JPH03504916A - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は１組織治癒の際に、脈管系を形成するため、ならびに異常な持続性脈管 形成を抑制するために重要な成長因子の組換え生産に関する。特に１本発明は、 ヒトの塩基性および酸性の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）をコードする遺伝子の 類似体をクローニングし、そして発現させる。

技術的背景 組織が創傷または火傷のような外傷を受けた場合の修復過程は極めて複雑である が、多数のタンパク因子により仲介されることが知られている。これらの因子は 、破壊された組織を置換するように働く細胞の増殖および分化に必須である。

数多くの候補となる因子は、脳、脳下垂体、および視床下部などのいろいろな組 織の抽出物が培養細胞の有糸分裂を促進する能力を基準として同定されている。

多数の短縮名がこれらの抽出物中の活性因子に与えられている。これらの活性因 子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、マクロファージ由来成長因子（Ｍ ＤＧＦ）　、表皮成長因子（ＥＧＦ）、腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）、内皮細胞 成長因子（ＥＣＧＦ）　、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、視床下部由来成長因 子（ＨＤＧＦ）　、網膜由来成長因子（ＲＤＧＦ）　、およびヘパリン結合成長 因子（ＨＧＦ）が含まれる。（Ｒ，Ｒｏ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　（１９８４）　２３　：６２９５−６２９９を参照）。

治癒に関与する過程の１つ、すなわち血管の形成は、腫瘍においてヘパリンによ り強く影響されることを報告した。このことおよび他の研究から、ヘパリンが、 多数のこのような成長因子活性に関連するタンパクに対して特異的に結合するこ とは明らかである。従って、ヘパリンが精製手段として用いられてきた。ヘパリ ンが正および負に荷電した両方の因子に結合することから、成長因子のヘパリン に対する親和性は。

全体のイオン電荷に無関係であることが示されている（Ｍａｃｉａｇ。

ヘパリンに対する結合能力または非結合能力は、いろいろな抽出物における活性 を区別する１つの尺度である。例えば。

ＥＧＦおよびＰＤＧＦはヘパリンに強く結合しない；実際には、　ＥＧＦはヘパ リンに全く詰合しない。上述の他の因子は強いヘパリン結合性を示す。しかしな がら、酸性の脳ＦＧＦ　、　ＥＣＧＦ、　ＲＤＧＦおよびＨＧＦ−αは、実際に は、同一因子であると考えられている。同様に、脳下垂体ＦＧＦ　、陽イオン性 の脳ＦＧＰ　、　ＴＡＰおよびＨＧＦ−も同一タンパクであると考えられている （Ｌｏｂｂ、　Ｒ，Ｒ，。

ｅｔ　ａｌ、　（前出））。ヘパリン親和性を用いて精製された１３の内皮成長 因子の要約および比較が、　Ｌｏｂｂ、　Ｒ，、ら、　Ｊ　ＢｉｏｌＣｈｅｍヘ パリン−アフィニティークロマトグラフィーを用いて。

毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性を示す塩基性の繊維芽細胞成長因子が、 ラットの軟骨肉腫（Ｓｈｉｎｇ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ。

米国特許第４．４４４．７６０号は、　１６，６００および１６．８００ダルト ンの分子量を有する酸性のウシの脳繊維芽細胞成長因子の２つの異種型を精製し た。Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚおよび協同研究者らは。

ウシの脳および脳下垂体の両方に塩基性の繊維芽細胞成長因子活性が存在するこ とを示し、そしてヘパリン−アフィニティークロマトグラフィーを他の精製技術 と組合せて、これらｅｔａｌ、（同）　６９６３−６９６７）。これらの因子の 分子量も、ヒトの（１９８５）　１２８　：　５５４−５６２）。

ウシの脳下垂体由来の塩基性ＦＧＦに対する完全な配列が決内皮細胞を用いたイ ンビトロ分析で強い有糸分裂活性を示した（塩基性ＦＧＦは、　６０ｐｇ／ｍｌ のＥＤｓｏを有する）。

酸性ＦＧＦは、約６．０００ｐｇ／ｍｌのＥＤｓ。を有する。ウシの脳組織由来 の酸性ＦＧＦのＮ末端配列は、　Ｂｏｈｌｅｎ、　Ｐ、、　ら、　ＥＭＢＯＪＧ 、らは、ヒトの脳から調製された酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦ両方のＮ末端配 列を決定し、そしてそれらをウシのＦＧＦの配列と比較した（Ｂｉｏｃｈｅｍ　 Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　（１９８６）　１３５　：　５４１−５４ ８）。彼らの結果は、ここに開示された結果と一致している。

また、ウシの脳由来の酸性ＦＧＦの全アミノ酸配列が、単離されたタンパクから 決定された（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ　。

定は、１つのアミノ酸を除いて一致している。しかし、　Ｅｓｃｈらは後に、彼 らの配列はＧ　ｉｍｅｎｅｚ−Ｇａ　１１ｅｇｏらの配列と一致すると報告した 。ヒトの酸性ＦＧＦの全アミノ酸配列が、その遺伝子から推定された（Ｊａｙｅ 、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４１−５ ４５．そして完全なヒトのタンパク配列もＧ　ｉｍｅｎｅｚ−Ｇａ　ｌ　ｌｅｇ ｏ。

により決定された）。

上述のＦＧＦタンパクおよび他の成長因子は、外傷を受けた組織の治癒を促進す る際、明らかに有効である（例えば、　５ｐｏｒｎ。

６４１３を参照）。Ｄａｖｉｄｓｏｎら（前出）は、特に創傷治癒におけるＦＧ Ｆの有効性を開示している。塩基性ＦＧＦの天然タンパクは、心筋梗塞の治療に 有用であると言われている（Ｓｖｅｔ−Ｍｏｌｄａｖｓｋｙ。

Ｇ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｌａｎｃｅｔ　（１９７７年４月２３日）　９１ ３　；米国特許第４、２９６．１００号および第４．３’７８．３４７号）。さ らに、ヒトの塩基性ＦＧＦが、ラット胎児の海馬体神経細胞における神経細胞の 生存および神経突起の伸長を増大させることが見出されてい病およびパーキンソ ン病のような退化神経学的疾病の治療にも有用であり得ることを示唆している。

上述のＦＧＦタンパクは、創傷９手術、火傷、骨折または神経病的変性の結果と して外傷を受けた組織の修復を促進するための、効果的な手段を提供する。しか しながら、これらの成長因子のある特性に関するデータが集められており、この データは、　　ＦＧＦの作用物質は組織の修復に関して天然のＦＧＰタンパクよ りも治療上効果的であり得、ある状況においては。

ＦＧＦ拮抗体もまた治療上有用であり得るということを示唆している。

例えば、天然のＰＧＦと比べてより強い生物学的活性を有するＦＧＦの作用物質 は、上述の創傷治療の指標に使用するのがより望ましい。対照的に、　ＰＧＦの 拮抗体は、血管新生が主な病状である治療に非常に有用であり、脈管形成過程を 阻害するのに治療上有用である。それゆえ、天然のＦＧＰの効果に拮抗するＦＧ Ｆ類似体を構築することも望ましく、そのため脈管形成が阻害される。

はっきりした生物学的活性に関与するタンパクの領域、または細胞環境での因子 の相互作用に重要な領域を単離するためには、これらの成長因子について報告さ れている天然ＦＧＰのＤＮＡ配列に修飾を与えることが望ましいと考えられる。

特異的相互作用の適当な領域または部位が決定されて、構造類似体が作られ得る 。これは９例えば創傷治癒活性のようなある活性を維持するが、細胞外基質にお けるＦＧＦの隔離のような望ましくない機能を減少させるかまたは除去する。

これらのＦＧＦタンパク類似体を大量に、かついかなる毒性不純物あるいは感染 性不純物を含まない形で利用し得ることを保証することもまた望ましい。治療に 用いるには、このタンパクのヒト型のものが好ましく、そして恐らく必要とされ る。ヒトの酸性ＦＧＰおよび塩基性ＦＧＰの両方のタンパクをコードするＤＮＡ 配列が組換えＤＮＡ技術によりクローン化され９発現されているので９部位特異 的変異処理が用いられて、酸性および塩基性の種々のＦＧＦ類似体が生産され得 る。本発明は、ここに酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦ類似体を実用的な量で、か つ純粋であって、汚染されていない形で得る方法を与える。

発明の開示 本発明は、創傷、骨折、火傷組織、創傷心筋組織、退化神経組織または他の外傷 の治癒を効果的に促進させるのに有用な繊維芽細胞成長因子類似体の合成および 操作の手段を与える。同時に、脈管形成阻害因子のような繊維芽細胞成長因子も 提供される。この因子は、血管新生が主な病状である眼科学、皮膚科学およびリ ウマチ病学に共通の疾病、ならびに脳腫瘍のような最も脈管形成能の高いものを 包含するがこれに限定されない、ある種の新生物における疾病の治療に有用であ る。これらの類似体をコードする遺伝子のクローニングおよび発現は９本発明の 方法および材料によって与えられる。

ある様相において１本発明は、ヒトの酸性および塩基性のＦＧＦの類似体（ヒ） 　ａＦＧＦおよびヒ）　ｂＦＧＦ）をコードする組換えＤＮＡ配列に関する。他 の様相において９本発明は、これらのＤＮＡ配列を有する組換えベクター、この ようなベクターを用いて形質転換され、そしてこれらのＤＮＡ配列を保持する宿 主細胞。

およびこれらの形質転換された細胞により生産される組換えタンパクに関する。

さらに他の様相において１本発明は１組換え技術を用いたこれらの繊維芽細胞成 長因子類似体の生産方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図および第２図は、ヒトの塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦをコードする天然 のＤＮＡ配列、ならびにこれらの推定アミノ酸配列をそれぞれ示す。

第３図は、ヒトの酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列の比較、ならび に潜在的なヘパリン結合領域および受容体結合領域を含む、変更の標的となる種 々の領域を示す。

第４図は９合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーター調節配 列の構築、ならびにプラスミドｐＴＲＰ−２３３の制限酵素切断部位の地図を示 す。

第５図は、プラスミドｐＵｃ９ｄｅｌｌ（３−ｐＴＳＦ−３の構築の流れ図であ る。

第６図は、　　ＦＧＦ類似体の遺伝子配列のいずれかを１発現ベクターｐＵｃ９ ｄｅｌＨ３−ｐＴＳＦ−３に挿入するのに用いた方法の説明図である。

第７図は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ヘパリンアフィニティーカ ラムを用いて、野性型ｂＦＧＦを、二重システィン置換ＦＧＦ類似体ｂＦＧ　Ｆ −Ｃ７８／９６Ｓとを比較した結果を示す。第７図は、　ＮａＣ１濃度勾配（０ ，６Ｍ〜３．０Ｍ）で展開したヘパリンＨＰＬＣカラムからの１０■の還元型（ 第７図ａ）および非還元型（第７図ｂ　）　ｂＦＧＰ−Ｃ７８／９６Ｓの溶出を 示す。還元条件下（第７図Ｃ）および非還元条件下（第７図ｄ）における、精製 された野性型ｂＦＧＦを用いて同様の実験を、比較のために提供する。

２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成長因子は、他の人々によ り均一にまで精製され、そして部分的にあるいは完全に配列決定されている。両 因子は、ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞、ヒトの請静脈内皮細 胞、ウシの副腎皮質ステロイド産生細胞、顆粒膜細胞および脈管平滑筋細胞など の培養細胞を用いたインビトロ分析において有糸分裂活性を示す。これらの細胞 培養を用いるイン別のインビトロ分析が、　Ｅｓｃｈら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ 　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＬＩＳＡ）たウシの塩基性ｂＦＧＦは、ニワ）　ＩＪの 漿尿膜分析においてインビボで脈管形成能があることが示されている（Ｇｏｓｐ ｏｄａｒｏｗ　ｉｃｚ。

ミックブレス））。精製されたウシの酸性ＦＧＦは、同じ分析においてインビボ で脈管形成能があることが示されている（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、Ａ、、　ｅｔａ ｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（前出））。

ウシの脳下垂体の塩基性ＦＧＦは、　Ｅｓｃｈ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉは第１図に示されている。報告された一次配列は、１４６個のアミノ 酸を含んでおり、第１図中の「１０」番のプロリン残基で始まっている；この配 列のＮ末端部分は、　１３０ｈｌｅｎら、　ＰｒｏｃウシのタンパクのＮ末端と 一致している。より大きな分子量を有するヒトの塩基性ＦＧＦは、ヒトの肝細胞 系列、　５Ｋ−１１ＥＰ−１について、　５ｕｌｌｉｖａｎ、　Ｒ，Ｊ、ら、　 Ｊ　Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ　（１９８５）　１０１　：１０８ａ；Ｋｌａｇｓｂｒｕ ｎ、　　Ｍ、ら、　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　　ｔｌｓＡ　　 （１９８６）　８３　：２４４８−２４５２　　；　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、　　 Ｍ、ら、　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ（ヒトの胎盤組 織）により報告されており、同様に脳下垂体およびヒトの前立腺組織由来のもの は、　Ｕｎｅｏら、　　Ｂｉｏｃｈｅｍれている。ヒトの塩基性ＦＧＦのＤＮＡ において、第１図の上流側配列を潜在的なＡＴＧ翻訳開始コドンまで翻訳するこ とは、第１図において残基１０で示されるプロリンの上流側のアミノ酸を含む、 タンパクの別の型のものも生産され得ることを示す。

ＡＴＧコドンは、プロリン残基に対応するコドンから９コドン上流に存在する。

遺伝子が真核系で発現する場合、メチオニンがこのＡＴＧによりコードされるの ならば、開始メチオニンとして働き、プロセッシングを受けて除去されることは かなり確かである。遺伝子が組換えによって細菌系で発現する場合、このような プロセッシングは、起こり得る場合も、起こり得ない場合もある。従って、細菌 で発現される「長円型のタンパクは、さらに８つまたは９つのアミノ酸配列をＮ 末端に含み１合計１５４個または１５５個のアミノ酸である。全ての研究グルー プは、この伸長したＦＧＦの多くが、そのＮ末端でブロックされていることも示 している。

（以下余白） 上述のインビトロ分析においてＦＧＰ活性を有し、かつウシの脳下垂体の塩基性 ＦＧＦ　（１４６個のアミノ酸型）と類似していると推定されるＮ末端配列を有 するタンパクも、ウシの脳。

副腎、網膜、およびヒトの胎盤がら単離されている。これらの組織のあるものか ら得られた天然のタンパクは、不均一である一推定される１５個のＮ末端アミノ 酸を欠く第２の型は。

少なくとも３つの型が存在する。成熟型は第１図の１０番目のアミノ酸（プロリ ン）から始まり、推定の成熟型配列のうち。

長い型はＮ末端にさらに８個のアミノ酸を含んでおり、短い型は１５個のアミノ 酸を欠いている。従って、天然で生産される「長い（ｌｏｎｇ）Ｊ塩基性ＦＧＦ は、１５４個または１５５個のアミノ酸を含み（Ａｂｒａｈａｍ、　Ｊ、Ａ、ら 、　ＥＭＢＯＪ（１９８６）５　：　２５２３−２５２８）　。

［基本型（ｐｒ　ｉｍａｒｙ）　Ｊ塩基性ＦＧＦは、１４６個のアミノ酸を含み 、そして「短い（ｓｈｏｒｔ）　Ｊ塩基性ＦＧＦは、１３１個のアミノ酸を含ん でいるき考えられている。さらに上流にまで伸長した型が存在することも可能で ある。これらのＦＧＦは、非常に多くの塩基性アミノ酸残基〈リジン、アルギニ ン、ヒスチジン）を含んでおり、従って中性ｐＨの下で陽イオン性であるので、 「塩基性Ｊ　　ＦＧＦと呼ばれる。

あるタンパクが前述の分析でＰＧＦ活性を有し、ヘパリンに結合し、中性ｐ＋＋ の下で陽イオンであり、そしてウシの血清アルブミン（もし適当なら）、あるい はウシ（またはヒト）のＦＧＦもしくはそれの合成ペプチドまたは天然ペプチド に対する他の抗体に結合した。アミノ末端配列［ｔｙｒｌｏ：ｌ　ＦＧＦ　（１ −１０）の合成類似体を用いて調製された抗体と免疫的に反応する場合、このタ ンパクをここでは塩基性ＦＧＦ　（またはｂＦＧＦと呼ぶ）と定義する。Ｂａ１ ｒｄ、Ａ、ら、　　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（１９８５）１ ０　：３０９−３１７を参照されたい。

酸性ＦＧＦは、他の人々によりウシおよびヒトの脳から単離されており、ヒトの 酸性ＦＧＦの完全なコード配列が決定され。

これは第２図で示される。

この酸性タンパクはまた３つの活性型が知られており、第１の型は図の「１６」 番のフェニルアラニン残基で始まる１４０アミノ酸配列を有しており、第２の短 い型はアミノ酸２２〜１５５に対応し、そしてＮ末端の伸長型は２〜１５５に対 応する（ア衡な数の酸性アミノ酸残基、すなわちグルタミン酸およびアスパラギ ン酸を含んでおり、従って中性ｐＨＯ下で陰イオンである。

あるタンパクがインビトロ分析でＦＧＦ活性を示し、ヘパリンに結合し、中性ｐ ＨＯ下で陰イオンであり、そしてヒトまたはウシの酸性ＦＧＦあるいはそれの合 成ペプチドまたは天然ペプチドに対して調製された抗体と免疫的に反応する場合 、このタンパクをここでは酸性ＦＧＦ　（または、ここではａＦＧＦと呼ぶ）と 定義する。

酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、上述のタンパク、または第１図および第２図 に示されるアミノ酸配列を有するタンパクを示すために、ここで用いられる。も ちろん、これらの定義は、示された特定の配列に限定されるものでなく、前述の インビトロ分析および免疫的交叉感受性分析によって測定したＰＧＦ作用物質の 生物学的活性が保持される限り、アミノ酸残基の欠失、付加、延長または交換の ような、偶然の変化あるいは計画的に誘導した変化を含む類似体タンパクを包含 する。

