LU83461A1 - Interferone und deren herstellung - Google Patents

Description

ί ** Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft,Basel,Schweiz RAN 4100/15 5

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ie.

10 Interferone und deren Herstellung- 15 Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d.h. Verfahren, die auf diesem Gebiet verwendet werden und Produkte, die mit diesen Verfahren erhalten werden.

20 Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung

Polypeptide, insbesondere reife Human-Leukozyten-Interferone, diese enthaltende pharmazeutische Präparate und ein Verfahren zu deren Herstellung, das darin besteht, dass man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Ex-„ 25 pression eines solchen Polypeptids befähigten, replikablen

Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Polypeptid isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Expressions-Vektoren (im folgenden kurz Vektoren genannt), die in diesem Verfahren verwendet wer-30 den und die neuen Mikroorganismen, die diese Vektoren enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Schliesslich -^S· betrifft die Erfindung DNS-Sequenzen, die die Aminosäure-Ί Sequenzen von reifen Human-Leukozyten-Interferonen kodieren.

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Mez/25.6.1981 35 £ι * - 2 -Hintergrund der Erfindung

Human-Leukozyten-Interferon (LelF) wurde zuerst von ~ Isaacs and Lindenmann (Proc. R. Soc. B 147, 258-267 [1957]; .* 5 U.S.P. 3.699.222) entdeckt und in Form der rohen Präzipitate hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen, x

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das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur ^ Herstellung relativ homogener Leukozyten-Interferone aus normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukämischen 10 Spendern geführt (z.B. Deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2.947.134). Diese Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen, bestimmten Zellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüberhinaus kann Interferon die Zell-Prolifera-Ί5 tion hemmen und die Immunantwort modulieren. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, dass Leukozyten-Interferon klinisch als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und Krankheiten eingesetzt wurde.

20 In der Vergangenheit wurden Leukozyten-Interferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. T6.> 640-644 [1979];

Zoon et al., ibid. 76^ 5601-5605 [1979]). Die berichteten

Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17,500 bis 25 etwa 21,000. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparate 8 9 sind bemerkenswert hoch mit 2 x 10 bis 1 x 10 Einheiten s pro mg Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen

Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsmethoden die Be-30 Stimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al., „-s,-' Science 207, 527 [1980]; Levy et al. , Proc. Natl. Acad.

^ Sei. U.S.A. 77_, 5102-5104 [1980]). Die Frage der Glyco- 2 sylierung der verschiedenen Leukozyten-Interferone ist bis jetzt noch nicht völlig abgeklärt, aber es ist soviel 35 klar, dass Unterschiede in den Molekulargewichten nicht allein durch Glykosylierung hervorgerufen werden. Es ist auch klar, dass die Leukozyten-Interferone deutlich unterschieden sind voneinander durch unterschiedliche Amino- \ - 3 - » säurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Fällen niedriger als 80%.

Während das aus Spender-Leukozyten isolierte homogene 5 Leukozyten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakteri-sierung und zu limitierten klinischen Studien, reicht die-se Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen

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Mengen an Interferon, die fur breite klinische Prüfungen und die anschliessende prophylaktische und/oder therapeutische 10 Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Leukozyten-Interferons in Antitumor-und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit < 1%) und die langen Zeiten, die nötig sind, um 15 genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in grösserem Massstab geführt.

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es jedoch 20 inzwischen gelungen, eine grosse Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, dass sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, den A und B Ketten des 25 Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198, 1056-1063 [1977]; Goeddel et al., - Nature 281, 544-548 [1979]). Kürzlich gelang durch die An wendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin und Thymosin alpha 1 und ver-30 schiedene Autoren haben berichtet, dass es ihnen gelungen ist, Human-Leukozyten-Interferon kodierende DNS und ent-sprechende Proteine mit Leukozyten-Interferonaktivität zu erhalten (Nagata et al. , Nature 284, 316-320 [1980]; Mantei et al. , Gene Jj3, 1-10 [1980]; Taniguchi et al. , 35 Nature 285, 547-549 [1980]).

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger

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- 4 - DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt· Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfasst diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d.h. ein "Replicon") und gewöhn-5 lieh ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Pall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das Interests sierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit 10 der Plasmide liegt in der Tatsache, dass sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonucléase eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das 15 Plasmid an den Spaltstellen oder ananschliessend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle 20 eingeführt und grosse Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d.h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcrip-25 tion und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte - Plasmid (Exprèssionsvektor, Vektor) zur Herstellung des

Polypeptids verwendet werden, dass durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozess wird als Expression be-30 zeichnet.

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die durch RNS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z.B. beim Tryptophan- oder "trp"-Pro-35 moter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, - 5 - ♦ die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, 5 die der kodierende Strang enthält, vom 5'- zum 3'-Ende in mRNS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Amino-** säure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten

Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. 10 Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNS-

Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungs-stelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schliesslich die Nukleotid Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende 15 des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in 20 Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle 25 kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase - sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch

Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

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Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, dass die Anwendung der rekombinanten DNS-Technologie

Vf ^ (d.h. die Einfügung von Interferongenen in mikrobielle

Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobiel-s 35 1er genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung grosser Mengen Leukozyten-Interferon wäre, welches trotz der Tatsache, dass es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behänd- ’ιΛ - 6 - lung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.

Ein erstes Leukozyten-Interferon-Gen wurde erfindungs-5 gemäss durch die folgenden Massnahmen erhalten: (1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Human- ** leukozyten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle JO möglichen Nucleotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden können.

(2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS

Ί5 enthielten. Andere induzierte und radioaktiv markierte mRNS wurde mit Plasmid-cDNS aus dieser Bank hybridisiert. Hybridisierende mRNS wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet. Plasmid-DNS aus Kolonien, die in diesem Test Interferonaktivität besassen, 20 wurden ferner auf Hybridisierung mit Sonden die nach (1) erhalten wurden, getestet. 1

Parallel zu dem Vorgehen unter (2) wurde mittels induzierter mRNS erhaltene cDNS in Plasmiden dazu verwendet, 25 eine unabhängige Bank transformierter Kolonien zu bilden.

Die gemäss (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für ^ die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS 30 als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkrip-tion dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNS zu iw bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiter-hin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon voll-t 35 ständig kodierenden Gens. Jedes gemäss (1) oder (2) er haltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfragment kann als Sonde für ein ungekürztes Gen verwendet werden.

. - 7 - (4) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde massge-schneidert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptids verhindern könnte, auszuschliessen und um es 5 in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können ^ bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Promoters. Das exprimierte Interferon ^ wurde soweit gereinigt, dass es charakterisiert und seine

Aktivität bestimmt werden konnte.

10 (5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Genfragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyten-Interferone verwendet werden.

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Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie, wurde die mikrobielle Herstellung der Familie homologer Leukozyten-Interferone (in nicht-glykosylierter Form) als reife 20 Polypeptide, d.h. im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht. Diese Interferone können direkt exprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, dass sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen ge-25 eignet sind.

Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit sie exprimiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch, ebenfalls in einem 30 in vivo-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten mikrobiell hergestellten reifen Leukozyten-Interferons k. handelte.

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Der Ausdruck "reifes Leukozyten-Interferon", der im a 35 Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, definiert ein mikrobiell (z.B. bakteriell) hergestelltes Interferonmolekül, das keine Glykosylgruppen trägt. Reifes Leukozyten-Interferon, gemäss vorliegender Erfindung, wird ' - 8 - » von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Aminosäurecodon des natürlichen Produktes exprimiert. Das "reife" Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (für das ATG codiert) enthalten, 5 ohne dass damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der mikrobielle Wirt aus dem unmittelbaren Translationsprodukt das Methionin abspalten. Reifes ’W'

Leukozyten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader, ist exprimiert 10 werden, wobei das Konjugat spezifisch intra- oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Nr. 2007676A). Schliesslich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand 15 transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezerniert wird. Expression von reifem Leukozyten-Interferon bedeutet bakterielle oder andere mikrobielle Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält.

