SU1414319A3

SU1414319A3 - Способ получени лейкоцитарных интерферонов человека

Info

Publication number: SU1414319A3
Application number: SU813302642A
Authority: SU
Inventors: Фан Нормен Геддель Девид; Пестка Сидней
Original assignee: Ф.Хорфманн-Ля Рош Унд Ко,Аг (Фирма); Генентех,Инк. (Фирма)
Priority date: 1980-07-01
Filing date: 1981-06-30
Publication date: 1988-07-30
Also published as: ATA290981A; PL148276B1; KE3534A; GEP19960519B; DE3177288T2; FI812067L; ATE29727T1; GB2079291A; IE49255B1; IT1137272B; GB2079291B; AU7246281A; YU47700B; HU196457B; IE811463L; FR2486098A1; CH651308A5; DD210305A5; CS503781A2; RO87590A

Abstract

Изобретение относитс к технологии рекомбинантных ДНК, т.е. к способам , использующимс в рекомбинантной ДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. Штамм бактерий Escherichia coli трансформируют рекомбинантами из группы pI,eIFiA25, pLelF В trp 7, pLelF С trp 35, pLelF D trp 11, pLelF FF trp 1, pLelF I trp 1 и pLelF j trp 1, далее культивируют трансформанты, выдел ют и очищают лейкоцитарный интерферон.

Description

4ib СлЭ

СО

СМ

Изобретение относитс к области технологии рекомбинантвых ДНК, т,е« к способам, использующимс в реком- бинантиой ДНК-технологии, и к продуктам полученньвд этими способами.

Пример, Используют два мик- роорганизма; Eocoli х1776 и E.coli К-12 шт мм (конец A.thi , hsr , bsn-L) ,

мРНК лейкоцитарного интерферона человека (LelF) получают из лейко- п.итой человек а 5 вз тых у- больных хронической миелогенной лейкемией Тако вл ютс лини клеток, обозна- чемка KG-tj полученных от пациентов с -острой миелогенной лейкемией„

У KG-1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона мРНК с помощью вирусов Сендай или Ньюкаст ла, Клетки собирают 5 ч спуст после индуцировани и РНК приготовл ют по методике с применением гуанидин-- тиоцианат-гуанидингидрохлорида. Дл получени 12 S фракций поли (А) мРНК используют олигодеокситимидин d Т-целлюлозную хроматографию и са харе зное градиентное ультрацентри- фугч-грорание,

5 мкг мРНК используют дл получени двойной цепочки кДНК по цепо методике,.. Указанные кДНК фрак цйокир тот по размерам с помощью электрофореза на 6%-ном полиакриламид- иом геле и 230 нг материала с разме- paMii в интервале от 500 до 1500 в,п. выде.г. ют электроэлюированием. 100 и г этой кДН К присоедин ют к деоксицити- дкновым остаткам (dc) и реденатури- руют с 470 нг плазмид рН R3225 которые были соединены с деоксигуанозино вьми (dG) остатка; ш по (Pst I) сайту и используют дл трансформации E.col х177бо Получают устойчивые к тетрациклину , чувствительные к ампициллин трансформанты о Синтезируют четыре набора дезоксиолигонуклеотидньгх зондов дл каждой последовательности, содержащие три (T-IA, В, С, D) или , один (Т-13А, Bj С D) олигонуклеотид KaxgiaK.

мРНК получают из 12 S РНК,, KG-l индуцированных вирусом Сендай либо целиком поли (Л) мРНК из неиндуци Ч-г ,

рованньж лейкоцитов, Р меченные кДНК готов т известным способом Не. меченный продукт выдел ют с покощью Гельфильтрации на колонке, заполненной 10 мл Сефадекс С-ЗО, обработан

0

5

0

5

0

5

0

ной о J 3N NaOn В течение 30 мин при 70 С дл разрушени РНК нейтрализуют НС1 и осуществл ют гибридизацию.

Дл идентификации клонов pL1-pL30 используют быстрый процесс изолировани плазмиды по Бирнбойму.

При этом получают 1 мкг плазмиды. ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов Secoli К-12 штаммг 294, Каждый образец ДНК денатурируют и нанос т на нитроцеллюлозные фильтры в трех экземпл рахр следу методике Кафатоса с сотр (см, выше ) ,

Три группы нитроцэллюлозн ых фильтровэ содержащих 500 образцов плазмид5 гибридизируют со стимулированной кДНКд заложенной с Т-1 группой носителей информации (прай- меров), Т-ТЗ, заложенной стимулированной кДНК, нестикулированной кДНК,, приготовленной с использованием обеих групп носителей информации

Клоны считают положительными, если они гибридизирутот сильнее один или оба зонда стимулированной кДНК, чем полностью нестимулированный зонд Бьто отобрано 30 положительных клонов () из 500 дл дальнейшего анализа.

Трансформанты E.coli х1776 скри- нируют по методике гибридизации колоний использу в качестве зонда

7

Р-меченную стимулированную мРНК. Немеченную мРИК из нестимулированных клеток смешивают с зондом при соотношении 200:1 дл конкуренции с нестимулированной мРНК, имеющейс в

32.

Р-меченном препарате Гибридизаци меченой мРНК будет происходить предпочтительно в колони хJ содержащих стимулированные последовательности,

Получают три класса трансформантов;

yi 2-3% колоний, гибридизованных -

мРНК очень сильно5 10% гибридизован- нмх; значительно меньше, чем 1-й клесс; остальное, не дающее определимый сигнал гибриднаацин

Исследуют положительные колонии (классы 1 и 2) на наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который зависит от гибридизации интерфероновой мРНК конкретно в плазмиду ДНК, Пер- вокачапьно вьфащивают индивидуально 60 сильно положительных колоний (класс 1) в 100 -(л среды МЭ дополненной тетрациклином (200 мкг/мл),

диаминопимелиновой кислотой (100 мкг/мл), тимидином (20 мкг/мл)j и d-биотином (1 мкг/мл).

