DD210305A5 - Verfahren zur herstellung von mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein gentechnisches Verfahren zur Herstellung von Leukozyten-Interferon, was auch Ziel der Erfindung ist. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen zu entwickeln, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosaeuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons ohne Praesequenz faehig sind. Erfindungsgemaess besteht das Verfahren darin, dass man einen Mikroorganismus mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids befaehigten replikablen Vektors transformiert und kultiviert.

Description

Berlin, den 8« 12. 83 • 62 990 12

Ausscheidung I aus AP C 12 K/231 371 ^ 59 477 12

Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen Anwendungsgebiet der Erfindung

"Ά Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie» d, h· Verfahren, die auf diesem Gebiet verwendet werden.

Genauer gesägt^ betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide» insbesondere die Herstellung reifer Human-Leukozyten-Interferone.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hüman-Leukozyten-Interferon (LeIF), wurde zuerst von Isaacs and Lindenmann (Proc. R. Soc. B 147, 258 - 267 ^3.957'Jk U. S. P. 3.699.222) entdeckt und in Form der rohen Präzipita- ~%J" te hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen» das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur Herstellung relativ homogener Leukozyten-Interferone aus normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukämischen Spendern geführt (z* B, Deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2*947.134). Diese Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen» bestimmten Zellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüber hinaus kann Interferon die Zell-Proliferation hemmen und die !ramunantwort modulieren. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß Leukozyten_TInterferon klinisch als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und Krankheiten eingesetzt wurde.

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In der Vergangenheit wurden Leukozyten-Interferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76_, 640 - 644 /~1979_7,· Zoon et al. * Ibid. 76, 5601 - 5605 ^""1979J⁷) . Die berichteten Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17*500 bis etwa 21,000. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparate

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sind bemerkenswert hoch mit 2 χ 10 bis 1 χ 10 Einheiten pro rag Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsniethoden die Bestimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al., Science 207 , 527 £"~1980_/ϊ Levy et al.,-. Proc. Natl, Acad, Sei. U.S.A. 77, 5102 - 51Ö4 </°"*198Oj7) . Die Frage der Glycosylierung der verschiedenen Leukozyten-Interferone ist bis jetzt noch nicht völlig abgeklärt» aber es ist soviel klar, daß Unterschiede in den Molekulargewichten nicht allein durch Glycosylierung hervorgerufen werden«;: Es-ist: auch klar, daß die Leukozyten-Interferone deutlich unterschieden sind voneinander durch unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Fällen niedriger als 80 %.

Während das aus Spender-Leukozyten isolierte homogene Leukozyten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und zu limitierten klinischen Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Eva-

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luation des Human-Leukozyten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit <1 %) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten, haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in größerem Maßstab geführt.

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es jedoch inzwischen gelungen» eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden Wie Somatostatin, den A und B Ketten des Huraan-Insulins und Huroan-Wachstumshonnon gestatten (Itakura et al·, Science 198 , 1056 - 1063 £~¹⁹⁷⁷-7i Goeddel et al., Nature .281, 544 - 548 ^~*1979__7). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin und Thyfliosin alpha 1 und verschiedene Autoren haben be»' richtet, daß es ihnen gelungen ist, Human-Leükozyten-Interferonaktivität zu erhalten (Nagata et al., Nature 284 , 316 320 ^f"l980j7; Mantei et al. , Gene 10, 1-10 ^""l980j7; Taniguchi et al., Nature 285, 547 - 549 £~19SQ_J).

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chroraosomale Schleife doppelsträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasraid-DNS enthaltene Information umfaßt diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d. h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben,

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Klone der..Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthalten,, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasraid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt, aber das erhaltene reköijsbinante Plasraid· wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und große Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rskombinierten Plasraiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d.h* operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids.v. eingefügt _r,, die^:: für die? Transcription- und = Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasraid (Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptide verwendet werden, daß durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet,

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die. durch RNS-Polyraerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z. B. beim Tryptophan- oder " trp"-Pr-omoter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promoter-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Re-

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pressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'- zum 3'-Ende in raRNS, die dann wiederum in das PoIy-.^ peptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz —' übersetzt wird. CJede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNS-Polytnerase zunächst Nukleotide, die eine Rib osora en- Bindu η gss teile kodieren -, danri;:' ein-Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der" mRNS zu ÄÜG wird) und schließlich die Nukleotid Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen, die Polymerase noch weitere mRNS-Seqüenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stop- signals von· den Ribosoflien: nicht n^ehr übersetzt werderTW Die^; Ribosoraen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der r"~\ raRNS an _t in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt» wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, richtig liegen in bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind» Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der .Wirts-Zelle» Abtrennung von anderen Bakterisnproteinen und Reinigung in üblicher Weise,

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, daß die

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Anwendung der rekombinanten DNS-Technologie (d. h. die Einfügung von Interferongenen in raikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung großer Mengen Leukozyten-Interferon wäre,, welches trotz der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.

Ziel der Erfindung;

Es ist Ziel der Erfindung,. Leukozyten-Interferon unter Einsatz der Gentechnik herzustellen,

Da rlequnq.i des Wesens- der Erf indunq

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde-, ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen zu entwickeln, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz eines reifen Huraan-Leukozyten-Interferons ohne Präsequenz fähig sind«

Ein erstes Leukozyten-Interferon-Gen wurde erfindungsgemäS durch die folgenden Maßnahmen erhalten;

(1) Aminosäürepartialsequenzen von homogenem Humanleukozyten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkoflibinationen repräsentieren, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden können.

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(2) Es wurden Bänke von'Bakterienkolonien 'hergestellt, die komplementäre ONS (cDlslS) aus induzierter mRNS enthielten. Andere induzierte und radioaktiv markierte raRNS wurde mit Plasmid-cQNS aus dieser Bank hybridisiert* Hybridisierende raRNS wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet, Plasfflid-DNS aus" Kolonien,, die in diesem Test Interferonaktivität besaßen, wurden ferner auf Hybridisierung mit Sonden"_t die nach (1) enthalten wurden, getestet.

(3) Parallel zu dönv-Vorgehen-unter (2) wurde mittels induzierter'raRNS' "erhaltene cDNS in Plasraiden dazu verwendet, eine unabhängige Bank transformierter Kolonien zu bilden. Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter sinsträngiger cDNS verwendet« die wiederum als Hybridisierungssonder. benutzt wurden. Die synt-h-^'iiseh'en;' Sonden" hybridisiert;öh mit" induzierter 'ragNS;- als Matrize und Wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radioraarkierte cDNS zu bilden. In dieser vVeise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Oedes geraäS {1) oder {2} erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfragment kann als Sonde für ein ungekürztes Gen verwendet werden.»

(4) Das se erhaltene ungekürzte Gen wurde maßgeschneidert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptids

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verhindern könnte, auszuschließen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Promoters» Das exprimierte Interferon wurde soweit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte.

(5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Gen-Fragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyten-Xn tetter one vervyendet werden.

Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekorabinanten DNS-Technologie, wurde die mikrobielle Herstellung der Familie homologer Leukozyten-Interferone (in nicht-glykosylierter Form) als reife Polypeptide _s d, h» im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht» Diese Interferone können direkt exprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, daß sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen geeignet sind.

Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit sie expriraiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch,, ebenfalls in einem in vivo-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten raikrobiell hergestellten reifen Leukozyten-Interferons handelte.

Der Ausdruck "reifes Leukozyten-Interferon", der im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, de-

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finiert ein mikrobiell (ζ. Β, bakteriell) hergestelltes Interferonmolekül* das keine Glykosylgruppen trägt. Reifes Leukozyten-Interferon, gemäß vorliegender Erfindung,wird von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Arainosäurecodon des natürlichen Produktes expriraiert. Das "reife" Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (fur das ATG codiert) enthalten, ohne daß damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der mikrobielle Wert aus dem unmittelbaren Translationsprodukt das Methionin abspalten. Reifes Leukozyten-Interferon kann zusammen rait einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader ist, expriraiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra- oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche.britische Patentanmeldung Nr, 2007676A). Schließlich kann das reife Interferon zusanraen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestallt Werden, das das Konjugat arr die Zellwand transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezerniert wird, Expression von reifem Leukozyten-Interferon bedeutet bakterielle oder andere mikrobielle Herstellung eines Interferon-moleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält.

Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Leukozyten-Interferons (Figuren 4 und 9) wurden auf Grund der DNS-Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) ermittelt. Für alle diese einzelnen Leukozyten-Interferone existieren natürlich, von Individuum zu Individuum unterschiedliche allelische Varianten, Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch Austausch (Substitution, Inversion), Deletion oder Inser-

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tion einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Derartige allelische Variationen der erfindungsgernäßen Leukozyten-Interferone A bis 3 sind von den jeweiligen Formeln (LeIF A bis LeIF G) mitumiaßt und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung»

Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt zwei Aminosäurepartialsequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und. bis zur Homogenität gereinigt wurden, gemeinsam sind. Sie sind T-I und T-13 bezeichnet, Es sind alle möglichen mRNS-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechenden cDNS-Sequenzen. Die Buchstaben A, T, Gj. C und U bezeichnen die Nucleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil. Der Buchstabe N bedeutet Aj G _:J C oder U> Οά,β;- Pol^ynucl.eatide s±nd;_: vom 5' -Ende (links) zum 3'-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere DNS (nicht-kodierender Strang) von 3'- in 5'-Richtung wiedergegeben.