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Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Leukozyten-Interf er one (Figuren 4 und 9) wurden auf Grund der DNS-Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) ermittelt. Für alle diese einzelnen Leukozyten-Interferone 25 existieren natürliche, von Individuum zu Individuum unterschiedliche allelische Varianten. Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch Austausch (Substitution, Inversion) , Deletion oder Insertion einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Derartige allelische Variationen 30 der erfindungsgemässen Leukozyten-Interferone A bis J sind von den jeweiligen Formeln (LelF A bis LeiF J) mitumfasst ^ ^ und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt zwei Aminosäurepartialsequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und bis zur Homogenität gereinigt wurden, * 35 * ' - 9 - ο gemeinsam sind. Sie sind T-l und T-13 bezeichnet. Es sind alle möglichen mRNS-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechenden cDNS-Sequenzen.

Die Buchstaben A, T, G, C und U bezeichnen die Nucleotide 5 mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil.

Der Buchstabe N bedeutet A, G, C oder U. Die Polynucleotide sind vom 5'-Ende (links) zum 3'-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere DNS (nicht-kodierender Strang) von 3'- in 5'-Richtung wieder-10 gegeben.

Figur 2 stellt ein Autoradiogramm dar, das die Hybri- 32 disierung von möglichen LelF-Plasmiden mit P-markierten * synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt.

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Figur 3 gibt die Nukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyten-Interferonen verwendet werden können. Der ATG Translations-Start-Codon 20 und die Stoptripletts für jedes LelF sind unterstrichen.

Auf die Stoptripletts folgen unübersetzte Sequenzen. Dem vollständigen Gen für LelF A fehlt ein Codon in der Position 200 bis 202, der bei den anderen LelFs vorhanden ist.

Vor der Leader-Sequenz liegen ebenfalls unübersetzte Se-25 quenzen. Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges reifes LelF E. Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz.

30 Figur 4 gibt einen Ueberblick über die aus den be- stimmten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäure-X Sequenzen von 8 Leukozyten-Interferonen (A bis H). Die

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J- fur die Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren verwendeten grossen Buchstaben sind die von der IUPAC-IUB Kommission a 35 für biochemische Nomenklatur empfohlenen. Es bedeuten: „ A Alanin; C Cystein; D Asparaginsäure; E Glutaminsäure; F Phenylalanin; G Glycin; H Histidin; I Isoleucin; K Lysin; L Leucin; M Methionin; N Asparagin; P Prolin; Q Glutamin; - 10 - *

R Arginin; S Serin; T Threonin; V Valin; W Tryptophan; und Y Tyrosin. Die Zahlen geben die Position der Aminosäuren an (S bezieht sich auf das Signal-Peptid). Der Bindestrich in der 165 Aminosäuren umfassenden Sequenz von LelF A in 5 Position 44 wurde eingeführt, um die Sequenz des LelF A

*î> in Uebereinstimmung mit den 166 Aminosäuren der anderen Leukozyten-Interferone zu bringen. Für die Festlegung der Aminosäuresequenz des LelF E wurde das Nukleotid in Position 187 (Figur 3) nicht berücksichtigt. Die Sterne (Sequenz von 10 LelF E) stellen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren, die allen LelFs (mit Ausnahme des Pseudogens LelF E) gemeinsam sind, sind in Zeile "All" dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im Human-Fibroblasten-Interferon Vorkommen.

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Figur 5 gibt die Restriktionsendonuclease-Karten der klonierten cDNSs von 8 verschiedenen Leukozyten-Interferonen wieder (A bis H). Die hybriden Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailing-Methode (Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 20 411-416 [1980]) hergestellt. Die cDNS-Einsätze können daher mit Pstl herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDNS-Einsatzes stellen die anschliessenden homopolymeren dC:dG-Schwänze dar. Die Lage der PvuII-,

EcoRI- und Bglll-Restriktionsstellen sind angegeben.

25 Schattierte Regionen in der Figur stellen kodierende Sequenzen für reife LelFs dar; die schräg-gestrichelten Regionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während die weissen Regionen nicht-kodierende Sequenzen darstellen.

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In Figur 6 wird schematisch die Konstruktion eines Gens, das die direkte mikrobielle Synthese von reifem LelF A

I * kodiert, dargestellt. Es werden die Restriktionsstellen (Pstl, usw.) sowie die verwendeten Bruchstücke gezeigt.

* 35 Die Abkürzung "b.p." bedeutet Basenpaare.

- Figur 7 (nicht massstabsgerecht) stellt schematisch die Restriktions-Karte von 2 Genfragmenten dar, die zur ’ - 11 -

Expression von reifem LelF B verwendet wurden. Die be-zeichneten Nukleotid-Codons sind die Enden der kodierenden Stränge, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen.

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Die Figuren 8 und 9 geben die DNS- und Aminosäuresequenzen der Leukozyten-Interferone A, C, H, I und J wieder.

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In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DNS-Sequenz, während der Bindestrich in der Se-10 quenz von LelF A die benachbarten Aminosäuren, Phenylalanin und Glycin miteinander verbindet.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFUEHRUNGSFORMEN 15 A. Die verwendeten Mikroorganismen

Die beiden folgenden Mikroorganismen wurden verwendet: E. coli x 1776, wie beschrieben in U.S.P. 4.190.495, und E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi-, hsr-, hsm*), wie in 20 der britischen Patentanmeldung Nr. 2055382 A beschrieben. Beide Organismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert unter den ATCC Nrr. 31537 und 31446.

Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt.

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Ausser den beiden oben genannten E. coli-Stämmen können aber auch andere Stämme, beispielsweise E. coli B oder weitere Mikroben-Stämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type 30 Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind. Vergleiche auch Deutsche Offenlegungs-\ schrift 2644432. Weitere Mikroorganismen, die erfindungs- gemäss verwendet werden können, sind z.B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen 35 vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, - 12 - können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefepromotors.

B. Quelle und Reinigung von LelF mRNS 5

LelF mRNS kann von Human-Leukozyten (normalerweise von CML-Patienten), die zur Produktion von Interferon mit Sendai-Virus oder NDV, wie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2947134 beschrieben, angeregt wurden, 10 erhalten werden. Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist eine Zelllinie, die KG-1 bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter myelogener Leukämie ableitet. Die Zelllinie, beschrieben von Koeffler, H.P. und Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), . 15 wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosewell

Park Memorial Institute) 1640 mit 10% FCS (fötales Kälberserum), hitzeinaktiviert, 25 mM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxy-ethyl-piperazin-N1-2-ethan-sulfonsäure) und 50 ug/ml Gentamycin. Die Zellen können in dem vorstehend beschriebenen 20 Medium nach Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid eingefroren werden. Die KG-1 Linie ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. CRL 8031 deponiert worden.

Die KG-l-Zellen wurden nach der von Rubinstein et al.

25 in (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 775, 640-644 [1979]) beschriebenen Weise mit Sendai-Virus oder NDV zur Produktion von Leukozyten-Interferon-mRNS angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRNS wurde nach der Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode 30 (chirgwin et al., Biochemistry 18^, 5294-5299 [1979]) herge- £ stellt. RNS aus nicht-induzierten Zellen wurde in der \ gleichen Weise isoliert. Oligo-deoxythÿmidin (dT)-Cellulose- / \ r?“ Chromatographie und Saccharose-Gradient-Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S Fraktion von Poly(A)-mRNS, wie 35 von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1976]) und Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 [1989]) beschrieben, zu erhalten. Diese mRNS hatte einen Interferontiter von 8000-10,000 Einheiten pro Microgramm - 13 - im Xenopus laevis Oozytentest (Cavalieri et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. _7_4, 3287-3291 ( 1977]).

