Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nosnika ekspresji zdolnego, w transformo¬ wanym nim szczepie E. coli, do ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich zawie¬ rajacego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy metionina jest przylaczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166-167 aminokwasów, oraz czesciowa sekwencje ami- nokwasowa Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser,jak wskazano w sekwencjach przedstawionych na fig. 4 lub 9 w pozycji od 139 do 151, za pomoca technologii rekombinan- towego DNA.Interferon leukocytów ludzkich /LelF/ zostal po raz pierwszy odkryty i otrzymany w pos- taoi bardzo surowych osadów przez Isaacs'aiLindenmanna /Proc. R. Soc, B 147, 258-267, 1957A Od tego czasu podjeto wysilki majace na celu oczyszczanie i scharakteryzowanie tego materialu, co doprowadzilo do otrzymania wzglednie jednorodnych interferonów leukocytów ludzkich pochodzacych od zdrowych lub chorych na bialaczke dawców leukocytów /opis patento¬ wy RFN DOS nr 2947134/. Interferony te tworza rodzine bialek znanych z tego, ze posiadaja zdolnosc nadawania komórkom docelowym stanu opornosci na wirusy. Oprócz tego, interferon moze hamowac namnazanie sie komórek i wplywac na odpowiedz immunologiczna. Wlasciwosci te sklaniaja do klinicznego uzywania interferonu leukocytów jako srodka leczniczego do lecze¬ nia zakazen wirusowych i chorób nowotworowych.Interferony leukocytów oczyszczono do istotnej jednorodnosci /Rubinstein i inni, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 76, 640-644 /1979/; Zoon i inni, ibid., 76, 5601-5605 /1979/7, a ich ciezar czasteczkowy zawiera sie w granicach od okolo 17 500 do okolo 21 000. Aktywnosc ' 8 9 wlasciwa tych preparatów jest nadzwyczaj wysoka i wynosi 2 x 10 do 1 x 10 jednostek/mg bialka, ale ich wydajnosc z hodowli komórkowych jest zniechecajaco niska. Tym niemniej, postepy w metodach ustalania sekwencji bialek pozwolily na ustalenie czesciowej sekwencji 148 2762 148 276 aminokwasów /Zoon 1 wsp., Science, 207, 527 /1980/f levy 1 wep., Proc* Matl. Acad. Sci.USA, 77, 3102-5104 /1980/. Wyjasnienie eprawy gllkosyleojl róznych Interferonów leuko¬ cytów nie jest dotychczas calkowite* ale obecnie wiadomo, te róznice w glikozylacji wsród bialek tej rod siny nie wynikaja tylko ze spektrum Baobserwowanyeh ciezarów czas¬ teczkowych. Natomiast Interferony leukocytów róznia elf znecanie w skladtle eminokwaso- wym 1 sekwencji, a homologla aminokwasów jest w niektórych przypadkach mniejsza niz 80$.Chociaz izolowanie z leukocytów dawców lapewnialo doatatecsna ilosc materialu do cze¬ sciowej charakteryzacji i ograniczonych badan klinicznych homogennego interferonu leuko¬ cytów, jest to zupelnie niewystarczajace zródlo interferonu w ilosciach niezbednych do badan klinicznych na wielka skale, a nastepnie eeerokiego stosowania zapobiegawczego 1/ lub leczniczego. I rzeczywiscie, badacze kliniczni stosujaoy obecnie w badaniach aktyw¬ nosci przeciwnowotworowej i przeciwwirueowej interferony otrzymane z ludzkich leukocy¬ tów byli ograniczeni do surowyoh / < 151 ezyatosci/ preparatom togo materialu, a dlugi ' czas wytwarzania odpowiednich ilosci, nawet przy nierealistycznym poziomie cen, krytycz¬ nie opóznial badania na duza skale.Wraz z opraoowanlem technologii rekomblnantowego Dli, atalo alf Jednak mozliwe kontro¬ lowane wytwarzanie wielu róznorodnych uzytecznych polipeptydów przy uzyoiu drobnoustro¬ jów. Obecnie dostepne sa bakterie modyfikowane przy uzyciu taj technologii umozliwiajace wytwarzanie produktów polipeptydowych, takich jak sometostatyna9 lancuch i i B insuliny ludzkiej 1 ludzki hormon wzrostu /Itekura 1 inni, Science, 196, 1056-1063 /1977/7, /Goe- ddel 1 inni, Nature, 281, 544-548 /1979/7. Ostatnio uzyta technik rekomblnantowego DNA w przypadku tworzenia przez bakterie pro insuliny i tymozyny 1t a azereg autorów do¬ nioslo o otrzymaniu DNI kodujacego interferon leukocytów ludzkich 1 uzyskaniu bialek o aktywnosci interferonu leukocytów /hagata 1 inni, Natura, 264, 316-320 /1980/, Mentel i inni, Gene, 10, 1-10 /1980/, Tanlguchi 1 inni, Nature, 265, 547-549 /1960/ /. Jednak wszystkie te wymienione publikacje lacznie opieuja klonowania plazmidu zawierajacego wstawke genetyczna, kodujaoa wytwarzania Jedynie prekurworów interferonu leukocytów.W publikacji Nagata i wsp. opisano wyodrebianle plazmidu B* cali zawierajacego gen interferonu leukocytów. Wskazano w niej, ze komórki £• coli tranaformowane tym plazmi¬ dem wytwarzaja, w wyniku ekapreeji, polipeptyd o aktywnosci biologicznej interferonu.Przyznano jednak, ze powatajacy w wyniku ekapreeji polipeptyd moze nie byc dojrzalym interferonem leukocytów ludzkich, to Jest, ze polipeptyd powstajacy w wyniku ekspresji moze zawierac presekwencje nie wystepujaca w poatacl dojrzalego interferonu. V publika¬ cji tej, na przelomie stron 319 i 320 atwlerdsonos "Mozliwe Jaet takze, ze B. coli IF sklada sie z sekwencji LelP poprzedzonej sekwencja sygnalowa* gdy* analiza eekwenoji nukleotydowej klonowanego IP cDNA ujawnila obszar kodujaoy 22 aminokwaay, wystepujacy za pierwszym AUG 1 poprzedzajacy obszar kodujacy dojrzaly I? /U. Sohwarzeteln, N. Man- tel IM. S., wyniki niepublikowane/.Wspomniana publikaoja Mentel i wsp. opisuje sekwencJonowania oakleotydu genu leuko¬ cytu klonowanego przez Nagata 1 wsp. 1 potwierdza, ze obaaar kodujacy genu rzeczywiscie zawiera sekwenoje, kodujaoa bialko sygnalowa. W podsumowaniu w publikacji tej stwier¬ dzono: "Wstawka z 910 par zasad zawiera sekwenoje kodujaca a .567 /lub 543/ par zasad, okreslajaca domniemany polipeptyd preinterferonu skladajacy alf a bialka aygnalowego z 23 /lub mniej, mozliwe 15/ aminokwasów, po którym naetepuje polipeptyd Interferonu zawierajacy 166 aminokwasów"• We wspomnianej publlkaojl Tanlnguehl 1 wsp. porównano sekwencje a Dlz wytworzonego przez Tanlnguehl 1 wep. /Gene 10 /1980/, etr. 11-1571 kodujaca interferon flbroblas- tów, i otrzymane przez Mentel i wsp* kodujace Interferon leukocytów* Tak wiec, wszystkie dotychczasowe publikacja dotycza wytwarzania nosników ekspresji zdolnyoh do ekspresji prekursorów Interferonu leukocytów. W mrmeelwlenatwle do ujawnie¬ nia zawartego w wymienionych publikacjach, apoaób wedlug wynalazku dotyczy wytwarzania nosników ekspresji zdolnych, w transformowanym nim szczepie !• wali, da wytwarzania in¬ terferonów leukocytów ludzkich o pelnej dlugosci, którym ula tewersyeey zadna ludzka presekwenc ja lub jej ozesó, to Jeet dojrzalej poatacl interferonu leukocytów ludzkich.148 276 3 Obecnie stwierdzono, ze zastosowanie technologii rekombinantowego DNA /to jest in- seroja genów interferonu do drobnoustrojowych nosników ekspresji/ mogloby byc najsku¬ teczniejsza droga zapewnienia duzych ilosci interferonu leukocytów, który, pomimo bra¬ ku w tak tworzonym materiale glikozylacji charakterystycznej dla materialu pochodzace¬ go od czlowieka, móglby byc stosowany klinicznie do leczenia szeregu chorób wirusowych i nowotworowych.Sposób wytwarzania nosnika ekspresji zdolnego, w transformowanym nim szczepie E. co¬ li, do ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów, zawierajacego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy metionina jest przylaczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166-167 aminokwasów, oraz czesciowa sekwencje aminokwasowa Cys-Ala-Trp- -Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Jfet-Arg-Ser, jak wskazano na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 151 za pomoca technologii rekombinantowego. DNA, wedlug wynalazku charaktery¬ zuje sie tym, ze konstruuje sie wektor Z. coli zawierajacy promotor trp E. coli, opera¬ tor i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, izoluje sie gen o pelnej dlugosci, kodujacy interferon leukocytów ludzkich ze zbioru kolonii bakteryjnych zawierajacych DNA komplementarny z indukowanym mRNA leukocytów ludzkich lub z indukowanym mRNA linii komórkowej badz ludzki genomowy DNA, wycina sie przez ciecie restrykcyjne pelnej dlugos¬ ci gen kodujacy interferon leukocytów ludzkich, i dokonuje sie insercji tak wycietego genu, z wyeliminowana jakakolwiek sekwencja liderowa mogaca zapobiegac drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich, za promotorem trp E. coli, opera¬ torem i liderowym miejscem przylaczenia rybosomów trp, otrzymujac nosnik ekspresji Et co¬ li, zdolny do ekspresji w E. coli dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich.Otrzymywanie z leukocytów genu sposobem wedlug wynalazku obejmuje nastepujace etapy: 1/ Do skonstruowania próbek syntetycznego DNA, których kodony, w agregacie, reprezen¬ tuja wszystkie mozliwe kombinacje nukleotydów zdolne do kodowania czesciowych sekwencji aminokwasów stosuje sie czesciowe sekwencje aminokwasów interferonu leukocytów ludzkich, oczyszczone do stopnia jednorodnosci. 2/ Przygotowuje sie zbiór kolonii bakteryjnych zawierajacych DNA komplementarny /cDNA/ do indukowanego informacyjnego RNA. Inny indukowany mRNA, znaczony promieniotwórczo, hy- brydyzuje sie z plazmidowym cDNA tego zbioru. Zhybrydyzowany mRNA eluuje sie i bada pod wzgledem translacji do interferonu w oocytach. Plazmidowy DNA z kolonii, wykazujacych w ten sposób indukcje aktywnosci interferonu, bada sie dalej przez hybrydyzacje z prób¬ kami przygotowanymi jak opisano wyzej w etapie 1. 3/ Równolegle z przystapieniem do czynnosci w etapie 2 otrzymany w plazmidach cDNA indukowany mRNA stosuje sie do tworzenia niezaleznego zbioru transformowanych kolonii.Próbki otrzymane w etapie 1 stosuje sie do prymowania syntezy znaczonego promieniotwór¬ czo jednoniciowego cDNA przeznaczonego do zastosowania w charakterze próbek do hybrydy¬ zacji. Syntetyczne próbki zhybrydyzowane z indukowanym mRNA jako matryca wydluza sie za pomoca odwrotnej transkrypcji, tworzac indukowany, znaczony promieniotwórczo cDNA. Klony zbioru kolonii, które hybrydyzowaly z otrzymanym w ten sposób znaczonym promieniotwórczo cDNA, bada sie dalej w celu potwierdzenia obecnosci genu kodujacego interferon, o pelnej dlugosoi. Kazdego z fragmentów genu otrzymanych w etapie 1 lub 2 o domniemanej czescio¬ wej dlugosci mozna uzyc jako próbki dla genu o pelnej dlugosci. 4/ Gen o pelnej dlugosci, otrzymany jak opisano wyzej, poddaje sie obróbce z uzyciem syntetycznego DNA, aby wyeliminowac jakakolwiek sekwencje liderowa, która moglaby zapo¬ biegac ekspresji drobnoustrojowej dojrzalego polipeptydu i aby umozliwic prawidlowe umiejscowienie w nosniku ekspresji drobnoustrojowego promotora w stosunku do sygnalów startu i miejsca przylaczenia rybosomów. Powstaly w wyniku ekspresji interferon oczysz¬ cza sie do punktu pozwalajacego na potwierdzenie jego charakteru i oznaczenie aktywnosci. 