JPH0343088A - ａＦＧＦ蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、創傷の治癒促進剤などとして用いることので
きる酸性線維芽細胞成長囚子（以下、本明細書において
は、ａＦＧＦと略称することもある。）をコードする塩
基配列およびその上流にＴ７プロモーターを含有するベ
クター、該ベクターを保持する形質転換体、および該形
質転換体を培養するａＦ　Ｇ　Ｆの製造法に関する。

従来の技術 ａＦ　Ｇ　Ｆは、視床下部、脳、網膜などに見いだされ
ている分子量約１．６万、等電点が５〜７である内皮細
胞成長因子であり、ヘパリンと強く結合するという特徴
があり、また血管新生因子として一般に知られている。

ａＦ　Ｇ　Ｆを遺伝子工学的手法で製造する方法として
は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５．　９６０　（１
９８７）　；Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ　　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３　＋１６４７
１（１９８８）、およびＩ　ＣＳ　Ｕ　　５ｈｏｒｔＲ
ｅｐｏｒｔ　　ｖｏｌｕｍｅ　８．　　Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ　　ｉｎ　　ＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　：　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　ａｎｄＰ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　
ｏｆｔｈｅ　ｌ　９８８Ｍｉａｍｉ　　Ｂｉｏ／　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　　Ｗｉｎｔｅｒ　　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ。

ｒ　ＲＬ、　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐａｇｅ　１１０に記載の
方法が知られている。

発明が解決しようとする課題 ａＦ　Ｇ　Ｆを遺伝子工学的手法で大量に製造すること
ができれば、医薬などとしての使用の際に有利となる。

そこで、この因子を大量生産する方法の確立が望まれて
いた。

課題を解決するための手段 一般に、遺伝子工学的手法を用いて遺伝子産物を大量生
産する場合、各々の遺伝子産物をコードする遺伝子ごと
に最適のプロモーター、宿主およびベクター系を選択し
て用いる必要がある。

そこで本発明者らはこのような考えに基づいて、まず既
に報告されているヒ）　ａＦ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列［
Ｆ、　Ｅｓｃｈら、　Ｂｉｏｃｈ’ｅａ＋、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、土３３　：　５５４−５６２．１９８５
コをもとにヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａを化学合成
し、このｃＤＮＡを種々のプロモーター、宿主およびベ
クターを用いて発現させ、発現量（遺伝子産物の産生量
）を比較検討した結果、ａＦＧＦ　ｃＤＮＡの発現には
Ｔ７プロモーターを用いた大腸閑遺伝子発現系［Ｐ、　
　冒、　　５ｔｕｄｉｅｒ、　　　ら、　　Ｊ、　　Ｍ
ｏ１．　　Ｂｉｑｌ、　　　１　８　９　　：１１３−
１３０．１９８６］が最も優れていることを見い出した
。本発明者らは、これらの知見に基づき、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、ａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質をコードする塩
基配列およびその上流にＴ７プロモーターを含有するベ
クター （２）、上記（１）のベクターを保持する形質転換体。

および （３）、上記（２）の形質転換体を培地に培養すること
を特徴とするａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質の製造法である。

ａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質としては、ウシ型のもの、ヒト型の
もの、などが挙げられる。ウシ型のもの、ヒト型のもの
のアミノ酸配列は、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）
第６１１−６１７頁（１９８６年）に記載されている。

また、ａＦＧＦ蛋白質としては、その一部が変異された
ムティンでもよい。

該ａＦ　Ｇ　Ｆムティンとしては、本来元のペプチドあ
るいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであり、し
たがって該変異としては、アミノ酸の付加、構成アミノ
酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のａＦ
ＧＦ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のａ
Ｆ　Ｇ　Ｆ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されてい
るものが挙げられる。

ａＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているム
ティンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペ
プチドを発現する際に用いられる開始コドンに基因する
メチオニンや、シグナルペプチドは含まれないものであ
る。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ａＦ　Ｇ　Ｆの特徴を失わない限り何個でも
よい。さらに好ましくは、ａＦＧＦと相同性（ホモロジ
ー）が認められており、同様の活性を示すタンパクのア
ミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ａＦＧＦの少なくとも１個のａＦ　Ｇ　Ｆ構成アミノ酸
が欠損しているムティンにおける欠損している構成アミ
ノ酸の数としては、ａＦＧＦの有する特徴を失わない限
り何個でもよい。

ａＦＧＦの少なくとも１個のａＦ　Ｇ　Ｆ構成アミノ酸
が別のアミノ酸で置換されているムティンにおける置換
される前の少なくとも１個のａＦＧＦｆ！成アミノ酸の
数としては、ａＦ　Ｇ　Ｆの特徴を失わない限り何個で
もよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン。

グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セゾン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好マシい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

該ムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つまたは
３つが組み合わさったものでもよい。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイザー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及
びジエイ・ビー・レコノク（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、
　）、　シエネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　、アカデミツク
ブレス社（１９８３年）第３１−５０頁、１こ示されて
いる。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム
・スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍ、　）及びニス・ギラム（
Ｇｉｌｌａｍ、　Ｓ、）、ジエネテイノク・エンジニア
リング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）
３巻　１−３２頁に示されている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 （ａ）ａＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種
形成させる（この１本鎖で代替えすべきシスティン用コ
ドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチ
センス・トリプレットを包含する領域に対して上記ブラ
イマーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他の
アミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス
・トリブレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ
）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ、突
然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を
形成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を？Ｓｌ　製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、形質転換体を得る。

本発明で用いられるＴ７プロモーターとしては、’［’
７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプロモーター［
Ｊ、Ｌ、　０ａｋｌｅｙ　ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、ヱ４　：　４２６６−４２７０
（１９７７）、　Ｍ、　Ｄ、　Ｒｏｓａ、　Ｃｅ１ｌ　
１６　：　８１５−８２５（１９７９）＋　　Ｎ、　　
Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ　ら、　　Ｎａｔｕｒｅ　２８
０：　３５（１９７９）、　　Ｊ、　　Ｊ、　　Ｄｕｎ
ｎら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ。

１６６　：　４７７−５３５（１９８３）］のいずれで
もよいがφ１０プロモーター［Ａ、　Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇら、Ｇｅｎｅ５６：１２５　１３５（１９８７）
コが好ましい。

本発明で用いられる転−写ターミネーターとしては、大
腸菌の系で作動するターミネータ−ならいずれでもよい
が、好ましくはＴφターミネータ−［Ｆ、　　Ｉｆ、　
　５ｔｕｄｉｅｒ　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉ
ｏｌ、　　１８９　：１１３−１３０（１９８６）］が
用いられる。

本発明で用いられるＴＴＲＮＡポリメラーゼ遺伝子とし
てはＴ７遺伝子１　［Ｆ、　Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒら。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１８９　：１１３　１
３０（１９８６）コをあげることが出来る。

本発明のベクターに用いる基となるベクターとしてはた
とえばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９゜ｐＭＢ９．
ｐＫＣ７，ｐＡＣＹＣｌ　７７、ｐＫＮ４１０などを挙
げることができる。

本発明に用いられるベクターは上記ベクターにＴ７プロ
モーター、Ｔ７ターミネーターを組み込んで構築される
。このようなベクターとしては、ｐＥＴ　−１、ｐＥＴ
　−２，ｐＥＴ　−３，ｐＥＴ　−４，ｐＥＴ−５［Ａ
、　Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｇｅｎｅ　５６　：　
ｌ　２５−１３５（１９８７）コをあげることができる
が、好ましくはｐＥ　Ｔ　−３Ｃ［同上］が用いられる
。

本発明で用いられる形質転換体の宿主としては、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ７遺伝子１）［Ｆ。