C. Herstellung von Koloniebänken, die LelF-cDNS-5 Sequenzen enthalten.

5 ug mRNS wurde zur Herstellung doppelsträngiger cDNS

nach Standardmethoden (Wickens et al., J. Biol. Chem.

253, 2483-2495 [1978] und Goeddel et al., Nature 281, 10 544-548 [1979]) verwendet. Die cDNS wurde der Grösse nach fraktioniert durch Elektrophorese an einem 6% Polyacrylamidgel und 230 ng des Materials mit 500-1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert. 100 ng dieser cDNS wurden mit Deoxycytidin (de)-Resten nach der von Chang et 15 al. (Nature 275, 617-624 [1978]) beschriebenen Methode verlängert, verbunden mit 470 ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosin (dG)-Resten an der Pstl-Spaltstelle (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 [1977]) verlängert worden war und zur Transformation von E. coli x 1776 verwendet.

20 Es wurden etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten pro ng cDNS erhalten.

In einem zweiten ähnlichen Experiment wurden etwa 1000 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche E. coli 25 K-12 Stamm 294-Transformanten pro ng cDNS erhalten. In diesem Falle lag die Grösse des fraktionierten cDNS-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren. Es wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit Deoxycytidin (dC) gewonnen.

30 d. Herstellung synthetischer Oligonucleotide und jir deren Verwendung

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Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen verschiedener tryptischer Fragmente von humanen Leukozyten-Interferonen 35 erlaubte die Synthese von Deoxyoligonukleotiden, die bestimmten Regionen der LelF mRNS komplementär waren. Die beiden tryptischen Peptide Tl und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12 -¾ - 14 - bzw. 4 Undecameren erforderte, um alle möglichen Nucleotid-sequenzen zu erfassen (Figur 1). 4 Sätze von Deoxynukle-otidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3 (T-lA, B, C, D) oder ein (T-13A, B, C, D) Oligo- 5 nucleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxy-kt oligonucleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriestermethode (Créa et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. TJi, 5765-5769 [1978]). In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt.

10 Die zwölf T-l Sonden wurden in vier Pools zu 3 Sonden, wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.

Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-l Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, 15 wurden verwendet, um die Synthese radiomarkierter ein- strängiger cDNS zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten. Die Matrizen-mRNS war entweder 12S RNS von mit

Sendai-Virus induzierten KG-1 Zellen (8000 Einheiten IF-

Aktivität per ug) oder gesamte Poly(A)-mRNS aus nicht 32 20 induzierten Leukozyten ( 10 Einheiten pro pg). P-mar- kierte cDNS wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (Noyes et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 1770-1774 [1979]). Die 60 μΙ-Reaktionen wurden durchgeführt in 20mM Tris-HCl (pH 25 8,3), 20mM KCl, 8mM MgC^-und 30mM ß-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 ug jedes Starters (d.h. 12 ug insgesamt für die T-l Serie, 4 pg insgesamt für die T-13 Serie), 2 ug induzierter 12S mRNS (oder 10 ug nicht induzierter Poly (A)-mRNS), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 uCi (ct32P)dCTP 30 (Amersham, 2-3000 Ci/mmole) und 60 Einheiten reverser 3Γ Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Das Pro- dukt wurde von nicht-markiertem Material durch Gelfiltra-V tionen an einer 10 ml-Sephadex G-50 Saule getrennt, 3 0

Minuten bei 70°C mit 0,3N NaOH, zur Zerstörung der RNS, 35 behandelt und mit HCl neutralisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al. (Nucleic Acids Res. _7, 1541-1552 [1979]) beschrieben, durchgeführt.

- 15 - E. Identifizierung der Klone pLl-pL30

Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Res.

1_, 1513-1523 ( 1979), zur schnellen Isolierung von 5 Plasmiden wurde verwendet, um lug Plasmid-DNS aus jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten (vergleiche C) zu gewinnen. Jede DNS-Probe wurde dena- & turiert und auf Nitrocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al. (siehe oben), 10 aufgebracht.

Die drei Sätze der Nitrocellulosefilter, die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert mit 15 a) induzierter cDNS, gestärkt mit einem T-l Startersatz, b) T-13 gestarteter induzierter cDNS und c) nicht induzierter cDNS, hergestellt unter Verwendung 20 beider Startersätze. Klone wurden als positiv angesehen, wenn sie stärker hybridisierten mit einer oder beiden der induzierten cDNS-Sonden als mit der gesamten nicht induzierten Sonde. 30 positive Klone (pLl-pL30) wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesucht.

25 F. Identifikation der Klone pL-31-pL39.

Isolierung eines Plasmids (Nr. 104), das ein LelF-Gen-fragment enthielt.

30 Transformanten von E. coli x 1776 wurden nach der '* Koloniehybridisierungsmethode von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]) ge- - 3 2

testet, unter Verwendung von P-markierter induzierter mRNS

als Sonde (Lillenhaug et al. , Biochemistry, 1_5, 1858-1865 35 [1976]). Nichtmarkierte mRNS von nicht-induzierten Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200:1 gemischt, 32 um zu konkurrieren mit in dem P-markierten Praparat vorhandener nicht-induzierter mRNS. Die Hybridisierung markierter ψ- - 16 - mRNS sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Transformanten wurden erhalten: 32 5 (1) 2-3% der Kolonien hybridisierten sehr stark mit P- 4» mRNS, (2) 10% hybridisierten signifikant schwächer als die erste Klasse und 10 (3) der Rest lieferte kein erkennbares Hybridisierungs-signal.

Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2)) wurden 15 auf die Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-mRNS an Plasmid-DNS beruht. Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (1)) individuell in 100 ml M9-Medium, das ergänzt war mit Tetra-20 cyclin (20 ug/ml), Diaminopimelinsäure (100 pg/ml), Thymidin (20 ug/ml) und d-Biotin (1 ug/ml), gezüchtet. Das M9-Medium enthält pro Liter: Na2HP04 (6g), K^PC^ (3g), NaCl (0,5 g) und NH^Cl (1 g). Nach Autoklavieren wurde 1 ml steriles IM MgSO^ und 10 ml steriles 0,01 M CaC^ zugesetzt. Jeweils > 25 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefasst und die Plasmid-

DNS wurde, wie von Clewell et al., Biochemistry 9_, 4428-440 [1970], beschrieben, isoliert. 10 ug jedes Plasmid-DNS-Pools wurden mit Hindlll gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papier (Diazobenzyloxymethylpapier) ge-30 bunden. 1 pg gereinigter mRNS aus induzierten Zellen wurde ^ an jedes Filter hybridisiert. Nicht-hybridisierte mRNS

wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRNS wurde eluiert und in Xenopus laevis Oozyten überführt. In diesem Assay waren alle sechs Pools negativ.

35 Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2)) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs Pools hybridisierte einer (K10) jedesmal, wenn er ge- •Λ - 17 -

prüft wurde, signifikant stärker als die übrigen. Um den spezifischen Interferon-cDNS-Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool K10 zusammengefassten neun Kolonien Plasmid-DNS hergestellt und individuell geprüft. Zwei der , 5 neun Plasmide (Nr. 101 und 104) banden Interferon-mRNS

stärker als die anderen. Aus dem Plasmid Nr. 104 wurde ein besonderes Bgl II-Restriktionsfragment, das 260 Basen- ^ 3 2 paare enthielt, isoliert, P-markiert nach der von Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), beschriebe benen Methode und als Sonde verwendet, um 400 E. coli 294-Transformanten nach einem in situ-Kolonie-Screeningver-fahren (Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]) zu testen. Neun Kolonien (pL31-pL39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Masse 15 mit dieser Sonde hybridisierten.

Zusätzlich wurde das markierte 260-Basenpaar-Fragment verwendet, um 4000 E. coli 294-Transformanten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiziert wer-20 den, die in unterschiedlichem Masse mit dieser Sonde hybridisierten. Eine enthielt das LelF G-Fragment, eine enthielt das LelF H-Fragment und eine enthielt ein Fragment, das als LelF Hl bezeichnet wurde (offensichtlich ein Allel von LelF H). Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, 25 wurden "LelF G", "pLelF H", usw., bezeichnet.

G. Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LelF Gens.

20 Plasmid DNS wurde aus allen 39 potentiellen LelF- ί cDNS-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen .:'g 260 Basenpaare-enthaltenden DNS-Sonde getestet, unter Ver-

Wendung des Hybridisierungsprozederes von Kafatos et al. (siehe oben). Drei Plasmide (pL4, pL31, pL34) gaben sehr 35 starke Hybridisierungssignale, vier (pLl3, pL30, pL32, pL36) hybridisierten mittelmässig, während drei (pL6, pL8, pLl4) nur schwach mit der Sonde hybridisierten.

- 18 -

Die 39 potentiellen LelF cDNS Rekombinant-Plasmide 32 wurden ebenfalls unter Verwendung der P-markierten synthetischen Undecameren (individuelle T-l Starterpools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden ge-5 testet. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausge- 4Ç- wählt, dass eine perfekte Basen-Paarung notwendig war, um feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 [1979]). Auf diese Weise wurde Plasmid-DNS aus den 39 Klonen nach einer Stan-10 dardmethode (Clewell et al., siehe oben) hergestellt und mittels Biorad Agarose A-50 Säulenchromatographie gereinigt. Proben von je 3 pg jedes Präparats wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, mit Alkali denaturiert und auf 2 Nitrocellulosefilter getüpfelt (1,5 ug/Fleck) 15 wie von Kafatos et al., (siehe oben) beschrieben. Die individuellen synthetischen Deoxyoligonucleotid-Starter 32 und Starterpools wurden mit (γ P)ATP folgendermassen phosphoryliert: 50 pmol Oligonucleotid und 100 pMol 32 γ P ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden 20 mit 30 μΐ 50 mMol Tris-HCl, 10 mMol MgC^ und 15 mMol ß-Mercaptoethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T4

Polynucleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Minuten bei 32 37°C wurden die P-markierten Starter durch Chromato- ® graphie an 10 ml Sephadex G-50-Saulen gereinigt. Die Ä 25 Hybridisierungen wurden unter Verwendung von 10° cpm

Starter T-13C oder 3xl06 cpm Starterpool T-1C durchgeführt und zwar bei 15°C während 14 Stunden in 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2], 10 x Denhardt's Lösung [0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% 30 Polyvinylpyrolidon, 0,2% Ficoll], wie von Wallace et al. (siehe oben) beschrieben. Die Filter wurden während 5 Minuten bei 0°C in 6 x SSC gewaschen, getrocknet und Röntgen- .32 film ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 fur P-Starterpool T-13C und Starter T-lC dargestellt.

Die Plasmid-DNS aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-lC und Starter T-13C, während Hybridisation mit den anderen Undecameren nicht 35 - 19 - festgestellt werden'konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LelF-Plasmide (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) mit diesen beiden Sonden. Die Restriktionsanalyse zeigte jedoch, dass nur 5 1 der Plasmide, pL31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes

BglII-Fragment enthielt. Pstl-Behandlung von pL31 zeigte, dass die Grösse des cDNS-Abschnittes etwa 1000 Basenpaare war.

10 Der gesamte Pstl Abschnitt von pL31 wurde sowohl nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert (Methods Enzymol.

65, 499-560 [1980]) wie nach der Dideoxy-Kettenbruchmethode (Smith, Methods Enzymol. ^5, 560-580 [1980]) durchgeführt, nachdem die Sau3a-Fragmente in einen Ml3-Vektor unter-15 kloniert worden waren. Die DNS-Sequenz ist in Figur 3 ("A") gezeigt. Aus dieser Sequenz wurde die gesamte Aminosäuresequenz des LelF A vorhergesagt, einschliesslich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Translations-Start-codon befindet sich 60 Nukleotide vom 5'-Ende der Sequenz 20 entfernt und wird nach 188 Codons von einem TGA Stop- triplett gefolgt. Es gibt 342 nicht übersetzte Nucleotide am 3'-Ende, die schliesslich von einer Poly (A)-Sequenz gefolgt werden. Das mutmassliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem LelF aus Leukozyten) 25 ist 23 Aminosäuren lang. Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife LelF A hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390. Der Figur 4 kann entnommen werden, dass die trypti-schen Peptide T-l und T-13 den Aminosäuren 145-149 und 57-61 des LelF A entsprechen. Die tatsächlichen DNS-Sequenzen, 30 die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden ^ durch den Starterpool Tl-C und den Starter T13-C (Figur 8) dargestellt).

35 - 20 - H. Direkte Expression von reifem Leukozyten-Interferon Ά (LelF ä) 1. Allgemeines 5

V

Die Methode, nach der das reife LelF A direkt expri-miert wurde, ist eine Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]), insofern es eine Kombination 10 von synthetischer (N-terminal) und komplementärer DNS darstellte.

ψ

Wie in Figur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LelF A eine Sau3a-Restriktionsendo-15 nuclease-Stelle. Es wurden 2 synthetische Deoxyolinucleo-tide geschaffen, die einen ATG-Translations-Startcodon enthalten, den Codon für die Aminosäure 1 (Cystein) wiederherstellen und ein EcoRI kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, 20 das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt. Das entstandene 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde an 2 zusätzliche DNS-Fragmente gehängt, so dass ein künstlich-natürliches Hybridgen aus 865 Basenpaaren entstand, das LelF A kodierte und welches durch EcoRI- und Pstl-Restriktions-25 stellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die EcoRI-und Pstl-Restriktionsstellen des Plasmids pBR322 eingefügt und lieferte das Plasmid pLelF Al.

2. Konstruktion des Tryptophan-Kontrollelements 30 (enthaltend den E. coli trp Promoter, Operator und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle ohne die ATG-Seguenz für den Translationsbeginn).

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon 35 mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al., J. Baterio-logy 133, 1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im fol- - 21 - genden LE1 genannt), sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20 pg) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente 5 wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus 'y.

einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 pg der aus pGMl erhaltenen 10 DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten DNS-Ligase in

Gegenwart von 200 pMol des 51-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 μΐ T^ DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgC^, 5 mMol Dithiothreit) bei 4°C über Nacht behandelt. Die Lösung 15 wurde dann 10 Minuten auf 70°C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5% Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei grössten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst 20 mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 x TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der a 25 Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na2EDTA in 1 Liter ^0). Die wässrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung 30 in wässriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator Ç- enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die ^ darin besteht, dass man Fragmente in ein Tetracyclin-empfind liches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-35 Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids 3 - 22 -

Res. j5, 3267-3287 [1979]) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyclin-5 empfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.

10 / 15 / 20 / 25 / 30 / vt / 35 / - 23 - pBRHl wurde mit EeoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion enfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem ^ 5 der drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit DNS-Ligase,wie bereits beschrieben verbunden. Die DNS des Reaktionsgemischs wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Ü.S.A. 71, 3455-3459 [1974]) 10 verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)»

Platten gebracht,die 20 pg/ml Ampicillin und 5 pg/ml Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tretacyclin-resti-stente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktions-15 enzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.

Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 28l, 544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 μΐ 25 E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 μΐ Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7-4, 7 mM MgC^, 1 mM ß-Mercaptoethanol),enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, während 30 Minuten bei 0°C und 2 Stunden bei 37°C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle 30 folgendermassen verändert : k 5' CTAGA — 5’ CTAGA — 3' T — **" 3’ TCT —

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plasmidfragment wurde vom - - 24 - te kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 Ug) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 5 0,01 pg) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes: — T CTAGA--- — TCTAGA— ~ -- AGC + TCT--- —AGCTCT— 10 mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T-C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294—Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, 15 dass sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise: - TCTAGA - -TCTAGA - 20 — AGCTCT - — AGATCT -

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterolo-, 25 ger Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 28l, 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon^ bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons 30 und 153 Aminosäurecodons,die von cDNS über reverse-Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 ug pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI 35 und E. coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment,sowie dTTP und dATP,wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

' - 25 -

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Frag- ment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetra- cyclineresistenz-verleihenden Strukturgens,aber es fehlt ihm „ 5 das Tetracyclin Promoter-OperatorrSystem, so dass, wenn es « anschliessend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde 10 nach dem Klenow-Polymerase I -Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

; 15 Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und 20 dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt und das entstandene gross Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besass ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombi- 3 25 nation in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbun-30 den unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen;die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal-und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt: 35

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang -TCTAG AATTCTATG- -TCTAGAATTCTATG- + - -AGATC TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC- _*=_2<5—

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promoter) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend r 5 konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression 'in des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde ' in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB- 1 Platten, die 5 pg/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert.

10

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution erhalten, das den trp-Promoter, Operator und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, dem aber eine . 15 ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DNS-

Fragment wurde in die EcoRI-Spaltstelle von pLelF A kloniert. Expressionsplasmide, die das so modifizierte trp-Regulon (E. coli-Operon, dem die Attenuator-Sequenz fehlt, so dass die Expression erhöht ist) können bis zu vorgegebenen Konzentra- or) tionen herangezüchtet werden in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promoter-Operatorsystem zu unterdrücken. Wird dann das Tryptophan entzogen und das System entblockiert, so wird das gewünschte Produkt exprimiert.

’ ! 25 j Im vorliegenden Fall und wie in Figur 6 dargestellt, wurden 250 pg des Plasmids pL31 mit Pstl behandelt und das , 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelelektrophorese an einem 6% Polyacrylamidgel isoliert. Es wurden etwa 40 pg des Teilstücks aus den Gel durch Elektroelution erhalten und 30 m 3 gleiche Teile für die weitere Behandlung aufgeteilt: a) Eine 16 pg-Probe des Fragments wurde teilweise gespalten mit 40 Einheiten von Bglll während 45 Minuten bei 37°C und das r Reaktionsgemisch wurde an einem 6% Polyacrylamidgel gereinigt.

Etwa 2 pg des gewünschten 670 Basenpaare-enthaltenden Frag-35 ments wurden erhalten, b) Eine andere Probe (8 pg) des 1000 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bruchstücks wurde mit Avall und Bglll behandelt. 1 pg des in Figur 6 gezeigten 150 Basenpaare - 27 - enthaltenden Fragments wurden nach Gelelektrophorese erhalten. c) 16 μβ des 1000 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden mit Sau5a und AvaII behandelt. Nach Elektrophorese an 10% Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 μg (10 pMol) des 54 Basen-5 paare-enthaltenden Fragments erhalten..Die zwei angegebenen Deoxyolinucleotide, 5'-dAATTCATGTGT (Fragment l) und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriesterme-thode synthetisiert. Das Fragment 2 wurde folgendermassen phosphoryliert : 200 μ 1 (etwa 40 pM) von (γ-^Ρ) AIP (Amersham, 1Ö 5000 Ci/mM) wurden zur Trockne gebracht und in 50 μΐ 60 mM Tris-HCl (pH 8), lOmM MgCl2, 15 niM ß-Mercaptoethanol, 100 pM des DNS-Fragments und 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase re-suspendiert. Nach 15 Minuten bei 57°C wurde 1 μΐ lOmM ATP hinzusetzt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. 15 Das Gemisch wurde dann während 15 Minuten auf 70°C erwärmt, mit 100 pM des 51-OH-Fragments 1 und 10 pM des 54 Basenpaare-enthaltenden Sau5a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4°C während 5 Stunden in 50 ml 20mM Tris-HCl (pH 7,5), lOmM Mg Cl^, lOmM Dithiothreit, 0,5mM ATP und 10 20 Einheiten T4 DNS-Ligase hergestellt. Das Gemisch wurde der Elektrophorese an einem 6% Polyacrylamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde durch Elektroelu-tion erhalten. Etwa 50 ng (1 pM) des 45 Basenpaare-enthaltenden Produkts wurden mit 0,5 ug (5 pM) des 150 Basenpaare-ent-25 haltenden Avall - BglII-Fragments und 1 μg (2 pM) des 670 Basenpaare-enthaltenden Bglll - Pstl-Fragments vereint. Die Bindung wurde bei 20°C während 16 Stunden unter Verwendung von 20 Einheiten T4 DNS-Ligase hergestellt. Die Ligase wurde dann durch Erhitzen auf 65°C während 10 Minuten inaktiviert und 50 das Gemisch wurde mit EcoRI und Pstl behandelt zwecks Spaltung von Polymeren des Gens. Das Gemisch wurde dann durch ««' PAGE (6 %) gereinigt. Es wurden etwa 20 ng (0,04 pM) des 865 Basenpaare-enthaltenden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Spaltstellen von pBR522 (0,5 jig) eingefügt. Die Transformation von E, coli 294 lieferte 70 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transf ormant en.

- 28 -

Die aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNS wurde mit EcoRI und Pstl behandelt. 16 der 18 Plasmide be-sassen ein EcoRI - Pstl-Fragment, das 865 Base paare lang war. 1 pg eines dieser'Plasmide (pLelF Al) wurde mit EcoRI

5 behandelt und an das 300 Basenpaare enthaltende EcoRI-

Fragment (0,1 jig), das den E. coli trp-Promoter und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, gebunden. Die den v trp-Promoter enthaltenden Transformanten wurden unter Ver wendung einer trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness Kolonie- 10 Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dem trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in der Richtung des LelF A-Gens orientiert war.

15 I. In vitro und in vivo Aktivität von LelF A

Extrakte für den IF-Assay wurden folgendermassen hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden inL-Brühe, enthaltend 5 jug/ml Tetracyclin, bis zu einem A^^Q-Wert von etwa 1,0 auf- 20 gezogen, dann mit 25 ml M9-Medium, enthaltend 5 pg/ml Tetra--cyclin verdünnt. Wenn der A^^Q-Wert 1,0 erreicht hatte, wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8,0 und 50 mM EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt und nach 5-e 25 minütiger Aufbewahrung bei 0° C wurden die Zellen durch

Ultrabeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15,000 U/Min) und die Interferon-Aktivität im Ueberstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LelF-Standard nach dem . CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von IF-Molekülen pro o 30 Zelle wurde eine spezifische LelF-Aktivität von ^ x 10° Ein-heiten pro mg verwendet.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, liefert Klon pLelF A trp 25, in dem der trp-Promoter in der richtigen Richtung orientiert

Q

35 ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 x 10 Einheiten pro Liter). Wie in Tabelle 2 gezeigt, verhält sich das von E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF A trp 25 hergestellte Interferon wie authen- - 29 - tisches Human-LelF; es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper neutralisiert.

Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20,000.

4 5

Der Nachweis von in vivo-Aktivität von Interferon macht die Gegenwart von Makrophagen und natürlichen Killer-

•kV

zellen (NK) notwendig, und es scheint dass diese Zellen stimuliert werden. Es war daher möglich, dass das von E. coli 10 294/pLeIF A 25 produzierte Interferon, das im Zellkultur-Assay antivirale Aktivität zeigte, an infizierten Tieren inaktiv ist.

