HU196457B - Process for producing interferons - Google Patents

Process for producing interferons Download PDF

Info

Publication number
HU196457B
HU196457B HU811882A HU188281A HU196457B HU 196457 B HU196457 B HU 196457B HU 811882 A HU811882 A HU 811882A HU 188281 A HU188281 A HU 188281A HU 196457 B HU196457 B HU 196457B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lelf
interferon
trp
plasmid
mature
Prior art date
Application number
HU811882A
Other languages
English (en)
Inventor
David Goeddel
Sidney Pestka
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27496622&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU196457(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US06/256,204 external-priority patent/US6610830B1/en
Application filed by Hoffmann La Roche, Genentech Inc filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HU196457B publication Critical patent/HU196457B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány a dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológiára vonatkozik, azaz a DNS-rekombinációs technológiánál alkalmazott eljárásokra és az ezekkel az eljárásokkal kapott termékekre.
Közelebbről, a találmány tárgyát polipeptidek, pontosabban érett emberi leukocita interferonok, az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és az említett polipeptidek előállítására szolgáló eljárás képezik. A találmány az eljárás során alkalmazott termelő közegekre, az ezeket tartalmazó új mikroorganizmusokra és az előállításukra szolgáló eljárásokra is kiterjed. Azoknak a DNS-szekvenciáknafc az előállításéra is a találmány tárgyát képezi, amelyek az érett emberi leukocita interferon aminosav-szekvenciáit kódoló szekvenciákat tartalmaznak.
Az emberi leukocita interferont (LelF) Isaacs és Lindenmann fedezte fel és állította először elő eléggé szennyezett csapadék alakjában (Proc. R. Soc., B 147, 258-267 /1958/; 3 699 222 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezután erőfeszítések történtek az anyag tisztítására és jellemzésére, s sikerült viszonylag homogén leukocita interferonokat előállítani egészséges vagy leukémiás személyek fehérvérsejtjeiből (2 947 134 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsájtási irat). Ezek az interferonok a kémiai szerkezetüket tekintve fehérjék, s az őket tartalmazó sejteket képesek a vírusokkal szemben ellenállóvá tenni.
Ezen túlmenően, az interferon gátolhatja a sejtburjánzást és befolyásolhatja az immunreakciót.
A fenti tulajdonságok ösztönzést adnak arra, hogy a leukocita interferont felhasználják a gyógyászatban vírusfertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésére.
A leukocita interferonokat gyakorlatilag a homogenitás eléréséig tisztították (Rubinstein és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 640-644 /1979/; Zoon és munkatársai, idézett mű, 76, 5601-5605 /1979/), és hozzávetőleg a 17500-21000 közötti molekulasúly-tartományt adták meg. E készítmények fajlagos aktivitása igen nagy, 2 x 10s - 1 χ 109 egység/mg fehérje, kedvezőtlenül csekély azonban a sejttenyészetből való kinyerés hozama.
A fehérjék aminosav-szekvenciáját feltáró módszerek fejlődése azonban lehetővé tette az interferonok aminosav-szekvenciáinak meghatározását (Zoon és munkatársai, Science, 207, 527 /1980/; Levy és munkatársai,
Próc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5102-5104 /1980/).
Jelenleg nem ismerjük még teljes pontossággal a glikozilezödést a különböző leukocita interferonoknál, annyit azonban tudunk, hogy az egyes interferonoknál nem csupán a glikozilezódés közötti különbségek a felelősek a megfigyelt eltérő molekulasúlyokért.
A leukocita interferonok között az aminosav-összetétel és aminosav-szekvencia szempontjából jelentés különbségek tapasztalhatók, és az aminosav-homoló gia egyes esetekben kisebb mértékű 80%-nál.
A véradóktól származó fehérvérsejtekből elegendő homogén interferont lehetett ugyan elkülöníteni a szerkezet részleges jellemzéséhez és korlátozott mértékű klinikai vizsgálatokhoz, ilyen módon azonban nem állítható elő olyan mennyiségű interferon, amely a kiterjedt klinikai kipróbálásokhoz, majd pedig az azokat követő profilaktikus és/vagy terápiás alkalmazásokhoz lenne szükséges. Ennek következtében az emberi fehérvérsejt-eredetű interferonoknak a daganatellenes és vírusellenes hatását feltáró klinikai vizsgálatok eddig elsősorban nyers (< 1% tisztaságú) készítményekre korlátozódtak, és az egyébként rendkívül költséges gyártáshoz szükséges hosszú idő késlelteti az anyag kiterjedt tanulmányozását.
A DNS-rekombinációs eljárások létrehozásával lehetővé vált azonban igen sokféle hasznos polipeptid bakteriális úton történő szabályozott termelése. Már rendelkezésre állnak olyan, a DNS-rekombinációs eljárásokkal módosított baktériumok, amelyekkel például a következő polipeptidek állíthatók elő: szomatosztatin, az emberi inzulin A és B komponense és az emberi növekedési hormon (Itakura és munkatársai, Science, 198, 10561063 /1977/; Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544-548 /1979/1.
Újabban DNS-rekombinációs eljárással állították elő bakteriális úton a csecsemőmirigy által termelt, immunitást biztosító .timozin alfa 1’ anyagot és a proinzulint, tóbb szerző pedig leírta az emberi leukocita interferon és leukocita interferon aktivitással rendelkező fehérjék DNS-kódolását (Nagata és munkatársai, Natúré, 284, 316-320 /1980/; Mantei és munkatársai, Gene, 10, 1-10 /1980/; Taniguchi és munkatársai, Natúré, 285, 54754S /1980/).
A DNS-rekombinációs eljárások középpontjában a plazmid áll, amely a baktériumokban és más mikrobákban található DNS kettős spirál nem-kromoszóma része. A plazmidban kódolt információra van szükség a plazmid újabb sejtekben történő reprodukálásához (azaz .replikon létrehozásához), és általában egy vagy több olyan kiválasztási jellemzőnek, például baktériumok esetén az an'.ibiotiki^mokkal szembeni ellenállóképességnek az átadásához, amely biztosítja, hogy a szóbanforgó plazmidot tartalmazó .gazda' sejt kiónjai felismerésük után előnyben részesítve növekedjenek a szelektív táptalajon.
z\ bakteriális plazmidok hasznosíthatósága azon alapul, hogy specifikus módon hasíthatok egyik vagy másik restrikciós endonukleézzai (vagy restrikciós enzimmel). Az egyes restrikciós enzimek a plazmidban lévő DNS különböző helyeire .emlékeznek'. A hasítás folytán létrejövő heterológ gének vagy géntöredékek beilleszthetők a plazmidba, úgy, hogy a végek kapcsolódnak a hasítási helyhez vagy az azzal szomszédos újjáalakult véghez.
A DNS-rekombinéciót a sejten kivül végzik, a létrehozott .rekombináns' plazmid azonban bevihető a sejtbe a transzformációnak nevezett eljárással, és nagy mennyiségben nyerhető heterológ gént tartalmazó rekombinált palzmid a transzformációval kapott sejtek szaporításával.
Továbbá, ha megfelelően történt a gén beillesztése a plazmid azon részeihez képest, amelyek a DNS-ben kódolt információ átírását (transcription) és lefordítását (translation) szabályozzák, akkor a kapott termelő közeg felhasználható annak a polipeptid szekvenciának a tényleges termelésére, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejezésnek is nevezik.
A polipeptid előállítása (kifejezése) a promotor néven ismert tartományban indul be, amelyet a ribonukleinsav (RNS) polimeróz ismer fel és kötődik hozzá. Egyes esetekben, például a találmánnyal kapcsolatban előnyös triptofán (trp) promotor esetében, a protnotor tartományokat átfedik az .operátor tartományok, és igy kombinált promotor-operátor jön létre. Az operátorok olyan DNS szekvenciák, amelyeket felismernek az úgynevezett represszor fehérjék, amelyek arra szolgálnak, hogy szabályozzák az átírás beindulásának gyakoriságát egy bizonyos promotornál.
A polimeráz enzim végighalad a DNS mentén, és átírja a kódolt spirálagban az 5’ végétől a 3’ végéig tárolt információt üzenethordozó ribonukleinsavvá (mRNS), amely viszont átalakul a DNS által kódolt aminosav-szekvenciájú polipeptiddé. Minden egyes aminosavat egy nukleotid triplett vagy .kodon kódol azon belül, amelyet a szabadalmi leírás céljaira szerkezeti génnek nevezünk. Ez az a rész, amely a létrehozott termék aminosav-szekvenciáját kódolja.
A promotorhoz történő kötődés után az RNS polimeráz először átírja azokat a nukleotidokat, amelyek egy riboszóma kötési helyet kódolnak, majd a lefordítás kiváltása vagy .startjel következik (ez rendszerint ATG /adenin-timin-guanin/, amely a létrejövő üzenethordozó ribonukleinsavban AUG-vé alakul), azután pedig a nukleotid kodonok jönnek létre magában a szerkezeti génben. Úgynevezett megállító kodonok kerülnek a szerkezeti gén végére, amelyek utón a polimeróz további üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS) szekvenciát hozhat létre. A megállítójel miatt ezt nem fordítják ie a riboszómák.
A riboszómák az üzenethordozó ribonukleinsavon található kötési helyhez kapcsolódnak, és létrehozzák a kódolt, polipeptidet, a lefordítás startjelétöl kezdve a fentebb említett mególlítójelig. A kívánt termék akkor képződik, ha a riboszóma kötési helyét kódoló szekvenciák megfelelően helyezkednek el az AUG indító kodonhoz képest, és ha valamennyi többi kodon követi fázisban az indító kodont. A képződő terméket úgy különítik el, hogy a .gazda sejtet elbontják és megfelelő tisztítást alkalmaznak a többi baktériumfehérje eltávolítására.
Megfigyeltük, hogy a DNS-rekombinációs technológia alkalmazása - azaz interferon gének beillesztése mikrobiológiai termelő közegekbe és termelése a mikrobiológiai génsTabályozó elemek irányításával - a leghatékonyabb módon szolgáltat nagy mennyiségű leukocita interferont. Az igy nyert interferon - az emberi eredetű anyagtól eltérően - nem glikozilezett ugyan, felhasználható azonban sokféle vírusos és daganatos megbetegedés gyógyítására.
A találmány szerint a következőképpen állítottuk elő az első leukocita gént:
(1) Homogenitás eléréséig tisztított emberi leukocita interferon részleges aminosav-szekvenciáit felhasználtuk szintetikus DNS mintákból álló sorozatok létrehozásához. Ezek kodonjai a részleges aminosav-szekvenciók kódolására képes összes lehetséges nukleotid-kombinációnak megfelelnek.
(2) Indukált üzenethordozó ribonukleinsav felhasználásával kiegészítő dezoxiribonukleinsavat (cDNS) tartalmazó baktériumtelepek készletét készítettük el. Radioaktív izotóppal jelzett más indukált mRNS-t hibridizáltunk a fenti telepekből származó cDNShez. A hibridizáló mRNS-t eluáltuk és megvizsgáltuk az interferonba történő lefordításra oocyta teszttel. A telepekből nyert plazmid DNS-t, amely ilyen módon interferon aktivitást váltott ki, tovább vizsgáltuk a fenti (1) pontban leírt mintákhoz való hibridizálásra.
(3) A (2) pontban ismertetett műveletekkel párhuzamosan a plazmidokba bevitt, indukált mRNS eredetű cDNS-t felhasználtuk transzformáns telepek készletének előállítására. Az (1) pont szerinti mintákat alkalmaztuk a radioaktív izotóppal jelzett egyszálú cDNS szintézisének beindítására, hibridizált minták létrehozása céljából. A szintetikus mintákat indukált mRNS-val, mint templóttal hibridizáltuk és a fordított átírással meghosszabbítottuk. Ekkor indukált, radioaktív izotóppal jelzett cDNS-t kaptunk. Az ilyen módon nyert, radioaktív izotóppal jelzett cDNS-hez hibridizált, telep-készletből származó kiónokat Tovább tanulmányoztuk, hogy igazoljuk a teljes hosszúságú interferont kódoló gén jelenlétét. Az (1) vagy (2) pont szerint előállított bármilyen részleges hosszúságú, feltételezett géntöredék maga is felhasználható a teljes hosszúságú gén kimutatáséra.
(4) A fentiek szerint nyert, teljes hoszszúságú gént szintetikus DNS alkalmazásával átalakítottuk, hogy eitávolilsuk az esetleges vezető szekvenciát, amely megakadályozhatja az érett polipeptid mikrobiológiai kifejeződését, és hogy biztosítsuk a megfelelő elhelyezkedést a kifejeződő közvetítőben a startjelekhez és a mikrobiológiai promotor riboszóma kötési helyéhez képest. A termelt interferont ezután addig tisztítottuk, hogy lehetővé váljon az azonosítása és aktivitásának meghatározása.
(5) A fentiek szerint készített interferon géntöredéket felhasználtuk hibridizációval más, részlegese a homológ leukocita interferonok kimutatásánoz.
A DNS-rekombinációs eljárások fenti módon történő alkalmazásával jó kitermeléssel sikerült mikrobiológiai úton előállítani nagy tisztaságú, homológ, glikozílezetlen leukocita interferonokat, mint érett polipeptideket, gyakorlatilag a megfelelő elöszekvencia vagy annak részei nélkül. Ezek az interferonok közvetlenül előállithatók, elkülöníthetők és tisztíthatok, úgy, hogy a kapott termék felhasználható állatok és emberek vírusos vagy daganatos megbetegedéseinek kezelésére. Az eddig előállított interferonok hatékonyaknak bizonyultak az in vitro vizsgálatok úorán, sőt, in vivő vizsgálatokban is. Ez utóbbiaknál az első alkalommal került felhasználásra mikrobiológiai úton termeit érett leukocita interferon.
Az .érett leuk ocita interferon kifejezésen a leírásban mikrobiológiai (például bakteriális) úton termelt interferon molekulát értünk, amely glikozil-csoportokat nem tartalmaz. A találmány szerinti érett leukocita interferon lefordítási startjel (ATG)-től azonnal kifejeződik, közvetlenül a természetes termék első aminosav kodonja előtt. Az .érett polipeptid ennek következtében a szekvenciája első a ninosav jaként az ATG által kódolt metionint tartalmazhat anélkül, hogy a jellege lényegesen megváltozna. Másrészt, a mikrobiológiai .gazda átalakíthatja a lefordítás termékét, eltávolítva így a metionint.
Az érett leukocita interferon egy összekapcsolt fehérjével együtt is képződhet, amely eltér a szokásos vezetőtől, s specifikus módon hasítható sejten belüli vagy sejten kívüli környezetben (lásd a 2 007 676 A sz. nagy-britanniai publikált szabadalmi leírást).
Végül az érett interferon egy mikrobiológiai .jel pepiidhez kapcsolva is képződhet, amely az összekapcsolt terméket a sejtfalhoz szállítja, ahol a jel lekapcsolódik, és az érett polipeptid kiválasztódik.
Az érett leukocita interferon .kifejeződés ’-en olyan interferon molekula baktei'iális vagy más mikrobiol· -giai úton történő termelését értjük, amely sem glikozil-csoportokat, sem olyan elószekvenciát nem tartalmaz, amely azonnal kiváltja egy emberi leukocita interferon genom mRNS lefordítását.
