SE465223B - Moget rekombinant-humanleukocytinterferon och foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents

Description

465 225 2 donatorer (tyska Offenlegungsschrift 2.947.134). Dessa inter- feroner utgör en familj av proteiner som är känd för att upp- visa förmåga att ge ett virusbeständigt tillstånd i dessas målceller. Dessutom kan interferon bidra till inhibering av cellproliferation och modulera immunrespons. Dessa egen- skaper har bidragit till klinisk användning av leukocyt- interferoner såsom ett terapeutiskt medel för behandling av virala infektioner och maligna sjukdomar.

Leukocytinterferoner har renats till väsentligen homogenitet (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 640-644 (1979); Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605 (l979))och rappor- terade molekylvikter sträcker sig från ca 17.500 till ca 21.000. Den specifika aktiviteten av dessa preparat är märkligt hög, 2 x 108 till 1 x 109 utbyten från cellkulturmetoder har varit avskräckande låga. enheter/mg protein, men Icke desto mindre har framsteg ifråga om proteinsekvens- tekniker tillåtit bestämning av partiella aminosyrasekvenser (Zoon et al., Science 207, 527 (1980): Levy et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 77, 5102-5104 (1980)). Klarläggande av glykosyleringen av olika leukocytinterferoner är hittills icke fullständig, men det är numera klarlagt att skillnader ifråga om glykosylering bland familjemedlemmar icke ensamt kan förklara de spektrum av molekylvikter som observeras.

I stället skiljer sig leukocytinterferoner tydligt åt ifråga om aminosyrasammansättning och sekvens, och aminosyrahomo- login är, i vissa klasser, mindre än 80 %.

Isolering från donatorleukocyter har gett tillräckligt mate- rial för partiell karakterisering och begränsade kliniska undersökningar med homogent leukocytinterferon men är en helt otillräcklig källa för de mängder av interferon som erfordras för kliniska försök i stor skala och för profylaktisk och/- ~e1ler terapeutisk användning i stor skala därefter. Hittills utförda kliniska undersökningar med interferoner härrörande från humanleukocyt vid antitumör- och antiviralprovning har huvudsakligen begränsats till råa (<1 % renhetsgrad) prepara- tioner av materialet, och långa erforderliga tidrymder för 465 223 3 tillverkning av tillräckliga mängder, även vid orealistiska prisnivåer, har på ett kritiskt sätt fördröjt undersökningar på bred front.

Med tillkomsten av rekombinant DNA-teknologi har det emeller- tid blivit möjligt att åstadkomma reglerad mikrobiell fram- ställning av en enorm mångfald av användbara polypeptider.

Det finns redan tillgängligt bakterier modifierade med denna teknologi, som tillåter framställning av sådana polypeptid- produkter som somatostatin, A- och B-kedjorna för human- insulin och humant tillväxthormon (Itakura et al., Science 198, 1056-1063 (1977): Goeddel et al., Nature 281, 544-548 (1979)). Senare har rekombinant DNA-metoder använts för âstadkommande av bakteriell framställning av proinsulin och thymosin alfa 1 och ett flertal författare har rapporterat beträffande erhållande av DNA-kodning för humanleukocyt- interferon och beträffande erhållna proteiner med leukocyt- interferonaktivitet (Nagata et al., Nature 284, 316-320 (l980); Mantei et al., Gene 10, 1-lO (l980); Taniguchi et al., Nature 285, 547-549 (1980)).

Arbetshästen inom rekombinant DNA-teknologi är plasmiden, en icke-kromosomisk slinga av dubbelsträng-DNA som finnes i bakterier och andra mikrober, ofta i multipla kopior per cell.

Inkluderad i den information som är kodad i plasmid-DNA är den information som kräves för reproducering av plasmiden i dotterceller (dvs. en "rep1ikon") och vanligen ett eller fler urvalskarakteristika, såsom, ifråga om bakterier, beständig- het mot antibiotika som tillåter kloner av värdcellen inne- hållande plasmiden ifråga att bli igenkända och växa pre- ferentiellt i selektiva media. Användbarheten av plasmider ligger i det förhållandet, att de kan klyvas specifikt av någon restriktionsendonukleas eller "restriktionsenzym“, vilka vart och ett igenkänner ett särskilt ställe på plasmid- -DNA. Därefter kan heterologa gener eller genfragment in- föras i plasmiden genom ändvis förening vid klyvningsstället eller vid rekonstruerade ändar invid klyvningsstället. DNA- -rekombination genomföres utanför cellen, men den erhållna 465 223 4 “rekombinant"-plasmiden kan införas i cellen med en process, som benämnes transformation, och stora mängder av den hetero- logt gen-haltiga rekombinantplasmiden erhålles genom odling av transformanten. Om genen införes på rätt sätt vad beträf- far delar av plasmiden som styr transkription och translation av det kodade DNA-meddelandet, kan den erhållna expressions- vehikeln användas för framställning av den polypeptidsekvens för vilken den införda genen kodar, vilket är en process som benämnes expression.

Expression initieras i ett område som benämnes promotorn, som igenkännes av och bindes av RNA-polymeras. I vissa fall, såsom i den tryptofan- eller “trp"-promotor, som föredrages vid genomförande av föreliggande uppfinning, överlappas promotorområden av "operator"-områden till bildning av en kombinerad promotor-operator. Operatorer är DNA-sekvenser som igenkännes av s.k. repressorproteiner, vilka har till uppgift att reglera frekvensen av transkriptionsinitiering vid en viss promotor. Polymeras vandrar längs DNA och transkriberar den information som förefinnes i de kodande strängarna från dess 5'- till 3'-ände till budbärar-RNA, som i sin tur translateras in i en polypeptid med den aminosyra- sekvens, för vilken DNA kodar. Varje aminosyra är kodad av en nukleotidtriplett eller "kodon" i vad som i föreliggande sammanhang kan betecknas såsom "strukturgenen“, dvs. den del som kodar aminosyrasekvensen av den uttryckta produkten.

Efter bindning till promotorn kommer RNA-polymeras först att transkribera nukleotider som kodar ett ribosombindningsställe, därefter en translationsinitiering eller "start"-signal (vanligen ATG, som i den erhållna budbärar-RNA blir AUG), därefter nukleotidkodonerna i strukturgenen själv. S.k. stoppkodoner transkriberas vid änden av strukturgenen, var- efter polymerasen kan bilda en ytterligare sekvens av bud- bärar-RNA, som, på grund av närvaron av stoppsignalen, för- blir otranslaterad av ribosomerna. Ribosomer bindes till bindningsstället som finnes på budbärar-RNA, i bakterier vanligen såsom den mRNA, som bildas, och producerar själva den kodade polypeptiden, med början vid translationsstart- 465 223 5 signalen och slut vid den förutnämnda stoppsignalen. Den önskade produkten bildas om de sekvenser som kodar ribosom- bindningsstället är belägna på lämpligt sätt i förhållande till AUG-initieringskodonen och om alla kvarvarande kodoner följer initieringskodonen i fas. Den erhållna produkten kan erhållas genom lysering av värdcellen och tillvaratagande av produkten genom lämplig rening från andra bakterieproteiner.

Enligt uppfinningen har det visat sig att tillämpning av DNA- -teknologi (dvs. införing av interferongener i mikrobiella expressionsvehiklar och expression (uttryckande) därav under j kontroll av mikrobiella genregulatorelement) utgör den effek- tivaste vägen för framställning av stora mängder leukocyt- interferon, vilket, trots frånvaron,i på detta sätt framställt material,av glykosyleringsegenskapen hos humanbaserat mate- rial, skulle kunna användas kliniskt vid behandling av en stor mångfald virala och neoplastiska sjukdomstillstånd.

Tillvägagångssättet för erhållande av en första leukocytgen enligt uppfinningen innefattar följande steg: (1) Partiella aminosyrasekvenser från humanleukocytinter- feron som renats till homogenitet användes för uppbyggnad av uppsättningar av syntetiska DNA-sonder, vars kodoner, i aggregatet, representerade alla möjliga nukleotidkombina- tioner som var i stånd att koda de partiella aminosyra- sekvenserna. (2) Bakteriekolonibanker framställdes innehållande komplementär DNA (CDNA) från inducerad budbärar-RNA. inducerad mRNA som radiomärkts hybridiserades till plasmid- Hybridiserande mRNA eluerades och Annan -cDNA från denna bank. provades beträffande translation till interferon i oocyt- försök. Plasmid-DNA från kolonier som visade sig inducera interferonaktivitet på detta sätt har vidare provats beträf- fande hybridisering till sonder framställda såsom beskrives i (1) ovan. '465 225 6 (3) Parallellt med tillvägagångssättet enligt del (2) ovan användes inducerad mRNA-deriverad cDNA i plasmider för bild- ning av en oberoende bank av transformantkolonier. Sonderna från del (l) användes för igångsättning av syntes av radio- märkta enkelsträngade CDNA för användning såsom hybridise- ringssonder. De syntetiska sonderna hybridiserade med inducerad mRNA såsom mall och utökades (extended) genom omvänd transkription till bildning av inducerad, radiomärkt CDNA. Kloner från den kolonibank som hybridiserade till radiomärkt cDNA, som erhållits på detta sätt, har undersökts ytterligare för att bekräfta närvaron av en fullängd-inter- feronkodande gen. Godtyckligt antaget genfragment av par- tiell längd som erhållits enligt del (l) eller (2) kan i sig användas såsom sond för fullängdgenen. (4) Den fullängdgen som erhållits ovan skräddarsyddes med användning av syntetisk DNA för eliminering av en eventuell ledårsekvens, som skulle kunna förhindra mikrobiell expres- sion av den utvecklade polypeptiden och tillåta lämplig positionering i en expressionsvehikel i förhållande till startsignalerna och ribosombindningsstället för en mikrobiell promotor. Uttryckt (expressed) interferon renades till ett stadium, som tillät bekräftande av dess karaktär och bestäm- ning av dess aktivitet. (5) Det interferongenfragment som framställdes på det ovan angivna sättet användes i sig såsom sond (probing), genom hybridisering, för andra partiellt homologa leukocytinter- feronspecies.

Vid tillämpning av metoderna för rekombinant DNA-teknologi såsom skisserats ovan erhölls mikrobiell produktion med högt utbyte och renhetsgrad av familjen av homologa leukocyt- interferoner (oglykosylerade) såsom färdiga polypeptider, väsentligen icke åtföljt av motsvarande presekvens eller någon del därav. Dessa interferoner kan bringas till direkt expression, tillvaratas och renas till nivåer, som gör dessa lämpade för användning vid behandling av virala och maligna 465 225 7 sjukdomar hos djur och människor. Familjemedlemmar som hittills uttryckts har visat sig verksamma vid in vitro-för- sök och, vid den första demonstrationen av denna typ, lika- ledes vid in vivo-försök, varvid de sistnämnda försöken innefattar det första färdiga leukocytinterferon som fram- ställts mikrobiellt.

Uttrycket “moget (fullt utvecklat) leukocytinterferon" som användes i samband med föreliggande uppfinning avser en mikrobiellt (exempelvis bakteriellt) framställd interferon- molekyl, som saknar glykosylgrupper. Moget leukocytinter- feron, enligt föreliggande uppfinning, är omedelbart uttryckt från en translationsstartsignal (ATG) omedelbart före den första aminosyrakodonen hos den naturliga produkten. Den "mogna" polypeptiden kan sålunda innehålla såsom första aminosyra i dess sekvens metionin (vilket ATG kodar) utan väsentlig förändring av dess karaktär. Å andra sidan kan_ den mikrobiella värden behandla translationsprodukten så att det initiala metioninet uteslutes. "Uttryck" (expression) av mfiget' leukocytinterferon betecknar bakteriell eller annan mikrobiell produktion av en interferonmolekyl, som icke inne- håller några glykosylgrupper eller en presekvens som omedel- bart âtföljer (attends) mRNA-translation av en human leukocyt- interferongenom.