拮抗体活性を有するＦＧＦ類似体は、もちろん、変化した活性および特異性を有 する。

ここで記述した種々のＦＧＦ類似体は、定方向突然変異の技術により計画的に誘 導した変化を有する。これらの類似体は。

ＦＧＦの一般的な二次構造を保持しているが、　ＦＧＦの種々の拮抗体型および 作用物質型を生じるように突然変異を受けている。

ることをインビト°口で実証しており、そしてＭａｃｉａｑ、　Ｔ、　　ら。

ていることを報告している。このように、細胞外基質を含む細胞外環境に存在す るヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン様グリコサミノグリカン、およびヘパラン 様グリコサミノグリカンは、インビボでＦＧＦ（！＝ｉｇ合し得るようである。

塩基性ＦＧＦはインビトロにおいて脈管および毛細血管の内皮細胞により産生さ れる細胞外基質中で合成されるので（ＢａｉｒｄおよびＬｉｎｇ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　（１９８７）　１４２　 ：　４２８−４３５）　、ヘパリン結合能が小さい塩基性ＦＧＦ類似体は、潜在 能が高められる。

なぜなら、より多くのＦＧＦがその標的レセプターに達し、そして細胞外環境の ヘパリンおよびヘパリン様化合物により隔離されないからである。これらの類似 体は、処置にあたり必要とされる各類似体の投与景が少ないので、治療上より有 用年ヘパリンとの結合を仲介し得る塩基性ＦＧＰの領域である。第３図に示され る２６〜３１番の残基および１１５〜１２０番の残基を推定している。恐らく芳 香族残基と共にクラスター化している塩基性残基の、ヘパリンきの結合を仲介す る能力は、他のり変異は９分子の２次構造（例えば、αヘリックス、βシート。

回転モチーフ（ｔｕｒｎ　ｍｏｔｉｆｓ）　）の変化を最少にするように考慮し て、これらの標的領域にある正に荷電したアミノ酸を中性の残基または負に荷電 した残基に置き換えている。本発明の研究における主な機能的ヘパリン結合ドメ インであるとは思われない、上記で同定された推定ヘパリン結合ドメインとは対 照的に、クラスター化された塩基性残基を含む１２８〜１３８番の残基を有する ｂＦＧＦの第３の領域は、潜在的なヘパリン結合ドメインとして標的とされた。

ヘパリン結合ドメインを標的とする好ましい変異体は、　ｂＰＧＦ−に１２８Ｓ 、　ｂＦＧＦ−に１２８Ｅ、　ｂＦＧＦ−Ｒ１２９Ｔ、　ｂＦＧＦ−に１３４Ｓ 、　ｂＦＧＦ−に１３８Ｓ、およびに１２８Ｓ／Ｒ１２９Ｔを含む。塩基性また は正に荷電した残基を、グルタミン酸のような負に荷電した残基を置換するのが 好ましい。

ｂＦＧＦの類似体は、　ｂＦＧＦ−ＸＹＺと定義される：ここで、　Ｘは変異を 受ける天然のヒトのｂＦＧＦ配列のアミノ酸であり、　Ｙはアミノ酸Ｘの位置で あり、そしてＺはＹ位置にＸの代わりに用いられるアミノ酸残基である。

ヘパリンの結合を減少させるか、または除去することが見い出されているｂＦＧ Ｆの変異は、結果として作用物質活性または拮抗体活性のいずれかを有する類似 体を生成することが見出された他の変異と組み合わせることもできる。

ここで与えられる教示に従って、さらにＦＧＦ類似体を作ることも、当業者の範 囲内である。この教示においては、ヘパリンの結合に重要なこれらの残基は、他 の中性アミノ酸（例えば、セリン、アラニン、グリシンなど）または負に荷電し たアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）に変えられるか、あるい はここで記入したＨＰＬＣヘパリン−アフィニティー分析で試験されるようなヘ パリン結合活性を減少させるように欠失させられる。酸性型ＦＧＦの類似体は、 上述のように正に荷電したアミノ酸を欠失させるか、またはヘパリン−結合ドメ インに対応する正に荷電したアミノ酸（２３〜２７゜１１５〜１２０．１２７〜 １３７）を中性もしくは負に荷電したアミノ酸に置き倹えることにより構築され 得る。

細菌で生産された組換えタンパクは、活性型で回収するのが困難であるらしいと いうことが見い出されている。例えば。

細菌で生産されたシスティンを含有するタンパクは、しばしば生物学的機能を阻 害し得る間違った分子内システィンを生参照のこと）。天然のＦＧＦタンパクに 存在する１個またはそれ以上のシスティン残基を修飾することは１間違ったジス ルフィド結合の形成を最小限に抑え、　　ＦＧＦタンパクを安定にするための還 元剤を使用する必要性がなくなり、このために多量体形成または間違ったジスル フィド結合を減少させる。そのことにより９組換えにより生産された類似体の回 収量を増加させ、終始単量体型に保つことによりＦＧＦ調製物の均一性を高め、 その貯蔵安定性を改善し、そして創傷に適用した場合のその半減期を減らす。予 期せずにこれらの類似体は増大した生物学的活性を有することが示されている。

一般に、上述のシスティン残基における修飾は、得られるタンパクのアミノ酸置 換に対応して、ある特定のシスティンを指定するコドン内の１個のヌクレオチド を変えることにより行われる。システィン残基は、塩基性型ＦＧＦでは、　３７ ．７８゜９６、および１０１番めの位置に生じ、酸性型では３１．９８および１ ３２番めの位置に生じる。天然のＦＧＦのジスルフィド構造は知られていないの で、　　ＦＧＦの１個および複数個のシスティン置換を両方とも、ここに例示す る。これらの修飾がタンパク類似体の１次構造に変化を生じさせたとしても、シ スティン置換類似体が他の拮抗体の変化と組み合わされてないのならば、好適な 類似体は、　　ＦＧＦにより正常に誘導される細胞応答に影響を与える能力を一 般に保持する。

これらの同様のシスティン置換体が前述のヘパリン−結合変異体のような他の類 似体の置換体と組み合わせて作られ得。

さらに実例となるＦＧＦ類似体が生産される。同様に、前述のＦＧＦ類似体のい ずれかを、１個もしくはそれ以上の以下にあげるアミノ酸置換を有するように修 飾し得、所望の類似体が生産される。

ｂＦＧＦ活性を有する拮抗体は、糖尿病性の網膜症、後水晶体線維増殖病、血管 新生緑内障、慢性関節リウマチ、血管腫。

血管繊維腫、乾癖、アテローム硬化症を包含する異常な持続性脈管形成に関連す る種々の疾病において（Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｊ、おび避妊薬として臨床的に適用 される。さらに、ある種の固体腫瘍は増殖を維持するために新生血管形成を必要 とすることが示されている。脈管形成過程でＦＧＦが果たす重要な役割が与えら れると、　　ＦＧＦの効果を阻害しうるＰＧＦ類似体はこれらの疾病を治療する のに有用であることは明らかである。このように、　　ＦＧＦレセプターに結合 する類似体は、まだ生物学的応答を引き出さないか、または、小さい生物学的応 答を示す類似体は、有用な拮抗体特性を示す。

塩基性ＦＧＦに対する特異的な細胞表面レセプターを生成する能力は、仔ハムス ターの腎臓細胞（ＮｅｕｆｅｌｄおよびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ。

５ｗ１ｓｓ　３Ｔ３およびねずみ骨格筋細胞系（ＯｌｗｉｎおよびＨａｕｓｃｈ ｋａ。

１１６００−１１６０７）を包含する種々の細胞型において記述されている。さ らに、結合についての研究は、塩基性および酸性のいずれの型のＦＧＦも、同じ 高い親和性レセプターと結合し得ることを示唆している（　ＱｌｗｉｎおよびＨ ａｕｓｃｈｋａ、前出、ならびホルモン（例えば、　ｂＦＧＦ）とそのレセプタ ーとの相互作用は、しっかりとした特異的な分子会合をもたらす。この会合は、 イオン対の形成またはファンデルヴアールス力のようなよく知られた分子内の引 き合う力のいずれか、あるいは全部を伴い得る。この会合の特異性および安定性 は、「適合の正確さ」　（レセプターおよびホルモンの、２つのタンパクの正確 な３次元分子構造）、ならびに「適合のかたさ」　（これらの分子構造は、エネ ルギー的に好ましい近位のアミノ酸側鎖のために特異的な分子内の引き合いをも たらすような、正確なアミノ酸配列から構成されているという事実）として考え られ得ることに基づく。このように、レセプター結合領域内のアミノ酸の置換、 欠失および挿入は、該領域の分子構造またはアミノ酸側鎖の相互作用（ホルモン とレセプターとの間における）のいずれか、あるいはその両方に影響し得る。好 ましい構造を安定させるかまたはアミノ酸側鎖の相互作用を高める変化は、レセ プターの親和性を増大させるが、好ましい構造を不安定にさせるかまたはアミノ 酸側鎖の相互作用を減少させる変化は、レセプターの親和性を減少させる。前者 の変化は、該変化の作用体への導入がより効能のある作用物質を生じ得るので、 そして該変化の拮抗体への導入がより効能のある拮抗体を生じ得るので１本来有 用である。後者の変化は、レセプター結合にとってきわめて重要なアミノ酸断片 を決定するうえで有用である。

５ｃｈｕｂｅｒｔら（Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ（１９８７）１０４　：　６３５ −６４３　）は、　　ｂＦＧＦのフラグメント　（第３図によれば３３〜７７番 および１１２〜１２９番の残基）を含む合成ペプチドが、　ｂＦＧＦとそのレセ プターとの結合を阻害することを示している。従って、これらの領域は。

ＦＧＦレセプター結杏配列を含むことがわかる。ヒトの塩基性ＦＧＦの推定され るレセプター結合領域および後者に隣接した付加的領域（例えば、酸性ＦＧＦの 相当するアミノ酸配列領域と強い相同性を示す９９〜１１１番のアミノ酸）内の ヒト塩基性ＦＧＰに、我々はアミノ酸置換を導入している。荷電した（正および 負）アミノ酸および芳香族アミノ酸の両者は、中性の残基で置換する標的であっ た。これらの置換は、得られるタンパクの２次構造の変化を最少にするように考 慮して行われた。従って、類似体Ｄ９９ＡおよびＲ１１６Ｔは増大されたレセプ ター親和性および３Ｔ３分裂促進活性を示すが、類似体Ｅ１０５ＳおよびＹ１１ ２Ａは減少されたレセプター結合を示すと考えられる（本明細書の表３を参照の こと）。

本発明の目的のために９次の用語を以下のように定義する。

「作用物質（ａｇｏｎｉｓｔ　）　Ｊとは、　　ＦＧＦレセプターと結合し。

かつ典型的な生物学的応答をひき起こし得るＦＧＦ類似体を意味する。例えば、 　ＦＧＦ作用物質は、　ＦＧＦレセプターに結合し得るが、ヘパリンに結合する 能力は小さいタンパクであり得。

そのことによってより効能のある治療薬が作られる。

「拮抗体（ａｔｉｔａｇｏｎｉｓｔ）　Ｊとは、同じレセプタ一部位に対する競 合的な機構によりＦＧＦの効果を妨げる。　ＦＧＦ類似体を意味する。拮抗体は １通常ＦＧＦに付随している２次的な生物学的応答を誘導する能力が小さい。

「部位特異的変異処理（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ）　Ｊまたは「定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ） 　Ｊとは、オリゴヌクレオチド定方向突然変異法の使用を意味する。この方法は 、特定のコドンまたは変えられるコドンの位置でｂＦＧＦ遺伝子の領域と相補的 であるが該コドン内の１個または複数個の塩基が変えられている９合成オリゴヌ クレオチドを使用する必要がある。この技術により１選択される他のアミノ酸の いずれかで置換される特定のアミノ酸を生じるように設計された遺伝子を９作製 し得る。欠失が望まれる場合には、オリゴヌクレオチドブライマーは特定のコド ンを欠している。例えば、特定のシスティンを、グリシン、バリン、アラニン。

ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプト ファン、セリン、スレオニン、またはメチオニンのような中性アミノ酸に変換す ることは、好ましい方法である。セリンおよびアラニンは、システィンと化学的 に類似しているので、最も好ましい置換物質である。システィンを欠失する場合 、天然の親タンパクまたは微生物により産生された野性型ｂＦＧＦよりも、成熟 類似体はアミノ酸１個分だけ短い。

「精製した」または「純粋の」とは、天然の状態で見られる１通常それに付随す る物質を含まないものを意味する。従って９例えば「純粋の」酸性ヒ）　ＰＧＦ 　（ｈＦＧＦ）は、ヒトの脳または脳下垂体における本来の環境下で通常付随し ている物質を含んでいない酸性ｈＦＧＦを意味する。もちろん、「純粋」の酸性 ｈＦＧＦは、グリコシド残基のような、それと共有結合によって結合している物 質を含み得る。

「動作可能に連結した」とは、１ｆＬ分がその通常の機能を果たすように位置し ている連結部を意味する。従って、コード配列に動作可能に連結した。制御配列 またはプロモーターは。

このコード配列の発現に効果的である。

「制御配列」とは、　　ＤＮＡ配列、あるいは所望のコード配列に適切に連結し た場合、このような配列に適合した宿主においてその発現を有効にし得る配列を 意味する。このような制御配列には、少なくとも原核および真核宿主におけるプ ロモーターが含まれるが、任意に転写終止シグナルも含まれる。

発現を効果的にするのに必要な他の因子または補助的な他の因子もまた同定され 得る。ここで用いられるように、「制御配列」とは、単に、用いられる特定の宿 主において発現を効果的にするのに要求されるどのようなりＮＡ配列をも意味す る。

「細胞」または「細胞培養」、もしくはｒ組換宿主細胞」または「宿主細胞」と は、内容から明らかであるので、しばしば互換性をもって用いられる。これらの 用語は、直接の対象細胞を包含するが、もちろん、その子孫をも包含する。偶然 の変異あるいは環境め変化により、必ずしもすべての子孫が親細胞と正確に同一 でないことが理解されている。しかしながら、このような変化した子孫は、その 子孫が初めの形質転換細胞に与えられた所望の性質を保持している限り、これら の用語に包含される。この場合９例えばこのような性質は。

組換えＦＧＦの類似体を生産する能力であり得る。

（以下余白） Ｂ、一般的記載 本発明は成長因子タンパク類似体をコードするＤＮＡを提供し、この成長因子タ ンパク類似体は、２つの異った適用をされる。第一の適用はＦＧＦの適用と同様 であり、類似体は、血管形成および／または細胞の増殖または細胞の生存を助長 することにより１組織の修復を促進する。これらの精製された成長因子は一般に 、血管新生、再生および治療を促進するために、傷ついたもしくは病気にかかっ た組織に局所的に適用される。適当な対象としては、火傷、骨折、成形外科で扱 われるような外科的擦過傷、または治療を要する他のものがある。これら因子の 適用は治療を促進するので、それらはまた。

感染の危険を減少させる。

ＦＧＦが血管の新生を促進するということにおいて価値がある適応症には、骨折 、靭帯および腰の治療、ａ炎、および滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火傷、切 傷、裂傷、褥癒、および糖尿病患者に見られるような遅治應性潰瘍のような皮膚 の状態；および虚血症および心筋梗塞症時の組織治療時、が包含される。

創傷の治療を促進する類似体のほかに、脈管形成を阻害するＦＧＦ類似体を構築 し得る。ＦＧＦの脈管形成活性に拮抗的に作用しうるＦＧＦ類似体は、糖尿病性 の網膜症、および血管新生緑内障などの眼の網膜傷害；乾麿および後水晶体線維 増殖病などの皮膚病；慢性炎症；慢性関節リウマチ；アテローム硬化症；および 血管腫、血管繊維腫などのある種の良性および悪性の腫瘍、ならびに充実性腫瘍 の増殖のような高度に血管形成するある種の新生物；などの新生血管形成が主な 病変である。ある種の疾病を治療するのに臨床上有用である。

入手可能な賦形剤および担体を用い組換え技術により生産される成長因子の処方 は、当該分野で既知の標準的な方法により調製される。このタンパクは、所望で あれば、制御された放出システムの一部として１点眼剤、ローション、ゲル。

散剤、包帯剤または抗生物質のような付加的な活性成分を有する軟膏、として処 方され得る。

表面の障害に関して最も適当である局所的な投与においては１例えば、　１０ｎ ｇ／ｍｅ　−１００ｍｇ／　ｍｊ！の溶液；好ましい範囲は１０、／ｍ１−１０ ■／−の溶液を用いる標準的な局所的処方が採用される。そのような溶液は患部 に、１日あたり６回まで適用される。火傷への適用のようなある種の適用には、 １回で投与するのが好ましい。潰瘍への適用のような他の適用には。

複数回で投与するのが好適であり得る。もちろん軟膏または他の処方物の濃度は 、傷の程度または病期、ならびに患者の性質に依存する。はとんどの処方（プロ トコル）においては。

用量は時間が経過して傷跡が残る可能性が減少するにつれて減じられる。例えば 、第３度の火傷のような最も重症の傷は典型的には１１００Ｊｉ／ｍ１組成物で 処置される。しかし、治療が始まると、用量は傷が治療するにつれて徐々に約１ ０■／−またはそれ以下にまで下げられる。ＢＳＡを担体としたＥＧＦの局所的 処方は、　Ｆｒａｎｋｌｉｎ、　Ｊ、Ｄ、、ら、　Ｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｄＲｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃ　Ｓｕｒｇ（１９７９）　　６４　：　７６６−７７０．に開 示されている。

持続性の脈管形成に関連する疾病の治療には、　　ＦＧＦ阻害物質が適用され、 その処方物の濃度は投与の様式にかかわらず一般に１０倍高い。高い投薬量は、 　ＦＧＦ阻害物質が細胞内で生産されたＦＧＦと効果的に競合するのを確実にす る。このように乾審および後水晶体線維増殖病を治療するのに用いられるＦＧＦ 阻害物質の局所的投与のためには、投薬量は１０倍に増加させる。

関節炎ならびに骨および組織の治療には、標的の近傍に直接的に移入した皮下移 植物、ステープルまたは遅延放出性の処方物の手段により、投与が局所的になさ れることが好ましい。外科手術は骨の損傷のような状況に対しては必要となるこ ともあり得るので、直接的な注入が有利である。遅延放出型は、　　ｔｌｙｄｒ ｏｎ　　（Ｌａｎｇｅｒ、　　Ｒ１，ら、　　Ｎａｔｕｒｅ（１９７６）　２６ ３ニア９７−７９９）またはＥｌｖａｘ　４０Ｐ（Ｄｕｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒａ ｙ、　Ｊ、Ｂ、、ら、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９８３）的放出系は、　ｔｌｓｉ ｅｈ、　Ｄ、　Ｓ、　Ｔ、ら、　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　５ｃｉ（１９８３）７２：１ ７−２２により示唆されている。本発明では望ましくはないが、特に上皮成長因 子の処方がＢｕｃｋｌｅｙ、　Ａ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ（１９８５）８２　：　７３４０−７３４４に示唆されている。