Egyes leukocita interferon fehérjéket úgy azonosítottunk, hogy meghatározott öszszetételü DNS gén ; 3. és 8. ábra) felhasználásával deduktív módon megállapítottuk az aminosav-szekvenciákat (4. és 9. ábra). Nyilvánvaló, hogy ezeknél az interferonoknál ahogyan valamennyi, találmány szerinti leukocita interferon fehérjénél - természetes allél-változatok fordulnak elő. Ezeket a változatokat az jellemezheti, hogy egy vagy több aminosavban különbözik a teljes szekvencia, vagy a szekvenciában egy vagy több aminosavat érintő kihagyások, helyettesítések, beillesztések, sorrendcserék vagy kiegészítések találhatók.
A találmány minden egyes leukocita interferon fehérjénél (LelF) az egyes alléi változatokra is kiterjed, amelyeket LelF A LelF J megjelöléssel látjuk el.
Az ábrák leírása:
Az 1. ábrán két olyan aminosav-szekvenciát ismertetünk, amely megtalálható volt valamennyi, emberi fehérvérsejtből elkülönített és homogénre tisztított. interferonnál. A két aminosav-szekvenciát T-l illetve T-13 jelöléssel láttuk el. Az ezeket a peptideket kódoló összes lehetséges mRNS szekvenciát bemutatjuk, a megfelelő DNS szekvenciákkal együtt. Az A, T, G, C illetve U betű az adenin, timin, guanin, citozin illetve uracil bázisokat tartalmazó nukleotidokat jelöli. Az N betű az A, G, C és U nukleotidok bármelyikére vonatkozik. A polinukleotidok ábrázolása az 5’ (baloldali) végtől a 3’ (jobboldali! vég irányába történik, a kétszálú (d.s.) DNS-nél pedig megfordítva az alsó vagy nem kódolt ágra vonatkozólag.
A 2. ábrán 32P izotóppal jelzett szintetikus dezoxioligo-nukleotidokkal hibridizált LelF plazmidok autorádiogramja látható.
A 3. ábra nyolc géntöredék nukleotid szekvenciáit mutatja be (a kódolt ágakat). Ezeket a géntöredékeket, amelyeket A ... H betűkkel jelöltük, leukocita interferonok előállításához történő felhasználásra különítettük el. Minden egyes leukocita interferonnál aláhúztuk az ATG lefordítás beindító kodont és a lezáró triplettet. A megállító kodonok vagy lezáró triplettek után 3’ leforditatlan tartományok következnek. A LelF A-ra vonatkozó teljes hosszúságú génből hiányzik egy kodon, amely megtalálható a többi feltüntetett interferonban, amint azt a 3. ábra harmadik A sora jelzi. Az 5’ leforditatlan tartomány megelőzi a vezető szekvenciáit. Az elkülönített E töredékből hiányzik a teljes vezető, tartalmazza azonban a vélt érett LelF E-re vonatkozó egész gént. Az elkülönített G töredékben nincs jelen az egész kódoló szekvencia.
A 4. árán a nukleotid szekvenciák alapján meghatározott nyolc LelF fehérjét hasonlítjuk össze. Azokat az egybetűs rövidítéseket használjuk, amelyeket a IUPAC-IUB biokémiai nomenklatúrával foglalkozó bizottsága ajánl:
A lalanin), C (cisztein), D (aszparaginsav), E (glutaminsav), F (fenilalanin), G (glicin), H (hisztidin), I (izoleucin), K (lizin), L (leucin), M (metionin,, N (aszparagin), P (prolin), <3 (glutamin), R (arginin), S (szerin), T (treonin), V (valin), W (triptofán) és Y (tirozin,.
A számok az aminosavak helyzetére vonatkoznak (S a jel peptidre vonatkozik,. .A 11' a valamennyi LelF-ben (a pszendogén LelF E kivételével) közös aminosavakra vonatkozik.
A 165 aminosavból álló LelF A szekvenciában a 44-es helyzetben található vízszintes vonal szerepe az, hogy összevethető legyen a LelF A szekvencia a többi LelF 166 aminosavból álló szekvenciáival. A LelF E szekvencia meghatározásánál figyelmen kívül hagytuk a kódoló tartományában lévő külön nukleotidot (187-es helyzetben a 3. ábrán). A csillagok fázison belüli lezáró kodonokat jelölnek. Olyan aminosavak is láthatók, amelyek valamennyi LelF-ben megtalálhatók, a pszeudogén LelF E kivételével. Az aláhúzott maradékok olyan aminosavak, amelyek emberi fibroblaszt interferonban is jelen vannak.
Az 5. ábra a nyolcféle LelF típussal (A-H) klónozott cDNS-ak restrikciós endonukleáz enzimekkel történő feltárással kapott összetételét szemlélteti. A hibrid plazmidokat a dC : dG alakitó módszerrel hoztuk létre (D. V. Goeddel és munkatársai, Natúré, 287, 411416 /1980/). A cDNS beillesztéseket Pst I enzim alkalmazásával hasíthatjuk le. Az egyes cDNS beillesztések végén található vonalak a szegélyező homopolimer dC : dG végződést jelentik. Jeleztük a Pvu II, Ecolt I és Bgl II restrikciós helyek elhelyezkedését. Az ábra pontozott részei az érett leukocita interferonok kódoló szekvenciáinak felelnek meg, a vonalkázott részek pedig a jelölő peptid kódoló szekvenciáit jelképezik. Az üresen hagyott részek a 3’ és 5' nem-kódoló szekvenciákat mutatják.
A 6. ábra az érett LelF A közvetlen mikrobiológiai szintézisét kódoló gén felépítését mutatja be vázlatosan. A restrikciós helyeket és maradékokat a Pst I stb. jelölés szemlélteti. A b.p. jelölés jelentése bázispár.
A 7. ábra vázlatosan és nem méretarányosan mutatja be a LelF B érett leukocita interferon előállításánál alkalmazott két géntöredék restrikciós enzimekkel meghatározott összetételét. A feltüntetett kodon szekvenciák a kódoló ágak végződései, amelyek a Sau 3a restrikciós enzimmel végzett feltárással képződtek a két megadott esetben.
A 8. és 9. ábrán öt találmány szerinti LelF fehérje, közöttük az I és J típus DNS és aminosav-szekvenciáit adjuk meg (a betűk jelentését illetően lásd a 4. ábrához adott magyarázatot,. A 9. ábrán a csillag lezáró kodont jelöl a megfelelő DNS szekvenciában, a vonal pedig törlést vagy hiányt jelez a szekvenciában.
A találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük:
A. Az alkalmazott mikroorganizmusok
Munkánk során elsősorban két mikroorganizmus törzset használtunk: Escherichia coli x 1776 (amelyet a 4 190 495 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek) és Escherichia coli K-12 294 (végződés A, thi, hsr, hsmi?, (amelyet a 2 055 382 A sz. nagy-britanniai publikált szabadalmi bejelentésben ismertetnek,. Mindkét törzs az American Type Culture Collection mikroorganizmus-gyűjteményben lett deponálva ATCC 31537 illetve 31446 számon. Az összes DNS-rekombinációs kísérletet az amerikai egyesült államokbeli National Institutes of Health által megadott idevágó irányelvekkel összhangban végeztük.
Jóllehet a találmány szerinti eljárás különösen előnyös változatánál az Escherichia coli x 1776 és Escherichia coli K-12 294 törzset használtuk, azonban más ismert Escherichia coli törzs is alkalmazható, például az Escherichia coli B vagy egyéb mikróbatörzsek, amelyek közül számos deponálva van és beszerezhető az elfogadott mikroorganizmus-gyűjteményektől, mint amilyen az American Type Culture Collection. Lásd ezzel kapcsolatban a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsájtási iratot.
Az alkalmas egyéb mikroorganizmusok közül megemlíthetjük például a következőket: Bacilli, igy Bacillus subtilis, egyéb Enterobacteriaceae, így Salmonella typhimurium és Serratia marcescens. E mikroorganizmusok olyan plazmidokat használnak fel, amelyek reprodukcióra képesek és heterológ gén szekvenciákat tudnak termelni.
Élesztők, például Saccharomyces cerevisiae is alkalmazható .gazda' organizmusként a találmány szerinti interferon fehérjék előállításához, mivel egy élesztő promotor irányitása mellett az ezt kódoló géneket termelnek.
B. Leukocita interferon (LelF) üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS! kinyerése és tisztítása
A LelF mRNS emberi fehérvérsejtekből, általában krónikus csontvelő leukémiában szenvedő betegek fehérvérsejtjeiből nyerhető ki, miután a leukocitákat interferon termelésére serkentettük Sendai vagy Newcastle kór vírusával, a 2 947 134 sz. német szövetségi köztársaségbeli kőzrebocsátási iratban Jéírt módon. Különösen előnyösen a KG-1 megjelölésű sejtvonalból nyerhetjük a LelF mRNS-t, s munkánk során is így jártunk el. A KG-1 sejtvonal heveny csontvelő leukémiás betegtől származik, s Koeffler és Godle irta le (Science, 200, 1153 /1978/).
A sejtvonal könnyen növekszik olyan táptalajon, amelynek összetétele a következő:
RPMI 1640 (Rosewell Park Memóriái Institute),
-510
10% FCS (magzati borjúszérum), hőkezeléssel inaktivált, mM HEPES puffer (N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N’-/2-etán-szulfonsav/), yg/ml gentamicin.
Hetenként két alkalommal altenyészetet készítünk 1-3 részre osztással. A fenti táptalajon termelt sejteket 10% dimetil-szulfoxid hozzáadása után megfagyaszthatjuk.
A KG-1 sejtvonal CRL 8031 számon lett deponálva az American Type Culture Collection (ATCC) mikroorganizmus-gyűjteményben.
A KG-1 sejteket Sendai vagy Newcastle kór vírusával indukáltuk leukocita interferon mRNS termelésére Rubinstein és munkatársai módszerével (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76', 640-644 /1979/). A sejteket az indukálás után 5 órával gyűjtöttük össze, és a ribonukleinsavat a guanidin-tiocianát/guanidin-hidrokiorid eljárással külőnítettül el (Chirgwin és munkatársai, Biochemistry, 18, 5294-5299 /1979/). Hasonló módon különítettük el a ribonukleinsavat az indukálatlan sejtekből. Öli— go(dezoxitimidin) (dT) - cellulóz kromatográfiát és változó szacharóz-koncentrációjú (szacharóz-gradiens) ultracentrifugálást alkalmaztunk a poli(A) mRNS 12S frakciójának elkülönítésére a Green és munkatársai (Arch. Biochem. Biophys., 172, 74-89 /1976/) valamint Okuyuma és munkatársai (Arch. Biochem. Biophys., 188, 98-104 /1978/1 által leírt módon. Az így kapott mRNS interferontitere 8000-10000 egység/ug volt a Xenopus laevis oocyta vizsgálatnál (Cavalieri és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3287-3291 /1977/).
C. A LelF cDNS szekvenciákat tartalmazó tenyészetek készítése pg mRNS-ból hagyományos módon készítettünk kétszálú cDNS-t (Wickens és munkatársai, J. Bioi. Chem. 253, 2483-2495 /1978/ és Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544548 /1979/). A kiegészítő DNS-t a méret alapján frakcionáltuk 6%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel, és 230 g mennyiségű, 500-1500 bázispár méretű anyagot különítettünk el elektroelúcióval. E kiegészítő dezoxiribonukleinsav (cDNS) 100 ng részét dezoxicitidin (dC) farokkal láttuk el Chang és munkatársai szerint (Natúré, 275, 617-624 /1978/), 470 ng pBr322 plazmiddal (ATCC
344) - amelyre a Pst I helyen dezoxiguanozin (dG) farkakat vittünk fel kapcsoltuk össze (Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95-113 /1977/), és felhasználtuk az Escherichia coli x 1776 törzs transzformálására. Hozzávetőleg 130, tetraciklinre rezisztens, ampicillinre érzékeny, transzformált terméket kaptunk 1 ng cDNS-re vonatkoztatva.
Egy második hasonló kísérlet során mintegy 1000, tetraciklinre rezisztens, ampicillinre érzékeny, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformált terméket kaptunk 1 ng cDNS-re vonatkoztatva. Ebben az esetben 600-1300 bázispár közötti méretű cDNS-t nyertünk ki a méret alapján történő frakcionálás után elektroelúcióval a dezoxicitidinnel való farokképzéshez.
D. Szintetikus oligonukleotidok előállítása és felhasználása
Az emberi leukocita interferon számos triptikus töredékében jelenlevő aminosavak szekvenciájának ismerete lehetővé tette a LeJF mRNS különböző tartományait kiegészítő szintetikus dezoxioligonukleotidok megtervezését. A T-l és T-13 triptikus peptideket választottuk ki, mivel az aminosav-szekvenciájuk mindössze 12 illetve 4 undekamer szintézisét tette szükségessé az összes lehetséges kódoló szekvencia biztosításához (1. ábra).
A dezoxioligonukleotid minták 4 sorozatát szintetizáltuk minden egyes szekvenciához. Ezek vagy három (T-1A, B, C, D) vagy egy (T-13A, B, C, D) oligonukleotidot tartalmaztak. A 11 bázisnak megfelelő hoszszúságú kiegészítő dezoxioligonukleotidokat a foszfortriészteres módszerrel vegyi úton szintetizáltuk (Crea és munkatársai, Proc. Náci. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769 /1978/). Négy mintát készítettünk a T-13 sorozatban. A tizenkét T-l mintát 3-3 mintából álló négy csoportban készítettük el, amint azt az 1. ábra szemlélteti.
A T-13 sorozatba tartozó négy különálló mintát és a tizenkét T-l mintát felhasználtuk alaprészként radioaktív izotóppal jelzett egyszálú DNS szintéziséhez. Ez utóbbi hibridizációs mintaként alkalmazható. A templát mRNS vagy a Sendai kór vírusával indukált KG-1 sejtekből kinyert 12S RNS (8000 egység interferonaktivitás per Mg) vagy indukálatlan fehérvérsejtekből elkülönített teljes poli(A) mRNS volt (interferon-aktivitás < 10 egység per Mg)· 32P izotóppal jelzett kiegészítő dezoxiribonukleinsavat készítettünk ezekből az alaprészekből ismert reakciókörülmények alkalmazásával (Noyes és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1770-1774 /1979/).
A reakciókat 60 ul térfogatban végeztük, 20 mM trisz-hidroklorid (trisz/hidroxi-metil/-amino-metán-hidroklorid) (pH = 8,3), 20 mM kálium-klorid, 8 mM magnézium-klorid és 30 mM béta-merkapto-etanol jelenlétében. A reakcióhoz 1 ug mennyiséget használtunk fe! az egyes alaprészekből (azaz összesen 12 ug-ot a T-l sorozathoz és összesen 4 ugot a T-13 sorozathoz), továbbá 2 ug .indukált mRNS 12S frakciót (vagy 10 ug indukálatlan poli(A) mRNS-t), 0,5 mM dATP-t, dCTPt, dTTP-t, 200 mCí (alfa 32P) dCTP-t (Amersham, 2-3000 Ci/mól) és 60 egység fordított transzkriptázt (Bethesda Research Laboratories).
