PL148260B1 - Method of obtaining mature interferon of human leucocytes - Google Patents
Method of obtaining mature interferon of human leucocytes Download PDFInfo
- Publication number
- PL148260B1 PL148260B1 PL1981231940A PL23194081A PL148260B1 PL 148260 B1 PL148260 B1 PL 148260B1 PL 1981231940 A PL1981231940 A PL 1981231940A PL 23194081 A PL23194081 A PL 23194081A PL 148260 B1 PL148260 B1 PL 148260B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- interferon
- human leukocyte
- dna fragment
- leukocyte interferon
- lelf
- Prior art date
Links
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims description 77
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 74
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 135
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 72
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 70
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 24
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 21
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- HGKJFNCLOHKEHS-FXQIFTODSA-N Met-Cys-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O HGKJFNCLOHKEHS-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 claims description 2
- GZBZACMXFIPIDX-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(=O)O GZBZACMXFIPIDX-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- NTRAGDHVSGKUSF-AVGNSLFASA-N Leu-Arg-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NTRAGDHVSGKUSF-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 2
- 108010081985 glycyl-cystinyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 2
- OJQJUQUBJGTCRY-WFBYXXMGSA-N Cys-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OJQJUQUBJGTCRY-WFBYXXMGSA-N 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 81
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 65
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 16
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 16
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 16
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- 101001034833 Homo sapiens Interferon alpha-21 Proteins 0.000 description 4
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 4
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 4
- 102100039729 Interferon alpha-21 Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- 101100244921 Homo sapiens PRDX1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102100029139 Peroxiredoxin-1 Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- -1 diazobenzyloxymethyl Chemical group 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101001028702 Homo sapiens Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Proteins 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037173 Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Human genes 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 238000002238 CM-cellulose chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100536354 Drosophila melanogaster tant gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100277637 Mus musculus Dffa gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002341 glycosylamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- TZZZDHRJSLJNBU-UHFFFAOYSA-N guanidine;thiocyanic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.SC#N.NC(N)=N.NC(N)=N TZZZDHRJSLJNBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 208000018883 loss of balance Diseases 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108091007054 readthrough proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000012863 translational readthrough Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dojrzalego interferonu leukocytów ludz¬ kich, zawierajacego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy do N-kotfca pierwszego amino¬ kwasu tego interferonu przylaozona jest metionina, zawierajacego 166-167 aminokwasów i o czesciowej sekwenoji Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser,jak przedstawio¬ no na sekwencjach na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 159.Interferon ludzkich leukocytów /LelF/ zostal po raz pierwszy odkryty i otrzymany w po¬ staci bardzo surowych osadów przez Isaacs'a i Lindenmanna /Proc. R. Soc, B 147, 258-267 /1957/. Od tego czasu podjeto wysilki majace na celu oczyszczenie i charakterystyke tego materialu, co doprowadzilo do otrzymania wzglednie jednorodnych interferonów leukocytów ludzkich otrzymanych od zdrowyoh lub o horyeh na bialaczke dawoów leukocytów /opis paten¬ towy RFN nr 2947134/. Interferony te tworza rodzine bialek znanych z tego, ze posiadaja zdolnosc nadawania komórkom docelowym stanu opornosci na wirusy. Oprócz tego, interferon moze hamowaó namnazanie sie komórek i wplywaó na odpowiedz immunologiczna. Wlasciwosci te sklaniaja do klinicznego uzywania interferonu do leczenia zakazen wirusowych i chorób no¬ wotworowych.Interferony leukocytów oczyszczono do istotnej jednorodnosci /Rubinstein i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 76, 640-644 /1979/; Zoon i wsp., ibid., 76, 5601-5605 /1979/, o ciezarze czasteczkowym, jak doniesiono, w zakresie od okolo 17 500 do okolo 21 000.O Q Aktywnosc wlasciwa tych preparatów jest nadzwyczaj wysoka i wynosi 2 x 10 do 1 x 10 jednostek/mg bialka, ale wydajnosc z hodowli komórkowych jest zniechecajaco niska. Tym niemniej, postepy w metodach ustalania sekwencji bialek pozwolily na ustalenie czescio¬ wej sekwencji aminokwasów /Zoon i wsp., Science, 207, 527 /1980/; Levy i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5102-5104 /19B0/. Wyswietlenie sprawy glikozylacji róznych 148 2602 148 260 interferonów leukocytów nie jest dotychczas calkowite, ale obecnie wiadomo, ze róznice w glikozylacji wsród bialek tej rodziny nie wynikaja tylko ze apektrum zaobserwowanych ciezarów czasteczkowych. Natomiast interferony leukocytów róznia sie znacznie w skla¬ dzie aminokwasowym i sekwencji, a homologia aminokwasów jest w niektórych przypadkach nizsza od 80*.Chociaz izolowanie z leukocytów dawców zapewnilo dostateczna ilosc materialu do je¬ go czesciowej charakteryzacji i ograniczonych badan klinicznych homogennego interfero¬ nu leukocytów, to jest to calkowicie nieodpowiednie zródlo uzyskiwania interferonu w ilosciach niezbednych do badan klinicznych na wielka skale, a nastepnie szerokiego sto¬ sowania zapobiegawczego i/lub leczniczego. I rzeczywiscie, badacze kliniczni stosujacy obecnie w badaniach aktywnosci przeoiwnowotworowej i przeciwwirusowej interferony otrzy¬ mane z ludzkich leukocytów, byli ograniczeni do surowych / < 1S& czystosci/ preparatów tego materialu, a dlugi czas wytwarzania odpowiednich ich ilosci, nawet przy nierealis¬ tycznym poziomie cen, krytycznie opóznial badania na duza skale.Wraz z opracowaniem technologii rekombinantowego DNA, stalo sie mozliwe kontrolowane wytwarzanie przez drobnoustroje, bardzo wielu uzytecznych polipeptydów. Obecnie mozliwe jest, dzieki tej technologii, modyfikowanie bakterii w celu umozliwienia wytwarzania produktów polipeptydowych, takich jak somotostatyna, lancuch A i B insuliny ludzkiej i ludzki hormon wzrostu /Itakura i wsp., Science, 198, 1056-1063 /1977/, Goeddel i wsp., Nature, 281, 544-548 /1979/. Ostatnio uzyto technik rekombinantowego DNA w procesie bakteryjnego wytwarzania pro insuliny 1 tymoiyny o£ 1, a szereg autorów donioslo o utrzy¬ maniu DNA kodujacego interferon leukocytów ludzkich 1 bedacych wynikiem tego procesu bialek o aktywnosci interferonu leukocytów /Nagata i wsp., Nature, 284, 316-320 /19B0/, Mantei i wsp., Gene, 10, 1-10 /1980/, Taniguchi i wsp., Nature, 285, 547-549 /19B0/.Jednak wszystkie te wymienione publikacje lacznie opisuja klonowanie plazmidu zawie¬ rajacego wstawke genetyczna, kodujaoa wytwarzanie jedynie prekursorów interferonu leu¬ kocytów.W publikacji Nagata 1 wsp. opisano wyodrebnianie plazmidu E. ooll, zawierajacego gen interferonu leukocytów. Wskazano w niej, ze komórki E. ooli transformowane tym plazmidem wytwarzaja, w wyniku ekspresji, polipeptyd o aktywnosci biologicznej inter¬ feronu. Przyznano jednak, ze powstajacy w wyniku ekspresji polipeptyd moze nie byó dojrzalym interferonem leukocytów ludzkich, to jest, ze polipeptyd powstajacy w wyniku ekspresji moze zawierac presekwencje nie wystepujaca w postaci dojrzalego interferonu.W publikacji tej, na przelomie stron 319 i 320 stwierdzono: "Mozliwe jest takze, ze E. coli IP sklada sie z sekwencji Le-IP poprzedzonej sekwencja sygnalowa, gdyz analiza sekwenoji nukleotydowej klonowanego IP cDNA ujawnila obszar kodujacy 22 aminokwasy, wystepujacy za pierwszym AUG i poprzedzajacy obszar kodujacy dojrzaly IP /M. Schwarz- stein, N. Mantei i M. S., wyniki niepublikowanen.Wspomniana publikacja Mantei i wsp. opisuje sekwencjonowanie nukleotydu genu leuko¬ cytu klonowanego przez Nagata i wsp. 1 potwierdza, ze obszar kodujacy genu rzeczywis¬ cie zawiera sekwencje, kodujaca bialko sygnalowe. W podsumowaniu w publikacji tej stwierdzono: "Wstawka z 910 par zasad zawiera sekwencje kodujaca z 567 /lub 543/ par zasad, okreslajaca domniemany polipeptyd preinterferonu skladajacy sie z bialka syg¬ nalowego z 23 /lub mniej, mozliwe 15/ aminokwasów, po którym nastepuje polipeptyd interferonu zawierajacy 166 aminokwasów".We wspomnianej publikacji Taninguchi i wsp. porównano sekwencje cDNA wytworzonego przez Taninguchi i wsp. /Gene 10 /1980/, str. 11-157, kodujace interferon fibroblas- tów, i otrzymane przez Mantei i wsp., kodujace interferon leukocytów".Tak wiec, wszystkie dotychczasowe publikacje dotycza wytwarzania prekursorów in¬ terferonu leukocytów. W przeciwienstwie do tego, sposób wedlug wynalazku dotyczy wy¬ twarzania interferonów leukocytów ludzkich o pelnej dlugosci, którym nie towarzyszy zadna ludzka presekwencjs lub jej czesc, to jest dojrzalej postaoi interferonu leuko¬ cytów ludzkioh.148 260 3 Obecnie stwierdzono, ze zastosowanie technologii rekombinantowego DNA /to jest in- ssrcji genów interferonu do drobnoustrojowych nosników ekspresji i ich ekspresji pod kontrola drobnoustrojowych elementów regulatorowych genów/ mogloby byc* najskuteczniej- sza droga zapewnienia duzych ilosci interferonu leukocytów, który, pomimo braku w tak tworzonym materiale glikozylacji charakterystycznej dla materialu pochodzacego od czlowieka, móglby byc* zastosowany klinioznie w szerokim zakresie w leczeniu chorób wirusowych i nowotworowych.Sposób wytwarzania dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich, zawierajacego 165- -166 aminokwasów lub, w przypadku gdy do H-koóca pierwszego aminokwasu tego interfe- ronu przylaczona jest metionina, zawierajacego 166-167 aminokwasów, i o czesciowej sekwencji Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser,jak przedstawiono w sekwencjach na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 151» przez powodowanie wzrostu hodowli drobnoustrojów transformowanych zdolnym do replikacji drobnoustrojowym nos¬ nikiem ekspresji, i ekspresji interferonu, charakteryzuje sie tym, ze konstruuje sie wektor E. coli zawierajacy promotor trp. E. coli, operator i liderowe miejsce przy¬ laczenia rybosomów trp, izoluje sie fragment DNA kodujacy dojrzaly interferon leuko¬ cytów ludzkich i dokonuje sie insercji tego fragmentu DNA interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp. E. coli, operatorem i liderowym miejscem przylaczenia rybosomów trp, otrzymanym wektorem ekspresji E. coli zdolnym do ekspresji dojrza¬ lego interferonu leukocytów ludzkich transformuje sie w znany sposób szczep E. ooli i powoduje sie wzrost transformowanego drobnoustroju w pozywce zawierajacej dodatek tryptofanu w ilosci wystarczajacej do represji ukladu promotor trp - operator, obni¬ za sie poziom tryptofanu w pozywce az do indukcji transformowanego drobnoustroju do wytwarzania interferonu, po czym transformowany drobnoustrój poddaje sie lizie przez dodatnie lizozymu i nastepna sonifikacje, i wreszcie odzyskuje sie interferon w zna¬ ny sposób, zwlaszcza metoda stracania, za pomoca chromatografii typu "size ezclusion", wysokocisnieniowej chromatografii cieczowej z odwrócona faza /RP-8/ lub chromatografii powinowactwa na unieruchomionych przeciwcialach przeciw interferonowi.Otrzymywanie leukocytów genu stosowanego w sposobie wedlug wynalazku obejmuje na¬ stepujace etapy: 1/ Do skonstruowania próbek syntetycznego DNA, których kodony, w agregacie, repre¬ zentuja wszystkie mozliwe kombinacje nukleotydów zdolne do kodowania czesciowych sek¬ wencji aminokwasów stosuje sie czesciowe sekwencje aminokwasów interferonu leukocytów ludzkich, oczyszczonego do stopnia jednorodnosci. 2/ Przygotowuje sie zbiór kolonii bakteryjnych zawierajacych DNA komplementarny /cDNA/ do indukowanego informacyjnego RNA. Inny indukowany mRNA, znaczony promienio¬ twórczo, hybrydyzuje sie z plazmidowym cDNA tego zbioru. Zhybrydyzowany mRNA eluuje sie i bada pod wzgledem translacji do interferonu w oocytach. Plazmidowy DNA z kolonii, wykazujaoych w ten sposób indukcje aktywnosci interferonu, bada sie dalej przez hybry¬ dyzacje z próbkami przygotowanymi jako opisano wyzej w etapie 1. 3/ Równolegli z przystapieniem do czynnosci w etapie 2 otrzymany w plazmidach cDNA indukowany mRNA stosuje sie do tworzenia niezaleznego zbioru transformowanych kolonii. Próbki otrzymane w etapie 1 stosuje sie do prymowania syntezy znaczonego promieniotwórczo jednoniciowego cDNA, stosowanego w charakterze próbek do hybrydyzacji.Syntetyczne próbki zhybrydyzowane z indukowanym mRNA jako matryca wydluza sie za pomo¬ ca odwrotnej transkrypcji, tworzac indukowane, znaczone promieniotwórczo cDNA.Klony zbioru kolonii, które hybrydyzowaly z otrzymanym w ten sposób znaczonym pro¬ mieniotwórczo cDNA, bada sie dalej w celu potwierdzenia obecnosci genu kodujacego in¬ terferon, o pelnej dlugosci. Kazdego z fragmentów genu otrzymanych w etapie 1 lub 2 o domniemanej czesciowej dlugosci mozna uzyc jako próbki dla genu o pelnej dlugosci; 4/ Gen o pelnej dlugosci, otrzymany jak opisano wyzej, poddaje sie obróbce z uzy¬ ciem syntetycznego DNA, eliminujac jakakolwiek sekwencje liderowa, mogaca zapobiegac bakteryjnej ekspresji dojrzalego polipeptydu i w celu umozliwienia prawidlowego umiej¬ scowienia w nosniku ekspresji drobnoustrojowego promotora w odniesieniu do sygnalów4 148 260 startu i miejsca przylaczenia rybosomów. Powstaly w wyniku ekspresji interferon oczy¬ szcza sie do punktu pozwalajacego na potwierdzenie jego charakteru i oznaczenie aktyw¬ nosci; 5/ Fragment genu interferonu, przygotowany w powyzszy sposób, stosuje sie jako prób¬ ke do hybrydyzacji dla innych, czesciowo homologicznych, rodzajów interferonu leukocytów.Czynnikiem glównie wykorzystywanym w technologii rekombinantowego DNA jest plazmid, niecnromosomaIna petla dwuniciowego DNA znajdowana w bakteriach i innych drobnoustro¬ jach, czesto w wielu kopiach na komórke. W sklad informacji kodowanej przez plazmidowy DNA wchodzi informacja wymagana do replikacji plazmidu w komórkach potomnych /to jest "replikon"/ i zwykle jedna lub wiecej selekcyjnych cech charakterystycznych takich jak, w przypadku bakterii, opornosc na antybiotyki, która pozwala na rozpoznanie klonów ko¬ mórek gospodarza zawierajaoych plazmid, o którym mowa, i uprzywilejowany wzrost w wy¬ biórczych podlozach.Uzytecznosc plazmidów polega na tym, ze moga byc one specyficznie rozszczepione przez taka lub inna endonukleaze restrykcyjna, czyli "enzym restrykcyjny", z