Ferner ist es durchaus möglich, dass sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosy- Üerten LelF A von der des glykosylierten Interferons, das aus 15 menschlichen Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet. Es wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell hergestelltem LelF A (2 % rein) und von aus, Leukozyten isoliertem LelF (8 % rein) miteinander verglichen und zwar an Hand der lethalen Enzephalomyocarditis (EMC) bei Totenkopfäffchen 20 (Tabelle 3)·

Tabelle 1: Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli ·= 25 E. coli K-12

Stamm 294 Zelldichte IF-Aktivität LelF-Mole- tranformiert ( „ Ί, , , Λ küle pro durch (Zellen/ml) E/ml Kultur Ζθ11β pLelF A trp 25 3,5 x 108 36,000 9,000 30 pLelF A trp 25 1,8 x 109 250,000 12,000 35 - 30 -

Tabelle 2: Vergleich der Aktivität von Extrakten aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit Standard-LelF *)

Interferon-Aktivität (E/ml) 5 ____ ~ Kanichen-anti- unbehandelt pH 2 Human-Leukozyten-

Antikörper 294/pLeIF A trp 25- 500 500 < 10 10 Extrakt

LelF-Standard 500 500 < 10 *) Der 250,000 E/ml enthaltende Extrakt von E. coli 294/ pLelF A trp 25,der in Tabelle 1 beschrieben wird, wurde auf 15 das 500-fache verdünnt mit Minimalmedium,so dass er eine spezifische Aktivität von 500 E/ml aufwies. Ein vorher gegen NIH-Leukozyten-Interferon-Standard titrierter Leuko-cyten-Interferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500 E/ml verdünnt. Aliquote 20

Teile (jeweils 1 ml) wurden mit 1 H HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4°C inkubiert, durch Zusatz von NaOH neutralisiert und die IF-Aktivität nach dem Standard- CPE-Hemmtest bestimmt < Aliquote Teile (25 }il) der 500 E/ml-Proben(unbeha&delt)

wurden mit 25 ul Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Interferon Ä 25 O

während 60 Minuten bei 37 C inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 x g während 5 Minuten und der Ueberstand getestet.

30 -* ' 35 * - 31 - i

Tabelle 3: Antiviraler Effekt verschiedener LelF-Präparate gegen EMC Virus -Infektionen bei Totenkopfäffchen , '5 Deber·- Serum PFU/ml

Behandlung lebende ----

Tag 2 Tag 3 Tag 4 "l .

V _______ __________

Kontrolle 0/3 10 λ 3χ104} 105j IO (Bakterienpro- 0 >3 0 llO^ 1,200 v3-4xlO^ teine) 0 J 0 J 0 j

Bakterielles

LelF A 3/300 0 0 0 0 0 0 0 15

LelF-Standard 3/300 0 0 0 0

Alle Affen waren männlichen Geschlechts (mittleres 20 Gewicht 713 g) und besassen keine EMC Virus-Antikörper vor der Infektion. Die Affen wurden intramuskulär mit 100 x LDcrv 50 EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Kontrolltiere starben 134, 158 und 164 Stunden nach der Infektion. Die g

Interferon-Behandlung mit 10° Einheiten erfolgte intravenös 25 und zwar -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 und 240 Stunden nach der Infektion. Bei dem bakteriellen Leukozyten-Interferon handelte es sich um eine Säulenchromatographie-Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit einer spezifischen Akti- g vität von 7,4 x 10υ E/mg Protein. Die bei den Kontrollen 30 verwendeten Bakterien-Proteine waren der Säulenfraktion * des Lysats von E. coli 294/pBR322 bei doppelter Gesamtprotein konzentration äquivalent. Bei dem Leukozyten-Interferon-Standard handelte es sich um durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen menschlichen Zellen, das chromato- g 35 graphisch auf eine spezifische Aktivität von 32 x 10° E/mg Protein gereinigt war.

" - 32 -

Die Kontrolltiere verloren das Gleichgewichttzeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmassen und wässerige Augen, beginnend etwa 8 Stunden vor dem Tod. Die mit Interferon behandelten Affen zeigten keine die-^ ser Abnormalitäten: sie blieben während der gesamten Zeit aktiv und entwickelten keine Yirämie. Der eine Affe der Kon-^ trollgruppe, der innerhalb von 4 Tagen keine Virämie ent wickelte, starb zuletzt (l64 Stunden nach der Infektion), 10 aber zeigte nach dem Tode hohe Virus-Titer im Herzen und Gehirn. Die Interferon-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigen somit, dass der antivirale Effekt der LeIF-Präparate an den infizierten 15

Tieren lediglich der Wirkung des Interferons zugeschrieben werden kann, da die kontaminierenden Proteine des bakteriellen und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig unterschiedlich sind. Ausserdem deuten die Ergebnisse darauf-2Q hin, dass für eine in vivo antivirale Aktivität von LelF A eine Glykosylierung nicht notwendig ist.

25 y/ 30 >/ 35 - 33 - J. Isolierung von cDNS für weitere Leukozyten-Interferone DNS aus dem Plasmid, das DNS für das vollständige

LelF A enthält, wurde mit Pstl herausgeschnitten, elektro- 32 - 5 phoretisch isoliert und mit P markiert. Die erhaltene radioaktiv markierte DNS wurde als Sonde für das Screening von zusätzlichen E. coli 294-Transformanten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in Teil C beschrieben, erhalten wurden [nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von 10 Grunstein und Hogness (siehe oben)]. Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert. Plasmid-DNS aus diesen Kolonien sowie aus den zehn hybridisierenden Kolonien, die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit Pstl herausgeschnitten und nach drei verschiedenen 15 Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese Pstl-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit der Restiktions-Endonucleasen Bglll, PvuII und EcoRl entstanden, charakterisiert. Die Analyse erlaubte die Klass-Klassifizierung von mindestens acht unterschiedlichen 20 Typen (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F,

LelF G und LelF H), dargestellt in Figur 5, wie einen Ueberblick über die Lage der verschiedenen Restriktionsstellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LelF A gibt. Ein Typ von 25 diesen, LelF D, ist anscheinend identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980), beschriebenen LelF.

Ferner wurden verschiedene DNSs mit dem von Cleveland 00 et al. (Cell 2Q_, 95-105 [1980]) beschriebenen Hybridisations-s Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigkeit, LelF-mRNS

selektiv von Poly-A enthaltender RNS aus KG-1 Zellen zu entfernen. In diesem Test waren LelF A, B, C und F positiv. Schliesslich wurden letztere Pstl-Fragmente in Plasmide 35 eingefügt, E. coli 294 wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden exprimiert. Die expri-mierten Produkte, von denen man annahm, dass sie Präinter-ferone wären, waren im CPE-Assay auf Interferon-Aktivität - 34 - alle positiv, wobei nur das LelF F-Fragement geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alle LelF-Typen sequenziert.

r 5k. Direkte Expression eines zweiten reifen Leukozyten interferons (LelF B)

Die Sequenz des isolierten DNS-Fragements, welches das Gen für reifes LelF B enthält, zeigt, dass die ersten 10 vierzehn Nucleotide für LelF A und B identisch sind. Folglich wurde ein Fragement aus pLelF A25, das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und den Beginn des LelF A (=B)-Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Expressions-Plasmid 15 kombiniert. Die Restriktionskarten für die Pst-Fragmente von pL4 (ein Plasmid, enthaltend das LelF B-Gen aus Figur 5) und pLelF A25 sind in den Figuren 7a und 7b dargestellt.

Um das etwa 950 (=Basenpaare) lange Sau3a-Pstl-Frag-20 ment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in diesem Bereich liegender Sau3a-Restriktionsstellen. Es wurde folgendermassen vorgegangen: 25 1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert: a) 110 b.p. aus Sau3a-EcoRI; b) 132 b.p. aus EcoRI-Xba; c) 700 b.p. aus Xba-Pst.

30 * 2. Die Fragmente (la) und (1b) wurden miteinander ver bunden und mit Xba und Bglll behandelt, um Selbstpoly-merisation über die Sau 3a- und Xba-Enden zu verhindern (die entsprechende Sau3a-Spaltstelle lag innerhalb einer 35 Bglll-Spaltstelle; Bglll-Schnitte hinterlassen ein Sau3a · kohäsives Ende). Es wurde ein 242 b.p. enthaltendes Fragment isoliert.