-612
A terméket a reagálatlan izotópos anyagtól 10 ml-es Sephadex'R) G-50 töltetet tartalmazó oszlopon végzett gélszüréssel választottuk el. A töltetet 0,3 n nátrium-hidroxid-oldattal kezeltük 30 percig 70 °C-on az RNS elroncsolása céljából, és sósavval semlegesítettük.
A hibridizációkat a Kafatos és munkatársai által leírt módon végeztük (Nucleic Acids Rés., 7, 1541-1552 /1979/)
E. A pLl-pL30 klánok azonosítása
Bimbóim és munkatársai ('Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 /1979/) gyors plazmidelkülönitó eljárását alkalmaztuk ahhoz, hogy 1-1 Mg plazmid DNS-at állítsunk elő 500, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformációval kapott termékből (lásd a C. pontot). Minden egyes DNS mintát denaturáltunk és három párhuzamos nitrocellulóz szűrőre vittük fel Kafatos és munkatásai eljárása szerint.
A nitrocellulóz szűrők 3 sorozatán lévő 500 plazmid mintát az alábbi komponensekkel hibridizáltuk:
a) az alaprész T-l sorozatával készített, indukált cDNS-val,
b) az alaprész T-13 sorozatával készített, indukált cDNS-val és
c) indukálatlan cDNS-val, amely mindkét alaprész sorozat felhasználásával készült.
A kiónokat akkor tekintettük pozitívaknak, ha erősebben hibridizálódtak az egyik vagy mindkét indukált cDNS mintákkal, mint az indukálatlan mintával. Harminc .pozitív’ kiónt (pLl-pL30) választottunk ki az 500 közül további vizsgalatokhoz.
F. A pL31-pL39 kiónok azonosítása,
LelF géntöredéket tartalmazó plazmid (104. számú) elkülönítése
Az Escherichia coli x 1776 törzsből transzformációval kapott termékeket Grunstein és Hogness tenyészethibridizációs módszerével (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 39613965 /1975/) vizsgáltuk, 32P izotóppal jelzett, indukált mRNS alkalmazásával (Lillenhang és munkatársai, Biochemistry, 15, 1858-1865 /1976/). Az indukálatlan sejtekből kinyert, izotóppal nem jelzett mRNS-at 200 : 1 arányban kevertük össze az izotóppal jelzett, indukált mRNS-val, hogy ellensúlyozzuk a 32P izotóppal jelzett anyagban jelenlevő indukálatlan mRNS-at. Az izotóppal jelzett mRNS hibridizációját előnyösen olyan tenyészetekkel végezzük, amelyek indukált szekvenciákat tartalmaznak. A transzformációval nyert termékek három fajtáját kaptuk:
(1) A tenyészetek 2-3%-a igen erősen hibridizálódott a 32P-mRNS-val.
(2) A tenyészetek 10%-a jelentősen kevésbé hibridizálódott, mint a fenti fi) csoport.
(3) A többi tenyészetnél nem volt kimutatható hibridizáció.
A pozitívnak talált tenyészeteknél (a fenti /1/ és /2/ csoport) megvizsgáltuk az interferonra specifikus szekvenciák jelenlétét olyan vizsgálattal, amely az interferon mRNS és a palzmid DNS közötti specifikus hibridizációtól függ.
Kezdetben 60 erősen pozitív tenyészetet (amelyek a fenti /1/ csoportba tartoznak) tenyésztettünk külön-külön 100 ml M9 táptalajon. Az M9 táptalaj 6 g/l dinátrium-hidrogén-foszfátot, 3 g/l kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g/l nátrium-kloridot és 1 g/l Smmónium-kloridot tartalmaz, s adalékanyagként 20 Mg/ml tetraciklint, 100 Mg/ml diamino-pimelinsavat, 20 Mg/ml timidint és 1 Mg/ml d-biotint adtunk hozzá. A táptalajt autoklávban kezeltük, majd 1 ml steril 1M magnézium-szulfát-oldatot és 10 ml steril 0,01M kalcium-klorid-oldatot adtunk hozzá.
10-10 tenyészetet együttesen (pool) kezeltünk, és a plazmid DNS-t a Clewell és munkatársai által leírt módon (Biochemistry, 9, 4428-4440 /1970/1 különítettük el a kapott hat csoportból. Az egyes palzmid DNS csoportokból 10-10 jug mennyiséget Hind III enzimmel hasítottunk, denaturáltunk és kovalens kötéssel DBM (diazobenziloxi-metil) papírhoz kapcsoltunk.
Minden egyes szűrőhöz 1 pg, indukált sejtekből származó tisztított mRNS-at hibridizáltunk. A hibridizálatlan mRNS-at mosással eltávolítottuk. A specifikus módon hibridizált mRNS-at eluáltuk és Xenopus laevis oocytákkal vizsgáltuk. Ily módon mind a hat csoport negatívnak bizonyult.
gyengén pozitív tenyészetből (a fenti /2/ csoportból) 6 csoportot készítettünk. Közülük öt 10-10 tenyészetet, egy pedig 9 tenyészetet tartalmazott. Az egyes csoportokból elkülönítettük a plazmidokat és a fentebb ismertetett módon megvizsgáltuk. A hat vizsgált csoportból az egyik (K10) lényegesen magasabb szintes hibridizált az interferon mRNS-val, mint a háttér szintje, minden egyes mérés során. A specifikus interferon cDNS klón azonosítása céljából plazmid DNSakat állítottunk elő a K10 csoport 9 tenyészetéből, és külön-külön vizsgáltuk a plazmid DNS-at. A 9 plazmid közül kettő (a 101, és 104. számú) lényegesen a háttérszínt felett kötődött az interferon tnRNS-hoz. A 104. számú plazmidból egyetlen Bgl II restrikciós töí-edéket különítettünk el, amely 260 bázispárt tartalmazott. Ezt a töredéket 32P izotóppal jelöltük Taylor és munkatársai módszerével (Biochim. Biophys. Acta, 442, 324-330 /1976/), és felhasználtuk 400, Escherichia coli K-12 294 törzzsel kapott, transzformált termék független vizsgáltához, in situ végzett tenyészetvizsgáló módszerrel (Grunstein és Hogness, Proc. Natl. Sci. USA, 72, 3961-3965 /1975/). Kilenc olyan tenyészetet (pL-31-pL39) azonosítottunk, amely különböző mér-714 tékben hibridizált ezzel az izotóppal jelzett restrikciós töredékkel.
Ezen túlmenően, az izotóppal jelzett, 260 bázispárból álló töredéket felhasználtuk 4000 különböző, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformálással nyert termék hasonló módon történő független vizsgálatára. 50 olyan tenyészetet azonosítottunk, amely különböző mértékben hibridizált ennél a vizsgálatnál. Az egyik a LelF G töredéket tartalmazta, egy másik a LelF H töredéket, egy további a LelF Hl jelzéssel ellátott töredéket tartalmazta, amely a LelF H-nak nyilvánvalóan megfelelő alléi változat. A képződő hibrid plazmidokat .pLelF H stb. megjelöléssel láttuk el.
G. Az első teljes hosszúságú LelF gén elkülönítése és a szekvenciák meghatározása
Plazmid DNS-at állítottunk elő mind a 39 lehetséges LelF cDNS kiónból és ismételt vizsgálatot végeztünk ugyanazzal a 260 bázispárbói álló DNS töredékkel, Kafatos és munkatársai hibridizációs ejárását alkalmazva (lásd fentebb). Három plazmid (pL4, pL31, pL34) igen erős hibridizációs jelet adott, négy plazmid (pL13, pL30, pL32, pL36) közepesen hibridizált, három plazmid (pL6, pL8, pL14) pedig gyengén hibridizált a DNS töredékkel.
A 39 lehetséges LelF cDNS rekombinációs plazmidot olyan vizsgálatnak is alávetettük, amelynek során 32P izotóppal jelzett szintetikus undekamereket (egyes T-1 alaprészcsoportok vagy egyes T-13 alaprészek) közvetlenül használtunk a hibridizációhoz. A hibridizáció körülményeit úgy választottuk meg, hogy csak tökéletes bázispárositás esetén lehessen kimutatni a hibridizációs jeleket (Wallace és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 6, 3543-3557 /1979/1.
Tehát a 39 klónból a plazmid DNS-at hagyományos elbontással állítottuk elő (Clewell és munkatársai, lásd fentebb), és Biorad Agarose A-50 oszlopon végzett kromatográfiával tisztítottuk.
Mindegyikből 3-3 pg mintát lineárissá tettünk EcoRI enzimmel való kezeléssel, lúgban denaturáltuk és két különálló nitrocellulóz szűrőre vittük fel, 1,5 pg mennyiséget egy-egy szűrőre (Kafatos és munkatársai, lásd fentebb). Az egyes szintetikus dezoxioligonukleotid alaprészeket és alaprészegyütteseket a következőképpen foszforileztük (gamma 32P) ATP-tai (ATP - adenozin-trifoszfát):
pmól oligonukleotidot és 100 pmól (gamma 32P) ATP-ot (New England Nuclear, 2500 Ci/mól) 30 pl 50 mM trisz-hidrokloriddal, 10 mM magnézium-kloriddal és 15 mM béta-merkapto-etanollal elegyítettünk. 2 egység T4 polinukleotid kinázt adtunk hozzá, majd az elegyet 30 percig tartottuk 37 °C-on. A 32P izotóppal jelzett alaprészeket 10 ml térfogatú, Sephadex1®1 G-50 töltetet tartalmazó oszlopokon végzett kromatográfiával tisztítottuk. A hibridizációkat 10® cpm T-13C alaprész vagy 3 x 10® cpm T-1C alaprész alkalmazásával hajtottuk végre, 15 °C-on 14 órán át, Wallace és munkatársai eljárása szerint (lásd fentebb), 6 x SSC-oldatban (1 x SSC-oldat összetétele: 0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M nátrium-citrát, pH = 7,2) és 10 x Denhardt-oldatban (0,2% szarvasmarha szérumalbumin, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% Ficoll). A szűrőket 5 percig mostuk (háromszor) 0 °C-on 6 x SSC-oldattal, szárítottuk és röntgenfilmet tettünk ki az anyag gammasugárzása behatásának. A kapott eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be a 32P izotóppal jelzett T-13C alaprészegyüttesre és a T-1C alaprészre vonatkozólag.
Azt tapasztaltuk, hogy a 104. számú klóntól származó plazmid DNS jelentős mértékben hibridizálódott a T-1C alarészegyüttessel és a T-13C alaprésszel, nem mutatott azonban észrevehető hibridizációt a többi ur.dekanierrel.
Amint az a 2. ábrán látható, a 39 lehetséges LelF plazmid közül több (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) szintén hibridizálódott mindkét alaprésztipussal. A restrikciós analízis azonban azt mutatta, hogy e plazmidok közül az egyik (pL31) egy 260 bázispárból álló belső BglII töredéket is tartalmazott. A pl 31 plazmid PstI enzimmel végzett feltárása azt az eredményt szolgáltatta, hogy a cDNS beillesztés mérete közelítőleg 1000 bázispár.
A pL31 plazmidban lévő egész PstI beillesztés szekvenciáit meghatároztuk, mind a Maxam-Gilbert-féle kémiai módszerrel (Methcds Enzymol.,' 65, 499-560 /1980/), mind pedig a didezoxi-lánclezáró eljárással (Smith, Mcthods Enzymol., 65, 560-580 /1980/1, a
Sau3a töredékek M13 vektorba történő alklónczását követően.
A DNS szekvencia a 3. ábrán látható (.A). A lefordítást megszabó megfelelő .leolvasó keret a rendelkezésre álló fehérje szekvenciákból, az ismert LelF molekulasúlyokból és a három lehetséges leolvasó keretben lévő megállító triplettek viszonylagos elterjedtségéből állapítható meg. E leolvasó keret viszont lehetővé tette az egész LelF aminosav szekvenciájának a meghatározását, beleértve az elő- vagy jel peptidet is.
Az első ATG lefordítást kiváltó kodonban 60 nukleotidot találtunk, a szekvencia 5' végétől kezdve, majd 188 kodon után egy TGA lezáró triplett következett. 342 leforditatlan nukleotid volt a 3’ végen, majd egy poli(A) szekvencia következett. A feltételezett jel peptid (amely feltehetően részt vesz az érett leukocita interferonnak a fehérvérsejtekből való kiválasztásában) 23 aminosav hosszúságú. Az érett leukocita interferont felépítő 165 aminosav számított molekulasúlya 19390.
-816
A pL31 plazmid által kódolt leukocita interferont .LelF A jelöléssel láttuk el. A szekvenciákra vonatkozó adatokból látható (4. ábra -A), hogy a LelF B TI és T13 triptikus peptidjei a LelF A 145-149 illetve 57-61 számú aminosavjainak felelnek meg. Az ebben a két tartományban talált tényleges DNS kódoló szekvenciák a Tl-C alaprészegyüttessel és a T13-C alaprésszel jellemezhetők (lásd a
8. ábrát).
H. Az érett leukocita interferon A (LelF
A) közvetlen termelése
Az az eljárás, amelyet a LelF A-nak mint érett interferon polipeptidnek a közvetlen kifejezése céljából követtünk, egy változata volt az emberi növekedési hormon elöálitására leírt korábbi eljárásnak (Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544-548 /1979/), amennyiben mindkét eljárásnál szintetikus (N-végzödésű) és kiegészítő DNS-ak összekapcsolásáról volt szó.
Amint a 6. ábrán látható, egy Sau3a restrikciós endonukleaz hely célszerűen a LelF A 1. és 3. kodonja között helyezkedik el. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot választottunk ki, amelyek ATG lefordítást kiváltó kodont tartalmaznak, helyreállítják az 1. számú aminosavra (cisztein! vonatkozó kodont és EcoRI .tapadás (sticky) véget hoznak létre. Ezeket az oligomereket a pL31 plazmid 34 bázispárból álló, Sau3a és Avall közötti töredékéhez kapcsoltuk. A képződött, 45 bázispárból álló terméket két további DNS töredékhez kapcsoltuk. Ily módon egy 865 bázispárból álló, szintetikus/természetes eredetű hibrid gén képződött, amely a LelF A-t kódolja, és amelyet megkötnek az EcoRI és PstI restrikciós helyek. Ezt a gént beillesztettük a pBR322 plazmidba az EcoRI és PstI helyek közé. így a pLeiF Al plazmidot kaptuk.
A triptofán szabályozó elem kialakítása (A triptofán szabályozó elem Escherichia coli triptofán /trp/ promotort, operátort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmaz, nélkülözi azonban a lefordítás kiváltásához szükséges ATG szekvenciát.)
A pGMI plazmid (ATCC 31622) hordozza a aLE1413 törlést tartalmazó Escherichia coli triptofán operont (Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 133, 1457-1466 /1978/), és ennek következtében - a trp promotor-operátor rendszer irányítása alatt - olyan őszszekapcsolt fehérjét termel, amely magába foglalja a trp vezető első hat aminosavját és a trp E polipeptidnek mintegy utolsó harmadát (az a továbbiakban LE’ jelöléssel szerepel), valamint az egész trp D polipeptidet.
pg pGMI plazmidot feltártunk a Pvull restrikciós enzimmel, amely öt helyen hasítja a plazmidot. A géntöredékeket ezután EcoRI összekapcsolókkal kapcsoltuk össze (ezek egy önkiegészitő oligonukleotidból állnak, amely szekvenciája pCATGAATTCATG) és így egy EcoRI hasítási hely jött létre, amelyet később egy EcoRI helyet tartalmazó plazmidba lehetett klónozni.
