NO159392B - Fremgangsmaate for fremstilling av modent ikke-glykosylertinterferon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant DNA-teknologi, dvs. fremgangsmåter som brukes i rekombinant DNA-teknologi,

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse fremstilling av leukocyttinterferoner hos voksne mennesker, som består i at man får en kultur av en mikroorganisme transformert med en vektor som kan uttrykke disse polypeptider til å vokse opp og uttrykke disse polypeptider. Vektorene som brukes i denne fremgangsmåte og de nye mikroorganismer som inneholder disse vektorene samt fremgangsmåten for fremstilling derav er også beskrevet.

Humant leukocyttinterferon (LelF) ble først oppdaget og fremstilt i form av meget rå fellinger av Isaacs og Lindemann (Proe. R. Soc. B 147, 258-267 [1957]; US patent 3.699.22). Forsøk på å rense og karakterisere materialet har pågått siden dengang, og har ført til fremstilling av relativt homogene leukocyttinterferoner som stammer fra normale eller leukemiske donatorers leukocytter (DOS nr. 2..947.134. Interferoner er kjent for å ha den egenskap at de bringer sine målceller i en virusresistent tilstand. Dertil kan interferon forhindre celledeling og modulere immunitetsreaksjon. Disse egenskaper har forårsaket klinisk bruk av leukocyttinterferon som et terapeutisk middel for behandling av virusinfeksjoner og sykdommer.

Leukocyttinterferoner har blitt renset til hovedsakelig homogenitet (Rubinstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 640-644 [1979]; Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605 [1979], og er rapportert å ha molekylvektsområde fra 17.500 til 21.000. Den spesifikke aktiviteten til dise preparatene er bemerkelsesverdig høy, 2 x 10<8> til 1 x IO<9> enheter/mg protein, men utbytter fra cellekulturmetoder har vært skuff-ende lave. Ikke desto mindre har fremskritt i proteinsek-vensteknikker muliggjort bestemmelsen av partielle aminosyresekvenser (Zoon et al., Science 207. 527 [1980]; Levy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77, 5102-5104 [1980]). Klarleggelsen av glykosyleringen til forskjellige leukocytt-interferoner er ennå ikke fullstendig, men det er nå klart at forskjeller i glykocyleringen blant medlemmer av familien ikke alene er ansvarlig for molekylvektsspekteret som er observert. I stedet varierer leukocyttinterferoner markert i aminosyresammensetning og sekvens, og aminosyrehomologi

er i noen tilfeller mindre enn 80 %.

Selv om isolering fra donatorleukocytter har gitt tilstrekkelig materiale for partial karakterisering og begrensede kliniske studier med homogent leukocyttinterferon, er det en helt uegnet kilde for de mengder av interferon som trengs for kliniske forsøk i stor skala og for bred skala profylak-tisk og/eller terapeutisk anvendelse deretter. Faktisk har tidligere kliniske undersøkelser som anvendte humant leukocytt-avledede interferoner i antitumor- og antivirusforsøk

i første rekke vært begrenset til rå (< 1 prosent

rene) preparater av materialet, og lange fremstillingstider for tilstrekkelige mengder, også på urealistiske prisnivåer, har forsinket kritisk undersøkelsene på en utvidet front.

Rekombinant DNA -teknologi har imidlertid gitt muligheten for kontrollert mikrobiell fremstilling av et enormt utvalg nyttige polypeptider. Allerede under kontroll modifiseres bakterier gjennom denne teknologi til å gi produksjon av slike polypeptidprodukter som somatostatin, A-og B-kjedene av humant insulin og humant veksthormon (Itakura et al., Science 198, 1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]). Nylig har rekombinante DNA-teknikker blitt brukt for å frembringe bakteriell produksjon av proinsulin og thymosin alfa 1 og flere forfatt-ere har beskrevet resultater av DNA-koding for human leukocyttinterf eron og resulterende proteiner med leukocyttinter-feronaktivitet (Nagata et al., Nature 284, 316-320 [1980];

Mantel et al., Gene 10, 1-10 [1980]; Taniguchi et al.,

Nature 285, 547-549 [1980].

Ved rekombinant DNA-teknologi anvendes plasmider i stor grad, og slike består av en ikke-kromosom Al-ring av dobbeltk;}edet DNA som finnes hos bakterier og andre mikrober, ofte i flere kopier pr. celle. Innbefattet i informasjonen som er innkodet i plasmid DNA er den som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replicon") og normalt ett eller flere seleksjonskarakteristika så som, i tilfellet bakterier, motstandsevne mot antibiotika, hvilket muliggjør at kloner fra vertscellen som inneholder plasmidet av interesse gjenkjennes og fortrinnsvis dyrkes i selektivt medium. Anven-delsen av plasmidene ligger i at de kan spaltes spesifikt av en eller annen restriksjonsendonuklease eller "restriksjons-enzym", som hver gjenkjenner og spalter spesifikke sekvenser på plasmid DNA. Deretter kan heterologe gener eller genfragmenter innsettes i plasmidet gjennom endepunktet på spaltningspunktet eller på rekonstruerte ender nær spaltningspunktet. DNA-rekombinasjon utføres utenfor cellen, men det resulterende "rekombinante" plasmid kan innføres gjennom en prosess kjent som transformasjon, og store mengder av det heterologe genholdige rekombinante plasmidet erholdes ved å dyrke transformanten. Der hvor genet er riktig innsatt i forhold til deler av plasmidet som styrer transkripsjon og overføring av det innkodede DNA budskap, kan den resulterende vektor brukes til å faktisk produsere polypeptidsekvensen som det insatte genet koder, en prosess som kalles ekspresjon.

Ekspresjon påbegynnes i et område som er kjent som promoteren, hvilket gjenkjennes og bindes til RNA polymerase. I noen tilfeller, som ved tryptofan eller "trp" promoter som er foretrukket i praksis i foreliggende oppfinnelse, overlappes promoterregioner av "operator"-regioner og danner en kombinert promoter-operator. Operatorer er DNA sekvenser som gjenkjennes av såkalte repressorproteiner som tjener til å regu-lere frekvensen av transkripsjon initiering ved en spesiell promoter. Polymerasen går langs DNA'et og transkriberer informasjonen fra dens 5' til 3'-ende til budbringer-RNA, hvilken igjen translateres til et polypeptid med den aminosyresekvens som DNA koder for. Hver aminosyre er kodet av en nukleotid triplett eller "fcodon", som i foreliggende tilfelle kalles "strukturgenet", dvs. den del som koder aminosyresekvensen til det uttrykte produkt. Etter binding til promoteren transkriberer RNA-polymerasen først nukleotider som koder et ribosombindingspunkt, så en translasjonsbegynnelse eller et "start"-signal (ordinært ATG, som i det resulterende budbringer-RNA blir AUG), og så nukleotidkodonene innenfor selve strukturgenet. Såkalte stoppkodoner transkriberes ved enden av strukturgenet, hvoretter polymerasen kan danne en ytterligere frekvens av en budbringer-RNA, som på grunn av stoppsignalets nærvær vil forbli utranslatert av ribosomene. Ribosomer knyttes til bindingspunktet som foreligger på budbringer-RNA, i bakterier normalt ettersom m-RNA dannes, og produserer selv det kodede polypeptid ved å begynne med translasjonsstartsignalet og ende med det forutnevnte stopp-signal. Det ønskede produkt produseres hvis sekvensene som koder ribosombindingspunktet befinner seg riktig i forhold til AUG startkodonet og hvis alle øvrige kodoner følger startkodonet i fase. Det resulterende produkt kan erholdes ved å spalte vertscellen og isolere produktet gjennom riktig rensning fra annet bakterieprotein.

Det ble bemerket at anvendelse av rekombinant DNA teknologi (dvs. innsetting av interferongener i mikrobielle ekspre-sjonsbærere og deres ekspresjon under kontroll av mikrobielle genreguleringselementer) ville være den mest effektive måte å tilveiebringe store mengder leukocyttinterferon, hvilken, til tross for at glykosyleringskarakteristika mangler i således fremstilt materiale fra menneskekilder, kunne anvendes klinisk i behandling av et stort spektrum av virus og neoplastiske sykdommer.

Metoden for å oppnå et første leukocytt gen som kan anvendes ved fremstillingen ifølge foreliggende oppfinnelse, inneholdt de følgende trinn:

(1) Partielle aminosyresekvenser fra humant leukocyttinterferon renset frem til homogenitet ble brukt for å konstruere sett av syntetiske DNA prøver hvis codoner i aggregatet re-presenterte alle mulige nukleotidkombinasjoner som var i stand til å kode de partielle aminosyresekvenser. (2) Bakterielle kolonibanker ble fremstilt inneholdende komplementært DNA (cDNA) fra indusert m-RNA. Annet indusert m-RNA som var blitt radioaktivt merket, ble hybridisert til plasmid cDNA fra denne banken. Hybridiserende m-RNA bleeluert og undersøkt med hensyn til overføring til interferon i oocyttforsøk. Plasmid DNA fra kolonier som var vist å indusere interferonaktivitet på denne måten er videre undersøkt med hensyn til hybridisering til prøver fremstilt som beskrevet i (1) ovenfor. (3) Parallelt.med metoden i del (2) ovenfor, ble indusert m-RNA-avledet cDNA i plasmider brukt til å danne et uavhengig forhold av transformantkolonier. Prøvene fra del (1) ble brukt til å påvirke syntesen av radioaktivt merket enkeltkjedet cDNA for bruk til hybridiseringsundersøkel-ser. De syntetiske prøver hybridiserte med indusert m-RNA som mal og ble utvidet ved revers transkripsjon til å danne indusert, radioaktivt merket cDNA. Kloner fra koloni-forrådet som hybridiserte til radioaktivt merket cDNA erholdt på denne måte,er undersøkt videre for å bekrefte tilstedeværelsen av et interferongen med full lengde.

Hvilket som helst genfragment erholdt i del (1) eller (2) kan i seg selv brukes som en marker for gen med full lengde.

(4) Genet med full lengde som erholdtes ovenfor ble sammen-satt ved bruk av syntetisk DNA slik at man unngikk enhver leadersekvens som kunne forhindre mikrobiell ekspresjon av

det ferdige polypeptid og muliggjøre riktig plassering i en ekspresjonsvektor i forhold til startsignaler og ribosombindingspunktet for en mikrobiell promoter. Produsert inter-feron ble renset til en renhet som gjorde det mulig å fast-slå dets karakter og bestemme dets aktivitet. (5) Interferon-genfragmentet fremstilt på foregående måte ble i seg selv brukt i undersøkelser gjennom hybridisering av andre partielt homologe leukocyttinterferonarter.