- 35 - 3. Das Produkt von (2) wurde mit (lc) verbunden und mit Pstl und Bglll behandelt, wieder um Selbstpolymerisation zu verhindern. Ein etwa 950 b.p. enthaltendes Fragment, Sau 3a-Pstl (siehe Figur 7a) wurde isoliert. Dieses r 5 Fragment enthielt denjenigen Teil des LelF B-Gens, der v keine Entsprechung beim LelF A hatte.

J * 4. Ein etwa 300 b.p. enthaltendes Fragment (Hindlll-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomen- 10 bindungsstelle, das ATG-Startsignal und den Cystein-Codon von LelF A enthielt, wurde aus pLelF A25 isoliert.

5. Ein etwa 3600 b.p. enthaltendes Fragment (Pstl-Hindlll) wurde aus pBR322 isoliert. Es enthielt das 15 Replikon, das Tetracyclin-Resistenz, nicht aber Ampicillin-Resistenz kodiert.

6. Die Fragmente, die gemäss 3, 4 und 5 erhalten wurden, wurden miteinander verbunden und mit dem resul- 20 tierenden Plasmid wurde E. coli K-12 Stamm 294 transformiert.

Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Birnboim et al. , Nucleic Acids Res. _7, 1513-1523 [1979]) 25 und Plasmidproben wurden mit EcoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Ein EcoRI-EcoRI trp Promoter-Fragment; 2) das innere EcoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment vom Translations-Startsignal bis zur EcoRI-Spaltstelle von pL4.

30 5 Im CPE-Assay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, g

Aktivitäten von 10 x 10 Einheiten Interferon pro Liter bei Aj-j-q = 1. Ein repräsentativer Klon, der in dieser 35 Weise hergestellt wurde, ist E. coli 294/pLeIF B trp 7.

t

U

- 36 - L. Direkte Expression weiterer reifer Leukozyten Interferone (LelF C, D, F, H, I und J)

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen 5 LelF-Typen können geschneidert und in Vektoren eingebaut •U' werden zwecks Expression in Analogie zu der für das LelF A beschriebenen Weise. Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden, ob eine Restriktionsstelle genügend nahe an dem ersten 10 Aminosäurecodon des reifen Interferons liegt, so dass die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LelF A verwendet werden kann, d.h. die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restriktionsschnitt und Ersatz der aminoendständig zusammen mit der Präsequenz verlorenen 15 Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNS-Fragments. Sollte dies nicht der Fall sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an 'der Stelle abgetrennt, an der der Codon für die erste Aminosäure des 20 reifen Polypeptids beginnt, und zwar dadurch, dass 1. in der Umgebung dieses Punktes die doppel-strängige DNS in einsträngige DNS übergeführt wird; < 25 2. die im ersten Schritt gebildete einsträngige Region mit einer komplementären Starter-Sequenz einer einsträngigen DNS hybridisiert wird, deren 51-Ende gegenüber dem Nukleotid.liegt, das an 30 die beabsichtigte Spaltstelle grenzt; 1 derjenige Teil des in 31-Richtung des Starters --- liegenden zweiten Stranges, der in (1) eli miniert wurde, durch Umsetzung mit DNS-Poly- 35 merase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-haltigen Deoxynucelotid-triphos-phaten wieder hergestellt wird und - 37 - 4. die verbleibende einsträngige DNS-Sequenz, die über die beabsichtigte Spaltstelle hinausreicht, abgebaut wird.

'[ 5 Eine kurze synthetische DNS-Sequenz, die am 3'-Ende des kodierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann verbunden werden, z.B. über stumpfe Enden, mit dem zurechtgeschnittenen Gen für die reifen Interferone. Die Gene können in ein Plasmid eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters und seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden.

In ähnlicher Weise, wie es in Abschnitt K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente, die für LelF C und , 15 LelF B kodieren aufgebaut, zwecks direkter Expression in

Bakterien. Bei der Strategie, die zur Expression dieser weiteren Leukozyten-Interferone führte, wurde in jedem Falle auf das etwa 300 Basenpaare-enthaltende Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die 20 Ribosomenbindungsstelle, das ATG Startsignal und den

Cystein-Codon von LelF A aus PLelF A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Fragment wurde kombiniert mit den Fragmenten anderer Interferone, die die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die auf den allen gemeinsamen Cysteinrest 25 folgen, kodieren. Jedes erhaltene Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet.

Für die einzelnen Gene waren folgende Schritte notwendig: 30

LelF C

_ v?

Isolierung der folgenden Fragmente aus pLelF C: (a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment 05 Sau 3a - Sau 96; (b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau 96 - Pst I; (c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-ent- - 38 - haltenden Fragments (Hind III - Sau3a) aus pLelF A-25, wie in Teil K (4) oben beschrieben; (d) Isolierung des etwa 3600 Basenpaare-ent-5 haltenden Fragments aus Abschnitt K (5) oben.

Konstruktion: (1) Verbindung von (a) mit (c). Spaltung mit Bglll, "10 Hindlll und Isolierung des etwa 335 Basenpaare-enthaltenden Produktes.

(2) Verbindung der unter (1), (b) und (d) erhaltenen Bruchstücke und Transformierung von E. coli mit dem re- 15 suitierenden Plasmid.

Ein repräsentativer Klon der auf diese Weise erhalten wurde, ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF C trp 35.

20 LelF D

Aus pLelF D wurden isoliert: 23 a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Sau3a-AvaII); b) ein 150 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Avall-Bglll) und c) ein etwa 700 Basenpaare-enthaltendes Fragment 30 (Bglll-Pstl).

Je'"

Aus pLelF A25 wurde isoliert: .¾.

d) ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment 33 (HindIII-Sau3a).

Aus pBR322 wurde isoliert: i - 39 - e) ein etwa 3600 Basenpaare-enthaltendes Fragment (HindlII-PstI).

Konstruktion r 5 (1) Die Verbindung von (a) mit (b), Spaltung mit BglII und Reinigung liefert ein 185 Basenpaare-enthaltendes Produkt.

10 (2) Die Verbindung von (1) mit (d), Spaltung mit

Hindlll und Bglll und Reinigung liefert ein etwa 500 Basenpaare enthaltendes Produkt.

(3) Die Fragmente (2), (c) und (e) wurden miteinander 15 verbunden und E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert.

Ein in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

20

LelF F

Bei der Konstruktion eines vollständigen LelF F Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons • 25 kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1-13 zwischen

LelF B und LelF F zunutze machen. Ein den trp Promotor enthaltendes Fragment (A) mit geeignet konstruierten Enden wird aus pHGH207 erhalten, das oben beschrieben ist, über die Behandlung mit Pst I und Xba I und anschliessende Isolierung 30 eines ca. 1050 Basenpaaren enthaltenden Fragments. Ein zwei-tes Fragment (B) steht in dem grösseren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHky 10 mit Pstl und Bglll entstandenen Fragmente zur Verfügung. Das Fragment A enthält etwa das halbe die Ampicillinresistenz kodierende Gen, während Frag-35 ment B den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die Tetracyclinresistenz bis auf den zugehörigen Promotor enthält. Die Fragmente A und B werden mittels T4 Ligase kombiniert und das erhaltene Produkt wird mit Xbal und Bglll - 40 - behandelt, um Dimerisierungen auszuschliessen. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promoter-Operator, sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz enthält.

g Ein Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaaren wird durch v Behandlung von pLelF F mit Avall und Bglll erhalten. Dieses

Fragment enthält die Codons für die Aminosäuren 14-166 von LelF F.

10 Ein Fragment (e) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von pLelF B mit Xbal und Avall erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1-13 von LelF F.

' Die Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von jg T4 Ligase miteinander verbunden. Die kohäsiven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, dass das entstehende Plasmid in der richtigen Weise gebildet wird, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz unter die Kontrolle des trp Promoter-Operators gebracht wird, zusammen mit dem 20 Gen für reifes LelF F, so dass die damit transformierten Bakterien auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistenz selektio-niert werden können. Ein auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLelF F trp 1.