Среда М9 содержит 6 г/л , 3 г/л КНгР04 0,5 г NaCl и 1 После автоклавировани прибавл ют 1 мл стерильного 1М MgS04 и 10 мл стерильного 0,01 М CaCl. Собирают 10 культур и изолируют плазмкду ДНК из тести пулов, как описано КлевеллоМ с сотр. Biochemistry 9, 4Д28-440 (1970). 10 мкг каждого пула плазмиды ДНК расщепл ют Hind III денатурируют и ковалентно св зывают с ДВМ (диазо- бензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридизуют 1 мкг очищенной мРНК из стимулированных кле .ток, Негибридизованную мРНК удал ют промывкой. Специфически гибридизован- ную мРНК элюируют и транслируют в со циты личинок Xenopus. По этой пробе все 6 пулов были отрицательными. 5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пул из 9 колоний делают из 59 слабо поло- жительных колоний (класс 2), Готов т плазмиды из пулов и исследуют, как описано вьппе. Среды 6 тестированных пулов был тестирован один (к10), гиб- ридизованный в интерферонную мРНК . при условии значительно выше исходных уровней каждого времени. Дл того , чтобы определить специфический интерферонный кДНК-клон готов т плазмиды ДНК из 9 колоний пула К10 и ис- следуют индивидуально. Две из дев ти плазмид (№101 и № 104) св зьгоают ин;Терферонную мРНК существенно лучше чем при указанных исходных уровн х. Из плазмиды № 104 выдел ют один Bgl II рестрикционный фрагмент, со4О

держащий 260 в.р,, меченный Р с использованием процедуры, описанной Тейлором с сотр.,и используют в качестве зонда дл независимого скринин- га 400 E.coli 294 трансформантов с помощью процедуры скрининга колоний in situ.

Идентифицируют 9 колоний (рЬ 31- pL 39), которые гибридизуют до раз- личной степени с этим зондом.

Кроме того, используют меченньй 260 в,р, фрагмент дл независимого скрининга 4000 E.coli 294 трансформантов таким же образом. Индентифи- цируют 50 колоний, которые гибридизуют до различной степени с этим зондом . Одна содержит LeIF G-фрагмент, одна - LelF Н-фрагмент и одна - фраг19Ч

мент, обозначениьш LeIF HI, очень похожий на LeIF Н. Полученные гибридные плазмиды обозначают pLEIF Н и т.п

Готов т плазмиду ДНК из всех 39 потенциальных LeIF кДНК клонов и провод т повторный скрининг с тем же 260 Ворс ДНК зондом, использу процедуру гибридизации Кафатоса с сотр. (см. вьше) . Три плазмиды (pL 4, pL31 pL 34) дают очень сильные признаки (сигналы) гибридизации, четыре (pL 13, pL 30, pL 32, pL 36) гибри- дизованы умеренно и три (pL 6, pL 8 L 14) слабо гибридизованы зондом.

Также скринируют 39 потенциальных LeIF кДНК рекомбинантных плазмид с использованием Р-меченных синтетических ундекамеров (индивидуальные Т-1 первичные пулы праймеров информации или индивидуальные Т-13 праймеры информации) непосредственно в качестве гибридизующих зондов. Услови гибридизации выбирают таким образом, что дл определимых сигналов гибридизации должны требоватьс точно спаренные основани . Следовательно, плазмида ДНК из 3 клонов была приготовлена по стандартной процедуре очищени лизата (Клевелл с сотр., см. выше) и очищена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А-50.

Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейными обработкой Есо RI, денатурируют в щелочи и нанос т на 2 отдельных нитроцел полозньгх фильтра по 1,5 мкг на п тно (Кафатос с г/ см. выше), Фосфорилируют инди видуальные синтетические деоксиоли7 гонуклеотидные праймеры информации и пулы праймеров информации с помощью ( ) ATP следующим образом: 50 пкмоль олигонуклеотида и 100 пкмол ( У з р) АТР, (2500 Кю/ммоль) объедин ют в 30 мкл 50 мМ трис-НС1, 10 мМ MgCl, 15 1 ГЬ-меркаптоэтанола. Добавл ют 2 ед. Т4 ПОЛИНУклеотидкиназы и после 30 мин при 37 С, Р-меченные праймеры информации очищают хроматографией в колонках с 10 мл Сефадекс ®G-50, Гибридизации осуществл ют с использованием 10 срм пула праймеров Т-13С или 3 10 срм пула прайме- ра Т-1C при 15 С в течение 14 ч в 6х SSC (IxSSC 0,15 М NaCl, 0,015 М лимоннокислого натри , рН 7,2, 10х раствор Денхардта (0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% полипи5М

нилпиролидона, 0,2% фиколла). Фильтры промывают 5 JIHH (3 раза) при О С 6х SSC, сушат и облучают на рентгеновской пленке, ,

При этом плазмида ДНК из клона 104 дает значительную гибридизацию с пулом праймеров информации Т-1С и праймеров информации T-ISC но не дает определимой гибридизации с другими ундекамерами. Несколько из 39 по тенциальных LeIF плазмид (pL 2,4,13j 17,20,30,31,34) также гибридизуют с обоими этими зондами. Pst 1-усвоение pL 31 показывает размер кДНК-вставки который должен составл ть примерно 1000 в.р.

Найдено,, что первый/АТС-трансли- рующий начальный кодон состоит из 60 нуклеотидов от 5 конца последова тельности и затем 188 кодонов .после TGA концевого триплета, имеетс 342 нетранслируемых нуклеотидов у З конца , следующих на поли-(А)-последовательностью ,, Путативный сигнальный пептид (по-видимому, включеиньм в секрецию готового LeIF. из лейкоцитов имеет длину из 23 аминокислот, 165 аминокислот, составл ющих готовьш LeIF, имеют рассчитанный молекул рный вес 19390, LeIF5 закодированньй pL 31 обозначают LeIF А, SAU ЗА рес- трикционный эндонуклеазньй участок расположен между кодонами 1 и 3u)FA. Два синтетических деоксиолигонукле- отида включают АТС-транслирующ1й начальный кодон, реконструируют кодон аминокислоты 1 (цистеин) и создают Есо RI липкий конец. Эти олигомеры были св заны в 34 в,р„ SAU За-А all фрагмент pL 31. Полученньш в результате 45 в.р. продукт лигируют в два дополнительных фрагмента ДНК дл конструировани 86,5 в.р. синтетическог ( натурального гибридного гена, Кото рый кодирует LIF Аи,который св зываетс Есо RI и Pst I .(рестрнкционны- М11 участками). Такой ген включают в pR R322 мелоду Есо RI и Pst I участками дл получени плазмиды PLIF AI.