Ved å anvende metoder for rekombinant DNA teknologi som beskrevet ovenfor, oppnås mikrobiell fremstilling i høye utbytter og renhet av familien homologe leukocyttinterferoner (uglykosylerte) som ferdige polypeptider, hovedsakelig uten den tilsvarende presekvens eller annen del derav. Disse interferoner kan uttrykkes direkte, isoleres og renses til grader som gjør dem egnet for bruk ved behandling av virus og ondartede sykdommer hos mennesker og dyr. Hittil uttrykte interferoner har vist seg virkningsfulle i in vitro-undersøkelser og, i den første sådanne demonstra-sjon av sitt slag, også i in vivo-forsøk, idet sistnevnte innbefatter det første ferdige leukocyttinterferon som er fremstilt mikrobielt.

Uttrykket "ferdig leukocyttinterferon" brukt i sammenheng med foreliggende søknad angir et mikrobielt (f.eks. bakterielt) fremstilt interferonmolekyl uten glykosylgrupper. Ferdig leukocyttinterf eron fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes umiddelbart fra et translasjonsstartsignal (ATG) akkurat før det første aminosyrecodon av det naturlige produkt. Det "ferdige" polypeptid kan således inneholde som første aminosyre i sekvensene metionin (som ATG koder for) uten å særlig endre sin karakter. På den annen side kan den mikrobielle vert få translasjonsproduktet ved å fjerne det første metionin. Ferdig leukocyttinterferon kunne uttrykkes sammen med et konjugert protein forskjellig fra den konvensjonelle leder, idet konjugatet spesifikt er spaltbart i et intra- eller ekstracellulært miljø (se britisk patent nr. 2007676A). Til slutt kunne det ferdige interferon fremstilles i sammenheng med et mikrobielt "signal" peptid som transporterer konjugatet til celleveggr en hvor signalet fjernes og det ferdige polypeptid utsondres. "Ekspresjon" av ferdig leukocyttinterferon betegner bakteriell eller annen mikrobiell produksjon av et interferonmolekyl som ikke inneholder noen glykocylgrupper eller en presekvens som umiddelbart henger sammen med m-RNA overføring av et humant leukocyttinterferon-genom.

Spesielle leukocyttinterferon-proteiner herav er blitt de-finert ved hjelp av fastlagt DNA gen (figur 3 og 8) og de-duktiv aminosyresekvensbestemmelse (figur 4 og 9). For disse spesielle interferoner, faktisk hele familien av leukocyttinterf eronproteiner omfattes herunder, eksisterer og opptrer naturlig arvemessige variasjoner fra individ til individ. Disse variasjoner kan påvises ved (en) aminosyre-forskjell(er) i den totale sekvens eller ved utelatelser, substitusjoner, innsetninger, inversjoner eller addisjoner av (en) aminosyre(r) i denne rekkefølgen. For hvert leukocyttinterf eronprotein herunder, inngår merkede LelF A til LelF J slike arvemessige variasjoner innenfor rammen av merkingen . eller uttrykket som angir slike.

Beskrivelse av tegningene

Figur 1 angir 2 aminosyresekvenser som var felles for alle interferonarter isolert fra humanleukocytter og renset til homogen tilstand kalt T-l og T-13. Alle potensielle mRNA-sekvenser som koder for disse peptider er vist samt de tilsvarende DNA sekvenser. Bokstavene A, T, G, C og U betegner henholdsvis nukleotidene Som inneholder basene adenin, thymin, guanin, cytosin og uracil. Bokstaven N betegner hvilket som helst av nukleotidene A, G, C og U. Polynukleo-tider er angitt lest fra 5' (venstre) i 3' (høyre) retningen, og hvor dobbeltkjedet ("d.s.") DNA er angitt, vice-versa for bunnen eller ikke-kodingskjeden. Figur 2 er et autoradiogram som viser hybridisering av pot- ( 32

ensielle LelF plasmider med p<->merkede syntetiske deoksyoligonukleotider.

Figur 3 viser nukleotidsekvensen for 8 genfragmenter isolert som kandidater for bruk i ekspresjon av leukocyttinterferoner, henholdsvis betegnet "A" til "H". Start- og stoppkodonene for hver LelF er understreket.

Stoppkodonene eller avslutningstriplettene

er etterfulgt av 3" ikke-translaterte områder.

Det innsatte fullengdegen for LelF A mangler et kodon som finnes i de andre viste som angitt i den tredje A linje i fig. 3. 5' ikke-translaterte områder går forut for leader-sekvensene. Isolert mangler fragment E den fullstendige presekvens av leader , men inneholder det fullstendige gen for det antatte ferdige LelF E. Fragment G isolert, mangler den fulle kodesekvens.

Figur 4 er en sammenligning av de 8 LelF proteinsekvens-

£5r som er bestemt fra nukleotidsekvenser. En-bokstavs-for-kortelsene som anbefales av IUPAC-IUB Commission on Biochem-ical Nomenclature brukes: A, alanin, C, cystein, D asp-artinsyre, E, glutaminsyre, F, fenylalanin, G, glycin, H, histidin, I, isoleucin, K, lysin, L, leucin, M, metionin, N, aspargin, P, prolin, Q, glutamin, R, arginin, S, serin, T, treonin, V, valin, W, tryptofan og Y, tyrosin. Tallene refererer ti-1 aminosyreposisjoner (S refererer til signalpeptid). Bindestreken i 165 aminosyre LelF A sekvensen i posisjon 44 er innført for å innrette LelF A sekvensen etter 166 aminosyresekvensen for de andre LelF'er. Pilen angir i-faseavslutning av kodoner. Aminosyrer felles for alle LelF<*>er (unntatt pseudogene LelF E) er også vist. De understrekede rester er aminosyrer som også er tilstede i human fibroblastinterferon.

Figur 5 viser restriksjonsendonukleasekart for de 8 typer LelF klonet cDNA1 er (A til H) . Hybrid plasmidene ble konstruert ved dC:dG konstruksjonsmetoden (Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 411-416 [1980]. Derfor kan cDNA innsatser utføres ved bruk av Pstl. Linjene ved enden av hver cDNA innsats angir de flankerende homopolymere dC:dG haler. Posisjonene til PvuII, EcoRI og Bglll restriksjonspunkter er angitt. Skyggelagte områder i figuren representerer kodesekvenser for ferdige LelF'er, og de skraverte områdene angir signalpeptidkodesekvenser, og det åpne området viser

3' og 5' ikke-kodende sekvenser.

Figur 6 viser skjematisk konstruksjonen av et gen som koder for den direkte mikrobielle syntese av ferdig LelF A. Re-striks jonspunkter og rester er som vist ("Pstl", etc). Uttrykket "b.p." betegner "basepar". Figur 7 (ikke gradert) viser skjematisk et restriksjonskart av to gen-fragmenter anvendt i produksjon av ferdig leukocyttinterf eron LelF B. Codonsekvensene som er angitt fer avslutningen av den kodende region som følger ved nedbrytning med restriksjonsenzymet Sau3a i de to viste tilfeller. Figur 8 og 9 gir DNA og aminosyre (se fig. 4 ovenfor med hensyn til tilsvarende en-bokstavs-forkortelser) sekvenser for fem LelF proteiner herav, inklusive typer I og J. I fig. 9 angir stjernen en avslutningscodon i den tilsvarende DNA sekvens og bindestreken en utelatelse.eller hull i sekvensen.

BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

A. Anvendte mikroorganismer

Det heri beskrevne arbeid omfattet bruk av 2 mikroorganismer: E. coli x 1776 som beskrevet i U.S.P. 4.190.495 og E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi , hsr , hsm*), som beskrevet i britisk patent nr. 2055382 A. Hver var blitt deponert hos American Type Culture Collection (ATCC nr. 31537 henholdsvis 31446). Alt rekombinant DNA arbeide ble utført i overensstemmelse med de anvendelige retningslinjer fra National Institutes of Health.

Oppfinnelsen i sine sterkest foretrukne utførelsesformer

er beskrevet under henvisning til E. coli, omfattende ikke bare stammene E. coli x 1776 og E. coli K-12 stamme 294 som er -angitt ovenfor, men også andre kjente E. coli stammer,

så som E. coli B, eller andre mikrobielle stammer, hvorav mange er innlevert og tilgjengelige fra anerkjente mikroorganisme-deponeringsinstutisjoner så som American Type Cul-

ture Collection. Se også DOS 2644432. Disse andre mikroorganismer omfatter f.eks. Bacilli så som Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae blant hvilke kan nevnes som eksempler Salmonella typhimurium og Serratia marcescens, som kan anvende plasmider som kan replikere og uttrykke heterologe gensekvenser deri. Gjær så som Saccharomyces cerevisiae kan også med fordel anvendes som vertsorganisme i fremstillingen av interferonproteiner ved uttrykning av gener som koder for disse under kontroll av en gjærpromoter.

B. Kilde og rensning av LelF m- RNA

LelF m-RNA kan fremstilles fra human leukocytter, normalt sådanne fra pasienter med kronisk ryggmargsleukemi, som er blitt indusert til å produsere interferon med Sendai eller Newcastle - virus som beskrevet i f.eks. DOS nr. 2947134. En særlig foretrukket kilde, og den som brukes i foreliggende arbeide, er en cellelinje kalt KG-1 fra en pasient med akutt ryggmargsleukemi. Cellelinjen som er beskrevet av Koeffler, H.P. and Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), vokser godt i et kulturmedium omfattende RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 pluss 10 % varmei.nak-tivert FCS, (føtalt kalveserum). 25 mM HEPES buffer

(N-2-hydroksyetyl-piperazin-N<1->2-etan-sulfonsyre) og 50 p<g>/ ml gentamicin, og subkultiveres 1 til 3 splitt to ganger om uken. Celler kan fryses fra foran nevnte vekstmedium pluss 10 %'ig dimetylsulfoksyd. KG-1 er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC nr. CRL 8031) .