których kazdy roz¬ poznaje odmienne miejsce w plazmidowym DNA. Nastepnie mozna wprowadzic do plazmidu frag¬ menty heterologicznych genów lub genu przez laczenie konców w miejscu rozszczepienia, lub zrekonstruowanych konców przylegajacych do miejsca rozszczepienia. Rekombinacja DNA przeprowadzana jest poza komórka, ale wynikajacy z niej "rekombinantowy" plazmid mozna wprowadzic do komórki sposobem znanym jako transformacja. Przez wzrost transformantu otrzymuje sie duza ilosc rekombinantowego plazmidu, zawierajacego gen. Ponadto jesli gen jest wprowadzony do plazmidu prawidlowo w odniesieniu do czesci decydujacej o trans¬ krypcji i translacji kodowanej przez DNA informacji, mozna uzyc otrzymanego nosnika eks¬ presji do faktycznego tworzenia sekwencji polipeptydowej, która wprowadzony gen koduje, w procesie, na który w niniejszym opisie okresla sie jako ekspresje.Ekspresja jest inicjowana w regionie znanym jako promotor, który jest rozpoznawany przez przylaczenie polimerazy RNA. W niektórych przypadkach, jak w przypadku promotora tryptofanu czyli "trp", korzystnego w praktycznym zastosowaniu wynalazku, na regiony promotora zachodza regiony "operatora", tworzac kombinowany promotor - operator. Opera¬ torami sa sekwencje DNA rozpoznawane przez tak zwane bialka represorowe, które sluza do regulacji czestotliwosci inicjacji transkrypcji na poszczególnym promotorze. Polime- raza posuwa sie wzdluz DNA, dokonujac transkrypcji informacji zawartej w niciach kodu¬ jacych, od ich 5'- do 3 '- konca, do informacyjnego RNA, który z kolei ulega tranglakcji do polipeptydu o sekwencji aminokwasów, która koduje DNA.Kazdy aminokwas jest kodowany przez tryplet nukleotydowy czyli "kodon" w "genie strukturalnym", który mozna tak nazywac dla potrzeb niniejszego opisu, to jest w czes¬ ci kodujacej sekwencje aminokwasów produktu ekspresji* Po przylaczeniu promotora, po¬ limera za RNA najpierw dokonuje transkrypcji nukleotydów kodujacych miejsca przylacze¬ nia rybosomu, nastepnie sygnalu inicjacji translacji, czyli sygnalu "start" /zwykle ATG, który w powstajacym informacyjnym RNA staje sie AUG/, a pózniej kodonów nukleoty¬ dowy eh w samym genie strukturalnym. Tak zwane kodony stop ulegaja transkrypcji na kon¬ cu strukturalnego genu, po czym polimeraza moze tworzyc dodatkowa sekwencje mRNA, która z powodu obecnosci sygnalu stop, nie ulegnie translacji na rybosomach.Rybosomy lacza sie z miejscem przylaczenia, które zapewnia informacyjny RNA, w bak¬ teriach tworzony zwykle jako mRNA, przez co dochodzi do tworzenia kodowanego polipep¬ tydu, zaczynajac od sygnalu startu translacji, a konczac na uprzednio wspomnianym syg¬ nale stop. Pozadany produkt tworzy sie, jesli sekwencje kodujace miejsca przylaczenia rybosomów sa umiejscowione prawidlowo w odniesieniu do kodonu inicjacji AUG i jesli wszystkie pozostale kodony nastepuja po kodonie inicjacji w fazie. Powstaly produkt mozna otrzymac przez lize komórek gospodarza. Nastepnie odzyskuje sie produkt przez odpowiednie oczyszczenie od innych bialek bakteryjnych.W zastosowaniu metod technologii rekombinantowego DNA, jak to podano wyzej, osiaga sie wytwarzanie przez drobnoustroje, z wysoka wydajnoscia i czystoscia, rodziny homo-148 260 5 logicznych interferonów leukocytów /nie glikozylowanych/ Jako dojrzalych polipeptydów, którym zasadniczo nie towarzysza odpowiednie presekwencje lub jakiekolwiek ich czesoi.Te interferony moga ulegac bezposredniej ekspresji, odzyskaniu i oczyszczaniu do po¬ ziomu przystosowujacego je do uzycia w leczeniu chorób wirusowych i nowotworowych lu¬ dzi i zwierzat. Udowodniono, ze bialka z tej rodziny, ulegajace w ten sposób ekspre¬ sji, sa skuteczne w badaniach in vitro, a takze, jak wykazano w pierwszej demonstracji tego rodzaju, równiez w badaniach in vivo, przy czym te ostatnie badania obejmuja pier¬ wszy dojrzaly interferon leukocytów wytworzony przez drobnoustroje.Termin "dojrzaly interferon leukocytów" w kontekscie niniejszego opisu definiuje czasteczke interferonu wytworzona przez drobnoustroje /np. bakterie/, pozbawiona grup glikozylowych. Dojrzaly interferon leukocytów wytwarzany sposobem wedlug wynalazku ule¬ ga ekspresji bezposrednio od translacyjnego sygnalu startu /ATG/ dokladnie przed pierw¬ szym kodonem aminokwasu naturalnego produktu. "Dojrzaly" polipeptyd moze wiec zawierac jako pierwszy aminokwas w sekwencji metionine /która koduje ATG/, bez zasadniczej zmia¬ ny charakteru polipeptydu. Z drugiej strony, drobnoustrój-gospodarz moze przeksztalcac produkt translacji z usunieciem poczatkowej metioniny. Dojrzaly interferon leukocytów moze ulegac ekspresji lacznie z przylaczonym bialkiem, innym niz zwykly lider, przy czym koniugat moze byc specyficznie rozszczepialny w srodowisku wewnatrz- lub zewnatrz- komórkowym /patrz brytyjski opis patentowy nr 1007676 AA Wreszcie, dojrzaly interferon moze byc tworzony w polaczeniu z drobnoustrojowym peptydem "sygnalowym", który transpor¬ tuje koniugat do sciany komórkowej, gdzie peptyd sygnalowy ulega odszczepieniu, a doj¬ rzaly polipeptyd wydzieleniu. "Ekspresja" dojrzalego interferonu leukocytów oznacza wy¬ tworzenie przez bakterie lub inne drobnoustroje czasteczki interferonu nie zawieraja¬ cej grup glikozylowych lub presekwencji, co bezposrednio towarzyszy translacji mRNA interferonu leukocytów w oparciu o genom ludzki.Poszczególne leukocyty bialka interferonowe sa zdefiniowane przez okreslony DNA ge¬ nu /figury 3 i 8/ i dedukcyjna sekwencja aminokwasów /figury 4 i 9/. Nalezy rozumiec, ze w odniesieniu do tych poszczególnych interferonów, wlasciwie wszystkich z rodziny leukocytowych bialek interferonowych wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, istnieja naturalne wariaoje zalezne od alleli, pojawiajace sie od osobnika do osobnika. Waria¬ cje te mozna wykazac przez róznice /róznice/ w calkowitej sekwencji lub przez delecje, podstawienia, inseroje lub dodanie aminokwasu /aminokwasów/ we wspomnianej sekwencji.Dla kazdego z leukocytowych bialek interferonowych wedlug wynalazku, oznaczonych jako LelF A do LelF J, wspomniane wariacje zalezne od alleli objete sa zakresem oznaczenia lub definiujacego je terminu i w ten sposób, zakresem niniejszego wynalazku.Wynalazek jest blizej wyjasniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia dwie sek¬ wencje aminokwasów wspólne wszystkim rodzajom interferonu wyizolowanym z leukocytów ludzkich i oczyszczonym do stopnia jednorodnosoi, oznaczone T-1 i T-13. Wszystkie po- tenojalne sekwencje RNA kodujace te peptydy ukazano tak, jak i odpowiednie sekwencje DNA; litery A, T# G, C i U oznaczaja odpowiednio, nukleotydy zawierajace jako zasade adenine, tymine, guanine, cytozyne i uracyl. Litera N oznacza jakikolwiek z nukleoty- dów A, G, C i U. Polinukleotydy sa przedstawione jako odczytywane w kierunku od 5' /z lewej/ do 3' A prawej/, a gdy przedstawiony jest dwuniciowy /"d.s."/ DNA, w kie¬ runku odwrotnym dla nizszej lub nie kodujacej nici; fig. 2 przedstawia autoradiogram wykazujacy hybrydyzacje potencjalnego plazmidu LelF z syntetycznym dezoksyoligonukle- 32 otydem znaczonym J P; fig. 3 przedstawia sekwencje nukleotydów /nic kodujaca/ osmiu fragmentów genowych izolowanych jako kandydujace do uzycia w ekspresji interferonów leukocytów, odpowiednio oznaczonyoh od "A"do "H"; inicjacyjny kodon translaoji ATG i tryplet dla kazdego zakonczenia LelF jest podkreslony; po kodonach stop czyli tryple- tach zakonczenia nastepuja regiony 3' nie ulegajace translacji.Przedstawiono równiez gen LelF A, który stracil jeden kodon znajdowany w innych przedstawionych genach, jak wskazano w trzeciej linii A na fig. 3« Nie ulegajacy translacji region 5* poprzedza sekwencje liderowe. Po wyizolowaniu, we fragmencie H6 148 260 brak pelnej presekwencji lidera, ale zawiera on nie naruszony gen domniemanego dojrza¬ lego LelF E. We fragmencie G po wyizolowaniu brak pelnej sekwencji kodujacej* Figura 4 przedstawia porównanie sekwencji osmiu bialek LelF przewidzianych na pod¬ stawie sekwencji nukleotydów. Uzyto Jednoliterowych skrótów zalecanych przez IUPAC- -IUB Commiaion on Blochemical Nomenclature: A - alanina, C - cysteina, D - kwas aspa¬ raginowy, E - kwas glutaminowy, F - fenyloalanina, G - glicyna, H - histydyna, I - izoleucyna, K - lizyna, L - leacyna, M - metionina, H - asparagina, P - prolina, Q - glutamina, R - arginina, S - seryna, T - treonina, V - walina, W - tryptofan i Y - tyrozyna• Numery odnosza sie do pozycji aminokwasów /S odnosi sie do peptydu syg¬ nalowego/. Kreske w 165 aminokwasie sekwencji LelF A w pozycji 44 sprowadzono w celu ustawienia sekwencji LelF A w Jednym szeregu z 166-aminokwasowymi sekwencjami pozos¬ talych LelF. Sekwencje LelF E ustalono przy zignorowaniu nadprogramowego nukleotydu /pozycja 187 na fig. 3/ w regionie kodujacym. Gwiazdka wskazuje kodony zakonczenia w fazie* Przedstawiono równiez aminokwasy wspólne wszystkim LelF /z wylaczeniem pseudo- genu LelF E/. Podkreslone reszty sa resztami aminokwasów obecnymi równiez w interfe¬ ronie fibroblastów ludzkich.Figura 5 przedstawia mapy restrykcyjne sklonowanych DNA osmiu typów LelF /A do H/.Hybrydowe plazmidy konstruowano metoda laczenia konców dC : dG /D.V. Goeddel i wsp., Nature, 287, 411-416 /19B0//. Tak wiec, inserty cDNA mozna wyciac za pomoca Pstl.Linie na kazdym z konców insertów cDNA reprezentuja boczne homopollmeryczne zakoncze¬ nia dC:dG. Wskazano pozycje miejsc restrykcyjnych PvuII, EcoRI 1 Bglll. Obszary za¬ cieniowane na rysunku przedstawiaja sekwencje kodujace dojrzalych LelF. Obszary za¬ kreskowane skosnie przedstawiaja sekwencje kodujace peptydy sygnalowe, a obszary ot¬ warte ukazuja nie kodujace sekwencje 3* i 5*.Figura 6 przedstawia schematycznie konstrukcje genu kodujacego bezposrednia synte¬ ze przez drobnoustroje dojrzalego LelF A. Wskazano miejsca restrykcyjne i resuty /wPst I" itp./. Termin "b.p." oznacza "pary zasad".Figura 7 /nie w skali/ schematycznie przedstawia mape restrykcyjna dwóch fragmen¬ tów genów zastosowanych w wywolywaniu ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów LelF B. Wskazane sekwencje kodonów przedstawiaja zakonczenia nici kodujacej bedace rezultatem trawienia enzymem restrykcyjnym Sau3a w dwóch, pokazanych przypadkach.Figury 8 19 przedstawiaja sekwencje DNA 1 aminokwasów S bialek LelF wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, wlacznie z typami I i J /co do odpowiadajacych Jednolitych skrótów, patrz fig. 4/* W fig. 9 gwiazdka wskazuje kodon zakonczenia w odpowiadajacej mu sekwencji DNA, a lacznik delecje lub przerwe w sekwencji.Zastosowany drobnoustrój. W sposobie wedlug wynalazku korzystnie stosuje sie drobno¬ ustroje: E. coli x 1776, opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4190495 oraz B. coli K-12 szczep 294 /end A, thi", hsr", hsm£/, opisany w brytyjskim opisie patentowym nr 2055382 A. Kazdy z nich jest zdeponowany w American Type Culture Collection /numery rejestracyjne ATCC, odpowiednio, 31537 i 31446/. Cala prace zwiaza¬ na z rekombinantowym DNA prowadzi sie zgodnie ze stosowanymi wskazówkami National In- stitutes of Health.Wynalazek, w najkorzystniejszej postaci, opisano w odniesieniu do E. coli, w tym nie tylko szczepów E, ooli x 1776 1 E. coli K-12 szczep 294, zdefiniowanych wyzej, ale i innych znanych szczepów E. coli, takich jak E. coli B lub innych szczepów drobno¬ ustrojów, z których wiele jest zdeponowanych i dostepnych w znanych instytucjach depo¬ nujacych drobnoustroje, takich jak American Type Culture Collection. Patrz równiez opublikowany opis zgloszenia RFN nr 2644432. Do tych innych drobnoustrojów naleza np. laseczki, takie jak Bacillus subtilis i inne Enterobacteriaceae, wsród których mozna wspomniec, jako przyklady, Salmonella typhimurlum i Serratia marcescene, uzywajao plaz¬ midów, które moga powodowac reaplikacje i wywolywac ekspresje sekwencji heterologicz- nych genów w organizmie bakterii* Jako organizm bedacy gospodarzem w wytwarzaniu bia¬ lek interferonowych wedlug wynalazku, przez ekspresje genów kodujacych te bialka pod kontrola promotora drozdzowego mozna równiez korzystnie zastosowac drozdze, takie jak Saccharomyces cerevisiae.148 260 7 Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku mozna formulowac znanymi sposobami w celu otrzymania farmaceutycznie uzytecznych preparatów, w których polipeptyd wytwo¬ rzony sposobem wedlug wynalazku laczy sie z domieszka farmaceutycznie dozwolonego nos¬ nika. Odpowiednie nosniki i sposoby otrzymywania preparatów opissno w Reminton's Phar- maceutical Sciences przez E.W* Martina. Preparaty te zawieraja skuteczna ilosc bialka interferonowego wytworzonego sposobem wedlug wynalazku z odpowladnia iloscia nosnika i stanowia srodki lecznicze nadajace sie do skutecznego podawania pacjentowi. Korzy¬ stnym sposobem podawania jest droga pozajelitowa.LelF wytworzony sposobem wedlug wynalazku mozna podawac pozajelitowo pacjentom wy¬ magajacym przeciwnowotworowego lub przeciwwirusowego leczenia oraz pacjentom w stanie immunosupresji* Wielkosc i czestotliwosc dawek moze byc analogiczna do obecnie stoso¬ wanych w badaniach klinicznych materialów pochodzenia ludzkiego, np. /1-10/x10 jed¬ nostek dziennie, a w przypadku materialów o czystosci wyzszej od 1£ prawdopodobnie do np. 5 x 10 jednostek dziennie.Przykladem odpowiedniego dawkowania zasadniczo homogennego bakteryjnego LelF w po¬ staci do podawania pozajelitowego, moze byc rozpuszczenie 3 mg LelF o aktywnosci wlas- o ciwej np* 2 x 10 jednostek /mg w 25 ml 5 N ludzkiej albuminy surowiczej, przesaczenie przez saczek bakteriologiczny i aseptyczny, podzielenie przesaczonego roztworu do 100 fiolek, z których kazda zawierac bedzie 6 x 10 jednostek czystego interferonu odpo¬ wiedniego do podawania pozajelitowego* Korzystnie fiolki przechowuje sie przed uzyciem w niskiej temperaturze /-200/.Wynalazek zilustrowano blizej w nastepujacych przykladach: Przyklad I* Oczyszczanie mRNA LelF mRNA LelF mozna otrzymac z leukocytów ludzkich pochodzacych zwykle od pacjentów z przewlekla bialaczka szpikowa, indukowanych w celu wytworzenia interferonu wirusem Sendal lub choroby Bewcastle, jak opisano w opublikowanym opisie zgloszenia patento¬ wego RFN nr 2947134* Szczególnie korzystnym zródlem, którego uzywa sie w sposobie we¬ dlug wynalazku, jest linia komórkowa oznaczona KG-1, otrzymana od pacjenta z ostra bialaczka szpikowa. Ta linia komórkowa, opisana przez H. P. Koefflera i D. W. Golde*a, Science, 200, 1153 /1978/, rosnie latwo w hodowli w podlozu hodowlanym zawierajacym RPMI /Rosewell Park Memorial Institute/ 1640 + 10$ FCS /plodowa surowica cieleca/ inaktywowana cieplem, 25 mM buforu HEPES /kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-ete- nosulfonowy/ i 50 ug/ml gentamycyny i jest przeszczepiana z podzialem na 1-3 czesci dwa razy na tydzien.Komórki mozna wymrozic z wymienionego poprzednio podloza wzrostowego + 10$ dwu- metylosulfotlenku. KG-1 zdeponowano w American Type Culture Collection /nr rejestra¬ cyjny ATCC CRL 8031/* Komórki KG-1 indukuje sie w celu wytworzenia mRNA interferonu leukooytów wirusem Sendai lub choroby Newcastle metoda opisana przez Rubinsteina i innych /Proc* Natl.Acad. Sci. USA, 76, 640-644 /1979//. Komórki zbiera sie po uplywie 5 godzin po induk¬ cji i otrzymuje sie RNA metoda: tiocyjanian guanidyny-chlorowodorek guanidyny /Chirg- win i wsp*, Biochemistry, 18, 5294-5299 /1979//. RNA z komórek nie indukowanych