Speciella leukocytinterferonproteiner enligt uppfinningen har definierats med hjälp av bestämd DNA-gen (fig. 3 och 8) och deduktiv aminosyrasekvensanalys (sequencing) (fig. 4 och 9).

Det bör förstås att för dessa speciella interferoner och i själva verket för hela den familj av leukocytinterferon- 465 225 8 proteiner som innefattas av uppfinningen förekommer naturliga alleliska (allelic) variationer, som uppträder från individ till individ. Dessa variationer kan demonstreras med amino- syraskillnad eller aminosyraskillnader i totalsekvensen eller genom deletioner, substitutioner, införingar (insertions), inversioner eller additioner av en aminosyra eller aminosyror i sekvensen. För varje leukocytinterferonprotein enligt upp- finningen betecknad LeIF A till LeIF J, inkluderas alleler inom ramen för den beteckning (label) eller term som definie- rar denna och sålunda, föreliggande uppfinning.

Beskrivning av ritningsfigurerna.

Fig. l visar två aminosyrasekvenser, som var gemensamma för alla interferonspecies som isolerades från humanleukocyt och renades till homogenitet betecknad T-l och T-13. Alla poten- tiella mRNA-sekvenser som kodar för dessa peptider är visade, liksom motsvarande DNA-sekvenser. Bokstäverna A, T, G, C och U betecknar de nukleotider som innehåller baserna adenin, thymin, guanin, cytosin resp. uracil. Bokstaven N betecknar godtyckliga av nukleotiderna A, G, C och U. Polynukleotider återges såsom vid avläsning från 5'-(vänster) i 3'-(höger) -riktningen och, när dubbelsträngig ("d.s.“) DNA återges, vice versa för bottensträngen eller den icke-kodande strängen.

Fig. 2 är ett autoradiogram, som visar hybridisering av potentiella LeIF-plasmider med 32P-märkta syntetiska deoxi- oligonukleotider.

Fig. 3 visar nukleotidsekvenserna (kodande strängar) av åtta genfragment isolerade såsom kandidater för användning vid expression av leukocytinterferoner, betecknade "A" till "H" resp. ATG-translationsinitieringskodon och terminerings- triplett för varje LeIF är understruken. Stoppkodonerna eller termineringstripletterna följes av 3'-otranslaterade områden. Den inkluderade fullängdgenen för LeIF A saknar en kodon som återfinnes i andra visade, såsom anges i den tredje A-linjen på fig. 3. 5'-otranslaterade områden föregår ledar- 465 223 9 sekvenserna. Såsom isolerat saknar fragment E den fulla presekvensen av ledare men inkluderar hela genen för den antagna matura LeIF E. Fragment G saknar i isolerat till- stånd den fullständiga kodningssekvensen.

Fig. 4 är en jämförelse av de åtta LeIF-proteinsekvenser som förutsagts från nukleotidsekvenserna. De bokstavsförkort- ningar som rekommenderas av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature användes: A, alanin; C, cystein; D, asparginsyra; E, glutaminsyra; F, fenylalanin; G, glycin; H, histidin; I, isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, metionin; N, asparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, treonin; V, valin; W, tryptofan; och Y, tyrosin. Talen hänför till aminosyrapositioner (S avser signalpeptid).

Strecket i 165-aminosyran LeIF A-sekvensen vid positionen 44 är infört för att linjera upp LeIF A-sekvensen med de 166 aminosyrasekvenserna för de andra LeIF. LeIF E-sekvensen bestämdes med bortseende från den extra nukleotiden (position 187 på fig. 3) i dess kodningsregion. Asteriskerna indikerar i-fas-termineringskodoner. Aminosyror som är gemensamma för alla LeIF (med undantag av den pseudogena LeIF E) visas även.

De understrukna resterna är aminosyror som även närvarar i humant fibroblastinterferon.

Fig. 5 visar restriktionsendonukleaskartan för de åtta typerna av LeIF klonad cDNA (A till H). Hybridplasmiderna framställ- des med dC:dG-anpassningsmetoden (Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 4ll-416 (1980)). cDNA-insättningar kan därför åstad- kommas med användning av PstI. Linjerna vid änden av varje cDNA-insats representerar de flankerande homopolymera dC:dG- -ändarna. Positionerna för PvuIIq EcoRI-och BglII-restrik- tionsställena anges. Skuggade områden på figuren represente- rar kodningssekvenserna för matura LeIF, de tvärstreckade områdena indikerar signalpeptidkodande sekvenser och de öppna områdena visar 3'- och 5'-icke-kodande sekvenser.

Fig. 6 visar schematiskt konstruktionen av en gen, som kodar för direkt mikrobiell syntes av m09et LeIF A. Restriktions- 465 223 10 ställen och rester är såsom visas ("PstI", etc.). Uttrycket “b.p.“ betecknar "baspar".

Fig. 7 (icke i skala) visar schematiskt en restriktionskarta för två genfragment, som användes för uttryckande av moget leukocytinterferon LeIF B. Kodonsekvenserna som anges är de avslutningar av kodande strängar, som härrör från bearbetning (digestion) med restriktionsenzym Sau3a i de båda visade fallen.

Fig. 8 och 9 anger DNA- och aminosyrasekvenserna (se fig. 4 ovan för motsvarande enbokstavsförkortningar) för fem LeIF- -proteiner enligt uppfinningen, inkluderande typerna I och J.

På fig. 9 anger asterisken en terminationskodon i motsvarande DNA-sekvens och bindestrecket en deletion eller ett gap i sekvensen.

BESKRIVNING AV FÖREDRAGNA UTFÖRINGSFORMER.

A. Använda mikroorganismer.

Det beskrivna arbetet innefattar användning av två mikro- organismer: E. coli x 1776, såsom beskrives i den amerikanska patentskriften 4.190.495, och E. coli K-12 stam 294 (slut A, thi_, hsr', hsmš), såsom beskrives i den brittiska patent- publikationen 2055382 A. Båda har deponerats hos American 9 Type Culture Collection (ATCC accession nr 31537 resp. 31446).

Allt rekombinant DNA-arbete genomfördes i överensstämmelse med tillämpliga riktlinjer enligt National Institutes of Health.

De mest föredragna utföringsformerna av uppfinningen beskri- ves med hänvisning till användning av E. coli, inkluderande icke endast stammarna E. coli x 1776 och E. coli K-12 stam 294, enligt definition ovan, utan även andra kända E. coli- -stammar, såsom E. coli B, eller andra mikrobstammar, av .vilka många är deponerade och tillgängliga från godkända institutioner för deponering av mikroorganismer, exempelvis 465 223 ll American Type Culture Collection. Se även den tyska Offen- legungsschrift 2644432. Dessa andra mikroorganismer inne- fattar, exempelvis, Bacilli såsom Bacillus subtilis och andra enterobacteriaceae bland vilka kan nämnas t.ex. Salmonella typhimurium och Serratia marcescens, med användning av plas- mider som kan replikera och uttrycka heterologa gensekvenser däri. Jäst, exempelvis Saccharomyces cerevisiae, kan även användas med fördel såsom gästorganism vid framställning av interferonproteinerna enligt uppfinningen genom expression av gener som kodar för dessa under kontroll av en jästpromotor.

B. Källa för och rening av LeIF mRNA.

LeIF mRNA kan erhållas från humanleukocyter, vanligen sådana från patienter med kronisk myelogen leukemi, som inducerats att producera interferon med Sendai- eller Newcastle-sjukdoms- virus, såsom beskrives exempelvis i den tyska Offenlegungs- schrift 2947134. En särskilt föredragen källa, vilken an- vänts vid de arbeten som beskrives, är en cellinje betecknad KG-l härrörande från en patient med akut myelogen leukemi.

Denna cellinje, som beskrives av Koeffler, H.P. och Golde, D.W., Science 200, ll53 (1978), tillväxer lätt i ett kultur- medium innefattande RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 plus lO % FCS (fetal calf serum) som värmeinaktiverats, 25 mM HEPES buffert (N-2-hydroxietyl-piperazin-N'-2-etan- -sulfonsyra) och 50,ug/ml gentamicin, och subodlas med l till 3 uppdelningar (split) två gånger per vecka. Celler kan frysas från det i det föregående nämnda tillväxtmediet plus lO % dimetylsulfoxid. KG-l har deponerats hos American Type Culture Collection (ATCC accession nr CRL 8031).

KG-l-celler inducerades för att producera leukocytinterferon mRNA med Sendai- eller Newcastle-sjukdomsvirus med användning av den metod som beskrives av Rubinstein et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 76, 640-644 (1979)). Celler skördades 5 timmar efter induktion och RNA framställdes med guanidintiocyanat- -guanidinhydrokloridmetoden (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)). RNA från icke-inducerade celler isolera- .465 225 12 des på samma sätt. Oligodeoxithymidin (dT) - cellulosa- kromatografi och sackarosgradient-ultracentrifugering användes för erhållande av 128-fraktionen av poly-(A)-mRNA, såsom beskrives av Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 (1976)) och Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 (1978)). Detta mRNA hade en interferontiter av 8000-10.000 enheter per mikrogram i Xenopus laevis oocyte- -försök (Cavalierr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3287-3291 (1977)).

C. Framställning av kolonibanker innehållande LeIF cDNA- -sekvenser. 5,Mg mRNA användes för framställning av dubbelsträngig cDNA med standardmetoder (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 (1978) och Goeddel et al., Nature 281, 544-548 (1979)). CDNA storleksfraktionerades genom elektrofores på en 6 % polyakrylamidgel och 230 ng material med storlek varierande från 500 till 1500 b.p. tillvaratogs genom elektro- eluering. En 100 ng portion av denna cDNA “ändades" (tailed) med deoxicytidin (dC)-rester såsom beskrives av Chang et al., Nature 275, 617-624 (1978), behandlades (annealed) med 470 ng plasmid pBR322, som har ändats med deoxiguanosin (dG)-rester vid PstI-stället (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)), och användes för transformering av E. coli x 1776. Approximativt 130 tetracyklinresistanta, ampicillinsensitiva transformanter erhölls per ng CDNA.

Vid ett andra likartat försök erhölls ca 1000 tetracyklin- resistanta, ampicillinsensitiva E. coli K-12 stam 294-trans- formanter per ng cDNA. I detta fall tillvaratogs storleks- fraktionerat cDNA-material varierande i storlek från 600 till 1300 b.p. genom elektroeluering för dC-ändning (dC tailing).

D. Framställning av syntetiska oligonukleotider och användning därav.

Kännedom om aminosyrasekvenserna för ett flertal tryptiska 465 223 13 fragment av humanleukocytinterferon tillät utformning av syn- tetiska deoxioligonukleotider komplementära till olika områden av LeIF mRNA. De två tryptiska peptiderna T1 och Tl3 valdes, eftersom dessa hade aminosyrasekvenser, som kräver syntes av endast 12 resp. 4 undekamerer, som svarar mot alla möjliga kodningssekvenser (fig. 1). Fyra grupper av deoxioligo- nukleotidsonder syntetiserades för varje sekvens, innehållande antingen tre (T-1A, B, C, D) eller en (T-13A, B, C, D) oligo- nukleotider var. De indikerade komplementära deoxioligo- nukleotiderna med ll basers längd syntetiserades kemiskt med fosfotriestermetoden (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75, 5765-5769 (1978)). Fyra individuella sonder fram- ställdes i T-13-serierna. De tolv T-1-sonderna framställdes i fyra poler av tre sonder såsom visas på fig. 1.