KG-1 celler ble indusert til å produsere leukocyttinterferon mRNA med Sendai eller Newcastle - virus etterfulgt av den metode som er beskrevet av Rubinstein et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76, 640-644 [1979]). Celler ble høstet 5 timer etter induksjon og RNA fremstilt ved guanidin tiocyanat-guanidin hydroklorid-metoden (Chirgwin et al. Biochemistry .18, 5294-5299 [1979]). RNA fra ikke-induserte celler ble isolert på samme måten. Oligodeoksytymidin (dT) - cellulosekromatografi og sukrosegradient ultrasentri - fugering ble brukt for å oppnå 12S fraksjonen av poly (A) mRNA som beskrevet av Green et al. (Arch. Biochem. Biophys.

172, 74-89 [1976] og Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188' 98-104 [1978]).Dette m-RNA 'et hadde en interfer-onstyrke på 8000-10 000 enheter pr. mikrogram i Xenopus laevis oocyte bestemmelsen (Cavalieri et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74, 3287-3291 [1977]).

C. Fremstilling av kolonibanker inneholdende LelF cDNA

sekvenser

5 >ig mRNA ble brukt for fremstilling av dobbeltkjedet cDNA ved standardmetoder (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 [1978] og Goeddel et al., Nature 281, 544-548

[1979]). cDNA ble fraksjonert etter størrelse ved elektroforese på en 6 % polyakrylamidgel og 230 ng materiale varierende i størrelse fra 500 til 1500 b.p. ble isolert ved elektroeluering. En 100 ng porsjon av dette cDNA ble avsluttet med deoksycytidin (dC) rester som beskrevet av Chang et al., Nature 225, 617-624 (1978), behandlet med 470 ng plasmid pBR3 22 som var blitt avsluttet med deoksyguanosin (dG) rester på Pstl punktet (Bolivar et al., Gene 2, 95-113

[1977]), og brukt for å transformere E. coli x 1776. Omtrent 130 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive transformanter ble erholdt pr. ng cDNA.

I et andre lignende eksperiment erholdes ca. 1000 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive E. coli K-12 stamme 294 transformanter pr. ng cDNA. I dette tilfelle isoleres størrelsesfraksjonert cDNA materiale varierende i størrelse fra 600 til 1300 b.p. ved elektroeluering for dC avslutning.

D. Fremstilling av syntetiske oligonukleotider og bruk av

disse

Kjennskapen til aminosyresekvensen til flere tryptiske fragmenter av humant leukocyttinterferon muliggjorde konstruksjonen av syntetiske deoksyoligonukleotider som var komplementære til forskjellige regioner hos LelF m-RNA. De to tryptiske peptider Tl og T13 ble valgt fordi de hadde aminosyresekvenser som krevet syntese av henholdsvis bare 12 og 4 undekamerer for å oppfylle alle mulige kodingssekvenser (figur 1). Fire sett deoksyoligonukleotideprøver ble syntetisert for hver.sekvens inneholdende enten tre (T-lA, B, C, D) eller en (T-13A, B, C, D) oligonukleotider hver. De angitte komplementære deoksyoligonukleotider 11 baser lange ble syntetisert kjemisk ved fosfotriestermetoden (Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75, 5765-5769 [1978]). Fire individuelle prøver ble fremstilt i T-13-seriene.

De tolv T-l-prøvene ble fremstilt i fire forråd på tre prøv-er som vist i fig. 1.

De fire individuelle prøver av T-13 seriene og de tolv T-l prøver fremstilt i fire forråd på tre primere hver ble brukt for å prime syntesen av radioaktivt merket enkeltkjedet cDNA for bruk som hybridiseringsprøver. Sjablon mRNA var-enten 12S RNA fra Sendai-induserte KG-1 celler (8000 enheter IF aktivitet pr. p. g) eller total poly (A) mRNA fra ikke-induserte leukocytter (< 10 enheter pr. ug).

32

P-: merket cDNA ble fremstilt fra disse primere ved bruk av kjente reaksjonsbetingelser (Noyes et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 7j>, 1770-1774 [1979]). 60 >il reaksjonene ble utført i 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 20mM KC1, 8mM MgCl2, 3 0 mM (3-merkaptoetanol. Reaksjoner omfattet et ug for hver primer (dvs. 12 yig totalt for T-l serier, 4 ug totalt for T-13 serier), 2 ug for "induserte" 12S fraksjoner mRNA (eller 10 ug for ikke-induserte poly (A) mRNA), 0.5mM dATP, dCTP, 32

dTTP, 200 uCi (a P)dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmol), og 60 enheter revers transkriptase . Produkt ble adskilt fra ikke-innført markering ved gelfiltrering på en 10 ml "Sephadex" G-50 kolonne behandlet med 0.3N NaOH i 30 min. ved 70°C for å destruere RNA og nøytralisere med HC1. Hybridiseringer ble utført som beskrevet av Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979) .

E. Identifisering av kloner pLl- pL30

Den hurtige plasmidisoleringsmetoden til Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979) ble brukt for å frem-stille 1 ug plasmid DNA fra hver av 500 individuelle E. coli K-12 stamme 2 94 transformanter (se C). Hver DNA prøve ble denaturert og brakt på nitrocellulosefiltere in triplo etterfulgt av metoden til Kafatos et al. (se ovenfor).

De tre sett nitrocellulosefiltere som inneholdt de 500 plas-midprøver ble hybridisert med

a) indusert cDNA primet med T-l settet av primere,

b) T-l3 primet indusert cDNA, og

c) Ikke-indusert cDNA fremstilt ved bruk av begge sett

primere. Kloner ble betraktet som positive hvis de hybridiserte sterkere til en eller begge de induserte cDNA prøver enn til den totale ikke-induserte prøve. Tredve "positive" kloner (pLl-pL30) ble utvalgt fra 500 for videre analyse.

F. Identifisering av kloner pL31- pL39

Isolering av et plasmid ( nr. 104) inneholdende et LelF

gen- fragment

Transformanter av E. coli x 1776 ble undersøkt ved koloni-hybridiseringsmetoden til Grunstein and Hogness (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975] ved bruk av <32>P-merket indusert mRNA som prøve (Lillenhaug et al., Biochemistry, 1_5, 1858-1865 [1976]). Ikke-merket mRNA fra ikke-induserte celler ble blandet med prøver i et forhold på 200 til 1 for å konkurrere med ikke-indusert mRNA som

32

var tilstede i det P-merkede preparat. Hybridisering av merket m-RNA skulle fortrinnsvis opptre hos kolonier som inneholdt induserte sekvenser. Tre klasser av transformanter erholdtes:

32 (1) 2-3 % av koloniene hybridiserte meget sterkt til P-mRNA,

(2) 10 % hybridiserte betydelig mindre enn klasse 1, og

(3) Resten ga ikke noe påviselig hybridiseringssignal.

De positive kolonier (klasse (1) og (2)) ble undersøkt med hensyn til nærvær av interferonspesifikke sekvenser gjennom en undersøkelse som avhengér av hybridisering hos interferon mRNA spesifikt til plasmid DNA. Først ble 60 sterke positive kolonier (klasse 1) dyrket individuelt i 100 ml M9 medium tilsatt tetracyklin (20 ug/ml) , diaminopimelinf- : syre (100 ug/ml), thymidin (20 ug/ml), og d-biotin (1 ug/ml). M9 mediet inneholdt pr. liter Na2HP04 (6g), KH2P04 (3 g), NaCl (0,5 g) og NH4C1 (1 g). Etter autoklavering tilsettes 1 ml sterilt IM MgS04 og 10 ml sterilt 0.01 M CaCl2. Ti kulturer ble slått sammen og plasmid DNA isolert fra de seks forråd som beskrevet av Clewell et al., Biochemistry 9_, 4428-440 [1970]. Ti ug av hvert plasmid DNA forråd ble spaltet med Hindlll, denaturert og kovalent bundet til DBM (diazobenzyloksymetyl)papir. Et ;ug renset mRNA fra induserte celler ble hybridisert til hvert filter. Ikke-hybridisert mRNA ble fjernet ved vask. Det spesifikt hybridiserte mRNA ble eluert og overført i Xenopus laevis oocytter. I denne prøven var alle 6 forråd negative. 5 forråd på 10 kolonier hver og ett forråd på 9 kolonier hver ble fremstilt fra 59 svakt positive kolonier, (klasse 2) og plasmider ble fremstilt fra forrådene og undersøkt som ovenfor.

Blant de 6 undersøkte pooler hybridiserte et (K10) til interferon mRNA på nivåer betydelig høyere enn bakgrunns-nivåene hver gang det ble prøvet. For å identifisere det spesifikke interferon cDNA klon ble plasmid DNA'er fremstilt fra de 9 kolonier av forråd K10 og undersøkt enkelt-vis. 2 av de 9 plasmider (nr. 101 og nr. 104) bandt- interferon mRNA godt over bakgrunnsnivået. Fra plasmid nr. 104 ble et unikt Bglll restriksjonsfragment inneholdende 260

32

b.p. isolert, merket med p ve^ bruk av den metode som er beskrevet av Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), og brukt som prøve for uavhengig å utprøve 4 00 E. coli 294 transformanter ved en in situ koloni-utprøvnings-metode (Grunstein and Hogness, Proe. Nati. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]). 9 kolonier (pL31-pL39) ble identifisert som hybridiserte i forskjellig grad med denne prøven.

Dertil ble merket 260 b.p. fragment brukt til uavhengig å utprøve 4 000 E. coli 294 transformanter på samme måte.

50 kolonier ble identifisert som hybridisert i forskjellig grad med denne prøven. En inneholdt LelF G fragmentet, en inneholdt LelF H fragmentet og en inneholdt et fragment kalt

LelF Hl, en åpenbar allele til LelF H. Hybridplasmidene

som resulterte kalles "pLelF H", etc.

G. Isolering og sekvensering av et første full- lengde

LelF gen

Plasmid DNA ble fremstilt fra alle 39 potensielle LelF cDNA kloner og utprøvet på nytt medden samme 2 60 b.p. DNA prøve ved bruk av hybridiseringsmetoden til Katatos et al. (se ovenfor). Tre plasmider (pL4, pL31, pL34) ga meget sterke hybridiseringssignaler, 4 (pLl3, pL30, pL32, pL36) hybridiserte moderat, og 3 (pL6, pL8, pL14) hybridiserte svakt med prøven.