Figur 2 stellt ein Autoradiogramm dar,, das die Hybridisie-

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rung von möglichen LeIF-Plasfniden mit P-raarkierten synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt»

Figur 3 gibt die Nukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyten-Interferonen verwendet werden können. Der ATG Translations-Start-Codon und die Stoptripletts für jedes LeIF sind unterstrichen. Auf die

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Stoptripletts folgen urlübersetzte' Sequenzen» Dem vollständigen Gen für LeIF A fehlt ein Codon in der Position 200 bis 202, der bei den anderen LeIFs vorhanden ist, Vor der Leader-Sequenz liegen ebenfalls unübersetzte Sequenzen, Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges" reifes LeIF E, w' Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz*

Figur 4 gibt einen Oberblick über die aus den bestimmten

Nukleotidsequensen abgeleiteten' As incssuresequences von"8: Leüii-ozyten-Interfefonen (A bis H)V Die¹ für die 3'e'zWicHnuhg der einzelnen Aminosäuren verwendeten großen Buchstaben sind die von der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur empfohlenen. Es bedeuten:

A Alanin ; C Cystein; D Asparaginsäure; E Glutaminsäure ' ; F ^;: Phenylalanin ; G Glycin j '- H- His tidin ; I^s Is oleucin'; K"' Lysin ; L Leucin; M Methionin; N Asparagin; P Prolin; Q Glutamin; / - , R Arginin; S Serin; T Threonin; V Valin; VV Tryptophan; und Y Tyrosin» Die Zahlen geben die Position der Aminosäuren an (S bezieht sich auf das Signal-Peptid), Der Bindestrich in der Position 44 wurde eingeführt., um die Sequenz des LeIF A in Obereinstimmung mit den 156 Aminosäuren der anderen Leukozyten-Interferone zu bringen,. Für die Festlegung der Aminosäuresequenz des LeIF E wurde das Nukleotid in Position 187 (Figur 3) nicht berücksichtigt.·Die Sterne (Sequenz von LeIF E) steilen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren,; die allen LeIFs (mit Ausnahme des Pseudogens LeIF E) gemeinsam sind,, sind in Zeile "All" dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im Huraan-Fibroblasten-

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Interferon vorkommen.

Figur 5 gibt die Restriktionsendonuclease-Karten der klonierten cDNSs von 8 verschiedenen Leukozyten-Interferonen wieder (A bis H), Die hybriden Plasmide wurden nach der dCtdG-Täiling-Methode {Göeddel, D.V.. et al, Nature 237, 411 - 416 £~±^%0_7) hergestellt. Die cDNS-Einsätze können daher mit Pstl herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDNS-Einsatzes stellen die anschließenden homopol ymeren dC:dG-Schwänze dar. Die Lage der PvuII-, EcoRI- und Bglll-ISestriktionsstellen' sind angegeben. Schattierte Regionen in d'er Figur' stellen kodierende Sequenzen für reife LeIFs dar; die schräg-gestrichelten Regionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während.'',die:- weißen Regionen- nicht-kpdle;re'nde^i; Sequenzen darstellen.

In Figur 6 wird, schematisch die. KonstruktiOfT eines Gens, das die direkte mikrobielle Synthese von-reifem LeIF A kodiert» dargestellt. Es werden die Restriktonsstellen (Pstl, usvs?,.) sowie die verwendeten Bruchstücke gezeigt. Die Abkürzung "b.p." bedeutet Basenpaare*

Figur 7 (nicht maßstabsgerecht) stellt scheraatis.cn die Restriktions-Karte; von 2 Genfragraenten dar, die zur Expression von reifem LeIF 3 verwendet wurden. Die bezeichneten Nukleotid-Godons sind die Enden der kodierenden Strange, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen.

Die Figuren 8 und 9 geben die DMS- und Arainosäuresequenzen

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der Leukozyten-Interferone A, C₁ H, I und G wieder. In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DNS-Sequenz, während der Bindestrich in der Sequenz von LeIF A die benachbarten Aminosäuren, Phenylalanin und Glycin miteinander verbindet.

Beschreibung der bevorzugten Ausführunqsformen A. Die verwendeten Mikroorganismen

Die :;:.b ei-den- jlolgeovd en ., ,Mik^op^ga.fii.S;^

E» coli x^i: 1776, wie beschrieben in US.P* 4*190.495 j und E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi"¹ „ hsr", hsra, ) _? wie in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 055 382 A beschrieben. .Beide Organismsn v-'urden bei der American Type Culture CoI-Leölilpn deponiert unt?r nen ATCC ,Nr. 31537 und* 31446« Die gesarate Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt. .

Außer den beiden oben genannten E* coli-Stämmen. können aber auch andere Stamme, beispielsweise E. coli 3 oder weitere Mikroben-Stämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie dar American Type Culture Collec tion, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind, Vergleiche auch Deutsche Offenlegungsschrift 2 644 432. Wei tere Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind z. 3. BaCiIIi₄ wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhim.urium und Serratia marcescen.s zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene

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zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise. in Saccharorayces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefepromotors.

8. Quelle und Reinigung von LeIF inRNS .

LeIF mRNS kann von Huraan-Leukozyten (normalerweise von CHL-Patienten), die zur Produktion von Interferon mit Sendai-Virus oder NDV, wie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrif t. Nr. 2 947: 134. beschrieben, angeregt wurden, erhalten werden« Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist eine Zellinie, die KG-I bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter siyelogener Leukämie, ableitet. Die Zellinie, beschrieben von Köeffler, fl« P* und Golde, D, .'iv. _t Science 200, 1153 {1978), wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosevvell Park Memorial Institute) 1640 mit 10 % FCS (fötales Kälberseruffl), hitzeinaktiviert, 25 raM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N^>-2-ethan-sulfonsäure) und 50 ,ug/ml Gentamycin. Die Zellen können in dem vorstehend beschriebenen Medium nach Zusatz von 10 % Dimethylsulfoxid eingefroren werden. Die KG-I Linie ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCG Nr, CRL 8031 deponiert worden.

Oie KG-i-Zellen wurden nach der von Rubinstein et al. in (Proc Natl» Acad. Sei. U.S.A. 76_, 640 - 644 (1979)) beschriebenen Weise mit Sendai-Virus oder NDV zur Produktion von Leukozyten-Interferon-raRNS angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRNS wurde nach der Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode (Chirg-

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win et al., Biocheraistry 18, 5294- 5299 </~~1979j7} hergestellt, RNS aus nicht-induzierten Zellen wurde in der gleichen Weise isoliert, Oligo-deoxythymidin (dT)-Cellulose-Chroniatographie und Saccharose-Gradient-Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S ,.Fraktion von Poly(A)-mRNS, wie von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 £~197&J) und Okuyuma et al. (Arch. Bioehera. Biopbys. 188, 98 - 104 £~"l989_y) beschrieben, zu erhalten. Diese mRNS hat te einen Interferontiter von 8000 - 10,000 Einheiten pro Micrograinm' im- XenopuV laevis,· Oozytentest (Cavalieri et al.. Proc. -Natlv Acad. Sei, U.S.A. 74, 3287-- 3291 /~"l977_/) .

C. Herstellung von Koloniebänken, die LelF-cDNS-Sequenzen

enthalten : ^:·- ν ' ·."·-.' --^:"-; ' ' ';' ' ' ;' ' · '.. '-·"" ":-'^:: . '^:

% /UgviflSSlSSvtürde;-, iur^Si^'r^teilurigij d;öp,p"eisM;^;'rärt^;'gig:eft cO-NS',· Standardinethoden (Wickens et al., 3, Biol. Chem. 253, 2483 2495 /_"~1973_<_7 und Goeddel et al., Nature 281, 544 - 543 /_ 1979__/) verwendet. Die cDNS wurde der Größe nach fraktioniert durch Elektrophorese an :einem 5 % Polyacrylamidgel und 230 ng. des, Materials mit 500 .--. 1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert, 100 ng dieser cDNS wurden mit Deoxycytidin (dC)-Resten nach der von Chang et al. (Nature 275, 617 - 624 £"l97B_J) beschriebenen Methode verlängert ».. verbunden mit 470 ng des Plasm ids p8R322, welches mit Deoxyguanosin (dG)-Resten an der Pstl-Spaltstelle (Bolivar et al,, Gene 2,, .95 - 113 CVBIlJ) verlängert worden war und zur Transformation von E. coil χ 1776 verwendet, Es wurden, etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin^.erapfindliche Transforaänten pro ng cDNS erhalten.

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In einem zweiten ähnlichen Experiment wurden etwa 1000 Tetracyclin- resistente, Ampicillin-eiapfindliche E. coli !<~12 Stamm 294-Transfortnanten pro ng cDNS erhalten. In diesem Falle lag die Größe des fraktionierten cDNS-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren, Es wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit Deoxycytidin (dC) gewonnen.

