JPH04164096A - ａＦＧＦムテイン，ＤＮＡおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｗ策上皇科里分亙 本発明は、創傷の治癒促進剤などとして用いることので
きる酸性線維芽細胞成長因子（以下、本明細書において
は、ａＦＧＦと略称することもある。）の欠失型ムティ
ンをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ、該組換
えＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する形質転
換体、および該形質転換体を培養するａＦ　Ｇ　Ｆムテ
ィンの製造法に関する。

従来の技術 ａＦＧＦは、視床下部、脳、網膜などに見いだされてい
る分子置駒１，６万、等電点か５〜７である内皮細胞成
長因子であり、ヘパリンと強く結合するという特徴があ
り、また血管新生因子として一般に知られている。

ａＦＧＦを遺伝子工学的手法で製造する方法としては、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　：　９６０　（１９
８７）。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２６３　：　ｌ　６
４７１（１９８８）などに記載の方法が知られている。

また、アミノ酸置換型ａＦＧＦムティンに関して、ｒ　
ＣＳ　Ｕ　５ｈｏｒｔ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｖｏｌｕｍｅ　
８．　Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ　ａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９８８Ｍｉａｍｉ　　Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ。

Ｉ　ＲＬ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐａｇｅ　１１０に報告さ
れている。

発明が解決しようとする課題 一般に、生理活性物質はその活性発現のために必らずし
もその成熟型タンパクの全構造が必要であるとは言えな
い。場合により不必要なアミノ酸配列あるいは生物活性
を制限するような作用を示すドメイン部分を欠失した方
が生物活性ペプチドとして優れた性質を示すことが知ら
れている。

そこで本発明者らはａＦＧＦの欠失型ムティンをつくる
ことにより、ａＦ　Ｇ　Ｆより安定性、産生効率および
細胞増殖活性に優れ、さらに未知の生物活性の賦活化が
なされた分子をつくり得るであろうと考えた。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技術によりａＦＧＦの欠失
型ムティンを作成し、安定性の向上、細胞内での産生能
、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭意研究し、
本発明を完成した。

本発明は、（１）、ａＦ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列の連続
した９０〜１３３個のポリペプチド鎖からなる欠失型ム
ティン。

（２）、上記（１）のムティンをコートする塩基配列を
有する組換えＤＮＡ。

（３）、上記（２）の組換えＤＮＡを含むヘクター。

（４）、上記（３）のヘクターを保持する形質転換体。

および（５）、上記（４）の形質転換体を培地に培養す
ることを特徴とする上記（１）のムティンの製造法であ
る。

本発明のムティンの基本となる成熟型ａＦＧＦとしては
、ウシ型のもの、ヒト型のもの、などが挙げられる。ウ
シ型のもの、ヒト型のもののアミノ酸配列は、バイオケ
ミカル・アント・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔ　１ｏｎｓ）第６１１−６１７頁（１９
８６年）に記載されている。なかでもヒト型のものが好
ましい。

本発明のムティンとしては、さらに好ましくは、ａＦＧ
Ｆのアミノ酸配列の連続した１２０〜１３１個のポリペ
プチド鎖からなるもの、さらに、ａＦＧＦのアミノ酸配
列の連続した１２５〜１３１個のポリペプチド鎖からな
るもの、ａＦＧＦのアミノ酸配列の連続した１３１〜１
３３個のポリペプチド鎖からなるものか挙げられる。

本発明の欠失型ムティンとしては、Ｎ末端側からアミノ
酸が欠失しているものか好ましい。

この欠失型ムティンは、基本となる成熟型ａＦＧＦのポ
リペプチドのＣ末端から３個までのアミノ酸を欠失して
いてもよい。

本発明の欠失型ムティンの具体例としては、たとえば、
ヒ）ａＦＧＦのＮ末端の８個のアミノ酸を欠失したもの
、ヒ）ａＦＧＦのＮ末端ノ９　（［）アミノ酸を欠失し
たもの、ヒトａＦＧＦのＮ末端の１１個のアミノ酸を欠
失したもの、ヒトａＦＧＦのＮ末端の１２個のアミノ酸
を欠失したもの、ヒトａＦＧＦのＮ末端の２０個のアミ
ノ酸を欠失したもの、ヒトａＦＧＦのＮ末端の４３個の
アミノ酸を欠失したものなど挙げられる。