De 39 potensielle LelF cDNA rekombinante plasmider ble også

32

utprøvet ved å bruke P merkede syntetiske undekamerer (individuelle T-l primer forråd eller individuelle T-13 primere) direkte som hybridiseringsprøver. Hybridiseringsbe-tingelsene ble valgt slik at perfekt baseparing skulle være nødvendig for påviselige hybridiseringssignaler (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 [1979]). Således ble plasmid DNA fra 39 kloner fremstilt gjennom en standard-klaret lysatmetode (Clewell et al., se ovenfor) og renset ved "Biorad Agarose ■ A-50" kolonnekromatograf i. Prøver (3 pq) av hvert preparat ble linearisert ved behandling med Eco RI denaturert i alkali og avsatt på 2 separate nitrocellulosefiltere, 1,5 ^ug pr. avsetning (Kafatos et al., se ovenfor). Individuelle syntetiske deoksyoligonukleotide primere og

32

primerforråd ble fosforylert med (y P)ATP som følger:

32

50 pmol oligonukleotid og 100 pmol (y P)ATP

2500 Ci/mmol ble kombinert i 30 ;il 50mM Tris-HCl,

10 mM MgC^/ 15 mM 3-merkaptoetanol. 2 enheter T4 polynuk-leotid kinase ble tilsatt og etter 30 min. ved 37°C ble 32 32

P~ merkede primere renset ved kromatografi på 10 ml "Sephadex G-5o"kolonner. Hybridiseringer ble foretatt med 10 cpm eller primer T-13C eller 3 x:IO6 cpm av primerforråd T-1C. Hybridiseringene ble utført ved 15°C i 14 timer i 6 x SSC [1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat, pH 7.2], 10 x Denhardfs' [0,2 % kvegserumalbumin, 0,2 % poly-polyvinylpyrolidon, 0,2 % "Ficoll"] oppløsning, som beskrevet av Wallace et al- (se ovenfor). Filtere ble vasket i 5 min.

(3 ganger) ved 0°C i 6 x SSC, tørket, og utsatt for røntgen-32

film. Resultatene er vist i fig. 2 for P-primerforråd T-13C og primer T-1C.

Plasmid DNA fra klon 104 ble funnet å gi signifikant hybridisering med primerforråd T-1C og primer T-13C, men ingen påviselig hybridisering med de andre undekamerer. Som vist i figur 2 hybridiserte også flere av de 39 potensielle LelF plasmider (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) med begge disse prøver. Imidlertid, viste restriksjonsanalyse at bare en av disse plasmider, p.L31, også inneholdt et 260 b.p. inter-nt Bglll fragment. Pstl behandling av pL31 viste at størr-elsen til cDNA innsatsen var ca. 1000 b.p.

Hele Pstl innsatsen av pL31 ble sekvensbestemt ved både Maxam-Gilbert kjemiske metode (Methods Enzymol. 65, 4 99-560

[1980] og dideoksykjedeavslutningsmetoden (Smith, Methods Enzymol. 65, 560-580 [1980]) etter subkloning av Sau3a fragmenter til en M13 vektor. DNA sekvensen vises ("A") i fig.

3. Den riktige translasjonslesin9srammen kunne forutsies fra proteinsekvensinformasjonen under kontroll, det kjente området for LelF molekylvekter, og den relative forekomst av stopptripletter i de 3 mulige leserammer, og det muliggjorde igjen å forutsi LelF aminosyresekvensen innbefattet et pre- eller signalpeptid. Det første ATG transkripsjons-initieringscodon finnes 60 nukleotider fra 5'enden av sekvensen og følges, 188 codoner senere av en TGA avslutnings-triplett; det er 34 2 ikke-transkriberte nukleotider ved 3'enden, etterfulgt av en poly (A) sekvens. Det antatte signalpeptid (antagelig involvert i utskillelsen av ferdige LelF

fra leukocytter) er 23 aminosyrer langt. De 165 aminosyrer som utgjør det ferdige LelF har en kalkulert molekylvekt på 19 390. LelF som er kodet med pL31 kalles "LelF A". Man kan se fra sekvensdataene ("A") i fig. 4 at de tryptiske peptider Tl og T13 i LelF B tilsvarer aminosyrer 14 5 - 14 9 og henholdsvis 57 til 61 av LelF A. Den faktiske DNA kod-ingssekvens som finnes i disse 2 regioner er de som er angitt av primerforråd Tl-C og primer T13-C (se fig. 8).

H. Direkte ekspresjon av ferdig leukocyttinterferon A

( LelF A)

1. Generelt

Den fremgangsmåte som følges for å uttrykke LelF A direkte som et ferdig interferon polypeptid er en variant av den som tidligere ble anvendt for humane veksthormoner (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]), forsåvidt som den innbefatter kombinasjonen av syntetiske (N-terminale) og komplementære DNA1 er.

Som vist i fig. 6 lokaliseres et Sau3a restriksjonsendonu-kleasepunkt lett mellom codohene 1 og 3 i LelF A. 2 synte- • tiske deoksyoligonukleotider ble konstruert som inneholder et ATG transkripsjons-initieringskodon, gjengir codonet for aminosyre 1 (Cystein), og skaper en EcoRI festende ende. Disse oligomerer ble bundet til et 34 b.p. Sau3a - Avall-fragment av pL31. Det resulterende 4 5 b.p. produkt ble bundet til 2 ytterligere DNA fragmenter for å konstruere et 865 b.p. syntetisk-naturlig hybridgen som koder for LelF A og som er spaltet av EcoRI og Pstl restriksjonspunkter. Dette gen ble innsatt i pBR322 mellom EcoRI og Pstl punkter og ga plasmidet pLelF Al. 2. Konstruksjon av tryptofan- kontrollelementet ( inneholdende E. coli trp promotor, operator og trp leder ribo-som- bindingspunktfmen mangler en ATG sekvens for initiering av translasjon).

Plasmid pGMl bærer E. coli tryptofanoperon inneholdende delesjonen .&LE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 [1978] og uttrykker følgelig et fusjonsprotein inneholdende de første 6 aminosyrer av trp lederen og ca. den siste tredjedel av trp E polypeptidet (i det følgende henvist til i sammenheng som LE<1>), samt trp D polypeptidet i sin helhet, alt under kontroll av trp promotor-operator-systemet. Plasmid, 20 ug, ble behandlet med restriksjonsenzymet PvuII som spalter plasmidet på 5 steder. Genfragmenter ble deretter kombinert med EcoRI bindere (bestående av et selvkomplementerende oligonukleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG) som ga et EcoRI spaltningspunkt for en senere kloning til et plasmid inneholdende et EcoRI punkt. De 2 0 ug DNA fragmenter som erholdtes fra pGMl ble behandlet med 10 enheter T DNA ligase i nærvær av 200 pmol 5<1->fosforylert syntetisk oligonukleotid pCATGAATTCATG og i 20 ul T DNA ligasebuffer (20mM Tris, pH 7.6, 0.5 mM ATP, 10 mM MgCl , 5 mM ditiotreitol) ved 4 C natten over. Løsningen ble så oppvarmet 10 min. ved 7 0°C for å stoppe ligeringen. Kjedene ble spaltet ved EcoRI behandling og fragmentene, nå med EcoRI ender, ble skilt fra ved bruk av 5 % polyakrylamidgel elektroforese (heretter PAGE) og de 3 største fragmenter isolert fra gelen ved først behandling med etidiumbromid, lokalisere fragmentet med ultrafiolett lys, og skjære fra gelen de interesante deler. Hvert gelfragment med 3 00 mikroliter 0.1 x TBE, ble plassert i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 V en time i 0.1 x TBE buffer (TBE buffer inneholder: 10.8 g Tris base, 5,5 g bor-syre, 0.09 g Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige løsning ble oppsamlet fra dialyseposen, fenol ekstrahert, kloroform-ekstrahert og gjort 0.2 M natriumklorid, og DNA isolert i vann etter etanolutfelling. Det trp promotor-operator-holdige gen med EcoRI-bindende ender ble identifisert i den neste beskrevne metode, som omfatter innføring av fragmenter i et tetracyklinsensitivt plasmid, som etter promotor-operator-innsetning, blir tetracyklinresistent.

Plasmid pBRHI (Rodriguez et al,., Nucleic Acids Res. j>, 3267-3287 [1979]) uttrykker ampicillinresistens og inneholder genet for tetracyklinresistens, men, da det ikke er noen til-knyttet promotor, uttrykker det ikke den resistensen. Plasmidet er følgelig tetracyklinsensitivt. Ved å innføre et promotor-operator-system på EcoRI punktet, kan plasmidet gjøres tetracyklinresistent.

pBRHl ble behandlet med EcoRI og enzymet fjernet ved fenol-ekstraksjon etterfulgt av kloroformekstraksjon og isolert i vann etter etanolutfelling. Det resulterende DNA molekyl ble i adskilte reaksjonsblandinger kombinert med hvert av de 3 DNA fragmenter som erholdtes ovenfor og ligert med T4 DNA ligase som forut beskrevet. Det tilstedeværende DNA i

reaksjonsblandingen ble brukt for å transformere kompetent . E.coli K-12 stamme 294 gjennom standard teknikker (Hersh-field et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 7JL, 3455-3459

[1974]) og bakteriene satt på LB (Luria-Bertani) plater inneholdende 20 ug/ml ampicillin og 5 ug/ml tetracyklin. Flere tetracyklinresistente kolonier ble utvalgt, plasmid DNA isolert og tilstedeværelsen av det ønskede fragment bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Det resulterende plasmid kalles pBRHtrp.

Et EcoRI og BamHI behandlingsprodukt av virusgenomet av hepatitt B ble oppnådd med konvensjonelle midler og klonet i EcoRI og BamHI stillingene i plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) og ga plasmidet pHS32. Plasmid pHS 32 ble spaltet med Xbal, fenolekstrahert, kloroformekstra-hert og etanolutfelt. Det ble så behandlet med 1 ul E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment i 30 ul polymerasebuffer (50 mM kaliumfosfat pH 7.4, 7mM MgCl2, 1 mM p-merkaptoetanol) inneholdende 0.1 mM dTTP og O.lmM dCTP i 30 min. ved 0°C og deretter 2 timer ved 37°C. Denne behandlingen får 2 av de 4 nukleotider som er komplementære til den 5' utstikkende ende av Xbal spaltningssted-et til å fylles inn:

2 nukleotider, dC og dT, ble innsatt og ga en ende med 2

5' utstikkende nukleotider. Denne lineære rest av plasmid pHS32 (etter fenol- og kloroformekstraksjon)og gjenvinning i vann etter etanolutfelling) ble spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragmentet ble adskilt fra det mindre EcoRI-Xbal fragment ved PAGE og isolert etter elektroeluering. Dette DNA fragment fra pHS32 (0.2 ug), ble ligert under lignende betingelser som de som er beskrevet ovenfor til EcoRI-Taql fragmentet av tryptof an operon (~0.01 pg) , avledet fra pBRHtrp.