局所的投与で、持続的な放出の送達については、処方物中のＦＧＦ濃度は、状態 の程度、３７℃におけるＦＧＦの安定性、該ポリマーからのＦＧＦの放出速度、 ならびにＦＧＦ類似体の作用物質または拮抗体の性質を含む多くの因子に依存す る。一般的に、その処方は、　Ｂｕｃｋｌｅｙら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）　（前出））により記載されているように、因子が血清レ ベルの約１００倍、または１組織濃度の１０倍の、定常的な局部的濃度を達成す るように構成される。５〜５０ｎｇ／ｇ湿潤重量の組織中のＰＧＦ濃度（６０ｎ ｇ／　ｇ湿潤重量でのＥＧＰに比べて）を基準として、１時間あたり５０〜５０ ００Ｊ１ｇＰＧＦの放出が許容され得る。

もちろん、その初期濃度は傷の程度または病状の進度に依存する。

網膜傷害および血管新生緑内障のような眼科学に一般的な疾病を治療するには９ 点眼剤処方物または眼への直接注入が２つの好適な投与経路である。これらの適 用のための液体の処方物が当該分野で一般に知られており、該液体処方物は。

緩衝液もしくは生理食塩水、または適当な賦形剤中の処方物を包含する。用量レ ベルは、　　１ｚ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｊｌ！の間で。

１日あたり２〜４回与えられ得る。

ＦＧＰは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αまたはＴＧ Ｆ−）　、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２）、および／ または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような他の成長因子と、協奏的に、そ して共動的にも働き得ると期待される。さらに、骨の治療に関しては特に、それ は副甲状腺ホルモンまたはカルシトニンの作用物質または拮抗体と共働して働き 得る。なぜなら、これらの化合物は骨の増殖および再吸収を促進するからである 。従って、所望の組織の治療をより効果的に達成するために９本発明のＦＧＦが 前述の因子の１つもしくはそれ以上と同じ組成でもしくは同じ処方で投与される 実施態様もまた１本発明の組成物および投与処方内に包含される。

ＦＧＦは、軸索の成長、神経再生、および神経単位の生存を促進させることに効 果的であるので、それは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のようなある 種の神経性の疾患。

筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経疾患および神経系の一般的老化の処置；そ してを髄および末梢神経の外傷に有効であり得る。これらの症状に対して薬剤を 投与するときには。

慢性関節リウマチおよび骨の治癒に関連して上に述べた処方と同様の処方で注入 することによるのが好ましい。この薬剤はまた。　　ＦＧＦを生産する細胞培養 物の注入という手段を用いて細胞培養物を注入するという手段を用いても送達さ れ得る。

神経性疾患の処置はまた。損傷を受けた神経組織の機能を置き換るために、新し い細胞または組織を移植することも包含し得る（例えば、パーキンソン病患者に おける副腎および胎児脳組織の移植）。このようなケースでは、移植の成功の度 合いならびに移植された組織の機能の程度は、移植に先立ちＦＧＦまたは本発明 の類似体調製物で細胞培養物または組織を処理すること、および／または移植の 後にＦＧＦまたは本発明のＦＧＦ類似体を投与することにより高められる。

ＦＧＦおよびその類似体はまた。髄液に直接注入され得るか。

またはカニユーレ挿入法（ｃａｎｕ　ｆａｔ　１ｏｎ）もしくは浸透圧ミニポン プを用いた投与により脳に注入され得る。または、それらは全身に適用され得る 。アテローム硬化症末梢神経疾患など。

ならびに腫瘍脈管形成については９手術時に最初から適切な場所に送達されるよ うに薬剤を投与するため、全身に投与するのが好ましい。

全身的処方は一般に当該技術分野で既知であり、緩衝液または生理学的食塩水、 または他の適当な賦形剤中の処方物を包含する。ＦＧＦ作用物質投与のための、 用量レベルは、傷を治癒させ得る程度のレベルである。しかし１組織培養または 体外移植組織の維持、アテローム硬化症または腫瘍脈管形成については、それは 、血清または培地の１．０〜１１００ｎ／ｍｊ！で供給され得る。

さらに、ここで述べているＦＧＦタンパクにより供給されるような脈管形成刺激 により、インビトロにおける。プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）およびコラ ゲナーゼの放出が起こる２６２３−２６２７　）。従って１本発明のＦＧＦタン パクもまた。これらの酵素に応答する状況の処置に有用である。急性な状況（発 作または心臓発作に関連する血液凝固物が存在するような状況）では、凝固物を 溶解するために大用量のＰＡを直接投与することが必要であり得るが、塞栓症を 形成する慢性的傾向に対する処置のためには、血流のＰＡの適当なレベルを維持 するためにＦＧＦを投与することが望ましいかもしれない。従って、この症状に 対して、筋肉内または皮下注射のような従来の方法を用いて、薬剤、特にヘパリ ン結合能力が低減した類似体の全身投与を行うことが好ましい。

本発明は、上記の症状に関連した用途に、純粋なＦＧＦ類似体の実際的な量を提 供する。ここでは特異的な成長因子が例示されており、その各々は少くとも３つ の形について明らかに活性がある。酸性および塩基性類似体はいずれも、上述の ように、置型、基本型、そして矩型で発現すると考えられる。

長壁のＮ末端メチオニンは、真核細胞系において該タンパクが生産されると切り 離されること、そして、続くアミノ酸残基が転写後におそらくアセチル化により 誘導されると考えられる。

種々の型のＦＧＦは認識されるシグナル配列を持たないが。

それは何らかの方法で分泌されているか、または細胞から回収されているに違い ない。なぜなら、それを産生じている細胞の外の、膜結合受容体で９作用するか らである。従って。

認識される構造分泌経路によっては分泌され得ないので、その分泌は１例えば細 胞溶解による。またはエキソサイトシス（開口分泌）による、あるいはヘパラン 硫酸またはヘパリンのようなグリコサミノグリカンとの会合によるような他の方 法で達成される。ＰＧＦが自然に誘導されるほとんどの組織においては、そして 多くの哺乳類の発現系においては、そのような放出は９通常に用いられているＡ ２３１８７　（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）のようなカルシウムイオノフオアでのエ キソサイトシスを行うことにより達成され得る。インビトロの状態においては、 カルシウムイオノフオアは、　　ｌ　ｍＭ　ＣａＣｌ２の存在下で１〜１０μＭ となるように培地に加えられる。マクロファージまたは単球に由来する発現系で は、リポポリ多糖（ＬＰＳ）を１０ｇ／＋＋＋１で添加するような、またはＥ、 ｃｏｌｉｘンドトキシン（Ｄｉｆｃｏ＞　（３００ｎｇ／＋＋＋１）を加えるよ うな他の活性化法が効果的であることが示されている。これらの刺激は、マクロ ファージ由来の類似因子インターロイキン１を放出することが示されている（Ｍ ａｒｃｈ、　Ｃ，Ｊ、　。

ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１５　：　６４１−６４７）。これらの 手法もまた。

以下で述べるように、付加的なシグナル配列なしで細胞内で生産されると１組換 えにより生産されるＰＧＦタンパクを放出させるのに採用され得る。細胞内で産 生じたタンパクの放出を起こさせる刺激には、ホルボールエステルおよびトリグ リセリドが包含される。

遺伝子回収 例示したＦＧＦをコードしている配列が得られるような一般いるのと同様である 。これらの参照文献の各々を、ここに参照文献として引用する。

（以下余白） ＦＧＦ遺伝子の発現 ここで記述するＤＮＡ配列は、適当な発現系で発現され得る。

もちろん、ここで開示したＤＮＡに対しても、ゲノムもしくはｃＤＮＡのＦＧＦ 配列を回収するための前述のプロトコルを繰り返す必要はなく、従来の化学合成 法が適当に用いられ得る。その他、塩基性ＦＧＦをコードする遺伝子は、寄託さ れたバタテリオファージλ８８２から回収され、そしてヒト型に変えられ得る。

部位特異的変異処理は、　　ＤＮＡを調節することにより。

あらゆる所望の形のタンパクを得ることを可能にする。ＤＮＡ配列は、バクテリ ア、酵母、あるいは真核細胞を含むどのような宿主にでも適した適当な制御を供 給し得る。典型的な制御配列ＤＮＡおよび宿主を以下のＣ１１０節で与えている 。

特に、ここに記述されているＦＧＦ類似体のいずれかをコードする完全なりＮＡ は１例えば、　ＦＧＦの各ＤＮＡ類似配列を得るために９組換え方法および合成 方法を組合せて用いながら構築され得る。これらの遺伝子配列は、　ＦＧＦコー ド配列に結合している都合のよい制限部位を用いて構築されている。そのため。

全遺伝子は、適当に消化された宿主ベクターに挿入するため。

約５０３ｂｐ　Ｎｃｏ　Ｉ−）１ｉｎｄＩＩＩ制限断片に挿入され得、Ｆ叶コー ド配列がベクター上に存在する制御配列と操作可能に連結される。

細胞内で産生された形態のＰＧＦタンパク類似体は細胞溶解により得られる。あ るいは細胞からのそれらタンパクの遊離は。

所望形態でタンパクを得るために、開裂部位に対するシグナル配列の既知の関係 を利用して遺伝子配列に融合した。異種シグナル配列を用いることにより刺激さ れ得る。プラスミドｐＵｃ９−ＴＳＦＩＩおよびｐＵｃ９ｄｅ　１８３−ｐＴＳ Ｆ−３のようなＥ、ｃｏｌｉ細胞と適合可能な制御系を利用する細菌の発現系は 、特に好ましい。この一部と、複数のクローニング部位ポリリンカーとを有する 。

このように産生された組換えＦＧＦタンパクを９次いで、天然起源からＦＧＦを 精製するために用いられる方法と同様の方法で精製する。しかし、このタンパク は出発材料の極めて大部分を占めているので、精製はかなり簡単である。

Ｂ、標準的方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、オリゴヌクレオチドの構築１部位特異的変異 処理の実施などに用いる技術の大部分は、当該分野で広〈実施されている。そし て、はとんどの従業者は、特異的条件および方法を記載している標準資料に通じ ている。しかしながら９便宜上、以下の節にその概要を示す。

Ｂ、１．宿主および制御配列 原核生物および真核生物の両方の系を用いて、　　ＦＧＦ類似体をコードする配 列を発現し得る；原核生物の宿主は、もちろん、クローニングに最も便利である 。最も頻繁に使われる原核生物は、　Ｅ、ｃｏｌｉのいろいろな株で代表される ；しかしながら、他の微生物の株も使用し得る。宿主に適合した種より導かれる 複製部位１選択可能なマーカーおよび制御配列を含むプラスミドベクター′Ｄ１ 用いりれる；ＩＦＪ−ｕＧＩ、し、Ｃ０ＩＩ＆ゴ、典型を用いて形質転換される 。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイタリン耐性の遺伝子を含 んでいる。従って、所望のベクターを構築する際に保持され得るかあるいは分解 され得るような、複数の選択可能なマーカーを与える。一般に用いた原核生物制 御配列（ここでは、リポソーム結合部位配列に加えて、任意にオペレーターを伴 った。転写開始のためのプロモーターを含むと定義される）は、−ラクタマーゼ （ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（（１９８５） ４０　：　１８３）のような一般に用いられるプロモーターを含む。

細菌に加え、酵母のような真核微生物も宿主として、用いられ得る。数多くの他 の株または種を一般に利用し得るにも′６ゝし１こｆＪｔｍ匹斤人（ｔ５’Ｊ入 ＆ａ、　　　５ｌＩｎｃロＣ０ｍ０．ｅＬ　　ａｌ、　　　ＩＴａＬＬＩｒＪｌ ｆｌｌ；ｊ／を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベクターに対する制御配列 は、解糖酵素の合成に対するプロモーター（Ｈｅｓｓ、　ｅｔ他のプロモーター には、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ、ｅ ｔ　ａｌ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８０）２５５：２０７３）が含まれる 。転写が増殖条件および／または遺伝的背景により制御されるという付加的利点 を有する他のプロモーターとしては、アルコール脱水素酵素２．イソチトクロー ムＣ２酸性リン酸氷解酵素、窒素代謝に関連する分解酵素、アルファー因子系、 マルトースおよびガラクトース利用に応答する酵素に対するプロモーター領域が ある。また、ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端に存在することが望 ましいと考えられている。このようなターミネータ−は、酵母由来の遺伝子にお いてコード配列に続く３”未翻訳領域に見い出される。

もちろん、多細胞生物由来の真核生物の宿主細胞培養中で。

ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも可能である。例えば、　Ａ ｘｅｌら、　４．．３９９．２１６を参照されたい。これらの系は、イントロン をスプライシングし得るという付加的な利点を有し、従って、直接用いることに よってゲノム断片を発現させ得る。有用な宿主細胞系列には、νＥＲＯ，）Ｉｅ Ｌａ、仔ハムスク−（７）腎＠（Ｂｌ（Ｋ）、　ＣＶ−１，ＣＯ３，ＭＤＣＫ、 　Ｎ１）ｌ　３Ｔ３．　Ｌ、　ソしテチャイニーズハムスターの卵巣（Ｃ）１０ ）の細胞が含まれる。

このような細胞に対する発現ベクターには、普通９例えば。

サルウィルス４０　（ＳＶ４０）由来の初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒ ｓら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）　２７３：１１３）、あるいはポリオーマ。

アデノウィルス２．ウシの乳頭腫ウィルスまたはトリの肉腫ウィルス由来のプロ モーターのようなウィルスプロモーターなどの、哺乳類の細胞に適合するプロモ ーターおよび制御配列が含まれる。制御可能なプロモーター、　ｈＭＴＩＩ　（ Ｋａｒｉｎ、　Ｍ。

ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　７９７−８０２）もまた使用 し得る。哺乳類の細胞宿主系における形質転換の一般的な様相は、　Ａｘｅｌ　 ＜前出）により記述されている。現在では９　“エンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅ ｒ）”領域も発現を最適化する際に重要であることは明らかである；これらは、 一般に、非コードＤＮＡ領域におけるプロモーター領域の上流側または下流側に 見られる配列である。必要に応じて、ウィルスを起源として、複製起点を得るこ とができる。゛しかしながら、染色体への組込みが、真核生物におけるＤＮＡ複 製における共通の機構である。

Ｂ、２．形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適した標準的技術を用いること により、形質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９７２ ）　６９　：　２１１０によって記述されたような塩化カルシウムを用いたカル シウム処理。

コールドスプリングハーバ−プレス、　Ｐ、　２５４．およびＨａｎａｈａｎ。

Ｄ、、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９８３）１６６：５５７−５８０によって記述 されたようなＲｈＣＩ２法は、原核生物または実質的な細胞壁障害を有する他の 細胞に対して用いられ得る。このような細胞壁を持たない補正された方法が用い られ得る。酵母への形質転換は、　Ｂｅｇｇｓ。

て実施し得る。

所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には、当該分野に 既知の標準的な連結技術および制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド 、　　［ｌＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形に、切断し、整え 、そして再連結する。　。

ベクターを形成するＤＮＡ配列は、数多くの供給源から利用し得る。もとになる ベクターおよび制御系は、一般に、構築の際に配列の大部分として用いられる。

利用可能な“宿主”ベクター上に見い出される。典型的な配列は、上記のＣ６１ ゜節に示されている。適切なコード配列に対して、最初の構築は９通常、　ｃＤ ＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、または寄託されたプラスミドか ら適当な配列を回収することである。しかしながら、この配列が開示されれば、 それぞれのヌクレオチド誘導体から出発して、インビトロで全遺伝子配列を合成 し得る。例えば、５００〜１０００ｂｐというかなりの長さの遺伝子に対する全 遺伝子配列は、それぞれに重複した相補オリゴヌクレオチドを合成し、そして一 本領の重複していない部分をデオキシリボヌクレオチド３リン酸の存在下でＤＮ Ａポリメラーゼを用いて充填することにより、調製し得る。この方法は、配列が 既知であるいくつかの遺伝子の構築において記述されたようなホスホトリエステ ル法、あるいはＢｅａｕｃａｇｅ。

ミグイト法のいずれかによって調製される。また、この合成オリゴヌクレオチド は市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製し得る。アニーニング前 の一本鎖のリン酸化（ｋ　１ｎａｓ　ｉｎｇ）あるいはラベルのためのリン酸化 （ｋｉｎａｓｉｎｇ）は。

５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）、　１０ｒｎＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオ スレイトール。

１〜２　ｍＭＡＴＰ　、　１．７ｐｍｏｌｅ　［λ）２Ｐｌ　−ＡＴＰ　（２， ９ｍＣ１／ｍｍｏｌｅ）　。

０、１ｍＭスペルミジン、　　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で、過剰量１例え ば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いることによって行われる。

所望のベクターの成分が利用可能な場合には、それらを標準的な制限方法および 連結方法を用いて切断し、そして連結し得る。

部位特異的なりＮＡの切断は、当該分野に既知の条件下で。

適当な１つの制限酵素（または複数の制限酵素）を用いて処理することにより行 われるが、特別なものでは、これらの市販の制限酵素の生産者によって指定され た条件下において行われる。例えば、ニューイングランドバイオラボの製品カタ ログを参照されたい。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２ ０μｌの緩衝液中で、１単位の酵素によって切断する；実施例においては、典型 的には、過剰量の制限酵素を用いてＤＮＡ基質を確実に完全分解する。変更する ことも可能であるが、約３７℃にて約１〜２時間にわたってインキュベーション し得る。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホルムで抽出すること により、タンパクを除去する。

さらに、引き続いてエーテル抽出を行い得る。エタノールを用いて沈澱させるこ とにより、水層から核酸を回収する。必要に応じて、標準的な技術を用いてポリ アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を行うことにより、切断され た断片を大きさによって分離し得る。大きさによる分離に関する一般的な記述は 、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８０）　　６５　： ４９９−５６０に見い出される。