Ｗ、　　５ｔｕｄｉｅｒ　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　
　Ｂｉｏｌ、　　１８９　：１１３−１３０（１９８６
）］を組み込んだ大腸菌株、例えばＭＭ２９４．ＤＨ−
１，Ｃ６００，ＢＬ２１など、ならいずれでもよい。好
ましくはＴ７遺伝子ｌを組み込んだλファージが溶原化
したＭＭ２９４株およびＢＬ２１株が用いられる。この
場合Ｔ７遺伝子１のプロモーターとしては、発現誘導が
可能なプロモーター、たとえばＮａｃ、　ｒｅｃＡ、　
Ｔｒｐなどが用いられるが、Ｑａｃプロモーターが好ま
しい。

本発明で用いられる形質転換体は、上記Ｔ７遺伝子１　
（ＲＮ　Ａポリメラーゼ遺伝子）を組み込んだ大腸菌株
を、Ｔ７プロモーター・発現させる遺伝子・転写ターミ
ネータ−を保持するプラスミドで通常の方法たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ６
９　：　２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ土７：１０７
（１９８２）などに記載の方法、により形質転換して得
られる。この場合、使用する宿主をあらかしめＴ７リゾ
チーム遺伝子を有するプラスミドで形質転換しておき、
得られた形質転換体が２種の異なるプラスミドを同時に
保持していてもよい。

形質転換体を培養する際、培養に使用される培地として
は液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめ
られる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキス
トリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、た
とえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチーブ・
リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレ
イショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として
はたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、
塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス
、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

大腸菌形質転換体を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジエネテイツクス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ
　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｎ＋ｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１　４３３．Ｃｏ
１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　１９７２）］が好ま
しい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、たとえば３β−インドリル　アクリル酸ある
いはイソプロピルチオガラクトピラノシドのような薬剤
を加えることができる。

培養は通常約１５〜４３°Ｃで約３〜２４時間行い、必
要により、通気や撹拌を加えることもできる。

上記培養物からａＦＧＦ蛋白質を分離精製するには、例
えば下記の方法により行うことができる。

ａＦＧＦ蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集
め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩
衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、
フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび（または）
凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離によりａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質を得る方法などが適宜
用い得る。とりわけ、フレンチプレス法あるいはりゾチ
ームと超音波処理を併用する方法が好ましい。

上記上澄液からａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質を精製するには、自
体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこと
ができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析
や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限
外ろ過法、ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーな
どの特異的親和性を利用する方法、逆用高速液体クロマ
トグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点
電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げ
られる。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ａＦＧＦ蛋白質の精製法
として、大腸菌抽出液中のａＦＧＦ蛋白質にも適用する
と好都合である。たとえば中性附近のトリス、リン酸な
どの緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロースカラム
に、上記溶出液をかけ、十分洗った後、ＮａＣｌなどの
直線勾配溶出を行うことによりａＦＧＦ蛋白質を精製す
ることができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４昭和電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近の
緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣｌなど
の直線勾配溶出を行うと、ａＦＧＦ蛋白質はほぼ均一な
標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。

また、精り２過程、あるいは保存過程での微量の還元剤
の共存は、該は品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤
としてはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジエンちエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なａＦＧＦ蛋白質が得られ
る。本発明の実質的に純粋なａＦＧＦ蛋白質としては、
蛋白質含爪としてａＦＧＦ蛋白質を９５％（ｗ／ｗ）以
上であるもの、さらに好ましくはａＦＧＦ蛋白質を９８
％（Ｗ／ｗ）以上であるものが挙げられる。

このようにして製造された１ａＦＧＦ蛋白質は、たとえ
ば、創傷の治癒促進剤として用いることができ、また、
神経細胞増殖作用を有するので、各種神経障害の治療に
有効に利用できる。

ａＦＧＦ蛋白質を上記治療のための医薬として用いるに
は、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容さ
れうる担体２賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、
注射剤１錠剤、カプセル剤、液剤。