I fremgangsmåten for ligering av fragmentet fra pHS32 til

EcoRI - Taql fragmentet som beskrevet ovenfor, ligeres Taql utstikkende ende til Xbal gjenværende ende selv om det ikke er fullstendig Watson-Crick baseparet:

En del av denne ligeringsreaksjonsblandingen ble overført til E. coli 294 celler, varmebehandlet og satt på LB plater inneholdende ampicillin. 24 kolonier ble utvalgt, dyrket i 3 ml LB (Luria-Bertani) medier, og plasmid isolert. 6 av disse ble funnet å ha Xbal posisjonen^regenerert via E. coli katalysert DNA reparasjon og replikasjon:

Disse plasmider ble også funnet å spalte både med EcoRI

og Hpal og gi de ventede restriksjonsfragmenter. Et plasmid kalt pTrpl4, ble brukt for ekspresjon av heterologe polypeptider som omtalt' i det følgende.

Plasmidet pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979] inneholder et gen for humant veksthormon bygget opp av 23 aminosyrecodoner produsert fra syntetiske DNA fragmenter og 163 aminosyrecodoner erholdt fra komplementært DNA fremstilt gjennom revers transkripsjon av humant veksthormon m-RNA. Dette genet, selv om det mangler codonene til "pre" sekvensen til humant veksthormon, inneholder et ATG translasjonsinitieringskodon. Genet ble isolert fra 10 pg pHGH 107 etter behandling med EcoRI etterfulgt av E. coli DNA polymerase I Klenow fragment og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling-ble plasmidet behandlet med BamHI.

Det humane veksthormon (HGH) genholdige fragment ble isolert ved PAGE etterfulgt av elektroeluering. Det resulterende DNA fragment inneholder også de første 350 nukleotider av det tetracyklinresistente strukturgenet, men mangler tet-racyklinpromotor-operatorsystemet, slik at ved påfølgende kloning i et ekspresjonsplasmid, kan plasmidene som inneholder innsatsen lokaliseres ved restaurering av tetracyk-linresistensen. Fordi EcoRI enden til fragmentet er satt inn gjennom Klenow polymerase I -metoden, har fragmentet en frastøtende og en festende ende, hvilket sikrer riktig orientering ved senere innsetting i et ekspresjonsplasmid.

Ekspresjonsplasmidet pTrpl4 ble så fremstilt for mottagelse av det HGH geneholdige fragment fremstilt ovenfor. Således blepTrpl4 Xbal behandlet og de resulterende festende ender fylt opp ved Klenow polymerase I -metoden ved anvendelse av dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble det resulterende DNA behandlet med BamHI og det resulterende store plasmidfragment isolert ved PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-avledede fragment har en frastøtende og en festende ende som muliggjør rekombi-nering med riktig orientering med det HGH genh°ldige fragment som forut er beskrevet.

HGH genfragmentet og pTrpl4 AXba-BamHI fragmentet ble kombinert og føyet sammen under lignende betingelser som de som er beskrevet ovenfor. De innsatte Xbal og EcoRI ender ligerte sammen ved avvisende-endeligering.og gjenskapte både Xbal og EcoRI punktene.

Denne konstruksjonen gjenskaper også det tetracyklinresistente gen. Da plasmidet pHGH 107 uttrykker tetracyklinresistens fra en promotor som ligger oppstrøms for HGH

genet (lac-promotoren), hvilken konstruksjon kalles pHGH 207, og muliggjør ekspresjon av genet for tetracyklinresistens under kontrollen av tryptofanpromotor-operatoren. Således ble ligeringsblandingen overført i E. coli 294 og kolonier

utvalgt på LB plater som inneholdt 5 ug/ml tetracyklin.

Plasmid pHGH 207 ble EcoRI behandlet og et 300 b.p. fragment inneholdende trp promotoren, operatoren og trp leader-ribosombindende punkt men manglet en ATG sekvens for initiering av translasjon ble isolert fra PAGE etterfulgt av elektroeluering. Dette DNA fragment ble klonet i EcoRI stillingen til pLelF A. ^Plasmider som inneholdt det ovenfor modifiserte trp regulon (E. coli trp operon fra hvilket attenuatorsekvensen er fjernet for kontroller-bart å høyne ekspresjonsnivåer) kan dyrkes til forutbestem-te nivåer i et næringsmedium som inneholder ytterligere tryptofan i tilstrekkelige mengder til å hemme promo-ter-operatorsystemet, deretter fratas tryptofan for å gjen-fortrenge systemet og forårsake ekspresjon av det tilsiktede produkt.

Nærmere bestemt og under henvisning til fig. 6 ble 250 p.g plasmid pL31 behandlet med Pstl og 1000 b.p. innsatsen isolert ved gelelektroforese på en 6 % polyakrylamidgel. Ca.

4 0 ug innsats ble elektroeluert fra gelen og oppdelt i 3 alikvoter for viderebehandling: a) En 16 ug prøve av dette fragmentet ble partielt behandlet med 4 0 enheter Bglll i 4 5 min. ved 37°C og reaksjonsblandingen renset på en 6 % polyakrylamidgel. Ca. 2 ug av det ønskede 67 0 b.p. fragment ble isolert. b) En annen prøve (8 ug) av 1000 b.p. Pstl innsatsen ble spaltet med Avall og Bglll. Et >ig

av det angitte 150 b.p. fragment ble isolert etter gelelektroforese. c) 16 ^ug av 1000 b.p. stykket ble behandlet med Sau3a og Avall. Etter elektroforese på en 10 % polyakrylamidgel, ble ca. 0.25 ug (10 pmol) av 34 b.p. fragmentet isolert. De to angitte deoksyoligonukleotider, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) og 5'-dGATCACACATG (fragment 2) ble syntetisert ved fosfotriestermetoden. Fragment 2 ble

32 fosforylert som følger. 200 ul (/n/4 0 pmol) av ( y P) ATP 5000 Ci/mmol ble tørket og oppløst i 30 ul 60 mM Tris-HCl (pH8) , lOmM MgCl2, 15 mM [3-merkaptoetanol, inneholdende 100 pmol DNA fragment og 2 enheter T4 poly-nukleotidkinase. Etter 15 min. ved 37°C ble 1 ul lOmM ATP

tilsatt og reaksjonen fikk fortsette ytterligere 15 min. Blandingen ble så oppvarmet ved 70°C i 15 min., kombinert med 100 pmol 5<1->OH fragment 1 og 10 pmol av 34 b.p. Sau3a

- Avall fragmentet. Ligering ble utført i 5 timer ved 4°c i 50 ul 20mM Tris-HCl (pH7.5] lOmM Mg Cl2, 10 mM ditiotreitol, 0.5mM ATP og 10 enheter T4 DNA ligase. Blandingen ble underkastet elektroforese på en 6 % polyakrylamidgel og45 b.p. produktet isolert ved elektroeluering. Ca. 30 ng (1 pmol) av 45 b.p. produktet ble kombinert med 0.5 ug (5 pmol) av 150 b.p. Avall - Bglll fragmentet og 1 ug (2 pmol) av 670 b.p. Bglll - Pstl fragmentet. Ligeringen ble utført ved 2 0°C i 16 timer ved bruk av 20 enheter T4 DNA ligase. Ligasen ble inaktivert ved oppvarmning til 65°C i 10 min. Blandingen ble så behandlet med EcoRI og Pstl for å fjerne poly-merene fra genet. Blandingen ble renset ved 6 % PAGE.

Ca. 20 ng (0.04 pmol) av 865 b.p. produkt ble isolert. Halvparten (10ng) av dette ble ligert til pBR322 (0.3 ug) mellom EcoRI og Pstl punktene. Transformering av E. coli 294

ga 70 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive transformanter. Plasmid DNA isolert fra 18 av disse transformanter ble behandlet med EcoRI og Pstl. 16 av de 18 plasmider hadde et EcoRI - Pstl fragment 8 65 b.p. i lengde. En ug av en av disse, pLelF Al, ble behandlet med EcoRI.og lig-

ert til 300 b.p. EcoRI fragmentet (0.1 ug) inneholdende E. coli trp promotoren og trp lederribosombindingspunktet, fremstilt som beskrevet ovenfor. Transformanter inneholdende trp promotoren ble fastslått ved å bruke en <32>P-trp prøve i forbindelse med Grunstein-Hogness koloni-utplukk-ingsmetoden. Et asymetrisk plassert Xbal punkt i trp fragmentet muliggjorde bestemmelse av rekombinanter hvori trp promotoren var orientert i retning av LelF A genet.

I. In vitro og in vivo aktivitet av LelF A

Ekstrakter ble fremstilt for IF bestemmelse som følger: 1 ml kulturer ble dyrket i L medium inneholdende 5 ug/ml tetracyklin til en OD^^q verdi på ca. 1.0, så fortynnet til 25 ml M9 medium inneholdende 5 ug/ml tetracyklin. 10 ml prøver ble tatt ut ved sentrifugering når ODj-j-q nådde 1.0 og celle-pellets ble oppslemmet i 1 ml 15 % sukrose, 50 mM Tris-HCl

(pH 8.0), 50 mM EDTA. 1 mg lysozym ble tilsatt og etter 5 min. ved 0°C ble celler l<y>sert ved ultralyd. Prøvene ble sentrifugert 10 min. (15 000 omdr./rain.) og interferonaktiviteten i supernantene ble bestemt ved sammenligning med LelF standarder ved den cytopatiske virknings (CPE) inhiberingsmåling. For å bestemme antallet av IF molekyler pr. celle bruktes en LelF spesifikk aktivitet på 4 x 10Q enheter/mg.

Som vist i tabell 1, gir klon pLelF A trp 25, hvori trp promotoren var innsatt i den ønskede orientering, høye aktivitetsnivåer (så høye som 2.5 x 10 g enheter/liter). Som vist i tabell 2, virker IF produsert av E. coli K-12 stammen 294/pLeIF A trp 25 likt med autentisk human LelF, og det er stabilt ved behandling ved pH 2 og nøytraliseres av kanin-anti-human-leukocyttantistoffer. Interferonene opptrer med omtrentlig molkylvekt på 20 000.