Конструкци триптофанового контрольного элемента, содержащего ,, E.coli trp промотор, оператор и trp лидер рибосомсв зывающего участка, но не содержащего АТС-последовательности дл инициировани трансл ции,

Плазмида pGMI несет триптофановый оперой E.coli, содержащий делецию &L Е1413, и экспрессирует протеин.

196

включающий первые 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последний третий trp Е полипептид (позже упоминаемый в сочетании как LE ), а также trp D полипептид в его целости j все под контролем системы trp промотор-оператор, Плазмиду (20 мкг) обрабатывают рестрикционным ферментом PVU II, который расщепл ет плаз- миду на п ть участков Генные фрагменты затем комбинируют с линкерами Есо RI, состо щими из самокомплиментарного олигонуклеотида с последовательностью pCATGAATTCATG, обеспечн- ва Есо R 1-участок расщеплени дл последующего клонировани в плазмиду содержащута Есо. R 1-участок, Обрабатывают 20 мкг ДНК-фрагментов 5 полученных из pGMI, 10 ед« Тд ДНК-лмгазы в присутствии 200 пкмоль 5 -фосфорили рованного синтетического олигонуклеотида pGATGAATTCATG и в 20 мкл Т ДНК-лигазного буфера (20 kM трис,

рН 7,6, 0,5 мМ АТФ, 10 1Ж MgCL,, 5 мМ дитиотрейтола) 4 С в течение HO4Hi Затем раствор нагревают 10 мин при 70°С до прекращени лигации Gв зки отщепл ют перевариванием Есо R I и

фрагменты, теперь с концами Есо R I, отдел ют, использу электрофорез на 5%-ном пoлиaкpилa шднoм геле (ПАГЭ), и при наиболее широких фрагментах, выделенных из гел первым п тном с

этидиумбром}щом, локализу фрагменты ультрафиолетовым светом, и вырезают из гел интересующие участки. Помещают каждый гелевый фрагмент с 300 мкл 0,1 X ТБЕ в диализаторный

бачок и подвергают электрофорезу при 100 В в течение часа в 0,1 ТБЕ-буфере (ТБЕ-буфер содержит: 10,8 г трис-ос-- нова и , 5,5 г борной кислоты 0,09 г Na - ЭДАТУК в 1 л воды), Водный раствор собирают из диализатор- ного бачка, экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом делают s 0,2 М раствор хлористого натри и извлекают ДНК в воде после осаждени этаноломэ содержащий ген trp

промотор-оператор с липкими концами . Есо RI идентифицируют по указанной ниже процедуре, котора вызывает встзвление фрагментов в чувствительнуго к тетрациклину плазмиду, котора при вставлении промотор-оператора становитс устойчивой к тетрациклину,

Штазмида рВРЛ экспрессирует ам пицкллиновую устойчивость и содер7 1

жит ген устойчивости к тетрациклину Следовательно, плазмнда чувствительна к тетрациклину. Плазмиду делают устойчивой к тетрациклину путем введени системы промотор-оператор в участок EcoRI,

pBRHI расщепл ют EcoRI и удал ют фермент экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом и собирают в воде после осаждени этанолом . Полученную в результате молекулу ДНК в отдельных реакционных смес х объедин ют с каждым из трех фрагмен™ тон ДНК, полученных выше, и лигируют с Т ДНК-лигазой, как описано выше, Используют ДНК}, наход щуюс в реакционной смесп. Дл трансформации E.coli К-12 штамма 294 по стандартной методике и бактерии помещают на LB (Luria-Bertani)-пластины, содержащие 20 мкг/л ампициллина и 5 мкг/л тетрациклина . Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, изолируют плазмиду ДНК и доказывают наличие же- даемого фрагмента с помощью рестрик- ционного ферментного анализа. Полученную плазмиду обозначают рВ RH trp.

Продукт расщеплени с помощью Есо R I и Вам Н I вирусного генома гепатита В получают традиционным способом и клонируют в Есо R I и Ват Н I участки плазмиды р G Н 6 дл образовани плазмиды рН S 32. Затем расщепл ют плазмиду рН S 32 с помощью Xbal, экстрагируют фенолом, хлороформом , осаждают этанолом и обрабатывают 1 мкл E.coli ДНК-полимеразой I Klenow фрагмент (Боерингер-Ман - нхейм) в 30 мкл полимеразного буфера (50 мМ фосфата кали рН 7,4 мМ MgClg 1 мМ | |-меркаптоэтанола) S содержащего 0,1 мМ d ТТР и 0,1 мМ, d СТР, в течение 30 мин при 0°С, затем 2 ч при 37 С. Така обработка приводит к заполнению 2 из 4 нуклеотидов, комплементарных к выступакщему вперед 5 концу X Ьа I участка расщеплени ,

5 CTAGA .5 . CTAGA

3 Т 3 ТСТ Два нуклеотида, dC и dT, были включены и дали конец с двум выступающими вперед 5 нуклеотидами. Такой линейный остаток плазмиды рН S 32 (после экстракции фенолом и клоро формом и сбора в воде после осаждени этанолом) расщепл ют Есо R Ij отдел - ют широкий плазмидный фрагмент от меньшего Есо R I-XbaI-фрагмента с по19