izo¬ luje sie w ten sam sposób. Do otrzymania frakcji 128 mRNA poli /A/ uzywa sie chroma¬ tografii na oligodezoksytymidyno /dT/ - celulozie i ultrawirowania w gradiencie sa¬ charozy, jak opisali Green i wsp., /Arch. Eiochem. Biophys., 172, 74-69 /1976// i Oku- yuma i wsp., /Arch. Biochem. Biophys., 188, 98-104 /1978//. Taki mRNA wykazuje miano interferonu 8000-10 000 jednostek/jug w badaniu w oocytach Xenopus Iaevis /Cavalieri i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3287-3291 /1977//.Przyklad II. Przygotowanie zbiorów kolonii zewierajacych sekwencje LelF cDNA.Do otrzymania dwuniciowego cDNA zwyklymi metodami /Wickens i wsp., J. Biol. Chem., 253, 2483-2495 /1978/ i Goeddel i wsp., Nature, 281, 544-548 /1979// stosuje sie 5 ^ug mRNA. cDNA frakcjonuje sie pod wzgledem wielkosci za pomoca elektroforezy w 6% zelu8 148 260 poliakryloamidowym i za pomoca elektroelucji odzyskuje sie 230 ng materialu w zakresie 500-1500 b.p. Do konców tego cDNA, w 100 ng próbce, wprowadza sie reszty dezoksycyty- dyny /dC/f jak opisali Chang i wsp., Nature, 275, 617-624 /1978/, laczy z 470 ng plaz¬ midu pBR322, do konców którego wprowadzono reszty dezoksyguanozyny /dG/ w miejscu Pstl /Bolivar i wap., Gene, 2, 95-113 /1977// i uzywa do transformowania E. coli x 1776.Otrzymuje sie okolo 130 transformantów opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicy¬ line, na ng cDNA.W drugim podobnym eksperymencie otrzymuje sie okolo 1000 transformantów E. coli K-12 szczep 294 opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicyline, na ng cDNA. W tym przy¬ padku po frakcjonowaniu pod wzgledem wielkosci odzyskuje sie za pomoca elektroelucji cDNA w zakresie 600-1300 b.p. w celu wprowadzenia reszt dC.P r z y kl a d III. Otrzymywanie i stosowanie syntetycznych dezoksynukleotydów Znajomosc sekwencji aminokwasów kilku fragmentów trypsynowych interferonu leukocy¬ tów ludzkich pozwala wyznaczyc syntetyczne dezoksynukleotydy komplementarne do róznych regionów mRNA LelF. Wybrano dwa peptydy trypsynowe T1 i T13, poniewaz ich sekwencja aminokwasów wymaga syntezy tylko, odpowiednio, 12 i 4 undekarnerów odpowiadajacych wszy¬ stkim mozliwym sekwencjom kodujacym /fig. 1/. Syntetyzuje sie 4 zestawy próbek dezoksy- nukleotydów, dla kazdej z sekwencji zawierajacych albo trzy /T-1A, B, C, D/, albo jeden /T-13 A, B, C, D/ oligodezoksynukleotyd. Wskazane komplementarne dezoksynukleotydy o dlugosci 11 zasad syntetyzuje sie chemicznie metoda fosfotriestrowa /Crea i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769 /1978//. Otrzymuje sie cztery indywidualne próbki w serii T-13 a dwanascie próbek T-1 w czterech pulach po trzy próbki, jak przedstawio¬ no na fig. 1.Przygotowuje sie cztery indywidualne próbki serii T-13 i dwunastu T-1 w czterech pu¬ lach po trzy prlmery w kazdej i uzywa sie je do prymowania syntezy znaczonego promienio¬ twórczo jednoniciowego cDNA, uzywanego jako próbki do hybrydyzacji.Matryca mRNA jest albo 12S RNA z komórek KG-1 indukowanych wirusem Sendai /8000 jed¬ nostek aktywnosci IP//ig/, albo mRNA calkowicie poli /A/ z nie indukowanych leukocytów / < 10 jednostek/yug/. Z primerów tych, stosujao znane warunki reakcji /Noyes i wsp., Proc. Natl. icad. Sci. USA, 76, 1770-1774 /1979//, otrzymuje sie cDNA znakowany 32P.Reakcje prowadzi sie w objetosci 60/il, w 20 mM Tris-HCl /pH 8,3/, 20 mM KC1, 8 mM MgClp, 30 mM /S -merkaptoetanolu. W mieszaninach reakcyjnych znajduje sie 1 iig kazdego z primerów /to jest 12 jag w calosci dla serii T-1t 4 yug w calosci dla serii T-13/, 2 ug "indukowanej" frakcji 12S mRNA /lub 10/ig nie indukowanego mRNA poli /i//, 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200/iCi /oC 32P/ dCTP /Amersham, 2-3000 Ci/milimol/ i 60 jednostek odwrotnej transkryptazy /Bethesda Research Laboratories/.Produkt oddziela sie od materialu nie znaczonego za pomoca saczenia zelowego na 10 ml kolumnie zelu Sephadex^ G-50, traktuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 70°C 0,3 N NaOH w celu rozlozenia RNA i zobojetnia HC1. Hybrydyzacje przeprowadza sie jak opisali Kafatoo i wsp., Nucleic Acids Res., 7, 1541-1552 /1979/.Przyklad IV. Identyfikacja klonów pL1-pL30 Stosuje sie zwykla metode izolowania plazmidów opisana przez Birnboima i wsp., Nuc¬ leic Acids Res., 7, 1513-1523 /1979/, w celu otrzymania 1/ag plazmidowego DNA z kaz¬ dych 500 indywidualnych transformantów E. coli szczep 294 /patrz przyklad II/. Kazda próbke DNA denaturuje sie i nanosi na saozki nitrocelulozowe /po trzy jednakowe/ me¬ toda Kafatosa i wsp., /patrz wyzej/.Trzy zestawy saczków nitrocelulozowych, zawierajacych po 500 próbek plazmidu hy¬ brydyzuje sie z: a/ indukowanym primerem cDNA prymowanym zestawem primerów T-1, 2/ indukowanym cDNA prymowanym T-13, oraz c/ nie indukowanym cDNA preparowanym z uzy¬ ciem obydwu serii primerów.Klony sa uwazane za pozytywne, jesli hybrydyzuja silniej z jedna lub dwoma próbka¬ mi indukowanego cDNA niz z calkowicie nieindukowana próbka. Z pieciuset wybiera sie trzydziesci "pozytywnych" klonów /pL1-pL30/ do dalszej analizy.148 260 9 Przyklad V. Identyfikacja klonów pL31-pL39. Izolowanie plazmidu /nr 104/ zawierajacego fragment genu LelF.Transformanty E. coli x 1776 poddaje sie screeningowi metoda hybrydyzacji kolonii /Grunstein i Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965 /1975// z uzyciem ja¬ ko próbki indukowanego mRNA znaczonego ^ P /Lillenhaug i wsp.t Biochemistry, 15f 1858-1865 /1976//. Nieznaczony mRNA z nie indukowanych komórek miesza sie z próbka w stosunku 200:1 w celu kompetycji z nie indukowanym mRNA, obecnych w preparacie znaczo- nym J P. Hybrydyzacja znaozonego mRNA powinna byd uprzywilejowana w odniesieniu do kolonii zawierajacych indukowane sekwencje. Otrzymuje sie trzy klasy transformantów: 1/ 2-3* kolonii hybrydyzuje z ^2P-mRNA bardzo silnie, 2/ 10* hybrydyzuje znacznie slabiej niz klasa 1 oraz 3/ pozostale kolonie nie daja wykrywalnego sygnalu hybrydy¬ zacji* Pozytywne kolonie /klasa 1 i 2/ bada sie pod wzgledem obecnosci sekwencji specyfi¬ cznych dla interferonu w oznaczeniu zaleznym od hybrydyzacji mRNA specyficznego dla interferonu z plazmidowym DNA. Najpierw hoduje sie indywidualnie 60 wybitnie pozytyw¬ nych kolonii /klasa 1/ w 100 ml podloza M9 uzupelnionego tetracyklina /20 /ig/ml/f kwasem dwuaminopimelinowym /100 /ag/ml/, tymidyna /20 yug/ml/ i d-biotyna /1 /ig/ml/.Podloze M9 zawiera na litr: 6 g Na2HP04 3 g KH2P04 0,5 g NaCl i 1 g NH-C1. Po wy¬ jalowieniu w autoklawie dodaje sie 1 ml jalowego 1 M MgSO- i 10 ml jalowego 0,01 M CaClp* Tworzy sie pule z 10 hodowli i izoluje plazmidowy DNA z 6 pul, jak to opisali Clewell i wsp., Biochemistry, 9, 4428-4440 /1970/. 10yug z kazdej puli plazmidowego DNA rozszczepia sie Hind III, denaturuje i wiaze kowalencyjnie z DBM /dwuazobenzylo- ksymetylo/- bibula.Z kazdym saczkiem hybrydyzuje sie 1 fig oczyszczonego mRNA z indukowanych komórek. mRNA, który nie hybrydyzowal, usuwa sie za pomoca przemywania. Specyficznie zhybrydy- zowany mRNA eluuje sie i poddaje translacji w oocytach Xenopus laevis. W tym oznacze¬ niu wszystkie szesc pul okazuje sie ujemnymi. Z 59 slabo pozytywnych kolonii /klasa 2/ przygotowuje sie piec pul z dziesieciu kolonii kazda i jedna pule z dziewieciu kolonii, przeprowadza preparatyke plazmidów i bada jak opisano wyzej. Wsród badanych szesciu pul, jedna /K10/ hybrydyzuje z mRNA interferonu na poziomach znacznie wyzszych od tla przy kazdorazowym badaniu.W celu identyfikacji cDNA specyficznego dla interferonu przeprowadza sie preparaty¬ ke plazmidowego DNA z 9 kolonii puli K10 i bada indywidualnie. Dwa z dziewieciu plaz¬ midów /nr 101 i nr 104/ przylaczaja mRNA interferonu na poziomie znacznie wyzszym od tla. Unikalny fragment restrykcyjny Bglll zawierajacy 260 b.p. izoluje sie z plazmidu 32 nr 104, znakuje P metoda opisana przez Taylora i wsp., Blochem. Piophys. Acta., 442, 324-330 /1976/ i uzywa jako próbki do niezaleznego screeningu 400 transformantów E. coli 294 metoda screeningu kolonii in situ /Grunstein i Hogness, Proc. Natl. Sci. USA, 72, 3961-3965 /1975/. Dziewiec kolonii /pL31-pL39/ zidentyfikowano jako hybrydyzujace w róznym stopniu z ta próbka.Poza tym, w ten sam sposób znaczony fragment o 260 b-p. stosuje sie do niezaleznego screeningu 4000 transf ormantów E. coli 294. 50 kolonii identyfikuje sie jako hybrydy- zujaoe w róznym stopniu z ta próbka. Jedna z próbek zawiera fragment LelF G, jedna - LelF H, a inna zawiera fragment oznaczony LelF H1, przypuszczalnie allel LelF H.Otrzymany hybrydowy plazmid oznaczono "pLelF H", itp.Przyklad VI. Izolacja i oznaczenie sekwencji pierwszego genu LelF o pelnej dlugosci.Ze wszystkich 39 potencjalnych klonów cDNA LelF otrzymuje sie plazmid DNA i ponownie poddaje screeningowi z taka sama próbka DNA o 260 b.p. za pomoca metody hybrydyzacji Kafatosa i wsp. /patrz wyzej/. Trzy plazmidy /pL4, pL31, pL34/ daja bardzo silne sygna¬ ly hybrydyzacji, cztery /pL13, pL30, pL32, pL36/ hybrydyzuja umiarkowanie, a trzy /pL6, pL8, pL14/ slabo hybrydyzuja z próbka.10 148 260 Poddaje sie równiez screeningowi 39 potencjalnych rekombinantowych plazmidów cDNA LelF stosujac jako próbki do hybrydyzacji bezposrednio syntetyczne undekamery znaczo¬ ne ^2P /indywidualne pule primerów T1, lub indywidualne primery T13/. Wybiera sie ta¬ kie warunki hybrydyzacji, ze do wykrycia sygnalów hybrydyzacji wymagane jest dokladne parowanie zasad /Wallace i wsp.t Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 /1979/. Tak wiec w standardowy sposób metoda klarowanych lizatów /Clewell i wsp., patrz wyzej/, otrzymu¬ je sie plazmidowy DNA z 39 klonów i oczyszcza za pomoca chromatografii kolumnowej na kolumnie Biorad Agarose A-50.Próbki po 3 /ig kazdego preparatu przeprowadza sie w postac linearna za pomoca Zco RI, denaturuje w odczynie zasadowym i nakrapla na 2 oddzielne saczki nitrocelulozowe, po 1,5yUg na miejsce /Kafatos i wsp., patrz wyzej/* Indywidualne syntetyczne primery dezoksyoligonukleotydowe i pule primerów poddaje sie fosforylacji za pomoca /f P/ ATP w nastepujacy sposób: 50 pikomoli oligonukleotydu i 100 pikomoli f£ * P/ ATP /New England Nuclear, 2500 Ci/milimol/ laczy sie w 30 /ii 50 mM Tria-HCl, 10 mM MgCl2, 15 mK fi -merkaptoetanolu. Dodaje sie 2 jednostki kinazy polinukleotydowej T4 1 po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C, oczyszcza sie primery znaczone P za po¬ moca chromatografii na 10 ml kolumnach zelu Sephadex^ G-50. Hybrydyzacje przeprowa¬ dza sie z uzyciem primera T-13C /10 zliczen/min./ lub puli primerów T-1C /3 x 10 zliozen/min./. Hybrydyzacje przeprowadza sie w temperaturze 15°C w ciagu 14 godzin w 6 x SSC /1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodowy, pH 7,2/, 10 x w roztwo¬ rze Denhardta /0,256 bydleca albumina surowicza, 0,24 poliwinylopirolidon, 0,24 Ficoll/, jak opisali Wallace i wsp. /patrz wyzej/. Saczki przemywa sie w ciagu 5 minut /3 razy/ w temperaturze 0°C 6 x SSC, suszy i eksponuje na blonie czulej na promienie 7. Wyniki przedstawiono na fig. 2 dla puli ** P-primerów T-13C i T-1C.Stwierdzono, ze plazmidowy DNA z klonu 104 wykazuje znaczna hybrydyzacje z pula primerów T-1C i primerem T-13C, ale nie wykazuje wykrywalnej hybrydyzacji z innymi un- dekarnerami. Jak przedstawiono na fig. 2, kilka z potencjalnych plazmidów LelF /pL2, 4, 13. 17, 20, 30, 31t 34/ równiez hybrydyzuje z obydwoma tymi próbkami. Tym niemniej analiza restrykcyjna wykazuje, ze tylko jeden z tych plazmidów, pL31, równiez zawiera wewnetrzny fragment Bglll o 260 b.p. Trawienie pL31 Pstl wykazuje, ze dlugosó insertu cDNA wynosi okolo 1000 b.p.Analizuje sie sekwenoje calego insertu Pstl z pL31 zarówno chemiczna metoda Maxama- -Gilberta /Methods Enzymol., 65, 499-560 /1980//, jak i metoda dwudezoksy zakonczenia lancucha /Smith, Methods Enzymol., 65, 560-580 /1980// po podklonowanlu fragmentów Sau3a do nosnika M13. Sekwencje DNA przedstawiono na fig* 3 /nAw/. Odpowiednia trans- lacyjna faze odczytywania mozna przewidziec z posiadanej informacji co do sekwencji aminokwasów w bialku, znanego zakresu ciezarów czasteczkowych LelF i wzglednego wyste¬ powania trypletów stop w trzech mozliwych fazach odczytywania, co z kolei pozwala na przewidzenie calkowitej sekwencji aminokwasów, wlacznie z prepeptydem lub peptydem sygnalowym* Pierwszy kodon inicjacji translacji ATG stwierdzono w pozycji 60 sekwencji nukleo- tydów od konca 5', a nastepnie o 188 kodonów dalej wystepuje tryple t zakonczenia TGA, tak wiec istnieja 342 nie ulegajace translacji nukleotydy na koncu 3', a nastepnie sekwencja poli /A/. Domniemany peptyd sygnalowy /przypuszczalnie zaangazowany w wydzie¬ laniu dojrzalego LelF przez leukocyty/ ma dlugosó 23 aminokwasów. 165 aminokwasów skla¬ dajacych sie na dojrzaly LelF ma wyliczony ciezar czasteczkowy 19 390. LelF kodowany przez pL31 nazwano LelF A. Peptydy trypsynowe T1 i T13 LelF B odpowiadaja aminokwasom 145-149 i 57-61 w odniesieniu do LelF A, jak to jest widoczne z danych dotyczacych sek¬ wencji /"A"/ na fig. 4. Faktycznymi kodujacymi sekwencjami DNA znajdowanymi w tych dwóch regionach sa sekwencje reprezentowane przez pule primerów T1-C i primer T13-C /patrz fig. 8/.14B 260 11 Przyklad VII. Bezposrednia ekspresja dojrzalego Interferonu leukocytów A /LelF A/. 1. Uwagi ogólna. Metoda ekspresji LelF bezposrednio jako dojrzalego interferonu jest wariantem metody wczesniej uzywanej dla ludzkiego hormonu wzrostu /Goeddel i wsp., Nature, 261, 544-546 /1979//, w tym zakresie, w jakim wlacza kombinacje synte¬ tycznego /N-koncowego/ i komplementarnych DNA.Jak wskazano na figurze 6, miejsce endonukleazy restrykcyjnej Sau3a jest dogodnie ulokowane miedzy kodonami 1 a 3 LelF A* Zaplanowane sa dwa syntetyczne dazoksynukleo- tydy, które wlaczaja kodon inicjacji translacji ATG, przywracaja kodon pierwszego aminokwasu /cysteina/ 1 tworza lepkie konce EcoRI. Te oligomery laczy sie z fragmen¬ tem Sau3a - AvaII pL31 o 34 b.p. Powstaly produkt o 45 b.p. laczy sie z dwoma dodat¬ kowymi fragmentami DNA w celu konstrukcji hybrydowego genu syntetyczno-naturalnego kodujacego LelF oraz zakonczonego miejscami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl. Gen ten wla¬ cza sie do pER322 miedzy miejsca EcoRI i Pstl z otrzymaniem plazmidu pLelF Al. 2. Konstrukcja tryptofanowego elementu kontrolnego, zawierajacego promotor trp E. coli, operator 1 liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, ale bez sekwencji inicjacji translacji /ATG/. Plazmid pGMI zawiera petryptofanowy operon E. coli z de- lecja A LE1413 /Uiozzari i wsp., J. Bacteriology, 133, 1457-1466 /1978// i skutkiem tego doprowadza do ekspresji polaczonego bialka zawierajacego 6 pierwszych aminokwa¬ sów lidera trp i w przyblizeniu 3 ostatnie polipeptydu E trp /w dalszej czesci opisu lacznie nazywanego LEV, jak równiez polipeptyd D trp w calosci, wszystko pod kontro¬ la ukladu promotor-operator. 