本発明のムティンを製造するためには、従来の組換えＤ
ＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔ
ｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が採
用される。該技術は周知てあり、アール・エフ・レイサ
（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及びジェイ・ピー・レ
コノ、り（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　）、シェ不ティ
ノク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ）、アカテミンクプレス社（１９８３年
）第３１−５０頁、に示されている。オリコヌクレオチ
ドに指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ、
　　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌａｍ、　　Ｓ
、　）、ジェネティソク・エンジニアリング：原理と方
法、プレナムブレス１（１９８１年）３巻　１−３２頁
に示されている。

本発明のムティンをコードする構造遺伝子を製造するた
めには、たとえば、 （ａ）ａＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形
成させる、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び （Ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクー
レオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオ
チドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレ
オチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ
）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）によって
記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は
、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適
化するような長さであり、突然変異サイトから５′及び
３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）は、
ＤＮＡポリメラーゼの工牛ソヌクレアーゼ活性による突
然変異の修復をさけるのに十分な大きさとする。

本発明に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレ
オチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ま
しくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは
約１４個ないし約１８個の塩基を含有する。これらは通
常、変更されるコドンの少なくとも約３個の３′側塩基
を含有する。

たとえば、ａＦＧＦ構成アミノ酸が欠失しているムティ
ンを得る目的の場合における変異ａＦＧＦ遺伝子を作る
方法としては、三つの場合が考えられる。ひとつはａＦ
ＧＦのアミノ末端を欠失させる場合、二つめはａＦＧＦ
の中央部分を欠失させる場合、三つにはａＦ　Ｇ　Ｆの
カルボキシル末端を欠失させる場合である。

アミノ末端を欠失させる場合には欠失させようとするア
ミノ酸配列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコ
ドンをＭｅｔをコードするＡＴＧに特定部位指向性変異
法を用いて変更し、さらにそのコドンの５′−末端側に
適当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーター
との連結（１ｉｇａｔ　１ｏｎ）を容易にさせる。

アミノ酸配列をその中央部分で欠失させる場合には欠失
させたい配列をコードする遺伝子の５′および３′末端
側にユニークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変
異法を用いて生成し、この部位を酵素によって消化して
抜きとり、再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的
のアミノ酸を欠損したａＦＧＦをコードする遺伝子がで
き上る。

このとき制限酵素消化により読み取り枠かずれないよう
にすることは云うまでもない。

カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠損させる場合に
は、欠失させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコー
ドする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によってス
トップコドンに変更すればよい。

ただしオリゴヌクレオチドプライマーのデザインはどの
アミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもない。

プライマーは、ａＦ　Ｇ　Ｆ遺伝子の１本鎖がクローン
化されたＭ　ｌ　３　［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ
、　Ｃ。

Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　　ジーン（
Ｇｅｎｅ）、　　３３　１０３−１１９　（１９８５）
、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、メソッズ・イン・エンジ−モ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇ
ｙ）、土０１　２０−７８（１９８３））　、　ｆｄ　
［Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎ　ｅｔａｌ、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティック（Ｍｏ１．　Ｇｅｒ＋
、　Ｇｅｎｅｔ、）、　　ｌ　７７　２３１（１９８０
））　、又はφＸ　１７４　［Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ　ａｎ
ｄ　Ｓ。

Ｇｉｌｌａｍ、　　ジェネティック・エンジニアリング
（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、　Ｐ
ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｖｏｌ、３゜ｐｐｌ’　−
３２（１９８１））のような１本鎖ファージへ雑種形成
される。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖
のいずれでも運搬できることは認められる。ファージが
アンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号
づけたトリブレットを決定するこのコドンとの不一致以
外にもプライマーは突然変異させるコドンを含有するセ
ンス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合が
あってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する時
には、欠損させる二トンと対合をつくるトリブレット中
の適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域に対して相捕的でない場合があっても
よい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及びニ
ス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度は通
常、約０℃ないし７０°Ｃ１もつと一般的には約１０°
Ｃないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、プライマー
は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＬ　Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラーゼとの
反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ずるｄ
ｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガー
ゼでの処理によって閉鎖環ｄｓＤＮ　Ａへ変換される。

１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレア
ーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異形成へテロニ量体は、被感染能力をもつ
宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿主
によるヘテロニ量体の複製では、双方の鎖から子孫がで
きる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から突然変
異遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベク
ターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえ′ば大腸
菌由来のＰＢＲ３２２［シーン（ｇｅｎｅ）、　２　。