制限酵素で切断した断片は、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ） の存在下で、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片（クレノー（ Ｋｌｅｎｏｗ）　）で処理することによって平端な末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ） にすることが可能である。インキュベーションは、　５０ｍ１リス（ｐＨ７，６ ）　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜６ｍＭＤＴＴおよび０．１ 〜ｌ　ｍＭ　ｄＮＴＰ中、２０〜２５℃にて１５〜２５分間にわたって行う。ク レノー断片は、５”一本領の突出部分を充填するが、たとえ４つのｄＮＴＰが存 在しても、突出した３°一本領を元に戻す（ｃｈｕｗ　ｂａｃｋ）。必要に応じ て、突出部分の性質によって受ける制限内で、唯一のｄＮＴＰ、または選択され たｄＮＴＰを与えることにより１選択的に修復し得る。クレノー断片で処理した 後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させる。適当 な条件下で、　ＳｌヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１で処理することにより、ど のような一本鎖部分をも加水分解し得る。

連結は、１５〜５０μｌの容量で、以下の標準的な条件および温度の下で行う： 例えば、　２０ｍＭ）リス−Ｃｌ　（ｐ）Ｉ　７．５）　、　１０ｍＭＭｇＣＩ ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　３３μｇ／ｍｆ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１，そして（“粘着末端”の連結に対しては）０℃にて４０μＭ　ＡＴＰ、 　０．０１〜０．０２（ワイス）単位の７４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ、あるいは（ “平端な末端”の連結に対しては）　１４℃にて１　ｍＭ　ＡＴＰ、　　０．３ 〜０．６（ワイス）単位のＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ。分子間の“粘着末端”の 連結は１通常、　３３〜１００μｇ　／ｄ（Ｄ全ＤＮＡａ度（５〜１１００ｎの 全末端濃度）で行う。分子間の“平端な末端”の連結は。

１μＭの全末端濃度で行う。

“ベクター断片”を用いたベクターの構築においては、５゛リン酸を除去し、ベ クターの自己連結を防ぐため、一般にベクター断片を細菌アルカリホスファター ゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理する。分解 は、約ｌＯｍＭ）リス−）Ｉｃｅ、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中、ｐｉ（８にてベク ター１μｇあたり、約１単位のＢＡＰまたはＣＩＰを６０℃にて、約１時間にわ たって用いることによって行う。核酸断片を回収するために。

調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させる。あるい は、別の制限酵素で分解し、不要な断片を分離することによって二重に分解され ているベクターにおいても再連結を防止し得る。

配列の修正を必要とする。　ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクター上の部 分に対しては９部位特異的な突然変異を用い得これは、突然変異させるべき一重 鎖ファージＤＮＡに対して。

限られた不一致以外は、相補的であって、所望の変異を示すプライマー合成オリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。

オリゴヌクレオチドプライマーのサイズは、突然変異が導入される遺伝子領域へ のプライマーの安定した）１イブリダイゼーシヨンへの必要性、ならびに現在利 用し得るオリゴヌクレオチド合成方法の限界により決定される。オリゴヌクレオ チド定方向突然変異に用いるオリゴヌクレオチドを設計する際に検討される要因 （例えば、全体のサイズズ、突然変異部位に隣接している部分のサイズ）は、　 Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、およびＧｉｌｌａｍ。

クレオチドの全長は、　　ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による 突然変異の編集を避けるのに充分なサイズであり、突然変異部位から５゛および ３°側に伸長したものとの突然変異部位でのハイブリダイゼーションをできるだ け安定で特異的なものとする。本発明に従って突然変異に用いられるオリゴヌク レオチドは９通常、約１８個から約４５個の塩基、好ましくは約２３個から約２ ７個の塩基を有する。それらは９通常。

３゛末端の変更された。もしくは欠失されたコドンの少くとも３個の塩基を有す る。

修飾されたｂＦＧＦ遺伝子の調製法は、一般に、他のアミノ酸をコードするよう にコドンを除去または変更する合成ヌクレオチドプライマーを用いて、　ｂＦＧ Ｆ遺伝子の特定のコドンに部位特異的変異処理を誘導することを包含する。欠失 が導入された場合、所望のタンパクを発現するためのＤＮＡ配列の適当な読み枠 が保持され得ることが確認されなければならない。

プライマーは、　ｂＦＧＦ遺伝子鎖がクローン化されている。　Ｍ１３゜ｆｄ、 またはデルタ×１７４のような一重鎖ファージに７１イブリダイズされる。ファ ージは、遺伝子のセンス鎖かまたはアンチセンス鎖を有すると理解される。ファ ージがアンチセンス鎖を有する場合、プライマーは、他のアミノ酸をコードする コドもしくはトリプレットの欠失を規定するコドンと適合しないが、突然変異を うけるコドンを有するセンス鎮領域と同じである。ファージがセンス鎮を有する 場合、プライマーは。

欠失されるコドンと対になるトリプレットにおける適当な不適合を除いては、突 然変異を受けるコドンを有するセンス鎖領域と相補的である。ハイブリダイゼー ションに使用され得る条件は、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、およびＧｉｌｌａｍ、　Ｓ 、　（前出）により記述されている。温度は９通常、約０℃から７０℃の間の範 囲であり、より一般的には約１０℃〜５０℃の間の範囲である。ノ＼イブリダイ ゼーションの後で、　ＤＮＡポリメラーゼＩ、　Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転 写酵素、または他の適切なりＮＡポリメラーゼを用いた反応により、プライマー はファージＤＮＡ上で伸長される。得られ兆ｄｓＤＮＡは、　Ｔ、ＤＮＡリガー ゼのようなりＮＡリガーゼで処理することにより、閉環状のｄｓＤＮＡに変えら れる。１本鎖領域を有するＤＮＡ分子は、　Ｓｌエンドヌクレアーゼ処理により 分解され得る。

得られた二本鎖のＤＮＡを、ファージを補助する宿主細菌に形質転換させる。形 質転換した細菌の培養液を上層寒天に注ぎ、ファージを含む単一細胞からプラー クを形成させる。

理論的には、新しいプラークの５０％は、一本領として変異型を有するファージ を含み；５０％はもとの配列を有する。得られたプラークをリン酸化した合成プ ライマーとノ＼イブリダイゼーションさせた後、正確に一致するものは結合し得 るが。

もとのＤＮＡ鎖と一致しないものは結合が阻止されるのに十分な、洗浄温度で洗 浄する。次いで、プローブとハイブリダイズするプラークを選択し、培養し、そ してＤＮＡを回収する。

Ｃ１４，構築の確認 以下に示した構築において、プラスミド構築に対する正し２０７）または他の適 当な宿主をライゲーション混合液で形質転換することによって確認する。好結果 の形質転換体は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性または他の抗生物質 耐性により選択するか、あるいは当該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存 した他のマーカーを用いて選択する。この規模のＤＮＡ調製法が一般に用いられ る（例えば、　ｔｌｏｌｍｅｓ、Ｄ、ｓ、。

１５５２により記載されているようなドツトプロット分析法や制されているよう なジデオキシヌクレオチド法、あるいはｔＪａｘａｍらＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８０）　６５　：　４９９の方法によって塩基 配列を決定する。

Ｃ６５０例示される宿主 ここで、クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿主株は、以下のとおりで ある： クローニングおよび塩基配列の決定に対して、そしてほとんどの細菌のプロモー ターの制御下における構築物の発現に対して、　ＭＣ１０６１，Ｄｌｌｌ、　Ｒ Ｒｌ、　Ｂ、　Ｃ６００ｈｆ１．　Ｋ２Ｏ２，ＨＢＩＯｌ、　ＪＡ２２１以下の 実施例は９本発明を例証することを意図したものであって１本発明を限定するこ とを意図したものではない。ＦＧＦの出発物質をコードするＤＮＡは、まずウシ のゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして中枢プローブを得９次いで。

付加的なりＮＡの修復を行うことによって得られた。しかしながら、中枢プロー ブの配列が、現在、既知であり、従って。

インビトロで化学的に構築し得るので、この方法を繰り返す必要はない。さらに 、ウシのａＦＧＦおよびｂＦＧＦ配列、ならびにヒトのａＦＧＦおよびｂＦＧＦ 配列を保持するバクテリオファージは。

アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。

このように、以下の実施例において突然変異を誘発する出発物質として使用され るＤＮＡ配列は１種の材料源から入手し得る。

実施例１ 第４図に示す１０個のオリゴデオキシヌクレオチドをホスホトリエステル法で合 成し次いで精製した。１と１０を除く各オリゴデオキシヌクレオチドの５００ピ コモルを、　６０ｍＭ　）リス−ｔｌｃ］（ｐＨ８）、　１５ｍ）Ｊ　ＤＴＴ、 　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２０　ｕ［：ｉの〔λ−３２Ｐ　〕−ＡＴＰおよび２ ０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ／Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を 含有する２０ｄ中で、別々に３０分間３７℃でホスホリル化した。これにさらに 、　　６０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８）、　　１５ｍＭ　ＤＴＴ。

１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　１．５ｍＭ　　ＡＴＰおよび追加の２０単位のポリヌ クレオチドキナーゼを含有する１０ｍを添加し、さらに３０分間３７℃でインキ ュベートした。インキュベートに続いて、得られた試料を５分間１００℃でイン キュベートした。１と１０のオリゴデオキシヌクレオチドの５００ピコモルを、 　　ＡＴＰを除いた上記緩衝液で３０扉に希釈した。

二本鎖対を構成する各オリゴデオキシヌクレオチド（例えば１と２．３と４など のオリゴデオキシヌクレオチド、第４図）の１６．７ピコモルを混合し、９０℃ で２分間インキュベートし１次いで室温まで徐々に冷却した。次いで各対を他の 対と結合して構築を行い、フェノール／クロロホルムで抽出し。

次いでエタノールで沈澱させた。得られたオリゴデオキシヌクレオチド対を、５ ｍＭ）リス−ｆｌｃＩ（ｐＨ８）、　　１０ｍＭλＩｇｃ］２．２０ｍＭ　ＤＴ Ｔを含有する３０Ｊ、Ｌｌ中で再構成させ、５０℃で１０分間加熱し。

次に室温まで冷却して、　ＡＴＰを最終濃度０．５ｍＭまで添加した。

次に、８００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを添加して得られた混合物を１２．５ ℃で１２〜１６時間インキュベートした。

得られた連結混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し。

このＤＮＡをエタノールで沈澱させた。乾燥したＤＮＡを再構成して３０１．１ １とし、　ＥｃｏＲＩとＰｓｔ　Ｉで、１時間３７℃にて消化した。得られた混 合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、　Ｌａ ｅｍｍｌｉら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７巻、６８０の方法にしたがっ て、８％　ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動法によって９種々の二本鎖ＤＮ Ａセグメントを分離した。

得られたＤＮＡ断片を、ウェットゲル・オートラジオグラフィ化によって目視で きるようにし、長さが約１００ｂｐに相当するバンドを切取って、前記したのと 同様にして一夜溶離した。

切取った合成のＤＮＡ断片を、同様にＥｃｏＲＩとＰｓｔ　Ｉで消化したプラス ミドＭ１３−ｍｐ８もしくはＭ１３−ｍｐ９　（ＭｅｓｓｉｎｇとＶｉｅｉｒａ の前記文献）に連結し１次いでジデオキシヌクレオチド配列分析法（Ｓａｎｇｅ ｒらの前記文献）に付して、第４図に示す設計された配列を確認した。この設計 された配列は、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）の、プロモーター（−３５と 一１０領域）とオペレーターの領域と、トリプトファンオペロンのリーダーペプ チドのリポソーム結合領域とを有する。第４図に示す配列とＧｅｎｅ　（１９８ ０）　９巻：　２７−４７．　　Ｉｋｅｈａｒａ、　　Ｍ、、らＰｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃｉプラスミドｐＫＫ２３３−２（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、　ａ ｎｄ　Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、の前記文末端に、クレノー断片（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｃ、　）を充填し、　ｄＡＴＰ、　ｄ［：Ｔ Ｐ、　ｄＧＴＰおよびＴＴＰを５０μＭ添加した。これを２５℃テ２０分間イン キュベートした。フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた 後、Ｎｄｅｌで消化した［ｌＮＡいたプラスミドはｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄｅ と命名された。

２０ナノグラムのプラスミドＰＫＫ−２３３−２−ＮｄｅをＥｃｏＲＩ　（！： 　Ｐｓｔ　Ｉで完全に消化した後、　Ｍａｎｉａｔｊｓらの前記文献１３３〜１ ３４頁にしたがって小つシ腸ホスファターゼで処理した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ　）　。ＥｃｏＲＩとＰｓｔ　１で消化することによって、（前 記の）　Ｍ１３ＲＦから得た合成のｔｒｐプロモーター／オペレーター配列の５ ０ナノグラムを、　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで消化したｐＫＫ−２３３−２− Ｎｄｅの１０ナノグラムと混合し、前記のＴ４−ＤＮＡ−！、！ガーゼで連結し 。

次いでＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１１ｐＰ−／ｌ’１ａｃｌに形質転換した。得ら れた形質転換体を、　１００ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ合成ｔｒｐプロモ ーター／オペレーターを含有するプラスミドＤＮＡの存在に対してスクリーニン グし９次に適切なプラスミドを分離してＰＴｒｐ−２３３と命名した。

（１９８６）前記文献（これら文献はすべて本願に引用されている）に記載のヒ トｃＤＮＡとゲノムライブラリーから塩基性ＦＧＦクローンを単離するためのハ イブリダイゼーションプローブを発生させるのに、ウシ塩基性ＦＧＦ　ｃＤＮＡ を用いた。

塩基性ウシＦＧＦとヒトＰＧＦとでは、２つのアミノ酸しか差異がない。すなわ ち、１２３位には、ウシタンパクはＳｅｔを有しているが、　Ｔｈｒを有し、１ ３７位には、ウシタンパクはＰｒｏを有し。

ヒトタンパクはＳｅｒを有している。これらの差異は、各場合。

単一のヌクレオチドの差異によるものであるから、ウシｃＤＮＡは９通常、下記 のように部位に突然変異を誘発させることによって、前記のヒトタンパクをコー ドするよう修飾され、実際には、標準の部位突然変異法を用いてこれらのコドン を変化させる。λＢＢ２クローン（ＡＴＣＣ番号４０１９６）をＥｃｏＲＩで消 化して、　ｂＦＧＦタンパクをコードする部分にかかっている１、　４ｋｂの領 域をＭ１３ｍｐ８のｌ、ｃｏＲＩ部位に連結し、適切な方向に挿入物を有するフ ァージを回収した。そのインビトロでの突然変異の誘発は、３つのオリゴヌクレ オチドつまり“汎用（ｕｎ　１ｖｅｒｓａ　Ｉ）”プライマーである１７−ｍｅ ｒ；コドン１２３のコード配列を変える突然変異誘発性の１６−ｍｅｒの５’　 −ＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧ−３’　；およびコドン１３７の配列を変 える突然変異誘発性の１７−ｍａｒの５’　−ＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣ ＡＧ−３’の存在下で実施される。また突然変異を誘発されたファージは、２度 目のインビトロでのブライマーによる突然変異誘発法に付され、突然変異誘発性 の２５−ｍａｒの５’　−ＴＴＴ’　　　ＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴ ＴＴＣＡＧ−３’　を用いて、翻訳終止コドンから３４ｂｐ下流に旧ｎｄＩＩＩ 部位を作る。得られた突然変ＤＮＡの配列を。

ジデオキシヌクレオチド配列分析法（Ｓａｎｇｅｒら、前記文献）で決定し、所 望の突然変異誘発が起こったことを確認し、　ＦＧＰをコードする領域にかかっ ている約６３０ｂｐ断片をＨｉｎｄｌで切取り、　ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐ Ｕｃ１３に連結し、中間体のプラスミドｐＪＪ１５−１を得た。

ｐＪＪ１５−１に含有されるコード領域の５“末端（最初の１２５塩基対）のＧ ＋Ｃ含量を低下させるために９合成りＮＡ断片を、以下の合成オリゴヌクレオチ ドを用いて、以下に示す配列で構築した。そのオリゴヌクレオチドをアニールし て対にし、順に連結し９次いで旧ｎｄｌＩｒで切断したｍ１３ｍｐ９に連結した 。ｍｐ９内の合Ｊ＆１２５ｂｐ挿入物の配列をジデオキシ配列決定法で確認した 。その合成挿入物のＮｄｅ　Ｉから）ｌｈａ　Ｉサブ断片を単離して。

塩基性ＦＧＦＯカルボキシル末端の約３／４をコードする配列にかかっているＪ Ｊ１５−１由来の１（ｈａ　Ｉから旧ｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片である３７７の塩 基対に連結し９次に発現ベクターＰＴｒＰ−２３３のＮｄｅ　１部位とｔｆｉｎ ｄＩｆｆ部位に連結して、プラスミドｐＴＦｓ１１を得た。

オリゴヌクレオチドは次のとおりである。

番号　　　　配　列 １６７０　　　５’−ｐＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＴ ＣＡＣＴＡＣＣ１６２３Ｒ５”−ｐＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡ ＣＧＧＴＧＧＴＴ１６２４Ｒ５°〜ｐＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣ’Ｃ’ＣＡＣＣＡ ＧＧＴＣ’ＡＣ’ＴＴＣＡＡ１６２５Ｒ５’−ｐＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣ ＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣ１６８０５’−ｐＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴ ＧＣＧＣＡ１６７９　　　５’　−ｐＴＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧ Ａ１６２２　　　５°〜ｐＴＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡ ＧＴＧＡ１６Ｉ９　　　５°〜ｐＡｃ［’ＴＧＧＴＧＧ［、ＡＡＧＧＣＡ［’Ｃ ＡＧＡＡ［’ＣＡＣＣ’Ｇ１６２６　　　５“−ｐＡＧＴＡＣＡＧＡＣＧＴＴＴ ＴＧＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＧＴＧ１６７３　　　５’−ｐＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡ ＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＴＴＴＴＧ［：（以下余白） ｂＦＧＦのアミノ末端領域に対する合成遺伝子の構造は次のとおりである。