20 ug plazmidu trawi sie enzymem restrykcyjnym PvuII, który rozszczepia plazmid w 5 miejscach.Fragmenty genu laczy sie nastepnie z lacznikami EcoRI /skladajacymi sie z samokom- plementarnego oligonukleotydu o sekwencji pCATGAATTCATG/ zapewniajac miejsce rozszcze¬ pienia EcoRI do pózniejszego klonowania do plazmidu zawierajacego miejsce EcoRI* 20 ug fragmentów DNA otrzymanych z pGMl traktuje sie w ciagu nocy w temperaturze 4°C 10 jednostkami ligazy DNA T4 w obecnosci 200 pikomoli 5 "-fosforylowanego syntetycz¬ nego oligonukleotydu pCATGAATTCATG w 20 ul buforu dla ligazy DNA T4 /20 mM Tris, pH 7, 6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5mM dwutiotreitol/. Nastepnie roztwór ogrzewa sie w ciagu 10 minut w temperaturze 70°C w celu zatrzymania laczenia. Laczniki rozszczepia sie przez trawienie EcoRI, rozdEiela sie za pomoca elektroforezy w 5& zelu poliakry- loamidowym /w ponizszej czesci niniejszego opisu okreslanym PAGE/ i trzy najwieksze fragmenty izoluje sie z zelu przez, po pierwsze, barwienie bromkiem etidium, zlokali¬ zowanie fragmentów w swietle ultrafioletowym i wyciecie z zelu interesujacych czesci.Kazdy fragment umieszcza sie w woreczku dializacyjnym wraz z 300 ^litrami 0,1 x TBE i poddaje elektroforezie przy róznicy potencjalów 100 V w ciagu 1 godziny w 0,1 x buforze TBE /bufor TBE zawiera 10,6 g Tris w postaci zasady, 5t5 g kwasu borowego, 0,09 g NapEDTA w 1 litrze wody/. Zbiera sie roztwór wodny z woreczka dializacyjnego, ekstrahuje fenolem, ekstrahuje chloroformem, doprowadza do stezenia 0,2 M chlorkiem sodowym i odzyskuje DNA w wodzie po straceniu etanolem. Gen zawierajacy promotor- -operator trp z lepkimi koncami EcoRI identyfikuje sie metoda, która zostanie nastep¬ nie opisana, wymagajaca insercji fragmentów do plazmidu wrazliwego na tetracykline, który po wlaczeniu promotora-operatora staje sie odporny na tetracykline.Plazmid pBRHI /Rodriguez i wsp., Nucleic Acids Res., 6, 3267-3287 /1979// wykazu¬ je ekspresje opornosci na ampicyline i zawiera gen odpornosci na tetracykline, ale nie majac przylaczonego promotora, nie wykazuje ekspresji tej odpornosci. Plazmid jest skutkiem tego wrazliwy na tetracykline. Przez wprowadzenie ukladu promotor-ope¬ rator do miejsca EcoRI, plazmid mozna uczynic odpornym na tetracykline. pBRHI trawi sie EcoRI i usuwa enzym za pomoca ekstrakcji fenolem, a nastepnie chlo¬ roformem i odzyskuje w wodzie po straceniu etanolem. Powstajace czasteczki DNA sa w oddzielnych mieszaninach reakcyjnych mieszane z kazdym z trzech fragmentów DNA otrzy- manyoh jak opisano wyzej i laczone za pomooa ligazy DNA T4, Jak opisano wyzej.12 148 260 DNA obecny w mieszaninie reakcyjnej stosuje sie do transformowania kompetentnej B. co¬ li K-12 szczep 294 zwyklymi metodami /Hershfield i wsp.f Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71# 3455-3459/1974// i wysiewa bakterie na plytki IB /Luria-Berteni/ zawierajace am¬ picyline w stezeniu 20 /ig/ml i tetracykline w stezeniu 5 ig/nil. Selekcjonuje sie kil¬ ka kolonii, izoluje plazmidowy DNA i potwierdza obecnosc zadanego fragmentu za pomoca analizy enzymami restrykcyjnymi. Powstaly plazmid nazwano pBRHtrp.Produkt trawienia EcoRI i BamHI genomu wirusa hepatitis B otrzymuje sie zwyklymi sposobami i klonuje do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pGH6 /Goeddel i wsp., Nature, 281, 544 /1979// w celu utworzenia plazmidu pHS32. Plazmid pHS32 rozszczepia sie Xbal, ekstrahuje fenolem, nastepnie chloroformem i wytraca etanolem. Nastepnie otrzymany ma¬ terial traktuje sie 1 pi polimerazy DNA I B. coli /fragment Kle nowa/ produkcji Boehrin- ger-Mannheim, w 30/U buforu polimerazy /50 mM fosforan potasowy pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM fi -merkaptoetanol/ zawierajacego 0,1 mM dTTP i 0,1 mM dCTP w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C To traktowanie po¬ woduje, ze 2 z 4 nukleotydów staja sie komplementarne do wystajacego kotfca miejsca roz¬ szczepienia Ibal do uzupelnienia w: 5' CTAGA 5' CTAGA 3 T 3 TCT Dwa nukleotydy, dC i dT zostaja wlaczone dajac zakonczenie o dwóch wystajacych nukle- otydach 5*« Te linearna pozostalosc plazmidu pHS32 /po ekstrakcji fenolem, chloroformem oraz odzyskaniu w wodzie po straceniu etanolem/ rozszczepia sie BcoRI. Duzy fragment plazmidu oddziela sie od mniejszego fragmentu BcoRI - Ibal za pomoca PAGB i izoluje po elektroelucji. Ten fragment DNA otrzymany z pHS32 /0,2ig/ laczy sie w warunkach podob¬ nych do wyzej opisanych z fragmentem BcoRI - Taql operonu tryptofa nowego /-* 0,01 ug/, otrzymanym z pBRHtrp.W procesie laczenia fragmentu otrzymanego z pHS32 z fragmentem BooRI - Taql, jak opisano wyzej, laczy sie wystajacy koniec Taql z pozostalym wystajacym koncem Ibal, nawet jesli nie sa one calkowicie sparowane w sposób zgodny z zasada Watsona i Cricka: T CTAGA -TCTAGA AGC TCT -AGCTCT Czesc tej mieszaniny reakcyjnej, w której odbywalo sie laczenie, transformuje sie do komórek B. coli 294, poddaje sie obróbce cieplnej i wysiewa na plytki LB zawiera¬ jace ampicyline. Wybiera sie 24 kolonie, prowadzi ich hodowle w 3 ml podloza LB /Lu- ria-Bertani/ i izoluje sie plazmid. Stwierdzono, ze szesc z nich ma miejsce Ibal zre¬ generowane przez reparacje DNA katalizowana przez B. coli i replikacje: TCTAGA TCTAGA AGCTCT AGATCT Stwierdzono równiez, ze plazmidy te rozszczepiane sa zarówno przez BcoRI, jak i Hpal, dajao oczekiwane fragmenty restrykcyjne. Plazmidu oczyszczonego jako pTrp14, uzywa sie do ekspresji heterologicznych polipeptydów, jak opisano dalej.Plazmid pHGH 107 /Goeddel i wsp., Nature, 2B1, 544 /1979// zawiera gen ludzkiego hormonu wzrostu skladajacy sie z 23 kod o nów aminokwasów otrzymanych z fragmentów syn¬ tetycznego DNA i 163 kod onów aminokwasów otrzymanych z komplementarnego DNA otrzyma¬ nego za pomoca odwrotnej transkrypcji mRNA ludzkiego hormonu wzrostu. Gen ten, w któ¬ rym brak kodonów npre" sekwencji ludzkiego hormonu wzrostu, zawiera kod on inicjacji translacji ATG. Gen izoluje sie z 10/ug pHGH 107 przez dzialanie BcoRI, a nastepnie polimerazy DNA. I B. coli /fragment KIenowa/ i dTTp i dATP, jak opisano wyzej. Po ekstrakcji fenolem i chloroformem oraz wytraceniu etanolem, plazmid traktuje sie BamHI.Fragment zawierajacy gen ludzkiego hormonu wzrostu /HGH/ izoluje sie za pomoca PAGB, a nastepnie elektroelucji. Otrzymany fragment DNA zawiera równiez pierwsze 35014B 260 13 nukleotydów genu strukturalnego odpornosci na tetracykliny, ale brak w nim ukladu promotor-operator, tak wiec, gdy zostanie klonowany dla plazmidu wykazujacego eks¬ presje, mozna zlokalizowac plazmidy zawierajace insert przez przywrócenie odpornos¬ ci na tetracykline. Poniewaz EcoRI-koniec fragmentu uzupelniono metoda z uzyciem po- limerazy I /fragment Kle nowa/, fragment zawiera jeden wolny koniec i jeden lepki, co zapewnia prawidlowa orientacje po pózniejszym wlaczeniu do plazmidu wykazujacego eks¬ presje.Wytwarza sie nastepnie plazmid ekspresji pTrpH w celu przyjecia fragmentu zawie¬ rajacego gen HGH, otrzymanego jak opisano wyzej* Tak wiec trawi sie pTrp14 Ibal i powstale lepkie konce uzupelnia metoda z uzyciem polimerazy I /fragment Klenowa/ i dATP, dTTF, dGTP, dCTP. Po ekstrakcji fenolem i chloroformem, oraz wytraceniu etano¬ lem, powstaly DNA traktuje sie BamHI i otrzymany duzy fragment plazmidu izoluje sie za pomoca PAGB, a nastepnie elektroeluoji. Fragment otrzymany z pTrp14 zawiera jeden wolny koniec i jeden lepki, co pozwala na rekombinacje w prawidlowej orientaojl z fragmentem zawierajacym gen HGH, opisanym poprzednio.Fragment genu HGH i fragment A lba-BamHI pTrpH miesza sie 1 laczy w warunkach po¬ dobnych do opisanych wyzej. Uzupelnione konce Ibal i EcoRI laczy sie metoda laczenia wolnych konców w celu odtworzenia miejsca zarówno Xbal jak 1 EcoRI: Uzupelniony Xbal Uzupelniony EcoRI Inicjacja genu HGH TCTAG AATTCTATG TCTAGAATTCTATG + » AGATC TTAAGATAC AGATCTTAAGATAC Xbal EcoRI Konstrukcja ta przywraca równiez ekspresje genu opornosci na tetracykline. Ponie¬ waz plazmid pHGH 107 wykazuje ekspresje odpornosci na tetracykline od promotora w góre /promotor lac/, konstrukcja ta, oznaczona pHGH 207, pozwala na ekspresje genu opornosci na tetracykline pod kontrola ukladu promotor-operator tryptofanowy. Tak wiec mieszanine reakcyjna, z której odbywalo sie laczenie, transformuje sie E. ooli 294 i dokonuje selekcji kolonii na plytkach LB zawierajacyoh tetracykline w stezeniu 5 ug/ml# Plazmid pHGH 207 trawi sie EcoRI i odzyskuje sie za pomoca PAGE, a nastepnie elek¬ troeluoji, fragment o 300 b.p. zawierajacy promotor trp, operator i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, ale bez sekwencji inicjacji translacji ATG. Ten fragment DNA klonuje sie do miejsca EcoRI pLelF A. Plazmidy wykazujace ekspresje, zawierajace zmodyfikowany, jak wyzej, regulon trp /operon trp E. coli, z którego usunieto sekwen¬ cje oslabiajaca w celu mozliwego do kontrolowania podwyzszenia poziomu ekspresji/ mozna hodowac do ustalonego poziomu w podlozach odzywczych zawierajacych tryptofan w ilosciach niezbednych do represji ukladu promotor-operator, a nastepnie pozbawionych tryptofanu w celu depresji ukladu i mozliwosci ekspresji zadanego produktu.Bardziej szczególowo i w odniesieniu do fig. 6, trawi sie 250/Ug plazmidu pL31 Pstl i insert o 1000 b.p. izoluje sie za pomoca elektroforezy w 6% zelu poliakrylo- amidowym. Dokonuje sie elektroelucji z zelu okolo 40 /ig insertu i dzieli na 3 próbki do dalszego trawienia: a/ Trawi sie czesciowo 16 /ig próbke tego fragmentu 40 jednostkami Bg III w ciagu 45 minut w temperaturze 37°C i oczyszcza mieszanine reakcyjna w 6# zelu poliakrylo- amid owym. Odzyskuje sie okolo 2 yUg zadanego fragmentu o 670 b.p. b/ 8/ug insertu Pstl o 1000 b.p., jako inna próbke, poddaje sie dzialaniu AvaII i Bglll. Za pomoca elektroforezy w zelu odzyskuje sie 1 /ig wskazanego fragmentu o 150 b.p. c/ 16 /ag fragmentu o 1000 b.p. traktuje sie Sau3a i AvaII. Po elektroforezie w 10* zelu poliakryloamidowym odzyskuje sie okolo 0,25 /ag /10 pikomoli/ fragmentu o 34 b.p. Dwa wskazane oligodezoksynukleotydy, 5 '-dAATTCATGTGT /fragment 1/ i 5 '-dGATCA- CACATG /fragment 2/ syntezuje sie metoda fosfotriestrowa. Fragment 2 fosforyluje sie14 146 260 w nastepujacy sposób: 200 yul /^ 40 pikomoli/ /^ ** P/ ATP /Amershem, 5000 Ci/milimol/ przeprowadza sie w proszek i zawiesza w 30 yul 60 mM Tris-HCl /pH 890/9 10 mM MgClp, 15 mM p-merkaptoetanolu zawierajacym 100 pikomoli fragmentu DNA i 2 jednostki kinazy polinukleotydowej T 4« Po 15 minutach inokulacji w temperaturze 37°C dodaje sie 1 ul 10 mM ATP i prowadzi reakcje w ciagu dalszych 15 minut. Nastepnie mieszanine reakcyj¬ na ogrzewa sie w temperaturze 70°C w ciagu 15 minut, miesza z 100 pikomolami fragmen¬ tu 1 5 *-0H 1 10 pikomolami fragmentu Sau3a - AvaII o 34 b.p. Laczenie przeprowadza sie w ciagu 5 godzin w temperaturze 4°C w 50 yul 20 mM Tris-HCl /pH 7,5/, 10 mM MgCl2, 10 mM dwutiotreitolu, 0,5 mM ATP, w obecnosci 10 jednostek ligazy DNA T 4* Mieszanine poddaje sie elektroforezie w 6% zeli poliakryloamidowym i odzyskuje produkt o 45 b.p. za pomoca elektroelucji. Okolo 30 ng /1 pikomol/ produktu o 45 b.p. miesza sie z 0,5 ug /5 pikomoli/ fragmentu AvaII-Bg1II o 150 b.p. i 1yug /2 pikomole/ fragmentu Bg1II - PetI o670 b.p. Laczenie przeprowadza sie w temperaturze 20°C w ciagu 16 godzin z uzy¬ ciem 20 jednostek ligazy DNA T4. Ligeze inaktywuje sie przez ogrzewanie do temperatu¬ ry 65°C w ciagu 10 minut. Nastepnie mieszanine trawi sie EcoRl 1 Pstl w celu wyelimi¬ nowania polimerów genu. Mieszanine oczyszcza sie z zastosowaniem 6% PAGE. Izoluje sie 20 ng /0,04 pikomola/ produktu o 865 b.p* Polowe tej ilosci /10 ng/ wlacza sie do pBR322 /0t3 ug/ miedzy miejsca EcoRI a Patl. Transformacja E. coli 294 daje 70 trans- formantów odpornych na tetracykline, wrazliwyoh na ampicyline.Plazmidowy DNA izolowany z 18 tych transformantów trawi sie EcoRI i Pstl. 16 z tych 16 plazmidów mialo fragment EcoRI - Pstl o dlugosci 865 b.p. Jedenyug jednego z nich, pLelF A1 trawi sie EcoRI i laczy z 0,1 yug fragmentu EcoRI o 300 b.p. zawiera¬ jacego promotor trp i liderowe miejsca przylaczania rybosomów trp, otrzymanego jak opisano wyzej. Transformanty zawierajace promotor trp identyfikuje sie z uzyciem prób¬ ko ki J P-trp w polaczeniu z metoda screeningu kolonii Grundstelna-Hognessa. Asymetrycz¬ nie umieszczone we fragmencie trp miejsce lbaI pozwala na okreslenie rekombinantów, w któryoh promotor trp zorientowany byl w kierunku genu LelF A. 3. Aktywnosó LelF A in vitro i in vivo. Ekstrakty przygotowuje sie do badania IF w nastepujacy sposób. Prowadzi sie 1 ml hodowle w podlozu L zawierajacym tetracykllne w stezeniu 5 ug/ml do wartosci Accq okolo 190 i rozoiencza do objetosci 25 ml podlozem M9 zawierajacym tetracykllne w stezeniu 5yUg/ml. Zbiera sie przez odwirowanie 10 ml próbki, gdy Accq osiagnie 1,0 i osad komórek zawiesza w 1 ml 15& sacharozy, 50 mM Tris-HCl /pH 6,0/, 50 mM EDTA. Dodaje sie 1 mg llzozymu i po 5 minutach inkubacji w temperaturze 0°C komórki rozbija sie przez nadzwiekowienie. Próbki odwirowuje sie w ciagu 10 minut /15 000 obrotów /minute/ i okresla sie aktywnosó LelF w supernantantach w porównaniu ze standardowymi LelF na podstawie zahamowania efektu cytopatycznego /CPE/.W celu okreslenia ilosci czasteczek IF na komórke uzywa sie LelF o aktywnosoi wlasciwej 4 x 10 jednostek/mg.Jak to uwidoczniono w tablicy 1, klony pLelF A trp 25, do których promotor trp zos¬ tal wlaczony w zadanej orientacji, wykazuja wysoki poziom aktywnosci /tak wysoki, jak 2,5 x 10 jednostek/litr/. Jak to uwidoczniono w tablicy 2, IF wytworzony przez E. coli K-12 szczep 294/pLeIF A trp 25 zachowuje sie podobnie do oryginalnego ludzkiego LelF.Jest on stabilny w pH 2 i ulega neutralizacji przez królicze przeciwciala przeciw ludz¬ kim leukocytom. Interferon wykazuje ciezar czasteczkowy okolo 20 000.Skuteczne dzialanie interferonu in vivo wymaga obecnosci makrofagów i naturalnych komórek zabijajacych /NK/. Mechanizm dzialania in vivo obejmuje stymulacje tych komórek.Tak wiec, pozostaje mozliwe, ze interferon tworzony przez E. coli 294/pLeIF A 25, wyka¬ zujacy aktywnosc w badaniu w hodowlach komórkowych, nie wykazywalby aktywnosci w orga¬ nizmie zakazonych zwierzat. Ponadto, przeciwwlrusowa aktywnosó LelF A wytworzonego przez bakterie, nie gllkozylowane go, moze sie róznic od aktywnosci LelF otrzymanego z ludzkich leukocytów "buffy coat". Tak wiec, porównuje sie aktywnosc biologiczna wytwo¬ rzonego przez bakterie LelF A /2% czystosci/ z aktywnoscia LelF "buffy coat" /&& czys¬ tosci/ w smiertelnym zakazeniu wirusem zakalenia mózgu i miesnia sercowego u malp seimiri /tablica 3/.148 260 15 Tablica 1 Aktywnosc interferonu w ekstraktach E« coli B. ooli K-12 szczep 294 transformowany | przez I pLelP A trp 25 pLelP A trp 25 Gestosc komórek /komórki/ml/ 3,5 x 10b 1,8 x 109 | Aktywnosc IP jednostki/ml hodowli 36,000 250,000 Ilosc czasteczek LelP na komórke 9,000 j 12,000 Tablica 2 Porównanie aktywnosci ekstraktów*E. coli 294/pLeIP A 25 &e standardem LelP* I ¦ ekstrakt 294/pLeIP A trp 25 i standard LelP Aktywnosc interferonu I /jednostki/ml/ ] nie poddany obróboe 500 500 I pH 2 500 500 królicze przeciw- | ciala przeciw leuko¬ cytom ludzkim <10 I <10 T W powyzszej tablicy 2 uzyto nastepujacych oznaczen: x Ekstrakt E. coli 294/pLeIP i trp 25 o aktywnosci 250 000 jednostek/ml opissny w tablicy 1 rozciencza sie 500 x minimalnym podlozem podstawowym, co daje aktywnosc wlasciwa 500 jednostek/ml. Standard interferonu leukocytów /Wadley Institute/, uprzed¬ nio wymiareczkowany wobeo standardu interferonu leukocytów NIH, równiez rozciencza sie do koncowego stezenia 500 jednostek/ml. Próbki o objetosci 1 ml doprowadza sie do pH 2 za pomoca 1 N HC1, inkubuje w temperaturze 4°C w ciagu 52 godzin i zobojetnia przez dodanie NaOH, po czym okresla aktywnosc interferonu w zwyklym badaniu zahamowa¬ nia CPE. Próbki o objetosci 25yul o aktywnosci 500 jednostek/ml /nie poddane obrób¬ ce/ inkubuje sie z 25yul roztworu króliczych przeciwcial leukocytom ludzkim w tempe¬ raturze 37°C w ciagu 60 minut, wiruje przy 12 000 x g przez 5 minut i bada euperna- tant.Tablica 3 Przeciwwirueowe dzialanie róznych preparatów LelP przeciw zakazeniu wirusem EMC u malp saimiri Czynnik I dzialajacy j Kontrola /bialka bakteryjne/ i Bakteryjny LelP A Standard LelP I Ilosc zwierzat przezywajacych 0/3 3/3 3/3 I Surowicze czynniki tworzace lysinki, jednostki na ml dzien 2 10 0 3 0 u 0 0 0 0 0 0 • i —H [dzien 3 [3x10^ °y 0 0 0 0 0 0 dzien 4 1 j 10= 1,200 0. 