5/ Fragment genu interferonu, przygotowany w powyzszy sposób, stosuje sie jako próbke do hybrydyzacji dla innych, czesciowo homologicznych, rodzajów interferonu leukocytów.Czynnikiem glównie wykorzystywanym w technologii rekombinantowego DNA Jest plazmid, niechromosomalna petla dwuniciowego DNA znajdowana w bakteriach i innych drobnoustrojach4 148 276 czesto w wielu kopiach na komórke, W sklad informacji kodowanej przez plazmidowy DNA wchodzi informacja wymagana do replikacji plazmidów w komórkach potomnych /to jest "replikon"/ i zwykle jedna lub wiecej selekcyjnych cech charakterystycznych, takich jak w przypadku bakterii opornosc na antybiotyki, co pozwala na rozpoznanie klonów komórek gospodarza zawierajacyoh plazmid, o którym mowa, i na uprzywilejowany wzrost w wybiórczych podlozach. Uzytecznosc plazmidów polega na tym, ze moga byc one specy¬ ficznie rozszczepione przez taka lub inna endonukleaze restrykcyjna, czyli "enzym res- trakcyjny", z których kazdy rozpoznaje odmienne miejsce w plazmidowym DNA. Nastepnie mozna wprowadzic do plazmidu heterologiczne geny lub fragmenty hetero logicznych genów przez laczenie konców w miejscu rozszczepiania, lub zrekonstruowanych konców przylega¬ jacych do miejsca rozszczepienia. Rekombinacja DNA przeprowadzana jest poza komórka, ale wynikajacy z niej "rekombinantowy" plazmid mozna wprowadzic do komórki sposobem znanym jako transformacja. Przez wzrost transformantu otrzymuje sie duza ilosc rekom- binantowego plazmidu zawierajacego gen. Ponadto, jesli gen jest wprowadzony do plaz¬ midu prawidlowo w odniesieniu do ozesci decydujacych o transkrypcji i translacji kodo¬ wanej przez DNA informacji, mozna uzyc otrzymanego nosnika ekspresji do faktycznego tworzenia sekwencji polipeptydowej, która wprowadzony gen koduje, to jest procesu zwa¬ nego ekspresja.Ekspresja jest inicjowana w regionie znanym jako promotor, który jest rozpoznawany przez przylaczenie polimerazy RNA. W niektórych przypadkach, jak w przypadku promotora stanowiacego tryptofan lub "trp", korzystnego w praktycznym zastosowaniu wynalazku, na regiony promotora zachodza regiony "operatora", tworzac kombinowany promotor-operator.Operatorami sa sekwencje DNA rozpoznawane przez tak zwane bialka represorowe, które sluza do regulacji czestotliwosci inicjacji transkrypcji na poszczególnym promotorze.Polimeraza posuwa sie wzdluz DNA, dokonujac transkrypcji informacji zawartej w niciach kodujacych, od ich konca 5' - do konca 3 - do informacyjnego RNA, który z kolei ulega translacji do polipeptydu o sekwencji aminokwasów, która koduje DNA. Kazdy aminokwas jest kodowany przez tryplet nukleotydowy czyli "kodon", który moze celowo byloby na¬ zywac "genem strukturalnym", to jest w czesci kodujacej sekwencje aminokwasów produktu ekspresji. Po przylaozeniu do promotora, polimeraza RNA najpierw dokonuje transkrypcji nukleotydów kodujacych miejsca przylaczenia rybosomu, a nastepnie sygnalu inicjacji translacji, czyli sygnalu "start" /zwykle ATG, który w powstajacym informacyjnym RNA staje sie AUG/, a pózniej kodonów nukleotydowych w samym genie strukturalnym. Tak zwane kodony stop ulegaja transkrypcji na koncu strukturalnego genu, po czym polimeraza moze tworzyc dodatkowa sekwencje mRNA, która z powodu obecnosci sygnalu stop, nie ulegnie translacji na rybosomach. Rybosomy lacza sie z miejscem przylaczenia, które zapewnia informacyjny RNA, w bakteriach tworzony zwykle jako mRNA, przez co dochodzi do utworze¬ nia kodowanego polipeptydu, zaczynajac od sygnalu startu translacji, a konczac na up¬ rzednio wspomnianym sygnale stop. Pozadany produkt tworzy sie, jesli sekwencje kodujace miejsca przylaczenia rybosomów sa umiejscowione prawidlowo w odniesieniu do kodonu ini¬ cjacji AUG i jesli wszystkie pozostale kodony nastepuja po kodonie inicjacji w fazie.Powstaly produkt mozna otrzymywac przez lize komórek gospodarza i odzyskiwanie produktu przez odpowiednie oczyszczanie od Innych bialek bakteryjnych.W zastosowaniu metod technologii rekombinantowego DNA, jak to podano wyzej, osiaga sie wytwarzanie przez drobnoustroje, z wysoka wydajnoscia i czystoscia, rodziny homo¬ logicznych interferonów leukocytów /nie glikozylowanych/ jako dojrzalych polipeptydów, którym zasadniczo nie towarzysza odpowiednie presekwencje lub jakiekolwiek ich czesci.Te interferony moga ulegac bezposredniej ekspresji, odzyskaniu i oczyszczaniu do pozio¬ mu przystosowujacego je do uzycia w leczeniu chorób wirusowych i nowotworowych ludzi i zwierzat. Udowodniono, ze bialka z tej rodziny, ulegajace w ten sposób ekspresji, sa skuteczne w badaniach in vitro, i po raz pierwszy dla tego rodzaju bialek, równiez in vivo, przy czym te ostatnie badania obejmuja pierwszy dojrzaly interferon leukocytów wytwarzany przez drobnoustroje.145276 5 Termin "dojrzaly interferon leukocytów" w kontekscie niniejszego opisu definiuje czasteczke interferonu wytworzona przez drobnoustroje /np. bakterie/, pozbawiona grup glikozylowych. Dojrzaly interferon leukocytów wedlug wynalazku ulega ekspresji bezpos¬ rednio od translacyjnego sygnalu startu /ATG/ dokladnie przed pierwszym kodonem amino¬ kwasu naturalnego produktu. "Dojrzaly" polipeptyd moze wiec zawierac jako pierwszy ami¬ nokwas w sekwencji metionine /która koduje ATG/, bez zasadniczej zmiany charakteru po- lipeptydu. Z drugiej strony, drobnoustrój-gospodarz moze przeksztalcac produkt trans¬ lacji z usunieciem poczatkowej metioniny. Dojrzaly interferon leukocytów moze ulegac ekspresji lacznie z przylaczonym bialkiem, innym niz zwykly lider, przy czym koniugat moze byc specyficznie rozszczepialny w srodowisku wewnatrz- lub zewnatrzkomórkowym /patrz brytyjski opis patentowy nr 2007676 A/'• Wreszcie, dojrzaly interferon moze byc tworzony w polaczeniu z drobnoustrojowym pep- tydem "sygnalowym", który transportuje koniugat do sciany komórkowej, gdzie peptyd syg¬ nalowy ulega odszczepieniu, a dojrzaly polipeptyd wydzieleniu. "Ekspresja" dojrzalego interferonu leukocytów oznacza wytworzenie przez bakterie lub inne drobnoustroje czas¬ teczki interferonu nie zawierajacej grup glikozylowych lub presekwe ncji, co bezposred¬ nio towarzyszy translacji mRNA genomu interferonu leukocytów.Poszczególne leukocytowe bialka interferonowe sa zdefiniowane przez okreslony DNA genu /figury 3 i 8/ i dedukcyjna sekwencje aminokwasów /figury 4 i 9/. Nalezy rozumiec, ze w odniesieniu do tych poszczególnych interferonów, wlasciwie wszystkich z rodziny leukocytówych bialek interferonowych, których dotyczy wynalazek, istnieja naturalne wa¬ riacje zalezne od alleli, pojawiajace sie od osobnika do osobnika. Wariacje te mozna wykazac przez róznice /róznice/ w calkowitej sekwencji lub przez delecje, podstawienia, insercje, inwersje lub dodanie aminokwasu /aminokwasów/ we wpomnianej sekwencji. Dla kazdego z leukocytowyoh bialek interferonowych otrzymanych przy uzyciu nosnika ekspre¬ sji wytworzonego sposobem wedlug wynalazku, oznaczonych od LelF Ado LelF J wspomniane wariacje zalezne od alleli objete sa zakresem oznaczenia lub definiujacego je terminu i w ten sposób dotycza zakresu niniejszego wynalazku.Wynalazek jest blizej wyjasniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia dwie sek- wenaje aminokwasów wspólne wszystkim rodzajom interferonu wyizolowanym z leukocytów ludzkich i oczyszczonym do stopnia jednorodnosci, oznaczone T-1 i T-13. Wszystkie po¬ tencjalne sekwencje mRNA kodujace te peptydy ukazano tak, jak i odpowiednie sekwencje DNA. Litery A, T, G, C i U oznaczaja, odpowiednio, nukleotydy zawierajace jako zasade adenine, tymine, guanine, cytozyne i uracyl. Litera N oznacza którykolwiek z nukleoty- dów A, G, Ci U. Polinukleotydy sa przedstawione jako odczytywane w kierunku od 5' /z lewej/ do 3' /z prawej/, a gdy przedstawiony jest dwuniciowy /"d.s."/ DNA, w kierun¬ ku odwrotnym dla nizszej lub nie kodujacej nici; fig. 2 przedstawia autoradiogram wyka¬ zujacy hybrydyzaoje potencjalnego plazmidu LelF z syntetycznym dezoksyoligonukleotydem znaczonym -* P; fig. 3 przedstawia sekwencje nukleotydów /nic kodujaca/ osmiu fragmen¬ tów genowych izolowanych jako kandydujace do uzycia w ekspresji interferonów leukocy¬ tów, odpowiednio oznaczonych od "A" do "H"; inicjacyjny kodon translaoji ATG i tryplet dla kazdego zakonczenia LelF jest podkreslony,* po kodonach stop czyli trypletaoh za¬ konczenia nastepuja regiony 3' nie ulegajace translacji* Przedstawionemu równiez genowi LelF A o pelnej dlugosci, któremu brak jest jednego kodonu znajdowanego w innych przedstawionych genach, jak wskazano w trzeoiej linii A na fig. 3* Nie ulegajace translacji regiony 5' poprzedzaja sekwencje liderowe. Po wy¬ izolowaniu we fragmencie B brak pelnej presekwencji lidera, ale zawiera on nie naru¬ szony gen domniemanego dojrzalego LelF E. We fragmencie G po wyizolowaniu brak pelnej sekwencji kodujacej.Figura 4 przedstawia porównanie sekwencji osmiu bialek LeiF przewidzianyoh na pod¬ stawie sekwencji nukleotydów. Uzyto jednoliterowych skrótów zalecanyoh przez IUPAC- -IUB Commision on Biochemical Nomenclature: A - alanina, C - cysteina, D - kwas aspa¬ raginowy, B - kwas glutaminowy, F - fenyloalanina, G - glicyna, H - histydyna,6 148 276 I - izoleucyna, K - lizyna, L - leucyna, M - metionina, N - asparagina, P - prolina, Q - glutamina, R - arginina, S - seryna, T - treonina, V - walina, W - tryptofan i Y - tyrozyna. Numery odnosza sie do pozycji aminokwasów /S odnosi sie do peptydu syg¬ nalowego/. Kreske w 165 aminokwasie sekwencji LelF A w pozycji 44 wprowadzono w celu ustawienia sekwencji LelF A w jednym szeregu z 166 - aminokwasowymi sekwencjami pozo¬ stalych LelF. Sekwencje LelF E ustalono przy zignorowaniu nadprogramowego nukleotydu /pozycja 187 na fig. 3/ w regionie kodujacym. Gwiazdka wskazuje kodony zakonczenia w fazie. Przedstawiono równiez aminokwasy wspólne wszystkim LelF /z wylaczeniem peeudo- genu LeiF E/. Podkreslone reszty sa resztami aminokwasów obecnymi równiez w interfero¬ nie fibroblastów ludzkich.Figura 5 przedstawia mapy restrykcyjne sklonowanych cDNA osmiu typów LelF /A do H/.Hybrydowe plazmidy konstruowano metoda laczenia konców dC:dG /D. V. Goeddel i inni, Nature, 287, 411-416 /1980/.7. Tak wiec, inserty cDNA mozna wyciac za pomoca Pstl. Li¬ nie na kazdym z konców insertów cDNA reprezentuja boczne homopolimeryczne zakonczenia dC:dG. Wskazano pozycje miejsc restrykcyjnych PvuII, EcoRI i Bglll. Obszary zacienio- wane na rysunku przedstawiaja sekwencje kodujace dojrzalyoh LelF. Obszary zakreskowa¬ ne skosnie przedstawiaja sekwencje kodujace peptydy sygnalowe, a obszary otwarte uka¬ zuja nie kodujace sekwencje 3' i 5'; Figura 6 przedstawia schematycznie konstrukcje genu kodujacego bezposrednia synteze przez drobnoustroje dojrzalego LelF A. Wskazano miejsca restrykcyjne i reszty /MPetIM itp./. Termin !tb.p.w oznacza "pary zasad"; Figura 7 /nie w skali/ schematycznie przedstawia mape restrykcyjna dwcoh fragmentów genów zastosowanych do wywolywania ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów LelF B.Wskazane sekwencje kodonów przedstawiaja zakonczenia nici kodujacej bedace rezultatem trawienia enzymem restrykcyjnym Sau3a w dwóch pokazanyoh przypadkach.Figury 8 i 9 przedstawiaja sekwencje DNA i aminokwasów S bialek LelF wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, wlacznie z typami I i J /co do odpowiadajacych jednolitero¬ wych skrótów, patrz fig. 4/. Na fig. 9 gwiazdka wskazuje kodon zakonczenia w odpowia¬ dajacej mu sekwencji DNA, a lacznik delecje lub przerwe w sekwencji.Nizej opisano wynalazek w odniesieniu do jego korzystnych postaci.A. Zastosowany drobnoustrój Korzystnie stosuje sie dwa drobnoustroje E. coli x 1776, jak opisano w opisie paten¬ towym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4190495 oraz E. coli K-12 szczep 294 /end A, thi", hsr", hsm£/, jak opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 2055382 A. Kazdy z nich jest zdeponowany w American Type Culture Collection /numery rejestracyjne ATCC, odpowiednio, 31537 i 31446/. Cala prace zwiazana z rekombinantowym DNA prowadzi sie zgodnie ze stoso¬ wanymi wskazówkami National Institutes of Health.Wynalazek, w najkorzystniejszej postaci, opisano w odniesieniu do E. coli, w tym nie tylko szczepów E. coli x 1776 i E. coli K-12 szczep 294f zdefiniowanych wyzej, ale i in¬ nych znanyoh szczepów E. coli, takich jak E. coli B lub innych szczepów drobnoustrojów, z których wiele jest zdeponowanych i dostepnyoh w znanych instytucjach deponujacych drobnoustroje, takich jak American Type Culture Collection* Patrz równiez opublikowany opia zgloszenia patentowego RFN nr DOS 2644432.Wynalazek zilustrowano blizej w nastepujacych przykladach: Przyklad I. Wytwarzanie nosnika ekspresji zdolnego do ekspresji dojrzalego LelF A.A. Oczyszczanie mRNA LelF. mRNA mozna otrzymac z leukocytów