軟膏）として、温血動物（例、ヒト、マウス、ラット。

ハムスター、ウサキ、犬、ネコ）に対して非経口的また
は経口的に安全に投与することができる。

上記の医薬組成物としての製剤化は常法に従って行なわ
れる。

ａＦＧＦ蛋白質を上記した医薬として用いる場合には、
たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを
考纜して、１日量約ｌｏｎｇないし１０μｇ／ｋｇの中
から適当量を選んで投与される。

また、このようにして精製されたａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質は
、細胞培養を促進させるための試薬として用いることが
できる。この場合、ａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質を好ましくは、
培地ＩＱあたり約０．１−１０　　μｇとなるように培
地に加えることが好ましい。

後述の実施例で得られた形質転換体は、財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）に寄託され、また、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に
基づく寄託として寄託されている。受託番号および受託
臼を次の第１表に示す。

（以下余白） 本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　ｒＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　　
Ｃｏｓ＋ａｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｎｉ
ｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＮＡ ＤＮＡ ＮＡ ＡＴＰ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ：デオキシリボ核酸 ：相補的デオキシリボ核酸 ：アデニン ：チミン ：グアニン ：シトシン ：リボ核酸 ：デオ牛シアデノシン三リン酸 ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキシグアノシン三リン酸 ：デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ｄｒ ＤＴＡ ＤＳ ｃｙ＋ｙ ｌａ ａｌ ｅｕ １ｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ｉｓ ｈｅ ｙｒ ｒｐ ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ニゲリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ：イソロイシン ：セリン ：スレオニン ；システィン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギ゛ニン ：ヒスチジン ：フェニールアラニン ：チロシン ：トリブトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 本明細書において、ヒトおよびウシａＦ　Ｇ　Ｆの構成
アミノ酸の番号は、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第６１１−
６１７頁（１９８６年）に記載されたそれによるものと
する。

失兇判 以下に実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明は、これらによってなんら限定されるものでは
ない。

実施例１　　（ａＦＧＦの理造） （ａ）　　発現プラスミドの構築 化学合成されたヒトａＦＧＦのｃＤＮＡ（第１図）をｐ
Ｕ　Ｃ１８（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、上皇」。

２０−７８　（１９８３））に組み込んだプラスミドｐ
ＴＢ９１７をＢｓｐＭＩで切断し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａ
ｇｍｅｎｔの反応によりこの部位を平滑末端にした後Ｂ
ａｍＨＩで消化して０．４５ＫｂのＤＮＡ断片を調製し
た。

ベクターＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモーター
を保持するｐＥ　Ｔ　３　ｃ（５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、
　！、らＪ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９　：　１１３　１３０　
（１９８６））を用い、ｐＥＴ３ｃを　Ｎｄｅ！で切断
し、ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑末端とした後
Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼによりＮｃｏｌリンカ−５’−
ＣＣＡＴＧＧ−３’を結合させた。このプラスミドをＮ
ｃｏＴで切断し、その部位をＤＮＡポリメラーゼｌａｒ
ｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した後ＢａｍＨＩ
で切断してＳＩＯの配列を除き、そこに先の０．４５Ｋ
ｂ　ｂｌｕｎｔ　ＢｓｐＭ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて組み込んでｐＴＢ　９７５を
得たく第２図）。