0 0 0 0 0 0 3,4x104|16 148 260 Wszystkie malpy sa samcami /srednia waga 713 g/ i nie wykazuja przed zakazeniem przeciwcial przeciw wirusowi EMC. Malpy zakaza sie domiesniowo 100 x LD50 wirusa EMC /oznaczonymi na myszach/. Malpy kontrolne padly po 134, 158 i 164 godzinach od zaka¬ zenia. Leczenia interferonem /10 jednostek/ dokonuje sie przez dozylne podawanie w godzinach: - 4, ? 2, 23, 29, 48, 72, 168 i 240 w stosunku do czasu zakazenia. Bakte¬ ryjny interferon leukocytów jest frakcja otrzymana przy prowadzeniu chromatografii kolumnowej lizatu E. coli 294/pLeIF A 25 o aktywnosci wlasciwej 7,4 x 10 jednostek/ mg bialka. Kontrolne bialka bakteryjne sa równowazna frakcja otrzymana przy prowadze¬ niu chromatografii kolumnowej lizatu E. ooll 294/pBR322 przy dwukrotnym zageszczeniu bialka calkowitego. Standardem interferonu leukocytów jest interferon indukowany wi¬ rusem Sendai, z normalnych komórek ludzkich "buffy coat", oczyszczony chromatograficz¬ nie do aktywnosci wlasciwej 32 z 10 jednostek/mg bialka.Malpy kontrolne wykazywaly postepujacy letarg, utrate równowagi, porazenie wiotkie tylnych konczyn i zaburzenia w równowadze plynów zwiazane z oczami, zaczynajace sie osiem godzin przed smiercia. Malpy leczone interferonem nie wykazywaly zadnego z tyoh nienormalnych objawów, pozostawaly aktywne przez caly czas i nie wykazywaly wirem!i.Jedyna malpa w grupie kontrolnej, u której nie powstala w ciagu 4 dni wiremia, pad¬ la ostatnia /164 godziny po zakazeniu/. Wykazywala ona jednak wysokie miana wirusa w sercu i mózgu post mortem. U malp leczonych interferonem nie powstawaly przeciwciala przeciw wirusowi EMC, jak to oznaczono 14 i 21 dnia po zakazeniu. Wyniki te wykazuja, ze przeciwwirusowe dzialanie preparatów LelF u zakazonych zwierzat moze byc przypisa¬ na jedynie interferonowi, poniewaz bialka zanieczyszczajace sa calkowicie rózne w pre¬ paratach bakteryjnych i "buffy coat". Wyniki te wskazuja poza tym na to, ze glikozy- laoja nie jest wymagana jesli chodzi o aktywnosc przec iwwirusowa LelF A in 7ivo.Przyklad VIII. Izolowanie cDNA dalszych interferonów leukocytów.Z plazmidu zawierajacego calkowicie scharakteryzowany cDNA LelF A wycina sie DNA 32 za pomoca Pstl, izoluje elektroforetycznie i znakuje P. Powstalego znaczonego pro¬ mieniotwórczo DNA uzywa sie jako próbki do screeningu dodatkowych transformantów E. coli 294, otrzymanych w ten sam sposób jak opisano w czesci C, metoda screeningu kolonii in situ Grunsteina i Hognessa /patrz wyzej/. Izoluje sie kolonie hybrydyzuja¬ ce z próbka w róznych ilosciach. Izoluje sie plazmidowy DNA z tych kolonii oraz dzie¬ sieciu hybrydyzujacyoh kolonii okreslonych w czesci G, jak wyzej, przez przeciecie Pstl i charakteryzuje trzema róznymi metodami. Po pierwsze, te fragmenty Pstl charak¬ teryzuje sie przez sposób, w jaki trawione sa one przez endonukleazy restrykcyjne, z uzyciem enzymów Bglll, PvuII i EcoRI. Analiza pozwala na klasyfikacje co najmniej os¬ miu róznych typów /LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G i LelF H/ przedstawionych na fig. 5, gdzie rózne naciecia restrykcyjne przedstawione sa /w przy¬ blizeniu/ wzgledem dodatkowej znanej presekwencji 1 sekwencji kodujacej LelF A. Uwaza sie, ze jeden z nich, LelF D, jest identyczny z tym, o którym doniesli Naga ta i wsp., Nature, 284, 316-320 /1980/.Po drugie, rózne DNA bada sie metoda selekcji hybrydyzacyjnej, opisana przez Cle- velanda 1 wsp., Celi, 20, 95-105 /1980/, pod wzgledem zdolnosci do wybiórczego usu¬ wania mRNA LelF z RNA komórek KG-1 zawierajacego poll A. LelF A, B, CIF okazaly sie w tym badaniu pozytywne.Po trzecie, dalsze fragmenty Pstl wprowadza sie do plazmidu wykazujacego ekspresje, transformuje tym plazmidem E. ooll 294 1 doprowadza do ekspresji fragmentów. Produkty ekspresji, 00 do których uwaza sie, ze zawieraja pre interferony, byly wszystkie pozy¬ tywne w badaniu CPE aktywnosci interferonu, aczkolwiek w przypadku fragmentów LelF F aktywnosc byla bliska granicy. Oprócz powyzszych badan, wszystkie trzy LelF poddano badaniu sekwenoji.Przyklad IX. Bezposrednia ekspresja drugiego dojrzalego interferonu leuko¬ cytów /LelF B/.Sekwencja izolowanego fragmentu zawierajacego gen dojrzalego LelF B wskazuje na pierwsze 14 nukleotydów identycznych w typie A i B. Zgodnie z tym, izoluje sie frag¬ ment genu pLelF A25 zawierajacy uklad promotor-operator trp, miejsce przylaczenia ry-148 260 19 LelF H. Calkowity gen LelF H mozna uksztaltowac w celu ekspresji dojrzalego inter¬ feronu leukocytów w nastepujacy sposób: 1. Plazmid pLelF H poddaje sie trawieniu Haell i Rsal z izolowaniem fragmentu o 816 b.p. rozciagajacego sie od aminokwasu 10 sygnalowego peptydu do nie kodujaoego regionu 3. 2. Fragment denaturuje sie i poddaje syntezie reperacyjnej z uzyciem polimerazy DNA I /fragment Klenowa/ /Klenow i wsp., Proc* Natl. Acad. Sci. USA, 65, 168 /1970/, stosujac syntetyczny primer dezoksynukleotydowy 5*-dATG TGT AAT CTG TCT. 3. Powstaly produkt rozszczepia sie Sau3a i izoluje fragment o 452 b.p. reprezen¬ tujacy aminokwasy 1-150. 4. Przez trawienie pLelF H Sau3a i Pstl i izolowanie powstajacego fragmentu o 500 b.p. uzyskuje sie gen kodujacy aminokwasy od 150 do konca kodujacej sekwencji. 5. Fragmenty izolowane w stadium 3/ i 4/ laczy sie z utworzeniem fragmentu: 1 166 met cys asp stop ATG TGT GAT TGA PstI Sau3a kodujacego 166 aminokwasów LelF H. 6. pLelF A trp 25 trawi sie lba I, laczy wolne konce za pomoca polimerazy DNA i tra¬ wi produkt Pstl. Powstajacy duzy fragment mozna wyizolowac i polaczyc z produktem otrzymanym w stadium /5/ z utworzeniem plazmidu wykazujacego ekspresje, zdolnego, po transformacji E. ooli K-12 szczep 294 lub innej bakterii-gospodarze, do ekspresji dojrzalego LelF H.LelF I. Poddaje sie screeningowl faze Charon 4A zbioru rekomblnantów ludzkiego ge¬ nomu skonstruowanego przez Lawna i wsp. Celi, 15, 1157 /1978/, pod wzgledem genów in¬ terferonu leukocytów metoda opisana przez Lawna i wsp. /jak wyzej/ i Maniatisa i wsp.Celi, 15, 687 /1978/. Promieniotwórcza próbke odnoszaca sie do LelF otrzymana z cDNA klonu LelF A stosuje sie do screeningu okolo 500 000 lysinek. Za pomoca tego acreenin¬ gu otrzymano 6 klonów z genomem LelF. Po powtórnym screeningu i oczyszczeniu materialu z lysinek, jeden z tych klonów, HLeIF2, wybrano do dalszych badan.Przy uzyciu opisanych wyzej metod, mozna uzyc innych próbek do korzystnego izolowa¬ nia dodatkowych klonów LelF z ludzkiego genomu. Moga byc one, z kolei, zastosowane do wytwarzania sposobem wedlug wynalazku dodatkowych bialek interferonowych leukocytów. 1. Dokonuje sie podklonowania fragmentu EcoRI o 2000 b.p. klonu HLeIF2 do miejsca EcoRI w pBR325. Powstajacy plazmid LelF rozszczepia sie EcoRI i izoluje fragment o 2000 b.p. Dezoksyoligonukleotyd aAATTCTGCAG /konwertor EcoRI-Pstl/ laczy sie z frag¬ mentem EcoRI o 2000 b.p. i powstajacy produkt rozszczepia Pstl z otrzymaniem fragmen¬ tu o 2000 b.p* zawierajacego konce Pst I. Rozszczepia sie go Sau96 i izoluje fragment, który ma jeden koniec Pstl a jeden Sau 96, o 1100 b.p. 2. Plazmid pLelF C trp 35 trawi sie Pstl i Xbal. Izoluje sie duzy fragment. 3. Maly fragment Xbal-Pst I z pLelF C trp 35 trawi sie Xbal i Sau 96. Izoluje sie fragment Xbal-Sau 96 o 40 b.p.A* Fragmenty izolowane w stadiach /1/, /2/ i /3/ laczy sie z utworzeniem wykazuja¬ cego ekspresje plazmidu pLelF I trp 1.LelF J. 1. Plazmid pLelF J zawiera fragment Hindlll o 3*8 kilozasad DNA genomu ludz¬ kiego, w którego sklad wchodzi sekwencja genu LelF J. Z plazmidu tego izoluje sie frag¬ ment Ddel-Rsal o 760 b.p. 2. Plazmid pLelF B trp 7 rozszczepia sie Hindlll i Ddel 1 izoluje sie fragment Hlnd III-Ddel o 340 b.p. 3. Plazmid rozszczepia sie Pst I, konce przeksztalca w wolne za pomoca polimerazy DNAI /fragment Klenowa/, a nastepnie trawi Hindlll. Izoluje sie duzy fragment o okolo 3600 b.p. 4. Fragmenty izolowane w stadiach /1/, /2/ i /3/ laczy sie z utworzeniem wykazuja- oego ekspresje plazmidu pLelF J trp 1.20 148 260 Przyklad XI • Oczyszczanie.Zawartosc interferonu leukocytów w ekstraktach bakteryjnych mozna podwyzszyc, wy¬ konujac kolejno: 1, Wytracenie polietylenoimina, po którym wiekszosc bialek komórkowych, w tym in¬ terferon, pozostaje w supernatancie • 2* Frakcjonowanie siarczanem amonu, po którym interferon wytraca sie z roztworu przy 55* nasyceniu siarczanem amonowym. 3. Zawieszenie osadu wytraconego aiaroza nem amonowym o 0,06 M fosforanie potaso¬ wym, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 i poddanie dializie wobec 25 mM Tris-HCl o pH 7,9 /ak¬ tywnosc interferonu stwierdza sie w roztworze/. 4. Przeprowadzenie chromatografii supernantantu otrzymanego w sposób jak opisano wyzej na kolumnie z DEAE celuloza /eluujac gradientem liniowym od 0 do 0,2 M NaCl w 25 mM Tris-HCl, pH 8,5/. 5. Adsorpcje na Cibachrome Blue-Agarose lub hydroksyapatycie i elucje, odpowiednio 1,5 M KC1 lub 0,2 M roztworem fosforanu /fakultatywnie/. 6* Ustalenie ciezaru czasteczkowego na kolumnie zelu Sephadex®G-75. 7. Przeprowadzenie chromatografii kat io nowymiennej na CM-celulozie w 25 mM oota- nie amonowym w pH 5,0 z uzyciem do rozwijania gradientu octanu amonowego /do 0,2 M octanu amonowego/* Powyzszy sposób pozwala na uzyskanie materialu o czystosci 95*« Material mozna równiez oczyszczac za pomoca chromatografii typu nsize exclusionM, wysokocisnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami /RP-8/ lub chromato¬ grafii powinowactwa na unieruchomionych przeciwcialach przeciw interferonowi* Alternatywnie, material otrzymany w etapie /4/ mozna naniesc na kolumne z monoklo- nalnymi przeciwcialami, otrzymanymi w sposób opisany przez Milsteina, Scientifio Ame¬ rican, 243, 66 /19B0/ z elucja 0,2 M kwasem octowym, 0,1* Triton i 15 M NaCl.W alternatywnej, korzystnej postaci sposobu wedlug wynalazku, interferon leukocy¬ tów wytworzony sposobem wedlug wynalazku mozna oczyscic w nastepujacych operacjach: 1. Zamrozony osad komórek zawierajacych interferon leukocytów, który ulegl ekspre¬ sji, rozbija sie recznie przy uzyciu odpowiedniego urzadzenia do rozcierania. Czescio¬ wo rozmrozone komórki zawiesza sie w 4 objetosciach buforu A, zawierajacego 1 M Tria, o wartosci pH nastawionej na 7,5-8, 10* /wagowe objetosciowych/ sacharoze, 0,2 mM NaCl, 5 mMBDTA, 0,1 mM PMST i 10-100 mM MgCl2. Temperature zawiesiny doprowadza sie do okolo 4°C c Zawiesine przeprowadza sie przez homogenizator pod cisnieniem 413,685 • 10^ Pa, a nastepnie przeprowadza sie drugi raz pod cisnieniem mniejszym niz 67,948 • 10^ Pa.Plan wyplywajacy z homogenizatora, zarówno po pierwszym, jak i po drugim przejsciu zbiera sie w lazni z lodem. 2. Do homogenatu dodaje sie powoli polietylenoimine do stezenia okolo 0,35* i od¬ stawia sie na okolo 30 minut* Ciala stale usuwa sie za pomoca wirowania lub saczenia.W operacji tej trzeba kontrolowac temperature lub przeprowadzic proces wystarczajaco szybko tak, aby utrzymywac supernatant /przesacz/ w temperaturze nizszej niz 10°C.Supernatant /przesacz/ zateza sie do okolo 1/10 objetosoi wyjsciowej za pomoca ultra- filtraoji. Material w postaci czastek lub zamglenia usuwa sie za pomoca odpowiedniego saczka, takiego jak membrana miliporowata* 3* Sklarowany roztwór nanosi sie bezposrednio na kolumne z przeciwcialami monoklo- nalnymi przy przeplywie 5-8 cm/godz. /np. 25-40 ml/godz. przez kolumne o srednicy -2,6 om/* Po naniesieniu, kolumne przemywa sie okolo 10 objetosciami, w stosunku do objetos¬ oi kolumny, 25 mM Tris-HCl pH 7,5-8,5 zawierajacym 0,5 M NaCl i substancje powierzchnio¬ wo czynna, taka jak 0,2* Triton X 100 lub jego odpowiednik* Po przemyciu, kolumne prze¬ plukuje sie okolo 10 objetosciami, w stosunku do objetosci kolumny, roztworu zawiera¬ jacego 0,15 M NaCl i substancje powierzchniowo czynna, taka jak 0,1* Triton X 100 lub jego odpowiednik* Blucje prowadzi sie 0,2 M kwasem octowym zawierajacym substancje po¬ wierzchniowo czynna, taka jak 0,1* Triton X 100 lub jego odpowiednik* Frakcje z kolumny148 260 21 z monoklonalnymi przeciwolalami, zawierajace szczyt bialkowy /oznaczony na podstawie absorpcji UV lub w innych dogodnych badaniaoh/ laczy sie i doprowadza ich pH do okolo 4,5 za pomoca 1 N NaOH lub 1,0 M Tris w postaci zasady. 4. Polaczony szczyt interferonowy nanosi sie na wymiennik kationowy, taki jak celu¬ loza Whatman CM52, lub Jej odpowiednik, zrównowazony wlasciwym buforem, takim jak 50 mM octan amonowy o pH 4,5* Po naniesieniu kolumne przemywa sie buforem, którym byly zrównowazone, az absorbancja UV wycieku osiagnie plateau tak, ze z kolumny eluuje sie niewiele dodatkowyoh bialek* Nastepnie prowadzi sie elucje mieszanina 25 mM octa¬ nu amonowego 0,12 M chlorku sodowego lub kombinacje optymalizujaca odzyskanie inter¬ feronu 1 uzyskuje sie zlofilizowana substancje o zadowalajacym wygladzie i rozpusz¬ czalnosci.Monoklonalne przeciwciala uzywane w konkretnym zastosowaniu opisanym wyzej mozna otrzymac sposobami opisanymi przez Stache lina i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1848-1852 /1981/. Monoklonalne przeciwciala oczyszcza sie i wiaze konwencjonalnie z Affige1-10, jak opisano w dalszej czesci opisu* Przyklad XII. Otrzymywanie i oczyszczanie monoklonalnych przeciwcial z ply¬ nu puchlinowego.Kazda z 5 myszy Balb/c, sarnio, szczepi sie komórkami hybridoma ze srodkowej, loga¬ rytmicznej fazy wzrostu, w ilosci 10 x 10 . Okolo 5 1 10 zywotnych komórek otrzyma¬ nych od myszy tworzacyoh plyn wszozepia sie do otrzewnej kazdej z 10 lub wiekszej ilo¬ sci myszy. Zbieranie plynu puchlinowego od kazdej myszy powtarza sie 2-4-krotnie.Przenoszenie komórek od jednej grupy myszy do nastepnej ze zbieraniem plynu mozna pow¬ tarzac do trzech razy. Laczy sie plyn puchlinowy od myszy z kazdego przeniesienia.Komórki i debris usuwa sie z plynu puchlinowego przez wirowanie przy niskich obro¬ tach /500-100 x g/ w ciagu 15 minut. Nastepnie wirowanie prowadzi sie w ciagu 90 mi¬ nut przy 18 000 obrotach/minute. Supernatant zamraza sie i przechowuje w temperaturze -20°C. Po rozmrozeniu, dodatkowa fibryne 1 material w postaci czastek odwirowuje w ciagu 90 minut przy 35 000 obrotach/minute. W partiach plynu puchlinowego z kazdego przeniesienia bada sie aktywnosc swoistego przeciwciala metoda wiazania sie z faza stala /Stachelln i wsp. jak wyzej/ i puluje, jesli jest ona dostateczna.Stezenie bialka w spulowanych roztworach oznacza sie przez przyblizenie przyjmuja¬ ce, ze 1 mg bialka odpowiada absorbancji 1,2 w 280 nm w kuwecie o drodze optycznej 1,0 cm. Plyny puchlinowe o wysokim poziomie przeciwcial zawieraja 30-35 mg bialka/ml.Jest to odpowiednik 4-7 mg swoistego przeciwciala/ml. Plyn rozciencza sie PBS /0,01 M fosforan sodowy, pH 7,3, 0,15 M NaCl/ do stezenia bialka 10-12 mg/ml.Po kazdych 100 ml rozcienczonego roztworu dodaje sie powoli, przy energicznym mie¬ szaniu, w temperaturze 0°C, 90 ml roztworu