ludzkich, pochodzacych zwykle od pacjentów z przewlekla bialaczka szpikowa, indukowanych w celu wytworzenia interferonu wirusem Sendai lub choroby Newcastle, jak opisano np. w opublikowanym opi¬ sie zgloszenia patentowego RFN nr DOS 2947134. Szczególnie korzystnym zródlem, którego uzywa sie w sposobie wedlug wynalazku, jest linia komórkowa oznaczona KG-1, otrzymana od pacjenta z ostra bialaczka szpikowa. Ta linia komórkowa, opisana przez H. P. Koeff- lera i D. W. Golde'af Science, 200, 1153 /1978/, rosnie latwo w hodowli w pozywce zawie-148 276 7 rajacej RPMI /Rosewell Park Memorial Inetitute/ 1640 + 10* PCS /plodowa surowica ciele¬ ca/ inaktywowanej cieplem, 25 mM buforu HBPES /kwas N-2-hydrokeyetylopiperazyno-N'-2- -etanosulfonowy/ i 50 g/ml gentamycyny i jest przeszozepiana z podzialem aa 1-3 czesci dwa razy aa tydzien. Komórki mozaa wymrozic* z wymienionego poprzednio podloza wzrosto¬ wego + 10* dwumetylosulfot lenku. KG-1 zdeponowano w American Type Culture Collection /nr rejestracyjny ATCC CRL 8031/.Komórki KG-1 indukuje sie w celu wytworzenia mRNA interferonu leukocytów wirusem Sendai lub wirusem choroby Newcastle metoda opisana przez Rubinsteina i innych /troc.Natl. Aoad. Sci., USA, 76, 640-644 /1979/7* Komórki zbiera sie po uplywie 5 godzin po indukcji i otrzymuje sie RNA metoda: tiocyjanian guanidyny - chlorowodorek guanidyny /Bhirgwin i wsp., Biochemistry, 18, 5294-5299 /1979/ J. RNA z komórek nie indukowanych izoluje sie w ten sam sposób* Do otrzymania frakcji 12S mRNA poli /A/ uzywa sie chro¬ matografii na oligodezoksytymidyno /dT/ - celulozie i ultrawirówania w gradiencie sa¬ charozy, jak opisali Green i inni /Arch. Biochem. Biophys., 172, 74-89 /1976/ i Okuyu- ma i inni /Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 /1978/.7. Taki mRNA wykazuje miano in¬ terferonu 8000-10 000 jednostek^ug w badaniu w oocytach lenopus laevis /Cavalieri i inni, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 3287-3291 /1977/ /.B. Przygotowanie zbiorów kolonii zawierajacych sekwencje LelP cDNA.Do otrzymania dwuniciowego cDNA zwyklymi metodami /Wickens i inni, J. Biol. Chem., 253, 2483-2495 /1978/ i Goeddel i inni, Nature, 281, 544-548 /1979/J stosuje sie 5 /ig mRNA* cDNA frakcjonuje sie pod wzgledem wielkosci za pomoca elektroforezy w 6% ze¬ lu poliakryloamid owym i za pomoca elektroelucji odzyskuje sie 230 jig materialu w za¬ kresie 500-1500 b.p. Do konców tego cDNA, w 100 jxg próbce, wprowadza sie reszty dezo- ksycytydyny /dC/, jak opisali Chang i inni, Nature, 275," 617-624 /1978/, laczy z 470 ng plazmidu pBR322, do konców którego wprowadzono reszty dezoksyguanozyny /dG/ w miej¬ scu Pstl /feolivar i inni, Gene, 2, 95-113 /19777 i uzywa do transformowania E. coli x 1776, Otrzymuje sie okolo 130 transformantów opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicyline, na ng cDNA.W drugim podobnym eksperymencie otrzymuje sie okolo 1000 transf ormantów B. coli K-12 szczep 294 opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicyline, na mg cDNA. W tym przypadku po frakcjonowaniu pod wzgledem wielkosci odzyskuje sie za pomoca elektroelu¬ cji cDNA w zakresie 600-1300 b.p. w celu wprowadzenia reszt dC.C. Otrzymywanie i stosowanie syntetyoznych dezoksynukleotydów.Znajomosc sekwencji aminokwasów kilku fragmentów trypsynowych interferonu leukocytów ludzkich pozwala wyznaczyc syntetyczne dezoksynukleotydy komplementarne do róznych re¬ gionów mRNA LelF. Wybrano dwa peptydy trypsynowe T1 i T13, poniewaz ich sekwencja amino¬ kwasów wymaga syntezy tylko, odpowiednio, 12 i 4 undekarne rów, odpowiadajacych wszystkim mozliwym sekwencjom kodujacym /fig. 1/. Syntetyzuje sie 4 zestawy próbek dezoksynukleo¬ tydów, dla kazdej z sekwencji zawierajaoyoh albo trzy /T-1A, B, C, D/, albo jeden /T-13 A, B, C, D/ oligodezoksynukleotyd* Wskazane komplementarne dezoksynukleotydy o dlugosci 11 zasad syntetyzuje sie chemicznie metoda fosforotriestrowa /Crea i inni, Proc. Natl.Acad* Sci., USA, 75, 5764-5769 /197B/.7. Otrzymuje sie cztery indywidualne próbki w serii T-13, a dwanascie próbek T-1 w czterech pulaoh po trzy próbki, jak przedstawiono na fig. 1.Przygotowuje sie cztery indywidualne próbki serii T-13 i dwanascie T-1 w czterech pu¬ lach po trzy primery w kazdej i uzywa sie do prymowania syntezy znaczonego promieniotwór¬ czo jednoniciowego cDNA, uzywanego jako próbki do hybrydyzacji. Matryca mRNA jest albo 12S RNA z komórek KG-1 indukowanych wirusem Sendai /8000 jednostek aktywnosci IF//ig/, albo calkowity mRNA poli /A/ z nie indukowanych leukocytów / < 10 jednostek/^ig/. Z pri- merów tych, stosujac znane warunki reakcji /Noyes i inni, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 1770-1774 /1979/-7, otrzymuje sie cDNA znakowaoy 32P. Reakcje prowadzi siew objeto¬ sci 60 jxl9 w 20 mM Tris-HGl /pH 8,3/, 20 mM KC1, 6 mM MgClp, 30 mM y3 -merkaptoetanolu.W mieszaninaoh reakcyjnych znajduje sie 1 jig kazdego z primerów /to jest 12 )ig w calos¬ ci dla serii T-1, 4 ig w calosci dla serii T-13, 2 jug "indukowanej" frakcji 12S mRNA lub 10 ,ug nie indukowanego mRNA poli /A/ /, 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 jiCl / °^ 32P/8 148 276 dCTP Amersham, 2-3000 Ci /milimol/ i 60 jednostek odwrotnej transkryptazy /Bethesda Research Laboratories/. Produkt oddziela sie od materialu nie znaczonego za pomoca saczenia zelowego na 10 ml kolumnie zelu Sephade* G-50, traktuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 70°C 0f3 N roztworem Na OH w celu rozlozenia RNA i zobojetnienia HC1.Hybrydyzacje przeprowadza sie jak opisali Kafatos i inni, Nucleic Acids Res., 7, 1541-1552 /1979/.D. Identyfikacja klonów pL1-pL30.Stosuje sie szybka metode izolowania plazmidów opisana przez Birnboima i innych* Nucleic Acids Res.t 7, 1513-1523 /1979/, w celu otrzymania 1 ig plazmidowego DNA z kazdych 500 indywidualnych transformantów £• coli szczep 294 /patrz punkt B/. Kazda próbke denaturuje sie i nanosi na saczki nitrocelulozowe /po trzy jednakowe/ metoda Kafatosa i innych /patrz wyzej/.Trzy zestawy saczków nitrocelulozowych, zawierajacyoh po 500 próbek plazmidu hyb¬ rydyzuje sie z: a/ indukowanym cDNA prymowanym zestawem primerów T-1, b/ indukowanym cDNA prymowanym T-13» oraz c/ nie indukowanym cDNA otrzymanym przy uzyciu obydwu se¬ rii primerów* Klony sa uwazane za pozytywne, jesli hybrydyzuja silniej z jedna lub dwoma próbkami indukowanego cDNA niz z calkowicie nie indukowana próbka. Z pieciuset klonów wybiera sie trzydziesci "pozytywnych" klonów /pL1-pL30/ do dalszej analizy.B. Identyfikacja klonów pL31-pL39. Izolowanie plazmidu /nr 104/ zawierajacego frag¬ ment genu LelF.Transformanty E. coli x 1776 poddaje sie screeningowi metoda hybrydyzacji kolonii /Grunstein i Bogness, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 3961-3965 /1975/.7. stosujac jako próbke indukowany mRNA znaczony **2P /Lillenhaug i inni, Biochemistry, 159 1858- -1865 /1976/.7. Nieznaczony mRNA z nie indukowanych komórek miesza sie i próbka w stosunku 200:1 w celu kompetycji z nie indukowanym mRNA, obecnym w preparacie znaczo¬ nym -*2P. Hybrydyzacja znaczonego mRNA powinna byc uprzywilejowana w odniesieniu do kolonii zawierajacych indukowane sekwencje. Otrzymuje sie trzy klasy transformantów: 1/ 2-3* kolonii hybrydyzuje z 3 P-mRNA bardzo silnie, 2/ 10* hybrydyzuje znacznie slabiej niz klasa 1; oraz 3/ pozostale kolonie nie daja wykrywalnego sygnalu hybrydyzacji.Pozytywne kolonie /klasa 1 i 2/ bada sie pod wzgledem obecnosci sekwencji specyficz¬ nych dla interferonu w oznaczeniu zaleznym od hybrydyzacji mRNA specyficznego dla in¬ terferonu z plazmidowym DNA. Najpierw hoduje sie indywidualnie 60 wybitnie pozytywnych kolonii /klasa 1/ w 100 ml podloza M9 uzupelnionego tetracyklina /20 ig/ml/, kwasem dwu- aminopimelinowym /100 ig/ml/, tymidyna /20 /ig/ml/ i d-biotyna /1 ig/ml/. Podloze M9 za¬ wiera na litr: 6 g Na2HP0-, 3 g KH2P04 0,5 g NaCl i 1 g NH-C1. Po wyjalowieniu w auto¬ klawie dodaje sie 1 ml jalowego 1 molarnego.roztworu MgSO. i 10 ml jalowego 0,01 molar- nego roztworu CaClp. Tworzy sie pule z 10 hodowli i izoluje plazmidowy DNA z 6 pul, jak to opisali Clewell i inni, Biochemistry, 9, 4428-4440 /1970/. 10 ig z kazdej puli plaz¬ midowego DNA rozszczepia sie Hindlll, denaturuje i wiaze kowalencyjnie z DBM /dwuazo- benzyloksymetylo/-bibula. Z kazdym saozklem hybrydyzuje sie 1 jig oczyszczonego mRNA z indukowanych komórek.Niezhybrydyzowany mRNA usuwa sie za pomoca przemywania. Specyficznie zhybrydyzowany mRNA eluuje sie i poddaje translacji w oooytach Xenopus laevis. W tym oznaczeniu wszy¬ stkie szesc pul okazuje sie negatywnymi. Z 59 slabo pozytywnych kolonii /klasa 2/ przy¬ gotowuje sie piec pul z dziesieciu kolonii kazda 1 jedna pule z dziewieciu kolonii, przeprowadza preparatyke plazmidów i bada jak opisano wyzej. Wsród badanych szesciu pul, jedna /K10/ hybrydyzuje z mRNA interferonu na poziomach znacznie wyzszych od tla przy kazdorazowym badaniu.W celu identyfikacji cDNA specyficznego dla interferonu przeprowadza sie preparatyke plazmidowego DNA z 9 kolonii puli K-10 i bada indywidualnie. Dwa s dziewieciu plazmidów /nr 101 i nr 104/ przylaczaja mRNA interferonu na poziomie znacznie wyzszym od tla.Z plazmidu nr 104 izoluje sie unikalny fragment restrykcyjny Bg1II zawierajacy 260 b.p.,148 276 9 znakuje sie go P metoda opisana przez Taylora i innych, Biochem. Biophys. Acta, 442, 324-330 /1976/ i uzywa jako próbki do niezaleznego screeningu 400 transformantow E. co¬ li 294 metoda screeningu kolonii in situ Z&runstein i Hogness, Proc. Natl. Sci. USA, 72, 3961-3965 /1976/ J. Dziewiec kolonii /pL31-pL39/ zidentyfikowano jako hybrydyzuja- ce w róznym stopniu z ta próbka.Poza tym, w ten sam sposób do niezaleznego screeningu 4000 transformantow E. coli 294 stosuje sie znaczony fragment o 260 b.p. Identyfikuje sie 50 kolonii jako hybrydy- zujaoe w róznym stopniu z ta próbka. Jedna z próbek zawiera fragment LelF G, jedna - LelF H, a inna zawiera fragment oznaczony LelF H1, przypuszczalnie allel LelP H. Otrzy¬ mane hybrydowe plazmidy oznaczono "pLelF H", itp.F. Izolacja i oznaczenie sekwencji pierwszego genu LelF o pelnej dlugosci.Ze wszystkich 39 potencjalnych klonów cDNA LelF otrzymuje sie plazmid DNA i ponownie poddaje screeningowi z taka sama próbka DNA o 260 b.p. za pomoca metody hybrydyzacji Kafatosa i innych /patrz wyzej/. Trzy plazmidy /pL4f pL31, pL34/ daja bardzo silne syg¬ naly hybrydyzacji, cztery /pL13t pL30, pL32, pL36/ hybrydyzuja umiarkowanie a trzy /pL6, pL8, pL14/ slabo hybrydyzuja z próbka.Poddaje sie równiez soreeningowi 39 potencjalnych rekombinantowych plazmidów cDNA LelF, stosujac jako próbki bezposrednio do hybrydyzacji syntetyczne undekamery znaczone -*2P /indywidualne pule primerów T1, lub indywidualne primery T13/. Wybiera sie takie wa¬ runki hybrydyzacji, ze do wykrycia sygnalów hybrydyzacji wymagane jest dokladne parowa¬ nie zasad /Wallace i inni, Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 /1979/.7. Tak wiec, w stan¬ dardowy sposób metoda klarowanych lizatów /Clewe11 i inni, patrz wyzej/, otrzymuje sie plazmidowy DNA z 39 klonów i oczyszcza za pomoca chromatografii kolumnowej na kolumnie Biorad Agarose A-50.Próbki po 3 MS kazdego preparatu przeprowadza sie w postac linearna za pomoca EcoRI, denaturuje w odczynie zasadowym i nakrapla na 2 oddzielne saczki nitrocelulozowe, po 1»5ig na miejsce /Kafatos i inni, patrz wyzej/f Indywidualne syntetyczne primery dezo- ksyoligonukleotydów i pule primerów poddaje sie fosforylacji za pomoca / if P/ATP/ w nastepujacy sposób: 50 pikomoli oligonukleotydu i 100 pikomoli /'f ^ P/ATP/ New Eng- land Nuclear, 2500 Ci/milimol/ laczy sie w 30 il 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgClg, 15 mM /3-merkaptoetanolu. Dodaje sie 2 jednostki kinazy polinukleotydowej