ＨｉｎｄＩＩＩ　　Ｎｄｅ　１ ＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧ　ＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴ　ＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＣＣＴ ＧＣＣＡＧＣＴ　ＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡ　 ＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧ　ＧＧＡＣＧＧＴＣＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ［：ＴＴＣＡＣＧ ＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡＡＡＧ Ａ　ＣＣＣＡＡＡＡＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧ　ＡＣＣＡＣＧＧＡＡＧ　ＧＧ ＴＧＧＴ［：ＣＡＧ　ＴＧＡＡＧＴＴＴ（：Ｔ　ＧＧＧＴＴＴＴＧ［：Ａｈａ　 １ ＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡ　ＡＡＡＡＣＧＧＴＧＧ　ＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧ　ＣＧＣ ＡＧＡＣＡＴＧＡ［：ＧＴ　ＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＧ ＴＴＣＧＡｐＴｓＦｌｌのプラスミド遺伝子地図を、添付図面の第５図に示す。

実施例３ 突然変異を誘発された遺伝子挿入物の発現ベクターの調製プラスミドｐ　ＵＣ９ のボＩＪ　ＩＪンカー領域の旧ｎｄＩＩ［部位を除去して、第５図に示す最終の 発現ベクターへの突然変異ＤＮＡのサブクローン化を容易にした。約５■のｐｌ Ｊｃ９　（ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を、　ＨｉｎｄＩＩ［（２ ０単位；　ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、メーカーの指 示に従って０．０５ｍ７！中で消化した。次に反応物に０．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ とＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片（５単位；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｈｅｉｍ）を補充し、１５℃で３０分間インキュベートした。次に反応物を 、同体積のフェノール／クロロホルム（１／１）で２回、クロロホルムで２回抽 出し、　　０．２ＭＮａＣ１とし９次いで２．５倍体積のエタノールで沈澱させ た。得られた沈澱物を遠心分離〔４℃にてマイクロファージ（ｍ　１ｃｒｏｆ　 ｕｇｅ＞で１５．０００ｇ　〕によって集め、凍結乾燥し９次いでＩＸキナーゼ リガーゼ緩衝剤、１ｍＭＡＴＰｉ６よびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（２０単位；ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｆ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する０、　１ＷＬｌ中で、１ ２℃にて４時間インキュベートした。

反応生成物の一部ｃｏ、　Ｏｌｍｆ）を、コンピテントＭＣ１０６１細胞にトラ ンスフェクトするのに用いた。トランスフェクトされた細菌は、　　１００ｘ／ ＋＋＋１．のアンピシリンを補充したし寒天プレート上で一夜増殖させた。ＤＮ Ａを、アルカリ溶解法によって６個のコロニーから単離して、　ＨｉｎｄＩＩＩ 部位の喪失について試験した。プラスミドｐＬｌｃ９ｄｅｌＨ３−１を含有する 細菌を単離した。

このプラスミドＤＮＡを調製し、１０■をＰｖｕ　Ｉ　　（２０単位；　ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｌａｂｓ）とＥｃｏＲＩ　　（５０単位；ｎｅｗ　Ｅｎ ｇＩａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）とで、　　Ｏ，Ｗ中で、メーカーの指示にしたが って２時間消化した。次いで反応生成物を、同体積のフェノール／クロロホルム （１／１）で２回、同体積のフェノールで２回抽出して１次にイソプロパツール で沈澱させた。生じた沈澱物を遠心分離で集め、７０％エタノールで洗い、凍結 乾燥し、　　ｏ、ｏｏｇ−の水中に再懸濁させて、複製開始点を有する。　ｐＵ ｃ９ｄｅｌ）１３−１の約２、０７ｋｂのＰｖｕＩ　−ＥｃｏＲＩ断片（断片Ａ と命名）をアクリルアミドゲル電気泳動法で単離した。

同時にｐＴｓＦｌｌ　ＤＮＡ（１０ｇ）を、０．１５−中で、　Ｐｖｕ　Ｉ　（ １０単位）とＢｃｏＲＩ　　（１０単位）とともに、メーカーの指示にしたがっ て３７℃で１時間インキュベートして、上記のようにして収集した。Ｔｒｐプロ モーター／オペレーター領域、　ＦＧＦをコードする領域および転写終結配列を 有し、　ｐＴｓＦｌｌの断片Ｂと命名された。ｐＴｓＦｌｌの約１．３ｋｂのＰ ｖｕ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片を、ポリアクリＪＬ／７ミドゲル電気泳動法で単離 し、　ｐＵｃ９ｄｅｌＨ３−１の約２．０７ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断 片Ａに連結して、コンピテントＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ細胞にトランスフェクト するのに用いた。この細菌を。

１００■／ｍｌのアンピシリンを補充したし寒天プレート上で一夜増殖させた。

１つの組換え体ｐＨｃ９ｄｅ］Ｈ３−ｐＴＳＦ−３由来のプラスミドＤＮＡが単 離され、予想された制限地図を有することを示した（ＩＩｉｎｄＩＩＩはそのプ ラスミドを１回だけ切断したが、　ｌｉｎｄｍ　−ＥｃｏＲ１断片、旧ｎｄｌｌ Ｔ−Ｐｖｕ　１断片および）ｌｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片の大きさはそれぞ れ、約５６０と２９００ｂｐ、　８００と２７００ｂｐおよび５６０と２９００ ｂｐである。プラスミドｐＵｃ９ｄｅｌｌ１３−ｐＴＳＦ−３由来のＤＮＡを単 離し、メーカーの指示にしたがって、得られたＤＮＡの２００４を、１．０ｍｊ ｌ！で、１００単位の旧ｎｄ　ＩＩＩ　、　１００単位のＥｃｏＲＩ　、　５ｍ Ｍのスペルミジンとともに、３７℃で４時間インキュベートした。

反応物をブタノールで抽出し、その体積を０．７ｍＭに減少させ。

次に、上記のように、フェノール／クロロホルムとクロロホルムで抽出した。Ｄ ＮＡをエタノールで沈澱させて収集し、アンピシリン耐性遺伝子、複製開始点お よび２つの転写終始シグナルを有し、　ｐＵｃ９ｄｅｌ）１３−ｐＴＳＦ−３の 断片Ｃと命名された約２．９ｋｂの旧ｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ポリアク リルアミドゲルで２回続けて処理して単離した。このベクター断片は、インビト ロでの突然変異誘発によって変化させられたいずれのＤＮＡを発現させるのにも 好ましいベクターとして有用である。このベクターの構築物を第５図に示す。

プラスミドｐｌＪｃ９ｄｅｌＨ３−ｐＴＳＦ−３に非常によく似ており、多部位 ボＩＪ　ＩＪンカー領域に自然のままの旧ｎｄＩ］Ｉ部位を有するプラスミドｐ Ｕｃ９−ｐＴｓＦ１１も９組換え法によって調製されたＦＧＦ　（全形態）と本 発明の類似体のいずれをも発現する好ましいベクターとして用いることができる 。このベクターは、プラスミドｐＵｃ９とｐＴｓＦｌｌとをＰｖｕ　ＩとＥｃｏ ＲＩとで別個に消化して。

ｐＵｃ９から約２．０７ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩベクター断片を単離し 。

ｐＴｓＦｌｌからはｔｒｐプロモーター／オペレーター領域、　　ＦＧＦコード 領域および転写終結配列を有する約１．３ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片 を単離し、これら２つの単離された断片を連結することによって構築された。次 に、このベクターは、　Ｈｉｎｄｆｆｌ−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡカセットを適切 に消化されたベクター内に挿入し、Ｅ。

て教示されたように、　　ＦＧＦ類似体の遺伝子配列を発現するのに用いること ができる。

実施例４ 本願に記載のＦＧＦ類似体をコードするＤＮＡ配列のすべてを構築するのに、下 記のプロトコルを用いることができる。プラスミドＰＧＰｔ７９１０を、　ｐＴ ｓＦｌｌの約６０３ｂｐのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄＩ［［ＤＮＡ断片（Ｔｒｐプロモ ーター領域とヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡを含んでいる）をＭ１３ｍｐ９ベ クターのＥｃｏＲＩ　−）１ｉｎｄＩ１１部位に連結することによって構築した 。ＦＧＦｔ７９１０の一本鎖ＤＮＡを単離した後。

ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈの前記の文献に記載されているインビトロでの突然変 異誘発を９本願のいずれかの表に示されている合成オリゴヌクレオチドの１つ以 上を利用して行うことができる。

部位特異的突然変異誘発の条件は次のように概括することができる。ＩＪｉｇの 一重鎖ＤＮＡを、５ｎｇのホスホリル化突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（適 当な突然変異をコードする２３〜２５ｍｅｒのもの）と１ｎｇのＭ　１３汎用配 列決定用ブライマー（Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社より購入した１７ｍ ａｒのもの）とともに、　　１０ｍ１４　　トリス−１（ＣＩ　　（ｐＨ７，５ ）およびｌｏｍＭ　Ｍｇ’ＣＩｚの溶液０．０１ｍｆ中で、５〜１５分間５５℃ でハイブリッドさせる。反応物を室温まで冷却し、０．０１−の０．１２ｍＭ　 ｄＸＴＰｓ、　　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片５単位＜ＢｏｃｈｅｉＢ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、　２０単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）に添加し、１５℃で４〜６時間インキュベート した。次に反応物の一部（０，００２ｍＡ’）をコンピテントＪＭＩＯＩ細菌に 添加し、Ｌ寒天プレート上で。

３７℃にて一夜プレート化を行う。得られたＭ１３のクローンのＤＮＡを２枚の ニトロセルロースのフィルターの各々に移し。

減圧下８０℃で２時間焼き１次いでプレハイブリダイゼーション溶液：　６　ｘ ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭ　　クエン酸ナトリ ウム、　ｐＨ７，０）　、　　０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、２Ｘデンハー トの溶液（０，０５％フィコール、０．０５％ポリビニルピロリドン、０．０５ ％ウシ血清アルブミン）および０．４ｍｇ／ｍＡの変性サーモン精液ＤＮＡ中で 、４２℃にて２時間インキュベートする。次いで上記フィルタを、５°末端を〔 λ−３２Ｐ：ｌ　−ＡＴＰで標識付けした適当な突然変異誘発性オリゴヌクレオ チドと１４ポリヌクレオチドキナーゼとを含有する新鮮なプレハイブリダイゼー ション溶液とともに４２℃で３時間インキュベートした。次にフィルターを、　 　４ＸＳＳＣを用いて室温で１５分間２回と、６５℃で１５分間１回、およびＴ 　Ｍ　Ａ　［：　Ｌ溶液（３ｍＭ　　テトラメチルアンモニラクロリド、　５０ ｍＭ　　）リス−１（ＣＩ　ｐＨ８，０、２ｍＭＥＤＴＡ、　０．１％５ＯＳ） 中で室温にて１回と、　ＴＭＡＣＬ溶液中で６５℃で１回洗浄して、−夜室温で Ｘ線フィルムに暴露するのに用いる。Ｘ線フィルム上の黒い陽画に対応するクロ ーンを元のプレートから採取し、　　ＤＮＡを単離し９次いでジデオキシ配列決 定法によって、突然変異した配列の分析を行う。２つのオリゴヌクレオチドが二 重の突然変異体を産生ずるのに用いられている場合は、一方のフィルターは、一 方のオリゴヌクレオチドでスクリーニングされ、他方のフィルターは第２のオリ ゴヌクレオチドでスクリーニングされる。二重の突然変異体は９両者のオリゴヌ クレオチドに対して正のシグナルを持っている。

突然変異したＭ１３クローンのＤＮＡ複製型を調製し、　ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、突然変異ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を、アガロースゲル電 気泳動法で単離する。得られたＤＮＡ断片を、　ｐＵｃ９ｄｅｌＨ３−ｐＴＳＦ −３の断片Ｃ（実施例３に記載し、第６図に示す）連結し、コンピテントＨＢＩ ＯＩ細胞にトランスフェクトし１次いで１００ｘ／ｍｊ２のアンピシリンを補充 したし寒天プレート上で一夜増殖させる。コロニーを選択し、　　１００ｘ／ｍ ｆのアンピシリンを補充したしブロス中で増殖させ９次いでプラスミド形質転換 するのに用いる。

（以下余白） 実施例５ この実施例では、ヒト塩基性ＦＧＦタンパクの３４位と１０１位のシスティン残 基をセリン残基に変化させることにより二重突然変異を製造した。突然変異原性 の２３−ｍｅｒの５’　−ＡＣＧＴＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧ− ３’け２０２２）　（コドン３４の配列を変える）、および突然変異原性の２３ −ｍａｒの５’　−ＴＡＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’（ ＄２３２３＞　（コドン１０１の配列を変える）の各々約２塊を、５０４のＩ× キナーゼ／リガーゼ緩衝液（７錘トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，６゜１０ｍｍ　Ｍｇ Ｃｌ２．　５ｍｍ　　ジチオトレイトール）中、１ｍＭＡＴＰと５単位のＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼとともに、３７℃で３０分間インキュベートした。ホス ホリル化されたオリゴヌクレオチドを、１ｍＭ）リス−〇ＣＩ　ｐＨ８，０と１ 　ｍＭ　ＥＤＴＡで２倍に希釈した。

−重鎮のＭ１３鋳型ＦＧＦｔ７９１０の１■を、ホスホリル化されたオリゴヌク レオチドの２２２２と２３２３各々２０ｎｇと汎用のＭ１３配列決定用のプライ ７−　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）のｌｎｇとともに、　　 １０１１１１１１　　トリス−）ｔｃｌ　ｐＨ７，５と１０ｍｍ　ＭｇＣｌ２の １０ｕｌ中、５５℃で２０分間および室温で１０分間インキュベートした。反応 混合物に、　　０．５ｍＭ　ｄＸＴＰｓ、　　ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ 断片５単位、１ｍＭＡＴＰおよび２０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを補充し、１５ ℃で５時間インキュベートした。得られた反応混合物２扉を。

コンピテントＪＭＩＯ１細菌を形質転換するのに用いた。得られた形質転換細胞 を３７℃で一夜プレート上で培養し、得られたＭ１３ＤＮＡを前記のようにして ニトロセルロースのフィルターニ移した。各オリゴヌクレオチド（Ｊｔ２２２２ と＄２３２３）　１　ｇを、　　１ｍ［：ｉの〔λ−”Ｐ）　−ＡＴＰ（ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　＃ＮＥＧＯ３５Ｃ，約５ｍＣ１／ナノモル ）を冷ＡＴＰの代わりに用いること以外前記したのと同様にしてホスホリル化し た。得られた放射性プローブを。

二重フィルターに各別に添加し、前記したのと同様にして処理した。得られたオ ートラジオグラフからの正シグナルに対応するＭ１３クローンを単離し、　Ｓａ ｎｇｅｒらの前記文献の方法によって、−重鎮Ｍ１３　ＤＮＡを製造した。得ら れたＭ１３　ＤＮＡ鋳型（＃８７２５）を、ジデオキシ配列決定法によって分析 した結果、予想した変化が含まれていることが分かった。

Ｍ１３鋳型＄８７２５の二重鎖複製型分子（ＲＦ）を、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａ ｎｄ　Ｄａｖｙ。

Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９７９年）７巻、　１５１３〜１５１９頁の 方法で単離した。この方法では、感染されたＪＭＩＯＩから単離した５０扉の１ １３フアージ＄８７２５を、　５０ｍｊ！のＪＭＩＯＩ培養物（飽和培養物、Ｊ ブロスで２０倍に希釈）に接種するのに用い１次いで３７℃で６時間増殖させた 。細菌を遠心分離によって集め、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄｏｏｌｙの前記文 献に記載したのと同様にしてＤＮＡを単離した。

約５Ａ１ｇのＲＦＤＮＡをメーカーの説明どおりにＩ　ＸＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液 ０．４ｍｊｌ！中で、　ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１の各々４０単位によって、 ３７℃にて２時間かけて切断した。次に反応混合物を１等体積のフェノール／ク ロロホルム（１／１）で２回とクロロホルムで２回抽出し次いでエタノールで沈 澱させた。得られたＤＮＡを遠心分離によって採集し、７０％エタノールで洗い 、凍結乾慢し１次いで２０扉の１ｍＭ）リス−）１ｃＩ　ｐＨ８，０と１　ｍＭ 　　ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。得られたＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄＩｎ断片を、メ ーカーの指示にしたがって、　ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　（ＢＩＯＩＯＩ　Ｉｎｃ、 　；米国、カリフォルニア州、う・ジョラ）を用いてアガロースゲル電気泳動法 で単離した。約５０ｎｇのＥｃｏＲＩ　−）１ｉｎｄＩＩＩ挿入物を、　ｐＨｃ ９ｄｅｌＨ３−ｐＴＳＦ−３のＥｃｏＲＩ　−ＨｉｎｄＩ［Ｉベクター断片Ｃに 連結して、コンビテン）　ＭＣ１０６１細胞を形質転換するのに用いた。ＦＧＦ 類似体を精製するために、得られた細菌を実施例７に記載したのと同様に処理し １次に精製された類似体を、副腎皮質内皮（ＡＣＥ）細胞を刺激する性能につい て、実施例８に示すようにして試験した。

システィンからセリンへの置換部分を有する他の突然変異体を構築して細菌中に 発現させた。これらの構築物は１〜４個のＣｙｓ→Ｓｅｒ置換部分を有している 。これら置換部分すべてによって、各種レベルの活性をもったＦＧＦタンパクが 得られる。物理的な構築物を下記第１表に挙げる。これらのＦＧＦ類似体タンパ クは各々ヘパリン親和性カラムを用いて単離した。

（以下余白） 注：上記の凡例は、以下の表と、類似の説明のすべてに適用できる。特定のアミ ノ酸を示す一文字のコードは次のとおりである。

（以下余白） アスパラギン酸　　　　　　Ａｓｐ　　　　　　　　　［］グルタミン酸　　　 　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　Ｅメチオニン　　　　　　　　Ｍｅｔ　 　　　　　　　　Ｍフェニルアラニン　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　　　　ｐト リプトファン　　　　　　Ｔｒｐ　　　　　　　　　＠チロシン　　　　　　　 　　Ｔｙｒ　　　　　　　　　Ｙバリン　　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　 　　Ｖ以下の第２表に記載したｂＦＧＦ類似体の、ウシの副腎皮質内皮細胞の増 殖を刺激する性能について試験した。以下に示すように、二重突然変異体のｂＦ ＧＦ−［７８／９６Ｓは、活性が野生型ｂＦＧＦよりも増大している。保存位置 ３４と１０１．すなわちヒトとウシのａＦＧＦ、　　ウシとアフリカッメガエル のｂＦＧＦ、マウス１ｎｔ２゜ヒ）　ｈｓｔおよびヒ）　ＫＳ３を含むＦＧＦ類 縁分子のファミリー全体を通じて保存されている位置のシスティンが変ると、生 成した類似体の活性は著しく減少した。