мощью ПАГЭ и изолируют после электро- элюированиКс Этот ДНК-фрагмент из рН S 32 (0,2 мкт;) св зывают в услови- к, подобных указанным вьппе., с Есо R 1-Тар, 1-фрапчентом триптофанового оперена ( OjOl мкг), происход щего из рВ RH trp, В способе легировани фрагс ента нз рП S 32 к фрагменту

Есо В I - Tag 1, как описано вьппе, аыступающрз вперед Tag I конец св зан с Быстгттатлтдим вперед концом X Ъа Ij хот он не совершенно спарен основан1-гю Уатсона-Крика

-Е CTAGA - -TCTAGA -AGC ТСТ - -AGCTCT - Часть этой лигационной реакционной смесн трансформир1|Тот в клетки E.coli 294, провод т термообработку и поме щают на пластины LB, содержащие ам- .пициллин. Отбирают 24 колонии, выращивают в 3 мл LB (Луриа-Бертани) среды и изолируют плазмиду. Найдено, что 6 из них имеют Xbal-участок ре- ренерированный с помощью E.coli, катализированной ДНК повторным спариванием и репликацией

- TCTAGA - - TCTAGA - - AGCTCT -- AGATCT Найдено , что эти плазмиды расщепл ютс как Есо R I, так и Нра I и дают ожидаемые рестрикционные фрагменты , Одну плазмиду, обозначенную рТгр 14 , используют дл экспрессии гетерологических полипептидов,

Плазмида pHGH 107 содержит ген человеческого гормона роста (ЧГР), составленный из 23 аминокислотных кодонов, полученных из синтетических ДНК-фрагментовJ и 163 аминокислотных кодонов 5, полученных из комплементарной ДНК, полученной с помощью обратной транскрипции информационной РНК ЧГР, Этот .ген5 хот в нем отсутствуют кодоны рге последовательности ЧГР 5 содержит ATG-транслирукхций начальный кодон. Этот ген изолируют из 10 мкг pHGH 10 после обработки Есо R I с последующей обработкой E.coli ДНК полимеразой Кленоза фрагмента и d ТТР и d ATP. как указано выше. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждени этанолом плазмиду обра- батызают Ваи Н1о

Фрагмент, содержащий ген ЧГР, изолируют с помощью ПАГЭ с последующим электроэлюированием. Полученньй в результате ДНК-фрагмент также содержит

UU3

первые 350 нуклеотидов устойчивого к тетрациклину структурального гена но в нем отсутствует тетрациклинова система промотор-оператор, так что при последовательном клонировании в экспрессионную плазмиду плазмиды, содержащие вставку, могут быть обнаружены по восстановлению устойчивост к тетрациклину. Так как Есо R I коне фрагмента был заполнен в процедуре полимеразой I Кленова, фрагмент имеет один тупой и один липкий конец , обеспечивающий четкую ориентацию при последующем включении в экспрессивную плазмиду.

. Затем готов т экспрессивную плазмиду рТгр 1Ддл получейи фрагмента содержащего ЧГР-ген, приготовленного ранее, рТгр 14 расщепл ют XbAI и полченные липкие концы заполн ют-по процедуре полнмеразой I Кленова, примен d ATP, d TIP, dG IP и d СТР. Пос ле экстракции фенолом и хлороформом и осаждени этанолом полученную в результате ДНК обрабатывают Ват Н I и изолируют полученный в результате широкий плазмидный фрагмент с помощью ПАГЭ и электроэ.шоировани . Фрагмент , происход щий из рТгр 14, имеет один тупой и один липкий конец, позвол ющий рекомбинацию с четкой ориентацией с фрагментом, содержащим ЧГР- ген, описанный ранее

Фрагмент гена ЧГР и фрагмент рТгр 14 u,Xba-Bam Н I объедин ют и лигирую в услови х, подобных описанным выше. Заполненные Xbal и Есо R I концы, св занные вместе св зкой по тупому концу дл воссоздани участков Xbal и Есо R I: заполненный Xbal заполненный Есо R I инициирование геном ЧГР -TCTAG AATTCTATG- -TGTAGAATTCTATG- +

-AGATC TTAAGATAG -AGATGTTAAGATACXba I Есо R I

Така конструкци также воссоздает ген устойчивости к тетрациклину, Так как плазмида pHGU 107 экспресси- рует устойчивость к тетрациклину из промотора, расположенного вьше гена ЧГР (lac-промотор), эту конструкцию обозначают pHGH 207 ,она позвол ет осуществить экспрессию гена устойчивости к тетрациклину под контролем триптофа нового промотора-оператора, Лигацион- ную смесь трансформируют в E.coli 294 и отбирают колонии на LB-пластинах, содержащих 5 мкг/л тетрациклина.

5

0

К

bj

G

5

0

5

0

5

19 О ,

Плазм1 щу рН.ОИ 207 расщепл ют Есо R I с помощью ПАГЭ и электроэлю- ировани и выдел ют фрагмент, содержащий trp промоторJоператор и trp ведущий рибосомный св зующий участок,но в котором отсутствует АТС-последовательность дл инициировани трансл ции . Этот фрагмент ДНК клонируют и Есо R 1 участок pLelF А, Экспресси- онные плазмиды, содержапще модифицированный выше trp регулон (E.coli trp оперой, из которого была изъ та истощенна последовательность дл контролируемого повьшени уровней экспрессии), выращивают до заранее определенных уровней в питательной среде3 содержащей добавку триптофана в количестве, достаточном дл подавлени (репрессии) системы промо- , тор-оператор, затем изымают триптофан , чтобы дерепрессировать систему и вызвать экспрессию целевого продукта . Дл этого 250 мкг плазмиды pL 31 расщепл ют pst I и изолируют 1000 в,р, вставку гель-электрофорезом на 6%-ном полиакриламидном геле.

Из гел элюируют примерно 40 мкг вставки и раздел ют на три аликвота дл дальнейшего расщеплени образца 16 мкг этого фрагмента частично рас- щепл ют 40 ед, ВрД II- в течение 45 мин при 37 G и очищают реакционную смесь на 6%-ном полиакриламидном геле. Собирают приблизительно 2 мкг целевого 670 в.р. фрагмента.