T4 i po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37 C, oczyszcza sie primery znaczone P za pomoca chromato¬ grafii na 10 ml kolumnach zelu Sephade* G-50. Hybrydyzacje przeprowadza sie stosujac primer T-13C /10 zliczen/min./ lub pule primerów T-1C /3 x 10 zliczen/min/. Hybry¬ dyzacje przeprowadza sie w temperaturze 15°C w ciagu 14 godzin w 6 x SSC /1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0t015 M oytrynian sodowy, pH 7,2/, 10 x w roztworze Penhardta /0,2% nyd- leoa albumina surowicza, 0,2* poliwinylopirolidon, 0,2* Ficoll/, jak opisali Wallace i inni /patrz wyzej/. Saczki przemywa sie w ciagu 5 minut /3 razy/ w temperaturze 0°C w 6 z SSC, suszy i eksponuje na blonie czulej na promienie X. Wyniki przedstawiono na fig. 2 dla puli 32P-primerów T-13 C i T-1 C.Stwierdzono, ze plazmidowy DNA z klonu 104 wykazuje znaczna hybrydyzacje z pula primerów T-1C i primerem T-13C;ale nie wykazuje wykrywalnej hybrydyzacji z innymi un- de karne rami. Jak przedstawiono na fig. 2, kilka z potencjalnych plazmidów LelF /pL2, 4, 13» 17, 20, 30, 31, 34/ równiez hybrydyzuje z obydwoma tymi próbkami. Tym niemniej analiza restrykcyjna wykazuje, ze tylko jeden z tych plazmidów, pL31, zawiera równiez wewnetrzny fragment Bg III o 260 b.p. Trawienie pL31 za pomoca PatI wykazuje, ze dlu¬ gosc insertu cDNA wynosi okolo 1000 b.p.Analizuje sie sekwenoje calego insertu Pstl z pL31 zarówno chemiczna metoda Maxama- -Gilberta /Lfethods Enzymol., 65, 499-560 /1980/y, jak i metoda dwudezoksy - zakoncze¬ nia lancucha /Smith, Methods Enzymol., 65, 560-580 /1980/.7 po podklonowaniu fragmentów Sau3a do nosnika M13# Sekwencje DNA przedstawiono na fig. 3 /"Aw/. Odpowiednia transla- cyjna faze odczytywania mozna przewidziec z posiadanej informacji co do sekwencji ami¬ nokwasów w bialku, znanego zakresu ciezarów czasteczkowych LelF 1 wzglednego wystepowa-10 148 276 nia trypletów stop w trEech mozliwych fasach odczytywania, co z kolei pozwala przewi¬ dziec calkowita sekwencje aminokwasów, wlacznie z prepeptydem lub peptydem sygnalowym* Pierwszy kodon inicjacji translacji ATG stwierdEono w poEycji 60 sekwencji nukleotydów od konca 5 ', a nastepnie o 18B kodonów dalej wystepuje tryplet zakonczenia TGA, tak wiec istnieja 342 nie ulegajace translacji nukleotydy na koncu 3', a nastepnie sekwen¬ cja poli /AA Domniemany peptyd sygnalowy /przypuszczalnie zaangazowany w wydzielaniu dojrzalego LelP e leukocytów/ ma dlugosc 23 aminokwasów. 165 aminokwasów skladajacych sie na doj¬ rzaly LelF ma wyliczony ciezar czasteczkowy 19390. LelF kodowany przez pL31 nazwano LelF A* Peptydy trypeynowe T1 i T13 LelF B odpowiadaja aminokwasom 145-149 i 57-61 w odniesieniu do LelF A, jak to jest widoczne e danych dotyczacych sekwencji /WA"/ na fig. 4* Faktyoznymi kodujacymi sekwencjami DNA znajdowanymi w tych dwóch regionach sa sekwencje repreEentowane prEez pale primerów T1-C i primer T13-C /patrz fig. 8/.G. Wytwarzanie plazmidu pLelF A trp 25* 1. Uwagi ogólne. Metoda ekspresji LelF bezposrednio jako dojrzalego interferonu jest wariantem metody wczesniej uzywanej dla ludzkiego hormonu wzrostu /Goeddel i inni, Natu¬ re, 281, 544-548 /1979/.7, w tym zakresie, w jakim wlacza kombinacje syntetycznego /N-koncowego/ i komplementarnych DNA.Jak wskazano na figurze 6, miejsce endonukleazy restrykcyjnej Sau3a jest dogodnie ulokowane miedzy kodonami 1 i 3 LelF A. Zaplanowane sa dwa syntetyczne dezoksynukleo- tydy, które wlaczaja kodon inicjacji translacji .ATG, przywracaja kodon pierwszego ami¬ nokwasu /cysteina/ i tworza lepkie konce EcoRI. Oligomery te laczy sie z fragmentem Sau3a-AvaII o 34 b.p. Powstaly produkt o 45 b.p. laczy sie z dwoma dodatkowymi fragmen¬ tami DNA w celu konstrukcji hybrydowego genu syntetyczno-naturalnego kodujacego LelF oraz zakonczonego miejscami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl. Gen ten wlacza sie do p£R322 miedzy miejsca EcoRI i Pstl otrzymujac plazmid pLelF A1# 2. Konstrukcja tryptofanowego elementu kontrolnego /zawierajacego promotor trp E, coli, operator i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, ale bez sekwencji ini¬ cjacji translacji /ATG/J.Plazmid pGMI zawiera tryptofanowy operon E. coli s delecja ALE 1413 /Miozzari i inni, J. Bacteriology, 133» 1457-1466 /l978/_7 i dlatego doprowadza do ekspresji pola¬ czonego bialka zawierajacego 6 pierwszych aminokwasów lidera trp i w przyblizeniu 3 ostatnie aminokwasy polipeptydu E trp /w dalszej czesci opisu lacznie nazywanego LEV, jak równiez polipeptyd D trp w calosci, wszystko pod kontrola ukladu promotor-operator.Plazmid w ilosci 20 jig trawi sie enzymem restrykcyjnym PvuII, który rozszczepia plazmid w 5 miejscach. Fragmenty genu laczy sie nastepnie z lacznikami EcoRI /skladajacymi sie e samokomplementarnego oligonukleotydu o sekwencji pCATGAATTCATG/ zapewniajac miejsce rozszczepienia EcoRI do pózniejszego klonowania do plazmidu zawierajacego miejsce EcoRI.Fragmenty DNA w ilosci 20 jxg otrzymane z pGM1 traktuje sie w ciagu nocy w temperaturze 4°C 10 jednostkami ligazy DNA T4 w obecnosci 200 pikomoli 5* -foeforylowanego syntetycz¬ nego oligonukleotydu pCATGAATTCATG w 20 il buforu dla ligazy DNA T4 /20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP., 10 mM MgCl^, 5 mM dwutiotreitol/. Nastepnie roztwór ogrzewa sie w ciagu 10 minut w temperaturze 70°C w celu zatrzymania laczenia.Laczniki rozszczepia sie przez trawienie EcoRI, rozdziela sie za pomoca elektrofore¬ zy w 5$ zelu poliakryloamidowym /w dalszej czesci opisu okreslanym jako PAGE/ i izoluje sie z zelu trzy najwieksze fragmenty przez, po pierwsze, barwienie bromkiem etidium, zlokalizowanie fragmentów w swietle ultrafioletowym i wyciecie z zelu interesujacych czesci. Kazdy fragment umieszcza sie w woreczku dializacyjnym wraz £ 300/*- litrami 0,1 x TBB i poddaje w ciagu 1 godziny elektroforeEie w 0,1 x buforEe TBB przy róznicy potencjalów 100 V /bufor zawiera 10,8 g Tris w postaci zasady, 5.5 g kwasu borowego, 0,09 g NagBDTA w 1 litrze wody/. Zbiera sie wodny roztwór e worecska dialisacyjnego, ekstrahuje fenolem, ekstrahuje chloroformem, doprowadza do stezenia 0,2 M chlorkiem sodowym i odzyskuje DNA w wodzie po straceniu etanolem. Gen zawierajacy promotor-opera¬ tor trp z lepkimi koncami EcoRI identyfikuje sie metoda opisana dalej, wymagajaca in- eeroji fragmentów do plazmidu wrazliwego na tetracykline, który po wlaczeniu promotora-148 276 11 -operatora staje sie oporny Da tetracykliny.Plazmid pBRHI /Rodriguez i inni, Nuoleic Acide Ree., 6, 3267-3287 /1979/ ] wykasu¬ je ekspresje opornosci na ampicyline i zawiera gen opornosci na tetracykline, ale nie majac przylaczonego promotora, nie wykazuje ekspresji tej opornosci. Plazmid jest skut¬ kiem tego wrazliwy na tetracykline. Przez wprowadzenie ukladu promotor-operator do miej¬ sca EcoRI, plazmid mozna uczynic opornym na tetracykline.Plazmid pBRHI trawi sie EcoRI i usuwa enzym za pomoca ekstrakcji fenolem, a nastep¬ nie chloroformem i odzyskuje w wodzie po straceniu etanolem. Powstajace czasteczki DNA miesza sie w oddzielnych mieszaninach reakcyjnych z kazdym z trzech fragmentów DNA otrzymanych jak opisano wyzej i laczy za pomoca ligazy DNA T4, jak opisano wyzej. DNA obecny w mieszaninie reakcyjnej stosuje sie do transformowania zwyklymi metodami kom¬ petentnej E. coli K-12 szczep 294 /fcershfield i inni,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3455-3459 /1974/-7 i wysiewa bakterie na plytki LB /Luria-Bertani/ zawierajace ampicy¬ line w stezeniu 20 ug/ml i tetracykline w stezeniu 5 ig/ml. Selekcjonuje sie kilka ko¬ lonii, izoluje plazmidowy DNA i potwierdza obecnosc zadanego fragmentu za pomoca anali¬ zy enzymami restrykcyjnymi. Powstaly plazmid nazwano pBRHtrp.Produkt trawienia EcoRI i BamHI genomu wirusa hepatitis B otrzymuje sie zwyklymi spo¬ sobami i klonuje do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pGHG /Goeddel i inni, Nature, 281, 544 /1979/ ] w celu utworzenia plazmidu pHS32. Plazmid pHS32 rozszczepia sie Xbal, eks¬ trahuje fenolem, nastepnie chloroformem i wytraca etanolem. Nastepnie otrzymany material traktuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C 1 jxl polimerazy DNA I E. coli /fragment Klenowa/ produkcji Eoehringer-Mannheim, w 30 jil buforu polimerazy /50 mM fosforan pota¬ sowy, pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM Ji -merkaproetanol/ zawierajacego 0,1 mM dTTP i 0,1 mM dCTP, a nastepnie w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C. Traktowanie to powoduje, ze 2x4 nukleotydów staja komplementarne do wystajacego konca miejsca rozszczepienia Xbal do uzupelnienia w: 5' CTAGA 5' CTAGA 3' T 3' TCT Dwa nukleotydy, dC i dT zostaja wlaczone dajac zakonczenie o dwóch wystajacych nukleo- tydach 5'. Te linearna pozostalosc plazmidu pHS32 /po ekstrakcji fenolem, chloroformem oraz odzyskaniu w wodzie po straceniu etanolem/ rozszczepia sie EcoRI. Duzy fragment pla¬ zmidu oddziela sie od mniejszego fragmentu IcoRI-XbaI za pomoca PAGZ i izoluje po elek- troelucji. Ten fragment DNA otrzymany z pHS32 /0,2ag/ laczy sie w warunkach podobnych do wyzej opisanych z fragmentem EcoRI-TaqI operonu tryptofanowego / ^ 0,01 ig/, otrzy¬ manym z pBRHtrp.W procesie laczenia fragmentu otrzymanego z pHS32 z fragmentem EcoRI-TaqI, jak opisa¬ no wyzej, laczy sie wystajacy koniec Taql z pozostalym wystajacym koncem Xbal, nawet jesli nie sa one calkowicie sparowane w sposób zgodny z zasada Watsona i Cricka: T CTAGA -TCTAGA + AGC TCT -AGCTCT Czesc tej mieszaniny reakcyjnej, w której odbywalo sie laczenie, transformuje sie do komórek E. coli 294, poddaje sie obróbce cieplnej i wysiewa na plytki LB zawierajace ampicyline. Wybiera sie 24 kolonie, prowadzi ich hodowle 3 ml podloza LB /Luria-Berta¬ ni/ i izoluje sie plazmid. Stwierdzono, ze szesc sposród tych plazmidów ma miejsce Xbal zregenerowane przez reperacje DNA katalizowana przez 2. coli i replikacje -TCTAGA TCTAGA AGCTCT AGATCT Stwierdzono równiez, ze plazmidy te rozszczepiane sa zarówno przez EcoRI, jak i Hpal, dajac oczekiwane fragmenty restrykcyjne. Plazmidu oznaczonego jako pTrp14, uzywa sie do ekspresji heterologicznych polipeptydów, jak opisano dalej.12 148 276 Plazmid pHGH 107 /Goeddel i inni, Nature, 281, 544 /1979/.7, zawiera gen ludzkiego hormonu wzrostu skladajacy sie z 23 kodo nów aminokwasów otrzymanych z fragmentów syn¬ tetycznego DNA i 163 kodo nów aminokwasów otrzymanych z komplementarnego DNA otrzymane¬ go za pomoca odwrotnej transkrypcji mRNA ludzkiego hormonu wzrostu. Gen ten, w którym brak kodonów "pre" sekwencji ludzkiego hormonu wzrostu, zawiera kodon inicjacji trans¬ lacji ATG. Gen izoluje sie z 10 }ig pHGH 107 przez dzialanie EcoRI, a nastepnie po lime- razy DNA I E. coli /fragment Kle nowa/ i dTTF oraz dATP, jak opisano wyzej. Po ekstrak¬ cji fenolem i chloroformem oraz wytraceniu etanolem, plazmid traktuje sie BamHI.Fragment zawierajacy gen ludzkiego hormonu wzrostu /HGH/ izoluje sie za pomoca PAGE, a nastepnie elektroelucji. Otrzymany fragment DNA zawiera równiez pierwsze 350 nukleo- tydów genu strukturalnego opornosci na tetracykline, ale brak w nim ukladu promotor- -operator tak, ze gdy zostanie klonowany dla plazmidu wykazujacego ekspresje, mozna zlokalizowac plazmidy zawierajace insert przez przywrócenie opornosci na tetracykline.PoniewazBciRI - koniec fragmentu uzupelniono metoda z uzyciem polime razy I /fragment Klenowa/, fragment ten zawiera jeden wolny koniec i jeden koniec lepki, 00 zapewnia prawidlowa orientacje po pózniejszym wlaczeniu do plazmidu wykazujacego ekspresje.Wytwarza sie nastepnie plazmid ekspresji pTrpH w celu przyjecia fragmentu zawiera¬ jacego gen HGH, otrzymany jak opisano wyzej. Tak wiec trawi sie pTrpH Xbal i powsta¬ le lepkie konce uzupelnia metoda z uzyciem po lime razy 