第２表 ＡＣＥ細胞増殖測定法によるｂＦＧＦと各種システィン類似体の活性ＦＧＰ類似 体　　　　　　　　　　　　活性度（％）野生型ｂＦＧＦ　　　　　　　　　　 　　　　１００Ｃ７８Ｓ”　　　　　　　　　　　　　　　　　５３Ｃ９６Ｓ” 　　　　　　　　　　　　　　　　　９５Ｃ７８／９６Ｓ”　　　　　　　　　 　　　　　　１５９Ｃ３４／ｌ０ＩＳ　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｃ３ ４／７８／ｌ０ＩＳ”　　　　　　　　　　　　　　２Ｃ７８／９６／ｌ０ＩＳ ”　　　　　　　　　　　　　　２３Ｃ３４／７ｇ／９６／ｌ０ＩＳ”　　　　 　　　　　　　　　７０２個の別個の測定値の平均 ＋３個の別個の測定値の平均 実施例６ ｂＦＧＦ類似体とヘパリンとの相互作用は、ヘパリン−セファロース樹脂からタ ンパクを溶離するのに必要なトリス−塩酸緩衝溶液のイオン強度（ＮａＣ］濃度 ）によって特性が決定される。この分析法によってヘパリン−セファロース樹脂 に結合したｂＦＧＦ類似体を除去するのに要するＮａＣ１の濃度が測定される。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国、カリフォルニア州、リッ チモンド）が、ヘパリンをＢｌｏ−Ｇｅ１　ＴＳＫ−５０樹脂に導入することに よってヘパリン−５Ｐｌｔカラムを製造した。このカラム（７５Ｘ７．５ｍｍ内 径；４〜６ｍｇ／ｍｌのヘパリン）を、２台のＢｅｃｋｍａｎ　ｌｌ０Ｂ型５ｏ ｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｍｏｄｕｌｅ、　　１台のＢｅｃｋｍａｎ　４ ２１型制御器および１台のＫｒａｔｏｓ　Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｏｗ吸光度検出器 ７５７型とともに使用した。試料を０．５Ｍ　ＮａＣ１、２０ｍＭ　　）リス− １１ｃＩ　ｐＨ７，５中のカラムに入れ９次いで０．６〜３．０Ｍの勾配液で溶 離した。タンパクを２１４ｎｍにおける吸光度で監視した。各種の試料の伝導率 を試験し、　ＮａＣｌ緩衝標準溶液と比較して、上記勾配液のＮａＣ１濃度を決 定した。吸光度検出器で得たデータを集め、　ＡｃｃｅｓｓｏＣｈｒｏｍ（Ｎｅ ｌｓｏｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）を用い て分析した。

実施例５のシスティンが置換されたＦＧＦ類似体をヘパリンＨＰＬＣで分析した 。類似体のｂＦＧＦ−Ｃ７８／９６Ｓは、ジチオトレイトール処理ありの場合（ 第７図ａ）とジチオトレイトール処理なしの場合（第７図ｂ）に単一の種として 溶出する。このことは、野生型ｂＦＧＦが、ジチオトレイトール処理された場合 には単一の種として溶出するが（第７図ｃ）、還元剤が存在しない場合は非相同 性の種として溶出する（第７図ｄ）のと著しく異なっている。その上、この二重 突然変異体は、野生型ｂＦＧＦの場合のように逆層１（ＰＬＣまたはサイズ排除 クロマトグラフィーによって分析された場合、全く非相同性を示さない。

単一のシスティンが置換された突然変異体のＣ７８ＳとＣ９６Ｓは。

上記のように分析した場合、得られた生成物の非相同性が野生型ｂＦＧＦに比べ て減少する。

同じ上澄み画分の分裂促進活性を、以下に述べる内皮細胞増殖測定法またはＢａ 　］　ｂ／ｆＴ３Ｔ３チミジン補足測定法（ｔｌａｕｓｃｈｋａら（１９８６年 ）　、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２６１巻、　１２６６５〜１２６７４頁）を 利用して試験した。

この実施例では、約１００■の組換え体ｂＦＧＦを、細菌から単離する方法を述 べる。この方法は、大量を得るために規模を大きくすることができる。適切なプ ラスミドを有する細菌を。

１００、ｃｗ／ｒｎ１のアンピシリンを補充したしブロス中で一夜増殖させる。

１ｘＭ９塩（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記文献）０．４％グルコース。

２ｑ／ｍｆ＋７　ミニ／、　２００ｑ／ｍｊ？　Ｍｇ５０４−７Ｈ２０，０，５ ％　カザミノ酸、　１００μＭ　ＣａＣｌ２および１００．ｑ／蔵７７　ヒ’ｙ リン含有の１００ｄ中に、０．２ｍｊｌ！の培養物を接種し、振盪機にて３７℃ で増殖させる。

５５０ｎｍの波長で光学密度が０．１に達した時、培養物に、　２０．／ｉｆの インドールアクリル酸を補充する。光学密度が１．０に達した時、細菌を遠心分 離（５０００ｒｐｍ、　４℃、１５分間）によって採集し、ドライアイス／エタ ノール浴中で急速凍結させ一８０℃で貯蔵する。細菌のペレットを、　０．０２ Ｍ　　）　ＩＪスー塩酸ｐ）１７．５゜０．６Ｍ　ＮａＣｌ、　　１ｍＭ　ＰＭ ＳＦ、　８０ｎｇ／ｒｒｄ！アプロチニンおよび１０゜のりゾチームを含有する １、　Ｏｍｊｌ！中に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートする。得られた 混合物を、　５ｏｎｉｃａｔｏｒ　　Ｃｅ１ｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒ　（加熱シス テム）を用いて３のセツティングで５回超音波処理を行う。反応生成物を、　Ｄ ＮアーゼＩ　（１００単位）とＲＮアーゼＡ　（１００単位）とともに１５分間 ４℃で培養し９次いで１５分間４℃にて１０．０００ｒｐｍで遠心分離する。３ ．０Ｍ　ＮａＣｌ、　１０ｒｎＭトリスー）１ｃＩ　ｐＨ７，５で予め洗浄し、 　０．６Ｍ　　ＮａＣｌと０．０２Ｍ　）リス−）ＩＣＩ　ｐＨ７，５で平衡化 された８、　Ｏｍｊ！のヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社 ）に、上記の遠心分離で得られた上澄み液を注入す°る。２８０ｎｍの吸光度か ら判定してタンパクが検出されなくなるまで、カラムを０．６Ｍ　ＮａＣ１で洗 浄する。

次いでカラムを１．０Ｍ　　ＮａＣ１で洗浄し、結合物質を、　　２．０ＭＮａ Ｃ１，２０ｍＭ　　）リスー肛１ｐ８７．５で溶離する。生成物質の精製は、５ ｍＭのジチオトレイトールの存在もしくは不在下の緩衝液中で行うことができる 。

Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　（１９８５ 年）１２２巻、　３２３−３３２頁、に記載されている副腎皮質も管内皮（ＡＣ ε）細胞増殖測定法で、　ＦＧＦ類似体の野生型ＦＧＦに対する活性物質活性も しくはアンタゴニステト活性を試験する。個々の類似体を以下のようにして試験 した。約Ｉ×１０４の細胞を、１０％仔ウシ血清。

５０単位／ウェルのペニシリンおよび５０単位／ウェルのストレプトマイシンを 補充したＤＭＥ１６の２ｒｒ１１を入れたフアシヨン（Ｆａｌｃｏｎ）　　６ウ エルプレートにプレートした。各試料と野生型（ウシ脳下垂体塩基性）　ＦＧＦ の適当な希釈物（ｌｐｇ／ｍｊｌ！から１ｇ／ｍｅの最終濃度まで）の１０．ｄ を、細胞に添加した。負の対照として、　　ＦＧＦ試料を添加していない６ウエ ルを同時に試験した。プレートは３７℃で４８時間インキュベートし、細胞試料 は、適当なウェルに再添加され、さらに３７℃で４８時間インキュベートした。

次に細胞をトリプシン処理して、収集し、コールタ−カウンターで計数した。

ＡＴＣＣから入手したＢａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３細胞を用い、　ｆｌａｕｓｃｈｋａら 、　１９８６年の前記文献に記載の方法によって、　ｂＦＧＦ製剤の時にＤＮＡ 合成を刺激する性能を試験した。４．５ｇ／ｆｆグルコース、　２．２ｇ／βＮ ａＨＣＯ，，５０単位／ｍ１のペニシリン、５０■／−のストレプトマイシンお よび１０％仔ウシ血清（ＨＹ［ＬＯＮＥ）を含有するダルベツコの改質イーグル 培地（Ｄ！ＪＥ；ＧＩＢＣＯ）の０．２ｍｌに、約２０．０００／ウエルの密度 で９６ウエルプレート上に細胞を播種し、５％Ｃ０２゜９５％空気のインキュベ ーター内で３７℃にて、集密するまで（２〜３日間）増殖させた。培養物を、０ ．０１％　ウシ血清アルブミン含有の血清なしの培地に移した後、試験物質の適 切な希釈物０．０１ｍｆを添加した。培養物をさらに１６時間３７℃で培養し、 その後、培地を、０．０１％ウシ血清アルブミン＋５０μＣｉ／ｄの〔３Ｈ〕チ ミジンを含有する血清なしの培地に変更した。

次にプレートを２時間培養した後、　　ＴＣＡの沈降性カウントを次のようにし て測定した。９６ウエルのプレートを氷上に置き。

培地を注意深く取外し、冷ＰＢＳで２回洗浄し９次いで１０％トリクロロ酢酸と ともに４℃で２０分間培養した。残留放射性物質を０．ＩＮ　ＮａＯＨで可溶化 してカウントした。

これらの測定法を、野生型塩基性ＦＧＦに対する。　ＦＧＦ類似体それぞれの活 性物質活性もしくは拮抗体活性を試験するのに用いた。ＦＧＦ類似体が塩基性Ｆ ＧＦに対する拮抗体として作用する可能性は、１〜１１０００ｎのような適当な 量の特定の類似体とｌｎｇの塩基性ＦＧＦを混合し、その混合物を上記の測定法 で試験することによって確認される。

いくつかのオリゴヌクレオチドを構築し、　　ＦＧＦレセプター競合的結合測定 法で試験した。特異的突然変異体を以下に示すが、単一アミノ酸の置換体、二重 アミノ酸の置換体および欠失体、突然変異体が含まれている。

（以下余白） 表１ 類似体　　　　　　　オリゴヌクレオチド番　号０ｂＦＧＦ−に３５Ｓ　　　　 　５’−ｐＧＴＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴ　　　２５５３ ｂＦＧＦ−Ｒ４２Ｌ　　　　　５’−ｐＴＴＴ［：ＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣ ＡＣＣＣＣＧ　　　２３２７ｂＦＧＦ−Ｄ４６Ａ　　　　　５’−ｐｃＡＴ［： ＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧ　　　２２２１ｂＦＧＦ−Ｒ４８Ｌ　 　　　　５“−ｐｃｃｃ［’ＧＡ［：ＧＧＣＵＴＡＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧ　　　 ２４５４ｂＦＧＦ−Ｒ４８Ａ　　　　　５’−ｐＡＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＡ ＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧ　　　２５５５ｂＦＧＦ−Ｄ５０Ａ　　　　　５’−ｐＣ ＧＧ［：ＣＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＣＧＣＧ　　　２２２４ｂＦＧＦ− Ｖ５２Ｋ　　　　　５°−ｐＧＡＧＴＧＧＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＧ ＡＧ　　２４９１ｂＦＧＦ−Ｒ５３Ｌ　　　　　５’−ｐＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣ ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧ　　　２２２０ｂＦＧＦ−に５５Ｍ　　　　　５’ −ｐＧＧＴＣＣＧＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧＡＣＣＣＡＣ２２２３ｂＦＧＦ−に５ ５１　　　　５’−ｐＧＧＴｃｃＧｃＧＡＧＡＴＡＡＧｃＧＡ［：Ｃ［：ＡＣＡ 　　　２５６７ｂＦＧＦ−Ｄ５７Ａ　　　　　５’−ｐＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧ ＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＣＡ　　　２２２５ｂＦＧＦ−１１５９Ｎ　　　　　５’ −ｐＧＡＧＣＧＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＡＣ２３８３ｂＦＧＦ−Ｒ９ ０Ｔ　　　　　５°−ｐＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＴＣ３ ０８８ｂＦＧＦ−０９９Ａ　　　　　５°−ｐＡＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＡ ＧＴＧＴＴＴＣＴ　　　２３８１ｂＦＧＦ−ＥｌｏｏＡ　　　　　５’−ｐＧＴ ＴＡ（：ＡＧＡＵＧＣＣＴＧＴＴＴ（：ＴＴＴＴＴＴＧ　　２５４９ｂＦＧＦ− ＥｌｏｏＳ　　　　　５’−ｐＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＧＴＴＴ［：Ｔ ＴＴＴＴ　　２３８０ｂＦＧＦ−Ｅ］０５Ｓ　　　　　５°−ｐＧＴＴＴｃＴＴ ＴＴＴＴＴｃＡ［：ＧＡＴＴＧＧＡＧＴ　　　２５５６ｂＦＧＦ−Ｒ１０６Ｌ　 　　　　５’−ｐＣＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＡ　　　２４ ９４ｂＦＧＦ−Ｅ１０８Ａ　　　　　５’−ｐＴＧＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣＡＴＣ ＴＡＡＴＡＡＣＴＡ　　　２５５４ｂＦＧＦ−Ｙ１１２Ａ　　　　　５’−ｐＡ ＧＴＣＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＧ　　２４５０ｂＦＧＦ−Ｎ １１３Ｓ　　　　　５’−ｐＣＴＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＧＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧ 　　　２４５２ｂＦＧＦ−Ｒ１１６Ｔ　　　　　５’−ｐｃＡＡＴＡ［：ＴＴＡ ＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡ　　　３０９１ｂＦＧＦ−Ｒ１１８Ｌ　　　　 　５’−ｐＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴ　　　　２４８３ ｂＦＧＦ−に１１９Ｓ　　　　　　５’−ｐＡＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＡ ＣＡＣＣＡＧＴＴＧ　　　２５４８ｂＦＧＦ−（４，１−４３）　　　　５°− ｐＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＡＣＧＧ［：　　　２３３６ｂＦＧ Ｆ−（４９−５１）　　　　５’−ｐＣＣＣＧＡＣＧＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＧ ＡＧＡＡＧ　　　２３３５ｂＦＧＦ−（６２−６４）　　　　５’−ｐＣＣＡＣ ＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧ　　　２３３４ｂＦＧＦ−（８３− ８５）　　　　５’−ｐＧＣＡＡＡＣＬ：ＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡ 　　　２３３３ｂＦＧＦ−（１０５−１０７）　　　５’−ｐＴＧＴＴＴＣＴＴ ＴＴＴＴＧＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＣ２３３２ｂＦＧＦ−（１１２−１１４）　　 　５°−ｐＧＡＧＴｃＴＡＡＴＡＡｃＴＡ［：ＣＧＧＴＣＡＡＧＧ　　　２３３ ７（以下余白） プラスミドｐＵｃ９ｄｅｌＨ３−ＰＴＳＦＩＩ−３もしくはｐＬＩｃ９−ｐＴＳ Ｆ　１１のような適当な発現ベクターを用い、実施例７に記載したのと同様にし て、　　ＦＧＦ類似体を調製し、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーで 単離した。

競合結合測定法は、　　ＦＧＦレセプターに対する組換え塩基性ＦＧＰの相対的 親和性と比較したＦＧＦ類似体の相対的親和性を測定するために確立された。Ｆ ＧＦレセプターに対して高い親和性を有し９分裂促進活性を減少させた類似体は 、潜在的ＦＧＰ拮抗体と呼ばれている。

この測定法は、各種濃度の未標識のＦＧＦもしくは類似体の存在下で、飽和濃度 の［１２Ｊ）−塩基性組換えＦＧＦ　（１０ｎｇ／ｍｊりをＢａ１ｂ／ｃ３Ｔ３ 細胞に結合させて行われる。その結合は、平衡に達するまで４℃で３〜４時間行 われる。次いで細胞は、１２倍の、０．１％ゼラチン、　ｐＨを７．５に保持す るために５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含有する２Ｎ　Ｎａ１ｌで調製された塩類溶液 で洗浄した。細胞をＩＮ　ＮａＯＨで可溶化し、細胞に結合した放射能を測定し た。

この工程後、非特異的結合は５％もしくはそれより低く保持された。５０％まで 特異的な結合を阻害するＦＧＦの濃度に対する５０％まで特異的な結合を阻害す る類似体の濃度の比率をとることによって、　　ＦＧＦレセプターに対する類似 体の親和性は。

ウシ脳下垂体ＦＧＦの親和性を基準にして測定された。比率が１より小さい場合 は、類似体がＦＧＦよりもＦＧＦレセプターに対して親和性が高いことを示し、 比率が１より大きい場合は。

類似体がＦＧＦよりもＦＧＦレセプターに対して親和性が低いことを示した。

ＡＣＥ測定法によって分裂促進活性が低下していることがわかったいくつかの類 似体は、ウシ脳下垂体ＦＧＦと比較して。

ＦＧＦレセプターに対する親和性が同等もしくは高かった。ＡＣＥ測定法による 野性型の活性が５％より小さいが、　　ＦＧＦレセプターに対する親和性が同等 もしくは高い突然変異体には、　Ｒ３１Ｓ。