In vivo-virksomheten til interferon krever tilstedeværelsen av makrofager og naturlige killer (NK) celler og in vivo-virkningen synes å innbefatte stimulering av disse celler. Således forble det mulig at interferonet som var fremstilt av E. coli 294/pLeIF A 25, samtidig med at det hadde anti-virusaktivitet i cellekulturbestemmelsen, ikke ville være aktivt i infiserte dyr. Videre kunne in vivo antivirusaktiviteten til det bakterielt fremstilte ikke-glykosylerte LelF A være forskjellig fra det glykosylerte LelF fra human "buffy coat" leukocytter. Derfor ble den biologiske aktiviteten til bakterielt syntetisert LelF A (2 % rent) sammen-lignet med buffy coat LelF (8 % rent) i letal encefalo-myocarditt (EMC) virusinfeksjonen hos ekornaper (tabell 3).

TABELL 2 Sammenligning av aktiviteter hos ekstrakter fra E. coli 294/pLeIF A 25 med standard LelF<*>

250 000 enheter/ml ekstrakt av E. coli 294/pLeIF A trp 25 beskrevet i tabell 1 ble fortynnet 500 ganger med minimalt essensielt medium som gir en spesifikk aktivitet på 500 enheter/ml. En leukocyttinterferonstandard (Wadley Institute) forut titrert mot NIH leukocyttinterferonstandard ble også fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 500 U/ml. En ml alikvoter ble justert til pH 2 med IN HC1, inkubert ved 4°C i 52 timer, nøytralisert ved tilsetning av NaOH og IF aktivitet bestemt ved standard CPE inhiberingsmåling. 25 ul alikvoter av 500 enheter/ml prøvene (ubehandlet) ble inkubert med 25 ul kanin anti-human leukocyttinterferon i 60 min. ved 37°C, sentrifugert ved 12 000 x g i 5 min. og supernantanten målt.

TABELL 3 Antiviruseffekt av forskjellige LelF preparater mot EMC virusinfeksjon hos ekornape

Alle aper var hanner (gjennomsnittsvekt 713 g) og hadde ingen EMC virus-antistoffer før infeksjonen. Apene ble in-fisert intramuskulært med 100 x LDr„ EMC virus (bestemt i mus). Kontrollbehandlede aper døde 134, 158 og 164 timer etter infeksjonen. Interferonbehandlinger med 10^ enheter var ad intravenøs vei ved -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 og 240 timer, i forhold til infeksjonen. Det bakterielle leukocyttinterf eron var en kolonnekromatografifraksjon fra et lysat av E. coli 294/pLeIF A 25 med en spesifikk aktivitet på 7.4 x 10 enheter/mg protein. Kontrollbakterieprotein-ene var en ekvivalent kolonnefraksjon fra et lysat av E. coli 294/pBR322 på 2 ganger total proteinkonsentrasjon. Leukocyttinterferonstandarden var Sendai virus indusert interferon fra normale human "buffy coat" celler, renset kromatografisk til en spesifikk aktivitet på 32 x 10^ enheter/mg protein.

Kontrollapene viste tiltagende letargi tap av balanse, slapp paralyse av baklemmene og vann i øynene som begynte ca. 8 timer før død. Interferonbehandlede aper viste ingen av disse abnormaliteter, og de forble aktive Jiele tiden og utviklet ingen viremi. Den ene ape i kontrollgruppen som ikke utviklet viremi etter 4 dager døde senest (164 timer etter infeksjon) men viste høye konsentrasjoner av virus

i hjerte og hjerne etter død. De interferonbehandlede aper utviklet ikke antistoffer mot EMC virus ved måling 14 og 21 dager etter infeksjon. Disse resultater viser at antivirus-virkningene til LelF preparatene i de infiserte dyr kan til-skrives interferon alene fordi de medfølgende proteiner er helt forskjellige i de bakterielle og i"buffy coatf-preparatene. Dertil viser disse resultater at glykosylering ikke er nødvendig for in vivo antivirusaktiviteten til LelF A.

j. Isolering av cDNA' er for ytterligere leukocyttinterferoner

DNA fra det fullstendig karakteriserte LelF A cDNA-holdige plasmid ble spaltet f ra med Pstl, isolert elektrof oretisk og

32

merket med P. Det resulterende radioaktivt markerte DNA ble brukt som en prøve for å utvelge ytterligere E. coli

2 94 transformanter, erholdt identisk som dem i del C, ved in situ koloniutvelgelsesmetoden til Grunstein og Hogness (se forut). Kolonier ble isolert som hybridiserte i forskjellig grad med prøven. Plasmid DNA fra disse kolonier og de 10 hybridiserende kolonier som er omtalt i del G ovenfor ble isolert med Pstl skjæring og karakterisert gjennom 3 forskjellige metoder. Først ble disse Pst fragmenter karakterisert ved sine restriksjons-endonukleasebehandlings-mønstere med enzymene Bgl II, Pvu II og Eco RI. Denne ana-lysen muliggjorde klassifisering av minst 8 forskjellige typer (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF

G og LelF H), vist i figur 5, som omtrentlig angir lokali-: teten av forskjellige restriksjonsskjæringer i forhold til den nåkjente for sekvens og kodesekvens av LelF A. En av disse, LelF D, antas å være identisk med den som er rapportert av Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980).

For det andre ble visse av DNA'ene prøvet ved hybridiserings-utvalgsbestemmelsen som er beskrevet av Cleveland et al., Cell 20, 95-105 (1980) med hensyn til evnen og selektivt fjerne LelF mRNA fra poly-A-holdige KG-1 celle RNA. LelF A, B, C og F var positive i denne bestemmelse. For det tredje ble sistnevnte Pst fragmenter innsatt i et ekspresjonsplasmid, E. coli 294 overført med plasmidet, og fragmentene ble uttrykt. Ekspresjonsproduktene som ble antatt å ha vært forinterferoner, var alle positive i CPE bestemmelsen for interferonaktivitet, selv om aktiviteten var marginal i tilfellet LelF F fragmentet. I tillegg til det foregående er alle de beskrevne LelF typer sekvensbestemt.

K. Direkte ekspresjon av et andre ferdig leukocyttinterferon ( LelF B)

Sekvensen til det isolerte fragment bestående av genet for ferdig LelF B viser de første 14 nukleotider av typene A og B som identiske. Følgelig ble et fragment fra pLelF A25 bærende trp-promotor-operator, ribosombindende punkt og starten fra LelF A (=B) genet isolert og kombinert med den gjenværende delen av B-sekvensen i et ekspresjonsplasmid.

De iøynefallende restriksjonskart for Pst fragmentet av pL4

(et plasmid bestående av LelF B Pst-avsluttet gen angitt i fig. 5) og pLelF A25 er henholdsvis vist i fig. 7a og 7b.

For å oppnå det omtrentlige 950 b.p. Sau3a til Pstl fragment fra sekvensen som er vist i fig. 7a var flere trinn nødvendig fordi ett eller flere mellomliggende Sau3a res-triks jonspunkter var tilstede, dvs.:

1. De følgende fragmenter ble isolert:

a) 110b b.p. fra Sau3a til EcoRI; b) 132 b.p. fra EcoRI til Xba;

c) >700 b.p. fra Xba til Pst.

2. Fragmenter (la) og (lb) ble ligert og delt med Xba og

Bglll for å forhindre selvpolymerisasjon gjennom Sau 3a og Xba endestykker (det relevante Sau3a punkt var innenfor et Bglll punkt; Bglll deler for å levne en Sau3a festende ende). Et 24 2 b.p. fragment ble isolert. 3. Produktet fra (2) og (lc) ble ligert og delt med Pstl og Bglll, igjen for å forhindre selvpolymerisasjon. Et omtrentlig 950 b.p. fragment, Sau 3a til Pstl fra fig. 7a, ble isolert. Dette fragment besto av den del av LelF B genet som ikke var felles med LelF A. 4. Et omtrentlig 300 b.p. fragment (Hindlll til Sau3a) bestående av trp promotor-operator, ribosombindende punkt, ATG startsignal og cysteincodon av LelF A ble isolert fra pLelF A25. 5. Et omtrentlig 3600 b.p. fragment Pstl til Hindlll ble isolert fra pBR322. Dette omfattet repliconet og innkodet tetracyklin men ikke ampicillinresistens. 6. Fragmentene erholdt i trinnene 3, 4 og 5 ble trippelligert og det resulterende plasmid overført i E. coli K-12 stamme 2 94.

Transformanter ble miniutvalgt (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 1_, 1513-1523 [1979] og plasmidprøver spaltet med EcoRI. Spaltningen ga 3 fragmenter karakteristiske for: 1) EcoRI-EcoRI trp promotorfragment; 2) Det interne EcoRI til EcoRI fragment f ra: pL'4, og 3) proteintranslas jons-startsignal til EcoRI fragment fra pL4.

I CPE bestemmelse viser bakterieekstrakter fra kloner fremstilt på forutgående måte typisk ca. 10 x 10 enheter interferonaktivitet pr. liter ved >OD 550 = !• Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli 294/pLeIF B trp 7.

L. Direkte ekspresjon av ytterligere ferdig leukocytt-interferoner ( LelF C, D, F, H, I og J)

Ytterligere full-lengde genfragmenter som omfatter andre LelF typer kan settes sammen og konstrueres i vektorer som i tilfellet LelF A. Fullstenditg sekvensbestemmelse ved konvensjonelle midler vil klargjøre om et restriksjonspunkt ligger tilstrekkelig nær det første aminosyrekodon i den ferdige interferontype til å muliggjøre lett bruk av den metodikk som er anvendt i del H ovenfor for ekspresjonen av ferdig LelF A, dvs. eliminering av presekvensen ved restriksjonsoppdeling og erstatning av kodoner for N-terminale aminosyrer som er tapt i presekvenseliminering ved ligering av et syntetisk DNA fragment. Hvis dette ikke går, kan følgende metode anvendes. Denne omfatter kort spalting av det presekvensholdige fragment rett før det punkt hvor kodonet for den første aminosyren av det ferdige polypeptid begynner, ved at man:

1. overfører det dobbeltkjedede DNA til enkeltkjedet DNA

i et område som omgir dette punkt,

2. hybridiserer til det enkeltkjedede området dannet i trinn (a) en komplementær primerlengde av enkeltkjedet DNA idet 5' enden av primeren ligger motsatt nukleo-tidet som ligger opptil det tilsiktede spaltningspunkt, 3. restaurerer den del av det andre kjedet som er elimi-nert i trinn 1 som ligger i 3'-retningen fra primeren ved omsetning med DNA polymerase i nærvær av adenin, tymin, guanin og cytosin-holdige deoksynukleotidtri-fosfater, og 4. nedbryter den gjenværende enkeltkjedede lengde av DNA som stikker frem forbi det tilsiktede spaltningspunkt.