D. Herstellung synthetischer Oligonucleotide und deren Ver-Wendung

Die Kenntnis der Arainosäuresequenzen verschiedener trypti-.scher Fragmente von humanen Leukozyten-Interferonen erlaubte die Synthese von Deoxyoligonukleotiden, die bestimmten Regionen der LeIF nvRNS komplementär waren,.. Die beiden tryptischen. Peptide! Tl und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12 bzw. 4 Undecameren erforderte, um alle möglichen Nucleotidsequenzen zu erfassen (Figur 1). 4 Sätze von Deoxynukleötidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3 (T-IA, B, C₁ D) oder ein (T-13A, .B, C, D) Oligonucleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxyoligonucleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriesterraethode (Crsaet al,, Proc» Natl. Acad» Sei, U.S.A» T^₁ 5765 - 5769 _l"~1978_7) . In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt. Die zwölf T-I Sonden wurd_en in vier Pools zu 3 Sonden., wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.

Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-I Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, wurden verwendet j um die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten.

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Die Matrizen -mRNS war entweder 12S RNS von mit Sendai-Virus induzierten KG-IZellen (8000 Einheiten IF-Aktivität per ,ug) oder gesamte Poly(A)-raRNS aus nicht induzierten Leuko-

' 32

zyten ( 10 Einheiten pro ,ug). P-raarkierte cöNS wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (Noyes et al., Proc. Natl*.'Acadv- Sei« U.S.A. 76, 1770 - 1774 £~±979_J) . Die 60 ,ul-Reaktionen wurden durchgeführt in 20jhM Tris-HCl (pH 8,3), 2OmM KCl₁ 8raM MgCIp und 3OmM ß-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 ,ug jedes Starters (d. h. 12 /Ug insgesamt für die T-I Serie, 4 ,ug insgesamt für die T-13 Serie) , 2 ,ug:. induzierter 12S raRNS (oder 10; yug-.nicht induzierter Poly (A)-HiRNS)₇ 0,5 niM dATP, dCTP, uTTP_t 200 _/uCi (c<³²P)dCTP (Araersham, 2 - 3000 Ci/mmole) und 60 Einheiten reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories)♦ Das Produkt wurde von nicht-markiertem Ma-

(r) terial^: durch GeIfiltrationen an einer 10 ml-Sephadex ^; G-50 Säule", getrennt ₃< 3O.":.HinUt'en^!' bei, 70, ⁰C mit 0,-,3W·· NaOH _}, zur Zerstörung der RNS, behandelt und mit HCl neutralisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al. (Nucleic Acids Res. 7, 1541 - 1552 /f~1979__7) beschrieben, durchgeführt.

E. Identifizierung der Klone pLl-pL30

Die Methode von Birnboim et al. _t Nucleic Acids Res. 7_, 1513 - 1523 (1979), zur schnellen Isolierung von Plasraiden wurde verwendet _t um 1 ,ug Plasmid-DNS. aus. jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294-Transforraanten (vergleiche C) zu gewinnen. Oede DNS Probe wurde denaturiert

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und auf Nitrocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al» (siehe oben), aufgebracht«

Die drei Sätze der Nitrocellulosefilter, die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert mit

a) induzierter cONS, gestärkt mit einem T-I Startersatz,

b) T-13 gestarteter induzierter cöNS und

c) nicht induzierter cONS» hergestellt unter Verwendung beider Startersätze. Klone wurden als positiv angesehen, wenn sie stärker hybridisierten mit einer oder beiden der induzierten cDNS-Sonden als mit der gesamten nicht induzierten Sonde. 30 positive Klone (pLl-pL3Q) wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesucht«

F. Identifikation der Klone pL-31-pL39 Isolierung eines Plasnvids (Nr. 104), das ein LelF-Genfraqment enthielt _; _______ _«____«___

Transforraanten von E. coli χ 1776 wurden nach der Koloniehybridisieruhgsmethode von Grunstein und Hogness (Proc. Natl, Sei. U.S.A. 72,. 3961 - 3965 £~i975_J) getestet, unter Verwendurig von P-markierter induzierter raRNS als Sonde (LiI-lenhaug et al., Biochemistry, 13, 1858 - 1865 /7*1976J7) . Nichtmarkierte mRNS von nicht-induzierten Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200 : 1 gemischt', um zu

32 konkurrieren mit in detn P-raarkierten Präparat vorhandener nicht-induzierter mRNS. Die Hybridisierung markierter mRNS

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sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Transformanten wurden erhalten;

(1) 2 - 3 % der Kolonien hybridisierten sehr stark mit P-

raRNS ,

(2) 10 % hybridisierten signifikant schwächer als die erste Klasse und

(3). ..der Rest lieferte kein erkenn ha res Kybridisierungssignal.

Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2)) wurden auf die Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft£, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-mRNS an Plasmid-DNS beruht. Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (I)) individuell in 100 ml M9-Medium, das ergänzt war mit Tetracyclin (20 ,ug/ HiI)V Diaminopimelinsäure (100 ,ug/ml) , Thymidin (20 ,ug/ml) und d-Siotin (1 ,ug/ral) , gezüchtet. Das M9-Hedium enthält pro Liter; Na₂HPO₄ (6g), KH₂PO₄ (3g), NaCl (o_}5.g) und NH Cl (Ig), Nach Autoklavieren wurde 1 ml steriles IM MgSO und 10 ml steriles 0,01 M CaCl₂ zugesetzt, Oeweils 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefaßt und die Plasraid-DMS wurde, wie von Clesvell et al., Biochemistry 9_, 4428-440 /T¹⁹⁷⁰J/' beschrieben, isoliert. 10 ,ng jedes Plasmid-DNS-Pools wurden mit Hindlll gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papisr (Diazobenzyloxyraethylpapier) gebunden. 1 ,ug gereinigter raRNS aus induzierten Zellen wurde an jedes Filter hybridi-

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siert, Nicht-hybridisierte mRNS wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRNS wurde eluiert und in Xenopus laevis Qozyten überführt. In diesem Assay waren alle sechs Pools negativ. Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2)) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs Pools hybridisierte einer (KlO) jedesmal, wenn er geprüft wurde, signifikant stärker als die übrigen. Um den spezifischen Interferon-cDNS-Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool KlO zusammengefaßten neun Kolonien Plasmid-DNS hergestellt und individuell geprüft. Zwei der neun Plasmide (Nr. 101 und 104) banden Interferon-mRNS stärker als die anderen. Aus dem Plasmid Nr, 104 wurde ein besonderes SgI II-Restriktions-

32 fragment, das 260 Basenpaare enthielt, isoliert, P-markiert nach der von Taylor et al,, Biochim. Biophys. Acta 442, 324 - 330 (1976), beschriebenen Methode und als Sonde verwendet, um 400 E, coli 294-Transformanten nach einem in situ-Kolonie-Screeningverfahren (Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Sei. U.S.A. 7J2, 3961 - 3965 /fl975j7) zu testen, Neun Kolonien (pL31-pi-39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Maße mit dieser Sonde hybridisierten.

Zusätzlich wurde das markierte 260-Basenpaar-Fragment wendet, um 4000 E. coli 294-Transformanten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiziert werden, die in unterschiedlichem Maße mit dieser Sonde hybridisierten. Eine enthielt das LeIF G-Fragment, eine enthielt das LeIF Η-Fragment und eine enthielt ein Fragment, das als. LeIF Hl bezeichnet wurde (offensichtlich ein Allel von

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LeIF H). Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, wurden "LeIF G" , "pLeln H", usw., bezeichnet.

G* Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LeIF Gens ' -

Plasmid DNS wurde aus allen 39 potentiellen LeIF-cDNS-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen 260 Basenpaareenthaltenden DNS-Sonde getestet, unter Verwendung des Hybridisierungsprozederes von Kafatos et al· (siehe oben). Drei Plasmide?(pL4, pL31, PL34) gaben sehr starke Hybridisier rungssighäle, vier (pLl3, pL30', pL32, pL36) hybridisierten mittelmäßig, während drei {pL6 _t PL8, pL14) nur schwach mit der Sonde hybridisierten.

Die 39 potentiellen LeIF cDNS Rekombinant-Plasraide wurden

- 32 · ebenfalls/ unter" Ve rwendting der P-mar karten -synthetischen Undecatneren (individuelle T-I Starterpools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden getestet. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt, daS eine perfekte Basen-Paarung notwendig war» uro feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al., Nucleic Acids Res. (5, 3543 - 3557 £~1979_J) . Auf diese Weise wurde Plasraid-DNS aus den 39 Klonen nach einer Standardmethode Biorad Agarose A-50 Säulenchroraatographie gereinigt. Proben von je 3 /Ug jedes Präparats wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, mit Alkali denaturiert und auf 2 Nitrocellulosefilter getüpfelt (1,5 ,ug/Fleck) wie von Kafatos et al., (siehe oben) beschrieben. Die individuellen synthetischen Deoxyoligonucleotid-Starter und Starterpools wurden mit

32

("& P)ATP folgendermaßen phosphoryliert: 50 pmol Oligo-

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nucleotid und 100 pMol YP ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden mit 30 yUl 50 mMol Tris-HCl,. 10 mMol MgCl₂ und 15 mMol ß-Mercaptoethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T 4 Polynucleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Hinuten bei 37 C wurden die P-markierten Starter durch

(R) Chromatographie an 10 ml Sephadex ^ G-50-Säülen gereinigt. Die Hybridisierungen wurden unter Verwendung von 10 cpm Starter T-13C oder 3x10 cpm Starterpool T-IC durchgeführt, und zwar bei 15 C während 14 Stunden in 6 χ SSC //1.x SSC = 0*15 M NaCl, 0,015 H Natriumeitrat, pH 1,ZjF, 10 χ Denhardt's Lösung /~~0,2 % Rinderserumaiburain, 0,2 % Polyvinylpyrolidon, 0,2 % Ficoll_7_# wie von Wallace et al* (siehe oben) beschrieben. Die Filter wurden während 5 Minuten bei O C in 6 χ SSC gewaschen, getrocknet und Röntgenfilm ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Fii Starter T-IC dargestellt.