（ｂ）　　ヒトａＦＧＦｃＤＮＡの大腸菌での発現次に
大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７フアージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ　３　（Ｓｔｕｄ
ｉｅｒ、　Ｆ、　ＬらＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８９
　：　１１３−１３０　（１９８６））を溶原化させ、
さらにＴ７フアージのリゾチーム遺伝子をもつプラスミ
ドｐＬｙｓ　５（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　Ｉｌ、らＪ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８９　：　１１３−１３０　
（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳ株を作製した。この大腸菌株にｐＴＢ９７
５を導入し、大腸菌ＭＭ２９４　（Ｄ　Ｅ　３）／ｐＬ
ｙｓＳ、ｐＴＢ９７５（ＩＦＯ１４９３６，ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２５９９）をつくった。この菌を３５μｇ／ｄ
アンピシリン、１０ｄｇ／ｄクロラムフェニコールを含
む培地で３７°Ｃで培養し、濁度がＫｌｅｔｔ　　１７
０になったときイソプロピルβ−Ｄチオガラクトシド（
Ｉ　ＰＴＧ）を最終濃度が０．５ｍＭになるように加え
更に３時間培養を継続した。菌体を遠心により集め、水
冷したＰＢＳで洗った後、再果菌し使用時まで一２０’
Ｃに保存した。

（ｃ）　　ヒトａＦＧＦの精製 １１ｉｔｅｒ培養から集めた菌体を１００ｍの水冷１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、　　ｌ　Ｏｍ
Ｍ　Ｅ　ＤＴＡ、０．６Ｍ　ＮａＣ１，１０％シヨ糖、
　　０．２５ｍＭ　　ＰＭＳ　Ｆに実？蜀し、卵白リゾ
チームを０．５ｍｇ／ｄとなるように添加した。１［］
、’ｒ間水中に放置１麦３７°Ｃで５分間インキュベー
トし、水冷下で超音波処理（２０秒間、２回）を行い、
遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ。

１８　Ｋｒｐｍ、　３０　ｍｉｎ、　４°Ｃ）して上清
を得た。この上清を２００３１１２の水冷２０　ａ＋Ｍ
　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣ１２（ｐＨ７，４）、ｌ　　ｎＭ
　　ＥＤＴＡと混和し、２０＋＋＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１
２（ｐＨ７，４）、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０．２ＭＮａＣＱで平衡化したヘパリンセファロースカ
ラム（径２．５Ｘ４ｃｍ）にかけた。カラムを１５０ｄ
の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐ！１７．４）、　
　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ２で洗った後
、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ。

１．５ＭＮａＣｌ２で蛋白を溶出した。溶出液を６ｄ毎
に分画し、ＯＤ　ｔｓｏをモニターして２番目のピーク
画分（８−１１番、計　２４ｄ）を集めた（第３図）。

この両分２２ｄに対して等量の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ（ＮＨ，）
、Ｓｏ、を混和し、２ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ
７，４）、　　１ｍＭ　　　ＥＤＴＡ、　　　　ＩＭ（
ＮＨ４）ｔＳＯ−で平衡化シたフェニルセファロースカ
ラム（径２．５Ｘ８ｃｍ）にかけた（流速　０．５蚊／
ｍｉｎ、）。

２０　、ｒｄＱの同じ緩衝液てカラムを洗った後、ＩＭ
からＯＭの硫酸アンモニウム直線的７ｇＪ度勾配（流速
０　、５　ｄ／ｍｉｎ、、勾配時間２００分）をかけ、
溶出された画分４０−５５を集め（第４図）、精製ヒト
ａＦＧＦとした。

（ｄ）　　逆相Ｃ４ＨＰＬＣ 精製ヒトａＦ　Ｇ　Ｆ　１．２ｍｇ／ｍ溶液を０．２５
ｍの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合し、逆
相Ｃ４カラＡ　（ＶＹＤＡＣ）１．：、　７ブライし、
０．１％ＴＦＡ存在下に０％から９０％アセトニトリル
の直線的濃度勾配をかけ溶出パターンを調べた。流速１
ｍ／ｍｉｎ、、勾配時間６０分で行った（第５図）。

（ｅ）　　生物活性 ヒ）　ａＦ　Ｇ　Ｆの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａ
ｄａら、　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、８　
：　５８８−５９４（１９８８））に従い、マウスＢＡ
ＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起を［３Ｈ］チミジ
ンの取り込みを指標として測定した。検体添加時、必要
に応じて培地中および検体中にヘパリン（ＳＩＧＭＡ　
　Ｇｒａｄｅ　Ｉ　）溶液を混合した。