1 /fragment Kle nowa/ i dATP, dTTP, dGTP, dCTP, Po ekstrakcji fenolem i chloroformem, oraz wytraceniu etanolem, pow¬ staly DNA traktuje sie BamHI i otrzymany duzy fragment plazmidu izoluje sie za pomoca PAGE, a nastepnie elektroelucji. Fragment otrzymany z pTrpH zawiera jeden wolny koniec i jeden koniec lepki, co pozwala na rekombinacje w prawidlowej orientacji z fragmentem zawierajacym gen HGH, opisanym poprzednio.Fragment genu HGH i fragment A Iba-BamHI pTrpH miesza sie i laczy w warunkach po¬ dobnych do opisanych wyzej. Uzupelnione konce Xbal i EcoRI laczy sie metoda laczenia wolnych konców w celu odtworzenia miejsca zarówno Xbal jak i EcoRI: Uzupelniony Xbal Uzupelniony EcoRI Inicjacja genu HGH TCTAG AATTCTATG TCTAGAATTCTATG + * AGATC TTAAGATAC AGATCTTAAGATAC Xbal EcoRI Konstrukcja ta przywraca równiez ekspresje genu opornosci na tetracykline. Poniewaz plazmid pHGH 107 wykazuje ekspresje opornosci na tetracykline od promotora w góre /pro¬ motor lac/, konstrukcja ta, oznaczona pHGH 207, pozwala na ekspresje genu opornosci na tetracykline pod kontrola ukladu promotor-operator tryptofanowy. Tak wiec mieszanine reakcyjna, z której odbywalo sie laczenie, transformuje sie E. coli 294 i dokonuje se¬ lekcji kolonii na plytkach LB zawierajacych tetracykline w stezeniu 5Ug/ml.Plazmid pHGH 207 trawi sie EcoRI i za pomoca PAGE, a nastepnie elektroelucji odzys¬ kuje sie fragment o 300 b.p. zawierajacy promotor trp, operator i liderowe miejsce przy¬ laczenia rybosomów trp, ale bez sekwencji Inicjacji translacji ATG. Ten fragment DNA klonuje sie do miejsca EcoRI pLelF A. Plazmidy wykazujace ekspresje, zawierajace zmody¬ fikowany, jak wyzej, regulon trp /operon trp E. coli, z którego usunieto sekwencje osla¬ biajaca w celu mozliwego do kontrolowania podwyzszenia poziomu ekspresji/ mozna hodowac do ustalonego poziomu w podlozach odzywczyoh zawierajacych tryptofan w ilosciach nie¬ zbednych do represji ukladu promotor-operator, a nastepnie pozbawionych tryptofanu w celu depresji ukladu i mozliwosci ekspresji zadanego produktu* Bardziej szczególowo i w odniesieniu do fig. 6, 250/ig plazmidu pL31 trawi sie Pstl i insert o 1000 b.p. izoluje sie za pomoca elektroforezy w 6ff zelu poliakryloamidowym.Dokonuje sie elektroelucji z zelu okolo 40 jug insertu i dzieli go na 3 próbki do dal¬ szego trawienia:148 276 13 a/ Trawi sie czesciowo 16 jig próbke tego fragmentu 40 jednostkami BgHII w ciagu 45 minut w temperaturze 37°C i oczyszcza mieszanina reakcyjna w 6% zelu pol ia kryl oamid owym.Odzyskuje sie okolo 2 )ig zadanego fragmentu o 670 b.p. b/ 8 )xg insertu Petl o 1000 b.p., jako inna próbke, poddaje sie dzialaniu AvaII i Bg II. Za pomoca elektroforezy w zelu odzyskuje sie 1 jxg wskazanego fragmentu o 150 b.p. c/ 16 jig fragmentu o 1000 b.p. traktuje sie Sau3a i AvaII.Po elektroforezie w 10* zelu poliakryloamidowym odzyskuje sie okolo 0f25 ug /10 piko- moli/ fragmentu o 34 b.p. Dwa wskazane oligodezoksynukleotydy, 5 '-dAATTCATGTGT /frag¬ ment 1/ i 5'-dGATCACACATG /fragment 2/ syntetyzuje sie metoda f osfotriestowa. Fragment 2 fosforyluje sie w nastepujacy sposób: 200 ul / ^ 40 pikomoli/ / *f P/ATP/ Amersham, 5000 Ci /milomol/ przeprowadza sie w proszek i zawiesza w 30 )xl 60 mM Tris-HCl /pH 8,0/, 10 mM MgCl2, 15 mM p-merkaptoetanolu zawierajacym 100 pikomoli fragmentu DNA i 2 jednos¬ tki kinazy polinukleotydowej T4. Po 15 minutach inokulacji w temperaturze 37°C dodaje sie 1 Jul 10 mM ATP i prowadzi reakcje w ciagu dalszych 15 minut. Nastepnie mieszanine reakcyjna ogrzewa sie w ciagu 15 minut w temperaturze 70°C, miesza z 100 pikomolami fragmentu I 5*-0H i 10 pikomoli fragmentu Sau3a-AvaII o 34 b.p. Laczenie przeprowadza sie w ciagu 5 godzin w temperaturze 4°C « 50 jil 20 mM Tris-HCl /pH 7,5/, 10 mM MgClp, 10 mM dwutiotreitolu, 0,5 mM ATP, w obecnosci 10 jednostek ligazy DNA T4.Mieszanine poddaje sie elektroforezie w 64 zelu poliakryloamidowym i odzyskuje pro¬ dukt o 45 b.p. za pomoca elektroelucji. Okolo 30 jig /1 pikomol/ produktu o 45 b.p. mie¬ sza sie z 0,5 MS /5 pikomoli/ fragmentu AvaII-BglII o 150 b.p. i 1 ig /2 pikomole/ fragT mentu Bglll-Pstl o 670 b.p. Laczenie przeprowadza sie w temperaturze 20°C w ciagu 16 godzin z uzyciem 20 jednostek ligazy DNA T4. Ligaze inaktywuje sie przez ogrzewanie do temperatury 65°C w ciagu 10 minut. Nastepnie w celu wyeliminowania polimerów genu mie¬ szanine trawi sie EcoRI i Pstl. Mieszanine oczyszcza sie z zastosowaniem 6% PAGE. Izolu¬ je sie 20 ig /0,04 pikomola/ produktu o 865 b.p. Polowe tej ilosci /10 jig/ wlacza sie do pBR322 /0,3jug/ miedzy miejsca EcoRI a Pstl. Transformacja E. coli 294 daje 70 trans- fonnantów opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicyline. Plazmidowy DNA izolowany z 18 tych transformantów trawi Bie EcoRI i Pstl. Sposród tych 18 plazmidów 16 mialo frag¬ ment EcoRI-Pstl o dlugosci 865 b.p. Jeden^ag jednego z tych plazmidów, pLelP A1, trawi sie EcoRI i laczy z 0,1 /ig fragmentu EcoRI o 300 b.p. zawierajacego promotor trp i lide- rowe miejsca przylaczenia rybosomów trp, otrzymanego jak opisano wyzej. Transformanty zawierajace promotor trp identyfikuje sie z uzyciem próbki J P-trp w polaczeniu z metoda screeningu kolonii Grunsteina-Hognessa. Asymetrycznie umieszczone we fragmencie trp miejsce Xbal pozwala na okreslenie rekombinentów, w których promotor trp zorientowany byl w kierunku genu LelP A. 3* Aktywnosc LelP A in vitro i in vivo Ekstrakty przygotowuje sie do badania IP w nastepujacy sposób. Prowadzi sie 1 ml ho¬ dowle w podlozu L zawierajacym tetracykline w stezeniu 5/*g/ml do wartosci Accq okolo 1,0 i rozciencza do objetosci 25 ml podlozem M9 zawierajacym tetracykline w stezeniu 5 jag/ml. Gdy wartosc Acc0 osiagnie 1,0 zbiera sie przez odwirowanie 10 ml próbki i osad komórek zawiesza w 1 ml 154 sacharozy, 50 mM Tris-HCl /pH 8,0/, 50 mM EDTA. Dodaje sie 1 mg lizozynu i po 5 minutach inkubacji w temperaturze 0°C komórki rozbija sie przez nadzwiekowienie. Próbki odwirowuje sie w ciagu 10 minut /15 000 obrótów/minut e/ i okres¬ la sie aktywnosc LelP w supernatantach w porównaniu ze standardowymi LelF na podstawie zahamowania efektu cytopatycznego /CPE/. W celu okreslenia ilosci czasteczek IP na ko- R morke uzywa sie LelP o aktywnosci wlasciwej 4 x 10 jednostek/mg.Jak przedstawiono w tablicy 1, klony pLelP A trp 25, do których promotor trp zostal wlaczony w zadanej orientacji, wykazuja wysoki poziom aktywnosci /tak wysoki, jak 2,5 o x 10 jednostek/litr/. Jak przedstawiono w tablicy 2, IP wytworzony przez E. coli K-12 szczep 294/pLeIP A trp 25 zachowuje sie podobnie do oryginalnego ludzkiego LelP. Jest on stabilny w pH 2 i ulega neutralizacji przez królicze przeciwciala przeciw ludzkim leukocytom. Interferon wykazuje ciezar czasteczkowy okolo 20 000.14 148 276 Skuteczne dEialanle interferonu in vivo wymaga obeonosci makrofagów i naturalnych komórek zabijajacych /MK/. Mechanizm dzialania in vivo obejmuje stymulacje tych komórek.Tak wiec, pozostaje mozliwe, ze interferon tworzony przez £• coli 294/pLelF A 25, wy¬ kazujacy aktywnosc w badaniu w hodowlach komórkowych, nie wykazywalby aktywnosci w orga¬ nizmie zakazonych zwierzat. Ponadto, przeciwwirusowa aktywnosc LelF A wytworzonego przez bakterie, nie glikozylowane go, moze sie róznic od aktywnosci LelF otrzymanego z ludzkich leukocytów "buffy coat". Tak wiec, porównuje sie aktywnosc biologiczna wytwo¬ rzonego przez bakterie LelF A /2% czystosci/ z aktywnoscia LelF "buffy coat" /Q% czys¬ tosci/ w smiertelnym zakazeniu wirusem zapalenia mózgu i miesnia sercowego u malp sei- miri /tablica 3/.Tablica 1 Aktywnosc interferonu w ekstraktach E. coli E. coli K-12 szczep 294 transformowany przez JpLelF A trp 25 pLelF A trp 25 l Gestosc komórek Aomórki/ml/ 3,5 x 108 1,8 x 109 Aktywnosc IF jednostki/ml hodowli 36 000 250 000 Ilosc czasteczek LelF na komórke I 9 000 12 000 | Tablica 2 Porównanie aktywnosci ekstraktów B» coli 294/pLeIF A 25 ze standardem LelF* ekstrakt 294/pLeIF A trp 25 ! | Standard LelF Aktywnosc interferonu /jednostki/ml/ nie poddany obróbce 500 500 i I pH 2 500 500 i 1 królicze przeciwciala | przeciw leukocytom j ludzkim < 10 < 10 i * Ekstrakt E. coli 294/pLelF A trp 25 o aktywnosci 250 000 jednostek/ml opisany w tablicy 1 rozciencza sie 500 x minimalnym podlozem podstawowym, co daje aktywnosc wlasciwa 500 jednostek/ml* Standard interferonu leukocytów /Wadley Institute/, uprzed¬ nio wymiareczkowany wobec standardu interferonu leukocytów NIH, równiez rozolencza sie do koncowego stezenia 500 jednostek/ml* Próbki o objetosci 1 ml doprowadza sie do pH 2 es pomooa 1 N HC1, inkubuje w oiagu 52 godzin w temperaturze 4°C i zobojetnia przez dodanie NaOH, po czym okresla aktywnosc interferonu w zwyklym badaniu zahamowania CPE* Próbki o objetosci 25 Jil o aktywnosci 500 jednostek/ml /nie poddane obróbce/ inkubuje sie z 25,41 roztworem króliozyoh przeciwcial leukocytom ludzkim w ciagu 60 minut, w temperaturze 37°C, wiruje w ciagu 5 minut przy 12 000 x g i bada supernatant.Tablica 3 Dzialanie przeciwwirusowe róznyoh preparatów LelF przeciw zakazeniu wirusem EMC u malp selmlrl I Czynnik j dzialajacy Kontrola j /bialka l bakteryjne/ Bakteryjny LelF A Standard l LelF I I J | Ilosc zwierzat przezywa¬ jacych 0/3 3/3 3/3 I Surowicze czynniki tworzace lysinkl, I jednostki na ml | dzien 2 [OOO OOO OO O j dzien 3 I 3 x 10*1 0 I 104 oj 0 0 0 0 o ! 0 | I dzien 4 I I 1°51 4 1200 T 3,4x10* 0 J 0 0 0 0 0148 276 15 Wszystkie malpy sa samcami /sredni ciezar 713 g/ i nie wykazuja przed zakazeniem przeciwcial przeciw wirusowi EMC, Malpy aekaza sie domiesniowo 100 x LDc0 wirusa EMC /oznaczonymi na myszach/. Malpy kontrolne padly po 134, 158 i 164 godzinach od zakaze¬ nia* Leczenia interferonem /10 jednostek/ dokonuje sie przez dozylne podawanie w go¬ dzinach: -4, +2, 23, 29, 4Bf 72, 168 i 240 w stosunku do czasu zakazenia. Bakteryjny interferon leukocytów jest frakcja otrzymana przy prowadzeniu chromatografii kolumno¬ wej lizatu E. coli 294/pLeIF A 25 o aktywnosci wlasciwej 7,4 z 106 jednostek/mg bial¬ ka* Kontrolne bialka bakteryjne sa równowazna frakcja otrzymana przy prowadzeniu chro¬ matografii kolumnowej lizatu E. coli 294/pBR322 przy dwukrotnym zageszczeniu bialka calkowitego. Standardem interferonu leukocytów jest interferon indukowany wirusem Sen- dai, z normalnych komórek ludzkich "buffy coat", oczyszczony chromatograficznie do ak¬ tywnosci wlasciwej 32 x 10 jednostek/mg bialka.Malpy kohtrolne wykazywaly postepujacy letarg, utrate równowagi, porazenie wiotkie tylnych konczyn i zaburzenia w równowadze plynów zwiazane z oczami, zaczynajace sie osiem godzin przed smiercia. Malpy leczone interferonem nie wykazywaly zadnego z tych nienormalnych objawów, pozostawaly aktywne przez caly czas i nie wykazywaly wiremii.Jedyna malpa w grupie kontrolnej, u której nie powstala w ciagu 4 dni wiremia, padla ostatnia /164 godziny po zakazeniu/. Wykazywala ona jednak wysokie miana wirusa w ser¬ cu i mózgu post mortem. U malp leczonych interferonem nie powstawaly przeciwciala prze¬ ciw wirusowi EMC, jak to oznaczono 14 i 21 dnia po zakazeniu. Wyniki te wykazuja, ze przeciwwirusowe dzialania preparatów LelF u zakazonych zwierzat moze byó przypisane jer dynie interferonowi, poniewaz bialka zanieczyszczajace sa calkowicie rózne w prepara¬ tach bakteryjnych i "buffy coat". Wyniki te wskazuja poza tym na to, ze glikozylacja nie jest wymagana jesli chodzi o aktywnosc przec iwwirus owa LelP A in yivo.Przyklad II. Wytwarzanie dodatkowych plazmidów zdolnych do ekspresji dojrza¬ lych LelF B-H.Z Dlazmidu zawierajacego calkowicie scharakteryzowany cDNA LelF A wycina sie DNA za 32 pomoca Pstl, izoluje elektroforetycznie i znakuje P. Otrzymanego znaczonego promienio¬ twórczo DNA uzywa sie jako próbki do screeningu dodatkowych