32 —

Die Ergebnisse sind in Figur 2 für P-Starterpool 1-13C und

Die Plasraid-ONS aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-IC und Starter T-13C, während Hybridisation mit den anderen Undecameren nicht festgestellt werden konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LelF-Plasraide (pL2, 4, 13, 17, 20, 31* 34).mit diesen beiden Sonden. Die Restriktionsanalyse zeigte jedoch, daß·nur.1 der Plasmide, pL31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes Bglll-Fragment enthielt. Pstl-Behandlung von pL31 zeigte:, daß die GröSe des cDNS-Abschnittes etwa 1000 Basenpaare war.

Der gesamte Pstl Abschnitt von pL-31 wurde sowohl nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 6_5,

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499 - 560 ^~"l980_7) ^w^^e nach der Dideoxy-Kettenbruchraethode (Smith, Methods Enzyraol. 6_5, 560 - 580 /^19BOjJ) durchgeführt, nachdem die Sau3a-Fragmente in einen M13-Vektor unterkloniert worden waren. Die DNS-Sequenz ist in Figur 3 ("Angezeigt. Aus dieser Sequenz wurde die gesamte Aminosäuresequenz des LeIF A vorhergesagt, einschließlich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Translations-Startcodon befindet sich 60 Nukleotide vom 5'-Ende der Sequenz entfernt und wird nach 188 Codons von einem TGA Stoptriplett gefolgt. Es gibt 342 nicht übersetzte Nucleotide am 3'-Ende, die schließlich von, einer Poly (A)-Sequenz gefolgt werderu,. Das; mutmaßliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem LeIF aus Leukozyten) ist 23 Aminosäuren lang. Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife LeIF A hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390. Der Figur 4 kann entnommen werden/ daß die tryptischen Peptide Τ-ί und T-13 den Aminosäuren 145 - 149 und 57 - 61 des LeIF A entsprechen. Die tatsächlichen DNS-Sequenzen, die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden durch den Starterpool Tl-C und den Starter T13-C (Figur 8) dargestellt.

H. Direkte Expression von reifem Leukozyten-Interferon A (LeIF A)

1. Allgemeines

Die Methode, nach der das reife LeIF A direkt exprimiert wurde, ist eine Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten (Goeddel et al.,Nature 281 _f 544 —. 548 /~~1979_J) _t insofern es eine Kombination von

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synthetischer (N-terminal) und komplementärer DNS darstellte.

Wie in Figur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LeIF A eine SauSa-Restriktionsendonuclease-Stelle. Es wurden 2 synthetische Deoxyolinucleotide geschaffen, die einen ATG-Translations-Startcodon enthalten, den Codon für die Aminosäure 1 (Cystein) wiederherstellen und ein EcoRI kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt. Das entstandene 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde ah 2 zusätzliche DNS-F ragtnen te gehängt, so daß ein künstlich-natürliches Hybridgen aus 865 Basenpaaren entstand, das LeIF A kodierte und welches durch EcoRI- und Pstl-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die E'ö.öRI- und Pstl-Rastriktionssteilen des Plasm-ids pBR322 eingefügt und lieferte das Plastnid pLeIF Al.

2« Konstruktion des Tryptophan-Kontrolleletnents (enthaltend den E* coli trp Promoter, Operator und die trp-Leader-Ribosofflenbindungsstelle ohne die ATG-Sequenz für den Translationsbeqinn)

Das Plasinid pGMI trägt das E, coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ^LE14i3 (Miozzari et al.,; 3, Bakteriology 133, 1457 - 1466 Ζ~~¹⁹⁷⁸_Ζ) ^unc^ expriraiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 5 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im folgenden LE' genannt) , sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systeffls. Das Plasmid (20 /Ug) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten, Die Genfragmente wurden: dann mit EcoRI-

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Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltst'elle zu schaffen. Die 20 ,ug der aus pGMl erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T DNS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 ,ul T₄ DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP₁ 10 mMol MgCl₂, 5 mMol Dithiothreit) bei 4 ⁰C über Nacht behandelt» Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70 C erwärmt. Die Verbindungssequ^nzen wurden jnit, EcoRI ge.s,p.alten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5 % Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert» Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Dedes GeIfragment wurde mit 300 Microliter O₄I χ TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 χ TBE-Pfuf· fer der Elektrophorese bei 100 Volt.ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na^EDTA in 1 Liter H₂O), Die wäßrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und O,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wäßriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der ira folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht,, daß man Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die. durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden, .

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Das Plasmid pBRHI (Rodirguez et al« , Nucleic Acids, Res« 6_, 3267 ·- 3287 Z."l979__/) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht« Das Plasmid ist daher Tetracyclin-empfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden«

pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion entfernt, Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemische^ kombiniert mit jedem, der drei DNS-Fragmente_f die oben erhalten wurden und mit T. DNS-Ligase_# wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNS des Reaktionsgeniischs wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organisraen nach Standardtnethoden (Hershfield et al», Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. Tl₁ 3455 - 3459 l_ 1974__/) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20 ,ug/ml Ampicillin und 5 /Ug/ml Tetracyclin enthielten« Es wurden verschiedene Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzytnanalysen bestätigt,.Das entstandene Plasmid wurde/pBRHtrp genannt.

Ein EcoRI und BaraHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasraids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281, 544 /T¹⁹⁷^J/) ' wodurch das Piasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespal-

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ten, mit Phenol extrahiert, rait Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 ,ul E« coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheini) in.30 /Ul Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat pH 7,4, 7 mM MgGl₂, 1 mM ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 ^ raM dTTP und Ο,ΙΊηΜ dCfP, während 30 Minuten bei O ⁰C und ^v-~" 2 Stunden bei 37 C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermaßen verändert:

5' CTAGA - 5^f CTAGA-3 ' T- * 3' TCT* -·'.

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmidfragtnent wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 /Ug) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den oben beschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 ,ug) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

-- T CTAGA —- —TCTAGA--

— AGC TCT * --AGCTCT--,

mit der ungewöhnlichen 3asenpaarung T-C.. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294-Zellen transformiert _} hitzebehandelt und auf LB-Platten,. die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien.ausgewählt, in 3 ml LB-Mediura aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, daß sechs davon die Xbal-Spaltstellen ira

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E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise:

- TCTAGA - - TCTAGA - .

- AGCTCT - ⁷ - AGATCT -

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet» wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben» verwendet.

Das Plasniid pHGH 107 (Göeddel et al, , Nature 281,.. 544, /f"l979_—7) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aniinosäurecodpns und 153 Ajiinosäurecadons, die von cDNS über reverse Transcription der iriRN'S" erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält» besitzt ein ATG-Translations-Startcodon, Das Gen wurde aus 10 ,ug pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EeoRI und E, coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment, sowie dTTP und dATP* wie oben beschrieben, Nach Phenol- und Chlorofonnextraktion sowie Ethanolpräzipitatian wurde das Plasmid mit BaraHI behandelt,.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragmentvvurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclinresistenzverleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operator-Systera, so daß, wenn es anschließend in ein Expressionsplasfflid kloniert wird, diejenigen Plasmide,

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die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polyraerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist* wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde,vorbereitet * pTrpl4 wurde mit Xbai behandelt und. die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP,dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroforra-Extraktion soviie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BaroHI behandelt und das entstandene große Plasmidfragment wurde durch PAGE, und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment _t dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 BaraHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt:

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Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

-TCTAG AATTCTATG- -TCTAGAATTCTATG-

-AGATC ⁺ TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC-

Xbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promoter) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasraid» bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators« Das erhaltene Geraisch wurde in E, coil 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 yug/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert,

Das. Plasmid- pHGH 207 wurde, mit EcoRI, behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution erhalten, das den trp-Promoter, Operator und die trp-Leader-IRibosomenbindungssteile enthielt, dem aber eine ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DNS-Fragment wurde in die EcoRI-Spaltstelle von pLeIF A kloniert« Expressionsplasmide, die das so modifizierte trp-Regulon (E. coli-Operon, dem die.Attenuator-Sequenz fehlt, so daß die Expression erhöht ist) können bis zu vorgegebenen Konzentrationen herangezüchtet werden.in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promoter-Operatorsystem zu unterdrücken, Wird dann das Tryptophan entzogen und das System entblockiert, so wird das gewünschte Produkt expriraiert»

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Ira vorliegenden Fall und wie in Figur 6 dargestellt, wurden 250 ,ug des Plasmids pL31 mit Pstl behandelt und das 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelelektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel isoliert. Es wurden etwa 40 ,ug des Teilstücks aus den Gel durch.Elektroelution erhalten und in 3 gleiche Teile für die weitere Behandlung aufgeteilt: ''.'"..'

a) Eine 16 ,ug-Probe des Fragments wurde teilweise gespal-

/ Q

ten mit 40 Einheiten von.BgIII während 45 Minuten bei 37 C und das Reaktionsgemisch wurde an einem 6 % Polyacrylamid-, gel gereinigte E-tw,a 2/ ,ug. dee gewünscht erv> 67Ö^: Basenpaare^: enthaltenden Fragments wurden erhalten.

b) Eine andere Probe (8 ,ug) des 1000 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Sruchstücks wurde mit Avail und BgIII behandelt.