実施例２　（アミノ末端欠失型組換え型ヒ）ａＦＧＦム
ティンの製造） 化学合成されたヒトａＦＧＦのｃＤＮＡ（第１図）をｐ
Ｕ　Ｃ１８［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、±０１゜２Ｏ−７８（１９８３）］に組み込んだ
プラスミドｐＴＢ９１７をＳ　ｍａ　［（第６図）ある
いはＰｖｕ［［（第７図）で切断した後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼによりＮｃｏＩリンカ−５’−ＣＣＡＴＧ（、−
３’を結合させた。これらのプラスミドをＮｃｏｒ’お
よびＢａｍＨＩで切断し、０．４１ｋｂあるいは０．３
ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ベクターＤＮＡにはＴ７
フアージの＜６１０プロモーターを有するｐＥ　Ｔ　８
Ｃ［５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、　Ｗ、　（Ｂｒｏｏｋｈａ
ｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｓ　Ｕ。

Ｓ、Ａ）より分与を受けた。］を用いた。ｐＥ　Ｔ　８
　ＣをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そこに先の
０゜４１ｋｂあるいは０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４　
ＤＮＡリガーゼにより組みこんでｐＴＢ１０６９（第６
図）あるいはｐＴＢ１０７０（第７図）をそれぞれ得た
。

（ｂ）アミノ末端欠失型ｈａＦＧＦ　ｃＤＮＡの大腸菌
での発現 大腸菌ＭＭ２９４株に、Ｔ７フアージのＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３　［５ｔｕｄ
ｉｅｒ、　　Ｆ、　　Ｗ、　　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１
．　　Ｂｉｏｌ：　１８９゜１１３−１３０（１９８６
）コを溶原化させ、ざらにＴ７フアージのりゾチーム遺
伝子をもつプラスミ　ドｐＬｙｓＳ（Ｓｔｕｄｉｅｒ、
　　Ｆ、　　Ｗ、　　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂ
ｉｏｌ。

１８９　：　１１３−１３０（１９８６））を導入し、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＭ　２
９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐＬｙｓＳ株を作製した。こ
の大腸菌株にｐＴ　Ｂ　１０６９あるいはｐＴＢ１０７
０を導入し大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、
ｐＴＢ　１０６９（Ｉ　ＦＯ１４９３７、ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２６００）あるいは大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ１０７０（ＩＦＯ１４９３８，Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２６０１）をそれぞれつくった。これ
らの菌を３５μｇ／ｄアンピシリン、ＩＯμｇ／Ｎクロ
ラムフェニコールを含む培地で３７°Ｃで培養し、濁度
がＫｌｅｔｔ　１２０になったときイソプロピルβ−Ｄ
チオガラクトシドを最終濃度が０．５ｍＭになるように
添加し、更に２時間培養を継続した。菌体を遠心により
集め、水冷したフォスフェートバッフアートセライン（
ＰＢＳ）で洗った後回集菌し使用時まで一２０℃に保管
した。

（ｃ）アミノ末端５残基欠失型ｈａＦＧＦの精製７５ｊ
ｌ１２培養から集めた大腸ｍＭＭ２９４（ＤＥ３）ｐＬ
ｙｓｓ、ｐＴＢ１０６９（ＩＦＯ１４９３７゜ＦＥｒ（
Ｍ　　ＢＰ−２６００）の菌体を１０ｄ２の水冷Ｉ　Ｃ
）ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ７，４）、　１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣｄ、１０％シヨ糖、０．２
５５Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）に懸濁し、卵白リゾチームを０．５ｍｇ／ｍ１２と
なる様に添加した。１時間水中に放置後３７°Ｃで５分
間インキュベートし、水冷下で超音波処理を行イ、遠心
（ＳＯＲＶＡＬＬ、１８Ｋｒｐｍ、３０分。