transformantów E. coli 294, otrzymanych w ten sam sposób jak opisano w czesci B przykladu I metoda screeningu kolo¬ nii in situ Grunateina i Hognessa /patrz wyzej/.Izoluje sie kolonie hybrydyzujace z próbka w róznych ilosciach. Izoluje sie plazmi¬ dowy DNA z tych kolonii oraz dziesieciu hybrydyzujacyeh kolonii okreslonych w czesci G, jak wyzej, przez przeciecie reszt Pstl i charakteryzuje trzema róznymi metodami. Po pierwsze, fragmenty Pstl charakteryzuje sie przez sposób, w jaki trawione sa one przez endonukleazy restrykcyjne, z uzyciem enzymów Bglll, PvuLL i EcoRI. Analiza ta pozwala na klasyfikacje co najmniej osmiu róznych typów /LelF A, LelF B, LelF C, LelF E, LelF F, LelF G i LelF H/ przedstawionych na fig. 5, gdzie rózne naciecia restrykcyjne przed¬ stawione sa /w przyblizeniu/ wzgledem dodatkowej znanej presekwencji i sekwencji koduja¬ cej LeiF A. Uwaza sie, ze jeden z nich, LelF D, jest identyczny £ tym, o którym doniesli Nagata i inni, Nature, 284, 316-320 /1980/.Po drugie, rózne DNA bada sie metoda selekcji hybrydyzacyjnej, opisana przez Cleve- landa i innych, Celi, 20, 95-105 /1980/, pod wzgledem zdolnosci do wybiórczego usuwania mRNA-LelF z RNA komórek KG-1 zawierajacego poli A. LelF A, B, C i F okazaly sie w tej próbie pozytywne.Po trzecie, dalsze fragmenty Pstl wprowadza sie do plazmidu wykazujacego ekspresje, transformuje tym plazmidem B. coli 294 i doprowadza do ekspresji fragmentów. Produkty ekspresji, 00 do których uwaza sie, ze zawieraja preinterferony, byly wszystkie pozytyw¬ ne w badaniu aktywnosci CPE interferonu, aczkolwiek w przypadku fragmentu LelF F aktyw¬ nosc byla bliska granicy. Oprócz powyzszych badan, wszystkie trzy LelF poddano badaniu sekwenoji.16 146 276 ii. Wytwarzanie plazmidu pLe.IF B trp 7 Sekwencja izolowanego fragmentu zawierajacego gen dojrzalego LelF B wskazuje na pier¬ wsze 14 nukleotydów identycznych w typie A i B. Zgodnie z tym, izoluje sie fragment ge¬ nu pLelF A 25 zawierajacy uklad promotor-operator trp, miejsce przylaczenia rybosomów i startu genu LelF A /=B/ i miesza z pozostala czescia sekwencji B w plazmidzie wykazuja- oym ekspresje. Odpowiednie mapy restrykcyjne fragmentu Pst pL4 /plazmid zawierajacy gen LelF B zakonczony Pst, pokazany na fig. 5/ i pLelF A 25 przedstawiono na rysunku, odpo¬ wiednio aa fig. 7a i 7b.Dla otrzymania fragmentu Sau3a-Pstl o okolo 950 b.p. z sekwencji przedstawionej na fig. 7a, niezbednych jest kilka stadiów, a to z powodu obecnosci jednego lub kilku wy¬ traconyoh miejsc restrykcyjnych Sau3a, a mianowicie: 1. Izoluje sie nastepujace fragmenty: a/ Sau3a-EooRI o 110 b.p., b/ BcoRI-Xba o 132 b.p. oraz c/ Xba-Pst o 700 b.p. 2. Fragmenty /1a/ i /Ib/ laczy sie i nacina Ba pomoca Xba i Bglll w celu zapobiezenia samopolimeryzacji koncami Sau3a i Xba /zwiazane z omawiana sprawa miejsce Sau3a znajduje sie w miejscu Bglll, a Bgllll nacina z pozostawieniem lepkiego konca Sau3a/« Izoluje sie fragment o 242 b.p.Produkty otrzymane w stadiach /2/ i /1c/ laczy sie i nacina Pst i Bglll, takze w celu zapobiezenia samopolimeryzacji. Izoluje sie odpowiedni fragment Sau3a-Pstl o 950 b.p. /fig. 7a/. Fragment ten zawiera czesc genu LeiF B, która nie jest wspólna z LelF A. 4. Z pLelF A 25 izoluje sie fragment HindIII-Sau3a o okolo 300 b.p. zawierajacy uklad promotor-operator trp, miejsce przylaczenia rybosomów, sygnal startu ATG i kod on cystei¬ ny LelF A. 5» Z pBR322 izoluje sie fragment Pstl-Hindlll o okolo 3600 b.p. Zawiera on replikon i koduje opornosc na tetracykline, ale nie na ampicyline. 6. Fragmenty otrzymane w stadiach /3/, /4/ i /5/ laczy sie razem i powstalym plazmi¬ dem transformuje komórki £• coli K-12 szczep 294.Transformaaty poddaje sie miniscreeningowi /Birnboim i inni, Nucleic Acid Res.9 7, 1513-1523 /1979/^7 i próbki plazmidu trawi EcoRI. Produkt trawienia dostarcza 3 fragmen¬ ty o nastepujacej charakterystyce: 1/ fragment EcoRI-EcoRI promotora trp, 2/ wewnetrzny fragment EcoRI-EcoRI pL4, oraz 3/ fragment bialkowy sygnalu poczatku translacji - EcoRI pL 4.Ekstrakty bakteryjne klonów otrzymanych w powyzszy sposób wykazuja zwykle w próbie CPE okolo 10 x 10 jednostek aktywnosci interferonu na litr przy Accq = 1# Jednym * re¬ prezentatywnych klonów otrzymanych w ten sposób jest E. coli 294/pLeIF B trp 7.B. Wytwarzanie plazmidów zdolnych do ekspresji LelF C, D, F, H.Dodatkowe fragmenty genów /o pelnej dlugosci/ innych typów LelF mozna poddawac obrób¬ ce i wprowadzac do nosników ekspresji tak, jak w przypadku LelF A. Badanie calkowitej sekwencji zwyklymi srodkami ujawnia, czy miejsce restrykcyjne lezy dostateoznie blisko kodonu pierwszego aminokwasu dojrzalego interferonu typu pozwalajacego na dogodne pod¬ jecie dzialan zastosowanych w ozesci przykladu I, jak wyzej, w celu ekspresji dojrzale¬ go LelF A9 to jest eliminacji presekwenojl przez naciecie enzymem restrykcyjnym i przy- wróoenie kodonów fl-koncowych aminokwasów utraconych przy eliminacji presekwencji przez wlaczenie fragmentów syntetycznego DNA. Jesli nie spelni to zadania, mozna zastosowac nastepujacy sposób. Mówiac zwiezle, fragment zawierajacy presekwenoje odszczepia sie dokladnie przed punktem, w którym zaczyna sie kodon pierwszego aminokwasu dojrzalego po- lipeptydu, przez: 1/ konwersje dwuniciowego DNA do jednoniclowego w regionie otaczajacym ten punkt, 2/ hybrydyzacje jednoniclowego regionu utworzonego w stadium /a/ z komplemen¬ tarnym prlmerem dlugosci jednoniclowego DNA, przy czym koniec 5' primera jest polozony przeciwnie do nukleotydu przylegajacego do zadanego miejsca rozszczepienia, 3/ przywróce¬ nie czesci drugiej nici wyeliminowanej w stadium /1/, umiejscowionej w kierunku 3* od primera, za pomoca reakcji z udzialem polimerazy DNA w obecnosci trifosforanów trinukleo- tydów zawierajacych adenine, tymine, guanine i cytozyne, oraz 4/ trawienie pozostalego jednoniclowego DNA wystajacego poza zadany punkt rozszczepienia.148 276 17 Krótkie fragmenty syntetycznego DNA konczace nic kodujaca w stronie konca 3', z sy¬ gnalem poczatku translacji ATG, mozna przylaczyc, np. przez laczenie wolnych konców, do powstajacego w wyniku obróbki genu dojrzalego interferonu okreslonego typu i gen wla¬ czyc do plazmidu wykazujacego ekspresje pod kontrola promotora i polaczonego z nim miej¬ sca przylaczenia rybosomów* W sposób podobny do zastosowanego w czesci A powyzej, uksztaltowuje sie odpowiednio fragmenty genów LelP C i LelP D do bezposredniej ekspresji bakteryjnej. W strategie ekspresji tych dodatkowych interferonów leukocytów wchodzi w kazdym przypadku przywróce¬ nie fragmentu HindIII-Sau3a o okolo 300 b.p. zawierajacego uklad promotor-operator trp, miejsce przylaczenia rybosomów, sygnal startu ATG i kodon cysteiny LelP A z pLelP A25.Dolacza sie do niego fragmenty genów z genów dodatkowych interferonów, kodujace odpowied¬ nie sekwencje aminokwasów poza poczatkowa cysteine wspólna dla wszystkich. Kazdego otrzy¬ manego plazmidu uzywa sie do transformowania B. coli K-12 szczep 294. W celu utworzenia odpowiednioh genów stosuje sie nastepujace polaczenia: Wytwarzanie plazmidu pLelP C trp 35 Izoluje sie z pLelP C nastepujace fragmenty: a/ Sau3a-Sau96 o 35 b.p., b/ Sau96-Pstl o 900 b.p.f c/ z pLelP A25 izoluje sie odpowiedni fragment HindIII-Sau3a o okolo 300 b.p. sposobem opisanym wyzej w czesci K /4/t /d/ izoluje sie fragment jak opisano wyzej w czesci K /5/ o okolo 3600 b.p.Konstruowanie: 1/ Laczy sie a/ i /c/, rozszczepia Bglll, Hindlll i izoluje produkt o okolo 335 b.p., 2/ laczy sie trzy fragmenty: 1/ + b/ + d/ i otrzymanego plazmidu uzywa sie do transfor¬ mowania E. coli.Reprezentatywnym klonem otrzymanym w powyzszy sposób jest E. coli K-12 szczep 294/ pLelP C trp 35* Wytwarzanie plazmidu pLelP D trp 11 Z pLelP D izoluje sie nastepujace fragmenty: a/ Sau3a-AvaII o 35 b.p., b/ AvaII-£glII o 150 b.p., c/ Bglll-Pstl o okolo 700 b.p. Z pLelP A25 izoluje sie nastepujacy fragment: d/ HindIII-Sau3a o 300 b.p. Z pBR322 izoluje sie nastepujacy fragment: Hindlll-Pstl o okolo 3600 b.p.Konstruowanie: 1/ laczy sie a/ i b/, nacina Bglll i oczyszcza produkt 1/ o 185 b.p., 2/ laczy sie 1/ i d/, nacina Hindlll, Bglll i oczyszcza produkt /2/ o okolo 500 b.p., 3/ laczy sie 2/ + c/ + e/ i uzywa otrzymanego plazmidu do transformowania E. coli.Reprezentatywnym klonem otrzymanym w powyzszy sposób jest E. coli K-12 szczep 294/ pLelP D trp 11.Wytwarzanie plazmidu pLelP F trp 1 Fragment zawierajaoy LelP F mozna przygotowac do bezposredniej ekspresji przez pow¬ tórzenie, dogodne z powodu calkowitej homologii, aminokwasów 1-13 LelP B i LelP C.Fragment a/ zawierajacy promotor trp z odpowiednio uksztaltowanymi koncami otrzymuje sie z opisanego wyzej pH6H207, przez trawienie Pstl i Xbal, a nastepnie izolowanie fragmentu o okolo 1050 b.p. Drugi fragment b/ otrzymuje sie jako wiekszy z fragmentów powstajaoyoh w wyniku trawienia plazmidu pHKY 10 przez Pstl i Bgill. Fragment a/ zawie¬ ra okolo polowy genu kodujacego opornosc na ampicyline, a fragment b/ zawiera pozostala czesc tego genu i calkowity gen opornosci na tetracykline pozostawiony dla przyleglego promotora. Fragmenty a/ i b/ laczy sie za pomoca llgazy T4 i produkt traktuje Xbel i Bglll w celu wykluczenia dimeryzacji, tworzac fragment c/ zawierajacy uklad promotor- -operator trp i geny opornosci na tetracykline i ampicyline.Fragment d/ o okolo 580 b.p. otrzymuje sie z pLelF przez trawienie AvaII i Bglll.Zawiera on kodony aminokwasów 14-166 LelP F.Fragment e/ o okolo 49 b.p. otrzymuje sie z pLelP B przez trawienie Xbal i AvaII.Fragment e/ koduje aminokwasy 1-13 LelF F.18 146 276 Trzy fragmenty c/, d/ i e/ laczy sie razem w obecnosci ligazy T4. Lepkie konce odpo¬ wiednich fragmentów sa tego rodzaju, ze zlozony z nich plazmid przybiera postac kolista, z umiejscowieniem genu opornosci na tetracykliny pod kontrola ukladu promotor-operator trp razem z genem dojrzalego LelF F tak, ze bakterie transformowana zadanym plazmidem mozna wyselekcjonowac na plytkach zawierajacych tetraoykline. Reprezentatywnym klonem otrzymanym w powyzszy sposób jest E. coli K-12 szczep 294/pLeIF F trp 1.Wytwarzanie plazmidu pLel? H Calkowity gen LeiF H mozna uksztaltowac w celu ekspresji dojrzalego interferonu leuko¬ cytów w nastepujacy sposób: 1. Plazmid pLelP H poddaje sie trawieniu Haell i Rsal z izolowaniem fragmentu o 816 b.p. rozciagajacego sie od aminokwasu 10 sygnalowego peptydu do nie kodujacego regionu 3'. 2. Fragment denaturuje sie i poddaje syntezie reperacyjnej z uzyciem polimerazy DKA I /fragment Klenowa/ /klenow i inni, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 65, 168 /1970/^Z, stosujac syntetyczny prlmer dezoksynukleotydowy 5 '-dATG TGT AAT CTG TCT. 3. Powstaly produkt rozszczepia sie Sau3a i izoluje fragment o 452 b.p. reprezentuja¬ cy aminokwasy 1-150. 4* Przez trawienie pLelF H za pomoca Sau3a i Pstl i izolowanie powstajacego fragmentu o 500 b.p, uzyskuje sie gen kodujacy aminokwasy od 150-go do konca kodujacej sekwencji. 5. Fragmenty izolowane w stadium 3/ i 4/ laczy sie z utworzeniem fragmentu: 1 166 met cys asp stop ATG TGT.. *•• GAT TGA •*• PstI Sau3a kodujacego 166 aminokwasów LeiP H. 6. pLelP A trp 25 trawi sie Xbal, laczy wolne konce za pomoca polimerazy DNA i trawi produkt Pstl. Powstajacy duzy fragment mozna wyizolowac i polaczyc z produktem otrzyma¬ nym w stadium /5/ z utworzeniem plazmidu wykazujacego ekspresje, zdolnego, po transfor¬ macji E. coli K-12 szczep 294 lub innej bakterii-gospodarza, do ekspresji dojrzalego LelF H.Przyklad III. Wytwarzanie plazmidów zdolnych do ekspresji LelF I i J.A. Wytwarzanie plazmidu pLelF I Faze X Charon 4A zbioru rekombinantów ludzkiego genomu skonstruowanego przez Lawna i innych, Celi., 15, 1157 /1978/, poddaje sie screeningowi pod wzgledem genów interferonu leukocytów metoda opisana przez Lawna i innych /jak wyzej/ i Maniatisa i innych, Celi., 15» 687 /1978/. Próbke promieniotwórcza LelF pochodzaca z cDNA klonu LelF A stosuje isie do screenlngu okolo 500 000 lysinek. Za pomoca tego screeningu otrzymano 6 klonów z ge¬ nomem LelF. Po powtórnym screeningu 1 oczyszozeniu materialu z lysinek, jeden z tych klonów, A HLeIF29 wybrano do dalszych badan.Stosujac metody opisane wyzej, do korzystnego izolowania dodatkowyoh klonów LelF z genomu ludzkiego mozna uzyc innych próbek. Moga byc one z kolei stosowane do wytwarza¬ nia dodatkowych bialek interferonowyoh leukocytów. 