９５（１９７７）］、ｐＢＲ３２５［シーン、４，１２
１（１９７８）］、ｐＵＣ１２［ジーン、１９，２５９
（１９８２）］、ｐＵｃ　１．３［ジーン、１９，２５
９（１，９８２）］、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ［バイ
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ
　１ｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍ
ｕｎｉｃａｔｉｏｎ＞、　１１２＋　６７８（１９８３
）］などが挙げられるが、その他のものであっても、宿
主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用いる
ことができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　　コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
　Ｓ　ｐｒｒｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが挙
げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２゜ｐＵｃＩ
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ］　１０．ｐ
ＴＰ５．ｐｃ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳ
　Ｈ１９，ｐＳ　Ｈ１５）、あるいはλファージなどの
バクテリオファージおよびレトロウィルス。

ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、あるいは昆虫
ウィルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡＳＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、１ａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰＬ　　プロモーター。

Ｑｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、５ＰＯＩプロモーター、５
ＰＯ２プロモーター＋Ｉ）ｅｎＰプロモーターなど、宿
主か酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫ
プロモーター、ＧＡＰプロモーター。

ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエ
シェリキア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターま
たはＴ７プロモーターであることか好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、５Ｖ４ＯＥＩＥＩ来の
プロモーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙
げられ、とりわけＳ　Ｖ’　４　Ｑ由来のプロモーター
が好ましい。

このようにして構築されたムティンをコードする塩基配
列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを用いて、該ベ
クターを保持する形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばニジエリ牛ア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　
２　Ｄ　Ｈ１［Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、６０＋１６０（１９６８
）］、ＪＭ１０３　　［ヌクレイツク・アシ、ズ・リサ
ーチ、　（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ａｉｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ）９，３　ＣＪ　９（１９８１）］、　Ｊ　Ａ
２２１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）　１２０　＋５１７（１９７８
）］、ＨＢ１０１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー、４１，４５９（１９６９）］、Ｃ６００
［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３９，４４
０（１９５４）コ、ＭＭ２９４［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　７３゜４
１７４（１９７６）］などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　
１１１４［（ジーン、２４．２５５（１９８３）］、］
２０７−２１ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（
Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　９５　＋　８７（１９８４）］などが挙げられ
る。

上記酵母としては、たとえばサツ力ロマイセスセレビシ
アエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−
５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖ　
ｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ
細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、５９゜２１１０（１９７２）、ジーン、↓７，１０
７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ）。

１６８．１１１（１９７９）などに記載の方法に従って
行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰ　ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳ、Ａ　　７
５；１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわ
れる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ムティンをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換体が
得られる。

該形質転換体を培地に培養することにより、ムティンを
産生させる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルフース、デ牛ストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆軸、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどがあげられる。また、酵母、ビタミン類、
生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍ　ｉＩ　ｌ
ｅｒ＋ジャーナル・オブ・エクスベリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆＥｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、　４３１−４３３．　Ｃ
ｏ１ｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　　　Ｎｅｗ　　　Ｙｏｒｋ　　１　９
　７　２）コが好ましい。ここに必要によりプロモータ
ーを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリ
ル　アクリル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地ＣＢ　ｏｓｔｉａｎ、　　Ｋ　、　　Ｌ　
、　　ら。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＵＳＡ、７ヱ。

４５０５（１９８０）コが挙げられる。培地のｐＨは約
５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜
３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）１２２．５０
１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地Ｕヴイロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ
　１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ
　　ｏｒ　　ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｍｅｄｉ
ｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　　１９９．５１９（
１９６７）］。

１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メデイスン（Ｐ　ｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉｅ
ｔｙ　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）７３，１（１９５０）］などが挙げられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０〜４０°Ｃ１培養時間は約１５〜６０時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からムティンを分離精製するには、例えば下
記の方法により行うことかできる。

ムティンを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレン
チプレス、超音波、リゾチームおよび（または）凍結融
解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
によりムティンを得る方法などが適宜用い得る。とりわ
け、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ましい
。