I. yUg·.des in Figur 6 gezeigten 150 Basenpaare enthaltenden Fragments" wurden nach Gelelektröphbrese^erhai.teh,

c) 16 ,ug des lOOO: Basenpaare-enthaltend,en Fragments; wurden mit Sau3a und Avail-behandelt. Nach Elektrophorese an 10 % Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 ,ug (10.pMol) des 34 Basenpaare-enthaltenden Fragments erhalten. Die zwei angegebenen Deoxyolinucleotide, 5'-dAATTCATGTGT (Fragment 1) und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphortriestermethode synthetisiert. Das Fragment 2 wurde folgender-

32 maßen phosphoryliert: 200 /Ul (etwa 40 pM) von (γ P) ATP (Amershanä, 5000 Ci/mM) wurden zur Trockne gebracht und in 30 ,ul 60 mM Tris-HCl (pH 8), 1OmM MgCl₂, 15mM ß-Mercaptoethanol, 100 pM des DNS-Fragments und 2 Einheiten T4 PoIynukleotid-Kinase resuspendiert. Nach 15 Minuten bei 37 C wurde 1 ,ul 1OmM ATP hinzugesetzt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. Das Gemisch wurde dann während 15 ,Minuten auf 70 ⁰C erwäj-rat, mit 100 pM des 5*-QH-Fragments

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1 und 10 pM des 34 Basenpaare-enthaltenden Sau3a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4 C während 5 Stunden in 50 ml 2OmM Tris-HGl (pH 7,5), 1OmM Mg Cl₂, lOtnM Dithiothreit, 0,5mM ATP und 10 Einheiten T4 DMS-Ligase hergestellt» Das Gemisch wurde der Elektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare—enthaltende Produkt wurde durch Elektroelution erhalten. Etwa 30 ng (LpM)- des 45 Basenpaare-enthaltenden Produkts wurden mit 0,5 ,ug (5 pM) des 150 Basenpaare-enthaltenden AVÄII Bglll-Fragments und 1 ,ug (2 pli) des 670 Basenpaare-entnaltenden^: BgIII - Pstl-Frägments vereint, Die Bindung wurde bei 20 C während 16 Stunden unter Verwendung von 20 Einheiten T4 DNS-Ligase hergestellt. Die Ligase wurde dann durch Erhitzen auf 65 C während 10 Minuten inaktiviert und das Geraisch wurde mit EcoRI und Pstl behandelt zwecks Spaltung von Polymeren des Gens, Das Geraisch wurde dann durch PAGE (6'%) gereinigt. Es Wurden etwa 20 ng (0,04 pH;)" des 865 Basenpaare-enthaltenden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Spaltstellen von pBR322 (0,3 /Ug) eingefügt, Die Transformation von E. coli 294 lieferte 70 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche TransfOrmanten»

Die aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNS wurde mit EcoRI und Pstl behandelt. 16 und 18 Plasmide besaßen ein EcoRI - Pstl-Fragraent, das 865 Basenpaare lang war. 1 /Ug eines dieser Plasmide (pLelF Al) wurde tnit EcoRI behandelt und an das 300 Basenpaare enthaltende EcoRI-Fragraent (0,1 ,ug) , das den E, coli trp-Promoter und die trp-Leader-Ribosotaenbindungsstelle enthielt, gebunden. Die den trp-P_ro-

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moter enthaltenden Transformanten wurden unter Verwendung einer trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness Kolonie-Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dem trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinenten, in denen der trp-Promoter·in der Richtung des LeIF Α-Gens oriervtiert war.

I» In.vitro und in vivo Aktivität von LeIF A

Extrakte für den IF-Assay wurden folgendermaßen hergestellt: l_w„ ral-Kultu ren würden in L-B ruhe, en thai t end: 5 :./* 9/ral Tet ra- cyclin, bis zu einem A₁-J-Q-Wert von etwa 1,0 aufgezogen, dann mit 25 ml M9-Mediura, enthaltend 5 ,ug/ml Tetracyclin verdünnt. Wenn der A₅₅₀-WeTt 1,0 erreicht hatte,- wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8,0 und ,50-mM EDTA susp^:endi;ert.-. 1. mgVLysp^yrir'wurde ;^: zug.es-etzt> undinach^ 5ma.notiger Aufbewahrung bei O C wurden die Zellen durch Ultrabeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15,000 U/Min) und die Interferon-Aktivität im Oberstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LeIF-Standard nach dem CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von IF-Molekülen

8 pro Zelle wurde eine spezifische LeIF-Aktivität von 4 χ

Einheiten pro mg verwendet. ' , . '

Wie in Tabelle^ 1 gezeigt, liefert Klon pLeIF A trp 25, in dem der trp-Promoter in der richtigen Richtung orientiert

ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 χ 10 Einheiten pro Liter)* Wie in Tabelle 2 gezeigt,, verhält sich das von E, coil K-12 Stamm 294/pLeIF A trp 25 hergestellte Interferon wie

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. - 34 -

authentisches Hutnan-LelF; es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-anti-Huraan-Leukozyten-Antikörper neutralisiert, Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20,000.

Der Machweis von in vivo-Aktivität von Interferon macht die Gegenwart von Makrophagen und natürlichen Kil'lerzellen (NK) notwendig, und es scheint, daß diese Zellen stimuliert werden« Es war daher möglich, daß das von E* coli 294/pLeIF A produzierte Interferon, das im Zellkultur-Assay antivirale Aktivität zeigfe^ an infizierten Tieren inaktiv ist.. Ferner ist es durchaus möglich, daß sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosylierten LeIF A von der des glykosylierten Interferons, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet. Es wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell herges:teHtem«^;:L-eIF'A-(2 % rein) und von aus Leukozyten isoliertem LeIF (8 % rein) miteinander verglichen, und zwar an Hand der lethalen Enzephalomyocarditis (EHC) bei Totenkopfäffchen (Tabelle 3).

Tabelle 1: Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli

E. coli K-12	Zelldichte	IF-Ak	tivität	LeIF-MoIeküle	Zelle
Stamm 294	(Zellen/	E/ml	Kultur	pro
transformiert	ml)
durch	3,5 χ 108				tooo
pLeIF A trp 25	1,8 χ 109	36,	000	9.	,000
pLeIF A trp 25	250,	000	12.

62 990 12

Tabelle 2: Vergleich der Aktivität von Extrakten aus E, coli 294/pLeIF A 25 mit Standard-LelF

x)

	Interferon-Aktivität (E/ml)	pH 2	Kaninchen-anti- Human-Leukozyten Antikörper
	unbehandelt	500 500	.-.< 10 4 10
294/pLeiF A trp 25- Extrakt LelF-Standard	500 500

^x' Der 250,000 E/ml enthältende Extrakt von E.. coli 294/ pLelF A trp 25, der in Tabelle 1 beschrieben wird _f /wurde auf das?*'5©Öf/ädhe^;!<verdoiitvi?mit·'Minimäliji-eäiufiii'i/i s^:ä>d..äB--efc^:-eirv^;e⁵:*^s spezifische Aktivität von 500 E/ml aufwies« Ein vorher gegen NIH-Leukozyten-Interferon-Standard titrierter Leukocyten-Interferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500 E/ml verdünnt. Aliquote Teile (jeweils 1 ml) wurden:mit 1 N HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4 C inkubiert, durch Zusatz von NaOH neutralisiert und die IF-Aktivität nach dera Standard-CPE-Hemmtest bestimmt. Aliquote Teile (25 ,ul) der 500 E/ml-Proben (unbehandelt) wurden mit 25 ,ul Kaninchen-anti-Human-Leukozy-

ten-Interferon während 60 Minuten bei 37 C inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 χ g während 5 Minuten und der Überstand getestet.