1. Dokonuje sie podklonowania fragmentu EcoRI o 2000 b.p. klonu X HLeIF2 d"o miejsca EcoRI w pBR325. Powstajacy plazmid LelF rozszczepia sie EcoRI i izoluje fragment o 2000 b.p. Dezoksyoligonukleotyd dAATTCTGCAG /konwertor EcoRI-Pstl/ laczy sie z fragmentem EcoRI o 2000 b.p. i powstajacy produkt rozszczepia PsTI z otrzymaniem fragmentu o 2000 b.p. zawierajacego konce Pstl. Rozszczepia sie go Sau96 i izoluje fragment, który ma jeden koniec Pstl i jeden Sau96, o 1100 b.p. 2. Plazmid pLelF C trp 35 trawi sie Pstl i Xbal. Izoluje sie duzy fragment. 3* Maly fragment Xbal-Pstl z pLeLF C trp 35 trawi sie Xbal i Sau96. Izoluje sie frag¬ ment Xbal-Sau96 o 40 b.p. 4. Fragmenty izolowane w stadiach /1/, /2/ i /3/ laczy sie z utworzeniem wykazujace¬ go ekspresje plazmidu pLelF i trp 1.148 276 19 B. Wytwarzanie plazmidu LelF J 1. Plazmid pLelF J zawiera fragment HindIII DNA genomu ludzkiego o 3,8 kilozasad, w którego sklad wchodzi sekwenoja genu LelF J. Z plazmidu tego izoluje sie fragment Ddel- -Rsal o 760 b.p. 2. Plazmid pLelF B trp 7 rozszczepia sie Hindlll i Ddel i izoluje sie fragment Hindlll-Ddel o 340 b.p. 3» Plazmid pBR322 rozszczepia sie Pstl, konce przeksztalca sie w wolne z* pomoca po* limerazy DNA I /fragment Kle nowa/, a nastepnie trawi Hindlll. Izoluje sie duiy fragment o okolo 3600 tup* 4. Fragmenty izolowane w stadiach /1/, /2/ i /3/ laczy sie z utworzeniem wykazujace¬ go ekspresje plazmidu pLelF J trp 1.Zastrzezenia patentowe 1* Sposób wytwarzania nosnika ekspresji zdolnego, w transformowanym nim szczepie E. coli, do ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich zawierajacego 165-166 ami¬ nokwasów lub, w przypadku gdy metionina jest przylaczona do N-konca pierwszego aminokwa¬ su tego interferonu, 166-167 aminokwasów oraz czesciowa sekwencje aminokwasowa Cys-Ala- -Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Serfjak wskazano w sekwencjach przedstawio¬ nych na fig. 4 lub na fig* 9, w pozycji od 139 do 151, za pomoca technologii rekombi- nant owego DNA. znamienny tym, ze konstruuje sie wektor B. coli zawiera¬ jacy promotor trp £• coli, operator i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, izo¬ luje sie gen o pelnej dlugosci kodujacy interferon leukocytów ludzkich ze zbioru kolonii bakteryjnych zawierajacych DNA komplementarny z indukowanym mRNA leukocytów ludzkich lub z indukowanym mRNA linii komórkowej badz ludzki genomowy DNA, wycina sie przez ciecie restrykcyjne pelnej dlugosci gen kodujacy interferon leukocytów ludzkich, i dokonuje sie insercji tak wycietego genu z wyeliminowana jakakolwiek sekwencja liderowa mogaca zapo¬ biegac drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich za promoto¬ rem trp E. coli, operatorem i liderowym miejscem przylaczenia rybosomów trp, otrzymujac nosnik ekspresji E. coli zdolny do ekspresji w H. coli dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich. 2* Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu A leukocytów ludz¬ kich /LelF A/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4. 3, Sposób wedlug .za etrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu B leukocytów ludz¬ kich /LelF B/, o sekwencji aminokwasów w pozycji 1-166 przedstawionej na fig. 4. 4* Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny ty m,,ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich /LelF C/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4* 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich /LelF D/, o sekwencji aminokwasów w pozycji 1-166 przedstawionej na fig. 4* 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich /LelF F/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich /LelF H/, o sekwenoji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig* 4.B. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu I leukocytów ludz¬ kich /LelF I/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9. 9* Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu J leukooytów ludz¬ kich /LelF J/, o sekwencji aminokwasów w pozyoji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9.148 276 CO i O c s O. s O.Ol I I o I .2J •—I I O) 2: I o 1 X I I I < o < o < O o < o < o < b i* o (T-13B1 0 _C (T-13C I —C (T-13D 1 l I I ^ 1 1- *—* s 0 c % u Q- * "D s «** O.£ O* t_ < 1 •** Q 21 | Ol •—1 1 D O 1 O < o o GO O < O CD < 3 < < O < CD O O 7r» E < — — co o CD < CDI- O I I O I I I to * I 0 u. "5. Q» ^.O T I o I I I- I I I I o I O)148 276 Próbka 32P-T-1C 1 ^45 67 8910 1112 15 14 15 16 17 18 1gy 2122 2524 2fr 2627 2829 553152 53 34 5556 5758 39 95ofl3 32, Próbka "P-T-13C 1 2 5 k 5 6 1 L9 1011 12 1514 151617 1819202122^24 25262728295031325334 55565736 59 Fig.2148 276 88! u u t: 8 B & 5 O O H o 8 o H H O O O O B B O " o H 2 5 E E I E o o O O H O O O < HHHHHH 555555 looooo 55 5 < O H B B 51 51 < O O O o H H O H < O O < O o o o < o o < < o H O O O H O < O t o o o 5< < < < o o o o o o < oo < oooooo t-f-^ **!-' k"b* K o < - ^.^ ^. -. oooooo <<<<<< oooooo oooo oooooo HHHHHH oo u o oo oooooo HHHHHH OOOOOO o< b^Hb-b^b^b^ <<<<<* OOOOOO OOU U UU ouo ooo < oo oooooo oooooo <<<<<< oooooo oooooo <<<<<< O O H OOH <<<<<< t^ t-h* b-* t- b- ooo oooooo oooooo b-b-b-b-b^ fr u u o o o u oooooo oooooo <<<<<< oooooo <<<<<< oooooo OH OO OO oooooo < < < < o < < o o o o o <<<<<< o u u o o o HHHHHH u u o o o o oooooo oooooo HHHH [-t-* ooo u uo HHHHHH <<<<<< OOOOOO hi-hb^b^b^ oooooo HHHHHH OO UOOO OOOOOO OOOOOO oooo o,o HHHHHH O O O O O U b-b- b-b-b-b- OOOOOO B t-b^b^b"U O O H O O OO O O H ~ b^ < b" b- <- h- O U O O O OH H O H 5555 5 OOOO O &S5S S 5555 I OOOO O o < HHHH OOOO OOOO <<<< OOOO HHHH o 5 H O < O o o < o o o (-• < o H O O H < O o < o o < o o < o o H O O O < o <- o o o < < < o H O H O H O H < < H O H O O O O H O H O H O O H O O o HHHHHHH H O OUUH OO O OOOOHOOO OOOOOOOO HHHHOHHH OOOOHOOO OHHHHHHH OOOO O OOO HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOHOOO OOOOOOOO <<<<<<<< <<*CO<<<< OOOOOOOO OOOOHOOO ooo oo oo o o oooo oo < 55555555 <<<<<<<< oooouooo OOOOOOOO HHHHH b^b^b- b^ b-b-H H b-b^ b- OOOOOOOO <<<<<<<< O o o u o u o o o < ooo oo o 55555555 OHOOOOOO o OOOOOOOO HHHHHHH <<<<<<< ooooooo HHHHH HHH OOOOOOO< <<< OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOO O UOOO OOOOH<00 <<<<<<<< ooooooou H OO0O<0HO oouuuuoo ooooouoo HOUHHOHH H b^ b^ b^ b- \- h b- HHHHHHHH <<< O < OO < OO < OOOOOOOO H b^ U t- b^ b-i" b^ HHHHHHHH HHHHHHHH OOHOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<< < oooooo <<<<<< oooooo <<<<<< oooooo oooooo < < ¦. - - - oooooo HHHHHH H O OO O O O O OH O O O OO O < O HHHHHH UO U U H U OO UU U U HHHHHH O OOO H O O < O o 5 O H O O O H O O H U HH UH H H H u u u uu u u u u u uu u HHHHHH H OOOOOO O HHHHHH H OOOOOU U OOOOOOUO <<<<<< HOHHH OHHOHHHH HHHHHHHH O OOOOOOO OOOOOOOO HOHUHHHH OHOOOOOH <<<<<<<< OOOOOOOO < < oo < o< < b^ b- b- b^ t- b^ b^ i- OOHOUHUU b^ t-t-b^ U b-t-b^ b- b- h b^ t-b^ b^ U <<<<<<<< <<<<<<<< \<< < xo< o h < oo• OOOOOOOO <<<<<<<< HHHHHHHH O0OOHotJO - ) H U H U «HHHH UUUUOOOO OUOUOU*CO ooo << OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO b«b* <<<<<<<< OOOOOOOO OOOOOOOO OHOOOOOO HHHHHHHH HHHHHHHH OOOOOOOO oooo<<: HHHHHHHH oooo OOOOOOOO HHHHHHHH OOOOOOUU HHHHHHH*-' O O O U O O O O i-'i~* b- H H b-i- b^ OOOHOOOO <<<<<<<< ooooooo< ooo <<<<<<<< < <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< uuoooooo OOOOOOOO <<<<<<<< OOOHOOOO b-b^ b" b^ h* b^ b-b- b^i-*b- H HHHH ooooouuo HHHHHHHH U U O U U U U U HUHUUHHH <<<<<<<< <<<<<<<< OOOOOUOU HHHHHHHH t-H b" H b^ ^ b- b- OOOOOOOO HOOHOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< uuuuuuuu OOOOOOOO <<<<<<<< ouuuuuuu uuuuouuo HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO t-b^ t~ b-b^ t-t-h* . << OOOOOOOO OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOUU uuoouuuu co O) < ff U OU1 U* O X <(QUOUUUX < 00 OO UfeO X148 276 Ó * SSSSgSSS h* h* h* t-h* t* t* h* GTGAGGAAA GTGAGGAAA GTGAGGAAA GTGAAGAAA GTCAGAAAA GTGAAGAAA GTCAGAAAA GTGAAGAAA 1-h* t-i-* b+t* b+h CTGGC CTGGC CTGGC TTGGC CTGGC TTGGC CTGAC CTGGC O 4-tOOOOOOO CM- ii H H H H H H H »* <<<<<<< < OOOOOOH O o o o p o p p o HHHHHHHH OOOOOOOO <<-*<<<<< oooo oo o o ooooooo o << -OOOOOOOO OU Hfc-H H*-H <<<5< < << OOOOOOOO HHHhOHHH <<<<<<<< ooooo oo o HHHHHHHH O 'OOOOOOOO O-OOOOOOHO •^ oooooooo oooooooo HHHHH H HH OOOOOOOO • ooo <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< - OH < O < < < < < oooooooo HHHHHHHH ooooo ooo oooo 0000(5 000 ooo -OOHOHHHH O HHH 00- OOOOOOOO «*» o o<<-c<<<< oooo OOOOOOOO <<<<<<<£< OOOOHOOO t* < h* \~ b* V* t" t~ -<*.•<<<<<< -OHOOOOOO HOHHHHHH OHOOOO <0' HOHHHUHH OHOOOOOO HOHI-HHHH oo< ooooo OHOOOOOO OOOOOOOO S- S5S33S33 «¦"» OOOOOOOO OOOOOOOO t* h 1-b* t~ t-1-* b* oooh o OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO t-*t«t-t- <<<<<<<< OOOOOOOO b+h* b* h« h b* b* b* ooooooo< oo <<<<<<<< ' OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO <«DOOWU.OX l&iUitMbuktUifakiUi -•I5ii55ii ohooo <<<«£< <0 < <<<<<<<< ouo ooooo HHHHI-h-HH t TTTG TTTA GTTT TTTA TTTA TTTA TTTA TTTT OOOOOOOO HHH t-h»b^b^h HOOOOOOO Hb^Hb^HH^b^ HHO OHHHH HOO OOOOO OOOOOOOO O HHH HH Hb^h Ol- <<<<<<<< !/\ OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH OOO OOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOO OOO <<<<<<<< OOOOOOOO O HHHHHHHH O-OOOOOOOO *rs t* t* t-, f~ ±* i* ^ u.HHHHUhHH OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO OOOOOOOO OOOOOOOO HHHHHHf-H -o o o o o H < o OOOOOOOO OOO OHOOO HHHHHHHH OOOOOOOO H H H H H H F- H HHHHHHHH OOOOOOOO OHOOOOOO O OOOOOOOO 00- OOOOOOOO •* <<<<<<<£< OOOOHOOO <<<<<<<< l^^^t^^i-.^^ <<< <<<<<<<< OOOOOOOO < -<<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< oooo <<<<<< oo < ooooo b^ b^ t^ fr* b^ h b-H O OOOOOOOO *- HHHHHHHH N* <<<.<<<<< b^ \r^ b^ b-\-b-b^ b- O HHHHHHHH OOOOOOOO HHHHHHOH OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO -HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< <<<<<<<^ << OOOOOOOO OOOOHOH<- HHHHHHHH 4!