De fyra individuella sonderna av T-13-serierna och tolv T-1- -sonderna framställdes i fyra poler av tre primers var, användes för primning av syntesen av radiomärkt enkelsträngad cDNA för användning såsom hybridiseringssonder. Mönster-mRNA var antingen l2S RNA från Sendai-inducerade KG-1-celler (8000 enheter IF-aktivitet perlug) eller total poly-(A)-mRNA från oinducerade leukocyter ( cDNA framställdes av dessa primers med användning av kända reaktionsbetingelser (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 76, 1770-1774 (1979)). 60,ul-reaktioner genomfördes i 20 mM tris-HCl (PH 8,3), 20 mM KCl, 8 mM MgCl2, 30 mM ß- -merkaptoetanol. Reaktioner inkluderande l,ug av varje primer (dvs. 12 /Jg totalt för T-l-serierna, 4 ,ug totalt för T-l3- i -serierna), 2 pg "inducerad" l2S-fraktion-mRNA (eller l0,ug oinaucerad pø1y-(A)-mRNA),'o,5 mM dATP, dcmp, dTTP, zoo pci (a32 P)dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmol) och 60 enheter revers- transkriptas (Bethesda Research Laboratories). Produkt sepa- rerades från oinförlivad märksubstans genom gelfiltrering på en 10 ml Sephadex® G-50-kolonn, behandlad med O,3N NaOH under 30 minuter vid 70°C för förstöring av RNA och neutrali- serades med HCl. Hybridiseringar genomfördes såsom beskrivits av Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979). -465 225 14 E. Identifikation av kloner pLl-pL30.

Den snabba plasmidisoleringsmetoden enligt Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), användes för fram- ställning av l,ug plasmid DNA av var och en av 500 enskilda E. coli K-12-stammar 294 transformanter (se C). Varje DNA- -prov denaturerades och påfördes på nitrocellulosafilter i triplikat med metoden enligt Kafatos et al. (se ovan).

De tre grupperna av nitrocellulosafilter innehållande de 500 plasmidproverna hybridiserades med a) inducerad cDNA primningsbehandlad med T-l-uppsätt-I ningen av primers, b) T-13 primningsbehandlad, inducerad cDNA och c) oinducerad cDNA framställd med användning av båda grupperna av primers. Kloner ansågs positiva, om de hybri- diserades starkare till endera av eller båda de inducerade cDNA-sonderna än till den totalt oinducerade sonden. Trettio "positiva" kloner (pLl-pL30) utvaldes från de 500 för fort- satt analys.

F. Identifikation av kloner pL3l-pL39.

Isolering av en plasmid (nr 104) innehållande ett LeIF-genfragment.

Transformanter av E. coli x 1776 sållningsprovades med kolonihybridiseringsmetoden enligt Grunstein och Hogness (Prov. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975)) med använd- ning av 32P-märkt inducerad mRNA såsom sond (Lillenhaug et al., Biochemistry, 15, 1858-1865 (1976)). Omärkt mRNA från oinducerade celler blandades med sonden i ett förhållande av 200 till 1 för att konkurrera med oinducerad mRNA, som när- 32 varade i det P-märkta preparatet. Hybridisering av märkt mRNA borde uppträda företrädesvis till kolonier innehållande inducerade sekvenser. Tre klasser av transformanter erhölls: 32 (l) 2-3 % av kolonierna hybridiserades till P-mRNA mycket kraftigt, 465 223 15 (2) l0 % hybridiserades signifikant mindre än klass l och (3) återstoden gav icke någon detekterbar hybridiserings- signal.

De positiva kolonierna (klass (l) och (2)) undersöktes beträffande närvaron av interferonspecifika sekvenser genom en provning, som beror på hybridisering av interferon mRNA specifikt till plasmid DNA. Från början odiaaës so starkt positiva kolonier (klass l) individuellt i l00 ml M9-medium kompletterat med tetracyklin (20,ug/ml), diaminopimelinsyra (100 /Lg/ml) , thymidin (20 ßg/ml) och d-biotin (l/ug/ml) .

M9-mediet innehåller per liter Na2HP04 (6 g), KHZPO4 (3 g), NaCl (0,5 g) och NH4Cl (l g). Efter autoklavering tillsättes l ml steril lM MgSO4 och 10 ml steril 0,0lM CaCl2. Tio kulturer odlades och plasmid DNA isolerades från de sex polerna såsom beskrivits av Clewell et al., Biochemistry 9, 4428-440 (1970). 10/Mg av varje plasmid DNA-pol klövs med HindIII, denaturerades och bands kovalent till DBM (diazo- bensyloximetyl)-papper. l,ug av renad mRNA från inducerade celler hybridiserades till varje filter. Ohybridiserad mRNA avlägsnades genom tvättning. Specifikt hybridiserad mRNA eluerades och translaterades i Xenopus laevis oocytes. Med denna provning var alla sex polerna negativa. Fem poler av tio kolonier vardera och en pol av nio kolonier framställdes av 59 svagt positiva kolonier (klass 2) och plasmider prepa- rerades av polerna samt undersöktes på ovan angivet sätt.

Bland de sex provade polerna hybridiserades en (Kl0) till interferon mRNA vid nivåer, som signifikant överstiger bak- grundsnivåerna varje gång provning genomfördes. För identi- fiering av den specifika interferon cDNA framställdes klon- plasmid DNA av de 9 kolonierna av pol Kl0 och undersöktes individuellt. Två av de nio plasmiderna (nr l0l och 104) band interferon mRNA väl överstigande bakgrundsnivåerna. Av plasmid nr 104 isolerades ett unikt BglII-restriktionsfrag- ment innehållande 260 b.p., märktes med 32P med användning av den metod som beskrives av Taylor et al., Biochim. Biophys.

Acta 442, 324-330 (1976), och användes såsom sond för obe- roende sållningsprovning av 400 E. coli 294 transformanter (465 223 16 med en in situ-kolonisållningsmetod (Grunstein och Hogness, Prcc. Natl. Sci. USA 72, 3961-3965 (l975)). Nio kolonier (pL3l-pL39) identifierades, vilka hybridiserades i olika grad med denna sond.

Dessutom användes det märkta 260 b.p. fragmentet för obe- roende sållning av 4000 E. coli 294 transformanter på samma sätt. 50 kolonier identifierades, vilka hybridiserades i olika grad med denna sond. En innehöll LeIF G-fragmentet, en innehöll LeIF H-fragmentet och en innehöll ett fragment betecknat LeIF H1, en synbarligen allel till LeIF H. De hybridplasmider som erhölls betecknades "pLeIF H", etc.

G. Isolering och sekvensering av en första fullängd- -LeIF-gen .

Plasmid DNA framställdes av samtliga 39 potentiella LeIF cDNA-kloner och sållades på nytt med samma 260 b.p. DNA-sond med användning av hybridiseringsmetoden enligt Kafatos et al. (se ovan). Tre plasmider (pL4, pL3l, pL34) gav mycket starka hybridiseringssignaler, fyra (pLl3, pL30, pL32, pL36) hybri- diserade moderat och tre (pL6, pL8, pLl4) hybridiserade svagt med sonden.

De 39 potentiella LeIF cDNA-rekombinantplasmiderna sållnings- 32P-märkta syntetiska unde- provades även med användning av kamerer (individuella T-l primerpoler eller individuella T-13 primers) direkt såsom hybridiseringssonder. Hybridiserings- betingelserna valdes så att perfekt basparning skulle er- fordras för detekterbara hybridiseringssignaler (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 (1979)). Sålunda fram- ställdes plasmid DNA från de 39 klonerna med "standard cleared lysate procedure" (Clewell et al., se ovan) och renades med Biorad Agarose A-50-kolonnkromatografi.

Prover (3,ug) av varje preparat lineariserades genom behand- ling med Eco RI, denaturerades i alkali och påfördes fläckvis (spotted) på 2 separata nitrocellulosafilter, l,5,flg per fläck <1/ 465 223- 17 (Kafatos et al., se ovan). Individuella syntetiska deoxi- oligonukleotidprimers och primerpoler fosforylerades med (Y32 P)ATP enligt följande: 50 pmol av oligonukleotid och 100 pmol av (Y32 P)ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mmol) kombinerades i 30¿y1 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 15 mM ß-merkaptoetanol. 2 enheter av T4 polynukleotidkinas till- sattes och efter 30 minuter vid 37°C renades 32P primers genom kromatografi på 10 ml Sephadexcj'G%50-kolonner.

Hybridisering genomfördes med användning av 106 cpm av primer T-l3C eller 3 x 106 cpm av primerpol T-lC. Hybridiseringarna genomfördes vid l5°C under 14 timmar i 6 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat, pH 7,2), 10 x Denhardt's -märkta (0,2 % bovinserumalbumin, 0,2 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % Fricoll) lösning, såsom beskrives av Wallace et al. (se ovan).

Filtren tvättades under 5 minuter (3 gånger) vid OOC i 6 x SSC, torkades och exponerades för röntgenstrålfilm.

Resultaten visas på fig. 2 för 32P-primerpol T-13C och primer T-lC.

Plasmid DNA från klon 104 visade sig ge signifikant hybridi- sering med primerpol T-lC och primer T-13C, men ingen detek- terbar hybridisering med de andra undekamererna. Såsom visas på fig. 2 hybridiserade ett flertal av de 39 potentiella LeIF-plasmiderna (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) även med båda dessa sonder. Emellertid visade restriktionsanalys att endast en av dessa plasmider, pL3l, även innehöll ett 260 b.p. inre Bg1II-fragment. PstI-uppslutning av pL3l visade att storleken av cDNA-insatsen var ca 1000 b.p._ Hela PstI-insatsen av pL3l sekvenserades med både Maxam- -Gilberts kemiska metod (Methods Enzymol. 65, 499-560 (1980)) och med dideoxikedjetermineringsmetoden (Smith, Methods Enzymol. 65, 560-580 (1980)) efter subkloning av Sau3a-frag- ment i en Ml3-vektor. DNA-sekvensen visas (“A") på fig. 3.

Den tillämpliga translationsavläsningsramen kunde förutsägas av den tillgängliga proteinsekvensinformationen, det kända området av LeIF-molekylvikter, samt den relativa förekomsten av stopptripletter i de tre möjliga avläsningsramarna, och 465 223 18 detta i sin tur tillät förutsägelse av hela LeIF-aminosyra- sekvensen, inkluderande en pre- eller signalpeptid. Den första ATG-translationsinitieringskodonen âterfinnes 60 nukleotider från 5'-änden av sekvensen och följes, 188 kodoner äsenare, av en TGA-termineringstriplett; det finns 342 otrans- laterade nukleotider vid 3'-änden, följt av en po1y-(A)- -sekvens. Den putativa signalpeptiden (förmodligen involve- rad i sekretion av moget LeIF från leukocyter) har längden 23 aminosyror. De 165 aminosyror som bildar moget. LeIF har en beräknad molekylvikt av 19.390. I detta sammanhang be- tecknas LeIF kodad med pL3l "LeIF A". Det framgår av sekvensdata (“A") på fig. 4 att de tryptiska peptiderna T1 och Tl3 av LeIF B motsvarar aminosyrorna 145-149 resp. 57-61 hos LeIF A. De ifrågavarande DNA-kodningssekvenserna, som återfinnes i dessa två områden, är de som representeras av primerpol Tl-C och primer T13-C (se fig. 8).

H. Direkt expression av moget leukocytinterferon A (LeIF A) . 1. Allmänt.

Den metod som använts för expression av LeIF A direkt såsom en möqëñ interferonpolypeptid är en variant av den metod som tidigare använts för humant tillväxthormon (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 (1979)), i den mån att metoden inne- fattade kombination av syntetiskt (N-terminalt) och komple- mentärt DNA.

Såsom visas på fig. 6 är ett Sau3a-restriktionsendonukleas- ställe lämpligt beläget mellan kodonerna 1 och 3 hos LeIF A.

Två syntetiska deoxioligonukleotider designerades, vilka inkorporerade en ATG-translationsinitieringskodon, åter- ställde kodonen för aminosyra 1 (cystein) och skapade en EcoRI “klibbig ände". Dessa oligomerer ligerades till ett 4 34 b.p. Sau3a - AvaII-fragment av pL3l. Den erhållna 45 b.p. produkten ligerades till två ytterligare DNA-fragment till I bildning av en 865 b.p. syntetisk-naturlig hybridgen, som 465 223 l9 kodar för LeIF A och begränsas av EcoRI- och PstI-restrik- tionsställen. Denna gen infördes i pBR322 mellan EcoRI- och PstI-ställena för att ge plasmiden pLeIF Al. 2. Konstruktion av tryptofankontrollelementet (inne- hållande E. coli trp-promotor, operator och trp-ledar- ribosombindningsstället men saknande en ATG-sekvens för initiering av translation).