Другой образец (8 мкг) из 1000 в.р. pst I вставки рестриктируют А v all и Bgl II, Goбиpaют 1 мкг указанного 150 Вар. фрагмента после гель-электрофореза .

Обрабатьгаают 16 мкг 1000 в.,р, часть Г)Аи За и А V all. После электрофореза на 10%7ном полиакриламидном геле собирают приблизительно 0,25 «х (10 пкмоль) 34 в,р, фрагмента.

Синтезируют два указанных дезокси- олигонуклеотида 5 -d AATTCATGTGT (фрагмент 1) и 5 - d-GATCAGACATG (фрагмент 2) по фосфоротриэфирной процедуре.

Фрагмент 2 фосфорилируют следующим образом.

Высушивают 200 мкл ( пкмоль) ( р) - АТР (Qraersham ЗОООКю/ммоль) и повторно суспендируют в 30 мкл 60 LTfl трис-HG l (рН 8)j 10 мМ Мр.С, 15 кМ З-меркаптозтенолЯ) содержа- п{его 100 пкмоль ЛИК фрагмента и 2 едо

. 14

4 полинуклеотидной киназы. После 15 мин при 37 С прибавл ют 1 мкл 10 мМ АТР и реакци продолжаетс еще

15мин. Затем смесь нагревают при 70°С в течение 15 мин, объедин ют с 100 пкмоль 5 -ОН фрагмента 1 и

10 пкмоль 34 в,р. SAU За-А v all рагмента. Св зывание осуществл ют в течение 5 ч при 4 С в 50 мкл 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ MgClj, . 10 м1Л дитиотрейтола, 0,5 Mli АТР и 10 ед. Т4 ДНК лигазы. Смесь подвергают электрофорезу на 6%-ном полиакриламидном геле и электроэлюированием собирают 45 в.р. продукт. Объедин ют 30 нг (1 пкмоль) 45 в.р. продукта с 0,5мкг (5 пкмоль) 150 в.р. А-V aII-ВрД 2-го фрагмента и 1 мкг (2 пкмоль) 670 в,р. Bgl Il-Pst 1-го фрагмента. Лигирова- ние осуществл ют при 20 С в течение

16ч, использу 20 едь Т4 ДНК лигазы. Лигазу инактивируют, нагрева при 65 С в течение 10 мин. Затем смесь усваивают Есо R I и Pst I дл удалени полимеров из гена. Смесь очищают

на 6%-ном ПАГЭ. Изолируют около 20 нг, (0,04 пкмоль) 865 в.р. продукта. Половину этого продукта (10 нг) лиги- руют в p3R 322 (0,3 мкг) между сайтами Есо R I и Pst I. Трансформаци E.coli 294 дала 70 устойчивых к тетрациклину , чувствительных к ампициллину трансформантов. Плазмиду ДНК, изолированную из 18 из этих трансформантов , расщепл ют Есо R I и Pst I, 16 из 18 плазмид имеют Есо R I-Pst 1 фрагмент 865 в.р. в длину. Расщепл ют 1 мкг одной из них, pLelF, А 1, Есо R I и лигируют в 300 в.р, EcoRI фрагмент (0,1 мкг), содержащий Е„с611 trp промотор и ведущий рибосомный св зываклций сайт, приготовленный, как описано вьше. Идентифицируют трансформанты , содержащие trp промотор, использу P-trp зонд в сочетании с проце;(урой скрининга колоний Грюн- щтейна-Хогнесса, Асимметрично расположенный Xbal сайт в . trp фрагменте позвол ет определить рекомбинанты, в которых trp-npoMOTop ориентирован в направлении LeIF А-гена.

Определение активности LeIF А.

Экстракты готов т дл IF анализа следующим образом,

1 мл культуры выращивают в ей -бульоне , содержащем 5 мг/мл тетрациклина до значени А550 около 1,0. Затем разбавл ют 25 мл среды М9, сорержа1912

щей 5 мкг/мл тетрациклина. 10 мл образцы собирают цектрифугиропанием, когда ASSQ Достигнет значени 1,0 и гранулированные клетки суспендируют в 1 мл 15% раствора сахарозы, 50 мМ трис-НС (рН 8,0), 50 мМ ЕДТА. Добавл ют 1 мг лизозима и через 5 мин инкубации при 0°С клетки разрушают воздействием ультразвука. Образцы цент- рифугир тот в течение 10 мин (15000 об/мин) и активность интерферона в верхнем слое определ ют сравнением со стандартами LeIF с помощью

цитопатического эффекта (СРЕ) инги- бировани . Дл определени числа TF молекул на клетку используют LeIF удельную активность пор дка 4-10 ед/мг Клон pLelF А trp 25, в котором

trp промотор вставл ют в желаемой ориентации, дает высокие уровни активности (до 2, ед/л). Полученный с помощью E.coli К-12 штамма 294/pLeIF А trp 25 ведет себ подобно

аутентичному человеческому LeIF, он устойчив к обработке при рН 2 и нейтрализуетс античеловеческими лейкоцитарными антителами кроликов. Такой интерферон имеет кажущийс молекул рный вес приблизительно 20000.

Выделение с ДНК дополнительных лейкоцитарных интерферонов, ДНК из LeIF с ДНК-содержащей плазмиды вырезают с помощью pst 1, выделенной

электрофорезом, и мет т изотопом Р, Полученную в результате радиактивно меченную ДНК используют в качестве зонда дл скрининга дополнительных E.coli 294 трансформантов, полученных по способу, идентичному описанному в части С по методике in situ скрининга колонии, предложенной Грун- штейном и Хогнессом (см, вьше). Колонии , которые в различных количествах гибридизировали с зондом, вьще- л ют Плазмиду ДНК из таких колоний и дес ть гибридизированных колоний, на которые ссылаютс выше, с помощью Pst I и характе ризуют трем различными способами. Во-первых, образцы ре- стракционного эндонуклеазного рас- щегшенк с энзимами Bgl II, PVU II и Есо R 1, Такой анализ позвол ет классифицировать по крайней мере восемь различных типов (LeIF А, LeIF В, LeIF С, LeIF D, LeIF Е, LeIF F, LeIF G, LeIF H), что соответствует приблизительно положению различных рестрикционных разрезов относительно

13U

известной в насто щее врем предварительной последовательности и кодирующей последовательности.