上記上澄液からムティンを精製するには、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法なとの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなとの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
なとの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセルロースな
どを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかける
ことにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くことが
できる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液をかけ、素
通り画分を集めることは有効である。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ａＦＧＦムティンの精製
法として、抽出液中のａＦＧＦムティン蛋白質にも適用
すると好都合である。たとえば中性附近のトリス、リン
酸なとの緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロースカ
ラムに、上記溶出液をかけ、十分洗った後、Ｎ　ａＣＱ
などの直線勾配溶出を行うことによりａＦ　Ｇ　Ｆムテ
ィン蛋白質を精製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４．昭和電工製なと）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近の
緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮ　ａｃＩ２
などの直線勾配溶出を行うと、ａＦＧＦムティンはほぼ
均一な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして製造されたａＦＧＦムティンは、たとえ
ば、創傷の治癒促進剤として用いることかでき、また、
神経細胞増殖作用を有するので、各種神経障害の治療に
有効に利用できる。

ａＦＧＦムティンを上記治療のための医薬として用いる
には、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容
されうる担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例
、注射剤２錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温
血動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサ
ギ、犬、ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に
投与することができる。

上記の医薬組成物としての製剤化は常法に従って行なわ
れる。

ａＦＧＦムティンを上記した医薬として用いる場合には
、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１日量約１０ｎｇないし１０μｇ／ｋｇの
中から適当量を選んで投与される。

また、このようにして精製されたＪＩＦＧＦムティンは
、細胞培養を促進させるための試薬として用いることが
できる。この場合、ａＦＧＦムティンを好ましくは、培
地ＩＱあたり約０．１〜１０μｇとなるように培地に加
えることが好ましい。

後述の実施例で得られた形質転換体は、財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）に寄託され、また、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に
基づく寄託として寄託されている。受託番号および受託
臼を次の第１表に示す。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　ＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　　
Ｃｏｉｉｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｂｅｍｉｃ
ａｌＮ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　　：アデ
ニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　　　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ
　　　：デオキシチミジン三すン酸ｄＧＴＰ　　　：デ
オキシグアノシン三すン酸ｄＣＴＰ　　　：デオキシシ
チジン三すン酸ＡＴＰ　　　：アデ／シン三リン酸 Ｔｄｒ　　　　：チミジン ＥＤＴＡ　　：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　　ニ
ドデシル硫酸ナトリウムｃ、ｃｔｙ、　　　ニゲリシン Ａ、　　Ａｌａ　　　　：アラニン Ｖ、　Ｖａｌ　　　　：バリン Ｌ、　　Ｌｅｕ　　　　：ロイシン Ｉ、工１ｅ　　　　：インロイシン Ｓ、Ｓｅｒ　　　　：セリン Ｔ、Ｔｈｒ　　　　：スレオニン ｃ、ｃｙｓ　　　　ニジスティン Ｍ、　Ｍｅｔ　　　　：メチオニン Ｅ、Ｇｌｕ　　　　：グルタミン酸 り、　　Ａｓｐ　　　　：アスパラギン酸に、　　Ｌｙ
ｓ　　　　：リジン Ｒ，Ａｒｇ　　　　：アルギニン Ｈ，Ｈｉｓ　　　　：ヒスチジン Ｆ、Ｐｈｅ　　　　：フェニールアラニンｙ、’ｒｙｒ
　　　　：チロシン Ｗ、Ｔｒｐ　　　　ニトリブトファン ｐ、Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ｎ、　　Ａｓｎ　　　　：アスパラキンＱ、　　Ｇｌｎ
　　　　：グルタミン 本明細書において、ヒトおよびウシａＦ　Ｇ　Ｆの構成
アミノ酸の番号は、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第６１１−
６１７頁（１９８６年）に記載されたそれによるものと
する。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１　（アミノ末端４３残基欠失型ヒ）ａＦＧＦム
ティンの製造） （ａ）発現プラスミドの構築 化学合成されたヒトａＦＧＦのｃＤＮＡ（第１図）をｐ
Ｕ　Ｃ１８［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　　１０１゜２Ｏ−７８（１９８３）］に組み込
んだプラスミドｐＴ　Ｂ９１７（ｐＴＢ９１７を）：、
ｃｏｌｉに導入した形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２
ＭＭ２９４／ｐＴ　Ｂ　９１７はＩＦＯにＩＦＯ１５０
９３として寄託されている。）をＰｖｕＩＩ（第２図）
で切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりＮｃｏｌリン
カ−５′−ＣＣＡＴＧＧ−３’を結合させた。これらの
プラスミドをＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩで切断し、０．
４１ｋｂあるいは０．３ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。