Plasmid pGMI uppbär E. coli-tryptofanoperonet innehållande deletionen.4LEl4l3 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 (1978)) och uttrycker sålunda ett fusionsprotein innefattande de första 6 aminosyrorna av trp-ledaren och approximativt den sista tredjedelen av trp-E-polypeptiden (i det följande i sammansättningar (conjunction) betecknad LE') liksom trp-D-polypeptiden i dess helhet, det hela under kontroll av trp promotor-operatorsystemet. Plasmiden, 20,ug, behandlades med restriktionsenzymet PvuII, som klyver plas- miden vid fem ställen. Genfragmenten kombinerades därefter med EcoRI-linkers (bestående av en självkomplementär oligo- nukleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG), som ger ett EcoRI- -klyvningsställe för en senare kloning till en plasmid inne- hållande ett EcoRI-ställe. De 2OApg DNA-fragment som er- hållits från pGMl behandlades med 10 enheter T4 DNA-ligas i närvaro av 200 pmol av den 5'-fosforylerade syntetiska oligo- nukleotiden PCATGAATTCATG och i 2OÅßl T4.DNA-ligasbuffert (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, lO mM MgCl2, 5 mM ditio- treitol) vid 4°C över natten. Lösningen upphettades därefter lO minuter vid 70°C för avbrytande av ligeringen. Linkers- -ändarna klyvdes genom EcoRI-behandling och fragmenten, nu med EcoRI-ändar, separerades med användning av 5 % polyakryl- amidgelelektrofores (i det följande PAGE) och de tre största fragmenten isolerades från gelen genom att man först färgade med etidiumbromid, lokaliserade fragmenten med ultraviolett ljus och skar från gelen de delar som var av intresse. Varje gelfragment, med 300 mikroliter O,l x TBE, placerades i en dialyspåse och underkastades elektrofores vid 100 V under en timme i O,l X TBE-buffert (TBE-bufferten innehåller: lO,8 g Åes 223 20 Tris-bas, 5,5 g borsyra, 0,09 g Na2EDTA i l liter H20).

Vattenlösningen tillvaratogs från dialyspåsen, fenolextrahe- rades, kloroformextraherades och gjordes 0,2 M natriumklorid och DNA tillvaratogs i vatten efter etanolutfällning. Den trp promotor-operatorhaltiga genen med EcoRI "klibbiga ändar" identifierades med den metod som beskrives i det följande, vilken innefattar införande av fragment i en tetracyklin- känslig plasmid, vilken, efter införande av promotor-operator, blir tetracyklinresistent.

Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 (1979)) uttrycker ampicillinresistens och innehåller genen för tetracyklinresistens men uttrycker icke denna resistens eftersom det icke finnes någon associerad promotor.

Plasmiden är därför tetracyklinkänslig. Genom införande av ett promotor-operatorsystem i EcoRI-stället kan plasmiden göras tetracyklinresistent. pBRHI behandlades med EcoRI och enzymet avlägsnades med fenolextraktion följt av kloroformextraktion och tillvaratogs i vatten efter etanolutfällning. Den erhållna DNA-molekylen kombinerades, i separata reaktionsblandningar, med vardera av de tre DNA-fragment som erhålles ovan och ligerades med T4 DNA-ligas såsom beskrives i det föregående. Den DNA som när- varar i reaktionsblandningen användes för transformering av kompetent E. coli K-12-stam 294 med standardmetoder (Hershfield et all, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3459 (1974)) och bakterien avsattes (plated) på LB (Luria-Bertani)- -plattor innehållande 20lßg/ml ampicillin och 5,flg/ml tetra- cyklin. Flera tetracyklinbeständiga kolonier valdes, plasmid DNA isolerades och närvaron av det önskade fragmentet bekräf- tades genom restriktionsenzymanalys. Den erhållna plasmiden betecknas pBRHtrp.

En EcoRI- och BamHI-behandlingsprodukt av det virala genomet av hepatitis B erhölls med konventionella medel och klonades in i EcoRI- och BamHI-ställena hos plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) till bildning av plasmiden pHS32. 465 223 21 Plasmiden pHS32 klyvdes med XbaI, fenolextraherades, kloro- formextraherades och etanolutfälldes. Den behandlades där- efter med l.fd.EL coli DNA-polymeras I, Klenow-fragment (Boehringer-Mannheim) i 30,ul polymerasbuffert (50 mM kalium- fosfat pH 7,4, 7 mM MgCl2, l mM ß-merkaptoetanol) innehållande 0,1 mM dTTP och 0,1 mm dcTP under 30 minuter vid o°c och där- efter 2 timmar vid 37°C. Denna behandling bringar 2 av de 4 nukleotiderna komplementärt till den 5'-utskjutande änden av XbaI-klyvningsstället att ifyllas: 5' cTAGA-- 5' cTAGA-- 3' T-- 3' TcT-- Två nukleotider, dC och dT, införlivades och gav en ände med två 5'-utskjutande nukleotider. Denna lineära återstod av plasmid pHS32 (efter fenol- och kloroformextraktion och till- varatagande i vatten efter etanolutfällning) klyvdes med EcoRI. Det stora plasmidfragmentet separerades från det mindre EcoRI-XbaI-fragmentet med PAGE och isolerades efter elektroeluering. Detta DNA-fragment från pHS32 (O,2,ug). ligerades; under betingelser likartade med de som beskrivits ovan, till EcoRI-TaqI-fragmentet av tryptofanoperonet (~0,0l,ß9) härrörande från pBRHtrp.

Vid förfarandet för ligering av fragmentet från pHS32 till EcoRI - TaqI-fragmentet, såsom beskrivits ovan, ligeras den TaqI-utskjutande änden till den av XbaI kvarvarande utskju- tande änden även om den icke fullständigt Watson-Crick- -basparas: _- T CTAGA -- - TCTAGA -- + ______y --AGC TCT-- --AGCTCT-- En del av denna ligeringsreaktionsblandning transformerades till E. coli 294-celler, värmebehandlades och utfälldes på LB-plattor innehållande ampicillin. 24 kolonier valdes, odlades i 3 ml LB (Luria-Bertani)-medium och plasmidisolera- des. Sex av dessa visade sig ha XbaI-stället regenererat via E. coli-katalyserad DNA-reparation och replikering: -465 223 22 - TCTAGA- - TCTAGA- ---+ - AGcTcT- -AGATCT - Dessa plasmider visade sig även ge klyvning med både EcoRI och HpaI och att ge de förväntade restriktionsfragmenten.

En plasmid, betecknad pTrpl4, användes för expression av heterologa polypeptider, såsom diskuteras i det följande.

Plasmiden pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) innehåller en gen för humant tillväxthormon sammansatt av E 23 aminosyrakodoner framställda av syntetiska DNA-fragment och 163 aminosyrakodoner erhållna från komplementär DNA fram- ~ ställd via reverstranskription av humant tillväxthormon- budbärar-RNA. Trots att denna gen saknar kodonerna för "pre"-sekvensen hos humant tillväxthormon, innehåller den en ATG-translationsinitieringskodon. Genen isolerades från lO,ug pHGH 107 efter behandling med EcoRI följt av E. coli DNA-polymeras I. Klenow-fragment och dTTP och dATP såsom beskrivits ovan. Efter fenol- och kloroformextraktion samt etanolutfällning behandlades plasmiden med BamHI.

Fragmentet innehållande humant tillväxthormon (HGH)-gen iso- lerades med PAGE följt av elektroeluering. Det erhållna DNA- -fragmentet innehåller även de första 350 nukleotiderna för tetracyklinresistensstrukturgenen men saknar tetracyklin- promotor-operatorsystemet, så att, vid efterföljande kloning i en expressionsplasmid, plasmider innehållande insatsen kan lokaliseras genom återställandet av tetracyklinresistensen.

Eftersom EcoRI-änden av fragmentet ifyllts med Klenow-poly- meras I-metoden, har fragmentet en trubbig (blunt) och en klibbig ände, vilket säkerställer lämplig orientering vid efterföljande införing i en expressionsplasmid.

Expressionsplasmiden pTrpl4 framställdes därefter för mot- tagande av det HGH-genhaltiga fragment som beretts enligt ovan. Sålunda underkastades pTrpl4 Xbaï-behandling (upp- slutning, digested) och de erhållna "klibbiga ändarna" ifyll- des med Klenow-polymerisas I-metoden med användning av dATP, 465 223 23 dTTP, dGTP och dCTP: Efter extraktion med fenol och kloro¿ form samt utfällning med etanol behandlades erhållet DNA med BamHI och det erhållna stora plasmidfragmentet isolerades med PAGE och elektroeluering. Det pTrpl4-härledda fragmentet hade en "trubbig" och en "klibbig" ände tillåtande rekombinering med lämplig orientering med det HGH-genhaltiga fragment, som beskrivits ovan.

HGH-genfragmentet och pTrpl4.AXba-BamHI-fragmentet kombinera- des och ligerades tillsammans under betingelser som var lik- artade med de som beskrivits ovan. De ifyllda XbaI- och EcoRI-ändarna ligerades samman genom "trubbigåänd-ligering" till återskapande av både XbaI- och EcoRI-stället: Ifylld XbaI Ifylld EcoRI HGH-geninitiering -TCTAG AATTCTATG- *"TCTAGAATTCTATG- -AGATC ' TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC- XbaI ECORI Denna konstruktion återskapar även den tetracyklinresistenta genen. Eftersom plasmid pHGH 107 uttrycker tetracyklin- resistens från en promotor som ligger uppströms från HGH- -genen (lac-promotorn), tillåter denna konstruktion, som betecknas pHGH 207, uttryckande (expression) av genen för tetracyklinresistens under kontroll av tryptofanpromotor- -operatorn. Ligeringsblandningen transformerades sålunda till E. coli 294 och kolonierna valdes på LB-plattor inne- hållande 5,ug/ml tetracyklin.

Plasmid pHGH 207 underkastades EcoRI-behandling och ett 300 b.p. fragment innehållande trp-promotorn, operator och trp- -ledarribosonbindningsställe men saknande en ATG-sekvens för initiering av translation tillvaratogs genom PAGE följt av elektroeluering. Detta DNA-fragment klonades in i EcoRI- -stället hos pLeIF A. Expressionsplasmider innehållande enligt ovan modifierad trp-regulon (E. coli trp-operon från vilken attenuatorsekvensen avlägsnats för reglerbar höjning av expressionsnivåerna) kan odlas till förutbestämd nivå i 465 223 24 näringsmedia innehållande additiv tryptofan i mängder, som'är 'tillräckliga för att undertrycka promotor-operatorsystemet, därefter befrias från tryptofan för att upphäva undertryckan- det av systemet och möjliggöra expression av den avsedda produkten.

Speciellt, och med hänvisning till fig. 6, behandlades 250gug plasmid pL3l med Pstï och 1000 b.p. insatsen isolera- des genom gelelektrofores på en 6 % polyakrylamidgel.

Ca 40;¿g av insatsen elektroeluerades från gelen och upp- delades i 3 provvolymer under ytterligare behandling: a) Ett l6,ug prov av detta fragment behandlades partiellt med 40 enheter Bg1II under 45 minuter vid 3700 och reaktionsbland- ningen renades på en 6 % polyakrylamidgel. Ca 2;zg av det önskade 670 b.p. fragmentet tillvaratogs. b) Ett annat prov (8/1g) av den 1000 b.p. långa PstI-insatsen restriktions- behandlades med AvaII och Bg1II. 1.pg av det angivna 150 b.p. fragmentet tillvaratogs efter gelelektrofores. c) l6;¿g av det 1000 b.p. stycket behandlades med Sau3a och AvaII.