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Tabelle. 3:

Antiviraler Effekt verschiedener LelF-Präparate gegen EMG Virus-Infektionen bei Totenkopfäffchen

Behandlung	Oberle	tag	2	)	Serum PFU/ml	3	)	Tag 4
	bende	10	I3	Tag	) 4 )	105)
Kontrolle	0/3	O		3 XlO4	)	1,200 )3.4x10
(Bakterien		O.		O		O )
proteine)				0
Bakterielles		O				O
LeIF A-	3/3	O		O		O
		O		O.		O
		o;		. O		O
LeIF-Standard:	3/3	O	O		O
			O

Alle Affen waren männlichen Geschlechts (mittleres Gewicht 713 g) und.besaßen keine EMC Virus-Antikörper vor der Infektion« Die Affen wurden intramuskulär mit 100 χ LD._fl EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Kontrolltiere starben 134» 158 und 164 Stunden nach der Infektion. Die Interferon-Behandlung mit 10 Einheiten erfolgte intravenös, und zwar -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 und 240 Stunden nach der Infektion* Bei dem bakteriellen Leukozyten-Interferon.handelte es sich um eine Säulenchromatographie-Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit einer spezifischen Aktivität von 7,4 χ 10 E/mg Protein.. Die bei den Kontrollen verwendeten

62 990 12 - 37 -

Bakterien-Proteine waren der Säulenfraktion des Lysats von E, coli 294/pBR322 bei doppelter Gesatntproteinkonzentration äquivalent. Bei dem Leukozyten-Interferon-Standard handelte es sich um durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen menschlichen Zellen, das chromatographisch auf eine spezifische Aktivität von 32 χ 10< 5/mg 'Protein gereinigt war»

Die Kontrolltiere verloren das Gleichgewicht _t zeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmaßen und wäßrige Augen, beginnend etwa 8 Stunden· vor "dein Tod, Die mit Interferon behandelten Affen zeigteft^k^ih^^dii^r^bhortnalitäten; sie blieben während der gesamten Zeit aktiv und entwickelten keine Virämie« Der eine Affe der Kontrollgruppe der innerhalb von 4 Tagen keine Virämie. entwickelte,, starb zuletzt (164 Stunden nach der Infektion) _r aber zeigte nach dem Tode hoh©"Virus~Titer im = Herzen·¹ und'Gehirn, Di©·.* Interfe-, ron-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde* Die Ergebnisse zeigen somit, daß der antivirale Effekt der LeIF-Präparate an den infizierten Tieren lediglich der Wirkung des Interferons zugeschrieben werden kann^ da die. kontaminierenden Proteine des bakteriellen und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig unterschiedlich sind, Außerdem deuten die Ergebnisse darauf hin, daß für eine in vivo antivirale Aktivität von LeIF A eine Glykosylierung nicht notwendig ist. :

62 990 12 - 38 3» Isolierung von cDNS für weitere Leukozyten-Interferone

DNS aus dem Plasmid, das DNS für das vollständige LeIF A enthält, wurde mit Pstl herausgeschnitten, elektrophoretisch

32

isoliert und mit P markiert. Die erhaltene radioaktiv markierte ONS'-wurde als Sonde für das Screening von zusätzlichen E. coli 294-Transformanten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in Teil C beschrieben, erhalten wurden £~~nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von Grunstein und Hogness (siehe oben) J. Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert. Plasmid-DNS aus diesen Kolonien sowie aus den zehn hybridisierenden Kolonien, die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit Pstl herausgeschnitten und nach drei, verschiedenen Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese Pstl-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit der Restiktions-Endonucleasen BgIII,PvuII und EcoRI entstanden, charakterisiert. Die Analyse erlaubte die Klass-Klassifizierung von mindestens acht unterschiedlichen Typen (LeIF A, LeIF B₁ LeIF C,. LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H), dargestellt in Figur 5, wie einen Oberblick über die Lage der verschiedenen Restriktionsstellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LeIF A gibt. Ein Typ von- diesen, LeIF D, ist anscheinend identisch mit dem von Nagata et al. , Nature 284, 316 - 320 (1980), beschriebenen LeIF,

Ferner wurden verschiedene DNSs mit dem von Cleveland et al. (Cell 20, 95 - 105 /~~i980_/) beschriebenen Hybridisations-Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigkeit, LelF-mRNS

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selektiv von PoIy-A enthaltender RNS aus KG-I Zellen zu ent-• fernen« In diesem Test waren LeIF A, B, C und F positiv. Schließlich wurden letztere Pstl-Fragmente in Plastnide eingefügt, E, coil 294 wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden exprimiert..Die exprimiert.en Pro- ^-s dukte, von denen man annahm, daß sie Präinterferone wären, waren im CPE-Assay auf Interferon-Aktivität alle positiv» wobei nvir das LeIF F-Fragment geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alle LeIF-Typen sequenziert.

!<♦ Direkte Expression, eines zweiten reif an . Leukozyten-. Interferons (LeIF B)

Die Sequenz des isolierten DNS-Fragments * welches das Gen für reif es. LeIF B, enthält, zeigt, daß die ersten vierzehn Nucleotide ,für LeIF A> und, B identisch sind«, Folglich wurde ein Fragment aus ρ lsi F A25, das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und den 8'eginn des LeIF A' ·'"' . (=B)-Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Expressions-Plasrnid kombiniert, Die Restriktionskarten für die Pst-Fragmente von PL4 ( ein Plasmid,, enthaltend das LeIF B-Gen aus Figur 5) und pLelF A25 sind in den Figuren 7a und 7b dargestellt.

Um das etwa 950 (=Basenpaare) lange Sau3a-Pstl-Fragment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in diesem Bereich liegender Sau3a-Restriktionsstellen, Es wurde folgendermaßen vorgegangen:

62 990 12 - 40 -

1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert:

a) 110 b.p. aus Sau3a-EcoRI;

b) 132 b.p. aus_:EooRI-Xba;

c) 700 b.p. aus Xba-Pst.

2. Die Fragmente (la) und (Ib) wurden miteinander verbunden und mit Xba und BgIII behandelt, um Selbstpolyraerisation über die Sau3a- und Xba-Enden zu verhindern (die entsprechende Sau3a-Spaltstelle lag innerhalb einer Bglll-Spaltsteile; Bgril-Schnitte hinterlassen ein Sau3a kohäsives Ende). Es wurde ein 242 b.p* enthaltendes Fragment isoliert,

3. Das Produkt von (2) wurde mit (Ic) verbunden und mit Pstl und BgIII behandelt, wieder um Selbstpolymerisatipn zu verhindern. Ein etwa 950 b.p. enthaltendes' Fragment _t Sau 3a-Pstl (siehe Figur 7a) wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt denjenigen Teil des Le IF B-Gens, der keine Entsprechung beim LeIF A hatte·

4. Ein etwa 300 b.p» enthaltendes Fragment (HindIIl-Sau3a)y das den trp-Proffioter-Qperator> die Ribosomenbindungssteile _t das ÄTG-Startsignal und den Cystein-Codon von LeIF A enthielt, wurde aus pLeIF A25 isoliert.

5» Ein etwa 3600 b.p. enthaltendes Fragment (Pstl-Hindlll) wurde aus pBR322 isoliert. Es enthielt das'Replikon, das Tetracyclin-Resistenz, nicht aber Ampicillin-Resistenz kodiert.

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6« Die Fragmente, die gemäß 3_f 4 und 5 erhalten wurden, wurden miteinander verbunden und mit dem resultierenden Plasmid wurde E, coll K-12 Stamm 294 transformiert.

Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 - 1523 £~±979_J) und Plasmidproben wurden mit EcoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Ein EcoRI-EcoRI trp Promoter-Fragment ι 2) das innere EcoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment von Translations-Startsignal bis zur Eco-RI Spal t s t el 1 e ' von pL4.»

Im CPE-Assay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, Aktivitäten von 10 χ 10 Einheiten Interferon pro Liter, bei Α,_₅η = 1» Ein repräsentativer Klon,, der in dieser Weise hergestellt vvurdei ist E. coll 294/PLeIFB^tTp* 7.

L. Direkte Expression weiterer reifer Leukozyten Interfero ne¹ (LeIF C, D, F, H, I und 3)

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen LeIF-Typen können geschneidert und in Vektoren eingebaut werden zwecks Expression in Analogie zu der für das LeIF A beschriebenen Weise. Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden,, ob eine'Restriktionsstelle genügend nahe an dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferons liegt, so daß die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LeIF A verwendet werden kann, d. h. die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restrik-

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tionsschritt und Ersatz der aminoendständig zusammen mit der Präsequenz verlorenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNS-Fragraents. Sollte dies nicht der Fall sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an der Stelle abgetrennt, an der der Cödon für. die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar dadurch, daß

1. in der Umgebung dieses Punktes die doppelsträngige DNS in einsträngige DNS übergeführt wird;

2. die im ersten Schritt gebildete einsträngige Region mit einer komplementären Starter-Sequenz einer einsträngigen. DMS hybridisiert wird, deren 5'-Ende gegenüber dem' Mukleotid liegt ₇ das an die: beabsichtigte'· Spaltstelle grenzt;.

3. derjenige Teil des in 3'-Richtung des Starters liegenden zweiten Stranges, der in (1) eliminiert wurde, durch Umsetzung mit DNS-Polymerase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-haltigen DeoxynucelOtid-triphosphaten wieder hergestellt wird und

4. die verbleibende einsträngige DNS-Sequenz, die über

die beabsichtigte Spaltstelle hinausreicht, abgebaut wird.

Eine kurze synthetische DNS-Sequenz» die am 3'-Ende des kodierenden Stranges, mit dem Translations-Startsignal ATG

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endet, kann dann verbunden werden, z. B, über stumpfe Enden, mit dem zurechtgeschnxttenen Gen für die reifen Interferone. Die Gene können in ein Plasraid eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters und seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden.