siarczanu amonowego nasyconego w tempera¬ turze pokojowej. Zawiesine przetrzymuje sie w lodzie w ciagu 40-60 minut i wiruje przez 15 minut przy 10 000 obrotach/minute w temperaturze 4°C. SUpernatant dekantuje sie i dobrze odciaga. Osad bialkowy rozpuszcza sie w 0,02 M Tris-HCl /pH 7,9/ /0,04 M NaCl/bufor 1/. Roztwór bialkowy dializuje sie w ciagu 16-18 godzin w tempera¬ turze pokojowej wobeo 100 objetosci buforu I, z przynajmniej jedna zmiana buforu.Dializowany roztwór wiruje sie przy 15 000 obróta oh/minute w ciagu 10 minut w celu usuniecia nie rozpuszczonego materialu. Odzyskuje sie okolo 30-35& wyjsciowej ilosci bialka calkowitego w plynie puohlinowym /oznaczenie przez absorpcje w 280 nm/.Roztwór zawierajacy 30-40 mg bialka/ml nanosi sie na kolumne DEAB-celulozy zrówno¬ wazonej buforem I* Stosuje sie 00 najmniej 100 ml objetosci zloza kolumny na gram na¬ niesionego bialka. Przeciwcialo eluuje sie z kolumny linearnym gradientem NaCl zawie¬ rajacym 0,02 M Tris-HCl, o pH 7,9 i od 0,04 M do 0,5 M NaCl. Polaczone frakcje szczy¬ towe wyeluowane miedzy 0,06 a 0,1 M NaCl zateza sie przez wytracenie taka sama ilos¬ cia roztworu siarczanu amonowego nasyconego w temperaturze pokojowej 1 odwirowanie.Osad bialkowy rozpuszcza sie w 0,2 M NaHCO^ /pH 8,0/ /0,3 M NaCl /bufor II/, a nastep¬ nie dializuje wobeo trzech zmian tego samego buforu w temperaturze pokojowej.22 148 260 Dializowane roztwory odwirowuje sie przy 20 000 x g w ciagu 15 minut w celu usuniecia nierozpuszczalnego materialu. Stezenie bialka doprowadza sie za pomoca buforu II do 20-25 mg/ml.Przyklad XIII* Otrzymywanie immunoadsorbentów Affigel-10 /produkcji Bio- rad Laboratories, Richmond, Kalifornia/ przemywa sie na saczku ze szkla spiekanego trzykrotnie izopropanolem o temperaturze lodu, a nastepnie woda destylowana o tempe¬ raturze lodu. Zel w postaci papki /50$ w zimnej wodzie/ przenosi sie do plastykowych probówek i osadza przez krótkie wirowanie. Supernatant odciags sie. Upakowany zel miesza sie z taka sama objetoscia roztworu oczyszczonego przeciwciala i poddaje dzia¬ laniu obrotów "end-oYer-end" w temperaturze 4°C w ciagu 5 godzin.Po zajsciu reakcji zel odwirowuje sie i przemywa 2 razy buforem III /0,1 M NaHCO-/ 0,15 M NaCl/ w celu usuniecia nie zwiazanego przeciwciala. Oznaczenie bialka w pola¬ czonych przemywkach ujawnia, ze ponad 90$ przeciwciala zostalo zwiazane z zelem.W celu zablokowania miejsc, które nie przereagowaly, zel miesza sie z taka sama objetoscia 0,1 M chlorowodorku etanoloaminy /pH 8/ i poddaje dzialaniu obrotów "end- -over-end" w temperaturze pokojowej w ciagu 60 minut. Zel w postaci papki przemywa sie PBS w celu uwolnienia od substratów reakcji i przechowuje w PBS w obecnosci 0,0256 /wagowo objetosciowych/ azydku sodowego w temperaturze 4°C.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich zawierajacego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy do N-iconca pierwszego aminokwasu tego inter¬ feronu przylaczona jest metionina, zawierajacego 166-167 aminokwasów, i o czesciowej sekwencji Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Gla-Ile-Met-Arg-Ser,jak wskazano w sekwen¬ cjach na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 151» przez powodowanie wzrostu hodowli drobnoustrojów, transformowanych zdolnym do replikacji drobnoustrojowym nosnikiem eks¬ presji, i ekspresje interferonu, znamienny tymTze konstruuje sie wektor E. coli zawierajacy promotor trp E. coli, operator i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, izoluje sie fragment DNA kodujacy dojrzaly interferon leukocytów ludz¬ kich, i dokonuje sie insercji tego fragmentu DNA interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp E. coli, operatorem i liderowym miejscem przylaczenia rybosomów trp, otrzymanym wektorem ekspresji E. coli zdolnym do ekspresji dojrzalego interferonu leu¬ kocytów ludzkich, transformuje sie w znany sposób szczep E. coli 1 powoduje sie wzrost transformowanego drobnoustroju w pozywce zawierajacej dodatek tryptofanu w ilosci wys¬ tarczajacej do represji ukladu promotor trp - operator, obniza sie poziom tryptofanu w pozywoe az do indukcji transformowanego drobnoustroju do wytwarzania interferonu, po czym transformowany drobnoustrój poddaje sie lizie przez dodanie llzozymu i nastep¬ na sonifikacje, i wreszcie odzyskuje sie interferon w znany sposób, zwlaszcza metoda stracania, za pomoca chromatografii typu "size exclusion", wysokocisnieniowej chroma¬ tografii cieczowej z odwrócona faza /RF-8/ lub chromatografii powinowactwa na unieru¬ chomionych przeciwcialach przeciw interferonowi. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA interferonu leuko¬ cytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspre¬ sji dojrzalego interferonu A leukocytów ludzkich /LelP A/. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA inter¬ feronu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustro¬ jowej ekspresji dojrzalego interferonu B leukocytów ludzkich /LelP B/. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA inter¬ feronu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustro¬ jowej ekspresji dojrzalego interferonu C leukocytów ludzkich /LelP C/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4.148 260 23 5* Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ge jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu D leukocytów ludzkich /LelF D/f o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4» 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu P leukocytów ludzkich /LelF F/t o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y m, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu H leukocytów ludzkich /LelF H/, o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej.na fig* 4. 8* Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania ekspre¬ sji dojrzalego interferonu I leukocytów ludzkich /LelF I/, o^sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu J leukocytów ludzkich /LelF J/, o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9.Peptyd trypsynowy (T -1) Peptyd trypsynowy (T-13) Bialko Ala-Glu- Ile -Met-Arg — His-Glu-Met-Ile-Gln— mRNA 5' GCN GAA AUC AUG A(3N 5' CA GA AUG AUC CA„ GUC UG UG fc O Komplemen- 3* CTT TAG TAC GC (T-1A) 3' GTA CTT TAC TA (T-13A) tarne primery T DNA ___c (T.1B) __G (T.13B) T_(T.1C) c (T-13C) Rg.1 —-C T-(T-ID) — G--C---(T-13D)148 260 Próbka 32P- T- IC 1 ^ 4 5 C 7 8 9.101112131415l6l7j8l92p2l22232425 26 272829303132333435363738 Próbka *P - T - 13C 12 3 4C 6 TA 91011121314156171819 252627282930313233343536373839 4"*P^ Rg.2f % X0TJTrr9TT0XaLD90X0OXT0OX0Y00^^ H £I«f X0VXTrramU*HOY0X00XYX0X0Y!^^ O #!•! X0VXTTVf)TVfXI0X0O0XX0XT0aX0TOeU0XTr!XVMO0C^ Z *H xotx¥ y *fflTPXoxoooxooxTooxoYoai^vrf^ a *r<^ X0TXTrf!*TYaLaKO0XXCXY00X0Y^ a *XTT XOTXrfrO0*t)XtI3DPX0OXTO3X0TO0TfttTV^ O *I«T XOTXTTTOOTOXOd^OOXOaXTDOXOTD^ fl *I«T X0YJTYYWmXIM0«X0XXYD0X0TOOT^ T *I^ 0%% 0*% 00* 08C 09€ MXXJ3YfwaYaYX3XXTrrr?fnrxoo^ h ^i^t 0TXXJ3TTPX3T0TX0XXT¥TOTtTXCXX0T0T0TC^TO0OXX0VX0OX0XT0X0VO0rTV0V0OV0XXaXOXVT0XXD0TOVO0T0aXTaiTgnrfXT00 O £11 OYYXXOYTfXlOTOMXIXYYYYY3TXOOXOOOT0YOW 4 *I^ {^jjjoTroiwyTXOoxfyvovovxxxxoooTOTmTooaLiOTXTPxoxT * sm 3YXCXOYYTOOTOOIOXXTTrOY0TXOOXOOTf^ a *T*1 0YXXXDYTOXOT0OXXXXTYYTTOTXOOXODeTO 3 #J*q 0YDXX0tYDiXT«*X0XXTT0XTDYXaXX000Y^ O «**T 0TX0X0TTOX0T0TXOXLyffOWfX00X300TOT0XYOOOLX0fXiK)X0XT0X0VO0VVT0 T *X^ oirC orC ooc 09? 09Z XOOXOXOXOXTODOTTOXOt)¥ VfP10aXXt»VP0TT09OXTt)XXXTVDDVO0Y0 000XXXYYMXX0TOXVDYOVDYOCrrmi30OX00X^^ H JT^T X00X0X0X0XT0C)0YTaX0f)0TTOTO0XXOT00TT00OXTfJJLXOV XOOXXXVDOXXXOTOXTD O JI*'! xooxoxox3XToooYYoxoooYwrooxxD^^ DoooxxTooixxoTOXTOTOvovoavYDXoofro * *i«nr xujx)oxxoxTXPorrpxxopTTgrrooxxoT^ a *!•* X00XOIOX0XY0Dfm0X00DYTOYDaXX!yr00YT0^^ OOOXXXTOOXXIOTOXTOrOTOTDf)XTO*DXOXOCXOaXXOOXOK) a *I^ XOOXfXIOXOXTPC)trrT3XOfOTTTrrOC^^ 0000XTTfXD0XXXTDXT0TOT0VOfnrrOX0Df)XO0X0XXXODXaX0 O £1^ XOOXOXDXDXTODfrrrOXOOOTTCrrOOXI^rrDTTTXTDXTO^^ 000C^YYfXLIX0YOXTOTDYDTO0TYOTO fi Jl^I X0OXeX000XT00TTT0XOOtlff f TJDXXOTO0TT030 XXXOYOOTOOT0 00tAXXTO0XXX0Tf)XT0TDT0TOOTT0XX0f)XO0XrXXXXaiaiO T Of* Ot* Ott 081 09 i XTWTW10ETTTDTOf)0XTOXOM,TggXl^^ H fLI XTTOTT00MTrWTrOeXOCXOTXYaiJO J *I^ XYTOYDOY3XTYT0YDY9X03XOTXTOXX00t)P^^ 3 M^ XYTDTOO'TDXYTTOYOOOXOOXC0XYOXXOOY« Q JX^ XTTOTTO0atTTT0n»0X0ai0TXT0XX00O00Y00TXTrXOD01^ 0 *I^ X¥ JOffPaOXTTTOTOf)OX00X0TXTOXXO0f)POTTO H *I*Tf XTTYTODYf)XT3YDTDO0X00XMXTf)^^ T M^T ©«ri ort ooi os 09 DOXOtUOaiOOOOMYMTT^^ H *I*T »X0tVI^fUOOCKOXT?)XOYIXXOXIX^ d *X~1 tf *I*f ooi*)O£ODxaci0OXTaj3rxxiof^^ a ji^t 0OXO0XDaiOOOO0XTXT^UJOJJJ^^ O *L+T Of)XOOXOTXOODfOXOaLTriXXTXXXXXOYOXXOOO^ G JT*H[ DOXOaLOMOO0OIXraDXOYXXXOOXXM T M~t 0*1 Ot 1+ OZ- Oty- 09-kóO 480 500 520 540 L*IF ? TCCUAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTO^^ L#IF B TCCAAAGAATCACTOTATATCTGACAGAGAAGAAATACAGCTCrr^ L»XF C TCCAAAGAATCACTtrTTTATCTAATAGAGAGGAAATACAG^^ L«IF D TCCGAAGAATGACrCTCTATCTGACUGAGAAGAAATACATC L*IF £ TTOA A AGA ATCACTCTTTATCTGAOLAAGAAGAAOTATAOCCCr^ CTGTCAflAOCAOAAATCATGAGATCCrrTCTCTTTATGAACGAA L#IF F TCOAA AGA ATCACTCTTTATCTGACAGAGA AGA A ATACAQCC(?ITCrnXrrTQOGAQGTTGTCA^ L^IF G TTCAAAGAATCAC0(nt7rATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTQTGCATGOGAGGTT^ 560 580 600 620 640 1*IF A (OTGCAAGAAAGTITAAGAAQTAAGGAAX&4AAACTGGTrCAACAT^ hmir B CTTGCAAAAAAGATTGAAOA AAOGAATOAGACCTGGTACAACAOGGAAATGATTCTCATAGA^ L*IF C CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGATTGAAAACTGGTTCAACATOGCAAl^ L#IF D CTTGCAAOAJLA0ATTAAGGAGGAAGK}Aa7IItATCTCHTCCA^ LmlW B CTTGCAOGAAAGATTAAOGAOGAAGGAATCIaAACTCKHTCAACATOGAAATG^ L#XT F TTTTCAAGAAAGATTAAGGAGGAACXiAAl£lAACCaiTTCAAC^^ LmZW G CTTGOAAGAAAGATTAAGGAGGAACKlAAlflAAAACntHm^AACATOG L*IF H CTTGCAA A A AAGATTAACGAGGAAGGAl^^AAACTOGTTCATCAT^AAATGATTCTCATTGACTAATA^ 660 $80 700 720 }40 LmJT A TCAAAQACTCATUlTlVltXrTATQACC^ I I ¦ lililliBWlTTAATCAACATTgTATTCAgCTCTTAAOOCACTA LelF B TTTCAAAGACCCTTCTTTCTGCCAAAACCATGCTAra L*IF C TTn^AAGACTCACTTCTATAACCACGACXK)GTrc^ L#IF D TTTCAAAGACTCTCACCCCTOCTATAACTATOACCATGCTOATAAA L*IF B TGCCATTTCTCATTTTTOCTATATCCATGACATO £ L#IF F TTCAAAC^CTCATTTOtLCrrATAACCACCGC^ AflG A A ACATCAlUriTACCTGTOCAOGCA 00 LmTF G TrCAAATATTAATTTCTGCTATATCCATGAgrTGAOTroAATCAAAATTT^ Jg L*XF H TOAAAflAOTCACTTCTATAACCACCACAAflTTOAATCAAA O 760 780 800 eao $4o 1*XF B CttACTACrrCCCTrACAaATGA£CATGCTaATOOATCTATTC^ L#IF 0 TCCITTACAflATGACHSATTCTGATGTCTCrrOT^ L«XF D TOTTCATATAAC&TCATOrGCACCTTTACAC^^ LmlW B CTAGTTCCriTACOOATGATCATOCTaAJtKlATOgOT^ L*IF F CTAGTOCrrrACAGATgACCATOCTOATAGATCTAATr^^ 1 ITUrUCATBTAATATT L«IF O AAATCTTrACAGATGATCATGCCAATCTATCTATTCTAT^ 1*XF H CTTTACAGATaACCATTCTOATCrrCTCCTTTCATCTATTTATTTAAAT^ 860 880 900 920 ?40 L#IF A ATTACGTCATGTGCACCTTTGCACAGTGGTTAAT^ LmJF B CATATrATATTATGTGAACTTTTACATTGTGUUTT^^ l*IF C TOTWnTAATGTAAOAATATATGTTCTTCA^ L+IT B ATOTATTTTTACnTTGTCKiTTAATATA^ L*IF F ATOTGrTACrrTTTACATTGTGTTATATCAAAATATGTTAATCTAAtATTTAGTCAAT^ I*IF G TTAAATTATTTTAAACTTATGTTItnTCAGGTAATA^ L#IF H OGAGTAOCTTTACATTOTGGTTAATGTAACAAATATGTTCrrTGATATI^ 960 980 1000 LmlF B AATTCTTTATTTATTCTTTAAAATTGAACTCC L»IF F ATTATrmaiTATTCTTTAATA A AGA A ATTCCAAGCCC-poly/i/ Fta.3 /c.djSI SIO $20 S23 10 $0 30 kO LtlF A MALTFALLYALLYLSCKSSCSYGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKXSLFSCL]CDRHDFGFPQ Leip d maltftlmvalvvlsyk;sfsslgcdlpqthslgmrralillaqmrrispfsclkdrhdfefpq 1*XP C MAL»rSLi.MAVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLGWRRALILLGQMORrSPFSCLKDRHDFRIPQ L*IF D MASFFALLMYLYYLSCKSSCSLGCDLPETHSLDHRRTL)ILLAQMSRXSPSSCLMDRBDFGFPQ L«IF E LPLGCDLPQAHSVGNRRAFILLTQMRRISPFSYLKDRHDFDFPH L«IF F HALSFSLLMAVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLGWRRALILLAQMflaX*PFSCLKDRHDFQFPQ LsIFG UDFGFPQ L#XP H MALPFSLMMALVVLSCKSSCSLGCNLSQTHSLNWRRTLMLMAQMRRISPFSCLKDRHDFttFPQ w»zy«tki« MA * L YLSKS S G C L THSL R R L ^ QM XS S£L_£HDL L <* 50 60 ?0 80 90 iOO 1*IF ? SB. F-GtfQFQKABTXPYLHEMXQQXFNLFSTKDSSAAYDETLLDKPYTBL,YQQLNDLBACYXQO LalF B BBFDDKQFQKAQA1SVLHEM1QQTPNLPSTKDSSAALDETL1.DEFYIELDQQ;lVDL£VLCDQB L*IP C BBFDQtfQFQKAQAISVLHEMlQqTFNLFSTEDSSAAYEQSLLEKFSTBLYQQLNDLEACVIQB L«IF D BBFDGNQFQXAPAXSVLH£LIQQIFNLPTTKDSSAAVD£DLLDKFCTELYQQLNDLBACVNQB L«XF B QYFHOWHFQKVQAIFLFHBMMQQTFNLFSTKDSSDTYDBTLLDKSYT£LYQQLNDLBACVM K -i L#XF F £BFDG»QFQKAQAISVLHBMlQQTFNLFSTKDSSATYEQSLLEKFSTELNQQLirDMEACVIQB £ L#IF G ££FDGWQFQKAQAXSYLHBMXUQTFNLFSTKDSSAT¥DBTLLDKFYT£LYQQLtfDLEACMMQB ro L*XF H B£FDGNQFqKAQAXSYLH£MMQQTFNLFSTKNSSAA¥D£TLL£KFYXELFQQNKDLBACYXQB g wpvymt*lm E X T D &£&&£ I V L H E |10 120 130 \k0 150 |60 166 LeXF A VOTTBTPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKBKKYSPCAYEVVRAEIMRSFSLSTNLQBSLRSKE LeXF B YOYX£SPLMY£OSXLAYRKYPQRXTLYLTBKKYSSCAY£YYRA£INRSFSLSXNLQKRLKSK£ L«IF C YGYBBTPLMNBDSXLAYRKYFQRITLYLISRKYSPCAYBYYRA£XMRSLSFSTir LQ K R L R R K D L*IF D BRYOBTPLMlfVDSILAVKKYFRRITLYLTBKKYSPCA¥BYVRABIMRSLSLSTNLQBRLRRKB L*IF B VGYBBTPLRWVDSILAYRKYFQRITLYLTKKKYSPCS¥BAVRABIMRSFSL TVLQBRLRRKB L*IF F VGVBBTPLMNVDSILAVKXYFQRITLYLTEKKYSPCAYBVVRABIMRSFSLSKIPQBRLRRKB L*IF G YGY-BDTPLN]fYDSXLTYRKYFQRXTLYI,T£KKYSPGAYBYYRABXMRSFSLSANLQBRLRRKB LmlF H VQVBBTPLMWBDSXLAVRKYPQRITLYLMEKKYSPCAYBYYRABIMRSF8FSTMLQKRLRRKI w«sy«tfeL« Y PJLM D£XL V K I F £ I T L I L S K Y S £A¥BYYRABXMR8 S 8 Q L K %*poryzasad o 200 400 600 800 1000 i i i i i i i i i i i pvui Bg/n Pvun Bg/n A —I Kill»-..:Lli.:-;M.s-i,M-.-.'/VKI-l-.f..-i'iAiJ.-.'».fc,-a l~» EcoRI EcoRI PvuII PyuD g —I kVNSa-.:*l,v-r.--.-W'i'...-.»'.^l-lll.. c E F G H pvun Bg/n Pvun eco ri Q ^U LV.»^-l-.-J.V-Al.!--.«-..'».-l.vAv.^:J-.-.-:-.v:^.1;lv.lJ U ~ PwiH Eco RlPvuB ¦-ga???'.^.'.};."::-'.;-:;-.:,-.^1.^^-.-.'--,.-.^^! n a pwff Bg/n Bg/n ^-ir^vssjb:-y-:-i!u..V:V.t Pvun *~^hYi i • i • • i •'¦ r • m.v- • ••'••',/l »¦••• .-¦'.••• * ••! Pvul rsKL^;.v'-U!^:!^vv.-.--:V^^^:V'.'W^v-^r Rg.5148 260 Rstl l Sau 3a Sau 3a |AvaD jBg/fl * -!