Ｋ３５Ｓ、　Ｄ４６Ａ、　Ｒ４８Ｌ、　Ｄ５０Ａ、　Ｖ５２に、　Ｒ５３Ｌ、　 Ｒ９０Ｔ、　ＥｌｏｏＳ、　ＥｌｏｏＡ。

Ｒ１０６Ｌ、　Ｒ１１６Ｔ、　Ｒ１１８Ｌ、　Ｋ１１９Ｓが挙げられる。これら の化合物は拮抗体として有用であり得る。

また、これらの類似体も、前記の測定法のいずれか１つを用いて分裂促進性を試 験した。試験結果を以下の表３に示す。

（以下余白） 表３ ｈＦＧＦ　（ａ）　　　５％７２５％　０．０１％７１０％　０．５　／　　　 　１．２３　Ｍｂｂａ”　　　　　　＜０．２％７１００％　　　　　　　　　 　　　　　　　０．３　　／　　　　　　　　１．４３　　ＭＫ２７Ｍ　　　　 　　　　　　　　　　Ｏ，３／　０．２０２８Ｋ　　　　　　　　　８．８％／ 　　　　１．０／１．３ＫＫＲ”　　　８．５％７８．５％　０．１１％７４． ２％　　　　　　　約１．５ＭＲ３１Ｓ　　　１００％／１００％　０．４５％ ／１７．８％　１．０１０．８に３５Ｓ　　　　　　　　　２．６％１５５．５ ％　０．１　／　０．０５　１．２３　ＭＤ４６Ａ　　　　　　　　　２．８％ ／　　　　０．５／Ｒ４８Ｌ　　　　　　　　　１．７％／　　　　０．１６／ ２．０Ｒ４８Ａ　　　　　　　　　８．９％／８４．２％　０．３２／　０．３ Ｄ５０Ａ　　　　　　　　　０．３７％／　　　　２．５／２．５Ｖ５２Ｋ　　 　　　　　　　０．７２％／〉２０％　０．５１０．４Ｒ５３Ｌ　　　　　　　 　　Ｏ，５％／　　　　０．２２１０．２５　１．５６　ＭＫ５５１　　　　　 　　　１％７８％　　　　　く０，１％／４，２％　　　　２．０／１．６Ｋ　 ５５Ｍ　　　　　　　　　９０％／　　　　０．４１０．４Ｄ５７Ａ　　　　　 　　　　０．２７％Ｒ９０Ｔ　　　　　７７％７２１６％　　２．６８％／９５ ．４％　　０．６　／　０．５　　１．５８　ＭＫ９５Ｔ　　　　　１００％／ １７０％　　４４．９％／　　　　　　　　　　　　　　１．５８ＭＤ９９Ａ　 　　　　１５０％７２８０％　　１９．２％／　　　　　０．０４１０．０３　 　１．５３　ＭＥｌｏｏＳ　　　　　　　　　　　　　０．０３％／　　　　　 １．１１０．５ＥＩＯＱＡ　　　　　　　　　　　　　０．７５％／　　　　　 ０．８／１．０Ｅ１０５Ｓ　　　　１２．６％７１００％　　０．３　　　　　 　５０　　／　　４０Ｒ１０６Ｌ　　　［０％／２００％　　０．２７％／　　 　　　０．３１０．１３　　　１．５５　ＭＲ１０６Ｔ　　　　２１０％７２５ ０％　　９．１％／６２．５％　　　　　　　　　　１．５８ＭＥ１０８Ａ　　 　　１８０％７３０％／　　　　　　　２．５／２．５Ｙ１１２Ａ　　　　０． ２％７０．２％　　０．０１％７４．３％　　ｔｏｏ　／　１００　　１．．４ ９　ＭＮ１１３Ｓ　　　　１６０％７７．７％１　　　　　１．０／１．０Ｒ１ １６Ｔ　　　　　５０％／３００％　　０．６４％／　　　　　０．２　／　　 　　　　１．５３０−Ｒｌ１８Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１． ８％／　　　　　　　　　０．５１０．４に１１９Ｓ　　　　　４８％７２５０ ％　　０．６％７４１％　　　０．３５１０．２５　　１．５８　ＭＫ１２８Ｓ 　　　　２１０％７６８％／　　　　　　　０．３１０．２５　　１．３８　Ｍ Ｋ１２８ε　　　２００％／１４０％　　　１３％／　　　　　　　　　　　　 　　　　１．０４ＭＲ１２９Ｔ　　　　　８７％／１９０％　　１１．９％／　 　　　　１．３　／　０．５　　１．４５　ＭＲ１２９Ｌ　　　　　　　　　　 　　　１．３％／ＫＲ１２ｇ、　　　　１８５％７８．４％７　　　　　２．０ １０．８　　　１．１４Ｍ２９ＳＴ Ｋ１３４Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Ｏ０６ＭＫ１３８Ｓ　　　、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　１．０ＭＣ７８Ｓ　　　　　　　　　　　　　５３％／１２３％ 　　　０．３１０．２５　　１．５７　ＭＣ９６Ｓ　　　　　　　　　　　　　 ９５％／９６％　　　　０．３　／　０，８　　１．５８　ＭＣ７８，９６Ｓ　 　　１１８％／１６０％　　１５９％７１５１％　　０．２１０．１　　１．５ ８ＭＣ３４，ｌ０ＩＳ　　　　　　　　　　　２％／Ｃ３４，７８，６５％／１ ４４％　　２％７７２％　　　　０．４５／　０．５　　１．５０　Ｍ０１Ｓ Ｃ７８，９６，２３％７１２５％ ０１Ｓ 注： データは、野性型ＦＧＦの活性に対する種々のＦＧＦ類似体の活性を示す。第１ 行に括弧書きで、各測定法での野性型ＦＧＦのＥＤｓｏ実測値を示す。ＥＤ、。

は、類似体が、その測定法での最大値の半分の反応をもたらす濃度であり、その ためこれは力価の尺度となる。野性型の活性より低い活性を示す類似体について は、より高い濃度が野性型ＦＧＦに等しい活性をもたらすために必要である。そ のために、上記類似体のＥＤ、。値は野性型より高い（最大値の半分の刺激をも たらすのには、より多くの量の類似体が必要である）。

野性型の活性より高い活性を示す類似体については、野性型の活性に等しい活性 をもたらすのには、より少ない量の類似体でよい。そのために、このような類似 体のＥＤｓ。値は野性型より低い（類似体が最大値の半分の刺激をもたらすのに は。

より少ない量の類似体でよい）。各測定法における各種類似体のＥＤ、。値は、 野性型の活性を百分率で示しである（野性型ＦＧＦのＥＤ、。値を類似体のＥＤ ｓ。値で割って１００倍した％値）。

そのために、１００％より大きな値を示す類似体は、その測定法において、野性 型ＦＧＦより大きな活性を有すると考えられ、一方１００％より小さい値を示す 類似体は、その測定法において、野性型ＦＧＰより小さな活性を有すると考えら れる。

ｒ３Ｔ３　Ｍｉｔｏ、／ヘパリフ　−／＋Ｊ　　：このデータは、　３Ｔ３／Ｂ ａ１ｂ／ｃ細胞の分裂促進性測定法で観察された活性（チミジンの取込み）を、 この測定法で野性型ＦＧＦについて観察された活性を基準にして示す。１μｇ／ ｍｌのヘパリンが存在しない場合と存在している場合に得られた活性値をそれぞ れスラッシュ印の左と右に示しである。

ｒ　ＡＣＥ　Ｍｉｔｏ、　／　ヘパＩＪ　７−／＋Ｊ　　：このデータは、副腎 皮質内皮細胞増殖測定法で観察された活性を、この測定法で野性型ＦＧＦについ て観察された活性を基準にして示す。１μｇ／ｍｅのヘパリンが存在しない場合 と存在している場合に得られた活性値をそれぞれスラッシュ印の左と右に示しで ある。

ｒ　ＦＧＦ−Ｒｃ　Ｃｏｍｐ、　ｌ　ヘパリフ　−／＋Ｊ　　：このデータは、 競合結合測定法で測定され、　　ＦＧＦレセブターと結合する類似体の相対的性 能を示す。その値は、この測定法における。類似体のＥＤＳ、値の野性型ＦＧＦ のＥＤ５．値に対する比率である。そのために、１．０より小さい値を示す類似 体は。

レセプターに対する親和性が野性型より大きいと考えられる。

１．０より大きい値を示す類似体は、レセプターに対する親和性が野性型ＦＧＦ より小さいと考えられる。１μｇｏｄのヘパリンが存在しない場合と存在してい る場合に得られた活性値をそれぞれスラッシュ印の左と右に示しである。

野性型のレセプター活性に近い活性を示し１分裂促進性測定法において低い相対 的活性を示す類似体は、潜在的な拮抗体このデータは、類似体が、高速液体クロ マトグラフィーにてヘパリンイＳＫカラムから溶出する。適切な塩（ＮａＣ１） の濃度を示す。１．５８Ｍより小さい値を示す類似体は、この方法から判断して ヘパリンとの結合が減少していると考えられる。１．５８にほぼ等しい値（１， ５３〜１．６３）を示す類似体は、この方法から判断して、ヘパリンに対する親 和性が野性型ｂＦＧＦと著しく変わっているき考えられる。

ヘパリンとヘパリン様化合物との結合に関連する。塩基性ＦＧＦ分子の領域を目 標として突然変異を誘発させて、　　ＦＧＦ類似体を構築した。これら類似体は 、変更されたアミノ酸に対応する特定のヌクレオチド配列を有し、以下に列挙す る。

類似体　　　　　オリゴヌクレオチド　　　　　　　番号ｂＦＧＦ−に２７Ｍ　 　　　５’　−ｐＡＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＧ　　　２ ４８７ｂＦＧＦ−に３０Ａ　　　　５’−ｐＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣＧ ＴＣＴＧＴＡｆ：Ｔ　　　２５６６ｂＦＧＦ−Ｒ３１Ｓ　　　　５’−ｐＡＡＧ ＡＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡ　　　２５６８ｂＦＧＦ−Ｄ２８ Ｋ　　　　５’−ｐＧＴＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡ、ＡＣＧＴＣＴ　 　　２４８０ｂＦＧＦ−Ｒ１１８Ｌ　　　５°−ｐＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧ ＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴ　　　　２４８３ｂＦＧＦ−に３５Ｓ　　　　５”−ｐＧ ＴＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴ　　　２５５３ｂＦＧＦ−に １２８Ｓ　　　５’−ｐＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡ 　　　２５４５ｂＦＧＦ−に１２８Ｅ　　　５’−ｐＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧ ＡＧＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡ　　　３３３２ｂＦＧＰ−Ｒ１２９Ｔ　　　５’− ｐＧＧｃＡｃＴＧＡＡＡＡ［：ＴＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴ　　　　３０８７ｂＦＧ Ｆ−に１２８Ｅ／Ｒ１２９Ｔ ｂＦＧＦ−に１３４Ｓ　　　５°−ｐＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧ ＡＴＣＣＡＡ　　　３２１２ｂＦＧＦ−に１３８Ｓ　　　５’−ｐＡＡｃＴＴＧ ＧＡＴ［：ＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧ　　　３２１５これらの遺伝子配列 は、先に教示したような適当な発現ベクターに挿入して、得られたタンパクの減 少したヘパリン結合活性について試験した。表３に記載した結果は、１２８〜１ ３８の残基を有するｂＦＧＦの領域が、ヘパリンが結合する標的領域であること を示しているけれども、この領域でアミノ酸が置換されると、ヘパリン−５ＰＷ 樹脂からの溶出によって測定されるように、ヘパリンとの結合が減少する。

Ｎ末端の欠失によるＦＧＦ拮抗体の調製ｐＨｃ９ｄｅｌｔ１３−ＰＴＳＦ−３由 来で平滑末端処理をしたＮｄｅ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩＩ［ＦＧＦ断片をＭ１３ｍｐ １８のＳｍａ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩ１１部位にサブクローン化した。１つのオリゴを 用い、インビトロ突然変異誘発法を利用して、新規のＮｄｅ　Ｉ部位を、　　Ｆ ＧＦ分子のアミノ酸２５の位置に導入した。この新規Ｎｄｅ　Ｉ部位は、　　Ｐ ＧＦ断片をサブクローン化するための新しい制限部位および短い形態のＦＧＦの 新しい翻訳開始部位として役立っている。使用される突然変異誘発性オリゴの配 列は次のとおりである。

５’−ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　Ｇ ＧＡ　ＡＧＧ　ＣＡＣＣＡＧ短くしたＦＧＦを９発現用のｐＴＳＦ−デルベータ ー−ｇａ　１に、ＮｄｅｉＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローン化し、得られ たプラスミドをｂＦＧＦ　（２５〜１５５）と命名した。タンパクの配列は、そ のタンパクのＮ−末端がヒスチジンであることが確認された。ｐＴｓＰ−デルベ ーター−ｇａ　］は、　ｐＴｓＦ１１をＰｖｕ　ＩＩとＥｃｏＲＩで消化して、 β−ｇａ　］のプロモーターのオペレーターの近位側の半分を欠失させることに よって構築した。

Ｎ末端欠失類似体のｂＦＧＦ（２５〜１５５）を前記のヘパリン−セファロース クロマトグラフィーで精製した。この類似体は。

３Ｔ３分裂促進測定法ではｂＦＧＦと類似のＥＤ、。を示し１作用物質活性を示 す。３Ｔ３測定法における刺激は、野性型とｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の両者 について約１　ｎｇ／ｍ１でピークになるが、　（ヘパリンなしで測定した）類 似体についての刺激のレベルは野性型ｂＦＧＦについて観察されるほど大きくは ない。したがって。

ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）は部分的に作用物質の特徴を示す。さらに。

ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）類似体の濃度が１　ｎｇ／ｍｅより大きいと、明ら かに活性が阻害される。一方、野性型ｂＦＧＦについては、３Ｔ３測定法におけ る活性は約１　ｎｇ／ｍｆ！でビークになり、１μｇ／ｒｒＬ１でさえもそれほ ど減少しないが、　　１０ｎｇ／ｍＮでのｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の活性は 、野性型ｂＦＧＦの活性の約１５％であり、　１１００ｎ／ｍｌでは。

ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）は実質的に活性がなくなる。

ＦＧＦ類似体ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）は、　　ｌｎｇ／ｍ１以上の濃度でそ の性能を測定した場合ＦＧＦ拮抗体であり、これはヘパリンなしで野性型ＦＧＦ の活性を阻害する。ｌｎｇ／−の野性型ｂＰＧＦによってもたらされる活性は、 ｌｎｇ／ｍ１のｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の存在下で約５０％減少し、　　１ ０ｎｇ／ｍ１のｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の存在下で約７５％減少し、そして １１００ｎ／−のｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の存在下では９５％より高い値で 減少する。この阻害性が競合的であるということは、　　ｂＦＧＦ（２５〜１５ ５）の存在下で観察される野性型ｂＦＧＦのＥＤ５゜のシフトで説明される。野 性型ｂＦＧＦのＥＤ、。は、類似体ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）が存在しない場 合１ｎｇ／ｍ１．より小さく　、　　Ｌｏｎｇ／＋＋＋１のｂＦＧＦ（２５〜１ ５５）の存在下では約１０ｎｇ／ｒｎｆであり、そして１１００ｎ／ｍ１の類似 体ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）の存在下では約１１００ｎ／ｍｊ！である。これ らのデータは、　　ｂＦＧＦ（２５〜１５５）は、恐らく野性型ＦＧＦと類似の 親和性でＦＧＦレセプターと結合するが、活性が変化する（減少する）ことを示 唆している。したがって、ヘパリンが存在しない場合、　ＦＧＦ類似体ｂＦＧＦ 　（２５〜１５５）は、野性型ＦＧＦの競合的阻害剤であり、そのため、拮抗体 となる。

ＦＧＦ類似体ｂＦＧＦ　（２５〜１５５）は、　ＦＧＦ拮抗拮抗性活性したとは いえ１部分作用物質活性を保持している。その上、この類似体の作用物質活性は 、ヘパリンの存在によって高められるが、拮抗体活性は阻害される。それ故、類 似体のＦＧＦレセプターに対する親和性を大きく減少させることなく、類似体の 活性をさらに減少させるために、配列をさらに変えることが望ましい。ｂＦＧＦ （２５〜１５５）の活性が減少する理由は知られていないが、野性型ＦＧＦのＮ −末端セグメントの完全性が、十分な活性を得るのに必要であると予想される。

そのために、さらに、レセプター結合領域を除くＮ−末端領域に欠失および／ま たはアミノ酸置換を行うことによって、レセプター結合性を減少させることなく 、活性を減少させることができる。例えば、２５〜３３位のアミノ酸領域の欠失 によってこの目的は達成される。他の方法としては、７８〜９８位もしくは１３ ０〜１５５位のアミノ酸のような他の非レセプター結合領域のアミノ酸を欠失さ せるかまたは変更する方法がある。結局、この類似体の拮抗体活性は、ヘパリン によって阻害されるので、ヘパリンの結合を減少させる置換部を導入することに よって１作用物質活性を減少させ、相対的に拮抗体活性を増大させることができ る。これらの方法は組合わせて用いることができ。

本発明の範囲に含まれるものである。

（以下余白） 実施例１２ ＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列は、上のＣ，１節で述べたように。

種々の宿主中で組換えタンパクを生産するために、最も都合よく用いられる。し かし、＠乳動物系での発現は、該哺乳動物宿主が９本来生産されるタンパクで見 られるプロセッシングに類似した翻訳後プロセッシングを行い得るため、細菌系 での発現に比べて有利である。

このベクターを構築するために、このクローン化されたＦＧＦをコードする類似 体は、　　ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩ［Ｉで切断され、必要であればＥｃｏＲＩ 　！Ｊンカーまたは他の適当なリンカ−が付けられる。そしてこれは１次いで、 　ｐｉ（Ｓｌや、以下に記述のようなその誘導体といった適当な宿主ベクターに 挿入される。

このプラスミドｐ）ＩＳＩは、哺乳動物宿主中での挿入ＤＮＡの発現に適してい る。このプラスミドは、　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、　ｅｔａｌ、　　Ｎ ａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　２９７−８０２）がらのｇ４ｏｂｐの ｈＭＴ−ＩＩ配列を含む。この配列は、　　ｈＭＴ−ＩＩ遺伝子の−７６５の位 置のＨｉｎｄ１１１部位から、＋７０のＢａｍｔｌｌ開裂部位にわたっている。

ｐＨ３１を構築するために、プラスミドｐ８４ＨをＢａｍ１ｌｌで完全なまでに 分解し、末端のヌクレオチドを除去するべくエキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１で 処理し１次いでＨｉｎｄＩＩ［で分解した。所望のｇ４ｏｂｐ断片をｐＵｃ８　 （ν１ｅｉｒａ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　 ：　２５９−２６８）に連結した。このｐＨ［：８は旧ｎｄｌＩＩおよびＨｉｎ ｃＩＩの分解により。