In ähnlicher Weise, wie es in Abschnitt K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente* die für LeIF C und LeIF B kodieren aufgebaut, zwecks direkter Expression in Bakterien. Bei der Strategiej die zur Expression dieser weiteren Leukozyten-Interf eron.e·.·' führte:,.· wurde,;; in 3edem-i Falle auf dass etwä^ 300. "Bas ehpaäre-en thai tend e Fragment (i-3indIII-SaÜ3ä·') , das d'sn trp-Promoter-Gperator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG Startsignal und den Cystein-Codon von LeIF A aus PLeIF A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Fragment wurde kombiniert mit den Fragmenten anderer Interferone,- die die ·*· entsprechenden?' ApitiosäureäeCjueKi-zeh:, die-^v; au_:f deii^' allen'' getnsinsSinen''' Cysteinrest folgen, kodieren. Oedes erhaltene Plasmidwurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet»

Für die einzelnen Gene waren folgende Schritte notwendig:

LeIF C

Isolierung der folgenden Fragmente aus pLeIF C:

(a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau 3a - Sau 96;

(b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau 96 - Pst I;

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(c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-enthaltenden Fragments (Hindlll - Sau3a) aus pLelF A-25, wie in Teil K (4) oben beschrieben;

(d) Isolierung des etwa 3600 Sasenpaare-enthaltenden Fragments aus Abschnitt K (5) oben.

Konstruktion:

(1) Verbindung von (a) mit (c). Spaltung mit BgIII, Hind III und Isolierung des. etwa 335 Basenpaare-enthaltenden Produktes.

(2) Verbindung der unter (I)* (O)' und (d) erhaltenen Bruchstücke und Transformierüng von E. coil mit dem resultierenden Plasmid,

Ein repräsentativer Klon, der auf diese Weise erhalten wurde, ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF C trp 35.

LeIF D

Aus pLelF d wurden isoliert:

a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Sau3a-AvaII); .

b) ein 150 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Avall-Bglll) und

c) ein etwa 700 Basenpaare-enthaltendes Fragment (BgIII-Psti).

62 990 12 - 45 Aus pLelF A25 wurde isoliert:

d) ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a).

Aus P.B.R322 wurde isoliert:

e) ein etwa 3600 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Hindlll-Pstl).

Konstruktion

(1) Die Verbindung von (a) mit (b), Spaltung mit BgIIi und

Reinigung liefert ein 185 Basenpaare-enthaltendes Produkt.

(Z) Die Verbindung,von (1) mit (d) ₃ Spaltung.mit Hindill und BgIlI und Reinigung liefert ein etwa 500 Sasenpaare enthaltendes Produkt.

(3) Die Fragmente (2), (c) und (e) wurden miteinander verbunden und E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert.

Ein in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

LeIF F

Bei der Konstruktion eines vollständigen LeIF F Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1 - 13"zwischen LeIF 3 und LeIF: F zunutze machen. Ein den trp Promotor enthaltendes Fragment (A) mit geeignet konstruierten Enden wird aus

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pHGH207 erhalten, das oben beschrieben ist, über die Behandlung mit Pst I und XBa I und anschließende Isolierung eines ca* 1050 Basenpaare enthaltenden Fragments» Ein zweites Fragment (B) steht in dem größeren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHky 10 mit Pstl und BGlII entstandenen Fragmente zur Verfugung. !Das Fragment A^v enthält etwa da's halbe die Ampicillinre.sistenz kodierende Gen, während Fragment B den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die Tetracyclinresistenz bis auf den zugehörigen Promotor enthält. Die Fragmente A und 8 werden mittels T4 Ligase kombiniert und chas erhaltene Produkt wird mit XbaL und'" BgIII" behandelt, um Dimerisierungeri auszuschließen.. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promoter-Operator sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz enthält,

Ein Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaären wird durch Behandlung von pLelF F mit Avail und BgIII erhalten. Dieses Fragment enthält die Codons für die Aminosäuren 14 - 166 von LeIF F.

Ein Fragment (e) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von pLelF B mit Xbal und Avail erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1 - 13 von LeIF F,

Die Fragmente (c)χ (d) und (e) werden in Gegenwart von T4 Ligase miteinander verbunden. Die kohäsiven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, daß das entstehende Plasraid in der richtigen'Weise, gebildet wird, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz unter die Kontrolle des trp Promoter-Operators gebracht wird,» zusammen mit dem Gen für reifes LeIF F, so daß die damit transformierten Bakterien

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auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistenz selektioniert werden können. Ein auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLeIF F trp 1.

LeIF H

Das für die Expression von reifem LeIF H geeignete Gen kann folgendermaßen hergestellt werden:

1» Plasmid pLelF H wird der Behandlung rait Haell und. Rsal unterworfen und ein S16 Basenpaäre-'enthaltendes Fragment wird isoliert, welches den Bereich von der Aminosäure 10 des Signalpeptids bis zur 3' nicht codierenden Region kodiert.

2. Das Fragment wird, denaturiert" und; 'd%r R-epsrätüf synthese mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase i (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 6_5, 168 (1970)) unterworfen, bei der der synthetische Deoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird.

3. Das erhaltene Produkt wird mit Sau3a gespalten und ein 452 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Aminosäuren 1-150 kodiert, wird isoliert.

4. Die Behandlung von pLeIF H mit Sau3a und Pstl und. die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthaltenden Fragments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert.

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5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden Fragment

Met Cys ATG TGT ..

Asp Stop ... GAT TGA ... .— Pst I,

Sau3a , das die 166 Aminosäuren des LeIF H kodiert.

6. pLeIF A trp 25 wird zunächst mit Xbal, dann mit DNA Polymerase I und schließlich mit Pst I behandelt. Das resultierende große Fragment kann isoliert und mit dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Plasmid, mit detn E. coli K-12 Stamm 294 oder ein anderes 3akterium transformiert werden kann.» das dann in der Lage, ist, reifes LeIF. H. zu exprimieren.

LeIF I .

Die von Lawn et al., (Cell 15, 1157 1978) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen R Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen untersucht _} wobei die von Lawn et al. (siehe oben) und Maniatis et al. (Cell 15/ 687 l_ 1978_/) angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDNS des LeIF A-Kbns abgeleitete radioaktive LeIF-Sonde wurde verwendet, um etwa 5000,000 Plaques zu testen. Sechs LeIF-Klone wurden bei diesem Screening erhalten. Nach nochmaligem Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt. '.' '

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Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLelF-Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet' werden , ura weitere Leukozyten-Interferon-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.

1» Das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment des Klons HLeIF2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in p8R325 kloniert. Das resultierende Plasmid LeIF E wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthaltende Fragment isoliert. Das Dep^yoligonukleotid ,dAATTCTGCAG, (ein EcpRI -.P.,st.I_!-K.onyerter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment gebunden und das resultierende Fragment mit Pstl gespalten, so daß man ein 2000 Basenpaare-enthaltendes Fragment mit Pstl-Enden erhielt. Dieses wurde mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus IIOÖ Basenpaaren wurde isoliert, weiches ein Pstl- und ein Sau96-Ende besaß.

2. Das Plasmid pLeIF G trp. 35 wurde mit Pstl und Xbai behandelt. Das große Fragment wurde isoliert,

3. Das kleine Xbal - Pstl-Fragraent aus pLelF C trp 35 wurde mit Xbal und Sau96 behandelt. Ein 40 Basenpaare-enthaltendes Xbl-Sau96-Fragment wurde isoliert,

4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden zu dem Plasmid pLeIF I trp 1.

62 990 12 - 50 LeIF G

1, Das Plasmid pLeIF G enthält ein aus 3800 Basen be'stehendes Hindlll-Fragment des menschlichen Genoms, welches die LeIF.G-Gensequenz umfaßt. Ein 760 3asenpaare-enthaltendes Ddel Rsal-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.

2, Das Plasmid pLeIF B trp 7 wurde mit Hindlll und Ddel gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes Hindlll-Odel-Fragment isoliert.

3» Das Pläsrnid pBR322 wurde mit Psti gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) und schließlich wurde mit Hindlll behandelt» Das große,, etwa 3600 Basenpaare-enthaltende Fragment wurde isoliert.

4, Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden miteinander verbunden zu dem Plasraid pLeIF G trp 1.

M* Reinigung

Der Leukozyten-Interferon-Gehalt von Bakterienextrakten kann durch die folgenden Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolg-e erhöht werden:

1. Polyethylenirainfällung, bei der der größte Teil der cellulären Proteine, einschließlich des Interferons, im Ober- . stand verbleibt.

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2. Ammoniumsulfatfraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55 % mit Ammoniurasulfat aus der Lösung ausfällt«

3» Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M Kaliumphosphat, 1OmM Tris-HCl (pH 7,2) und Dialyse gegen 25 mM Tris-HGl (pH 7,9),wobei die Interferonaktivität in der Lösung bleibt.

4 ;,,,, Chromatographie des Qberstandes, auf ein pH von 8,5 eingestellt,, an einer DEAE-Cellulose-Saule (Elution mit einem linearen Gradienten von O bis 0,2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5).

5, Adsorption an Cibachrom Blau-Agarose,bzw, Hydroxylapatit und*Elutio_;rf mit I',5 _r;M^; KCl · bzw^:. 0,2 M PHos:phätlö_:sürigi (f/ tativ).

R) 6* Fraktionierung an einer Sephadex^^ G-75 Säule.

7, Kationenaustauschchroraatograpnie an CM-Cellulose in 25 mM Amraoniumacetat bei pH 5,0 mit einem Aramoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Ammoniumacetat),

Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren erhält man, ein Material von einer Reinheit mit über 95 %.