-• -W- Sau3a Sau3a Bgfll | Avafl —* 1 * P^tl /:&bp\ 150 bp S23 1 '2 3 12 13 tt 1S gly cys asp leu arg arg thr leu - GGCTGTiGATCTG-AGGAG^Aa TTG- -CCGACACftGAC- TCC TCCTGfe AAC- I Sau3a, Avall Syntetyczny DNA »wyodrebniony fragment 5'AATTCAT6TGT <*TCTG-AGGAG o34bP 3* GTACACACTAG AC-TCC TCC TG ligoza ONA T4 6"Kbp Avall, Bg/11 wyodrebniony fragment o 150 bp Bg/n wyodrebniony fragment o 670bp, czesciowo trawiony AATTCAreT?TSTaG-AGGAG Ava11. B9/n *" Bg/U _ MI G1ACACACTA&AC-TCCTCCTG -™—- ¦umilli i iiiiiiii llll EcoRI tftP AvaII ISObp ligoza DNA T4 i 2 1 Eco RI/ fttl Eco RI met cysasp Pst I AATTCATG TGTGAT ¦¦¦¦¦¦¦ m ¦¦¦ niiiiiniiiiiii min mi GTACACACTA 865bp 67Dbp Fig.6 Xba Rstl Sau3a EcoRI Sau3a| 1 LlK)bpJ-132bp GGCTGT^GATCTG EcoRI STOP Pst I TOObp -o- Fig. 7a HindDI EcoRI Xba EcoRI Sau 3a Le-IFA Pst I H E Trp—- ATGTGT GATCTG 3—I Fig. 7b8 % XMA«m)f0XD0fVLfUJO000T0TXY^ D xoojlooyoomóo910xi#ocoyoyxyyydyyoyooxyyi^ r XOJXDDYOD0daDOY0XX00C)OY0YXYYVOYVOYOV0VYX0XYXI^ I XWXOim00JO00X0XXD0COY0YXYYYDYY9YO0^^ H XOIXO0YOf0XO0f»XXOOOfJY0YXYYYDYVOYOYYYOXOXYX0XOXO YCUYYOYVY00XX3YXYYY00YtXL0X0ODIOXXYD0X0Yty ¥WJTWYM, Y OOC ooooxoYO¥ot?ooxopopixpo*«rerrxYfM*xLo^^ ? ? T»fxooxocxmjj lv ft o DOOOXOY9TOYY0aLO0rOJiOOYOOYOYXYf)X^ T ODOOXOYTYDYYf^YOOttUO0YOOYT)YXYfXLO^^ I OOOOXOYWOTT»OXg)ODOXXDPYOOYDYXYOXaLO^ H 000M0YfJYDYDY0XOD900XOOO0fmYXYt)XOXOX00OYYf^^ Y 00* ooxj^ojsoxaxYoxoY»frroYaYDOYOxxoxaxYvoxxooYf^ o 90XXOOXDf)XaXY0X0YD0YtnrOYOaY0XX0XaXYV0XX00YOT r OOXXOMOOXOXYDX0YOOYOYOYOOVOXXCaOXVVOXXM I O0XXD0X0fXL0XY0X0YYf)YYY0Y0OY0XX0X^ H OOXXOOX0OXaXYDX0Y*OYYY0Y0fY0XXaxaLVV0^^ Y OOC VaiXJ»YO0YOfrY00000XYYD00IXXY0XY0TOY0VOOYVa^ O YfXXI*mOY9OY0YOOOXLYDYOXXYYOXYOVOVOVOOYYf^^ T YOXXI3YO0YODY0000XX0YOMJX0YOX00Y9Y0 I YaXXXYYOOYtmOOOOXlXYYPlXLOYOXY3YPYOYPPYYgra H -•JJllXYOOYO0T0000XlXYf»XXX0Yf)XY0YT)Y0YO0Y Vfl*LDOXD0X0XXXX0X0X0XVYDVOOYMTOYOYDOOX00X0OXYaiX00 YOOYWYDO Y 00 Z VXOOOJ300YOYOOOYOYOXOOtUaLYaL9XOOPOXOXOXY O YXOOf)XOCOYOYOOOYOVOXOOfXIOXYOXOXOOOOXOXOXOfXK)XYODXYYYOYXOOY01^ T YXPOgXIOOOYOYOOOYOYOXOOOI^YPXOXOODYXOXDXXPIOXY I VXYY0X00OY0Y000YYYOX0X0X0XYYXDX0fK0X0X^^ H YXODOI^CXrYOYOOOYTYDXOOaXOXYfXLOXOOOfXLOX^ Y 001 !? -YO0OXYYYYOPXXXYXYQLOYX0OfrYXSPYOX"00YO00YJJO"YY0XXOO0 YOOOOYDYXOO¥ T TfPYtJOXOXOYYY0OYOY0Y0OXYX00Yf)YYXXX O -YOOOXYOYYOOXXXYOYYaOYXODOYXOYYOX-OXYOOOVXJ^)OYVOJXOYYYOOOOYOVXOOYYYYOYOJ^ f YOOOXXO9rnrOXXC)XYO0YOOYOOCOVOOVVaXYOXOOOOYXX I YOYXOXY0 YYOMOXYOOYOOYXOXSVOOYYOX-XXYOOOVOXOOOVX1J^)OYYXOOOYOOXO 0YVOYOY0XXDXO9YYDOYYYDVDOOYX-DODYYXXX H Y0YX0XY0YYOOX0XYDfrrrOYX0X0Y00YY0X-XXY0001l[0X0OOYXXIiOf)YYX00OYO0X00Y^ Y YXOYOXiMtTXO O YXOYOXXOXYXO p YXXD0XX0XYXO X YXOO3XXDXY&0 H VX0D0XXOXY» Y600 A CAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTC AACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAOGAGTAAGGAATGAAAACrrGGTTCAAGATGGAAATGATTTTG AT H CAG^GCAGAAATCATGAGATCCCTCTCnTTTTCAACAAACrrTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGG I CAGAGCAGAAATCATGAGATCTCTCrrCTTITTCAACAAACrrTGCAAAAAATATTAAGK^ J CAGAGCAGAAATCATGAGATCCrrTCrrCTTTTrCAACAAACTTGA A A A A AOGATTAAGGAGGAAGOigItfkAAACTGCTTCATCATOGAAATGATTCTCAT C CAOlGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCOTTTTCiLA^ 700 A TC*TTC«^TGCCAGCTCAC(rrTTTTATGATCTtK;CATCT H TGACTAATACATGITCTCACACTTTCATGAGTTCTTCCATTT^ I TC^CTAATACATTATCTCACACTTTCATGAGTTCCTCCAT^ J TGACTAATGCATCATCTOACACTTTCATGAGTTCTTCCATTTCAAA C TGACTAATACATTATCrTCACACriTTCATGAGTTCrrc^ 800 A GAGTATTAATCAAC^TTGTATTCAGCTCTTAAGGCAlirrAGTCCCriTACAGAGGA H AGGAGTCPTAAAGAAOCATCATGTATACCritJTGCAGGCACTAGTCCriTTACAGATGACCATG^ I AGTGTAAAGAAGCGTCGTGTATACCntlTGCAGGCACTAGTACTTTAC^^ J AGTCTTAAG/a(XJATCGTGTOTA.CCTGTGCAGGC^ C AGTOTA AAGA AGTOTCOTGTATACCTGTGCAOGCACTAGTCCTfrACUGATGACCAT^ 900 A TTTATTTAACrrATTTATAAAAC^LlCTTATTTTTGTTCATATTATGTCATGT^ U ATTTAACTATTTTTATTATTTAAATTATTTCT I TATTTTTAAGATTTAAATTATTTTTTTATGTAATATCA J TAACTATTTTTATTATTTAAATTATTTTTTATGTAATATC ATATGTACCTTTACATi GTGKSTTAATGTAACAAATATOITCTTCATATTTAOCCAATATA C ATTTITiLAJLlTTTATG«AATATCATOAGTCG 1,000 A TAAATTTATTTTOTGTTCTTCATTOA^ U TATATrAATTTCCTTriTCATTAAATTTTTACTATACAAAATTTCTGTGTTT^ I AATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATACAAA* I TTAATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATACAAAATTTCrrTGTGTTTGTTTArr 'TTTTAAGATTAAATGCCAAGCCntlACrrGT^TAACCTGACTTAA C TTAlATTTTTACTATACAAAATTTCrraaTGTTTG^ Fm 8 c-d-148 260 S1 SIO A MALTFALLYALLYLSCBBS H MALPPSLMMALYYLSCKSS I MALSFSLLMAYLTLSIKSI J MARSFSLLMYYLYLSYKSX C NALSPSLLNAYLYLSYKSI 820 1 10 CSYGCDLFQTHSLGS RRTL CSLOCRL8QTHSLirVRRTL CSLOCDLPaTHSLGMRRAL CSLGCDLPQTHSLR¥RRAL SLGCDLPQTHSLGVRRAL 20 30 A MLLACMRRISLPSCLl M MLNAQNRRISPFSC I ILLAQMORXSPFSC J XLLAQMGRXSFP8C C ILLGQMQRISPPSC 40 5 O LKDRHDFOFPQ£RF-OVfFQKAST LKORHDFRFPQSRFDairQFQKAQA LKDRFDFGLFQRSPDGVQFQKTQA LKDRHSFRFFRRSFDGHQFqKTQA LKDRHOFRXPqRRFOGVqFQKAQA 60 70 80 90 A XFYLHBMXQQXFRLF8TK08SAAVDRTLLDKFYT1LTQ H XSYLHBMMQQTFJrLPSTKtfSSAAVD£TLLBKPYXBLFQ X I S T L H £ O M T FN L F i X B D $ S 1 A H Q U L U ? S X I L I Q J XSYLHBMXQQTFVLF8TBBS8AAVBQSLLBKFSTBLYQ C XSYLHBMXQQTFVLFSTBD88AAVBQSLLBKPSTBXYQ A I X J c LMDL1A NIDL11 L JT N L B A L M D L B A L M D L B A 100 110 120 YXQGyOYTBTPLlfKBDSXLAYRKYFQ T I Q I T O T I I X F L X I I B S I l H I I ! IQ YXQBYGNBBTPLIftfBD YXQBYGYKBTP R I T L R I T L 8XLAYRRYPQRXTL LMBBD? XLAYRKYPQRXTL YXQBYGYBBTPLMHBD8XLAYRRYPQRXTL Fcg 9 PL PL PL
Claims (9)
1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich zawierajacego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy do N-iconca pierwszego aminokwasu tego inter¬ feronu przylaczona jest metionina, zawierajacego 166-167 aminokwasów, i o czesciowej sekwencji Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Gla-Ile-Met-Arg-Ser,jak wskazano w sekwen¬ cjach na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 151» przez powodowanie wzrostu hodowli drobnoustrojów, transformowanych zdolnym do replikacji drobnoustrojowym nosnikiem eks¬ presji, i ekspresje interferonu, znamienny tymTze konstruuje sie wektor E. coli zawierajacy promotor trp E. coli, operator i liderowe miejsce przylaczenia rybosomów trp, izoluje sie fragment DNA kodujacy dojrzaly interferon leukocytów ludz¬ kich, i dokonuje sie insercji tego fragmentu DNA interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp E. coli, operatorem i liderowym miejscem przylaczenia rybosomów trp, otrzymanym wektorem ekspresji E. coli zdolnym do ekspresji dojrzalego interferonu leu¬ kocytów ludzkich, transformuje sie w znany sposób szczep E. coli 1 powoduje sie wzrost transformowanego drobnoustroju w pozywce zawierajacej dodatek tryptofanu w ilosci wys¬ tarczajacej do represji ukladu promotor trp - operator, obniza sie poziom tryptofanu w pozywoe az do indukcji transformowanego drobnoustroju do wytwarzania interferonu, po czym transformowany drobnoustrój poddaje sie lizie przez dodanie llzozymu i nastep¬ na sonifikacje, i wreszcie odzyskuje sie interferon w znany sposób, zwlaszcza metoda stracania, za pomoca chromatografii typu "size exclusion", wysokocisnieniowej chroma¬ tografii cieczowej z odwrócona faza /RF-8/ lub chromatografii powinowactwa na unieru¬ chomionych przeciwcialach przeciw interferonowi.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA interferonu leuko¬ cytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspre¬ sji dojrzalego interferonu A leukocytów ludzkich /LelP A/.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA inter¬ feronu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustro¬ jowej ekspresji dojrzalego interferonu B leukocytów ludzkich /LelP B/. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA inter¬ feronu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobnoustro¬ jowej ekspresji dojrzalego interferonu C leukocytów ludzkich /LelP C/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.148 260 235. * Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ge jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu D leukocytów ludzkich /LelF D/f o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4»6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu P leukocytów ludzkich /LelF F/t o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 4.7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y m, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu H leukocytów ludzkich /LelF H/, o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej.na fig*
4.8. * Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania ekspre¬ sji dojrzalego interferonu I leukocytów ludzkich /LelF I/, o^sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako fragment DNA in¬ terferonu leukocytów ludzkich stosuje sie fragment DNA zdolny do powodowania drobno¬ ustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu J leukocytów ludzkich /LelF J/, o sekwen¬ cji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig. 9.Peptyd trypsynowy (T -1) Peptyd trypsynowy (T-13) Bialko Ala-Glu- Ile -Met-Arg — His-Glu-Met-Ile-Gln— mRNA 5' GCN GAA AUC AUG A(3N 5' CA GA AUG AUC CA„ GUC UG UG fc O Komplemen- 3* CTT TAG TAC GC (T-1A) 3' GTA CTT TAC TA (T-13A) tarne primery T DNA ___c (T.1B) __G (T.13B) T_(T.1C) c (T-13C) Rg.1 —-C T-(T-ID) — G--C---(T-13D)148 260 Próbka 32P- T- IC 1 ^ 4 5 C 7 89.101112131415l6l7j8l92p2l22232425 26 272829303132333435363738 Próbka *P - T - 13C 12 3 4C 6 TA 91011121314156171819 252627282930313233343536373839 4"*P^ Rg.2f % X0TJTrr9TT0XaLD90X0OXT0OX0Y00^^ H £I«f X0VXTrramU*HOY0X00XYX0X0Y!^^ O #!•! X0VXTTVf)TVfXI0X0O0XX0XT0aX0TOeU0XTr!XVMO0C^ Z *H xotx¥ y *fflTPXoxoooxooxTooxoYoai^vrf^ a *r<^ X0TXTrf!*TYaLaKO0XXCXY00X0Y^ a *XTT XOTXrfrO0*t)XtI3DPX0OXTO3X0TO0TfttTV^ O *I«T XOTXTTTOOTOXOd^OOXOaXTDOXOTD^ fl *I«T X0YJTYYWmXIM0«X0XXYD0X0TOOT^ T *I^ 0%% 0*% 00* 08C 09€ MXXJ3YfwaYaYX3XXTrrr?fnrxoo^ h ^i^t 0TXXJ3TTPX3T0TX0XXT¥TOTtTXCXX0T0T0TC^TO0OXX0VX0OX0XT0X0VO0rTV0V0OV0XXaXOXVT0XXD0TOVO0T0aXTaiTgnrfXT00 O £11 OYYXXOYTfXlOTOMXIXYYYYY3TXOOXOOOT0YOW 4 *I^ {^jjjoTroiwyTXOoxfyvovovxxxxoooTOTmTooaLiOTXTPxoxT * sm 3YXCXOYYTOOTOOIOXXTTrOY0TXOOXOOTf^ a *T*1 0YXXXDYTOXOT0OXXXXTYYTTOTXOOXODeTO 3 #J*q 0YDXX0tYDiXT«*X0XXTT0XTDYXaXX000Y^ O «**T 0TX0X0TTOX0T0TXOXLyffOWfX00X300TOT0XYOOOLX0fXiK)X0XT0X0VO0VVT0 T *X^ oirC orC ooc 09? 09Z XOOXOXOXOXTODOTTOXOt)¥ VfP10aXXt»VP0TT09OXTt)XXXTVDDVO0Y0 000XXXYYMXX0TOXVDYOVDYOCrrmi30OX00X^^ H JT^T X00X0X0X0XT0C)0YTaX0f)0TTOTO0XXOT00TT00OXTfJJLXOV XOOXXXVDOXXXOTOXTD O JI*'! xooxoxox3XToooYYoxoooYwrooxxD^^ DoooxxTooixxoTOXTOTOvovoavYDXoofro * *i«nr xujx)oxxoxTXPorrpxxopTTgrrooxxoT^ a *!•* X00XOIOX0XY0Dfm0X00DYTOYDaXX!yr00YT0^^ OOOXXXTOOXXIOTOXTOrOTOTDf)XTO*DXOXOCXOaXXOOXOK) a *I^ XOOXfXIOXOXTPC)trrT3XOfOTTTrrOC^^ 0000XTTfXD0XXXTDXT0TOT0VOfnrrOX0Df)XO0X0XXXODXaX0 O £1^ XOOXOXDXDXTODfrrrOXOOOTTCrrOOXI^rrDTTTXTDXTO^^ 000C^YYfXLIX0YOXTOTDYDTO0TYOTO fi Jl^I X0OXeX000XT00TTT0XOOtlff f TJDXXOTO0TT030 XXXOYOOTOOT0 00tAXXTO0XXX0Tf)XT0TDT0TOOTT0XX0f)XO0XrXXXXaiaiO T Of* Ot* Ott 081 09 i XTWTW10ETTTDTOf)0XTOXOM,TggXl^^ H fLI XTTOTT00MTrWTrOeXOCXOTXYaiJO J *I^ XYTOYDOY3XTYT0YDY9X03XOTXTOXX00t)P^^ 3 M^ XYTDTOO'TDXYTTOYOOOXOOXC0XYOXXOOY« Q JX^ XTTOTTO0atTTT0n»0X0ai0TXT0XX00O00Y00TXTrXOD01^ 0 *I^ X¥ JOffPaOXTTTOTOf)OX00X0TXTOXXO0f)POTTO H *I*Tf XTTYTODYf)XT3YDTDO0X00XMXTf)^^ T M^T ©«ri ort ooi os 09 DOXOtUOaiOOOOMYMTT^^ H *I*T »X0tVI^fUOOCKOXT?)XOYIXXOXIX^ d *X~1 tf *I*f ooi*)O£ODxaci0OXTaj3rxxiof^^ a ji^t 0OXO0XDaiOOOO0XTXT^UJOJJJ^^ O *L+T Of)XOOXOTXOODfOXOaLTriXXTXXXXXOYOXXOOO^ G JT*H[ DOXOaLOMOO0OIXraDXOYXXXOOXXM T M~t 0*1 Ot 1+ OZ- Oty- 09-kóO 480 500 520 540 L*IF ? TCCUAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTO^^ L#IF B TCCAAAGAATCACTOTATATCTGACAGAGAAGAAATACAGCTCrr^ L»XF C TCCAAAGAATCACTtrTTTATCTAATAGAGAGGAAATACAG^^ L«IF D TCCGAAGAATGACrCTCTATCTGACUGAGAAGAAATACATC L*IF £ TTOA A AGA ATCACTCTTTATCTGAOLAAGAAGAAOTATAOCCCr^ CTGTCAflAOCAOAAATCATGAGATCCrrTCTCTTTATGAACGAA L#IF F TCOAA AGA ATCACTCTTTATCTGACAGAGA AGA A ATACAQCC(?ITCrnXrrTQOGAQGTTGTCA^ L^IF G TTCAAAGAATCAC0(nt7rATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTQTGCATGOGAGGTT^ 560 580 600 620 640 1*IF A (OTGCAAGAAAGTITAAGAAQTAAGGAAX&4AAACTGGTrCAACAT^ hmir B CTTGCAAAAAAGATTGAAOA AAOGAATOAGACCTGGTACAACAOGGAAATGATTCTCATAGA^ L*IF C CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGATTGAAAACTGGTTCAACATOGCAAl^ L#IF D CTTGCAAOAJLA0ATTAAGGAGGAAGK}Aa7IItATCTCHTCCA^ LmlW B CTTGCAOGAAAGATTAAOGAOGAAGGAATCIaAACTCKHTCAACATOGAAATG^ L#XT F TTTTCAAGAAAGATTAAGGAGGAACXiAAl£lAACCaiTTCAAC^^ LmZW G CTTGOAAGAAAGATTAAGGAGGAACKlAAlflAAAACntHm^AACATOG L*IF H CTTGCAA A A AAGATTAACGAGGAAGGAl^^AAACTOGTTCATCAT^AAATGATTCTCATTGACTAATA^ 660 $80 700 720 }40 LmJT A TCAAAQACTCATUlTlVltXrTATQACC^ I I ¦ lililliBWlTTAATCAACATTgTATTCAgCTCTTAAOOCACTA LelF B TTTCAAAGACCCTTCTTTCTGCCAAAACCATGCTAra L*IF C TTn^AAGACTCACTTCTATAACCACGACXK)GTrc^ L#IF D TTTCAAAGACTCTCACCCCTOCTATAACTATOACCATGCTOATAAA L*IF B TGCCATTTCTCATTTTTOCTATATCCATGACATO £ L#IF F TTCAAAC^CTCATTTOtLCrrATAACCACCGC^ AflG A A ACATCAlUriTACCTGTOCAOGCA 00 LmTF G TrCAAATATTAATTTCTGCTATATCCATGAgrTGAOTroAATCAAAATTT^ Jg L*XF H TOAAAflAOTCACTTCTATAACCACCACAAflTTOAATCAAA O 760 780 800 eao $4o 1*XF B CttACTACrrCCCTrACAaATGA£CATGCTaATOOATCTATTC^ L#IF 0 TCCITTACAflATGACHSATTCTGATGTCTCrrOT^ L«XF D TOTTCATATAAC&TCATOrGCACCTTTACAC^^ LmlW B CTAGTTCCriTACOOATGATCATOCTaAJtKlATOgOT^ L*IF F CTAGTOCrrrACAGATgACCATOCTOATAGATCTAATr^^ 1 ITUrUCATBTAATATT L«IF O AAATCTTrACAGATGATCATGCCAATCTATCTATTCTAT^ 1*XF H CTTTACAGATaACCATTCTOATCrrCTCCTTTCATCTATTTATTTAAAT^ 860 880 900 920 ?40 L#IF A ATTACGTCATGTGCACCTTTGCACAGTGGTTAAT^ LmJF B CATATrATATTATGTGAACTTTTACATTGTGUUTT^^ l*IF C TOTWnTAATGTAAOAATATATGTTCTTCA^ L+IT B ATOTATTTTTACnTTGTCKiTTAATATA^ L*IF F ATOTGrTACrrTTTACATTGTGTTATATCAAAATATGTTAATCTAAtATTTAGTCAAT^ I*IF G TTAAATTATTTTAAACTTATGTTItnTCAGGTAATA^ L#IF H OGAGTAOCTTTACATTOTGGTTAATGTAACAAATATGTTCrrTGATATI^ 960 980 1000 LmlF B AATTCTTTATTTATTCTTTAAAATTGAACTCC L»IF F ATTATrmaiTATTCTTTAATA A AGA A ATTCCAAGCCC-poly/i/ Fta.3 /c.djSI SIO $20 S23 10 $0 30 kO LtlF A MALTFALLYALLYLSCKSSCSYGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKXSLFSCL]CDRHDFGFPQ Leip d maltftlmvalvvlsyk;sfsslgcdlpqthslgmrralillaqmrrispfsclkdrhdfefpq 1*XP C MAL»rSLi.MAVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLGWRRALILLGQMORrSPFSCLKDRHDFRIPQ L*IF D MASFFALLMYLYYLSCKSSCSLGCDLPETHSLDHRRTL)ILLAQMSRXSPSSCLMDRBDFGFPQ L«IF E LPLGCDLPQAHSVGNRRAFILLTQMRRISPFSYLKDRHDFDFPH L«IF F HALSFSLLMAVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLGWRRALILLAQMflaX*PFSCLKDRHDFQFPQ LsIFG UDFGFPQ L#XP H MALPFSLMMALVVLSCKSSCSLGCNLSQTHSLNWRRTLMLMAQMRRISPFSCLKDRHDFttFPQ w»zy«tki« MA * L YLSKS S G C L THSL R R L ^ QM XS S£L_£HDL L <* 50 60 ?0 80 90 iOO 1*IF ? SB. F-GtfQFQKABTXPYLHEMXQQXFNLFSTKDSSAAYDETLLDKPYTBL,YQQLNDLBACYXQO LalF B BBFDDKQFQKAQA1SVLHEM1QQTPNLPSTKDSSAALDETL1.DEFYIELDQQ;lVDL£VLCDQB L*IP C BBFDQtfQFQKAQAISVLHEMlQqTFNLFSTEDSSAAYEQSLLEKFSTBLYQQLNDLEACVIQB L«IF D BBFDGNQFQXAPAXSVLH£LIQQIFNLPTTKDSSAAVD£DLLDKFCTELYQQLNDLBACVNQB L«XF B QYFHOWHFQKVQAIFLFHBMMQQTFNLFSTKDSSDTYDBTLLDKSYT£LYQQLNDLBACVM K -i L#XF F £BFDG»QFQKAQAISVLHBMlQQTFNLFSTKDSSATYEQSLLEKFSTELNQQLirDMEACVIQB £ L#IF G ££FDGWQFQKAQAXSYLHBMXUQTFNLFSTKDSSAT¥DBTLLDKFYT£LYQQLtfDLEACMMQB ro L*XF H B£FDGNQFqKAQAXSYLH£MMQQTFNLFSTKNSSAA¥D£TLL£KFYXELFQQNKDLBACYXQB g wpvymt*lm E X T D &£&&£ I V L H E |10 120 130 \k0 150 |60 166 LeXF A VOTTBTPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKBKKYSPCAYEVVRAEIMRSFSLSTNLQBSLRSKE LeXF B YOYX£SPLMY£OSXLAYRKYPQRXTLYLTBKKYSSCAY£YYRA£INRSFSLSXNLQKRLKSK£ L«IF C YGYBBTPLMNBDSXLAYRKYFQRITLYLISRKYSPCAYBYYRA£XMRSLSFSTir LQ K R L R R K D L*IF D BRYOBTPLMlfVDSILAVKKYFRRITLYLTBKKYSPCA¥BYVRABIMRSLSLSTNLQBRLRRKB L*IF B VGYBBTPLRWVDSILAYRKYFQRITLYLTKKKYSPCS¥BAVRABIMRSFSL TVLQBRLRRKB L*IF F VGVBBTPLMNVDSILAVKXYFQRITLYLTEKKYSPCAYBVVRABIMRSFSLSKIPQBRLRRKB L*IF G YGY-BDTPLN]fYDSXLTYRKYFQRXTLYI,T£KKYSPGAYBYYRABXMRSFSLSANLQBRLRRKB LmlF H VQVBBTPLMWBDSXLAVRKYPQRITLYLMEKKYSPCAYBYYRABIMRSF8FSTMLQKRLRRKI w«sy«tfeL« Y PJLM D£XL V K I F £ I T L I L
5.S K Y S £A¥BYYRABXMR8 S 8 Q L K %*poryzasad o 200 400 600 800 1000 i i i i i i i i i i i pvui Bg/n Pvun Bg/n A —I Kill»-..:Lli.:-;M.s-i,M-.-.'/VKI-l-.f..-i'iAiJ.-.'».fc,-a l~» EcoRI EcoRI PvuII PyuD g —I kVNSa-.:*l,v-r.--.-W'i'...-.»'.^l-lll.. c E F G H pvun Bg/n Pvun eco ri Q ^U LV.»^-l-.-J.V-Al.!--.«-..'».-l.vAv.^:J-.-.-:-.v:^.1;lv.lJ U ~ PwiH Eco RlPvuB ¦-ga???'.^.'.};."::-'.;-:;-.:,-.^1.^^-.-.'--,.-.^^! n a pwff Bg/n Bg/n ^-ir^vssjb:-y-:-i!u..V:V.t Pvun *~^hYi i • i • • i •'¦ r • m.v- • ••'••',/l »¦••• .-¦'.••• * ••! Pvul rsKL^;.v'-U!^:!^vv.-.--:V^^^:V'.'W^v-^r Rg.5148 260 Rstl l Sau 3a Sau 3a |AvaD jBg/fl * -!-• -W- Sau3a Sau3a Bgfll | Avafl —* 1 * P^tl /:&bp\ 150 bp S23 1 '2 3 12 13 tt 1S gly cys asp leu arg arg thr leu - GGCTGTiGATCTG-AGGAG^Aa TTG- -CCGACACftGAC- TCC TCCTGfe AAC- I Sau3a, Avall Syntetyczny DNA »wyodrebniony fragment 5'AATTCAT6TGT <*TCTG-AGGAG o34bP 3* GTACACACTAG AC-TCC TCC TG ligoza ONA T4 6"Kbp Avall, Bg/11 wyodrebniony fragment o 150 bp Bg/n wyodrebniony fragment o 670bp, czesciowo trawiony AATTCAreT?TSTaG-AGGAG Ava11. B9/n *" Bg/U _ MI G1ACACACTA&AC-TCCTCCTG -™—- ¦umilli i iiiiiiii llll EcoRI tftP AvaII ISObp ligoza DNA T4 i 2 1 Eco RI/ fttl Eco RI met cysasp Pst I AATTCATG TGTGAT ¦¦¦¦¦¦¦ m ¦¦¦ niiiiiniiiiiii min mi GTACACACTA 865bp 67Dbp Fig.