En kort lengde av syntetisk DNA som slutter på 3'-enden til kodekjeden med translasjonsstartsignalet ATG kan så ligeres med, dvs. frastøtende e ndeligering til det resulterende opp-byggede genet for de ferdige interferoner og genet som er innsatt i et ekspresjonsplasmid og brakt under kontroll av en promoter og dens tilknyttede ribosombindingspunkt.

På lignende måte som anvendt i del K, forut ble genfrag-menter som koder LelF C og LelF D omtrentlig formet for direkte bakteriell ekspresjon. Ekspresjonsstrategi for disse ytterligere leukocyttinterferoner inneholdt i hvert tilfelle utvei til det omtrentlige 300 b.p. fragment (Hindlll til Sau3a) bestående av trp promotor-operator, ribosombindende punkt, ATG startsignal og cysteincodon av LelF A fra pLelF A25. Til dette kombinertes genfragmenter fra de ytterligere interferongener som kodet sine respektive aminosyresekvenser forbi det første cystein som var felles for alle. Hvert resulterende plasmid ble brukt til å transformere E. coli K-12 stamme 294. Ligeringer for å danne de respektive gener var følgende:

LelF C

Isoler de følgende fragmenter fra pLelF C:

la) 35 b.p. fra Sau 3a til Sau 96

(b) >900 b.p. Sau 96 til Pst I

(c) Isoler et omtrentlig 300 b.p. fragment (Hind III -

Sau 3a) fra pLelF A-25 som i del K (4) ovenfor. (d) Isoler det omtrentlig 3600 b.p. fragment fra del K (5) forut.

Oppbygning:

(1) Liger (a) og (c). Spalt med Bglll, Hindlll og isoler det omtrentlige 335 b.p. produkt. (2) Trippelliger (1) + (b) + (d) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF C trp 35.

LelF D

Isoler fra pLelF D:

a) 35 b.p. fra Sau3a til Avall

b) 150 b.p. fra Avall til Bglll

c) omtrentlig 700 b.p. fra Bglll til Pstl

Isoler fra pLelF A25:

d) 300 b.p. fra Hindlll til Sau3a

Isoler fra pBR322:

e) omtrentlig 3600 b.p. fra Hindlll til Pstl Oppbygning: (1) Liger (a) + (b), spalt med Bglll og rens et 185 b.p. produkt (1), (2) Liger (1) + (d), spalt med Hindlll, Bglll, og rens det omtrentlige 500 b.p. produkt (2). (3) Liger (2) + (c) + (e) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli

K-12 stamme 294/pLeIF D trp 11.

LelF F

Det LelF F holdige fragment kan oppbygges for direkte ekspresjon gjennom gjenoppbygning som lett foretas helt homo-logt for aminosyre 1-13 av LelF B og LelF F. Et trp promo-torholdig fragment (a) med omtrentlig formede ender erholdes fra pHGH207 beskrevet ovenfor via Pst I og Xba I spaltning, etterfulgt av isolering av det ca. 1050 b.p. fragment. Et andre fragment (b) erholdes som det største av fragmentene resulterende fra Pst I og Bglll spaltning av plasmidet pHKY 10. Fragment (a) inneholder ca. halvparten av genet som koder ampicillinresistens; fragment(b) inneholder resten av genet og hele genet for tetracyklinresistens bortsett fra den tilhørende promoter Fragmentene (a) og (b) kombi-neres via T4 ligase og produktet behandles med Xbal og Bglll for å eliminere dimerisering, og danner et fragment (c) omfattende trp promoter-operatoren og gener for tetracyklin og ampicillinresistens.

Et fragment (d) på omtrent 580 b.p. erholdes ved Avall og Bglll nedbrytning av pLelF F. Dette omfatter codoner for aminosyrer 14-166 av LelF F.

Et fragment (e) (49 b.p.) erholdes ved Xbal og Avall nedbrytning av pLelF B. Fragment (e) koder aminosyrer 1-13

av LelF F.

Fragmentene (c), (d) og (e) er trippelligert i nærvær av T4 ligase. De festende ender av de respektive fragmenter er slik at det sammensatte plasmid sirkulariserer korrekt, bringer tetracyklinresistensgenet under kontroll av trp promotor-operatoren sammen med genet for ferdig LelF F, slik at bakterier transformert med det ønskede plasmid kan ut-velges på tetracyklinholdige plater. Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 2 94/ pLelF F trp 1.

LelF H

Det fullstendige LelF H gen kan formes for ekspresjon som et ferdig leukocyttinterferon som følger: 1. Plasmid pLelF H underkastes Haell og Rsal nedbrytning ved isolering av 816 b.p. fragmentet som går fra signalpep-tidaminosyren 10 til det 3' ikke-kodende området. 2. Fragmentet denaturereres og underkastes reparasjons-syntese med Klenow-fragment av DNA polymerase I (Klenow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 65, 168 [1970] , anvendelse av den syntetiske deoksyribooligonukleotidprimer 5<1->dATG TGT AAT CTG TCT. 3. Det resulterende produkt spaltes med Sau3a og et 452 b.p. fragment bestående av aminosyrer 1 til 150 isoleres. 4. Sau3a og Pstl nedbrytning av pLelF H og isolering av det resulterende 500 b.p. fragment gir et gen som koder aminosyrer 150 gjennom enden av kodesekvensen. 5. Fragmenter isolert i trinn (3) og (4) ligeres til dannelse av et fragment:

som koder de 166 aminosyrer av LelF H.

6. pLelF A trp 2 5 spaltes med Xbal, endeavstumpes med DNA polymerase I og produktet spaltes med Pst,I. Det store resulterende fragment kan isoleres og ligeres med produktet fra trinn (5) og danne et ekspresjonsplasmid som etter transformering av E. coli K-12 stamme 294 eller annen vertsbakterie er i stand til å uttrykke ferdig LelF H.

LelF I

Fase XCharon 4A rekombinant forrådet av det humane genom kontruert av Lawn et al., Cell 15_, 1157 (1978), ble gransk-et etter leukocyttinterferongener ved fremgangsmåtene beskrevet av Lawn et al. (supra) og Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978). En radioaktiv LelF prøve som stammet fra cDNA klonet LelF A ble brukt for å granske ca. 500 000 plater. 6 LelF genomkloner erholdtes i dette utvalget. Etter reut-valg og platerensning ble en av disse kloner, A.HLeIF2, utvalgt for videre analyse.

Ved å bruke den ovénfor beskrevne metode kan andre prøver med fordel brukes for å isolere ytterligere LelF kloner fra det humane genom. Disse kan igjen anvendes for å frem-stille ytterligere leukocyttinterferonproteiner i henhold til denne oppfinnelse. 1. 2000 b.p. EcoRI fragmentet fra klon \HLeIF2 ble sub-klonet i pBR325 på EcoRI posisjonen. Det resulterende plasmid LelF I ble spaltet med EcoRI og 2000 b.p. fragmentet isolert. Deoksyoligonukleotidet dAATTCTGCAG (en EcoRI— Pstl konvertor) ble ligert til 2000 b.p. EcoRI fragmentet og det resulterende produkt spaltet med Pstl og ga et 2000 b.p. fragment som inneholdt Pstl ender. Dette ble spaltet med Sau96 og et 1100 b.p. fragment isolert som hadde en Pstl og en Sau96 ende. 2. Plasmidet pLelF C trp 35 ble spaltet med Pstl og Xbal. Det store fragmentet ble isolert. 3. Det lille Xbal - Pstl fragment fra pLelF C trp 35 ble nedbrutt med Xbal og Sau96. Et 40 b.p. Xbal - Sau96 fragment ble isolert. 4. Fragmenter isolert i trinn (1), (2) og (3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmid pLelF I trp 1.

LelF J

1. Plasmidet pLelF J inneholder en 3.8 kilobase Hindlll fragment fra humant genomisk DNA som inneholder LelF J gene-sekvensen. Et 760 b.p. Ddel - Rsal fragment ble isolert fra dette plasmidet. 2. Plasmidet pLelF B trp 7 ble spaltet med Hindlll og Ddel og et 340 b.p. Hindlll - Ddel fragment isolert. 3. Plasmidet pBR322 ble spaltet med Pstl, endeavstumpet ved inkubering med DNA polymerase I (Klenow fragment), så spaltet med Hindlll. Det store (~ 3600 b.p.) fragment ble isolert. 4. Fragmenter isolert i trinn (1), (2) og (3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmidet pLelF J trp 1.

M. Rensing

Innholdet av leukocyttinterferonet i bakterieekstrakter kan økes ved suksessivt: 1. Polyetylen - iminutfelling, hvori mesteparten av det cellulære protein innbefattende interferon forblir i supernantanten. 2. Ammoniumsulfatfraksjonering, hvorunder interferon kommer ut av løsningen i 55 % mettet ammoniumsulfat. 3. Oppslemming av ammoniumsulfatklumpen i 0.06 M kaliumfosfat 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, og dialyse mot 25 mM Tris-HCl, pH 7.9 (interferonaktiviteten forblir i løsning). 4. Kromatografi av den ovennevnte supernantant, pH justeres til 8.5 på en DEAE-cellulosekolonne (eluering med en lineær gradient av 0 til 0.2 M NaCl i 25 mM Tris-HCl, pH 8.5. 5. Adsorpsjon på "Cibachrome. Blue-Agarose" eller hydroksyl-apatitt og eluering med 1.5 M KC1 eller 0.2 M fosfatløsning

henholdsvis (valgfritt).

6. Molekylstørrelsesseparasjon på en "Sephadex G75" kolonne. 7. Kationbytterkromatografi på CM-cellulose i 25 mM ammoniumacetat ved pH 5.0 utviklet med en ammoniumacetatgradient (opptil 0.2 M ammoniumacetat).

Ovennevnte metode gir materiale med >95 % renhet.

Materialet kan også renses ved størrelsesekskluderingskroma-tografi, revers fase (RP-8) høytrykksvæskekromatografi eller affinitetskromatografi på immobiliserte antiinterfer-onantistoffer.