«QOObU.UX buktUtU^bLiUiUiUi ^-HO< ^O HHOOH 00H0<000 TGATCTCC CAAGTTGT TGACTTCT TGAATTCT ATTCATGA GACTTCTG GAGTTCTG TGTTCTTC <«*< HOOO < TTTT CTTT CTTT CTTT TCAC TTCT CTTC CTTT o«c o ooooh CM- <<< < *o OHOOO-COO HOHHHOHH OHOO OOHOOHHH <<<<<&<< OOHOH <00 OOHO < OOH 0<<<<0<< H0OOH<00 - << < HHHH < 0<<<0H0< 0<<0H < «* < HHHH<«*HH H O O O O H O O <<< OOOOH-COO H^Ht^HOHH O HHHf-HHHH O-<<<< NO OOOHO< OO TTTT TTCT TCCT TTCT GAAA CTGT TTCT TTCT <<<< ooo HHH OH OH H <<<-* - <<<<<<<< < <0 << << O O O < O < O O OOOOOOOO HOHHHOr-»M < < *< ooooo < oo <<<<<0 <<<<<<<< o ooooo oo. H V HHHHHHHH OOOOOHOO OOOOO HOO f-b^ H t-b- O H b- oooooo oo YWYOl YWYOl OYWOl YWYOl 1Y1W1 YYYYOl OYOYOl YWYOl 53t;53555 OOOOOOOO OOOOOOOO HHOOOOOO O OOOOO OOO *r\ <000 0 000 o *j:o<<<<<^ H <<<<<<< OOOOOOOO GAAA AAAA AAAA GAAA GAAA GAAA GAAA AAAA <<< OOOOOOOO OOOOO H OO OOOOOHOO tuUtUtUtUMUuUiUi • ¦D o co .O) I_L148 276 o 8 O CM- © o- HO 11 UH 0*0 OH 58 pp g ES P ty < < oo HH < < HO HO < < H O OH OH OH «o PS H < HO O H HO O < P5 HO HH O < H < < O < H < F- H < H < H O o OH < o oo p< H O 85 35 H O HO OH O O OH<<< ;SP882 OHOOO <<< OHOOO OH<0< 0 < 0 £P88£ PSSgS £2ssp << < h\^ < <0 o < o o < OHO <0 HO< < < O < O < < H «<000 OH <00 O < H HH H << <0 OHOOO H <00< O < < «C O < < O O < OHH H O O H H H H 0 HH OOO HOHH O b^h^ <<< H< <0< OH < << HH < OO < O H H H O H H H H HO < < < H < < < < H< < < < H< < < < << \-*^ H <0 < < < OOOO O f_0 |_ H H < < O O O OCJ < < < HO OO O H OO < < H OH OOO O < < O < OHOOO O eo ooo :E O ii H O H .c*« H 00 O H O O $ o o < < P£ PS < o OO H-* OO i o< < <: < o< o o o 0 OH << < <0 < < < HOOOO OOHHH HOHOO OOHHH OO < < < HHOO < OOHHH << OOH OO H < < < :. .55 OOO < < 3555P < O H < O HH OOO* HH HHHl 0«< H 3<< HHH < <0 HO< **<*-* o< < <<< HH< HOH H « < H H ppp H<< HHH HH< HHH < < < < < HHH HHH H< < HH H HH < H < < < OH <:»- h HOH OHO H O H « < H < ( t< Ol O H< OHO' O < H HO O' O OOI HOHl OH Ol < OO < i H OO 0< H< OO Ol HHHl < OO o o< < i OHO! OO < < < OO < OO HO H OHH< OOH j o< ol HOO< OOH! o5£; H O O f O H I- t < < < L H H H - HHHl ;E1 OH O.H < H H • < HOH HHH< < OH OH OH H H < H < < HH HHH H< H< < HH H< < OO 0< < H H O O O HI-HHH HOHOO OH H< < b*< HO O < HH H H < H < < < < <^h- t* < t-,< * < < < < < l- O < «* < U H HH OH < < O O H < HO OH H < O ^h HU H < < H< < < < «*0 H HO H < < HH << < O O OO < OH H< < HH H< O O < OH H < O H** < O < H H H OH H < H OH I- \^ HH O HO <0 H H < HOO 0*t OO <0 H OO < OH <. - H < HO H OH 0< ' < < OH H < Ht- < OH HH H OH 0<0 H < < < OHH H H HO O H < OH H < O H< < , H HO HH H< < < U< OH o <: ^t- o< H < PS O O < < l-H SP O < < H O < O O HH < H OO < H H H H O < H H < < H < < H < O < O O < < O < \^\^ H O OH P3 \^\- OH HO PS 3P < < < O H H < O PS < F- < < HO H H O O o- o NO- & O CO O) <(OUOU)[mOX UibubuUjbuUitLtlJu < OO OU U* O X bu bLi U4 U< Uj U< U414B 276 SI SIO S20 sn 10 LelF A MAlTFALlVALLVl$CICSSCSV6eDLPQTMSLGSRRlL LelF I MALTFVLIIVALVVL$VKSFSSLGCDLPQTHSlGNRRAL LelF C HALSFSLLAAVLVlSYKSIC$LGCDLPQfHSLGKRRAL UIF O NASFFALLNVLV«LSCKSSCSLGCOLPCTHSLPIlRRTL LelFT l/PLGCDLPQAHSVGftRRAFILlTQ»ftRIStFSrilllHD LtlF F N A l S F S L L N M L V l S T K S I C S L G C D L P Q T H S L G N ft ft A U LlAQH6RISPFSClKiRHt LelFG II • LtlF N N A L M S L N N A L f V L S C K S S C S L 6 C N L S Q T H S L N N R R T L N L N A Q N R R I S P F S C t I 11 N D MLLAQHRItlSlFSClKORttD ILLAQNRRI SPFSCIKIRHD 1LLGQHGRISPFSCL K•RMO NLLAQNSRISPSSCLIIORR0 Wszystkie ca fi Hi K S GC TKSl R R «* sci -tnij, £9 _ LelF A LelF I LelF C LelF O LelF E LelF F LelF G LelF H 1 50 60 EF-G»QFQKAETIPVLHEM1QQIFNLF EFDOKQFQKAQAISVLHEHIQQTFNLF EFDGNQFQKAQAISVLHEIMQQTFNLF EF0GNQFQKAPA1SVLHELIQQIFNLF VFHGNHFQKVQ4IFLFHEHHQQrFNLF EF06«QFQKAQAISVLHENIQQTFRLF EFOGNQFQKAQAISVLHEPtlQQTFNLF EF06N*FQKAQAISHHlNNQQTFNLF STKOSSAAUOET STKDSSAALDET $TEDSSAAyEQS TTKDSSAAUOED STKOSSDTUOET STKDSSATVEQS STKDSSATUOET STKNSSAAUOET LYQQLI8LCA L O Q QLI IL E V L V Q Q L I O L E A L YQQIIHCA l V QQLN »L E A L N Q * l ¦ 0 H E A L V QQLI»L E A L F OOMIOLEA V I QG C OQE V IQC VHQE VII • K V I QC MHQE V I QE Wszystkie eefo L L El Q) II ( 110 120 1)0 LelF A V ( LelF B V ( LelF C V ( LelF 0 E 1 LelF E V i LelF F Vi LelF G V < LelF M V ( Wszystkie 3 V T E » V 1 E • V E E l V G E i V E E i V E E ¦ V E 0 • V E E V TETPL"HKEDSrLAVRKVFQRITLVLKEKK SPLNVEOSILAVRKVFQRITLVLTEICK TPLNNE0SILAVRKYFQRITLVL1ERK TPLNHHS UAHKTf RR I HriTEU TPLRNVOSILAVRKVFQRITLVLTKKK TPLHNVDS1LAVKKVFQRITLVLTEKK TPLNNVOSILTVRKVFQRITLYLTEKK TPLMNEOSILAVRKYFQRITLVLMEKKV 140 C A U E V C A U E V C A U E V C A y E V C S U E A C A U E V C A WE V C A U E V ISO IM IM • • • EIHRSFSLSTIL4ESIRSKE EINRSFSLSI iLQKRlK SKI E I MR S L S F S TlL QKR L R R fc O EIMRSLSLSIRLRERLRRKE E I HR S F S l • TRUE R L R R * E CINISf $L$IIF«MLIRIC E I MR SF S L SAlL RER L RRK E EINRSFSFSTIMIILIIKB PIN O S I L UF RITLYL EKVS CAUEWRACINRS S S Fig. 4 poryzasad O 200 400 600 800 1000 I I I I I I I I I I I I Pvul Bg/I FMjI Bg/I B C D E F G H Eco RI EcoRI Pvul Pvul H.I.M-.^..WH;«.-attH»,»A.,iV;uiV.aii| PyuIBg/n F\ul Eco RI ^JA^a^,•^:;^A«ka^v'^v¦v¦;jJ:,v;¦^:¦;¦A^^ u F*vun Eco RI FVuI •^-csr- H » A Fvul «^LV^^i^^^H^V,W-;y.^^:.--Jyy.n- Bg/IBg/n F*vul i.i.. ¦. - ¦. ¦ v ¦ m*i.i ¦», m m..i- j . * *. ..¦ Pvul _B§iLav?---\'V--v.-vV.^^^'v''"•••»•¦••'•."•¦'-••¦••'•'••.'¦•'•!j Ihr Fig.5148 276 Sau 3a Sau3a Pstl | Aval i Bg/I l t l I ^ ,Ava. ||B Sau3a Sau3a Bg/I i Aval I H •+- Pstl 1 /34bp\ 150bp / S23 12 3 12 13 U 15 glycysaspleu argargthrleu -GGCTGTGflCIG-ASGAGGfCCllG- -CCGA(XTAGAC-TCCTCCTGGAAC- I Sau 3(3, AvaII SyntetycznyDNA I wyodrebniony fragment 5'AATTCATGTGT GATCTG- AGG AG °3Abp 3' GTACACACTAG AC-TCCTCCTG ligaza DNA TA 670bp Aval, Bg/I wyodrebniony fragment o 150 bp Bg/H wyodrebniony fragment o 670bp, czesciowo trawiony 12 3 12 13 met q/s osp leu arg arg A E ^ AATTCATG TGTGATCTG -AGG AG GTACACA CTAGAC-TCCTCCTG EcoRI AvaII 45bp i' nrnn 150bp Bg/D Pstl iii mmiiiini iii ¦¦ ¦¦iiiiiii ¦ ¦ mi ii i ¦ iiiiihh mu iii i li i lim i ~ 670bp ligoza DNA T4 ! p l EcoRI, Pstl Eco RI met cysasp p^ j AATTCATGTGTGAT mmiiiimi i 1111111 ii mini" »¦''¦'¦ "'i ii ii i 11 ii 11 ii ii i iii n i GTACACACTA 865bp Flg.6 Xba Pstl Sau3a EcoRI Sau3a l^110bp-M32bp GGCTGT GATCTG EcoRI -^ 700 bp STOP PstI -B Fig.7a Hindin EcoRI Xba EcoRI Sau3a Le-1FA Pstl Trp 3H ATGTGT GATCTG Fig. 7b148 276 GTATGTTCCCTA GTATGTTCCCTA GTATGTTCCnA GTATGTTCACTA GTATGTTCACTA TnAAGGC-TAGGCACAAAGCAAGGTCnCAGAGAACCTGGAGCCTMGGTTTAGGCTCACCCATT-TCMCCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACA TnAAGGC-TAGGCACAAAGCAAGGTCTTCAGAGAACCTGGAGCCTAAGGTnAGGCTGACCCATT-TCAACCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACA TnAAGACCTATGCACAGAGCAAGGTCnCAGAAAACCTACAACCCAAGGTTCAGTGTTACCCCTCATCAACCAGCCCAGCAGCATCnCAGGGTTCCCA TnAAGGCCTATGCACAGAGCAAAGTCTTCAGAAAACCTAGAGGCCAAAGTTCAAGGTTACCCATC-TCAAGTAGCCTAGCAACATnGCAACATCCCA- TnAAGACCTATGCACAGAGCAAAGTCTCCAGAAAACCTAGAGGCCACGGTTCAA-GTTACCCACC-TCAGGTAGCCTAGTGATATTTGCAAAATCCCA- ?i -wo ATGGCCnGACCnTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTA JnTi&CAnGCCCTrTGCnTAATGATGGCCCTGGTGCrGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGGGCTGTAATCTGTCTCAAACCCACAGCCTGAATA CTBlCCCTGTCCTTnCTnACTGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTAGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGG^^ nBteCCGGTCCTnTCTTTACTGATGGTCGTGCTGGTACTCAGCTACAAATCCATCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGCGTA ^CCCTGTCCTTnCTnACnATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCATCTGATCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACACCCTGCGTA 200 GCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTnTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGnT— ACAGGAGGACTTTGATGCTCATGGCACAAATGAGGAEAATCTCTCCnTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACnTGAATTTCCCCAGGAGGAATTTGA ATAGGAGGGCCnGATACTCCTGGCACAAATGGGAAGAATCTCTCCnTCTCCTGCCTGAAGGACAGACCTGACTTTGGACnCCCCAGGAGGAGTTTGA ATAGGAGGGCCnGATACTCCTGGCACAAATGGGAAGAATCTCTCCTTTCTCCTGCnGAAGGACAGACATGAAnCAGATTCCCAGAGGAGGAGTTTGA ATAG6AGGGCCnGATACTCCTGGGACAAATGGGAAGAATCTCTCCnTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGATTTCCGAATCCCCCAGGAGGAGTnGA 300 -GGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGA TGGCAACCAGnCCAGAAAGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATGCAGCAGACCnCAATCTCTTCAGCACAAAGAACTCATCTGCTGCnGG TGGCAACCAGnCCAGAAGACT(^GCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCMTCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCnG TGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCnGG TGGCAACCAGnCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTa 400 GATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGbGGGTGACAGAGACTCCCC GATGAGACCCTCCTAGAAAAATTCTACATTGAACTTTTCCAGCAAATGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCC GAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATAACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGATGGAAGAGACTCCCC GAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCC GAACAGAGCCTCCTAGAAAAAnTTCCACTGAAATnACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCC TGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGT TGATGAATGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAAGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTGATGGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGT TGATGAATGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTnATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTCAGCCTGGGAGGnGT TGATGAATGAGGACnCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATGGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGT TGATGAATGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATAGAGAGGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGnGT CAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCnTGTCAACAAACnGCAAGAAAGTTTAAGMGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAACATGGA^ CAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTTTCAACAMCTTGCM CA CAGAGCAGAAATCATGAGATCCnCTCnTTTCAACAAACnGAAAAAAGGATTAAGGAGGAAGGATTS^AACTGGTTCATCATGGAAATGATTCTCAT CAGAGCAGAAATCATGAGAT(XCTCTCGTnTCAACAMCTTGCAAAAMGATTAAGGAGGAAGGATTGAAAACTGGTTCAACATGGCA^ TGATTCGTATGCCAGCTCACCTTnTATGATCTGCCATTTCAAAGACTCATGnTCTGCTATGACCATGACACGATTTAMTCTTTTCAAATGnTTTAG TGACTAATACATCATCTCACACTTTCATGAGnCTTCW^ TGACTAATACAnATCTCACACTTTCATGAGTTCCTCCATTTCAAAGACTCACTTCTATAACCACCACGAGTTGAATCAAAATnTCAAATGTTTTCAGC T(^CTAATGCATCATCTCACACTrrCATGAGTTCnCCATTTCAAAGACTCACnCTATAACCACCACAAGTTGAATCAAAATTTCCAAATGTTTTCAGG TGACTAATACATTATCTCACACmCATGAGTTCTTCCAm Rg. 8148 276 800 A GAGTATTAATCAACATTGTATTCAGCTCnAAGGCACTAGTCCCnACAGAGGACCATGCTGACTGATCCAnATCTAnTAAATATTTTTAAAATAnA H AGGAGTGTAAAGAAGCATCATGTATACCTGTGCAGGCACTAGTCCnTACAGATGACCATGCTGATGTCTCCnTCATCTATTTATTTAAATATTTATTT I AGTGTAMGAAGCGTCGTGTATACCTGTGCAGGCACTAGTACTnACAGATGACCATGCTGATGTCTCTGTTWTCTATTTATTTAAATATTTATTTAAT J . AGTGTTAAGAAGCATCGTGTnACCTGTGCAGGCACTAGTCCnTACAGATGACCATTCTGATGTCTCCnTCATCTATTTATTTAAATAnTATnATT C AGTGTAAAGAAGTGTCGTGTATACCTGTGCAGGCACTAGTCCTTTACAGATGACCATTCTGATGTCTCTGnCATCTTnGTTTAAATAnTAnTAAn 900 A TTTAnTAACTATHATAAMCMCmTTmGTTCAU H AmAACTATmTATTATTTAAATTAnmTATGTTAATATft^^ I TATnTTAAGAnTAMnATTTnnATGTMTATCATGTGTACCTnACAnGTGGTGAATGTAACAATATATGTTCTTCATATTTAGCCAATATATT J TAACTATTTTTATTATTTAAATTAnnTTATGTAATATCATATGTACCTTTACATTGTGGTTAATGTAACAAATATGTTCnCATATTTAGCCAATATA C ATTTTTAAAAnTATGTAATATCATGAGTCGCTTTACATTGTGGTTAATGTAACAATATATGTTCnCATATTTAGCCAATATATTAAnTCCTTnTCA 1,000 A TAAAmATTnGTGnGTTCATTGMCmTGGTATGGMCTTn H TATAnAAnTCCTTTTTCAnAAATnnACTATACAAAATTTCTGTGTTTGGTAnT I AAmCCTTnTCATTAMTTTnACTATACAAMmcn^ J TTAATTTCCTTTTT CATTAAATTnTACTATACAAAATTTCTTGTGTTTGTTTATTnTTAAGATTAAATGCCAAGCCTGACTGTATAACCTGACTTAA C nAAATnnACTATACAAMnTCTTGTGnTGTnAnCTTTMGATAAAATGCCAAGGCTGACTTTACAACCTGACTTAAAMTAGATGATTTAAn Fig. 8 cd.SI SIO S20 1 10 A MALTFALLVALLYLSCKSSCSYGCDLPQTHSLGSRRTL H MALPFSLMMALVVLSCKSSCSLGCNLSQTHSLNNRRTL I MALSFSLLMAVLYLSYKSICSLGCDLPQTHSLGNRRAL J MARSFSLLMYVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLRNRRAL C MALSFSLLMAVLVLSYKSI*SLGCDLPQTHSLGNRRAL 20 30 40 50 A MLLA"QMRJMSLFSCLKDRHDFGFPQEEF-GNQFQKAET H MLMAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDGNQFQKAQA I ILLAQMGRISPFSCLKDRPDFGLPQEEFDGNQFQKTQA J ILLAQMGRISPFSCLKDRHEFRFPEEEFDGHQFQKTQA C ILLGQMGRISPFSCLKDRHDFRIPQEEFDGNQFQKAQA 60 70 80 90 A IPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQ H ISVLHEMMQQTFNLFSTKNSSAAUDETLLEKFYIELFQ I ISVLHE-MIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQ J ISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQ C ISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTEIYQ 100 110 120 A QLNDLEACYIQGYGYTETPLMKEDSILAVRKYFQRITL H QMNDLEACYIQEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITL I QLNNLEACVIQEVGMEETPLMNEDSILAYRKYFQRITL J QLNDLEACYIQEYGVKETPLMNEDFILAYRKYFQRITL C QLNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITL 130 140 150 160 A YLKEKKYSPCAWEYYRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE H YLMEKKYSPCAWEYYRAEIMRS^SFSTNLOKRLRRKD I YLTEKKYSPCAWEYYRAEIMRSLSFSTNLQKILRRKD J YLMEKKYSPCAWEYYRAEIMRSFSFSTNLKKGLRRKD C YLIERKYSPCAWEYYRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD Fig. 9 Pracownia Poligraficzna UP RP. Naklad 100 egz.Cena 1500 zl PL PL PL