Efter elektrofores på en 10 % polyakrylamidgel tillvaratogs ca 0,25,ug (10 pmol) av det 34 b.p. fragmentet. De två indikerade deoxioligonukleotiderna, 5'-dAATTCATGTGT (frag- ment 1) och 5'-dGATCACACATG (fragment 2) syntetiserades med fosfotriestermetoden. Fragment 2 fosforylerades på följande sätt. 200 ,ul (~4o pmol) av (y32P) ATP (Amershem, 5000 ci/- mmol) torkades ned och âteruppslammades i 30,u1 60 mM Tris- -HCl (pH 8), 10 mM MgCl2, 15 mM.ß-merkaptoetanol, innehål- lande 100 pmol DNA-fragment och 2 enheter av T4 polynukleo- tiakinee. Efter ls minuter vid 37°c tilleettee l ,ul lo mm ATP och reaktionen tilläts fortskrida ytterligare 15 minuter.

Blandningen upphettades därefter till 70°C under 15 minuter, kombinerades med 100 pmol av 5'-OH-fragmentet 1 och 10 pmol av 34 b.p. Sau3a-AvaII-fragmentet. Ligation genomfördes under 5 timmer via 4°c i 50 fil ev 20 mm Trie-Hcl (pH 7,5) . 10 mm Mgclz, lo mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP och 10 enheter T4 DNA-ligas. Blandningen elektroforerades på en 6 % poly- akrylamidgel och produkten 45 b.p. tillvaratogs genom elektro- eluering. Ca 30 ng (1 pmol) av den 45 b.p. produkten kombi- 465 2230 25 nerades med 0,5/zg (5 pmol) av 150 b.p. AvaII-BglII-frag- - mentet och l,ug (2 pmol) av 670 b.p. BglII-Pstl-fragmentet.

Ligeringen genomfördes vid 2000 under 16 timmar med använd- ning av 20 enheter av T4 DNA-ligas. Ligaset inaktiverades genom upphettning till 6500 10 minuter. Blandningen behand- lades därefter med EcoRI och PstI för eliminering av poly- merer av genen. Blandningen renades med 6 % PAGE. Ca 20 ng (0,04 pmol) av 865 b.p. produkt isolerades. Hälften (10 ng) av detta ligerades in i pBR322 (0,3,ug) mellan EcoRI- och PstI-ställena. Transformation av E. coli 294 gav 70 tetra- cyklinresistenta, empicillinkänsliga transformanter. Plasmid DNA isolerad från 18 av dessa transformanter uppslöts med EcoRI och PstI. 16 av de 18 plasmiderna hade ett EcoRI-PstI- -fragment med längden 865 b.p. ligg av ett av dessa, pLeIF Al, uppslöts med EcoRI och ligerades till det 300 b.p.

EcoRI-fragmentet (0,1,ug) innehållande E. coli trp-promotor och trp-ledarribosombindningsställe, som framställts enligt ovan. Transformanter innehållande trp-promotorn identifiera- des med användning av en 32P-trp-sond i samband med Grunstein-Hogness kolonisållningsmetod. Ett asymmetriskt lokaliserat XbaI-ställe i trp-fragmentet tillät bestämning av rekombinanter, i vilka trp-promotorn var orienterad i riktningen av LeIF A-genen.

I. In vitro- och in vivo-aktivitet av LeIF A.

Extrakt framställdes för IF-analys enligt följande: 1 ml kulturer odlades i L-odlingsvätska (broth) innehållande Slug/ml tetracyklin till ett A550-värde av ca 1,0, utspäddes därefter i 25 ml M9-medium innehållande 5,ug/ml tetracyklin. 10 ml prover skördades genom centrifugering när A550 nådde 1,0 och cellpelletar suspenderades i 1 ml av 15 % sackaros, so mM Tris-Hci (en 8,0) , so mM EDTA. 1 mg av :Lysozym tiil- sattes och efter 5 minuter vid 0°C sönderbröts cellerna genom ljudbehandling (sonication). Proverna centrifugerades 10 minuter (l5.000 rpm) och interferonaktiviteten i de över- stående vätskorna bestämdes genom jämförelse med LeIF- -standard med cytopatisk effekt (CPE)~inhiberingsanalys. .465 223 I g 26 För bestämning av antalet IF-molekyler per cell användes en 8 enheter/mg.

LeIF-specifik aktivitet av 4 x l0 Såsom visas i tabell I ger klon pLeIF A trp 25, i vilken trp- -promotorn insattes i den önskade orienteringen, höga akti- 8 enheter per liter). vitetsnivåer (så högt som 2,5 x 10 Såsom visas i tabell II beter sig IF framställt med E. coli - K-l2 stam 294/pLeIF A trp 25 på samma sätt som autentisk human LeIF. Den är stabil mot behandling vid pH 2 och neutra- liseras av kanin-antihuman-leukocytantikroppar. Interferonet har en skenbar molekylvikt av ca 20.000.

In vivo-verksamheten hos interferon kräver närvaron av makro- fager och naturliga mördarceller (killer cells, NK) och in vivo-sättet för verkan synes innefatta stimulering av dessa celler. Det var sålunda fortfarande möjligt att det inter- feron som framställts med E. coli 294/pLeIF A 25, trots att det hade antiviral aktivitet vid cellkulturprovning, icke skulle vara verksamt i infekterade djur. Vidare skulle den antivirala in vivo-aktiviteten hos bakteriellt framställd, icke-glykosylerad LeIF A kunna vara olik aktiviteten av glykosylerad LeIF härrörande från humana "buffy coat"- -leukocyter. Därför jämfördes den biologiska aktiviteten av bakteriellt syntetiserad LeIF A (renhetsgrad 2 %) med buffy coat-LeIF (renhetsgrad 8 %) i letal encefalo-myocarditis (EMC)-virusinfektion av ekorrapor (squirrel monkeys) (tabell III).

Tabell I.

Interferonaktivitet i extrakt av E. coli E. coli K-l2 - - LeIF- stam 294 Celldensitet IF-aktivitet -molekyler transformerad med (celler/ml) enheter/ml kultur per cell pLeIF A trp 25 3,5 X 108 36.ooo 9.ooo pLeIF A trp 25 1,8 X 109 25OÅOOO' " " 'l2.000 465 223. 27 Tabell II.

Jämförelse av aktiviteter hos extrakt från E. coli 294/pLeIF A 25 med standard-LeIF* Interferonaktivitet (enheter/ml) kanin-antihuman- obehandlad pH 2 -leukocytantikroppar 294/pLeIF A trp 25 500 500 extrakt LeIF standard 500. 500 *Det 250.000 enheter/ml-extrakt av E. coli 294/pLeIF A trp 25, som beskrives i tabell I, utspäddes 500-faldigt med minimalt essentiellt medium till en specifik aktivitet av 500 enheter/- ml. En leukocytinterferonstandard (Wadley Institute), som tidigare titrerats mot NIH-leukocytinterferonstandarden, utspäddes även till en slutlig koncentration av 500 U/ml. l ml provvolymer justerades till pH 2 med lN HCl, inkuberades vid 4°C 52 timmar, neutraliserades genom tillsats av Na0H och IF-aktiviteten bestämdes med standard-CPE-inhiberingsanalys. 25;1l provvolymer av proverna med 500 enheter/ml (obehandlade) inkuberades med 25,ul kanin-antihuman-leukocytinterferon 60 minuter vid 37°C, centrifugerades vid 12.000 x g 5 minuter och den överstående vätskan analyserades. 1465 223 28 Tabell III.

Antiviral effekt av olika LeIF-preparat mot EMC-virusinfektion av ekorrapor Serum plackbildande enheter/ml Över- Behandling levande dygn 2 dygn 3 dygn 4 Kontroll 0/3 l0 3xl04 105 o} 3 o 1o4 1.200 >3,4x1o4 I 0 0 O Bakterie- 3/3 0 0 0 -LeIF A O O O O O O LeIF-standard 3/3 0 0 0 O O O O O O Samtliga apor var hannar (medelvikt 713 g) och hade inga EMC- -virusantikroppar före infektionen. Aporna infekterades intramuskulärt med 100 x LD5O De kontrollbehandlade aporna dog vid 134, 158 och 164 timmar 6 EMC-virus (bestämt på möss). post infektion. Interferonbehandlingar med 10 enheter genomfördes på intravenös väg vid -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 och 240 timmar, i~förhållande till infektionen. Bakte- rieleukocytinterferonet var en kolonnkromatografifraktion från ett lysat av E. coli 294/pLeIF A 25 vid en specifik aktivitet av 7,4 x 106 enheter/mg protein. Kontrollbakterie- _ proteinerna var en ekvivalent kolonnfraktion från ett lysat av E. coli 294/pBR322 vid två gånger den totala protein- koncentrationen. Leukocytinterferonstandarden var Sendai- -virusinducerat interferon från normala humana "buffy-coat“- -celler, renat kromatografiskt till en specifik aktivitet av 32 x 106 enheter/mg protein.

Kontrollaporna uppvisade progressiv letargi, balansförlust, slapp paralys av baklemmar och rinnande ögon (watering of the eyes) med början ca 8 timmar före döden. Interferonbehand- 465 223 29 lade apor uppvisade icke någon av dessa abnormaliteter. De förblev aktiva hela tiden och utvecklade icke viremi. Den apa i kontrollgruppen som icke utvecklade viremi efter 4 dygn dog sist (lÉ4 timmar efter infektion) men uppvisade höga titervärden av virus i hjärta och hjärna post mortem. De interferonbehandlade aporna utvecklade icke antikroppar mot EMC-virus enligt bestämning 14 och 21 dygn efter infektionen.

Dessa resultat visar att de antivirala effekterna av LeIF- -preparat i de infekterade djuren kan enbart tillskrivas interferonet, eftersom de förorenande proteinerna är helt annorlunda i de bakteriella och buffy-coat-preparaten.

Dessutom visar dessa resultat att glykosylering icke erford- ras för antiviral aktivitet in vivo av LeIF A.

J. Isolering av cDNA för ytterligare leukocytinterferoner.

DNA från den helt karakteriserade LeIF A cDNA-haltiga plas- miden uttogs (excised) med PstI, isolerades elektroforetiskt och märktes med 32P. Det erhållna radioaktivt märkta DNA användes såsom en sond för sâllningsprovning av ytterligare E. coli 294-transformanter, som erhållits identiskt med de i del C, genom in situ-kolonisållningsmetoden enligt Grunstein och Hogness (se ovan). Kolonier isolerades, som hybridise- rades i olika mängder till sonden. Plasmid DNA från dessa kolonier och de tio hybridiserande kolonier, som nämnes i del G ovan, isolerades genom PstI-skärning och karakterisera- des med tre olika metoder. Först karakteriserades dessa Pst- -fragment med dessas restriktionsendonukleas-uppslutninge- mönster med enzymerna BglII, PvuII och EcoRI. Denna analys tillät klassificering av åtminstone åtta olika typer (LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G Och LeIF H), såsom visas på fig. 5, vilka approximerar läget av olika restriktionssnitt i förhållande till den numera kända pre- sekvensen och kodningssekvensen hos LeIF A. En av dessa, LeIF D, antages vara identisk med den som anges av Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980).

För det andra provades vissa av DNA-materialen beträffande 465 223 30 förmågan att selektivt avlägsna LeIF mRNA från poly-A inne- hållande KG-l cell RNA med den hybridiseringsurvalsanalys, som beskrives av Cleveland et al., Cell 20, 95-105 (l980).

LeIF A, B, C och F var positiva vid denna analys. För det tredje insattes de sistnämnda Pst-fragmenten i en expressions- plasmid, E. coli 294 omvandlades med plasmiden och fragmenten bringades till uttryck. Expressionsprodukterna, som antages ha varit pre-interferoner, var samtliga positiva vid CPE- -analys beträffande interferonaktivitet, även om aktiviteten var marginell ifråga om LeIF F-fragmentet. Förutom det före- gående har alla LeIF-typerna som beskrivits sekvensbehandlats.