ベクターＤＮＡにはＴ７フアージのφ１０プロモーター
を有するｐＥ　Ｔ　−８ｃ　［５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、
　Ｗ。

（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｓ
　Ｕ、　Ｓ、　Ａ）より分与を受けた。ｐＥＴ−８Ｃは
、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１８９゜１１３−１
３０（１９８６）、　Ｇｅｎｅ　５６．１２５−１３５
（１９８７）に記載されている。］を用いた。ｐＥＴ−
８ｃをＮ　ｃｏ　ＩおよびＢａａＨＩで切断し、そこに
先の０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り組み込んでｐＴＢ１０７０（第２図）を得た。

大腸１１ＭＭ２９４株に、Ｔ７フアージのＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３　［５ｔｕ
ｄｉｅｒ、　　Ｆ、　　Ｗ、　　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ　：　１８９゜１１３−１３０（１９８
６）］を溶原化させ、さらにＴ７フアージのリゾチーム
遺伝子をもつプラスミ　トｐＬｙｓＳ　（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ、　　Ｆ、　　１　　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　
Ｂｉｏ１１８９　：　１１３−１３０（１９８６））を
導入し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
ＭＭ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐＬｙｓＳ株を作製
した。この大腸菌株にｐＴＢ１０７０を導入し、大腸菌
ＭＭ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐＬ　ｙｓＳ、ｐＴ
Ｂ　　１０７０（Ｉ　Ｆ○　１４９３８．ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２６０１）をつくった。この菌を３５μｇ／−ア
ンピシリン、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含
む培地で３７℃で培養し、濁度かに１ｅｔｔ１２０にな
ったときイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを最終
濃度が０．５ｍＭになるように添加し、更に２時間培養
を継続した。菌体を遠心により集め、水冷したフォスフ
ェートバッフアートセライン（ＰＢＳ）で洗った後回集
菌し使用時まで一２０℃に保管した。

（ｃ）アミノ末端４３残基欠失型ｈａＦＧＦムテインの
精製 １２５−培養から集めた大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／
ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ１０７０（ＩＦＯ１４９３８、ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２６０１）の菌体を１０顧の氷冷ＩＱｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．２Ｍ　ＮａＣＱ、１０％シヨ糖、０．２５ｍＭ
ＰＭｓＦに懸濁し、卵白リゾチームを０．５ｔａｇ／？
ＲＩｌとなる様に添加した。１時間水中に放置後３７°
Ｃで５分間保温し、水冷下に超音波処理を行い、遠心し
た。沈殿を２ＭＮａＣＱに懸濁した後再び遠心して得ら
れた沈殿を、１５−の６Ｍ尿素。

２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１（ｐＨ７，４）、　１０
ｍＭジチオスレイトル（ＤＴＴ）に懸濁し、時々かくは
んしながら水上で３時間保温した。この溶液を遠心した
後の上清を、３Ｍ尿素、　２０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−
ＨＣｆ２（ｐＨ７，４）で平衡化したＱ−セファロース
カラム（径２、５　ｃｍｘ　８　ｃｍ）にかけた。カラ
ムを平衡化に用いたバッファーで洗浄した後、ＯＭから
ＩＭのＮａＣｌ直線的濃度勾配を流速０．６ｄ／分で１
６０分に渡ってかけ、２，５−毎に分画した（第３図）
。

溶出された画分１４−１９を集め２Ｑの２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＮ（ｐＨ７，４）、５ｍＭ　ＤＴＴに対して一
晩透析した後、３Ｑの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（
ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＤＴＴに対して３時間透析した
。以上の操作により、第４図に示すアミノ酸配列を有す
るＮ末４３残基欠失型ｈａＦ　Ｇ　Ｆムティンを３．２
ｍｇ得た。