Во-вторых, некоторые из ДНК испы тывают на гибридизационный выбор дл установлени способности селективно удал ть LeIF и КИК из поли-Aj содержащей KG-1 клеточной РНК, Согласно этому анализу LeIF А, В, С и F дают положительные результаты. В-третьих , последние фрагменты внедр ют в экспрессионную плазмиду E,coli294( трансформируют с плазмидой и фрагменты экспрессируют. Продукты такого экспрессировани представл ют собой пре-интерфероны, дают положительные результаты при СРЕ анализе на активность интерферона, хот и обладают маргинальной активностью в случае LeIF F-фрагмента.

В последовательности изолированного фрагмента, содержащего ген зрелого LeIF В, первые четйфнадцать нук леотидов типов А и В были идентичны. В соответствии с этим фрагмент из pLelF А 25, несущий trp промотор-оператор , место присоединепи рибосомы и начало LeIF А(В) гена, вьздел гот и соедин ют с остающейс частью В последовательности в экспрессионной плазмиде,

Дл получени приблизительно 950 в.р, SAU За к Pst фрагменту необходимо несколько стадий ввиду наличи одного или более чередующихс SAU За рестракционных сайтов,

1.Вьщелены следующие фрагменты; )0110 в.р. от SAU За до Fco R I, в) 7i 132 в,р. от Есо R I до ХЪа,

с) 700 в.р. от ХЬа до Pst.

2.Фрагменты (1а и 1в) лигируют и разрезают с помощью ХЬа и Bgl II

с тем, чтобы предотвратить самополимеризацию через SAU За и ХЬа концевые терминалы (соответствующий SAU За сайт находитс внутри сайта Bgl II, Bgl II разрезают с тем чтобы оставить SAU За - липкий конец ) . Вьщел ют 242 в.р. фрагмента.

3. Продукт со стадий (2) и (1с) лигируют и разрезают с помощью Pst I и Bgl 11 дл того, чтобы предотвратить самополимеризацию. Выдел ют приблизительно 950 в.р. фрагмента от SAU За до Pst. Такой фрагмент содержит часть LeIF В гена, не характерную дл LeIF А.

1

4.Приблизительна 300 в„р. фрагмента от Hind III до SAU За, содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединени рибосо, АТС начальный сигнал и цистеиновый кoдoнLeIFA, вьщел ют из pLelF А 25,

5.Приблизительно 3600 в.р. фрагмента Pst I - Hind III выдел ют из

Q рВ R 322„ Такой фрагмент содержит репликон и кодированный тетрациклин, но не обладает устойчивостью к ампициллину .

6.Фрагменты,, полученные на стади- 5 х 3 j4 j5 лигирутот и полученную в результате плазмиду трансформируют в E.coli К-12 штамм 294.

Трансформанты подвергают минискри- нйнгу и образцы плазмиды расщепл ют

0 с помощью Есо R I, Продукты такой реакции представл ют три фрагмента со следующими характеристиками: Есо R I- Есо R I trp промоторный фрагмент, внутренний Есо R I - Есо R I - Есо R

5 фрагмент pL4 и протеин-трансл ционный начальный сигнал - Есо R I фрагмент pL4.

Согласно СРЕ анализу бактериальные экстракты из клонов, полученных ука

0 занным способом, обычно имеют примерно 10-10 ед. интерфероновой активности на литр при Ajgg 1 . Один из таких клонов, полученных указанным способом, представл ет собой

3g E.coli 294/pLeIF В trp 7„

Пр мое экспрессирование дополнительных зрелых лейкоцитарных интер- феронов (LeIF С, D, F, Н, I и L). Дополнительные генные фрагменты

0 полной длины, которые содержат другие LeIF типы, могут быть преобразованы в последовательность и помещены в экспрессионные векторы дл экспрессировани , как это имеет место в случае LeIF А.

45

Коротка длина синтетической ДНК, обрывающа с на 3 -конце кодирующей

спирали, с трансл ционным начальным сигналом АТС затем лигируют например , путем лигировани тупого конца к полученному в результате сшитому гену дл зрелых интерферонов, ген внедр ют в экспрессионную плазмиду и регулируют с помощью промотора и св занного с ним сайта присоединени рибоCOt-lbl .

Согласно способу, аналогичному описанному вышед генные фрагменты, кодирующие LeIF С и LeIF D, соответ 51

ствующим образом конфигурируют дл пр мого бактериального экспрессиро- вани , Экспрессионна стратеги дл таких дополнительных лейкоцитньгх интерферонов в каждом случае включает использование приблизительно 300 в.р. фрагмента (Hind III-SAU За) содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединени рибосомы АТС-начальный сигнал и цистеиновый кодон LeIF А из pLelF А 25. К нему присоедин ют генные фрагменты из дополнительных интерфероновых генов, кодирующих их соответствующие последовательности аминокислот выше исходного цистейна, присущего всем последова- тельност мв Каждую полученную в ре-- зультате плазмиду используют дл трансформации E.coli К-12 штамм 294.

Из pLelF С выдел тот следующие фрагменты: а) 35 в.р. SAU 3A-SAU 96, в) 900 в.р. SAU 96 - Pst 1, с) выдел ют приблизительно 300 в.р. фрагмента (Hind 111 - SAU За) из pLelF А 25 аналогично описанному в части 4 d) выдел ют приблизительно 3600 в.ро фрагмента согласно части 5,

Построение.

1. Лигируют (а) и (с). Расщепление провод т с помощью Bgl II, Hind III и вьщел ют приблизительно 335 в.р. продукта.