Alternativt kan materialet fra trinn 4 settes på en monoklon-al-antistoffkolonne, fremstilt som beskrevet av Milstein, Scientific American 243, 66 (1980), og elueres. med 0.2 M eddiksyre, 0.1 % Triton og 0.15 M NaCl.

I en alternativ, foretrukket utførelsesform kan leukocyttinterferonet som er fremstilt ved de foran beskrevne fremgangsmåter renses gjennom følgende trinn: 1. Frosne celleaggregater som inneholder det uttrykte leukocyttinterf eron brytes opp manuelt eller med passende størr--elsesreduksjonsutstyr. De delvis opptinte celler oppslemm-es i 4 volumdeler buffer A som inneholder 0.1 M Tris justert til pH 7.5 8.0, 10 % (volum/vekt) sukrose, 0.2 M NaCl 5 mM EDTA, 0.1 mM PMSF og 10-100 mM MgCl2- Suspensjonen holdes ved ca. 4°C.

Suspensjonen føres gjennom en homogenisator ved ca. 410 atm. etterfulgt av et andre gjennomløp ved mindre enn 68 atm. Effluent fra homogenisatoren fra begge gjennomløp kjøles i et isbad. 2. Polyetylen-imin tilsettes langsomt til homogenisatet inntil en konsentrasjon på ca. 0,3 5 % og dette får stå i ca. 30 min.. De faste deler fjernes ved sentrifugering eller filtrering. Dette trinnet temperaturkontrollerés eller ut-føres tilstrekkelig raskt til åt supernantanten (filtratet) holdes på'mindre enn 10°C. Supernantanten (filtratet) kon-sentreres gjennom ultrafiltrering til ca. 1/10 av det opprinnelige volum. Partikkelformet stoff eller uklarhet i resten kan fjernes gjennom et passende filter så som en mikroporøs membran. 3. Den klarede løsning settes direkte på en monoklonisk antistoffkolonne med en hastighet på 5-8 cm/time (f.eks. 2 5-40 ml/time på en 2.6 cm diameter kolonne). Etter påfylling vaskes kolonnen med ca. 10 kolonnevolumdeler 25 mM "Tris-HCl", pH 7.5 - 8.5, inneholdende NaCl (0.5 M) og overflateaktivt middel så som "Triton X-100" (0.2 %) eller tilsvarende. Etter vask renses kolonnen med ca. 10 kolonnevolumdeler av løs-:<:->ning inneholdende 0.15 M NaCl og overflateaktivt middel så som Triton X-100 (0.1 %) eller tilsvarende. Kolonnen elueres med 0.2 M eddiksyre som inneholder overflateaktivt middel så som Triton X-100 (0.1 %) eller tilsvarende. Pro-teintoppen fra den monoklonale antistoffkolonne (målt med UV-absorpsjon eller annen formålstjenelig målemetode) sam-les og pH justeres til ca. 4.5 med 1 N NaOH eller 1.0 M Tris base. 4. Den samlede interferontopp settes på en kationbytter så som "Whatman CM52" cellulose eller ekvivalent som er ekvilibrert med en formålstjenlig buffer så som ammoniumacetat pH 4.5 (50 mM). Etter fylling vaskes kolonnen med ekvili-brerende buffer inntil UV absorpsjonen til effluenten har

nådd et slikt platå at lite ytterligere protein elueres fra kolonnen. Kolonnen elueres så med 25 mM ammoniumacetat/ 0.12 M natriumklorid eller en kombinasjon som optimaliserer gjenvinning av interferon og gir en lyofilisert kake med tilfredsstillende utseende og løselighetsegenskaper.

De monoklonale antistoffer som anvendes i den foretrukne utførelsesform som er beskrevet ovenfor, kan fremstilles gjennom de metoder som er beskrevet av Staehelin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78, 1848-52 (1981). Monoklonale antistoffer renses og bindes kovalent til Affigel-10, som beskrevet nedenunder: Fremstilling og rensning av monoklonale antistoffer fra ascitisk væske 5 hunnmus Balb/c ble alle inokulert med 5 til 10 x"10^ hybridomaceller fra midt-log vekstfase. Ca. 5 x 10^ leve-dyktige celler fra musen som produserer væske ble inokulert intraperitonealt i hver av 10 eller flere mus. Den ascitiske væske ble gjentatte ganger oppsamlet (2 - 4 ganger) fra hver mus. Opptil 3 overføringer og samlinger kan ut-føres fra en gruppe mus til den neste. Ascitisk væske fra mus ved hver overføring ble sammenslått.

Celler og avfall ble fjernet fra den ascitiske væske ved langsom sentrifugering (500 - 1000 x g) i.15 min.. Så sen-trifugerte man 90 min. ved 18 000 omdr./min. Supernantanten ble frosset og lagret ved -2 0°C. Etter tining ble ytterligere fibrin og partikkelmateriale fjernet ved sentrifugering ved 35 000 omdr./min. i 90 min. Satser av ascitisk væske fra hver overføring ble undersøkt med hensyn til spesifikk antistoffaktivitet gjennom en fastfase antistoff-bindende bestemmelse. (Staehelin et al., supra) og helt sammen hvis de var tilfredsstillende.

Konsentrering av protein i de sammenslåtte løsninger ble beregnet gjennom den tilnærmelse at 1 mg protein gir en absorpsjon på 1.2 ved 280 nm i en kuvette med en gjennom-løpslengde på 1.0 cm. Ascitesvæsker med høyt antistoffinn-hold inneholder 30 til. 3 5 mg protein/ml. Dette er ekvivalent med 4 - 7 mg spesifikt antistoff/ml. Væsken ble fortynnet med PBS (0.01 M natriumfosfat, pH 7.3, 0.15 M NaCl) til en proteinkonsentrasjon på 10 til 12 mg/ml.

Til hver 100 ml fortynnet løsning tilsattes 90 ml romtemp-eraturmettet natriumsulfatløsning langsomt under kraftig røring ved 0°C. Suspensjonen ble holdt i is i 40 til 60 min., så sentrifugert 15 min. ved 10 000 omdr./min. ved 4°C.

Supernantanten ble dekantert og drenert godt. Proteinklump-ene ble oppløst i 0.02 M "Tris.HCl" (pH 7,9)/0,04 M NaCl

(buffer I). Proteinløsningen ble dialysert i 16 til 18 timer ved romtemperatur mot 10 0 volumdeler fcuffer I med minst en forandring av bufferen. Den dialyserte løsning ble sentrifugert ved 15 000 omdr./min. i 10 min. for å fjerne uoppløst materiale. Ca. 30-35 % av den opprinnelige mengde totalt protein i den ascitiske væske ble gjenvunnet ifølge beregning av absorpsjon ved 28 0 nm.

Løsningen som inneholdt 30-40 mg protein pr. ml ble så satt på en kolonne av "DEAE"-cellulose ekvilibrert med buffer I.

Et kolonnebedvolum på minst 100 ml ble brukt for hvert g påsatt protein. Antistoffet ble eluert fra kolonnen med en lineær NaCl-gradient som inneholdt 0.02 M Tris.HCl, pH 7.9, fra 0.04 M til 0.5 M NaCl. Sammenslåtte toppfraksjoner som ble eluert meilom 0.06 og 0.1 M NaCl ble konsentrert gjennom felling med et likt volum av mettet ammoniumsulfatløsning og ved sentrifugering. Proteinaggregatene ble oppløst i 0.2 M NaHC03 (pH~ 8 . 0) /0 . 3 M NaCl ^b uffer II) fulgt av dialyse mot 3 forandringer av den samme buffer ved romtemperatur. De dialyserte løsninger ble sentrifugert ved 20 000

x g i 15 min. for å fjerne alt uløselig materiale. Protein-konsentrasjonen ble justert til 20 til 25 mg/ml med buffer

II.

Fremstilling av immunoadsorbanter

"Affigel-10" ble vasket på et sintret glassfilter 3 ganger med iskald isopropanol, etterfulgt av 3 vaskinger med iskaldt destillert vann. Geloppslemmingen (-'50 % i kaldt vann) ble

overført til plastikrør og utfelt gjennom en kort sentrifugering. Supernantanten ble pippetert av. Den pakkede gelen ble blandet med en lik volumdel renset antistoffløsning og dreiet ende-over-ende ved 4°C i 5 timer. Etter reaksjonen ble

gelen sentrifugert, så vasket 2 ganger med buffer III (0.1

M NaHCO3/0.15 M NaCl) for å fjerne ikke-koblet antistoff. Proteinbestemmelse av de kombinerte vaskinger viste at mer enn 90 % antistoff var koblet til gelen.

For å blokkere ikke-omsatte punkter ble gelen blandet med en lik volumdel 0.1 M etanolamin.HC1 (pH 8) og dreiet ende-over-ende ved romtemperatur i 60 min.. Geloppslemmingen ble vasket fri for reaktanter med PBS og lagret i PBS i nær vær av 0.02 % (vekt/volum) natriumazid ved 4°C.

Claims (15)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human leukocytt-interferon i ferdigutviklet form, karakterisert ved at den omfatter å dyrke en mikroorganisme transformert med en repliserbar mikrobiell ekspresjonsvektor som koder for, og som er istand til å uttrykke human leukocytt-interferon i ferdigutviklet form under normale betingelser for vekst og ekspresjon av et polypeptid.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ferdigutviklede humane leukocytt-interferon som er uttrykt, inneholder 165 eller 166 aminosyrer og valgfritt et ytterligere methionin ved N-terminalen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det ferdigutviklede humane leukocytt-interferon som er uttrykt, inneholder den partielle aminosyresekvens Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ferdigutviklede humane leukocytt-interferon som er uttrykt inneholder de konserverte aminosyrer som er felles for humane leukocytt-interferoner (LelF) A, B, C, D, F, H,I og J.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det ferdigutviklede humane leukocytt-interferon som uttrykkes er valgt fra grup-pen omfattende human leukocytt-interferon (LelF) A, B, C, D, F, H, I og J.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon A (LelF A).

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt- interferon som uttrykkes er interferon B (LelFB).

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon C (LelFC).

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon D (LelF D).

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon F (LelF F).

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon H (LelF H).

12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som utttrykkes er interferon I (LelF I).

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det humane leukocytt-interferon som uttrykkes er interferon J (LelF J).

14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 13, karakterisert ved at den transformerte mikroorganisme er en bakterie.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at bakterien er E. coli.