるリン酸カルシウム法に
より、ＣＨＯ（dhfr-）細胞にトランスフエクシヨンさ
せる。
7，4216、1980）への二重形質転換 上記プラスミドpKCRHAPEとdhfr遺伝子をもつプラスミド
pMTVdhfr（Nature，294，228，（1981，）を、ＤＮＡ−
リン酸カルシウム共沈物を用いるリン酸カルシウム法に
より、ＣＨＯ（dhfr-）細胞にトランスフエクシヨンさ
せる。
２日間培養し、その後α−ＭＥＭ培地（米国GIBCO社No.
410−2000）（−Thymidine，−Hypoxanthine）でサブカ
ルチヤーする。ここで生残つたクローン（dhfr+）を単
離した。このクローンのアポリポプロテインＥ生産性を
ウエスタンプロツト法で調べたところ、約１０mg／／
１日であつた。
410−2000）（−Thymidine，−Hypoxanthine）でサブカ
ルチヤーする。ここで生残つたクローン（dhfr+）を単
離した。このクローンのアポリポプロテインＥ生産性を
ウエスタンプロツト法で調べたところ、約１０mg／／
１日であつた。
比較例 実施例１の(iii)において、ＣＨＯ細胞のかわりにＬ，
Ｃ１２７，ＣＯＳ細胞を用い、選択マーカーとしてpSV2
neo［J.Mo1.App1.Genet.1,327（1982）］、選択培地と
してＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）４００μｇを含むα−
ＭＥＭ培地を使用する以外は同様にしてヒトアポＥを生
産するようなクローンを選択した。以下にその結果を示
す。
Ｃ１２７，ＣＯＳ細胞を用い、選択マーカーとしてpSV2
neo［J.Mo1.App1.Genet.1,327（1982）］、選択培地と
してＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）４００μｇを含むα−
ＭＥＭ培地を使用する以外は同様にしてヒトアポＥを生
産するようなクローンを選択した。以下にその結果を示
す。
〈発明の効果〉 本発明方法によればアポリポプロテイン蛋白を高産生量
で得ることができ、たとえばアポリポプロテインＥの場
合には、糖鎖を有する形で蛋白を取得できる。
で得ることができ、たとえばアポリポプロテインＥの場
合には、糖鎖を有する形で蛋白を取得できる。
第１図はアポリポプロテインＥをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを有するクロ
ーンの制限酵素切断地図を示し、第２図（その１〜４）
は、このＤＮＡ断片の塩基配列及びそれより想定される
アミノ酸配列を示す。 第３図及び第４図は、それぞれプラスミドpBR322HAPE及
びpKCRHAPEの構築工程の概略図である。
むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを有するクロ
ーンの制限酵素切断地図を示し、第２図（その１〜４）
は、このＤＮＡ断片の塩基配列及びそれより想定される
アミノ酸配列を示す。 第３図及び第４図は、それぞれプラスミドpBR322HAPE及
びpKCRHAPEの構築工程の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】真核生物プロモーター；下記の配列で表わ
されるヒトアポリポプロテイン又はヒトアポリポプロテ
イン様物質をコードする遺伝子；ポリアデニル化部位並
びに５′スプライス部位、イントロン及び３′スプライ
ス部位からなるスプライス配列ＤＮＡを含有する発現ベ
クター。 - 【請求項２】プロモータがSV40初期プロモータ、SV40後
期プロモータ、アポリポプロテインＥ遺伝子のプロモー
タ、アポリポプロテインＡ−Ｉ遺伝子のプロモータ、熱
ショック遺伝子のプロモータ、メタロチオネイン遺伝子
のプロモータ、ＨＳＶ ＴＫプロモータ、アデノウイル
スのプロモータ又はレトロウイルスのＬＴＲであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のベクター。 - 【請求項３】ポリアデニル化部位が、SV40 ＤＮＡ、β
−グロビン遺伝子又はメタロチオネイン遺伝子に由来す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記
載のベクター。 - 【請求項４】ポリアデニル化部位がヒトアポリポプロテ
インＥ又はヒトアポリポプロテインＥ様物質をコードす
る遺伝子の下流に存在することを特徴とする特許請求の
範囲第１〜３項のいずれかに記載のベクター。 - 【請求項５】スプライス配列ＤＮＡが、SV40 ＤＮＡ、
βグロビン遺伝子、アデノウイルスＤＮＡ、Ｉｇ可変領
域遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、アポリポプロテイ
ンＥ遺伝子又はアポリポプロテインＡ−Ｉ遺伝子に由来
することを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいず
れかに記載のベクター。 - 【請求項６】選択マーカを有することを特徴とする特許
請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のベクター。 - 【請求項７】選択マーカがDHFR遺伝子、aprt遺伝子、ｔ
ｋ遺伝子、ウシパピロ−マウイルス遺伝子又はアミノグ
リコシド３′−ホスフォトランスフェラーゼ遺伝子であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載のベクタ
ー。 - 【請求項８】真核生物プロモーター；下記の塩基配列で
表わされるヒトアポリポプロテイン又はヒトアポリポプ
ロテイン様物質をコードする遺伝子；ポリアデニル化部
位並びに５′スプライス部位、イントロン及び３′スプ
ライス部位からなるスプライス配列ＤＮＡを含有する発
現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60126989A JPH0653071B2 (ja) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | 発現ベクター及び形質転換細胞 |
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| ＥＭＢＯＪ．３，［４（１９８４）Ｐ．９０１〜９０８ |
| ＪＢＣ２５８，［１４（１９８３）Ｐ．８９９３〜９０００ |
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