2 Провод т тройное лигирование (1)+(b)(d) и трансформацию E.coli с помощью полученной в результате плазмиды.

Соответствующий клоН| полученный таким образомJ представл ет собой E.coli К-12 штамм 294/pLeIF С trp 35

LeIF D.

Из pLelF D вьщел ют: a) 35 в,р, SAU ЗА - A V all, в) 150 в,p. A v al Bgl II, c) приблизительно 700 в,р, Bgl II - Pst I

Из pLelF A 25 вьздел ют: d) 300 Bep. Hind III - SAU За.

Из рВ R 322 выдел ют; e) приблизительно 3600 в.р. Hind III - Pst lo

Построение. , ,

1.Лигирзпот (a)+(b), разрезают с помощью Bgl II и очищают 185 в.р. продукта (1).

2.Лигируют (1)(d), разрезают с помощью Hind HI, Bgl II и очищают приблизительно 500 в.р. продукта (2)

2. Лигируют (2)+(с)+(е) и транс- формирзпот E.coli с помощью полученной в результате плазмиды.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Соответствуюынй KjiOHj полученньп таким способом5 представл ет собой E.coli К-12 штамма 29 4/pLeir D trp 1 1 . LeIF F содержащий фрагмент может быть сшит дл пр мого экспресснровани через пересборку5 упрощенную полной гомологией a iннoкиcлo7 1-13 LeTF В и LeIF F trp промотср-содержащий фрагмент (а) с соответствутощим образом конфнгурирова нными концами получают из ЧГР 207 согласно описанному выше, через Pst I и ХЪа Х-расщепленке с последующим выделением приблизительно 1050 в„р. фрагмента. Второй фрагмент (Ь) получают в виде более крупного из фрагментов, полученных Pst I и Bgl II расщеплением плазмиды рНК Y 10,

Фрагмент (а) содержит приблизительно половину гена, кодирующего устойчивость к ампициллину, фрагмент (Ъ) - остаток гена и полный ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину. Фрагменты (а) и (Ь) объедин ют через Т4 лигазу и продукт обрабатывают ХЬа Т и Bg II дл подавлени димеризации с образованием фрагмента (с), содержащего trp промотор-оператор и гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину е

Фрагмент (d), содержащий приблизительно 580 в.р., получают расщеплением pLelF F под воздействием А Ya TI и Bgl II. Он содержит кодоны аминокислот 14-166 LeIF F.

Фрагмент (е) (49 в.р,) получают расщеплением pLelF В под воздействием ХЬа I и А V allo Фрагмент (е) кодирует аминокислоты 1-13 LeIF Fv

Фрагменты (с), (d) и (е) подвергают тройному лигированию в присутствии LT4-лигaзы„ Когезионные концы Соответствующих фрагментов что композиционна плазмида находитс в состо нии правильной циркул ции и при зтом ген устойчивости к тетращ-пс- лину находитс под контролем trp промотора-оператора совместно с геном : зрелого LeIF F, так что бактерии, трансформированные с помощью желаемой плазмиды, выбиратьс из пластин, содержащих тетрациклин. Клон, полученный таким образом, представл ет собой E.coli К-12 штамм 294/pLeIF F trp 1.

Полный LeIF Н-ген может быть конфигурирован дл экспрессировани в виде зрелого лейкоцитарного интерферона согласно следующему.

171Д

1.Плазмиду pLelF Н подвергают гидролизу в присутствии Пае II и RS al с выделением 816 в,р. фрагмента , простирающегос от сигнального пептида аминокислоты 10 до 3 некодирующего участка.

2.Фрагмент денатурируют и подвергают синтезу с фрагментом Кпенова ДНК полимеразы 1 с использованием синтетического дезоксирибо-олигоиук- леотидного праймера 5 -ATGTGTAATCTGTCT

3.Полученный в результате продукт расщепл ют с помощью SAU За и выдел ют 452 в.р. фрагмента, представл ющего собой аминокислоты 1-150.

4.В результате расщеплени LeIFН с помощью SAU За и Pst.1 и выделени полученного в результате- 500 в.р. фрагмента получают ген, кодирующий аминокислоты от 150 до конца кодирующей последовательности.

5.Фрагменты, вьщеленные на стади х (3) и (4), лигируют с образованием фрагмента

1166

met cys asp stop АТС TGT.. + i. GAT TGA - ... - Pst I

SAU За кодирующего 166 аминокислоты LeIF-H,

6.pLelF A trp 25 расщепл ют с помощью Xba I, лигируют тупые концы с помощью ДНК полимеразы 1 и продукт реакции расщепл ют с помощью Pst I. Полученный в результате большой фрагмент может быть вьщелен и лигирован

с продуктом со стадии (5) с образованием экспрессионной гшазмиды, способной после трансформации E.coli К-12 штамма 294 или другого бактериального хоз ина экспрессировать зре лый LeIF Н.

Л -фазную Чарон 4А рекомбинатную библиотеку человеческого генома подвергают скринингу на лейкоцитарные интерфероновые гены. Радиоактивный LeIF-зонд, полученный из сДНК клона LeIF А, используют дл скрининга 500000 колоний. Шесть LeIF геномных клонов получают в результате такого скрининга. В результате последующего скрининга и очистки колоний один из таких клонов, Н LeIF 2, выбирают дл дальнейшего анализа.

С использованием указанного способа могут примен тьс и другие зонды с тем, чтобы успешно провести выделение дополнительных LeIF клонов из человеческого генома. Они, в

. ЯЭ 18

свою очередь5 могут использоватьс дл получени дополнительных лейкоцитарных интерфероновьгх протеинов согласно изобретению.

1. 2000 в.р. Есо R I фрагмент клона/ХН LeIF 2 клонируют в pBR325 .на сайте нахождени Есо R I, Полученную в результате плазмиду LeIF I

Q расщепл ют с помощью Есо R I и выдел ют 2000 в.р. фрагмента. Деоксиоли- гонуклеотидный d AATTCTGCAG (конвертор Есо R I - Pst I) лигируют до 2000 в.р. Есо R I фрагмента и получен

5 ный в результате продукт расщепл ют с помощью Pst I с образованием.2000 фрагмента, содержащего Pst 1-конць. Этот продукт расщепл ют с помощью SAU 96 и 1100 в.р. фрагмент выдел ют.