K. Direkt expression av ett andra moget leukocyt- interferon (LeIF B).

Sekvensen av det isolerade fragmentet innefattande genen för moget LeIF B visar att de första fjorton nukleotiderna av typerna A och B är identiska. Sålunda isolerades ett frag- ment från pLeIF A 25 uppbärande trp-promotor-operator, ribo- sombindningsställe och starten för LeIF A (=B)-genen och kombinerades med den återstående delen av B-sekvensen i en expressionsplasmid. De framträdande restriktionskartorna för Pst-fragmentet av pL4 (en plasmid innefattande den LeIF B Pst-ändade gen som visas på fig. 5) och pLeIF A 25 visas på fig. 7a resp. 7b.

För erhållande av det ca 950 b.p. Sau3a till PstI-fragmentet från den sekvens som visas på fig. 7a erfordrades ett flertal steg på grund av närvaron av ett eller fler mellankommande Sau3a restriktionsställen, dvs.: l. Följande fragment isolerades: a) llOb b.p. från Sau3a till EcoRI, b) 132 b.p. från EcoRI till Xba, c) >7OO b.p. från Xba till Pst. 2. Fragment (la) och (lb) ligerades och skars med Xba och BglII för att förebygga självpolymerisering genom Sau3a och 465 223 31 Xba-ändterminaler (det relevanta Sau3a-stället var i ett BglII-ställe; BglII skär och kvarlämnar en Sau3a-klibbig ände).

Ett 242 b.p. fragment isolerades. 3. Produkten från (2) och (lc) ligerades och skars med PstI och BglII, likaledes för att förhindra självpolymerise- ring. Ett ca 950 b.p. fragment, Sau3a till PstI på fig. 7a, isolerades. Detta fragment innehöll den del av LeIF B-genen som icke var gemensam med LeIF A. 4. Ett ca 300 b.p. fragment (HindIII till Sau3a) inne- fattande trp-promotor-operator, ribosombindningsstället, ATG-startsignalen och cysteinkodonen hos LeIF A isolerades från pLeIF A 25. .5. Ett ca 3600 b.p. fragment PstI till HindIII isolerades från pBR322. Detta innefattade replikonen och kodade tetra- cyklin- men icke ampicillinresistens. 6. De fragment som erhölls i steg 3, 4 och 5 trippel- legerades och den erhållna plasmiden transformerades till E. coli K-12 stam 294.

Transformanter minisållades (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)) och plasmidproverna uppslutnings- behandlades med EcoRI. Uppslutningen gav tre fragment karakteristiska för: 1) EcoRI-EcoRI trp-promotorfragment, 2) inre EcoRI till EcoRI-fragment av pL4 och 3) protein- translationsstartsignal till EcoRI-fragment av pL4.

Vid CPE-analys ger bakterieextrakt från kloner framställda på i det föregående angivet sätt typiskt analysvärden vid ca 10 x 106 enheter interferonaktivitet per liter vid A550 = l. En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli 294/pLeIF B trp 7. 465 223. 32 L. Direkt uttryckande av ytterligare mogna leukocyt- interferoner (LeIF C, D, F, H, I och J).

Ytterligare fullängdgenfragment, som innefattar andra LeIF- kan "skräddarsys" och placeras i expressionsvehiklar Full- -typer, för uttryckande (expression) liksom ifråga om LeIF A. ständig sekvensbehandling med konventionella medel visar huruvida ett restriktionsställe ligger tillräckligt nära den första aminosyrakodonen av den mogna. interferontypen för att tillåta lämpligt utnyttjande av det tillvägagångssätt som användes i del H, ovan, för uttryckande av mogen LeIF A, dvs. eliminering av försekvensen genom restriktionsskärning och ersättande av kodoner för de N-terminala aminosyrorna, som går förlorade vid eliminering av presekvensen genom ligation av ett syntetiskt DNAffragment. Om detta icke lyckas kan följande tillvägagångssätt användas. Allmänt innefattar detta klyvning av det försekvenshaltiga fragmentet omedelbart före den punkt, vid vilken kodonen för den första aminosyran av den matura polypeptiden börjar, genom: l. omvandling av dubbelsträngad DNA till enkelsträngad DNA i ett område, som omger denna punkt, 2. hybridisering till det enkelsträngade område, som bildats i steg (a) av en komplementär primer-längd av enkelsträngñä DNA, varvid 5'-änden av primern ligger motsatt den nukleotid, som angränsar till det avsedda klyvningsstället, 3. återställande av den del av den andra strängen, som eliminerats i steg l, som ligger i 3'-riktningen från primern genom reaktion med DNA-polymeras i närvaro av adenin-, thymin-, guanin- och cytosinhaltiga deoxi- nukleotidtrifosfater och 4. uppslutning av återstående enkelsträngää längd av DNA, som skjuter ut förbi det avsedda klyvningsstället.

En kort längd av syntetisk DNA slutande, vid 3'-änden av den kodande strängen, med translationsstartsignalen ATG kan där- efter ligeras med, exempelvis, “trubbig-änd“-ligering till 465 223 33 den resulterande "skräddarsydda" genen för de mogna inter- feronerna samt genen insättas i en expressionsplasmid och bringas under kontroll av en promotor och dess associerade ribosombindningsställe.

Pâ ett sätt likartat med det som användes i del K ovan anpas- sades genfragment kodande LeIF C och LeIF D för direkt bak- teriell expression. Expressionsstrategin för dessa ytter- ligare leukocytinterferoner innefattade, i varje särskilt fall, utnyttjande av det ca 300 b.p. fragmentet (HindIII till Sau3a) innefattande trp-promotor-operator, ribosombindnings- ställe, ATG-startsignal och cysteinkodon av LeIF A från pLeIF A 25. Till detta kombinerades genfragment från de ytterligare interferongener som kodar dessas respektive amino- syrasekvenser bortom den initial-cystein som är gemensam för alla. Varje erhållen plasmid användes för transformering av E. coli K-12 stam 294. Ligationerna för framställning av respektive gener var följande: LeIF C.

Isolera följande fragment från pLeIF C: (a) 35 b.p. från Sau3a till Sau96. (b) >9OO b.p. Sau96 till PstI. (c) Isolera ett ca 300 b.p. fragment (HindIII - Sau3a) från pLeIF A 25 såsom i del K (4) ovan. (d) Isolera det ca 3600 b.p. fragmentet enligt del K (5) ovan.

Konstruktion: (1) Ligera (a) och (c). Klyv med BglII, HindIII och isolera produkten med ca 335 b.p. (2) Trippelligera (l) + (b) + (d) och transformera E. coli med den erhållna plasmiden.

En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli K-lz stam 294/pLeIF c trp 35. 465 223 34 LeIF D.

Isolera från pLeIF D: (a) 35 b.p. från Sau3a till AvaII. (b) l50 b.p. från AvaII till BglII. (c) Ca 700 b.p. från BglII till PstI.

Isolefa från pLeIF A 25: (d) 300 b.p. från HindIII till Sau3a.

Isolera från pBR322: (e) Ca 3600 b.p. från HindIII till PstI.

Konstruktion: (l) Ligera (a) + (b), skär med BglII och rena en produkt (l) med 185 b.p. (2) Ligera (l) + (d), skär med HindIII, BglII och rena produkten (2) med ca 500 b.p. (3) Ligera (2) + (c) + (e) och transformera E. coli med den erhållna plasmiden.

En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli K-l2 stam 294/pLeIF D trp ll.

LeIF F.

Det LeIF F-haltiga fragmentet kan skräddarsys för direkt uttryckande genom sammansättning (reassembly), som möjlig- göres genom fullständig homologi av aminosyrorna 1-13 hos LeIF B och LeIF F. Ett trp-promotor-haltigt fragment (a) med på lämpligt sätt utformade ändar erhålles från pHGH207, såsom beskrives ovan, via PstI- och XbaI-uppslutning följt av isolering av fragmentet med längden ca 1050 b.p. Ett andra fragment (b) erhålles såsom det större av fragmenten här- rörande från PstI- och BglII-uppslutning av plasmiden pHKY 10.

Fragment (a) innehåller ca halva den gen som kodar ampicillin- resistens, fragment (b) innehåller återstoden av denna gen och hela genen för tetracyklinresistens förutom den associe- rade promotorn. Fragmenten (a) och (b) kombineras via T4- 465 223 35 -ligas och produkten behandlas med XbaI och BglII för elimi- nering av dimerisering, med beredning av ett fragment (c) innefattande trp-promotor-operator och gener för tetracyklin- och ampicillinresistens.

Ett fragment (d) med ca 580 b.p. erhålles genom AvaII- och BglII-uppslutning av pLeIF F. Detta innefattar kodoner för aminosyror l4-166 hos LeIF F.

Ett fragment (e) (49 b.p.) erhålles genom XbaI- och AvaII- -uppslutning av pLeIF B. Fragment (e) kodar aminosyrorna l-l3 i LeIF F.

Fragmenten (c), (d) och (e) trippelligeras i närvaro av T4- -ligas. De kohesiva ändarna av respektive fragment är sådana, att kompositplasmiden cirkuläriseras korrekt, varvid tetracyklinresistensgenen bringas under kontroll av trp- -promotor-operatorn tillsammans med genen för mogen LeIF F, så att bakterier transformerade med den önskade plasmiden kan väljas på tetracyklinhaltiga plattor. En representativ klon framställd på detta sätt är E. coli K-12 stam 294/pLeIF F trp 1.

LeIF H.

Den kompletta LeIF H-genen kan konfigureras för expression såsom mogen leukocytinterferon på följande sätt: l. Plasmid pLeIF H underkastas HaeII- och RsaI-uppslut- ning med isolering av det 816 b.p. fragment, som sträcker sig från signalpeptidaminosyra 10 till det 3'-icke-kodande området. . 2. Fragmentet denatureras och underkastas reparations- syntes med Klenow-fragment av DNA-polymeras I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168 (1970)) med användning av den syntetiska deoxiribooligonukleotidprimern 5'-dATG TGT AAT CTG TCT. 465 225 36 3. Den erhållna produkten klyves med Sau3a och ett 452 b.p. fragment representerande aminosyrorna l till 150 iso- leras. 4. Sau3a- och PstI-uppslutning av pLeIF H samt isolering av det resulterande 500 b.p. fragmentet ger en gen, som kodar aminosyrorna 150 till änden av kodningssekvensen. 5. Fragment som isolerats i steg (3) och (4) ligeras till bildning av ett fragment: 1 166 met cys asp stop ATG TGT .._|__...GAT TGA__...._.1>stI Sau3a som kodar de 166 aminosyrorna hos LeIF H. 6. pLeIF A trp 25 uppslutes med XbaI, göres “blunt-ended" med DNA-polymeras I och produkten uppslutes med PstI. Det stora resulterande fragmentet kan isoleras och ligeras med produkten från steg (5) till bildning av en expressions- plasmid, som, vid transformation av E. coli K-12 stam 294 eller andra värdbakterier, kan uttrycka mogen LeIF H.

LeIF I.

Det "phase A Charon 4A recombinant library" för humant genom, som konstruerats av Lawn et al., Cell 15, ll57 (1978), såll- ningsprovades beträffande leukocytinterferongener med metoder som beskrives av Lawn et al. (supra) och Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978). En radioaktiv LeIF-sond härrörande från cDNA klon LeIF A användes för sållning av ca 500.000 plattor (plaques). Sex LeIF-genomkloner erhölls vid denna sållning.

Efter förnyad sållning och plattrening valdes en av dessa kloner,.AHLeIF2, för fortsatt analys.

Med användning av den metod som beskrivits ovan kan andra sonder användas med fördel för isolering av ytterligare LeIF- -kloner från humant genom. Dessa i sin tur kan användas för framställning av ytterligare leukocytinterferonproteiner in _ 465 223 3? enlighet med uppfinningen. l. 2000 b.p. EcoRI-fragment av klon AHLeIF2 subklonades till pBR325 vid'EcoRI-stället. Den erhållna plasmiden LeIF I klövs med EcoRI och fragmentet med 2000 b.p. isolerades.

Deoxioligonukleotiden dAATTCTGCAG (en EcoRI-PstI-konverter) ligerades till EcoRI-fragmentet med 2000 b.p. och den er- hållna produkten klyvdes med PstI och gav ett 2000 b.p. frag- ment innehållande PstI-ändar. Detta klövs med Sau96 och ett 1100 b.p. fragment isolerades, som har en PstI- och en Sau96- -ände. 2. Plasmiden pLeIF C trp 35 uppslöts med Pstl och XbaI.