A pGMI plazmidból nyert 20 Mg mennyiségű DNS töredékeket 10 egység Tí DNS-ligázzal kezeltük 200 pmól mennyiségű, az 5’ végén foszforilezett szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 pl Ti DNS-ljgáz pufferoldat (összetétele: 20 mM trisz, pH = 7,6; 0,5 mM adenozin-trifoszfát, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM ditiotreitol) jelenlétében, 4 °C-on, egy éjszakán át. Az oldatot ezután 10 percig hevítettük 70 °C-on az öszszekapcsolás megállítása céljából. Az összekapcsolókat EcoRI feltárással lehasitottuk és a töredéketet - amelyek most EcoRI végeket tartalmaztak - szétválasztottuk 5%-os poliakrilamidgél-elektroforézissel (PAGE). A három legnagyobb töredéket különítettük el a gélről, úgy, hogy először etidium-bromiddal megfestettük, ultraibolya fénnyel történő megvilágításnál a töredékek elhelyezkedését meghatároztuk, és levágtuk a gélből az elkülöníteni kívánt anyagot tartalmazó részeket.
Az egyes géntöredékeket tartalmazó géldarabokat 300 pl 0,1 x TBE pufferoldattal együtt dializáló zsákba helyeztük és 1 órán át végeztünk elektroforézist 100 V feszültséggel 0,1 x TBE pufferoldatban. (A TBE pufferoldat összetétele: 10,8 g trisz bázis,
5,5 g bórsav, 0,09 g etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó 1 liter vízben.) A dializáló zsákból a vizes oldatot eltávolítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk és 0,2 M nátrium-klorid-koncentrációt állítottunk be. A DNS-at etanolos kicsapással nyertük ki a vizes közegből.
A trp promotor-operátor rendszert tartalmazó, EcoRI tapadős végekkel ellátott gént az alábbiakban ismertetett módon azonosítottuk. A töredékeket tetraciklinre érzékeny plazmádba illesztettük, amely a promotor-operátor beillesztése után ellenállóvá vált tetraciklinnel szemben.
A pBRHI plazmid (Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 6, 3267-3287 /1979/) ampicillinnel szembeni rezisztenciát hoz létre, és tartalmazza a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, azonban ehhez kapcsolódó promotor hiányában nem hozza létre ezt a rezisztenciát. Épnek megfelelően a plazmid érzékeny tetraciklinre. Ha beviszünk egy promotor-operátor rendszert az EcoRI helyre, a plazmid rezisztenssé válik tetraciklinnel szemben.
A pBRHI plazmidot (ATCC 37070) EcoRI enzimmel feltártuk, és az enzimet fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval eltávolítottuk. A terméket etanolos kicsapás után vizes közegből nyertük ki. A DNS molekulát külön-külön a fenti három DNS töredék mindegyikével összekapcsoltuk, és az előbbi-918 ekben ismertetett módon Ti DNS-ligázzal kapcsoltuk össze. A reakcióelegyben jelenlevő DNS-at felhasználtuk a megfelelő Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálására, a szokásos módszerekkel (Hershfield és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3455-3459 /1974/). A baktériumokat LB (Luria-Bertani) lemezekre vittük fel, amelyek 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint tartalmaztak. Néhány, tetraciklinre rezisztens tenyészetet kiválasztottunk, a plazmid DNS-at elkülönítettük, és a kivánt töredék jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. A kapott plazmid jelölése: pBRHtrp.
A hepatitisz B vírus genóm EcoRI és BamHI enzimekkel a szokásos módon kapott feltárási terméket a pGH6 plazmid (ATCC 31539) EcoRI és BamHI helyeibe klónoztuk (Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 /1979/). Ekkor a pHS32 plazmidot kaptuk. Ez utóbbit Xbal enzimmel hasítottuk, fenollal extrahéltuk, kloroformmal extraháltuk, és a terméket etanollal kicsaptuk. Ezután 1 pl Escherichia coli DNS-polimeráz I Klenow töredékkel (Boehringer-Mannheim, kezeltük 30 pl polimeráz pufferoldatban (összetétele: 50 mM kálium-foszfát, pH = 7,4; 7 mM magnézium-klorid, 1 mM béta-merkapto-etanol) 0,1 mM dTTP és 0,1 mM dCTP jelenlétében, 30 percig 0 °C-on, majd 2 órán át 37 °C-on. E kezelés hatására az Xbal hasítási hely 5’-nél túlnyúló végénél lévő négy kiegészítő nukleotid közül kettő belép a 3’ véghez:
5’ CTAGA- 5’ CTAGA3’ · T- 3’ TCTKét nukleotid, dC és dT beépült, és az 5’ végződésnél ekkor két túlnyúló nukleotid maradt. A pHS32 plazmidnak ezt a lineáris maradékát (fenolos és kloroformos extrakció, majd vízből etanolos kicsapással történő kinyerés után) EcoRI enzimmel hasítottuk. A nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel választottuk el a kisebb EcoRI-Xbal töredéktől, és elektroelúcióval elkülönítettük. Ezt a pHS32 plazmidból származó, 0,2 pg mennyiségű DNS töredéket a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között a pBRHtrp plazmidból készített triptofán operon mintegy 0,01 pg mennyiségű EcoRI-Taql töredékével kapcsoltuk össze.
A pHS32 töredékét az EcoRI-Taql töredékhez kapcsoló eljárás során a Taql- túlnyúló véget kapcsoljuk az Xbal megmaradt túlnyúló véghez, jóllehet nem áll fenn tökéletes Watson-Crick bázispárosítás:
-T CTAGA- -TCTAGA+ -)
-AGC TCT- - AGCTCTEnnek az összekapcsoló reakcióelegynek egy részét Escherichia coli K-12 294 törzs sejtjeibe transzformáltuk, hökezeitük és ampicillint tartalmazó LB lemezekre vittük át. 24 tenyészetet választottunk ki, 3 ml LB (Luria-Bertani) táptalajon szaporítottuk és a plazmidot elkülönítettük. Hat esetben tapasztaltuk azt, hogy az Xbal hely regenerálódott az Escherichia coli által katalizált DNS párosítás és reprodukciós útján:
-TCTAGA- -TCTAGA->
- AGCTCT- - AGATCTEzek a plazmidok mind EcoRI, mind pedig Hpal enzimmel hasíthatok, és a várt restrikciós töredékeket szolgáltatják. Az egyik, pTrpl4 jelzésű plazmidot felhasználtuk heterológ polipeptidek termelésére az alábbiakban ismertetett módon.
A pHGH 107 plazmid (ATCC 31538) (Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 /1979/) az emberi növekedési hormonra vonatkozó gént tartalmaz, amely 23, szintetikus DNS töredékekből származó aminosav kodonból és 163 olyan aminosav kodonból áll, amely kiegészítő DNS-bói képződött az emberi növekedési hormon üzenethordozó ribonukleinsavjának fordított átírása útján. Ez a gén - jóllehet hiányzanak belőle az emberi növekedési hormon .elő' szekvenciájának kodon jai tartalmaz egy ATG lefordítást kiváltó kodont. A gént 10 pg pHGH 107 plazmidból különítettük el EcoRI enzimmel végzett kezeléssel, majd Escherichia coli DNS polimeráz I Klenow töredékkel, dTTP-vel és dATP-vel végzett kezeléssel, a fentebb tárgyalt módon. Fenolos és kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a plazmidot BamHI-vel kezeltük.
Az emberi növekedési hormon (HGH) génjét tartalmazó töredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel, majd elektroelúcióval különítettük el. A kapott DNS töredék a tetraciklinne) szembeni rezisztenciát biztosító szerkezeti gén első 350 nukleotidját is tartalmazza, azonban hiányzik belőle a tetraciklin promotor-operátor rendszer, és igy ha termelő plazmidba klónozzuk, a betétet tartalmazó plazmidok lokalizálhatok a tetraciklinnel szembeni rezisztencia visszaállésa alapján. Mivel a töredék EcoRI végét kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, a töredéknek egy .tompa' és egy .tapadós vége van, ami megfelelő irányítottságot biztosit, ha később egy termelő plazmidba illesztjük a töredéket.
Ezután a pTrpl4 termelő plazmidot készítettük elő a fenti HGH-gént tartalmazó töredék befogadására. A pTrphl plazmidot Xbal enzinwcl feltártuk, majd a kapott tapadós végeket kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, dATP, dTTP, dGTP és dCTP alkalmazáséval. Fenolos és kloroformos extrakció, végül etanolos kicsapás után a kapott DNS-at BamHI enzimmel kezeltük, és a képződön nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél11
-1020
-elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el. A pTrpl4 plazmidból nyert töredéknek egy tompa és egy tapadós vége van, ami lehetővé teszi a megfelelő irányítottságú rekombinációt a fentebb ismertetett, HGH- 5 -gént tartalmazó töredékkel.
A HGH-gént tartalmazó töredéket és a pTrpl4 aXba-BamHI töredéket hasonló körülmények között kapcsoltuk össze, mint amit fentebb leírtunk. A kitöltött Xbal és EcoRI végek a tompa végek összeillesztésével kapcsolódtak össze, s helyreállt mind az Xbal, mind pedig az EcoRI hely:
Xbal (kitöltött)
EcoRI (kitöltött)
HGH-gén kiváltás
-TCTAG
-AGATC
AATTCTATG-- -TCTAGAATTCTATG->
TTAAGATAO—— -AGATCTTAAGATACXbal EcoRI
Ez a szerkezet a tetraciklinnel szemben rezisztens gént is helyreállítja. Mivel a pHGH 107 plazmid tetraciklinnel szembeni rezisztenciát fejez ki a HGH-génen túl elhelyezkedő promotor (lac promotor) hatáséra, ez a pHGH 207 jelzésű szerkezet tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén kifejezését teszi lehetővé, amelyet a triptofán promotor-operátor szabályoz. Az összekapcsolt terméket Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk és 5 jug/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezeken választottuk ki a tenyészeteket.
A pHGH 207 plazmidot EcoRI enzimmel feltártuk, s poliakrilamidgél-elektroforézissel, s azt követő elektroelúcióval egy olyan, 300 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely tartalmazza a trp proraotort, operátort és a trp vezető riboszóma kötési helyet, hiányzott azonban belőle a lefordítás kiváltásához szükséges ATC szekvencia.
Ezt a DNS töredéket a pLelF A plazmid EcoRI helyéhez klónoztuk. A fentebb módosított trp szabályozót (regulon) (Escherichia coli trp operon, amelyből törölve lett a csillapító szekvencia a termelés szintjének szabályozott megnövelése érdekében) tartalmazó termelő plazmidok előre meghatározott menynyiségben szaporíthatok olyan táptalajokon, amelyek a promotoroperátor rendszer elnyomáséhoz elegendő mennyiségű triptofán adalékanyagot tartalmaznak, majd pedig triptofán hiány idézhető elö a promotor-operátor rendszer elnyomásának megszüntetésére és a kívánt kifejezésének biztosítására.
Közelebbről, az alábbiak szerint járunk el (itt a 6. ábrára hivatkozunk):
250 ug pL31 plazmidot feltártunk PstI enzimmel, és az 1000 bázispárból álló betétet 6%-os poliakrilamidgélen végzett gélelektroforézissel különítettük el. A gélből elektroelúcióval mintegy 40 ug mennyiségben nyertük ki a töredéket, és három alikvot részre osztottuk a további feltáráshoz:
a) A töredék 16 ug mennyiségét részleges feltárásnak vetettük alá 40 egység BglII enzimmel, 45 percig 37 °C-on, és a reakcióelegyet 6%-os poliakrilamidgélen tisztítottuk. Körülbelül 2 ug kívánt, 670 bázispárból álló töredéket nyertünk ki.
b) Az 1000 bázispárból álló PstI töredék egy másik, 8 ug mennyiségű részét Avall és BglII enzimmel kezeltük. A 6. ábrán jelzett, 150 bázispárból álló töredék 1 ug mennyiségű gét gélelektroforézissel nyertük ki.
c) Az 1000 bázispárból álló töredék 16 ug mennyiségét Sau3a és Avall enzimmel kezeltük. 10%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézis után közelítőleg 0,25 ug (10 pmól) 34 bázispárból álló töredéket kaptunk.
A két jelzett dezoxioligonukleotidot: 5’-dAATTCATGTGT (1. számú töredék) és 5’-dGATCACACATG (vagyis 3'-GTACACACTAG, 2.
számú töredék) a foszforsavtriészteres módszerrel szintetizáltuk. A 2. számú töredéket a kővetkezőképpen foszforileztük:
200 ul (mintegy 40 pmól, (gamma 32P) adenozin-lrifoszfátot (ATP, Amersham,
5000 Ci/mmól) megszárítottunk, és az alábbi összetételű elegyben szuszpendáltunk: 30 ul 60 mM trisz-hidroklorid (pH = 8), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM béta-merkapto-etanol, 100 pmól DNS töredék és 2 egység T4 polinukleotid kinéz. A reakcióelegyet 15 percig tartottuk 37 °C-on, majd 1 ul 10 mM ATP-ot adtunk hozzá és a reagáltatást további 15 percig folytattuk. Ezután a reakcióelegyet 15 percig melegítettük 70 °C-on, és
100 pmól 5’-OH töredékkel (1- számú) és pmól, 34 bázispárból álló, Sau3a és Avall közötti töredékkel kapcsoltuk össze. Az ószszekapcsolást 5 órán át végeztük 4 °C-on a következő összetételű elegyben: 50 ul 20 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP és 10 egység T4 DNS-ligáz. Az összekapcsolás után a reakcióelegyet elektroforézisnek vetettük alá 6%-os poliakrilamidgélen, és a 45 bázispárból álló terméket elektroelúcióval nyertük ki.