0 2. Плазмид.у pLelF С trp 35 расщеп- л пот с помощью Pst I и ХЪ al. Вьще- л ют крупный фрагмент,

3.Небольшой ХЬ al - Pst I фрагмент из pLelF С trp 35 расщепл ют с

5 помощью ХЪ а и SAU 96. Еьщел ют 40 в.р. ХЬ al - SAU 96 фрагмента,

4,Фрагменты, выделенные на стади х (1), (2) и (3), лигируют с образованием экспрессионной плазмиды

0 pLelF I trp 1. LeIF J.

,1. Плазмида pLelF J содержит 3,6 (: Hind III фрагмента человеческой геномной ДНК, котора включает LeIF J генную последовательность, и вьщел - ют 700 в.р. Dde I - RSa I фрагмент. 2. Плазмиду pLelF В trp 7 расщепл ют с помощью Hind III и Dde Г и выдел ют 350.в,р. Hind III-Dde I фрагмент,

Q 3«, Плазмиду рБ R 322 расщепл ют с помощью Pst Ij затупл ют концы в результате инкубировани в присутствии ДНК полимеразы I (кленовский - фрагмент), затем расщепл ют с помощьг, Hirid III и выдел ют крупный (i 3600 в,р) фрагмент,

4. Фрагменты, выделенные на стади х (1) (2) и (3), лигируют с образованием .экспрессионной плазмиды

р pLelF J trp I,

Очистка интерферона, 1. Замороженные клеточные гранулы содержащие экспрессированный лейкоцитарный интерферон в раздробл ют вручную али с использованием соответствующего оборудовани дл уменьшени размера частиц. Частично отта вшие клетки суспендируют в 4 об .буфера Aj содержащего 0,1 М трис (рН 755-8,0)3

35

45

55

19

10% (вес/об) сахарозы 0,2 М MaCl, 5 мМ ЕДТЛ, 0,1 мМ P11SF и 10-100 -sH Мр,С1 , Такую суспр.нзмю выдерживают при температуре приблизительно А®С, Полученную суспензию пропускают через гомогенизаторJ работающий под давлением 6000 фунт/дюй - j после чего снова пропускают через указаное устройствоэ но при давлении 1000 фунт/дюйм. Эффлюент из гомогенизатора от двух проходов охлаждают в бане со льдом,

2,Медленно добавл ют полиэти- ленимин к гомогенной среде до концентрации около 0,35% и полученной системе дают выстаиватьс в течение 30 мин Твердые вещества удал ют центрифугир ванием или фильтрацией. Температуру на этой стадий контролируют или провод т ее достаточно быстро, в результате чего верхний слой (фильтрат ) поддерживаетс при температуре менее 10°Св Верхний слой (фильтрат) концентрируют ультрафильтрацией приблизительно до 1/10 начального объема . Мелкие частицы или туманность

в удержанной фазе можно удалить на соответствующем фильтре, например на микропористой мембране.

3,Осветленный раствор загружают непосредственно в колонку с монокло- нальным антителом со скоростью подачи 5-8 см/ч (например, 25-40 мл/ч в колонку с диаметром 2,6 см). После загрузки колонку промьшают приблизительно 10 об 25 мМ трис-НС1 рН 755-8,55 включающего NaCl (0,5 М) и такое поверхностно-активное вещество , как Тритон-Х-100 (0,2%) или его эквивалент. После промывки колонку споласкивают приблизительно 10 об раствора5 содержащего 0515 М NaCl

и поверхностно-активное вещество, такое как Тритон Х-100 (0,1%) или его эквивалент. Колонку элюируют 0,2 М раствором уксусной кислоты, содержащим такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х-100 (0,1%) или-его эквиваленте Фракциюj дающую протеиновый пик из колонки с моно- клональным антителом (согласно УФ- спектроскопическому или другому ана1920

лизу) 5 объедии . ют и рН системы устанавливают приблизительно 4,5 с помощью 0,1 N раствора NaOH или 1 ,,О М трис-основани ми,

4 о Обьединенньй иитерфероновый пик загружают на катионообменник, такой как Еать;ан Qi 52 целлюлоза или его эквивалент5 который уравновешивают 1тодход Щ|;м буфером, так -тм как ацетат аммони , рН 4,5 (50 мМ), Пос- ле загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером до того момента, пока У -спектр дает ровный пр мой

при анализе элюента,, в результате че. го небольшое количество эффлюента элюируетс с колонки, Затем колонку элюируют 25 мМ ацетата аммони и 0s12 М хлористого натри или их комбинацией , котора оптимизирует регенерацию интерферона и приводит к об- разованию лиофилизированного осадка на фильтре.

Claims

Формула изобретени

Способ получени лейкоцитарных ин терферонов человека с частичной последовательностью C s-Ala-trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-I le-Met-Arg- -v -Ser-j предусматривающей трансформацию бактерий EtColi штамм 294 АТСС 31446 плазми,дами, выбранными из группы pLelF А 25, pLelF Б trp 7,

pLelF С trp 35, pLelF D trp 11,

pLelF F trp I, pLelF I trp 1, pLelF J trp I, культивирование полученных трансформаторов с последующим экстрагированием и очисткой полученных полипептидов .

Приоритет по признакам: 01 07о80 при частичной последовательности Cys-Ala-trp-Glu-Val-Val- -Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Serr, pLelF А 25, pLelFB trp 7, Escheri- chia coli ATCC 31446;

08„09о80, при pLelF С trp 35 pLelF D trp 11 , pLelF F trp I. 10,11o80 при pLelF I trp 1, pLelF J trp 1 ,

21„04;81 при экстрагировании и очистке полученных полипептидов.