Det stora fragmentet isolerades. 3. Det lilla XbaI-PstI-fragmentet från pLeIF C trp 35 uppslöts med XbaI och Sau96. Ett 40 b.p. XbaI-Sau96-fragment isolerades. 4. De fragment som isolerats i steg (l), (2) och (3) ligerades till bildning av expressionsplasmiden pLeIF I trp 1.

LeIF J. _ l. Plasmiden pLeIF J innehåller ett 3,8 kilobas HindIII- -fragment av humant genom-DNA, som inkluderar LeIF J-gen- sekvensen. Ett 760 b.p. DdeI-RsaI-fragment isolerades från denna plasmid. 2. Plasmiden pLeIF B trp 7 klövs med HindIII och DdeI och ett 340 b.p. HindIII-DdeI-fragment isolerades. I 3. Plasmiden pBR322 klövs med PstI, gjordes "blunt ended" genom inkubation med DNA-polymeras I (Klenow-fragment), upp- slöts därefter med HindIII. Det stora 0v3600 b.p. fragmentet isolerades. 4. Fragment isolerade i steg (1), (2) och (3) ligerades till bildning av expressionsplasmid pLeIF J trp l. 465 223 38 M. Rening.

Innehållet av leukocytinterferon i bakterieextrakt kan för- bättras genom successivt: l. Polyetylen-iminutfällning, varvid större delen av cellproteinet, inkluderande interferonet, kvarstannar i den överstående vätskan.

X 2. Ammoniumsulfatfraktionering, varvid interferon ut- träder ur lösningen i 55 % mättad ammoniumsulfatlösning. 3. Suspension av ammoniumsulfatpelletarna i 0,06 M kaliumfosfat, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, och dialys mot 25 mM Tris-HCl, pH 7,9 (interferonaktiviteten kvarstannar i lös- ning). 4.i Kromatografi av den ovan angivna överstående lös- ningen, pH justerat till 8,5, på en DEAE-cellulosakolonn (eluering med en linjär gradient av O till 0,2 M NaCl i 25 mM Tris-HCl, pH 8,5). 5. Adsorption på Cibachrome Blue-Agarose eller hydroxyl- apatit och eluering med 1,5 M KCl resp. 0,2 M fosfatlösning (valfritt). 6. Molekylär storleksuppdelning på en Sephadex® G-75- -kolonn. 7. Katjonbyteskromatografi på CM-cellulosa i 25 mM ammo- niumacetat vid pH 5,0, framkallat med en ammoniumacetat- gradient (till 0,2 M ammoniumacetat).

Den ovan angivna processen ger material med >95 % renhetsgrad.

Materialet kan även renas genom storleksexklusionskromatogra- fi, reversfas (RP-8)-högtrycksvätskekromatografi eller affi- nitetskromatografi på orörliggjorda antiinterferonantikroppar. 465 223 39 Alternativt kan materialet från steg 4 ovan bemängas på en monoklon antikroppkolonn, framställd såsom beskrives av Milstein, Scientific American 243, 66 (1980), och elueras med 0,2 M ättiksyra, 0,1 % Triton och 0,15 M NaCl.

Enligt en alternativ föredragen utföringsform kan det leuko- cytinterferon, som framställes med den ovan beskrivna metoden, renas med följande steg: l. Frusna cellpelletar innehållande det uttryckta leuko- cytinterferonet brytes upp manuellt eller genom lämplig storleksreducerande utrustning. De delvis tinade cellerna suspenderas i 4 volymer av en buffert A innehållande 0,1 M Tris justerat till pH 7,5-8,0, 10 % (w/v) sackaros, 0,2 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 mM PMSF och 10-100 mM MgC12. Suspen- sionen hålles vid ca 4oC.

Suspensionen föres genom en homogeniseringsanordning vid ca 420 at följt av en andra passage vid mindre än 70 at.

Effluenten från homogeniseringsanordningen från de båda passagerna kyles i ett isbad. 2. Polyetylenimin tillsättes långsamt till homogenatet till en koncentration av ca 0,35 % och tillâtes stå under ca 30 minuter. De fasta materialen avlägsnas genom centri- fugering eller filtrering. Detta steg är temperaturreglerat eller genomföras tillräckligt hastigt för att den överstående vätskan (filtratet) skall hållas vid mindre än 10°C. Den överstående vätskan (filtratet) koncentreras genom ultra- filtrering till ca 1/10 av utgångsvolymen. Partikelformigt material eller grumling i retentatet kan avlägsnas med ett lämpligt filter, exempelvis en mikroporös membran. 3. Den klarnade lösningen bemänges direkt på en monoklon- antikroppkolonn vid ett flöde av 5-8 cm/h (t.ex. 25-40 ml/h på en kolonn med diametern 2,6 cm). Efter bemängning av kolonnen tvättas denna med ca 10 kolonnvolymer 25 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,5, innefattande NaC1 (0,5 M) och ytaktivt medel, 465 223 40 exempelvis Triton X-100 (0,2 %) eller ekvivalent. Efter tvättningen sköljes kolonnen med ca 10 kolonnvolymer av lös- ning innehållande 0,15 M NaCl och ytaktivt medel, exempelvis Triton X-100 (O,l %) eller ekvivalent. Kolonnen elueras med 0,2 M ättiksyra innehållande ytaktivt medel, exempelvis Triton X-100 (0,1 %) eller ekvivalent. Proteintoppen från monoklonantikroppkolonnen (bestämd genom UV-absorption eller annan lämplig analys) polas och pH-värdet justeras till ca 4,5 med l N Na0H eller 1,0 M Tris-bas. 4. Den polade interferontoppen bemänges på en katjonisk bytare, exempelvis Whatman CM52-cellulosa eller ekvivalent, som utjämnats med en lämplig buffert, exempelvis ammonium- acetat pH 4,5 (50 mM). Efter bemängning tvättas kolonnen med utjämnande buffert, tills UV-absorptionen hos effluenten har nått ett platåvärde, så att föga mängd ytterligare pro- tein elueras från kolonnen. Kolonnen elueras därefter med 25 mM ammoniumacetat/0,12 M natriumklorid eller en kombina- tion som optimerar tillvaratagandet av interferon och ger en lyofiliserad kaka med tillfredsställande utseende och löslig- hetsegenskaper.

De monoklonantikroppar som användes enligt den föredragna utföringsform, som beskrives ovan, kan framställas med den metod, som beskrives av Staehelin et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 78, 1848-52 (1981). Monoklonantikroppar renas och bindes kovalent till Affigel-10 såsom beskrives i det följande: Framställning och rening av monoklonantikroppar från ascitisk vätska.

Fem mushonor Balb/c ympades vardera med 5 till 10 x 106 hybridoma-celler från mitt-log-tillväxtfasen. Ca 5 x 10 livskraftiga celler erhållna från musvätska (producing fluid) ympades intraperitonealt i var och en av 10 eller fler möss. 6 Ascitiäcvätska uppsamlades upprepade gånger (2 till 4 gånger) från varje mus. Upp till tre överföringar och uppsamlingar kan genomföras från en grupp av möss till nästa. Ascitisk 465 223 41 vätska från mössen vid varje överföring polades.

Celler och debris avlägsnades från ascitisk vätska med låg- hastighetscentrifugering (500-1000 x g) under 15 minuter.

Därefter genomfördes centrifugering 90 minuter vid 18.000 rpm.

Den överstående vätskan frös och lagrades vid -2000. Efter upptining avlägsnades ytterligare mängd fibrin och partikel- formigt material genom centrifugering vid 35.000 rpm under 90 minuter. Satser av ascitisk vätska från varje överföring provades beträffande specifik antikroppaktivitet med fast- fasantikroppsbindningsprovning (Staehelin et al., supra) och polades vid tillfredsställande resultat.

Koncentrationen av protein i de polade lösningarna bestämdes med approximationen att l mg protein ger en absorbans av 1,2 vid 280 nm i en kuvett med en banlängd av 1,0 cm. Ascites- -vätskor med hög halt av antikropp innehåller 30 till 35 mg protein/ml. Detta motsvarar 4-7 mg specifik antikropp/ml.

Vätskan utspäddes med PBS (0,0l M natriumfosfat, pH 7,3, 0,15 M NaCl) till en proteinkoncentration av 10 till 12 mg/ml.

Till varje 100 ml av utspädd lösning sattes 90 ml av vid rums- temperatur mättad ammoniumsulfatlösning långsamt med kraftig omrörning vid 0°C. Suspensionen hölls i is 40-60 minuter, centrifugerades därefter 15 minuter vid 10.000 rpm vid 400.

Den överstående vätskan dekanterades och fick avrinna väl.

Proteinpelletarna upplöstes i 0,02 M Tris.HCl (pH 7,9)/0,04 M NaC1 (buffert I). Proteinlösningen dialyserades 16-18 timmar vid rumstemperatur mot 100 volymer buffert I med minst ett utbyte av buffert. Den dialyserade lösningen centrifugerades vid 15.000 rpm 10 minuter för avlägsnande av oupplöst material.

Ca 30-35 % av den ursprungliga mängden av total proteinmängd i den ascitiska vätskan tillvaratogs enligt uppskattning genom absorption vid 280 nm.

Lösningen innehållande 30-40 mg protein per ml tillfördes därefter till en kolonn av DEAE-cellulosa, som utjämnats med buffert I. En kolonnbäddvolym av minst 100 ml användes för 2465 225 42 varje gram tillfört protein. Antikroppen eluerades från kolonnen med en linjär NaCl-gradient innehållande 0,02 M Tris.HCl, pH 7,9, från 0,04 M till 0,5 M NaCl. Polade topp- fraktioner eluerande mellan 0,06 och 0,1 M NaCl koncentrerades genom utfällning med en lika stor volym av vid rumstemperatur mättad ammoniumsulfatlösning och centrifugerades. Protein- pelletarna upplöstes i 0,2 M NaHC03 (pH«~8,0)/0,3 M NaCl (buffert II) följt av dialys mot ombyten av samma buffert vid rumstemperatur. De dialyserade lösningarna centrifugerades vid 20.000 x g 15 minuter för avlägsnande av olösligt mate- rial. Proteinkoncentrationen justerades vid 20-25 mg/ml med buffert II.

Preparation av immunoadsorbanter.

Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien, A.f.s.) tvättades på ett sinterglasfilter tre gånger med iskall iso- propanol följt av tre tvättningar med iskallt destillerat vatten. Geluppslamningen Qv50 % i kallt vatten) överfördes till plaströr och sedimenterades genom kortvarig centrifuge- ring. Den överstående vätskan avsögs. Den packade gelen blandades med en lika stor volym av renad antikropplösning och roterades ände-över-ände vid 400 under 5 timmar. Efter reaktion centrifugerades gelen, tvättades därefter två gånger med buffert III (0,1 M NaHC03/0,15 M NaCl) för avlägsnande av okopplad antikropp. Proteinbestämning av de kombinerade tvättvattnen visade att mer än 90 % av antikropparna kopplats till gelen.

För blockering av oreagerade ställen blandades gelen med en lika stor volym 0,1 M etanolamin.HCl (pH 8) och roterades ände-över-ände vid rumstemperatur 60 minuter. Geluppslam- ningen tvättades fri från reaktionskomponenter med PBS och lagrades i PBS i närvaro av 0,02 % (w/v) natriumazid vid 400.

N. Parenteral administrering.

LeIF kan administreras parenteralt till subjekt som kräver 465 223 43 antitumör eller antiviral behandling och till sådana som upp- visar immunosuppressiva betingelser. Dosering och doshastig- het kan vara parallella med vad som vanligen användes vid kliniska undersökningar av humanhärledda material, exempelvis ca (l-10) x 106 enheter per dygn, och ifråga om material med större renhetsgrad än l %, lämpligen upp till, exempelvis 5 x 107 enheter.