A 45 bázispárból álló termék 30 ng (1 pmól) mennyiségét 0,5 ug (5 pmól) Avall—BglII töredékkel (150 bázispárból áll) és
1 ug (2 pmól) BglII-PstI töredékkel 1670 bázispárból áll) kapcsoltuk össze, 20 °C-on 16 órán át, 20 egység T4 DNS-ligáz alkalmazásával. A Iigázt 10 percig 65 °C-on történő hevítéssel inaktiváltuk. A reakcióelegyet ezután
EcoRJ és PstI enzimmel kezeltük a gén poli12
-1122 merjei eltávolítása céljából, majd 6%-os poliakrilamidgéllel végzett elektroforézissel tisztítottuk. Mintegy 20 ng (0,04 pinól) mennyiségű, 865 bázispárból álló terméket különítettünk el. Ennek felét (10 ng) 0,3 Mg 5 pBR322 plazmidba kapcsoltuk, az EcoRl és PstI részek közé, majd a terméket Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformációval 70 transzformánst kaptunk, amelyek tetraciklinre rezisztensek, ampicil- pj linre érzékenyek voltak. Közülük 18 transzformánsból elkülönített plazmid DNS-at EcoRl és PstI enzimmel feltártunk. A 18 plazmid közül 16 esetben az EcoRI-PstI töredék 865 bázispár hosszúságú volt. Az egyikből (pLelF 15 Al) 1 ug mennyiséget EcoRl enzimmel feltártunk és 0,1 ng, 300 bázispárból álló EcoRl töredékhez kapcsoltunk. Ez utóbbi töredék az Escherichia coli trp promotort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazta, s a 20 fentebb ismertetett módon lett előállítva. A trp promotort tartalmazó transzformált termékeket 32P izotóppal jelzett trp minta és a Grunstein-Hogness-féle telepvizsgáló eljárás alkalmazásával azonosítottuk. A trp töredék- 25 ben aszimmetrikusan elhelyezkedő Xbal hely lehetővé tette azoknak a rekombinált termékeknek a meghatározását, amelyekben a trp promotort a LelF A génnek megfelelően volt irányítva. 30
I. .4 LelF A in vitro és ín vivő aktivitása
A következőképpen készítettünk extrák- 35 tumokat interferon-vizsgálathoz:
A H. szakaszban leírt módon kapott transzformáns 1-1 ml tenyészetét szaporítottunk húsleves táptalajon, amely 5 ug/ml tetraciklint tartalmazott. A szaporítást 1,0 40 körüli Asso-értékig végeztük, majd 5 Mg/ml tetraciklint tartalmazó 25 ml M9 táptalajjal hígítottuk. Amikor az A550 értéke 1,0 lett, 10-10 ml mintát különítettünk el centrifugálással. A sejt szemcséket 1 ml 15%-os szacha- 45 róz-oldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH = 8,0) és 50 mM etilén-dianiin-tetraecetsavat tartalmazott. 1 mg lizozimot adtunk hozzá, 5 percig tartottuk 0 °C-on, majd a sejteket ultrahanggal történő kezeléssel szétválasztottuk. A mintákat 10 percig centrifugáltuk 15000/perc fordulatszámon, és a felülúszó folyadék interferonaktivitását standard LelF mintákéval összehasonlítva határoztuk meg a citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata alapján. A sejtenként! interferonmolekulák számának meghatározásához 4 x 10s egység/mg fajlagos aktivitású leukocita interferont használtunk.
Amint az az 1. táblázatban látható, a pLelF Λ trp 25 plazmid - amelyben a trp promotort a kívánt irányítottsággal illesztettük be - nagy aktivitást mutat (2,5 x 108 eg/ség per liter). A 2. táblázatból az tűnik ki, hogy a pLelF A trp 25 promotort tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs által termelt interferon autentikus emberi leukocita interferonként viselkedik; ellenáll a pH = 2 értéken történő kezelésnek, és semlegesítik a nyúl antihumán leukocita antitestek. Az interferon látszólagos molekulasúlya közelítőleg 20.000.
Az interferon in vivő hatékonyságához makrofág és természetes ölő sejtek (NK) jelenlétére van szükség, és úgy tűnik, hogy az in vivő hatásmódhoz hozzátartozik ezeknek a sejteknek a stimulálása. Ezért fennáll annak lehetősége, hogy a pLelF A trp 25 promotort tartalmazó Escherichia coli 294 törzs által termelt interferon - jóllehet vírusölő aktivitással rendelkezik a sejttenyészetben végzett vizsgálatnál - esetleg nem hatékony a vírussal fertőzött állatokban. Emellett a bakteriális úton termelt, glikozil-csoportokat nem tartalmazó LelF A vírusölő aktivitása eltérő lehet az emberi fehérvérsejt eredetű, glikozilezett leukocita interferonétól. Ezért, a bakteriális úton szintetizált LelF (2%-os tisztaságú) biológiai aktivitását összehasonlítottuk a fehérvérsejtekből kinyert Le.F (8%-os tisztaságú) selyemmajom halálos enlcefalo-miokarditisz (EMC) vírusfertőzésére gyakorolt hatásával (3. táblázat).
1. táblázat
Escherichia coli extráktumokbán mért interferon-aktivitás
Escherichia coli K-12 294 törzs, amelyet az alábbi plazmiddal transzformáltunk
Sejtsűrűség, sejt/ml
Interferonaktivitás, egység/ml tenyészet
LelF molekula per sejt pLelF A trp 25 3,5 χ 108 pLelF A trp 25 1,8 χ 109
36000
250000
9000
12000
-1224
2. táblázat pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs extraktuma aktivitásának összehasonlítása a standard leukocita interferon aktivitásával*
Interferonaktivitás, egység/ml Kezeletlen pH = 2 Nyúl antihunián leukocita antitestek pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs extraktuma Standard LelF
500 500 < 10
500 500 < 10 * A pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs 250.000 egység/ml fajlagos aktivitású, az 1. táblázatban szereplő extraktumát esszenciális táptalajjal 500-szorosra hígítottuk, hogy a fajlagos aktivitása 500 egység/ml legyen. Egy standard leukocita interferont (Wadley Institute), amelynek aktivitását előzetesen titrálással meghatároztuk a NIH standard leukocita interferonhoz képest, szintén 500 egység/ml végső fajlagos aktivitásra állítottunk be. 1-1 ml alikvot részeket 1 N sósavval pH = 2 értékig savanyítottunk, 4 °C-on 52 órán át inkubáltunk, nátrium-hidroxid hozzáadásával semlegesítettünk, és meghatároztuk az inter20 feronaktivitást a hagyományos CPE gátlási vizsgálattal. Az 500 egység/ml fajlagos aktivitású (kezeletlen) minták 25 μί térfogatú alikvot részeit 60 percig inkubáltuk 25 ul nyúl antihumán leukocita interferonnal
37 °C-on, majd 5 percig centrifugáltuk 12000 g értéken, és a felülúszó folyadékot megvizsgáltuk.
3. táblázat
Különféle LelF készítmények vírusellenes hatása selyemmajmok EMC vírusfertőzésére
Szérum vérlemezke képződés, egység/ml
Kezelés Túlélők 2. nap 3. nap 4. nap
Kontroll 0/3 iO] 3 x ΙΟ4-! ιοη
(baktériumfehérjék) 0 > 3 0 . 10“ 1200 t >3,4 x 104
oj 0 J oj
Bakteriális eredetű
LelF A 3/3 0 0 0
0 0 0
0 0 0
Standard LelF 3/3 0 0 0
0 0 0
0 0 0
Az összes majom hím volt (átlagos test- 50 súly 713 g), és a fertőzés elótt nem rendelkeztek EMC vírus-antitestekkel. A majmokat intrarauszkulárisan fertőztük meg az EMC vírus LDso-értékének százszoros mennyiségével (az IDso-érték meghatározása egéren tör- 55 tént). A kontroll csoportba tartozó, megfertőzött majmok 134, 158 illetve 161 órával a fertőzés után elpusztultak. Az interferonos kezelések - 10® egységgel - intravénás beadással történtek a fertőzés előtt 4 órával, 60 illetve utána 2, 23, 29, 48, 72, 168 és 240 órával. A bakteriális eredetű leukocita interferon a pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs elbontott extraktumának oszlopkromatográfiával el- 65 különített frakciója volt, s 7,4 x 10® egység/mg fehérje aktivitással rendelkezett. A kontrollként alkalmazott bakteriális fehérjék a pBR322 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs elbontott extraktumának megfelelő oszlopkromatográfiás frakciójából származtak, a teljes fehérjekoncentráció kétszerese mellett. A standard leukocita interferon normális emberi fehérvérsejtekből Sendai vírussal kiváltott interferon volt, amelyet kromatográfiás úton 32 x 10® egység per mg fehérje fajlagos aktivitás eléréséig tisztítottuk.
A kontroll csoportba tartozó állatoknál egyre erősebb levertség, egyensúlyvesztés, a hátsó lábak bénultsága és a szemek vizese-1326 dése volt megfigyelhető körülbelül 8 órával a halál beállta előtt.
Az interferonnal kezelt állatoknál nem tapasztaltuk ezeket a tüneteket. Végig tevékenyek voltai, virémia nem alakult ki.
Az az egyetlen majom a kontroll csoportban, amelynél nem fejlődött ki virémia 4 nap elteltével, a legkésőbb pusztult el (164 órával a fertőzés után), s a tetemnél nagy virustitert mértünk a szívben és az agyban. Az interferonnal kezelt majmokban nem fejlődtek antitestek az EMC vírussal szemben, amint azt a fertőzés utáni 14. és 21. napon végzett meghatározásoknál tapasztaltuk.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a leukocita interferon készítmények vírusellenes hatása a megfertőzött állatokban egyedül az interferonnak tulajdonítható, mivel a szennyező fehérjék egészen különbözőek a bakteriális eredetű és a standard készítményeknél. A kapott eredmények azt is jelzik, hogy a glikozil-csoportok jelenléte nem szükséges a LelF A in vivő vírusellenes aktivitásához.
J. A kiegészítő dezoxiribonukleinsavak elkülönítése további leukocita interferonokhoz
A teljesen jellemzett LelF A cDNS-tartalmú plazmidból DNS-at hasítottunk ki Pstl enzimmel, poliakrilamidgél-elektroforézissel elkülönítettük és 32P izotóppal megjelöltük. Λ kapott, radioaktív izotóppal jelzett DNS-at felhasználtuk az Escherichia coli K-12 294 törzzsel nyert további transzformansok vizsgálatához. E transzformánsokat az F. pontban leírt módon állítottuk eiő, Grunstein és Hogness in situ tenyészetvizsgáló eljárásával (lásd fentebb). Azokat a telepeket különítettük el, amelyek az izotóppal jelzett mintával különböző mértékben hibridizáiódtak. Ezekből a tenyészetekből és a G. pontban említett tiz hibridizáló tenyészetből a plazmid DNS-at Pstl enzimmel történő hasítással különítettük el és három különböző módszerrel jellemeztük:
Először, ezeket a Pst töredékeket a restrikciós endonukleáz enzimekkel (BglII, PvuII és EcoRI) való feltárási jellemzőkkel vizsgáltuk. Ez az analízis legalább nyolc különféle típusra való felbontást tett lehetővé (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF il), amint az az 5. ábrán látható. Ezzel megközelítettük a különböző restrikciós hasításoknak a jelenleg ismert LelF A elöszekvencióhoz és kódoló szekvenciához viszonyított elhelyezkedését. Úgy véljük, hogy az egyik típus, a LelF D azonos azzal, amelyről Nagata és munkatársai (Natúré, 284, 316-320 /1980/) beszámolnak.
Másodszor, bizonyos dezoxiribonukleinsavakat a Cleveland és munkatársai által leírt (Cell, 20, 95-105 /1980/) hibridizációs kiválasztási teszttel vizsgáltuk. Ennél a tesztnél azt a képességet nézzük, amely biztosítja a LelF mRNS szelektív eltávolítását a politAl-tartalmú KG-1 sejt ribonukleinsavjábol.
Harmadszor, az utóbbi Pst töredékeket beillesztettük egy termelő plazmidba, Escherichia coli K-12 294 törzset transzformáltunk a plazmiddal és a törzs a töredékeket termelte. A kapott termékek - feltehetően elő-interferonok - mindegyike mutatott interferonaktivitást a CPE teszt során, bár a LelF F töredék esetében az aktivitás csekély mértékűnek bizonyult.
A fentiekben túlmenően valamennyi fentebb ismertetett LelF típus szekvenciáit is meghatároztuk.
K. Egy második érett Jeukocita interferon (LelE B) közvetlen expressziója
Az érett LelF B-hez szükséges gént tartalmazó elkülönített töredék szekvenciája azt mutatja, hogy a LelF A és LelF B első 14 nukleotidja azonos. Ennek megfelelően elkülönítettük a pLelF A trp 25 plazmidból egy olyan töredéket, amely tartalmazza a trp promotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet és a LelF A (= B) gén kezdetét és összekapcsoltuk a B szekvencia további részével egy termelő plazmidban. A pL4 klón Pst hasítási töredékére és a pLelF A 25 promotorra vonatkozó restrikciós térkép a 7a. illetve 7b. ábrán látható. (A pL4 a LelF B Pst-végződésű, az 5. ábrán vázolt génjét tartalmazza.)
Ahhoz, hogy megkapjuk a közelítőleg 950 bázispárból álló, Sau3a és Pstl közötti töredéket a 7a. ábrán bemutatott szekvenciából, különböző lépésekre volt szükség egy vagy több zavaró Sau3a restrikciós hely jelenléte miatt:
1. Az alábbi töredékeket különítettük el:
a) Sau3a és EcoRI közötti, 110 bázispárból álló töredék,
b) EcoRI és Xba közötti, 132 bázispárbói álló töredék,
c) Xba és Pst közötti, 700-nál több bázispárból álló töredék.
2. A fenti la) és lb) töredéket összekapcsoltuk és Xba és BglII enzimmel szétvágtuk, hogy elejét vegyük a Sau3a és Xba végződéseken keresztüli önpolimerizációnak (a Sauda hely a BglII helyen belül volt, a BglII hasításnál tapadós Sau3a végződés maradt vissza). Egy 242 bázispárból álló töredéket különítettünk el.
3. A fenti 2. pont és az le) pont szerinti terméket összekapcsoltuk és szétvágtuk Pstl és BglII enzimekkel, az őnpolimerizáció megakadályozására. Egy közelítőleg 950 bázispárból álló töredéket különítettük el, amely a 7a. ábrán látható Sau3a és Pstl közötti résznek felel meg. Ez a töredék tartalmazta a LelF B génnek azt a részét, amely nem közös a LelF A génnel.
-1428
4. A pLelF A trp 25 plazmidból egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (HindlII és Sau3a közötti rész) különítettünk el, amely tartalmazta a LelF Λ trp promotor-operátor rendszerét, riboszóma kötési helyét, ATG beinditójelét és cisztein kodonját.
5. A pBR322 plazmidból egy kőzelitöleg 3600 bázispárból álló, a PstI és Hindin közötti töredéket különítettünk el. Ez tartalmazta a replikont és kódolta a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát, nem kódolta azonban az ampicillinnel szembeni rezisztenciát.
6. A 3., 4. és 5. pont szerinti lépésekben kapott töredékeket összekapcsoltuk, és a kapott plazmidot Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk.
A transzformált termékeket megvizsgáltuk (Bimbóim és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 /1979/1, és a plazmid mintákat EcoRI enzimmel feltártuk. A feltárás három töredéket szolgáltatott, amelyek a kővetkezőkre jellemzők:
1) EcoRI - EcoRI trp promotor töredék;
2) a PL4 klón belső EcoRI - EcoRI töredéke; és
3) a pL4 klón EcoRI töredékéig terjedő, fehérjelefordítást kiváltó startjel.
A CPE vizsgálat azt az eredményt adta, hogy a fenti módon nyert kiónok bakteriális extrák tu mai bán az inlerferonaktivitás x 106 egység/liter volt, Asso = 1 értéknél. Egy ily módon előállított jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF B trp 7.