実施例２（アミノ末端９残基欠失型ヒ）　ａＦ　Ｇ　Ｆ
ムティンおよびアミノ末端１２残基欠 失型ヒトａＦ　Ｇ　Ｆムティンの製造）（ａ）発現プラ
スミドの構築： ヒトａＦＧＦのＣＤＮＡ　（第１図）を組み込んだプラ
スミドｐＴＢ９１７　［実施例１　（ａ）］を、Ｈｉｎ
ｄＩｎおよびＢａｍＨＩ消化してｃＤＮＡ部分を切り出
し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージ［Ｇｅｎｅ　３（、：１０
３−１１９（１９８５）］のＲＦＤＮＡのＨ１ｎｄＩ［
Ｉ　−Ｂ　ａｉＨＩ部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
組み込んだ（第５図）。得られたファージの単鎖ＤＮＡ
を調製し、ブライマー５’　−ＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＡ
ＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣ−３’あるいはブライマー５′−
ＧＣＡＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴ−３′を
用いて突然変異を導入し、ｐＴＢ１２０７あるいはｐＴ
８１２０８を得た（第５図）。部位特異的突然変異の反
応にはアマジャム社（Ｕ、に、）（７）キットを用いた
。次にプラスミドｐＴＢ１２０７あるいはｐＴ８１２０
８ＤＮＡをＮｃｏｌおよびＢａｍＨ）でそれぞれ消化し
、突然変異か導入されたａＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａを
切り出してＴ７フアージのφ１０プロモーターを有する
プラスミドｐＥ’ｒ−８ｃ（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
　　１８９．１１３−１３０（１９８６）、　Ｇｅｎｅ
　５６゜１２５−１３５（１９８７））のＮｃｏＩ−Ｂ
ａｍＨＩ部位に組み込み、アミノ末端９残基欠失型ｈａ
ＦＧＦムティン発現プラスミドｐＴＢ１２０９あるいは
アミノ末端１２残基欠失型ｈａＦ　Ｇ　Ｆムチ４フ発現
プラスミドｐ’ｒ　Ｂ　１２１０をそれぞれ得た（第６
図および第７図）。

（ｂ）アミノ末端欠失型ｈａＦＧＦムティンｃＤＮＡの
大腸菌での発現： 大ａｔｍＭｖｔ　２９４　株ニ、Ｔ７７ｙ−’；（ＤＲ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３
３５ｔｕｄｉｅｒ、　　Ｆ、　　Ｗ、　　ら、　　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１８９　：１１３−１３０
（１９８６）］を溶原化させ、ざらにＴ７フアージのり
ゾチーム遺伝子をもつプラスミドｐＬｙｓＳ（５ｔｕｄ
ｉｅｒ、　　Ｆ、　　Ｉｌ、　　ら、　　Ｊ、　　Ｍｏ
１．　　Ｂｉｏｌ、　　１８９：　１１３−１３１（１
９８６））を導入し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）ＭＭ　２９４　（Ｄ　Ｅ　３　）／　ｐＬ
　ｙｓＳ株を作製した。この大腸菌にｐＴＢ１２０９あ
るいはｐＴＢ１２１０を導入し大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳ。

ｐＴＢ１２０９（ｒＦｏ　　１５０６９．ＦＥＲＭＢＰ
−３０３９）あるいは大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐ
ＬｙｓＳ、ｐＴＢ　１２１０（Ｉ　ＦＯｌ　５０７０゜
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０４０）をそれぞれつくった。

これらの菌を３５μｇ／−アンピシリン、１０μｇ／滅
クロラムフェニコールを含む培地で３７℃で培養し、濁
度がＫｌｅｔｔ　ｌ　２０になったときインプロピルβ
−Ｄチオガラクトシドを最終濃度が０゜５ａ＋Ｍになる
ように添加し、更に２時間培養を継続した。菌体を遠心
により集め、水冷したフォスフェートバッフアートセラ
イン（ＰＢＳ）で洗った後回集菌し使用時まで一７０℃
に保管した。

これらの菌体の一部を用いて、ソニケーション処理およ
び遠心により粗抽出液を調製し、次に記載の方法に従い
生物活性を測定したところ、有意の活性が検出された。

生物活性・ ヒトａＦＧＦ活性は佐々田らの方法（５ａｓａｄａら。

Ｍｏ１．　　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　　８　：　５８８
−５９４（１９８８））に従い、マウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　ｃ　３　Ｔ　３細胞のＤＮＡ合成誘起を［３Ｈ］
チミジンの取り込みを指標として測定した。検体添加時
、必要に応じて培地中および検体中にヘパリン（ＳＩＧ
ＡＭ　　Ｇｒａｄｅ　Ｉ）溶液を混合した。

１２．５−培養から集めた大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ　３
）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴ　Ｂ　１２０９あるいは大腸菌Ｍ
Ｍ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ　１２１０の
菌体を１−の氷冷１０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１！（ｐ
Ｈ７，４）。