Såsom ett exempel på en lämplig dosform för väsentligen homo- gent bakteriellt LeIF i parenteral form kan 3 mg LeIF med en 8 enheter/mg upplösas specifik aktivitet av exempelvis 2 x 10 i 25 ml 5 N humanserumalbumin, varvid lösningen föres genom ett bakteriologiskt filter och den filtrerade lösningen aseptiskt uppdelas i 100 ampuller, vilka var och en inne- håller 6 x 106 enheter rent interferon lämpat för parenteral administrering. Ampullerna lagras lämpligen i kyla (-20OC) före användning.

Föreningarna enligt föreliggande uppfinning kan beredas enligt kända metoder till kompositioner för framställning av farma- ceutiskt användbara kompositioner, varigenom polypeptiden enligt uppfinningen kombineras i blandning med en farma- ceutiskt acceptabel bärarvehikel. Lämpliga vehiklar och sammansättningen av dessa beskrives i Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin, som är avsett att utgöra en del av föreliggande beskrivning. Sådana komposi- tioner innehåller en effektiv mängd av interferonproteinet enligt uppfinningen tillsammans med en lämplig mängd vehikel för beredning av farmaceutiskt acceptabla kompositioner, som är lämpade för effektiv administrering till värden. En föredragen administreringsmetod är parenteral.

Claims (35)

ih CN LH FO bb 04 '19 PATENTKRAV

1. l. Moget rekombinant-humanleukocytinterferon, k ä n - n e t e c k n a t av delaminosyrasekvensen Cys-Ala-Trp-Glu- -Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser, av 165-166 aminosyror och av aminosyran Asp, Glu eller Val i position 114 eller när metionin är bunden till N-terminus av den första aminosyran av nämnda interferon, av 166-l67 aminosyror och av aminosyran Asp, Glu eller Val i position ll5.

2. Interferon enligt patentkravet l icke åtföljt av en ytterligare metioninrest vid dess N-terminus.

3. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon A, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu LYS LYS TYI Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

4. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon B, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp 'Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp pg 465 22s Leu Glu Val Leu Cys Asp Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Ty: Glu Asp Se: Ile Leu Ala Val Arg Lys Ty: Phe G1n Arg Ile Th: Leu Ty: Leu Th: Glu Lys Lys Ty: Se: Se: Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe se; Leu ge; Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu.

5. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon C, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln Th: His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Se: Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Th: Phe Asn Leu Phe Ser Th: Glu Asp Ser Se: Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Th: Glu Leu Ty: Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Th: Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val ARg Lys Ty: Phe Gln Arg Ile Th: Leu Ty: Leu Ile Glu Arg Lys Ty: Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Se: Leu Ser Phe Ser Th: Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp.

6. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon D, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Glu Th: His Se: Leu Asp Asn Arg Arg Th: Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Se: Se: Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Pne Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn om Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Se: Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Th: Th: Lys Asp Se: Se: Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Th: Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Lefi Glu Ala Cys Val met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Th: Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys lys Ty: Phe Arg Arg Ile Th: Leu Ty: Leu Thr Glu Lys Lys Ty: Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Se: Leu Ser Th: Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu.

7. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon F, k ä n n e - 465 223 H45 t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln Th: His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Se: Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Se: Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Th: Phe Asn Leu Phe Se: Th: Lys Asp Se: Se: Ala Th: Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Th: Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Th: Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Ty: Phe Gln Arg Ile Th: Leu Ty: Leu Th: Glu Lys Lys Ty: Se: Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Se: Phe Se: Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu.

8. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon H, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asn Leu Ser Gln Th: His Se: Leu Ash Asn Arg Arg Th: Leu Met Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Se: Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Th: Phe Asn Leu Phe Se: Th: Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Th: Leu Leu Glu Lys Phe Ty: Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gln Val Gly Val Glu Glu Th: Pro Leu Met Asn Glu Asp Se: Ile Leu Ala Val Arg Lys Ty: Phe Gln Arg Ile Th: Leu Ty: leu Met Glu Lys Lys Ty: Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Se: Phe Ser Phe Se: Th: Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp.

9. Interferon enligt patentkravet l eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon I, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln .Th: His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Se: Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Pro Asp Phe Gly Leu Pro Gln'Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Th: Gln Ala Ile Se: Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Th: Phe Asn Leu Phe Ser Th: Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Se: Leu Leu Glu Lys Phe Ser Th: Glu Leu Ty: Gln Gln Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Th: Pro Q; 465 223 Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Ile Leu Arg Arg Lys Asp.

10. Interferon enligt patentkravet 1 eller 2, vilket utgör moget rekombinant-humanleukocytinterferon J, k ä n n e - t e c k n a t av aminosyrasekvensen Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp~Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Lys Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp.

11. Interferon enligt något av patentkraven 3 till 10 med en ytterligare metioninrest vid aminoterminus.

12. Moget rekombinant-humanleukocytinterferon enligt något av patentkraven 1 till 11, k ä n n e t e c k n a t därav, att det är bakteriellt framställt.

13. Moget rekombinant-humanleukocytinterferon enligt något av patentkraven 1 till ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att det är framställt med E. coli.

14. DNA-sekvens, k ä n n e t e c k n a d därav, att den kodar för ett moget rekombinant-humanleukocytinterferon enligt något av patentkraven 1 till 13.

15. DNA-sekvens enligt patentkravet 14, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den är operativt förenad med en DNA- -sekvens med förmåga att åstadkomma expression av ett moget 465 223 ”K rekombinant-humaninterferon enligt något av patentkraven 1 till ll i en bakterie.

16. DNA-sekvens enligt patentkravet 15, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den är operativt förenad med en DNA- -sekvens med förmåga att åstadkomma expression av ett moget rekombinant-humaninterferon enligt något av patentkraven l till 11 i E. coli.

17. Replikerbar expressionsvehikel med förmåga att, i en transformantbakterie, uttrycka ett moget rekombinant-human- interferon enligt något av patentkraven 1 till ll.

18. Replikerbar expressionsvehikel med förmåga att, i en transformant-E. coli, uttrycka ett moget rekombinant-human- interferon enligt något av patentkraven 1 till ll.

19. Replikerbar expressionsvehikel enligt patentkravet 17 eller 18, k ä n n e t e c k n a d därav, att den utgör en plasmid.

20. Replikerbar expressionsvehikel enligt patentkravet 19, k ä n n e t e c k n a d därav, att den utväljes ur gruppen bestående av plasmiderna pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, pLeIF F trp 1, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp ll, pLeIF G, pLeIF H, pLeIF I trpï och pLeIF J trp 1.

21. Transformerad bakterie, k ä n n e t e c k n a d därav, att den bär en replikerbar expressionsvehikel enligt något av patentkraven 17 till 20.

22. Transformerad bakterie enligt patentkravet 21, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är en stam av E. coli.

23. Transformerad bakterie enligt patentkravet 22, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är en E. coli K-12 294-stam. 465 223. W

24. Farmaceutisk komposition innehållande en terapeu- tiskt effektiv mängd av ett moget rekombinant-humanleukocyt- interferon enligt något av patentkraven l till 13 och ett bärarmaterial lämpligt för farmaceutisk administration.

25. Farmaceutisk komposition enligt patentkravet 24 för parenteral administration.

26. Användning av föreningarna enligt något av patent- kraven l till 13 för framställning av farmaceutiska komposi- tioner.

27. Användning av DNA-sekvenserna enligt patentkravet 14 vid mikrobiell framställning av en förening enligt något av patentkraven l till 13.

28. Användning av en replikerbar expressionsvehikel enligt något av patentkraven 17 till 20 vid bakteriell fram- ställning av en förening enligt något av patentkraven l till 13.

29. Användning av en transformerad bakterie enligt något av patentkraven 21 till 23 vid framställning av en förening enligt något av patentkraven l till 13.

30. DNA-sekvens enligt patentkravet 14, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den användes vid mikrobiell fram- ställning av en förening enligt något av patentkraven l till 13.

31. Expressionsvehikel enligt något av patentkraven 17 till 20, k ä n n e t e c k n a d därav, att den användes vid bakteriell framställning av en förening enligt något av patentkraven l till 13.

32. Transformerad bakterie enligt något av patentkraven 21 till 23, k ä n n e t e c k n a d därav, att den användes vid framställningen av en förening enligt något av patent- 465 223 kraven l till 13.

33. Ett förfarande för framställning av moget rekombinant humant leukocytinterferon enligt något av patentkraven l-13, vilket förfarande innefattar (a) konstruktion av en replikerbar expressionsvehikel genom kombinationen av följande steg: (l) ligering av ett LeIF genfragment med olika restriktionsenzymer vid restriktionsendonukleasställen belägna nära ändarna av LeIF genen och inom LeIF genen för att erhålla restriktionsfragment av LeIF genen, (2) preparation av ett DNA fragment som innefattar en ATG translations initiationskodon och en nukleotidsekvens som kodar för en aminosyrasekvens, identiska med de första aminosyrorna i den naturliga produkten och skapar restriktions endonukleasställen nära ändarna av DNA fragmentet, (3) ligering av DNA fragmentet och restriktions- fragmenten som innefattar portioner av LeIF genen, som kodar för aminosyrasekvenser bortom de första aminosyrorna i den naturliga produkten för konstruktion av en gen som kodar för moget leukocytinterferon, och (4) opererbar linkning av den gen som kodar för moget leukocytinterferon med en DNA sekvens med förmåga att åstadkomma bakteriell expression av nämnda interferon; (b) transformation av en bakterie med en replikerbar expressionsvehikel enligt ovan angivna steg (a) S7 465 223 (c) tillväxt av den transformerade bakterien i ett odlingsmedium; och (d) lysering av den transformerade bakterien och återvinning av det mogna rekombinant humant leukocytinterferonet.

34. Ett förfarande för framställning av transformerade bakteri med förmåga att uttrycka ett moget rekombinant humant leukocytinterferon enligt något av patentkraven l-13 vilket förfarande innefattar (a) konstruktion av en replikerbar expressionsvehikel genom kombinationen av följande steg: (l) ligering av ett LeIF genfragment med olika restriktionsenzymer vid restriktionsendonukleasställen belägna nära ändarna av LeIF genen och inom LeIF genen för att erhålla restriktionsfragment av LeIF genen, (2) preparation av ett DNA fragment som innefattar en ATG translations initiationskodon och en nukleotidsekvens som kodar för en aminosyrasekvens, identiska med de första aminosyrorna i den naturliga produkten och skapar restriktions endonukleasställen nära ändarna av DNA fragmentet, (3) ligering av DNA fragmentet och restriktions- fragmenten som innefattar portioner av LeIF genen, som kodar för aminosyrasekvenser bortom de första aminosyrorna i den naturliga produkten för konstruktion av en gen som kodar för moget leukocytinterferon, och (4) opererbar linkning av den gen som kodar för moget leukocytinterferon med en DNA sekvens med förmåga att åstadkomma bakteriell expression av nämnda interferon; (b) transformation av en bakterie med en replikerbar expressionsvehikel enligt ovan angivna steg (a) 465 223 Fl

35. Ett förfarande för framställning av en replikerbar expressionsvehikel med förmåga att i en transformerad bakterie uttrycka ett moget rekombinant humant leukocytinterferon enligt något av patentkraven l-l3, vilket förfarande innefattar (a) ligering av ett LeIF genfragment med olika restriktionsenzymer vid restriktionsendonukleasställen belägna nära ändarna av LeIF genen och inom LeIF genen för att erhålla restriktionsfragment av LeIF genen, (b) preparation av ett DNA fragment som innefattar en ATG translations initiationskodon och en nukleotidsekvens som kodar för en aminosyrasekvens, identiska med de första aminosyrorna i den naturliga produkten och skapar restriktions endonukleasställen nära ändarna av DNA fragmentet, (c) ligering av DNA fragmentet och restriktions- fragmenten som innefattar portioner av LeIF genen, som kodar för aminosyrasekvenser bortom de första aminosyrorna i den naturliga produkten för konstruktion av en gen som kodar för moget leukocytinterferon, och (d) opererbar linkning av den gen som kodar för moget leukocytinterferon med en DNA sekvens med förmåga att åstadkomma bakteriell expression av nämnda interferon.