L. További érett leukocita interferonok (LelF C, D, F, H, I és J1 közvetlen expressziója
Más LelF típusokat tartalmazó további, teljes hosszúságú géntőredékek állíthatók össze és vihetők be termelő közegekbe, ugyanúgy, mint a LelF A esetén. Az ismert módon történő szekvenciameghatározés feltárja, hogy egy restrikciós hely elég közel fekszik-e az érett interferontípus első aminosav kodonjához, hogy ezáltal lehetővé tegye a fenti H. pontban ismertetett módszer alkalmazását, azaz az előszekvencia eltávolításét restrikciós hasítással, és az ennek során eltávozott, a N-terminális aminosavakra vonatkozó kodonok pótlását szintetikus DNS töredékkel való összekapcsolással. Ha ez nem lehetséges, a következő eljárás , alkalmazható:
Az előszekvenciát tartalmazó töredéket pontosan azon a helyen hasítjuk el, ahol az érett polipeptid első aminosavjára vonatkozó kodon kezdődik, úgy, hogy
1. a kétszálú DNS-at egyszálú DNS-vá alakítjuk az illető helyet körülvevő tartományban;
2. az egyszálúvá alakított tartományhoz egy kiegészítő alaprészt hibridizálunk az egyszálú DNS-ból, úgy, hogy az alaprész 5’ vége a tervezett hasítási hely melletti nuk16 leotiddal szemközt helyezkedjen el;
3. az 1. pont szerinti művelet során a második szálból eltávolított részt helyreállítjuk. Ez az alaprészhez képest a 3’ irányban helyezkedik el. A helyreállítást DNS-polimerázzal végezzük, adenint, timint, guanint és citozint tartalmazó dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében; és
4. a DNS megmaradt egyszálú részét amely túlnyúlik a tervezett hasítási ponton felLárj uk.
A kódoló szól 3’ végénél végződő, rövid, szintetikus DNS, amely tartalmazza a lefordítást kiváltó ATG jelet, hozzákapcsolható például tompa végződésen keresztül az érett interferonokra vonatkozó, kapott génhez, a gén pedig termelő plazmidba illeszthető és egy promotor és az azzal kapcsolatos riboszóma kötési hely irányítása alá vihető.
Hasonló módon, mint ahogy a fenti K. részben ismertettük, előállítottunk a LelF C-t és a LelF D-t kódoló géntöredékeket az említett interferontipusok közvetlen, bakteriális úton történő termeléséhez. Ezeknek a leukocita interferonoknak az előállítása minden esetben egy kőzelitöleg 300 bázispárból álló töredéken alapult (HindlII és Sau3a közötti rész), amely a trp promotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet, az ATC beindító jelet és a LelF A interferonnak a pLelF A trp 25 plazmidtól származó cisztein kodonját tartalmazza. Ehhez a többi interferon génből nyert géntöredékeket kapcsoltunk, amelyek az egyes aminosav-szekvenciákat kódolták a kezdeti cisztein után, amely mindegyikben megtalálható. Az egyes kapott plazmidokat felhasználtuk az Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálásához. Az illető gének kialakítását célzó összekapcsolásokat a következőképpen végeztük:
LelF C
Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF C pazmidból:
(a) 35 bázispár hosszúságú, Sau3a és Sau96 közötti rész, (b) több mint 900 bázispár hosszúságú, Sau96 és PstI közötti rész, (c) elkülönítettünk egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (HindlII és Sau3a közötti rész) a pLelF A trp 25 plazmidból a fenti K. (4) részben leírtak szerint, (dl elkülönítettük a fenti K. 15) rész szerinti, közelítőleg 3600 bázispárból álló töredéket.
Előállítás:
(1) A fenti (a) és (c) pont szerinti töredéket összekapcsoltuk, majd a kapcsolási terméket BglII és HindlII enzimmel hasitot-1530 tűk és elkülönítettük a körülbelül 335 bázispárból álló terméket.
(2) A fenti (1), (b) és (d) pont szerinti három terméket összekapcsoltuk, és a kapott plazmiddal Escherichia coli K-12 294 Lörzset transzformáltunk. Az így nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF C trp 35.
LelF D
Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF D plazmidból:
(a, 35 bázispár hosszúságú, Sau3a és
Avall közötti rész, (b) 150 bázispár hosszúságú, Avall és
BglII közötti rész, (cl közelítőleg 700 bázispár hosszúságú, BglII és PstI közötti rész.
Elkülönítettük a pLelF A trp 25 plazmidból az alábbi töredékeket:
(d) 300 bázispár hosszúságú, HindlII és Sau3a közötti rész.
Elkülönítettük a pBR322 plazmidból az alábbi töredéket:
(e) közelítőleg 3600 bázispár hosszúságú, HindlII és Pstl közötti rész.
Előállítás:
(1) Összekapcsoltuk a fenti a) és b) pont szerinti töredéket, a terméket BglII enzimmel elhasítottuk és a kapott, 185 bázispárból álló terméket tisztítottuk.
(2) Összekapcsoltuk a fenti (1) és d) pont szerinti terméket, az összekapcsolási terméket Hindii! és BglII enzimmel hasítottuk. Tisztítás után közelítőleg 500 bázispárból álló terméket kaptunk.
(3) A fenti (2) pont szerinti terméket összekapcsoltuk a c) és e) pont szerinti töredékkel, és a kapott plazmiddal Escherichia coli K-12 294 törzset transzformáltunk.
Az igy nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF D trp 11.
LelF F
A LelF F-tartalmü töredéket annak alapján állíthatjuk elő, hogy a LelF B és a LelF F 1-13. számú aminosav jai teljesen homológok.
A fentebb leirt pHGH 207 plazmidból megfelelő konfigurációjú végekkel rendelkező trp promotort tartalmazó töredéket (al állítottunk elő Pstl és Xbal enzimmel végzett feltárás és a körülbelül 1050 bázispárból álló töredék elkülönítése útján. Egy második töredéknek (b) a pHKY‘10 vagy- pBR 322 (ATCC 31344) plazmid Pstl és BglII enzimekkel végzett feltárásánál képződő töredékek közül a nagyobbikat vettük. Az (a) töredék tartalmazza az ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló génnek mintegy felét, a (b) töredék pedig e gén hátralévő részét tartalmazza, továbbá a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló gént, a promotor kivételével.
Az (a) és (b) töredéke^ T4 ligázzal öszszekapcsoltuk, a terméket Xbal és BglII enzimmel kezeltük a dimerizáció kiküszöbölésére. Ekkor a (c) töredéket kaptuk, amely a trp promotor-operátor rendszert, valamint a tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló géneket tartalmazza.
A pLelF F plazmid Avall és BglII enzimekkel végzett feltárásával egy közelítőleg 580 bázispárból álló (d) töredékhez jutottunk. Ez a LelF F 14-166. számú aminosavjaira vonatkozó kodonokat tartalmazza.
A pLelF B plazmid Xbal és. Avall enzimekkel végzett feltárásával az (e) töredéket kaptuk, amely 49 bázispárból áll. Az (e) töredék a LelF F 1-13. számú aminosavját kódolja.
A 1c), (dl és le) töredéket egymáshoz kapcsoltuk T4 ligáz jelenlétében. Az illető töredékek kohéziós végei olyanok voltak, hegy a felépített plazmid megfelelően köralakú lett, és igy a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló gén az érett LelF F-re vonatkozó génnel együtt a trp promotor-operátor rendszer irányítása alá került. Ennek következtében a kívánt plazmiddal transzformáit baktériumokat tetraciklin-tartalmú tápta'ajlemezekeri lehetett kiválogatni. Égy ily módon nyert, jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF F trp 1.
LelF H
Az érett leukocita interferon kifejezéséhez szükséges teljes LelF H gént a következőképpen állítottuk elő:
1. A pLelF H plazmidot Haell és Rsal enzimmel feltártuk, és egy 816 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely a 10. számú jel peptid aminosavtól a 3’ nem-kódoló tartományig terjed.
2. A töredéket denaturáltuk és a DNS poSimeráz 1 Klenow töredékével kezelve (Klenow és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 168 /1970/1 bázispárosító szintézist végeztünk az 5-dATG TGT AAT CTG TCT szintetikus dezoxiribooligonukleotid alaprész alkalmazásával.
3. A kapott terméket Sau3a enzimmel hasítottuk és egy 452 bázispárból álló töredéket különítettünk el. Ez a töredék az 1150. számú aminosavaknak felel meg.
4. A pLelF H plazmidot Sau3a és Pstl enzimmel feltártuk és egy 500 bázispárból álló töredéket különítettünk el. Ily módon olyan gént kaptunk, amely a 150. számú aminosav és a kódoló szekvencia vége közötti aminosavakat kódolja.
5. A fenti 3. és 4. pont szerint elkülönítet- töredékeket összekapcsoltuk, és így egy
-1632 olyan töredéket kaptunk, amely a LelF H 166 aminosavját kódolja:
166 met cys asp megállító
ATG TGT.. | ...GAT TGA_..._PstI
Sau3a
6. A pLelF A trp 25 plazmidot Xbal enzimmel feltártuk, DNS polimeráz I enzimmel tompavégűvé alakítottuk, majd a terméket PstI enzimmel feltártuk. A kapott nagy töredéket elkülönítettük és összekapcsoltuk a fenti 5. pont szerinti termékkel. Olyan expressziós pLelF H plazmidot kaptunk, amely Escherichia coli K-12 294 törzsbe vagy más .gazda' baktériumba transzformálva képes az érett LelF H termelésére.
LelF I
Az emberi genom λ-fág Charon 4A rekombinációs .könyvtár -át, amelyet Lawn és munkatársai hoztak létre (Cell, 15, 1157 /1978/) szűrővizsgálatnak vetettünk alá a leukocita interferon génekre vonatkozólag a Lawn és munkatársai (idézett irodalmi hely), valamint Maniatis és munkatársai (Cell, 15, 687 /1987/) által leírt módon. Egy, a cDNS LelF A klónból származó radioaktív LelF mintát használtunk közelítőleg 500.000 vérlemezke szűrővizsgálatához. Ennek során hat LelF genom kiónt kaptunk. Ismételt szűrővizsgálat és vérlemezke-tisztítás után e kiónok egyikét (xHLeIF2) választottuk ki a további elemzéshez.
A fentebb ismertetett módszer segítségével más mintákat is alkalmazhatunk további LelF kiónoknak az emberi genomból való elkülönítéséhez. Ezek viszont felhasználhatók további leukocita interferon fehérjéknek a találmány szerinti előállítására.
1. A XHLeIF2 klón 2000 bázispárból álló EcoRI töredékét klónozással bevittük a pBR325 plazmidba az EcoRI helynél. A kapott LelF I plazmidot EcoRI enzimmel hasítottuk és elkülönítettük a 2000 bázispártról álló töredéket. A dAATTCTGCAG dezoxioligonukleotidot (EcoRI-PstI átalakító) hozzákapcsoltuk a 2000 bázispárból álló EcoRI töredékhez, majd a terméket PstI enzimmel hasítottuk. így egy 2000 bázispárból álló, PstI végeket tartalmazó töredéket kaptunk. Ezt Sau96 enzimmel elhasitottuk, és egy 1100 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amelynek egy PstI és egy Sau96 vége van.
2. A pLelF C trp 35 plazmidot feltártuk PstI és Xbal enzimmel. A nagy töredéket különítettük el.
3. A pLelF C trp 35 plazmid Xbal és PstI enzimmel végzett feltárásánál képződött kis töredéket Xbal és Sau96 enzimmel feltár18 tűk. Egy 40 bázispárból álló, Xbal-Sau96 töredéket különítettünk el.
4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk, és ilyen módon a pLelF I trp 1 termelő plazmidot kaptuk.
LelF J
1. Az emberi genom λ-fág Charon 4A rekombinációs könyvtárából kiindulva az előző szakaszban leírthoz hasonló módon nyerhető pLelF J plazmid a humán genom-DNS 3,8 kilobázisú, a LelF J génszekvencia HindHI töredékét tartalmazza. Ebből a plazmidból egy 760 bázispárból álló Ddel-Rsal töredéket különítettünk el.
2. A pLelF B trp 7 plazmidot HindHI és Ddel enzimekkel elhasítottuk. Egy 340 bázispárból álló HindlII-Ddel töredéket különítettünk el.
3. A pBR322 plazmidot PstI enzimmel elhasitottuk, DNS polimeráz I (Klenow töredék) enzimmel inkubálva tompa-végűvé alakítottuk, és HindUI enzimmel feltáruk. A nagy (körülbelül 3600 bázispárból álló) töredéket különítettük el.
4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk egymással. így a pLelF J trp 1 termelő plazmidot kaptuk.
M. Tisztítás
A baktériumtenyészetek extraktumainak leukocita interferon tartalmát (és ezzel együtt az interferon tisztaságát) az alábbi, egymást követő műveletekkel növelhetjük:
1. Kicsapás polietilén-iminnel, amelynek során a sejtfehérje legnagyobb része, az interferonnal együtt, a felülúszó folyadékban marad.
2. Frakcionálás ammónium-szulfáttal, amikor az interferon az oldatból átkerül az 55%-os telített ammónium-szulfátba.
3. Az ammónium-szulfát szemcséket 0,06 M kálium-foszfát és 10 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,2) elegyében szuszpendáljuk, és 25 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,9) oldattal szemben dializáljuk (az interferon aktivitás oldatban marad).
4. A fenti felülúszó folyadék pH-értékét 8,5-re állítjuk be és DEAE-cellulóz töltetű oszlopon kromatografáljuk. Az elúciót 25 mM trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 8,5) végezzük, zérusról 0,2 M nátrium-klorid-koncentrációra növelt lineáris grádiens mellett.
5. Adszorpciós Cibachrome Blue-Agarose vagy hidroxil-apatit adszorbensen és elúció
1,5 M kálium-klorid-oldattal illetve 0,2 M foszfát-oldattal (fakultatív).
(>. Molekulaméret alapján történő elválasztás SephadexlH) G-75 oszlopon.
-1734
7. Kationcserélő kromatográfia karboxi-metil-cellulóz segítségével 25 mM ammónium-acetát-oldatban, pH = 5,0 értéken, 0,2 M ammónium-acetát-koncentrációig változtatott gradiens mellett.
Ezzel az eljárással 95% feletti tisztaságú anyagot kapunk.
Az anyagot egyéb módszerekkel is tisztíthatjuk, így méretkizárásos kromatográfiával, fordított fázisú (RP-8) nagynyomású folyadékkromatográfiával vagy rögzített antiinterferon-antitesteken végzett affinitáskromatográfiával.
Úgy is eljárhatunk, hogy a fenti műveletsor 4. pontja szerint nyert anyagot monoklón antitest-oszlopra visszük fel (Milstein, Scientific American, 243, 66 /1980/), majd
0,2 M ecetsavat, 0,1% Tritont és 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal eluáijuk.
Előnyösen úgy is eljárhatunk, hogy a találmány szerint előállított leukocita interferont az alábbi lépésekkel tisztítjuk:
1. A termelt leukocita interferont tartalmazó, szemcsékké fagyasztott sejteket kézi úton vagy alkalmas örlöberendezéssel összetörjük. A részben felengedett sejteket 4 térfogatrész .A pufferoldatban szuszpendáljuk, amelynek összetétele a következő: 0,1 M trisz (7,5-8,0 közötti pH-ra beállítva), 10 vegyes % szacharóz, 0,2 M nátrium-klorid, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 0,1 mM PMSF és 10100 mM magnézium-klorid. A szuszpenziót 4 °C körüli hőmérsékleten tartjuk.
A szuszpenziót homogenizáló berendezésen vezetjük át 41,5 · 106 Pa körüli nyomáson, majd ismét átvezetjük 6,9 10G Pa alatti nyomáson. Mindkét étvezetésnél a homogenizáló berendezésből eltávozott folyadékot jeges fürdővel hűtjük.