１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣｌ２．１０％シ
ョ糖。

０．２５ｍＭ　ＰＭＳＦに懸濁し、水冷下に超音波処理
を行った後１時間水中に放置後遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ、
１８Ｋｒｐｍ、３０分、４°Ｃ）して上清を得た。この
上清を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）で
平衡化したヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８ｃｍＸ　
５　ｃｍ）にかけた。カラムを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＱ（ｐＨ７，４）、０．６Ｍ　　ＮａＣｌ２で洗浄後
、ＯＭから２ＭのＮａＣＱ直線的濃度勾配（流速１！／
ｍｉｎ、勾配時間１時間）をかけ分画した。溶比された
画分のうち、欠失型ｈａＦＧＦを含む画分を集めた。

以上の操作により、第８図に示すアミノ酸配列を有する
Ｎ末９残基欠失型ｈａＦＧＦムティンを１　、２　ｍｇ
、第９図に示すアミノ酸配列を有するＮ末１２残基欠失
型ｈａＦ　Ｇ　Ｆムティンを０．１ｍｇそれぞれ得た。

（ｄ）アミノ末端９残基および１２残基欠失型ｈａＦＧ
Ｆムテインの生物活性： 上記（ｃ）で得た９残基欠失型及び１２残基欠失型ムテ
インの生物活性は、佐々田らの方法（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　　８．　５８８　５９４（１９
８ｇ））により、低血清濃度下においたマウスＢＡＬＢ
／ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起を［’Ｈ］チミジンの
取り込みを指標として測定した。ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞を５％牛脂児血清を含むＤＭＥＭを用いて、９６ウエ
ルプレート（ヌンク社、テンマーク）にまき（２Ｘ１０
’個／ウェル）、翌日培地を０．５％牛脂児血清を含む
ＤＭＥＭ２−ととりかえた。３日後試料（５％牛アルブ
ミンを含むＤＭＥＭ中）を順次ｌ：５に希釈もの０．０
１−をヘパリン（シグマ社、　Ｇｒａｄｅ　Ｉ　＋最終
濃度５０μｇ／りと共にまたはヘパリンなしでそれぞれ
のウェルに加えた。

試料を添加した後１８時間後に、１μＣ１の［メチル−
１）（］チミジン（５Ｃｉ／５ｎｏｌ　；　ＣＥ　Ａ、
　７ランス）を加えた。細胞を４時間インキュベートし
た後、トリプシン処理し、タイターチック　ハーベスタ
−（Ｓｋａｔｒｏｎ、　Ｌｉｅｒ、　　ノルウェイ）で
グラスフィルター上に集めた。フィルターを乾燥し、シ
ンチレーション液に浸し、シンチレーションカウンター
で放射活性を測定した。該活性は、スタンダードとして
牛脳下垂体から得られたＦＧＦ（宝酒造株式会社製）を
用い最大ＤＮＡ合成誘起活性の５０％を与える濃度を決
定することにより計算した。該ムティンのヘパリン存在
又は非存在下における比活性を表２に示す。表２におけ
る値は成熟型のａＦＧＦのヘパリン存在下の活性を１．
０とした場合の比較値を示す。