４℃）して上清を得た。この上清を２０ｍＭＴｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，４）で平衡化したヘパリンＨＩ’ＬＣ
カラム（径０．８　ｃｍＸ　５　ａｍ）にかけた。カラ
ムを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ’ｊ（ｐＨ７，４）、０
．６Ｍ　　ＮａＣ（で洗浄後、ＱＭから２ＭのＮａＣｌ
２直線的ｌ農度勾配（流速１ｍ／ｍｉｎ、勾配時間１時
間）をかけ、１ｄｆｌｉｉに分画した。溶出された画分
２８−３２を集めた（第８図）。以上の操作により５残
基欠失型ヒ）ａＦＧＦを４．２ｍｇ得た。

（ｄ）アミノ末端４３残基欠失型ｈａＦＧＦの精製１２
！Ｍ培養から集めた犬腸閑ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬ
ｙｓＳ、ｐＴＢ　１０７０（ｆ　ＦＯ１４９３８、ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２６０１）の菌体を１（Ｍの氷冷１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、　１０ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣ０，１０％シぢ糖、０．２５
ｍＭＰＭＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０．５ｍｇ／
１ｔｔｌとなる様に添加した。１時間水中に放置後３７
°Ｃで５分間保温し、水冷下に超音波処理を行い、遠心
した。沈殿を２ＭＮａｃ（ｌに懸濁した後再び遠心して
得られた沈殿を、１５−の６Ｍ尿素。

２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＤＴＴに懸濁し、時々かくはんしながら氷上で３時
間保温した。この溶液を遠心した後の上清を、３Ｍ尿素
、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）で平衡
化したＱ−セファロースカラム（径２．５ｃｍＸ８ｃｍ
）にかけた。カラムを平衡化に用いたバッファーで洗浄
した後、ＯＭからＩＭのＮａＣ（！直線的濃度勾配を流
速０．６ｄ／分で１６０分に渡ってかけ、２．５Ｊ１１
２毎に分画した（第９図）。溶出された画分１４−１９
を集め２ｇの２ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，
４）、５ｍＭ　ＤＴＴに対して一晩透析した後、３Ｑの
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ
ＤＴＴに対して３時間透析した。以上の操作によりＮ末
４３残基欠失型ヒトａＦＧＦを３．２ｍｇ得た。

発明の効果 本発明のＴ７プロモーターを含有するベクターを用いる
ことにより、ａＦ　Ｇ　Ｆ蛋白質を効率良く製造するこ
とができるので、本発明方法はａＦＧＦ蛋白質の工業的
生産に有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で用いられた、ヒ）ａＦＧＦのｃＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図は、実施例１で得られた、プラスミドｐＴＢ９７
５の構築図を示す。 第３図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第４図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第５図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第６図は、実施例２で得られた、アミノ末端５残基欠失
型ａＦＧＦ発現用ベクターｐＴＢ１０６９の構築図を示
す。 第７図は、実施例２で得られた、アミノ末端４３残基欠
失型ａＦＧＦ発現用ベクターｐＴＢ１０７０の構築図を
示す。 第８図は、実施例２で得られた、アミ／末端５残基欠失
型ａＦＧＦ精製用に使用したヘパリンＨＰＬＣカラムか
らの溶出パターンを示す。 第９図は、実施例２で得られた、アミノ末端４３残基欠
失型ａＦＧＦ精製用に使用したＱセファロースカラムか
らの溶出パターンを示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）蛋白質を
   コードする塩基配列およびその上流にＴ７プロモーター
   を含有するベクター。
2. （２）、ａＦＧＦ蛋白質がａＦＧＦである請求項１記載
   のベクター。
3. （３）、ａＦＧＦ蛋白質がａＦＧＦの欠矢型ムテインで
   ある請求項１記載のベクター。
4. （４）、請求項２記載のベクターを保持する形質転換体
   。
5. （５）、請求項４記載の形質転換体を培地に培養するこ
   とを特徴とするａＦＧＦ蛋白質の製造法。