2. A homogén anyaghoz 0,35% körüli koncentráció eléréséig lassan polietilén-iminL adunk és körülbelül 30 percig állni hagyjuk. A szilárd anyagot centrifugáljuk vagy szűrjük. Ennél a lépésnél vagy szabályoznunk kell a hőmérsékletet, vagy elég gyorsan elvégezni a műveletet ahhoz, hogy a felülúszó folyadék (illetve szűrlet) hőmérséklete 10 “C alatt maradjon. A felülúszó folyadékot (illetve szürletet) ultraszüréssel az eredeti térfogatának mintegy 1/10-ére koncentráljuk. Λ visszamaradt folyadék esetleges zavarossága megfelelő szűrő, például mikropórusú membrán segítségéve szüntethető meg.
3. A tisztított oldatot közvetlenül egy monoklón antitest-oszlopra vezetjük 5-8 cm/ óra fluxus mellett (például 25-10 ml per óra sebességgel 2,6 cm átmérőjű oszlop esetén). Az oszlopra történő felvitel után az oszlopot a térfogata mintegy tízszeresének megfelelő mennyiségű 25 mM trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,5-8,51 mossuk, amely 0,5 M nátrium-kloridot és felületaktív anyagot (például 0,2% Triton Χ-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmaz. Λ mosás után az oszlopot a térfogata mintegy tízszeresének megfelelő mennyiségű oldattal öblítjük át, amely 0,15 M nátrium-kloridot és felületaktív anyagot (például 0,1% Triton Χ-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmaz. Az oszlopot ezután felületaktív anyagot (például 0,1% Triton Χ-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmazó 0,2 M ecetsav-oldattal eluáijuk. A fehérje maximumnál a monoklón antitest-oszlopról eltávozó folyadékot elegyítjük, és a pH-értékét körülbelül 4,5-re állítjuk be 1 n nátrium-hidroxid-oldat vagy 1,0 M trisz bázis segítségével (a fehérje maximumot az ultraibolya-abszorbancia alapján vagy más alkalmas vizsgálattal határozzuk meg.)
1. Az interferont tartalmazó oldatot olyan kationcserélő oszlopra (például Víhatman CM52 cellulóz vagy vele egyenértékű készítmény) visszük fel, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk alkalmas pufferoldattal, például 50 mM ammónium-acetát-oldattal (pH = 1,5). Az oszlopot az interferon felvitele után addig mossuk a fenti pufferoldattal, amíg a távozó folyadék ultraibolya-abszorbanciája állandó értéket nem ér el. Ezzel biztosítjuk, hogy kevés, az interferontól eltérő fehérje távozzon az oszlopról az elúció során. Az oszlopot ezután 25 mM ammónium-acetátot és 0,12 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal vagy olyan eluálószer-kombinációval eluáijuk, amellyel optimális módon távolítható ei az interferon, és kielégítő megjelenésű és oldhatóságu liofilizált terméket szolgáltat.
A fenti tisztító eljárásnál alkalmazott monoklón antitestek Staehelin és munkatársai eljárásával állíthatók elő (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1848-52 /1981/). A monoklón antitestek tisztítását és Affigel-10 gélhez kovalens kötéssel való kapcsolását az alábbiak szerint végezzük:
Monoklón antitestek előállítása hasvízkórnál képződő váladékból és tisztítása
Ót nőstény Balb/c egeret beoltottunk (5-10) x 10G mennyiségű, közepes növekedési fázisban lévő hybridoma sejttel. A váladékot termelő egerekből vett körülbelül 5 x 10G mennyiségű életképes sejttel intraperitoneálisan beoltottunk 10 vagy még több egeret. Minden egyes egértől ismételten (2-4 alkalommal) összegyűjtöttük a hasvizkóros váladékot. Legfeljebb három alkalommal vihető át a fertőzés az egyik egércsoportról a másikra. Egy-egy átvitel előtt az egerektől vett hasvizkóros váladékokat elegyítettük.
A hasvizkóros váladékból a sejteket és sejttöredékeket 15 percig végzett kissebességű centrifugálással (500-1000 x g) távolítottul; el. Ezután 90 percig centrifugáltuk percenkénti 18.000 fordulatszámon. A felülúszó foyadékot megfagyasztottuk és -20 °Con tároltuk. Felengedés után a még jelenlévő
-1836
20-25 mg/ml értékre állítottuk be a II. pufferoldattal.
fibrint és egyéb részecskéket percenkénti 35.000 fordulatszámon 90 percig végzett centrifugálással távolítottuk el. Minden egyes fertözésátvitelnél az összegyűjtött váladékot megvizsgáltuk a fajlagos antitest-aktivitásra vonatkozólag antitest-megkötő teszttel (Staehelin és munkatársai, idézett publikáció). A kielégítőnek talált váladékokat egyesítettük.
Az oldatok fehérjekoncentrációjának meghatározása azon a becslésen alapult, hogy az 1 cm-es küvettában, 280 nm hullámhoszszúságú fényben 1 mg fehérje abszorbanciája 1,2. A hasvízkórnál képződő, nagy antitest-tartalmú váladék 30-35 mg/ml fehérjét tartalmaz. Ez egyenértékű 4-7 mg/ml antitest-koncentrációval. A folyadékot PBS-vel (0,01 M nátrium-foszfát /pH = 7,3/, 0,15 M nátrium-klorid) 10-12 mg/ml fehérjekoncentrációig hígítottuk.
100 ml hígított oldathoz 90 ml mennyiségű, szobahőmérsékleten telített ammónium-szulfót-oldatot adtunk, lassan, erőteljes keverés közben, 0 °C-on. A szuszpenziót 4060 percig jég között tartottuk, majd 15 percig 10.000/perc fordulatszámon centrifugáltuk 4 °C-on. A felűlúszó folyadékot dekantáltuk és jól leszívtuk. A fehérje szemcséket az I. pufferoldatban oldottuk (0,02 M trisz-hidroklorid /pH = 7,9/, 0,04 M nátrium-klorid). A fehérjeoldatot 16-18 órán át dializáltuk szobahőmérsékleten 100 térfogatrész 1. pufferoldattal szemben. Λ dialízis során legalább egyszer kicseréltük a pufferoldatot. Λ dializált oldatot 10 percig centrifugáltuk 15.000/perc forduiatszámon a feloldatlan anyag eltávolítása céljából. A hasvizkóros állatok váladékában lévő összes fehérje eredeti mennyiségének mintegy 30-35%-át nyeltük ki a 280 nm hullámhosszúságú fénnyel végzett abszorpciós meghatározás alapján.
A 30-40 mg/ml fehérjét tartalmazó oldatot ezután DEAE-cellulózzal töltött oszlopra vittük fel, miután az adszorbenst egyensúlyba hoztuk az I. pufferoldattal. 1-1 g felvitt fehérjéhez legalább 100 ml oszlopágy-térfogátot használtunk. Az antitesteket 0,02 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,9) eluáltuk az oszlopról, miközben a nátrium-klorid-koncentrációt lineáris módon 0,04 M-ról 0,5 M értékre növeltük. A 0,06 M és 0,1 M közötti nátrium-klorid-koncentrációknái összegyűjtött frakciókat egyesítettük, és koncentráltuk azonos térfogatú, szobahőmérsékleten telített ammónium-szulfát-oldattal végzett kicsapással és centrifugálással. Λ fehérjeszemcséket a II. pufferoldatban (0,2 M nátrium- hidrogén-karbonát /pH-érték körülbeül 8,0/ és 0,3 M nátrium-klorid) oldattuk, majd szobahőmérsékleten dializáltuk a II. pufferoldattal szemben. Λ dialízis során háromszor cseréltük ki a pufferoldatot. A dializált oldatokat 15 percig centrifugáltuk 20.000 x g értéken az esetleg jelenlevő oldhatatlan anyag eltávolítása céljából. A fehér jekoncentrációt
Immunadszorbensek készítése
Affigel-10 gélt (BioRad Laboratories, Richmond, California, zsugorított üvegszűrön háromszor mostunk jéghideg izopropanollal, majd ugyancsak háromszor jéghideg desztillált vízzel. A körülbelül 50%-os hideg vizes gélszuszpenziót műanyag centrifugacsövekbe töltöttük és rövid ideig végzett centrifugálással ülepítettük. A felülúszó folyadékot leszívtuk. A gélt összekevertük azonos térfogatú tisztított antitest-oldattal és 5 órán át tartottuk 4 °C-on mozgatás közben. A gél és az antitestet közötti reakció lejátszódása után a gélt. centrifugáltuk, a III. pufferoldatlal (0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát, 0,15 M nátrium-klorid) kétszer mostuk a gélhez nem kötődött antitestek eltávolítása céljából. Az egyesített mosöfolyadékokban végzett fehérjemeghatározás azt mutatta, hogy az antitesteknek több mint 90%-a gélhez kötődött.
A gélben jelenlévő . reagálatlan helyek elzárására a gélt a térfogatával megegyező mennyiségű 0,1 M etanolamin-hidroklorid-oldattal (pH = 8) kevertük össze és 60 percig szobahőmérsékleten tartottuk mozgatás közben. Λ gélszuszpenziót PBS oldattal a reagensektől mentesre mostuk és 4 °C-on PBS oldatban tároltuk, 0,02 vegyes % nátrium-azid jelenlétében.
N. Parentei’ális beadás
A ieukocita interferon beadható parenterálisan olyan személyeknek, akiknél daganatellenes vagy vírusellenes kezelésre van szükség, valamint olyan esetekben, amikor immunszupressziv viszonyok állnak fenn. Az alkalmazott dózis ugyanolyan lehet, mint a jelenleg. klinikai vizsgálat alatt álló, emberi eredetű anyagoké, például körülbelül napi (1-10) χ 106 egység. Olyan anyagok esetében, amelyek koncentrációja 1% feletti, valószínűleg például 5 x 10’ egységig terjedhet a napi dózis.
Például a következőképpen állíthatunk elő egy parenterálisan beadható, gyakorlatilag homogén, bakteriális úton termelt ieukocita interferon készítményt:
mg Ieukocita interferont, amelynek fajlagos aktivitása mondjuk 2 x 10s egység/mg, 25 ml 5%-os humán szérum albuminban oldunk, az oldatot bakteriológiai szűrőn vezetjük át és a szürletet aszeptikus körülmények között 100 ampullába töltjük. Minden egyes ampulla 6 x 10ü egység tiszta interferont tartalmaz, amely parenterálisan beadható. Az ampullákat célszerűen hidegen (-20 °C) tároljuk felhasználás előtt.
-1938
A találmány szerinti polipeptideket önmagában ismert módon gyógyszerkészítményekké alakíthatjuk. Ekkor a polipeptidet gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal/anyagokkal keverjük össze. Az alkalmas vivőanyagokat és gyógyszerformákat például a Remington’s Pharmaceutical Sciences kézikönyv (szerkesztő E. W. Martin) ismerteti. A gyógyszerkészítmények a találmány szerinti interferon fehérje hatékony mennyiségét tartalmazzák, megfelelő mennyiségű vivőanyaggal együtt. Előnyös a parenterálisan beadható gyógyszerkészítmény.

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF A 1166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF A polipeptidet kifejezni képes LelF A trp típusú plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy indukált emberi fehérvérsejt mRNS-ból vagy sejtvonal mRNS-ból, előnyösen a KG-1 sejtvonal (ATCC CRL 8031) mRNS-éből származó cDNS-t tartalmazó baktériumtelep-bankokat állítunk elő, az interferon aktivitás kiváltására képesnek mutatkozó telepekből a plazmid DNS-eket elkülönítjük és ezeket szintetikus DNS vizsgáló mintáknak egy indukált mRNS-ból származó cDNS-sel történő hibridizálása és a hibridizált szintetikus DNS vizsgáló minták reverz transzkripcióval történő hosszabbítása útján kapott, rádióaktiv jelzésű cDNS vizsgáló mintákhoz hibridizáljuk, a legerősebben hibridizáló és a teljes lánchosszúságú LelF A gént tartalmazó kiónokat kiválasztjuk, az emlitett hibridizáló kiónok teljes LelF A génjét szintetikus dezoxioligoriukleotidok alkalmazásával módosítjuk az érett LelF A mikrobiális kifejezését esetleg gátló vezető szekvenciák kiküszöbölése végett, és a kapott terméket egy trp promotort, operatort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazó plazmidba iktatjuk oly módon, hogy a módosított LelF A gén operatíven kapcsolódjék az említett trp szabályozó rendszerrel. (Elsőbbsége: 1980. 07. 01.)
  2. 2. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF B, C, D vagy F 1-166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF B, LelF C, LelF D vagy LelF F kifejezésére képes LelF B trp, LelF C trp, LelF D trp vagy LelF F trp típusú plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy interferon-aktivitás kiváltására képesnek mutatkozó telepekből származó plazmid DNSeket az 1. igénypont szerint kapott teljes lánchosszúságú LelF A génből származó, radioaktív jelzésű DNS-sel hibridizálunk, a hibridizációt mutató és a teljes lánchosszúságú LelF B, LelF C, LelF D vagy LelF F gént tartalmazó kiónokat kiválasztjuk, az említett hibridizáló kiónok teljes lánchosszúságú interferon génjeit resztrikciós enzimmel hasítjuk az érett LelF-el mikrobiális kifejezését esetleg gátló vezető szekvenciák kiküszöbölésére, majd egy trp promotor, operátor és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazó plazmidok ba iktatjuk be oly módon, hogy a resztrikciós enzimmel kezelt interferon gének operatíven kapcsolódjanak az említett trp szabályozó rendszerrel. (Elsőbbsége: 1980. 09. 08.)
  3. 3. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF Η 1166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF 11 kifejezésére képes LelF H trp típusú plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy interferon-aktivitás kiváltására képesnek mutatkozó telepekből származó plazmid DNS-t az 1. igénypont szerint kapott teljes lánchosszúságú LelF A génből származó, rádióaktiv jelzésű DNS-sel hibridizálunk, a hibridizációt mutató és a teljes lánchosszúságú LelF 11 gént tartalmazó kiónokat kiválasztjuk, az emlitett hibridizáló kiónok teljes lánchoszszúságú interferon génjeit resztrikciós enzimmel hasítjuk az érett LelF H mikrobiális kifejezését esetleg gátló vezető szekvenciák kiküszöbölésére, majd egy trp promotort, operátort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazó plazmidokba iktatjuk be oly módon, hogy a resztrikciós enzimmel kezelt interferon gén operatíven kapcsolódjék az említett trp szabályozó rendszerrel. (Elsőbbsége: 1980. 11. 10.)
  4. 4. Eljárás a 9. ábra szerinti LelF I vagy J 1-166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF I vagy LelF J kifejezésére képes LelF I trp LelF J trp tipusú plazmidok előállitásé”a, azzal jellemezve, hogy az emberi genom z-fág Charon 4A rekombináns könyvtárát az 1. igénypont szerint kapott teljes lánchosszúságú LelF A génből származó, rádióaktiv jelzésű DNS-sel hibridizáljuk, a hibridizációt riiutató és a teljes lánc hosszúságú LelF I vagy LelF J géneket tartalmazó kiónokat kiválasztjuk, az emlitett hibridizáló kiónok interferon génjeit resztrikciós enzimmel hasítjuk az érett LelF-ek mikrobiális kifejezését esetleg gátló vezető szekvenciák kiküszöbölése végett, majd egy trp promotort, operátort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazó plazmidokba iktatjuk be oly módon, hogy a resztrikciós enzimmel kezelt interferon gének operatíven kapcsolódjanak az emlitett trp szabályozó rendszerrel. (Elsőbbsége: 1981. 04. 21.)