第２表 ヘ　　パ　　リ　　ン 一十 ａＦＧＦ　　　　　　　　Ｏ，０２１，０ｄｅｓ　　１
−　９　　　　　０．０１　　　　　　　０．７ｄｅｓ
　ｌ　−１２＜０．０１　　　　　０．２発明の効果 本発明のａＦＧＦの欠失型ムティンは、成熟型ａＦＧＦ
より安定性が向上され、活性が向上されている等の優れ
た性質を有するので、損傷、血栓症、動脈硬化症などの
治療薬として有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で用いられた、ヒ）ａＦＧＦのｃＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図は、実施例１で得られた、Ｎ末４３残基欠失型ｈ
ａＦＧＦムティン発現用ベクターｐＴＢ１０７０の構築
図を示す。 第３図は、実施例１で得られた、Ｎ末４３残基欠失型ｈ
ａＦ　Ｇ　Ｆムティン精製用に使用したＱセファロース
カラムからの溶出パターンを示す。 第４図は、実施例１で得られたＮ末４３残基欠失型ａＦ
ＧＦムティンのアミノ酸配列を示す。第４図におけるＮ
末端のＭは、翻訳開始コドンによるメチオニンを示す。 第５図は、実施例２（ａ）で得られた、プラスミドｐＴ
Ｂ１２０７およびｐＴ８１２０８の構築図を示す。 第６図は、実施例２（ａ）で得られた、プラスミドｐＴ
Ｂ１２０９の構築図を示す。 第７図は、実施例２（ａ）で得られた、プラスミドｐＴ
Ｂ１２１０の構築図を示す。 第８図は、実施例２で得られたＮ末９残基欠失型ｈａＦ
　Ｇ　Ｆムティンのアミノ酸配列を示す。第８図のアミ
ノ酸配列のＮ末端のＭは、翻訳開始コドンによるメチオ
ニンを示す。 第９図は、実施例２で得られたＮ末１２残基欠失型ｈａ
ＦＧＦムティンのアミノ酸配列を示ス。 第９図のアミノ酸配列のＮ末端のＭは、１訳開始　　−
コドンによるメチオニンを示す。 代理人　弁理士　　岩　１）　　弘（ほか４名）ｗ３　
　　図 フラクシ四ン数 Ｑ　　　悶　　　０：　　　α ト　　　１）　　父　　　− （１）２！：２０口 Ｈｌの氏の の　　　←　　　−２の ２σ＞Ｑシ ー　　　ω　　　Ｈの　　　− ＞ａｚａ、ｗ １）　　−０：ｆ− ！才　　　　　　（５，ＪＺ！　　　　鴎国トー〉＜ く　　　ロ　　　瞑　　　−ｆ ω　　　Σ　　　国　　　≧　　　Ｏ ａ＜　　　　−ｚａ 〇　　　−−−２ −＞　　　−国　　　工 Σ　　　σ　　　Ｏ＜　　　← （Ｏ 法 〒 区 吐 法 工 ロ　　　く　　　ロ　　　匡　　　叫　　　ｆ良（／＋
Σ田≧σ Ｑ、Ａ＜、ＡＺＣ：） −σ　　　−−×　　　２ （−ト　　　　−　　　に）　　　ニ ー　　　〇　　　σ　　　Ｏ＜　　　←叫　　　−〇　
　　圓　　　０：　　　匡：ｅ！：　　　　←　　　１
）　　２　　　山Ｏロ　　　１ｍＱ−＋（１）ｏ：４　
　　　の００　　　　ヱ　　　の　　　Ｃ／）Ｅ−−’
ｄ　　　　の＞α”；ｓａｚａｗ −←　　　シ　　　＞＞Ｚ　　　　鋲 −〇　　　（３）　　　−：！ニア、Ｊ２　　　ロ　　
　ａ、ａｚ’ｔｂ −＞　　　＞　　　０　　１）　　−−×　　　ヒ　　
　の　　　口　　　国　　　〇　　　−Σ　　　Ｏ（４
）　　　←　　　−〉　　　く＞＞０　　　　悶　　　
−− ←　　　の　　　口　　　国　　　〇　　　−０国トー
ンく ロ　　　く　　　ρ　　　匡　　　Ｌ　　　ｆ−の　　
　Σ　　　（３）　　　≧　　　σＪＪ＜ＪＺ（５ −σ　　　−匡　　　２　　　ト 部　　　−＞　　　−国　　　工 ０’）”　　　←　　悶　　ｆ　　函 Ｏσ（３）２＋２０口 ２　　　の　　　の　　　←　　　−父　　　のの　　
　α　　　父　　　σ　　　＞Ｕ＞Ｏロ　　　−　　　
ω　　　ト　　　の　　　−＞部’；、−ＩＪＺＣ：）
−’ｒ ＪＥ−＞＞＞Ｚ　　　　山 −〇　　　１）　　−工　　　輩　　　−Σ　　　ロ　
　　（５！Ｚ！Ｌ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）のアミノ
   酸配列の連続した９０〜１３３個のポリペプチド鎖から
   なる欠失型ムテイン。
2. （２）、請求項１記載のムテインをコードする塩基配列
   を有する組換えＤＮＡ。
3. （３）、請求項２記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
4. （４）、請求項３記載のベクターを保持する形質転換体
   。
5. （５）、請求項４記載の形質転換体を培地に培養するこ
   とを特徴とする請求項１記載のムテインの製造法。