開いている。この連結混合物は、大腸菌ＨＢＩＯＩをＡｍｐｌｌに形質転換する ために用いられた。ｐ）ＩｓＩと名付けられた１つの候補プラスミドは単離され 、ダイデオキシ配列法により、配列決定された。ｐＨ３１は、好都合な制限部位 を含むポＩＪ　ＩＪンカーの上流側に、ｈＭＴ−ｎ制御配列を含む。

使用可能な宿主プラスミドｐＨｓ１は、メタロチオネインプロモーターのほかに 、付加的な制御要素を含有させて、さらに改変され得る。特に、ＳＶ４０のよう なウィルス系のエンハンサ−要素だけでなく、ｈＧＨのような他のタンパクの３ ′非翻訳領域に結合した終結シグナルも包含され得る。

ＭＴ−Ｉｔプロモーターに動作可能に連結された状態にあるＳＶ４０エンハンサ −を含む一対の宿主発現ベクターは、　ｐＨ３１のＭＴ−■プロモーター配列の 前方にある旧ｎｄＩＩＩ部位に、　１１２０ｂｐの５Ｖ４０ＤＮＡ断片を挿入す ることにより、構築された。このＳＶ４０　ＤＮＡ断片は、　ＳＶ４０の複製起 点まで及び、　５１７１番目のヌクレオチドから５２４３番目のヌクレオチド（ 起点）と、　　１０７−２５０番目のヌクレオチドの７２ｂｐ反復構造とを含ん でおり、そして後期ウィルスｍＲＮＡの５°末端を含む起点側の１０４６番目の ヌクレオチドにまで至る。この１１２０ｂｐからなるＨｉｎｄｌＩ［断片は、Ｓ Ｖ４０　ＤＮＡ　（Ｂｕｃｈｍａｎ、　Ａ、Ｒｌｅｔ　ａｌ、　ＤＮＡ　Ｔｕｍ ｏｒν１ｒｕｓｅｓ、　２ｄ　ｅｄ　（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ。

ｃｄ、）、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）。

ｐｐ、　７９９−８４１）のｔ（ｉｎｄＩＩＩによる分解から得られ、増幅のた めにｐＢＲ３２２にクローン化される。このクローニングベクターをＨｉｎｄＩ ＩＩで切断し、そしてこの１１２０ｂｐのＳＶ４０　ＤＮＡ断片をゲル電気泳動 法により単離し、そしてｐＨｓ１　（これはＨｉｎｄＩＩＩにより分解し。

ＣＩＰ処理した）に連結した。得られたベクター（これは、　ｐＨ５ｌ−３Ｖ（ ９）　＃よびｐＨ５ｌ−３Ｖ　（１０）と名付けられた）は、それぞれ反対方向 に、ＭＴ−Ｕプロモーターを生じる断片を含む。ｐ）ＩＳＩ−３Ｖ　（９）では 、エンハンサ−は、　５’ｍＲＮＡの転写開始部位から約１６００ｂｐのところ にあり、また反対方向には、このエンハンサ−は、５゛ｍＲＮＡの転写開始部位 からは、およそ９８０ｂｐのところにある。両方向とも動作可能であるが、エン ハンサ−配列が転写開始部位に近い方向では、より高いレベルの発現を示す。

転写開始部位の２５０−４００ｂｐ上流側にエンハンサ−を置くことを避けるこ とは、最適であると考えられている。

さらに、　ＭＴプロモーターのＴＡＴＡボックスの５゛−末端から上流側に、そ れぞれ、　１９０ｂｐ、　２５０ｂｐおよび３６０ｂｐ１．１ｍ、　ＳＶ４０エ ンハンサ−の３°末端を置いたベクターが構築された。この構築は、ヒ）ＭＴプ ロモーター上流側の制御領域の地図化に基づいによる制御のための反復部位を含 む配列を保持している。しかし、　１９０ｂｆｌと２５０ｂｐとに分離した構築 物は、これらの部位からさらに上流側にあるグルココルチコイドによる制御のた めの配列を保持していない。

これらのベクター（これは、　ｐ）Ｉｓ’−３ν１９０．　ｐｆｌｓ’−３Ｖ２ ５０ｊ＝；、、！：びｐＨＳ”−５Ｖ３６０と名付けられた）は、以下のように 調製される：全での構築物は、メタロチオネインプロモーターおよび上流領域を 含む配列の長さ以外は一致している。このプロモーターおよび上流領域は、　ｐ ｆｌｓｌから切断された断片として供される。

ｐＨ５’−８ＶＩ９０に対し、　ｐＨ５ｌがＳａｃ　Ｕで分解され、平滑化され 。

そしてＫｐｎｌＵンカーに連結される。次いで、このＤＮＡは、　ＭＴ−■制御 配列の適当な部分を遊離させるために、　　ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ　ｌで分解 される。同様に、　ｐｔｌｓ’−５Ｖ２５０では、　ｐｆｌｓｌがｆ（ｇａ　Ｉ で分解され、平滑化され、Ｋｐｎｌ！Ｊンヵーに連結された後、　　ＥｃｏＲＩ およびＫｐｎｌで分解される。ｐＨ５’−５シ３６０に対して、最初の分解にお いてＤｄｅｌが用いられる。

このＳＶ４０エンハンサ−を含む中間ベクターは、　ＳＶ４０の）ｌｉｎｄＩ［ ［／Ｋｐｎ　ｌ断片（これは、　５１７１１７１番目から２９４番目の位置にま で及んでおり、また、　Ｋｐｎ１部位から５０ｂｐのところにエンハンサ−要素 を含んで°いる）を、　Ｋｐｎｌ／１ｌｉｎｄＩＩＪで分解されたｐｔｌＣ−８ ｖに挿入することにより調製され、　ｐＵｃ−３Ｖが得られる。（ｐＨｃ１９は 、ポリリンカー領域に、順番に）ＩｉｎｄＩＩＩ、　ＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩ の３つの好都合な制限部位を含む）。この完成したベクターは、上で記述のよう に調製されるＫｐｎ　ｌ／　ＥｃｏＲｌ断片を、　Ｋｐｎｌ／１１：ｃｏＲＩで 分解されたｐＵｃ−３Ｖに挿入することにより、得られる。

それゆえ、先に改変された全てのベクターは、ＳＶ４０のエンハンサ−要素を利 用している。もちろん、他のウィルスのエンハンサ−であれば、同様の方法で用 いられるだろう。

転写終結制御配列を供与するために、このコード配列、およびヒト成長ホルモン の３゛非非翻訳列を表すＤＮＡをｐｌ（Ｓｌに連結した。この中間ベクターは、 　ｈＧＨコード配列に代えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対し 、　ｈＧＨ３°非翻訳配列を供与し得る。

このゲノム配列をコードするｈＧＩ＋を、　　Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲｌで分解 し、続いてポリアクリルアミドゲル精製することにより、　　ｐ２．６−３　（ ＤｅＮｏｔｏ、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（ １９８１０９：３７１９）から単離した。このＢａｍ旧は最初のエキソンの５° 末端で切断する。ＥｃｏＲＩは機能遺伝子の３′位で切断する。この単離された 断片を、　　ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲＩで分解されたｐＨ３１に連結した。この連 結混合物を大腸菌ＭＣ１０６］のＡｍｐＲに形質転換した。成功した形質転換体 は、制限分析により選抜し、所望のプラスミドｐＭＴ−ｈＧＨｇを含む株をさら に増殖させて、多量のプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐｆｌｓｌ−３Ｖ　（９）まタハｐｔｌｓ１−３Ｖ（１０）を構築するためでは あるが。

ｐＨ３１を代用するために、先に記述の方法と同様の方法で、　ＭＴプロモータ ーの制御下にあるｈＧ）１ｍｍ壬子含み、ＳＶ４０エンハンサ−と動作可能に連 結され、そしてそれぞれ、　ｐＨＧＨｇ−３Ｖ　（９）およびｐｈＧ）Ｉｇ−３ Ｖ　（１０）と名付けらレタ一対（Ｄへ’）　９−　（ｐＭＴ−ｈＧ）Ｉｇ）を 得た。その連結混合物は大腸菌１０６１をＡｍ　ｐ　Ｒに形質転換するために用 いられた。そして適切な構造が確認された。

発現ベクターの構築 次いで、　　ＦＧＦ類似体のいずれをもコードする［ｌＮＡ配列に適応する宿主 ベクターとして、　ｐｈＧ）Ｉｇ−３ν（１ｏ）を用いる。ｐｈＧＨｇ−ＳＶ　 （１０）をＢａｍ旧および３ｍａｌで分解し、クレノーで平滑化し。

そしてｈＧ）Ｉコード配列を切断するためにＣＩＰで処理する。この開かれたベ クターをＮｄｅｌ　（平滑末端）　／１ｌｉｎｄＩ［［（平滑末端）ＦＧＦ類似 体断片に連結し、所望の発現ベクターｐＦＧＦ−５Ｖ　（１０）を得る。

さらに、　ＰＨ５Ｉ、および上で記述のような、Ｓｖエンハンサ−の種々の配置 を含むべく改変されたｐＨ３１を包含するこれらの配列の発現を得るために、他 の宿主ベクターが用いられてもよい。挿入は、この宿主ベクターのＢａｍＨＩ／ 　ＥｃｏＲＩ分解を用いての、類似の方法による。また、酸性または塩基性ＦＧ Ｆ類似体の“長い”形態、　“基本の”形態あるいは“短い”形態のいずれをも コードするべく改変されたＤＮＡも用いられ得る。

これらのベクターは、以下で論じる目的のために、一般的にｐＭＴ−ＦＧＦと呼 ばれる。

哺乳動物の組換え体によるＦＧＦの生産チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） −Ｋｌ細胞を、Ｆ１２培地およびＤＭＥ培地の１：１混合物から構成される培地 上で、１２％ウシ胎児血清とともに生長させる。このコンピテント細胞を。

ＮＥＯは、ネオマイシン類似体６４１８に耐性を与える機能遺伝子を含む。この 形質転換では、　５００ｎｇのｐＳＶ２−ＮＥＯおよび５μｇのｐＭＴ−ＦＧＦ を、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、、　　ら、　Ｃｅ１ｌ　（１９７９）　１６　：　 ７７７−７８５、のプロトコルに従って、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱物中 で、１６エデイシユの細胞に適用する。それとともに。

これらをＤＮＡに４時間さらした後、１５％グリセロールで２分間“ショック” を加える。１日後、　Ｇ４１８耐性コロニーのプールを与えるために、この細胞 を１■／−の６４１８にさらす。これらの耐性コロニーはＦＧＦ生産のために分 析され９次いでクローン化され得る。

成功した形質転換体（これらはまたｐＭＴ−ＦＧＦの安定な遺伝形質を有する） を、クローン単離体の精製のため、低密度でプレート上にまく。これらの単離体 の少量を、　ＦＧＦ生産をうまく分析するために、　１０−’Ｍの塩化亜鉛にさ らした後、多孔プレート上で生長させる。ＦＧＦの定量は通常の方法を用いて。

適当なＦＧＦタンパク類似体に対し調製される抗血清に対して。

標準的なＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイにより行われる。

所望のＦＧＦを大量に生産するクローン分離体が選抜される。

適当な条件下にてＦＧＦ類似体を生産するべく示される細胞を、１０％のウシ胎 児血清で補足された基本培地に１７１０集密度でまき、−夜インキユベートし９ 次いで、ｌＸｌ０−’Ｍ〜３Ｘ　１０−’Ｍの濃度範囲の塩化亜鉛を加えること により、　ＦＧＰの生産を誘導する。２　Ｘ　１０−’Ｍ　ＺｎＣｌ２の最適の 誘導条件下で。

７〜１０日間にわたりＦＧＦのレベルが上昇する。

望むなら、　　ＦＧＦ類似体がこの溶解した細胞から得られ、そして天然タンパ クに対する先に述べた方法によるか、またはさらに、先に論じたように、前述の 構築物により生産されるＦＧＦタンパク類似体の分泌は、カルシウムイオノフオ アや他の適当な刺激剤によって開始されるエキソサイトシスにより、達成され得 る。ＣＨＤ細胞により生産されるタンパクが。

特に、　ＬＰＳやホルボールエステルの刺激により、放出されるということは期 待できないものの９例えば、　ＣＨＯ細胞に代えて９組換え宿主としてマクロフ ァージ由来の細胞系を用いることにより、このような分泌が行われ得る。また、 シグナル配列を与えるために、その構築を変えることにより１通常の構築経路を 用いる分泌も、　Ｃｌｌ０や他の畷乳動物細胞の宿主を用いて行われ得る。もち ろん１分泌を生じることは、タンパク精製作業がずっと簡単になるので有利であ る。

１９８５年９月９日またはそれ以前に、出願人は、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅＣｕｌｔｕｒｅ　（：ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、　Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、　ＭＯ，ｌｌ５Ａ、にλファージのλＢＢ２を寄託した。これは、　ＡＴ ＣＣ受託番号４０１９６を割り当てられた。１９８６年９月１２日またはそれ以 前に、λＢＢ２　（ＡＴＣ（：　４０１９６）の寄託条件は、微生物の寄託に対 する国際的な承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）で明記された条件 に適合するように変えられた。寄託された株が入手可能であるということは、そ の特許法に従って、いかなる政府の権威の下で許された権利にも違反して、その 発明を実施するためのライセンスとして解釈されるべきではない。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 排他的な所有権または特典が請求される本発明の実施態様は以下のように定義さ れる：１．哺乳類ＦＧＦの類似体をコードする組換えＤＮＡ配列。 ２．ヒトＦＧＦタンパク類似体をコードする，請求項１のＤＮＡ配列。 ３．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体をコードする，請求項２のＤＮＡ配列。 ４．ヘパリン結合に対する親和性が減少したヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体を コードする，請求項３のＤＮＡ配列。 ５．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体をコードする請求項４のＤＮＡ配列であっ て，該ＤＮＡ配列は，残基１２８〜１３８を含むヘパリン結合ドメインに位置す る１個またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸残基を，中性アミノ酸または負に 荷電したアミノ酸で置換することを包含する。 ６．請求項５のＤＮＡ配列であって，前記中性アミノ酸または負に荷電したアミ ノ酸は，セリン，トレオニン，またはグルタミン酸からなる群から選択される。 ７．請求項５のＤＮＡ配列であって，前記置換されたアミノ酸の位置および組成 は，セリン１２８，グルタミン酸１２８，トレオニン１２８，セリン１２８／ト レニオン１２８，およびセリン１３６からなる群から選択される。 ８．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体をコードする請求項２のＤＮＡ配列であっ て，１個またはそれ以上のシステイン残基は中性アミノ酸によって置換されてお り，該タンパク類似体は天然の塩基性ＦＧＦの生物学的活性を示す。 ９．請求項８のＤＮＡ配列であって，前記中性アミノ酸はセリンまたはアラニン である。 １０．請求項９のＤＮＡ配列であって，前記置換されたシステイン残基は，７８ 位または９６位にあるか，あるいはそれらの組み合わせである。 １１．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体をコードする請求項３のＤＮＡ配列であ って，該類似体はＦＧＦのレセプターに結合し，生物学的応答を誘導する能力が 減少している。 １２．ＦＧＦ拮抗体活性を有する，ＦＧＦのアミノ末端欠失類似体をコードする ，請求項３のＤＮＡ配列。 １３．請求項１２のＤＮＡ配列であって，該欠失はヒト塩基性ＦＧＦの残基１〜 ２４に及んでいる。 １４．ヒト塩基性ＦＧＦ類似体をコードする請求項１２のＤＮＡ配列であって， 該ＤＮＡ配列は，中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸で置換された，残基 １２８〜１３８を含むヘパリン結合ドメインに位置する１個またはそれ以上の正 に荷電したアミノ酸残基をさらに有する。 １５．発現の制御配列に作動可能なように連結されている，請求項３のＤＮＡ配 列。 １６．請求項１５のＤＮＡ配列であって，前記制御配列は転写終結シグナルを含 む。 １７．組換え宿主細胞に形質転換される，請求項３のＤＮＡ配列。 １８．請求項３のＤＮＡ配列を含み，かつＦＧＦまたはその類似体を発現させる のに効果的な組換えベクター。 １９．プラスミドｐＵＣ９−ＴＳＦ１１およびｐＵＣ９ｄｅｌＨ３−ｐＴＳＦ− ３からなる群から選択される，請求項１８のベクター。 ２０．請求項１８のベクターであって，ＦＧＦ類似体をコードするＤＮＡ配列は 細菌に適合する制御配列に作動可能なように連結されている。 ２１．請求項１８のベクターであって，ＦＧＦ類似体をコードするＤＮＡ配列は 哺乳類宿主に適合する制御配列に作動可能なように連結されている。 ２２．請求項１８のベクターで形質転換された組換え宿主細胞。 ２３．請求項２０のベクターで形質転換された細菌細胞。 ２４．請求項２１のベクターで形質転換された哺乳類細胞。 ２５．ＦＧＦタンパク類似体を製造する方法であって，該製造方法は，請求項３ のＤＮＡを有する宿主細胞を培養すること，およびＦＧＦタンパク類似体を回収 すること，を包含する。 ２６．請求項２５の方法であって，前記宿主細胞は細菌のものである。 ２７．請求項２５の方法であって，前記宿主細胞は哺乳類のものである。 ２８．ヘパリン結合に対する親和性が減少したヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体 であって，該類似体は，残基１２８〜１３８を含むヘパリン結合ドメインに位置 する１個またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸残基を，中性アミノ酸または負 に荷電したアミノ酸で置換することを包含する。 ２９．ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体であって，７８位または９６位にあるシ ステインあるいはそれらの組合せが中性アミノ酸で置換されており，該類似体は 天然のヒト塩基性ＦＧＦの生物学的活性を示す。 ３０．ｂＦＧＦ−Ｃ７８／９６Ｓである，請求項２９のヒト塩基性ＦＧＦタンパ ク類似体。 ３１．ヒト塩基性ＦＧＦの拮抗体。 ３２．請求項３１のＦＧＦ拮抗体であって，塩基性ＦＧＦにおける最初の２４個 のアミノ酸末端残基は欠失している。