  5. 5. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF A 1166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF A kifejezésére képes Escherichía coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1. igénypont szerint előállított plazmidot alkalmazunk egy Escherichía coli törzs transzformáláséra. (Elsőbbsége: 1980. 07. 01.)
  6. 6. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF B, C, D vagy F 1-166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF B, LelF C, LelF D vagy Leli·’ F kifejezésére képes Escherichía coli transzformánsok előállítására, azzal jelle21
    -2040 mezve, hogy egy a 2. igénypont szerint előállított plazmidot alkalmazunk egy Escherichia coli törzs transzformálására. (Elsőbbsége: 1980. 09. 08.)
  7. 7. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF Η 1- 6
    166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF H kifejezésére képes Escherichia coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy a 3. igénypont szerint előállított plazmidot alkalmazunk egy Esche- 10 richía coli törzs transzformálására. (Elsőbbsége: 1980. 11. 10.)
  8. 8. Eljárás a 9. ábra szerinti LelF I vagy J 1-166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF I vagy LelF J kifejezésére 15 képes Escherichia coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 4. igénypont szerint elősütött plazmidot alkalmazunk egy Escherichia coli törzs transzformálására. (Elsőbbsége: 1981. 0-1. 21.) 20
  9. 9. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF A 1166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF A interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 5. igénypont szerint előállított transzformánst alkalmas tápkö- 35 zegben tenyésztünk, a termelt érett LelF A interferont elkülönítjük és kívánt esetben tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1980. 07. 01.)
  10. 10. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF B, C,
    D vagy F 1-166 aminosav-szekvenciáját tar- 30 talmazó érett LelF B, LelF C, LelF D vagy LelF F interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 6. igénypont szerint előállított transzformánst alkalmas tápközegben tenyésztünk, a termelt érett LelF B, 35 LelF C, LelF D vagy LelF F interferont elkülönítjük és kivánt esetben tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1980. 09. 08.)
  11. 11. Eljárás a 4. ábra szerinti LelF Η 1166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett 40 LelF H interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerint előállított transzformánst alkalmas tápközegben tenyésztünk, a termelt érett LelF H interferont elkülönítjük és kívánt esetben tisztit- 45 juk. (Elsőbbsége: 1980. 11. 10.)
  12. 12. Eljárás a 9. ábra szerinti LelF I vagy J 1-166 aminosav-szekvenciáját tartalmazó érett LelF I vagy LelF J interferon előállításra, azzal jellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerint előállított transzformánst alkalmas tápközegben tenyésztünk, a termelt érett LelF I vagy LelF J interferont elkülönítjük és kivánt esetben tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1981. 04. 21.)
  13. 13. Eljárás humán leukocita interferon aktivitású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerint előállított érett LelF A interferont gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivöanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze és a keveréket gyógyászati alkalmazásra megfelelő alakba hozzuk. (Elsőbbsége: 1980. 07. 01.)
    11. Eljárás humán leukocita interferon aktivitású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerint előállított érett LelF B, LelF C, LelF D vagy LelF F interferont gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivöanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze és a keveréket gyógyászati alkalmazásra megfelelő alakban hozzuk. (Elsőbbsége: 1980. 09. 08.)
  14. 15. Eljárás humán leukocita interferon aktivitású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerint előállított érett LelF H interferont gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze és a keveréket gyógyászati alkalmazásra megfelelő alakba hozzuk. (Elsőbbsége: 1980. 11. 10.)
  15. 16. Eljárás humán leukocita interferon aktivitású gyógyszerkészítmények elöálütására, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerint előállított érett LelF I vagy LelF J interferont gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze és a keveréket gyógyászati alkalmazásra megfelelő alakba hozzuk. (Elsőbbsége: 1981. 04.
HU811882A 1980-07-01 1981-06-29 Process for producing interferons HU196457B (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16498680A 1980-07-01 1980-07-01
US18490980A 1980-09-08 1980-09-08
US20557880A 1980-11-10 1980-11-10
US06/256,204 US6610830B1 (en) 1980-07-01 1981-04-21 Microbial production of mature human leukocyte interferons

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU196457B true HU196457B (en) 1988-11-28

Family

ID=27496622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU811882A HU196457B (en) 1980-07-01 1981-06-29 Process for producing interferons

Country Status (36)

Country Link
EP (2) EP0211148B2 (hu)
AR (1) AR242833A1 (hu)
AT (3) ATE29727T1 (hu)
AU (1) AU552004B2 (hu)
BG (1) BG42189A3 (hu)
BR (1) BR8104189A (hu)
CH (2) CH651308A5 (hu)
CS (1) CS273152B2 (hu)
DD (3) DD210305A5 (hu)
DE (3) DE3125706C2 (hu)
DK (1) DK173543B1 (hu)
DZ (1) DZ312A1 (hu)
ES (1) ES503528A0 (hu)
FI (1) FI82712C (hu)
FR (1) FR2486098B1 (hu)
GB (1) GB2079291B (hu)
GE (1) GEP19960519B (hu)
GR (1) GR75714B (hu)
HK (1) HK49285A (hu)
HU (1) HU196457B (hu)
IE (1) IE49255B1 (hu)
IT (1) IT1137272B (hu)
KE (1) KE3534A (hu)
LU (1) LU83461A1 (hu)
MC (1) MC1396A1 (hu)
MY (1) MY8700711A (hu)
NL (1) NL8103151A (hu)
NO (1) NO159392C (hu)
NZ (1) NZ197572A (hu)
PH (1) PH18036A (hu)
PL (3) PL148261B1 (hu)
PT (1) PT73289B (hu)
RO (1) RO87590A (hu)
SE (2) SE8104093L (hu)
SU (1) SU1414319A3 (hu)
YU (1) YU47700B (hu)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
KR860001471B1 (ko) 1980-04-03 1986-09-26 비오겐 엔. 브이 인체의 섬유아세포 인터페론(IFN-β)폴리펩티드의 제조방법
EP0042246B1 (en) * 1980-06-12 1987-03-18 The Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Plasmid
DK489481A (da) * 1980-11-10 1982-05-11 Searle & Co Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
EP0085693A1 (en) * 1981-08-14 1983-08-17 A/S Alfred Benzon Subjects relating to human inteferon-alpha subtype proteins and corresponding antibodies
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
US4975276A (en) * 1982-01-15 1990-12-04 Cetus Corporation Interferon-alpha 54
US4973479A (en) * 1982-01-15 1990-11-27 Cetus Corporation Interferon-α61
US5098703A (en) * 1982-01-15 1992-03-24 Cetus Corporation Interferon-alpha 76
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US6432677B1 (en) 1982-03-08 2002-08-13 Genentech, Inc. Non-human animal interferons
US5827694A (en) * 1982-03-08 1998-10-27 Genentech, Inc. DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides
ATE64618T1 (de) * 1982-03-15 1991-07-15 Schering Corp Hybride dns, damit hergestellte bindungszusammensetzung und verfahren dafuer.
US4695543A (en) * 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
CA1210714A (en) * 1982-03-23 1986-09-02 Alan Sloma .alpha.-INTERFERON GX-1
US4748233A (en) * 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US5831023A (en) * 1982-11-01 1998-11-03 Genentech, Inc. Recombinant animal interferon polypeptides
FR2541579B1 (fr) * 1983-02-24 1987-12-18 Inst Organicheskogo Sinteza Ak Interferon n leucocytaire humain et procede d'obtention de celui-ci dans les cellules bacteriennes
EP0165942A1 (en) * 1983-12-23 1986-01-02 Monash University PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-$g(a)
SU1364343A1 (ru) * 1984-07-13 1988-01-07 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2
IL76360A0 (en) 1984-09-26 1986-01-31 Takeda Chemical Industries Ltd Mutual separation of proteins
WO1986002068A1 (en) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mutual separation of proteins
US5196323A (en) * 1985-04-27 1993-03-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Process for preparing and purifying alpha-interferon
DE3515336C2 (de) * 1985-04-27 1994-01-20 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS6463395A (en) * 1987-05-04 1989-03-09 Oncogen Oncostatin m and novel composition having antitumor activity
CA1309044C (en) * 1987-11-09 1992-10-20 Toshiya Takano Method of producing foreign gene products
GB8813032D0 (en) * 1988-06-02 1988-07-06 Boehringer Ingelheim Int Antiviral pharmaceutical composition
WO1991003251A1 (en) * 1989-09-08 1991-03-21 California Institute Of Biological Research Cr2 ligand compositions and methods for modulating immune cell functions
DE3932311A1 (de) * 1989-09-28 1991-04-11 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur reinigung von beta-interferon
AU1854695A (en) * 1994-03-07 1995-09-25 Imperial College Of Science, Technology And Medicine The use of interferon subtypes in the preparation of medicaments to treat viral infections
EP1104809A1 (en) * 1994-04-09 2001-06-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for producing alpha-interferon
GB9609932D0 (en) * 1996-05-13 1996-07-17 Hoffmann La Roche Use of IL-12 and IFN alpha for the treatment of infectious diseases
US20030190307A1 (en) 1996-12-24 2003-10-09 Biogen, Inc. Stable liquid interferon formulations
ZA9811070B (en) 1997-12-08 2000-07-03 Genentech Inc Type I interferons.
CA2311681A1 (en) 1997-12-08 1999-06-17 Genentech, Inc. Human interferon-epsilon: a type i interferon
DK1588716T3 (da) 1998-08-06 2011-05-23 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uratoxidase-konjugater og anvendelse deraf
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
US6268178B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Phage Biotechnology Corp. Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides
WO2002036627A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Pbl Biomedical Laboratories Interferons, uses and compositions related thereto
FR2822845B1 (fr) 2001-03-30 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
FR2825716B1 (fr) 2001-06-11 2004-09-24 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 7
SI3321359T1 (sl) 2005-04-11 2021-07-30 Horizon Pharma Rheumatology Llc Variantne oblike urat oksidaze in uporaba le-teh
CN107033233A (zh) * 2008-01-18 2017-08-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 非糖基化蛋白质的纯化
HUP1200205A3 (en) 2009-06-25 2012-09-28 Savient Pharmaceuticals Method and kits for perdicting infusion reaction risk and antibody-mediated low of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricare therapy
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN150740B (hu) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
FI77877C (fi) * 1979-04-20 1989-05-10 Technobiotic Ltd Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein.
CY1346A (en) * 1980-01-08 1987-01-16 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
EP0042246B1 (en) * 1980-06-12 1987-03-18 The Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Plasmid
ES8302778A1 (es) * 1980-11-10 1983-02-01 Genentech Inc Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
DE3280127D1 (de) * 1981-03-27 1990-04-12 Ici Plc Genetisch modifizierte mikroorganismen.

Also Published As

Publication number Publication date
YU162281A (en) 1984-02-29
DE3125706C2 (de) 1995-05-24
FI82712B (fi) 1990-12-31
MY8700711A (en) 1987-12-31
SE465223B (sv) 1991-08-12
MC1396A1 (fr) 1982-04-27
IE811463L (en) 1982-01-01
AU7246281A (en) 1982-01-07
ATA290981A (de) 1985-09-15
AU552004B2 (en) 1986-05-22
NO159392B (no) 1988-09-12
PL231940A1 (en) 1983-07-18
EP0211148B2 (en) 1999-11-24
PH18036A (en) 1985-03-06
SE465223C5 (sv) 1998-02-10
IT8122682A0 (it) 1981-07-01
AR242833A1 (es) 1993-05-31
DK291081A (da) 1982-01-02
CS273152B2 (en) 1991-03-12
DE3177288T3 (de) 2000-03-16
GB2079291B (en) 1984-06-13
HK49285A (en) 1985-07-05
FI82712C (fi) 1991-04-10
DE3125706A1 (de) 1982-04-15
DK173543B1 (da) 2001-02-05
EP0211148A1 (en) 1987-02-25
NO812247L (no) 1982-01-04
PL148261B1 (en) 1989-09-30
PT73289B (en) 1983-05-11
CH657141A5 (de) 1986-08-15
FR2486098B1 (fr) 1985-12-27
NZ197572A (en) 1985-07-31
DD210305A5 (de) 1984-06-06
FR2486098A1 (fr) 1982-01-08
DE3177288T2 (de) 1992-12-10
GB2079291A (en) 1982-01-20
PT73289A (en) 1981-07-01
YU47700B (sh) 1996-01-08
DD202307A5 (de) 1983-09-07
PL148276B1 (en) 1989-09-30
BR8104189A (pt) 1982-03-16
DZ312A1 (fr) 2004-09-13
BG42189A3 (en) 1987-10-15
RO87590A (ro) 1986-07-30
SE8104093L (sv) 1982-01-02
LU83461A1 (de) 1983-04-06
GEP19960519B (en) 1996-07-02
NO159392C (no) 1988-12-21
FI812067L (fi) 1982-01-02
CH651308A5 (de) 1985-09-13
EP0043980A3 (en) 1982-09-15
DE3176448D1 (en) 1987-10-22
IT1137272B (it) 1986-09-03
NL8103151A (nl) 1982-02-01
PL148260B1 (en) 1989-09-30
DE3177288D1 (de) 1992-10-01
DD210304A5 (de) 1984-06-06
SU1414319A3 (ru) 1988-07-30
CS503781A2 (en) 1990-07-12
GR75714B (hu) 1984-08-02
ES8207514A1 (es) 1982-10-01
EP0043980A2 (en) 1982-01-20
EP0211148B1 (en) 1992-08-26
ES503528A0 (es) 1982-10-01
KE3534A (en) 1985-06-07
ATE29727T1 (de) 1987-10-15
EP0043980B1 (en) 1987-09-16
AT380272B (de) 1986-05-12
ATE79901T1 (de) 1992-09-15
IE49255B1 (en) 1985-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU196457B (en) Process for producing interferons
US6610830B1 (en) Microbial production of mature human leukocyte interferons
AU601675B2 (en) Purification, production and use of tumor necrosis factors
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
HU193512B (en) Process for preparing hybride interferones from human erythrocytes
HU193507B (en) Process for producing interferen-like pelypeptides
US4801685A (en) Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
JPH0240080B2 (hu)
JPS6363199B2 (hu)
US4810645A (en) Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
KR870000510B1 (ko) 형질전환된 미생물의 제조방법
FI82713B (fi) Plasmid, som foermaor expressera humant moget leukocytinterferon, foerfarande foer dess framstaellning samt dess anvaendning vid framstaellning av humant leukocytinterferon.
KR870000511B1 (ko) 발현 비히클의 제조방법
CS273182B2 (en) Method of expressive vector production capable to give mature human leucocytic interferon in transformed strain of escherichia coli by means of expression
IL63197A (en) Intraferons for mature human oocytes, their preparation and preparations containing them
Goeddel Microbial production of mature human leukocyte interferons
BG60939B2 (bg) човешки имунен интерферон
NO164178B (no) Plasmid som koder for et ferdigutviklet human leukocyttinterferon.

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628