6.Xba Rstl Sau3a EcoRI Sau3a| 1 LlK)bpJ-132bp GGCTGT^GATCTG EcoRI STOP Pst I TOObp -o- Fig. 7a HindDI EcoRI Xba EcoRI Sau 3a Le-IFA Pst I H E Trp—- ATGTGT GATCTG 3—I Fig. 7b8 % XMA«m)f0XD0fVLfUJO000T0TXY^ D xoojlooyoomóo910xi#ocoyoyxyyydyyoyooxyyi^ r XOJXDDYOD0daDOY0XX00C)OY0YXYYVOYVOYOV0VYX0XYXI^ I XWXOim00JO00X0XXD0COY0YXYYYDYY9YO0^^ H XOIXO0YOf0XO0f»XXOOOfJY0YXYYYDYVOYOYYYOXOXYX0XOXO YCUYYOYVY00XX3YXYYY00YtXL0X0ODIOXXYD0X0Yty ¥WJTWYM, Y OOC ooooxoYO¥ot?ooxopopixpo*«rerrxYfM*xLo^^ ? ? T»fxooxocxmjj lv ft o DOOOXOY9TOYY0aLO0rOJiOOYOOYOYXYf)X^ T ODOOXOYTYDYYf^YOOttUO0YOOYT)YXYfXLO^^ I OOOOXOYWOTT»OXg)ODOXXDPYOOYDYXYOXaLO^ H 000M0YfJYDYDY0XOD900XOOO0fmYXYt)XOXOX00OYYf^^ Y 00* ooxj^ojsoxaxYoxoY»frroYaYDOYOxxoxaxYvoxxooYf^ o 90XXOOXDf)XaXY0X0YD0YtnrOYOaY0XX0XaXYV0XX00YOT r OOXXOMOOXOXYDX0YOOYOYOYOOVOXXCaOXVVOXXM I O0XXD0X0fXL0XY0X0YYf)YYY0Y0OY0XX0X^ H OOXXOOX0OXaXYDX0Y*OYYY0Y0fY0XXaxaLVV0^^ Y OOC VaiXJ»YO0YOfrY00000XYYD00IXXY0XY0TOY0VOOYVa^ O YfXXI*mOY9OY0YOOOXLYDYOXXYYOXYOVOVOVOOYYf^^ T YOXXI3YO0YODY0000XX0YOMJX0YOX00Y9Y0 I YaXXXYYOOYtmOOOOXlXYYPlXLOYOXY3YPYOYPPYYgra H -•JJllXYOOYO0T0000XlXYf»XXX0Yf)XY0YT)Y0YO0Y Vfl*LDOXD0X0XXXX0X0X0XVYDVOOYMTOYOYDOOX00X0OXYaiX00 YOOYWYDO Y 00 Z VXOOOJ300YOYOOOYOYOXOOtUaLYaL9XOOPOXOXOXY O YXOOf)XOCOYOYOOOYOVOXOOfXIOXYOXOXOOOOXOXOXOfXK)XYODXYYYOYXOOY01^ T YXPOgXIOOOYOYOOOYOYOXOOOI^YPXOXOODYXOXDXXPIOXY I VXYY0X00OY0Y000YYYOX0X0X0XYYXDX0fK0X0X^^ H YXODOI^CXrYOYOOOYTYDXOOaXOXYfXLOXOOOfXLOX^ Y 001 !? -YO0OXYYYYOPXXXYXYQLOYX0OfrYXSPYOX"00YO00YJJO"YY0XXOO0 YOOOOYDYXOO¥ T TfPYtJOXOXOYYY0OYOY0Y0OXYX00Yf)YYXXX O -YOOOXYOYYOOXXXYOYYaOYXODOYXOYYOX-OXYOOOVXJ^)OYVOJXOYYYOOOOYOVXOOYYYYOYOJ^ f YOOOXXO9rnrOXXC)XYO0YOOYOOCOVOOVVaXYOXOOOOYXX I YOYXOXY0 YYOMOXYOOYOOYXOXSVOOYYOX-XXYOOOVOXOOOVX1J^)OYYXOOOYOOXO 0YVOYOY0XXDXO9YYDOYYYDVDOOYX-DODYYXXX H Y0YX0XY0YYOOX0XYDfrrrOYX0X0Y00YY0X-XXY0001l[0X0OOYXXIiOf)YYX00OYO0X00Y^ Y YXOYOXiMtTXO O YXOYOXXOXYXO p YXXD0XX0XYXO X YXOO3XXDXY&0 H VX0D0XXOXY» Y600 A CAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTC AACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAOGAGTAAGGAATGAAAACrrGGTTCAAGATGGAAATGATTTTG AT H CAG^GCAGAAATCATGAGATCCCTCTCnTTTTCAACAAACrrTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGG I CAGAGCAGAAATCATGAGATCTCTCrrCTTITTCAACAAACrrTGCAAAAAATATTAAGK^ J CAGAGCAGAAATCATGAGATCCrrTCrrCTTTTrCAACAAACTTGA A A A A AOGATTAAGGAGGAAGOigItfkAAACTGCTTCATCATOGAAATGATTCTCAT C CAOlGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCOTTTTCiLA^ 700 A TC*TTC«^TGCCAGCTCAC(rrTTTTATGATCTtK;CATCT H TGACTAATACATGITCTCACACTTTCATGAGTTCTTCCATTT^ I TC^CTAATACATTATCTCACACTTTCATGAGTTCCTCCAT^ J TGACTAATGCATCATCTOACACTTTCATGAGTTCTTCCATTTCAAA C TGACTAATACATTATCrTCACACriTTCATGAGTTCrrc^ 800 A GAGTATTAATCAAC^TTGTATTCAGCTCTTAAGGCAlirrAGTCCCriTACAGAGGA H AGGAGTCPTAAAGAAOCATCATGTATACCritJTGCAGGCACTAGTCCriTTACAGATGACCATG^ I AGTGTAAAGAAGCGTCGTGTATACCntlTGCAGGCACTAGTACTTTAC^^ J AGTCTTAAG/a(XJATCGTGTOTA.
7.CCTGTGCAGGC^ C AGTOTA AAGA AGTOTCOTGTATACCTGTGCAOGCACTAGTCCTfrACUGATGACCAT^ 900 A TTTATTTAACrrATTTATAAAAC^LlCTTATTTTTGTTCATATTATGTCATGT^ U ATTTAACTATTTTTATTATTTAAATTATTTCT I TATTTTTAAGATTTAAATTATTTTTTTATGTAATATCA J TAACTATTTTTATTATTTAAATTATTTTTTATGTAATATC ATATGTACCTTTACATi GTGKSTTAATGTAACAAATATOITCTTCATATTTAOCCAATATA C ATTTITiLAJLlTTTATG«AATATCATOAGTCG 1,000 A TAAATTTATTTTOTGTTCTTCATTOA^ U TATATrAATTTCCTTriTCATTAAATTTTTACTATACAAAATTTCTGTGTTT^ I AATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATACAAA* I TTAATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATACAAAATTTCrrTGTGTTTGTTTArr 'TTTTAAGATTAAATGCCAAGCCntlACrrGT^TAACCTGACTTAA C TTAlATTTTTACTATACAAAATTTCrraaTGTTTG^ Fm 8 c-d-148 260 S1 SIO A MALTFALLYALLYLSCBBS H MALPPSLMMALYYLSCKSS I MALSFSLLMAYLTLSIKSI J MARSFSLLMYYLYLSYKSX C NALSPSLLNAYLYLSYKSI 820 1 10 CSYGCDLFQTHSLGS RRTL CSLOCRL8QTHSLirVRRTL CSLOCDLPaTHSLGMRRAL CSLGCDLPQTHSLR¥RRAL SLGCDLPQTHSLGVRRAL 20 30 A MLLACMRRISLPSCLl M MLNAQNRRISPFSC I ILLAQMORXSPFSC J XLLAQMGRXSFP8C C ILLGQMQRISPPSC 40 5 O LKDRHDFOFPQ£RF-OVfFQKAST LKORHDFRFPQSRFDairQFQKAQA LKDRFDFGLFQRSPDGVQFQKTQA LKDRHSFRFFRRSFDGHQFqKTQA LKDRHOFRXPqRRFOGVqFQKAQA 60 70 80 90 A XFYLHBMXQQXFRLF8TK08SAAVDRTLLDKFYT1LTQ H XSYLHBMMQQTFJrLPSTKtfSSAAVD£TLLBKPYXBLFQ X I S T L H £ O M T FN L F i X B D $ S 1 A H Q U L U ? S X I L I Q J XSYLHBMXQQTFVLF8TBBS8AAVBQSLLBKFSTBLYQ C XSYLHBMXQQTFVLFSTBD88AAVBQSLLBKPSTBXYQ A I X J c LMDL1A NIDL11 L JT N L B A L M D L B A L M D L B A 100 110 120 YXQGyOYTBTPLlfKBDSXLAYRKYFQ T I Q I T O T I I X F L X I I B
8.S I l H I I ! IQ YXQBYGNBBTPLIftfBD YXQBYGYKBTP R I T L R I T L 8XLAYRRYPQRXTL LMBBD? XLAYRKYPQRXTL YXQBYGYBBTPLMHBD8XLAYRRYPQRXTL Fcg
9.PL PL PL
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16498680A | 1980-07-01 | 1980-07-01 | |
| US18490980A | 1980-09-08 | 1980-09-08 | |
| US20557880A | 1980-11-10 | 1980-11-10 | |
| US06/256,204 US6610830B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-04-21 | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL231940A1 PL231940A1 (en) | 1983-07-18 |
| PL148260B1 true PL148260B1 (en) | 1989-09-30 |
Family
ID=27496622
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1981255773A PL148261B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-06-30 | Method of obtaining microorganisms capable to produce mature interferon of human leucocytes |
| PL1981231940A PL148260B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-06-30 | Method of obtaining mature interferon of human leucocytes |
| PL1981255774A PL148276B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-06-30 | Method of obtaining an expression carrier capable to express a mature interferone of human leucocytes in a transformed strain of e. coli |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1981255773A PL148261B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-06-30 | Method of obtaining microorganisms capable to produce mature interferon of human leucocytes |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1981255774A PL148276B1 (en) | 1980-07-01 | 1981-06-30 | Method of obtaining an expression carrier capable to express a mature interferone of human leucocytes in a transformed strain of e. coli |
Country Status (36)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0043980B1 (pl) |
| AR (1) | AR242833A1 (pl) |
| AT (3) | ATE79901T1 (pl) |
| AU (1) | AU552004B2 (pl) |
| BG (1) | BG42189A3 (pl) |
| BR (1) | BR8104189A (pl) |
| CH (2) | CH657141A5 (pl) |
| CS (1) | CS273152B2 (pl) |
| DD (3) | DD202307A5 (pl) |
| DE (3) | DE3177288T3 (pl) |
| DK (1) | DK173543B1 (pl) |
| DZ (1) | DZ312A1 (pl) |
| ES (1) | ES8207514A1 (pl) |
| FI (1) | FI82712C (pl) |
| FR (1) | FR2486098B1 (pl) |
| GB (1) | GB2079291B (pl) |
| GE (1) | GEP19960519B (pl) |
| GR (1) | GR75714B (pl) |
| HK (1) | HK49285A (pl) |
| HU (1) | HU196457B (pl) |
| IE (1) | IE49255B1 (pl) |
| IT (1) | IT1137272B (pl) |
| KE (1) | KE3534A (pl) |
| LU (1) | LU83461A1 (pl) |
| MC (1) | MC1396A1 (pl) |
| MY (1) | MY8700711A (pl) |
| NL (1) | NL8103151A (pl) |
| NO (1) | NO159392C (pl) |
| NZ (1) | NZ197572A (pl) |
| PH (1) | PH18036A (pl) |
| PL (3) | PL148261B1 (pl) |
| PT (1) | PT73289B (pl) |
| RO (1) | RO87590A (pl) |
| SE (2) | SE8104093L (pl) |
| SU (1) | SU1414319A3 (pl) |
| YU (1) | YU47700B (pl) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| DE3177213D1 (de) | 1980-04-03 | 1990-10-18 | Biogen Inc | Dns-sequenzen, rekombinante dns-molekuele und verfahren zur herstellung von dem menschlichen fibroblast-interferon. |
| ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| WO1983000693A1 (en) * | 1981-08-14 | 1983-03-03 | Berg, Kurt, Frimann | SUBJECTS RELATING TO HUMAN INTEFERON-'alpha' SUBTYPE PROTEINS AND CORRESPONDING ANTIBODIES |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| US4973479A (en) * | 1982-01-15 | 1990-11-27 | Cetus Corporation | Interferon-α61 |
| US4975276A (en) * | 1982-01-15 | 1990-12-04 | Cetus Corporation | Interferon-alpha 54 |
| US5098703A (en) * | 1982-01-15 | 1992-03-24 | Cetus Corporation | Interferon-alpha 76 |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US6432677B1 (en) | 1982-03-08 | 2002-08-13 | Genentech, Inc. | Non-human animal interferons |
| US5827694A (en) * | 1982-03-08 | 1998-10-27 | Genentech, Inc. | DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| DE3382317D1 (de) * | 1982-03-15 | 1991-07-25 | Schering Corp | Hybride dns, damit hergestellte bindungszusammensetzung und verfahren dafuer. |
| CA1210714A (en) * | 1982-03-23 | 1986-09-02 | Alan Sloma | .alpha.-INTERFERON GX-1 |
| US4695543A (en) * | 1982-03-23 | 1987-09-22 | Bristol-Myers Company | Alpha Interferon GX-1 |
| US4748233A (en) * | 1982-03-23 | 1988-05-31 | Bristol-Myers Company | Alpha-interferon Gx-1 |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| US5831023A (en) * | 1982-11-01 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant animal interferon polypeptides |
| JPS60500574A (ja) * | 1983-02-24 | 1985-04-25 | インステイチユト オルガニチエスコゴ シンテザ アカデミイ ナウク ラトビイスコイ エスエスア−ル | ヒト白血球インタ−フェロンｎ及び細菌細胞におけるその製造方法 |
| WO1985002862A1 (en) * | 1983-12-23 | 1985-07-04 | Monash University | PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-alpha |
| SU1364343A1 (ru) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 |
| IL76360A0 (en) | 1984-09-26 | 1986-01-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mutual separation of proteins |
| WO1986002068A1 (en) * | 1984-09-26 | 1986-04-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Mutual separation of proteins |
| US5196323A (en) * | 1985-04-27 | 1993-03-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Process for preparing and purifying alpha-interferon |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| JP2514950B2 (ja) * | 1986-03-10 | 1996-07-10 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体 |
| JPS6463395A (en) * | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| CA1309044C (en) * | 1987-11-09 | 1992-10-20 | Toshiya Takano | Method of producing foreign gene products |
| GB8813032D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Boehringer Ingelheim Int | Antiviral pharmaceutical composition |
| WO1991003251A1 (en) * | 1989-09-08 | 1991-03-21 | California Institute Of Biological Research | Cr2 ligand compositions and methods for modulating immune cell functions |
| DE3932311A1 (de) * | 1989-09-28 | 1991-04-11 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur reinigung von beta-interferon |
| AU1854695A (en) * | 1994-03-07 | 1995-09-25 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | The use of interferon subtypes in the preparation of medicaments to treat viral infections |
| EP1104809A1 (en) * | 1994-04-09 | 2001-06-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for producing alpha-interferon |
| GB9609932D0 (en) * | 1996-05-13 | 1996-07-17 | Hoffmann La Roche | Use of IL-12 and IFN alpha for the treatment of infectious diseases |
| US20030190307A1 (en) | 1996-12-24 | 2003-10-09 | Biogen, Inc. | Stable liquid interferon formulations |
| ZA9811070B (en) | 1997-12-08 | 2000-07-03 | Genentech Inc | Type I interferons. |
| EP1037995A1 (en) | 1997-12-08 | 2000-09-27 | Genentech, Inc. | Human interferon-epsilon: a type 1 interferon |
| ATE498409T1 (de) | 1998-08-06 | 2011-03-15 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-uricase konjugate und verwendung davon |
| US6783965B1 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| US6268178B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-07-31 | Phage Biotechnology Corp. | Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides |
| WO2002036627A2 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-10 | Pbl Biomedical Laboratories | Interferons, uses and compositions related thereto |
| FR2822845B1 (fr) | 2001-03-30 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques |
| FR2823220B1 (fr) | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
| FR2825716B1 (fr) | 2001-06-11 | 2004-09-24 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 7 |
| WO2006110819A2 (en) | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
| US20110034672A1 (en) * | 2008-01-18 | 2011-02-10 | Roberto Falkenstein | Purification of not-glycosylated polypeptides |
| BRPI1010069A2 (pt) | 2009-06-25 | 2016-03-15 | Savient Pharmaceuticals Inc | "método para prevenir reações à infusão durante terapia por uricase peguilada em pacientes; e método para diagnosticar se um paciente tratado com uricase peguilada desenvolverá reações à infusão ou desenvolverá liberação de uricase peguilada mediada por anticorpo sem a medição de títulos de anticorpos anti-peg e anti-uricase peguilada" |
| WO2018087345A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN150740B (pl) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| FI77877C (fi) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. |
| EP0032134B2 (en) * | 1980-01-08 | 1993-10-13 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-alpha like polypeptides |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
| ES8302778A1 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| EP0062971B1 (en) * | 1981-03-27 | 1990-03-07 | Imperial Chemical Industries Plc | Genetically modified microorganisms |
-
1981
- 1981-06-26 CH CH1475/85A patent/CH657141A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 CH CH4244/81A patent/CH651308A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-29 BG BG052673A patent/BG42189A3/xx unknown
- 1981-06-29 DZ DZ816241A patent/DZ312A1/fr active
- 1981-06-29 HU HU811882A patent/HU196457B/hu unknown
- 1981-06-29 FR FR8112724A patent/FR2486098B1/fr not_active Expired
- 1981-06-29 MC MC811525A patent/MC1396A1/xx unknown
- 1981-06-30 ES ES503528A patent/ES8207514A1/es not_active Expired
- 1981-06-30 YU YU162281A patent/YU47700B/sh unknown
- 1981-06-30 LU LU83461A patent/LU83461A1/de unknown
- 1981-06-30 AR AR81285934A patent/AR242833A1/es active
- 1981-06-30 EP EP81105067A patent/EP0043980B1/en not_active Expired
- 1981-06-30 PL PL1981255773A patent/PL148261B1/pl unknown
- 1981-06-30 PL PL1981231940A patent/PL148260B1/pl unknown
- 1981-06-30 PL PL1981255774A patent/PL148276B1/pl unknown
- 1981-06-30 DK DK198102910A patent/DK173543B1/da not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 SU SU813302642A patent/SU1414319A3/ru active
- 1981-06-30 CS CS503781A patent/CS273152B2/cs unknown
- 1981-06-30 NL NL8103151A patent/NL8103151A/nl not_active Application Discontinuation
- 1981-06-30 GR GR65379A patent/GR75714B/el unknown
- 1981-06-30 PT PT73289A patent/PT73289B/pt unknown
- 1981-06-30 RO RO81104732A patent/RO87590A/ro unknown
- 1981-06-30 DE DE3177288T patent/DE3177288T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1981-06-30 AT AT86105365T patent/ATE79901T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 AT AT81105067T patent/ATE29727T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 DE DE8181105067T patent/DE3176448D1/de not_active Expired
- 1981-06-30 EP EP86105365A patent/EP0211148B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-06-30 IE IE1463/81A patent/IE49255B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 NZ NZ197572A patent/NZ197572A/en unknown
- 1981-06-30 AT AT0290981A patent/AT380272B/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 DE DE3125706A patent/DE3125706C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1981-06-30 NO NO812247A patent/NO159392C/no not_active IP Right Cessation
- 1981-06-30 SE SE8104093D patent/SE8104093L/xx not_active Application Discontinuation
- 1981-06-30 SE SE8104093A patent/SE465223C5/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-07-01 IT IT22682/81A patent/IT1137272B/it active Protection Beyond IP Right Term
- 1981-07-01 GB GB8120279A patent/GB2079291B/en not_active Expired
- 1981-07-01 DD DD81231371A patent/DD202307A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-01 FI FI812067A patent/FI82712C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-07-01 DD DD81255299A patent/DD210304A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-01 PH PH25843A patent/PH18036A/en unknown
- 1981-07-01 AU AU72462/81A patent/AU552004B2/en not_active Expired
- 1981-07-01 BR BR8104189A patent/BR8104189A/pt unknown
- 1981-07-01 DD DD81255300A patent/DD210305A5/de not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-05-21 KE KE3534A patent/KE3534A/xx unknown
- 1985-06-27 HK HK492/85A patent/HK49285A/xx not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-12-30 MY MY711/87A patent/MY8700711A/xx unknown
-
1993
- 1993-07-12 GE GEAP1993999A patent/GEP19960519B/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL148260B1 (en) | Method of obtaining mature interferon of human leucocytes | |
| US6482613B1 (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferons | |
| US4456748A (en) | Hybrid human leukocyte interferons | |
| US4678751A (en) | Hybrid human leukocyte interferons | |
| JP2515308B2 (ja) | ヒト免疫インタ−フエロン | |
| AU601675B2 (en) | Purification, production and use of tumor necrosis factors | |
| CA1341569C (en) | Microbial production of human fibroblast interferon | |
| KR920007439B1 (ko) | 하이브리드 인간 백혈구 인터페론 | |
| US4801685A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
| JPS6363199B2 (pl) | ||
| US4810645A (en) | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L | |
| KR870000510B1 (ko) | 형질전환된 미생물의 제조방법 | |
| FI82713C (fi) | Plasmid, som foermaor expressera humant moget leukocytinterferon, foerfarande foer dess framstaellning samt dess anvaendning vid framstaellning av humant leukocytinterferon. | |
| SE453512B (sv) | Menniskoleukocytinterferon n och forfarande for framstellning derav i bakterieceller | |
| KR870000511B1 (ko) | 발현 비히클의 제조방법 | |
| IL63197A (en) | Intraferons for mature human oocytes, their preparation and preparations containing them | |
| LIU et al. | Expression of a Pseudogene for Interferon-αL | |
| Goeddel | Microbial production of mature human leukocyte interferons | |
| CS273181B2 (en) | Method of escherichia coli cells production that are capable to produce mature human leucocytic interferon | |
| NO164178B (no) | Plasmid som koder for et ferdigutviklet human leukocyttinterferon. | |
| NZ214261A (en) | Human immune interferon: production by recombinant dna technology |