Das Material kann auch gereinigt werden durch Größenausschluß-Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-S) oder Affinitätschroraatographie an immobilisierten Antiinterf eron-Äntikörpern.,

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Ferner kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243, 66 (1980) beschrieben,, hergestellt wird und mit 0,2 M Essigsäure, 0,1 % Triton und 0,15 M NaCl eluiert Werden.

In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das erfindungsgeraäß erhaltene Interferon folgendermaßen gereinigt werden; _v

1. Gefrorenes Zellmater±al M^r&%e$h&0*ߣh zerkleinert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen VoIu^- men des Puffers A, enthaltend 0,1 M Tris (pH 7,5 - 3,0), pH 7,5 - 8,0), 10 % (w/v) Saccharose, 0,2 M NaCl, -5mM.-ED.TA, Q_#,l rnR PMSF und 10 - 100 mM MgCl₂, suspendiert .,,Die_: Suspensaob vvirdvdarm 2 χ bei 4 C unter einem Druck von etwa und weniger als 70 Atmosphären durch einen Homogenisator gegeben und- schließlich in einem Eisbad gekühlt.

2* Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenirain bis zu einer Konzentration von etwa 0,35 % zugesetzt. Das Gemisch wird stehengelassen und die Feststoffe werden durch Zentrifugieren und Filtration getrennt» Bei diesem Schritt wird die Temperatur unter 10 C gehalten. Der überstand (bzw. das.Filtrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die Lösung wird notfalls noch einmal durch eine mikroporöse Membran filtriert»

3, Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler

62 990 12 - 53 -

Antikörper bei einer Durchflußrate von 5 - 8 cm/Stunde (z. B, 25 - 40 ml pro Stunde bei einem Säulendurchmesser von 2,6 cm) gegeben. Es wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolurnen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8:,5) , 0,5 M NaCl und 0,2 % eines Detergenzes, wie Triton X-IOO enthält, gewaschen. Anschließend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M NaCl und 0,1 % eines Detergenzes, «/ie Triton X-IOO, enthält gespült. Die Säule wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton X-IOO, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden zus^ajiraengef aßt und mit ;|...JsL$aO$ oder_: 1,0.. M^^ris-Bas^. g^ einen pH von etwa" 4,5 gebracht,

4* Diese Fraktion wird dann auf einen Kationenaustauscher _t beispielsweise Whatmann CM52-Cellulose, der vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Ammoniunacetat, pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurde, gebracht. Es wurde dann mit dem Puffer so lange gewaschen ,' bis die UV-Absorption im Eluat konstant war« Die Säule wurde dann ,mit 25 .mM Ammoniumacetat/0,12 M iNatriumchlorid eluiert und das Eluat wurde in üblicherweise aufgearbeitet.

Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al. , Proc* Natl» Acad. Sei. U,S.A, 7Έ, 1848 - 52 (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Reinigung und Bindung der raonoklonalen Antikörper an Affigel-10 wird im folgenden beschrieben.

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Gewinnung und Reinigung monoklonaler Antikörper aus Aszites-Flüssigkeit ;

Fünf weibliche Balb/c Mäuse wurden jeweils mit 5 - 10 χ Hybriddomzellen aus der Mitte der logarithmischen VVachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) wurden jeweils mit 5 χ 10 lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert.

Die Aszites-Flüssigkeit jeder Maus wurde gesammelt· Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten mit 500 - 1000 χ g und dann 90 Minuten mit 18000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert* Der Oberstand wurde gefroren und bei -20 C

Q deni:.,Auf tauen., wurde .weiteres, f este.s, Material

durch 90. minütiges. Zentrifugieren mi,t. 35OÖO_: Umdrehungen pro Minute entfernt. Die von jeder Maus erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikörperbindungstest (Staehelin et al», siehe oben) getestet und, wenn möglich, zusammengefaßt.

Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, daß in einer 1 cra-Küvette 1 rag Protein eine Absorption von 1,2 bei 280 nm lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit einem hohen Antikörpergehalt enthielten 30 - 35 mg Protein/ml. Dies entspricht etwa 4 - 7 mg spezifischem Antikörper/ml. Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3, 0,15 M NaCl) auf eine Proteinkonzentration von 10 - 12 mg/ ml.

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Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0 C unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Amnjoniumsulfatlösung gegeben. Die Suspension wurde während 40 - 70 Minuten in Eis aufbewahrt:, dann während 15 Minuten bei 4 C mit .10,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert«. Der Oberstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9)/0,04 M NaCl (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16 - 18 Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers I dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen ρro_; Minute zen.tr.if.^: agiert^« Etwa, 30; - 3tT% des ursprünglichen GeSaffltproteingehaltes der Aszates-Flüssigkeit würde wiedergefunden mittels Messung der Absorption bei 280 nm.

Eine Lösung, enthaltend 30 - 40 mg Protein/ml wurde dann auf sine DEAE-Cellulosesäule, die mit'Puffer I äquilibriert war» gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Säulenvolumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,04 M - 0,5 M) in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem NaCl-Gehalt von 0,06-0,1 M worden zusammengefaßt, konzentriert und mit bei Zimmertemperatur gesättigter Amraoniurasulfatlösung versetzt« Es wurde zentrifugiert , der Proteinkuchen wurde in 0,2 M NaHCQ, (pH etwa 8,0)/ 0,3 M NaCl (Puffer II) gelöst und bei Raumtemperatur gegen diesen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20.000 χ g zentrifugiert und der Proteingehalt wurde auf 20 - 25 mg/ml mit Puff er II eingestellt.

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- 56 Herstellung von Immunadsorbentien

Affigel-1Q (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen* Das Gel, das noch etwa 50 % Wasser enthielt^ wurde in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert. Der Überstand wurde verdunstet. Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4 C Ende-über-Ende rotieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M NaHCO-,/0,15 M NaCl) gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen. Die Proteinbestimmung zeigte, daß mehr als S0_ % des Antikörpers an das Gel gebunden 'worden.'war.

Um noch freie,, reaktive Bindungsstellen abzusättigen, wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gemischt und während 60 Minuten bei Raumtemperatur Ende-über-Ende rotieren gelassen. Schließlich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4 ⁰C in PBS in Gegenwart von 0,02 % (w/v) Natriumazid aufbewahrt.

N. Parenterale Applikation

LeIF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immunsuppresive Zustände aufweisen. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Interferone kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials,

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das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wurde, anlehnen und

kann z. B. etwa 1 - 10 χ 10 Einheiten pro Tag, im Fall von

Material mit einer Reinheit, die größer ist als 1 %, bis zu etwa 5 χ 10 Einheiten pro Tag betragen.

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden/ daß raan 3 mg bakteriell hergestelltes LeIF mit einer spezifischen Aktivität

von etwa 2 χ 10 Einheiten pro mg in 25 ml 5 N humanem Seruraaiburain löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung,aseptisch in 100.Ampullen abfüllt, von denen jede 6 χ 10 Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20 ⁰C) aufbewahrt.

Die\H e r.s teilung: pharmaze.u t iseh e r P räpa r a t e~-_t di@\- er fin dungs-'^f gemäße Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerraaterialien,wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen»

Claims (8)

1. 62 990 12

   - 58 ErfIndunqsanspruch

   1, Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz eines reifen Huraan-Leukozyten-Interferons ohne Präsequenz fähig sind, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus rait einem zur Expression eines solchen PoIypeptids befähigten replikablen Vektors transformiert und kultiviert.

   .2. Veriahnenv nach .Punkt l, gekennzeichnet, dadurch, daS,. der Vektor zur Expression eines Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines aminoendständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons befähigt ist»

   3.*._Λ Verf äftrenV naöi?· Punkt i", gekennzeichnet dadurch * daß d'eV . Vektor zur Expression eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz eines aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder tnikrobielles Signalprotein verlängerten reifen Huraan-Leukozyten-Interferons befähigt ist,

   4· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression eines Polypeptids mit der Arainosäurepartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Aer befähigt ist.

   5* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression eines Polypeptids befähigt ist, daß die in Fig. 4 in Zeile "All" angegebenen Aminosäuren an den angegebenen Stellen der Aminosäuresequenz enthält.

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2. 6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon
   (LeIF) A₁-B, C₁ D', F, H, I oder CI befähigt ist.
3. 7. Verfahren änach Purik'ti I₁,,. gekennzeichnet dadurch ,,·., daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon

   A (LeIF A) befähigt ist.
4. 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der

   Vefctor:; zur'ExpjressaoiT¹' von: HumaTi-LeUkozytoh-Inte^f^e'roh· B^: (LeIF B) befähigt ist.

   9» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Hümäh-Leukozyten-Interferon C (LeIF C) befähigt ist.

   IQ, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon D (LeIF D) befähigt ist,,
5. 11. Verfahren nachPunkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon F (LeIF F) befähigt ist.
6. 12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon H (LeIF H) befähigt ist.
7. 13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon I (LeIi=¹T)' b'äfaKigt isW . " ' '"--Λ'

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   14· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor zur Expression von Human-Leukozyten-Interferon D (LeIF O) befähigt ist.

   15« Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 14, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
8. 16. Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium E. coli ist»

   -Hierzu 10 Blatt Zeichnungen -