25 LelF H

Das für die Expression von reifem LelF H geeignete Gen kann folgendermassen hergestellt werden: 30 1. Plasmid pLelF H wird der Behandlung mit Haell und

Rsal unterworfen und ein 816 Basenpaare-enthaltendes Fragment wird isoliert, welches, den Bereich von der Aminosäure 10 des Signalpeptids bis zur 3 1 nicht codierenden Region kodiert.

2. Das Fragment wird denaturiert und der Reparatursynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. ü5, 168 [1970]) unter- 35 - 41 - worfen, bei der der synthetische Deoxyribooligonucleotid-Starter 51-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird.

3. Das erhaltene Produkt wird mit Sau3a gespalten und 5 ein 452 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Amino- säuren 1-150 kodiert, wird isoliert.

4. Die Behandlung von pLelF H mit Sau3a und Pstl und die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthaltenden Frag-10 ments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert.

5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden Fragment 15 1 166

Met Cys Asp Stop ATG TGT .. |_ ... GAT TG A_____Pst I,

Sau3a , 20 das die 166 Aminosäuren des LelF H kodiert.

6. pLelF A trp 25 wird zunächst mit Xbal, dann mit DNA Polymerase I und schliesslich mit Pst I behandelt.

Das resultierende grosse Fragment kann isoliert und mit : 25 dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Plasmid, mit dem E. coli K-12 Stamm 294 oder ein anderes Bakterium transformiert werden kann, das dann in der Lage ist, reifes LelF H zu exprimieren.

30 LelF I

h

Die von Lawn et al. , (Cell JJ5, 1157 1978) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen R Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen untersucht, wobei die 35 von Lawn et al. (siehe oben) und Maniatis et al. (Cell 15, 687 [1978]) angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDNS des LelF A-Klons abgeleitete radioaktive LelF-Sonde wurde verwendet, um etwa 5000,000 Plaques zu testen. Sechs - 42 -

LelF-Klone wurden bei diesem Screening erhalten. Nach nochmaligem Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt.

5 Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode ·*> können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLelF-j Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet werden, um weitere Leukozyten-Interferon-Proteine gemäss der vorliegenden Erfindung herzustellen.

10 1. Das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRl-Fragment des Klons HLeIF2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in pBR325 kloniert. Das resultierende Plasmid LelF E wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthaltende Frag- , 15 ment isoliert. Das Deoxyoligonukleotid dAATTCTGCAG (ein

EcoRI - Pstl-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRl-Fragment gebunden und das resultierende Fragment mit Pstl gespalten, so dass man ein 2000 Basenpaareenthaltendes Fragment mit Pstl-Enden erhielt. Dieses wurde 20 mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus 1100 Basenpaaren wurde isoliert, welches ein Pstl- und ein Sau96-Ende be-sass.

2. Das Plasmid pLelF C trp 35 wurde mit Pstl und Xbal 25 behandelt. Das grosse Fragment wurde isoliert.

3. Das kleine Xbal - Pstl-Fragment aus pLelF C trp 35 wurde mit Xbal und Sau96 behandelt. Ein 40 Basenpaare-ent-haltendes Xbl-Sau96-Fragment wurde isoliert.

30 * 4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden zu dem Plasmid pLelF I trp 1.

LelF J 35 1. Das Plasmid pLelF J enthält ein aus 3800 Basen bestehendes Hindlll-Fragment des menschlichen Genoms, welches die LelF J Gensequenz umfasst. Ein 760 Basenpaare-enthal- - 43 - tendes Ddel - Rsal-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.

2. Das Plasmid pLelF B trp 7 wurde mit Hindlll und 5 Ddel gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes Hindlll-Ddel-Fragment isoliert.

) 3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pstl gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DNA-Poly- 10 merase I (Klenow Fragment) und schliesslich wurde mit Hindlll behandelt. Das grosse, etwa 3600 Basenpaare-ent-haltende Fragment wurde isoliert.

4. Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden mitein-15 ander verbunden zu dem Plasmid pLelF J trp 1.

M. Reinigung

Der Leukozyten-Interferon-Gehalt von Bakterienextrakten 20 kann durch die folgenden Massnahmen in der angegebenen Reihenfolge erhöht werden: 1. Polyethyleniminfällung, bei der der grösste Teil der cellularen Proteine, einschliesslich des Interferons, 25 im Ueberstend verbleibt.

2. Amoniumsulfatfraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55% mit Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt.

30

i" 3. Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M

Kaliumphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und Dialyse gegen -t 25 mM Tris-HCl (pH 7,9), wobei die Interferonaktivität in der Lösung bleibt. 1 35

Chromatographie des Ueberstandes, auf ein pH von

8,5 eingestellt, an einer DEAE-Cellulose-Säule (Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 25 mM

- 44 -

Tris-HCl, pH 8,5).

5. Adsorption an' Cibachrom Blau-Agarose bzw. Hydroxyl-apatit und Elution mit 1,5 M KCl bzw. 0,2 M Phosphatlösung *.. 5 (fakultativ).

i- 5. Fraktionierung an einer Sephadex G-75 Saule.

7. Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose 10 in 25 mM Ammoniumacetat bei pH 5,0 mit einem Ammoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Ammoniumacetat).

Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren erhält man ein Material von einer Reinheit mit über 95%.

15

Das Material kann auch gereinigt werden durch Grössenausschluss-Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-8) oder Affinitätschromatographie an immobilisierten Antiinterferon-Antikörpern.

20

Ferner kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243, 66 (1980) beschrieben, hergestellt wird und mit 0,2 M Essigsäure, 0,1% Triton und 0,15 M NaCl eluiert werden.

In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das er-findungsgemäss erhaltene Interferon folgendermassen gereinigt werden: 30 1. Gefrorenes Zellmaterial wird mechanisch zerkleiniert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen Volumen des Puffers A, enthaltend 0,1 M Tris (pH 7,5-8,0), pH 7,5-8,0), 10% (w/v) Saccharose, 0,2 M NaCl, 5mM EDTA, 55 0,1 mM PMSF und 10-100 mM MgC^, suspendiert. Die Suspension wird dann 2 x bei 4°C unter einem Druck von etwa 400 und weniger als 70 Atmosphären durch einen Homogenisator gegeben und schliesslich in einem Eisbad gekühlt.

- 45 - 2. Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenimin bis zu einer Konzentration von etwa 0,35% zugesetzt. Das Gemisch wird stehengelassen und die Feststoffe werden durch Zentrifugieren und Filtration getrennt. Bei diesem Schritt •4; 5 wird die Temperatur unter 10°C gehalten. Der Ueberstand (bzw. das Filtrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert.

Die Lösung wird notfalls noch einmal durch eine mikroporöse Membran filtriert.

10 3. Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler Antikörper bei einer Durchflussrate von 5-8 cm/ Stunde (z.B. 25-40 ml pro Stunde bei einem Säulendurchmesser von 2,6 cm) gegeben. Es wird mit dem etwa zehn- 15 fachen Säulenvolumen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5-8,5), 0,5 M NaCl und 0,2% eines Detergenzes, wie Triton X-100 enthält, gewaschen. Anschliessend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M NaCl und 0,1% eines Detergenzes, wie Triton X-100, enthält 20 gespült. Die Säule wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1% eines Detergenzes, wie Triton X-100, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden zusammengefasst und mit 1 N NaOH oder 1,0 M Tris-Base auf einen pH von etwa 4,5 gebracht.

25 4. Diese Fraktion wird dann auf einen Kationenaustauscher, beispielsweise Whatmann CM52-Cellulose, der vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Ammoniumacetat, pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurde, gebracht. Es 30 wurde dann mit dem Puffer so lange gewaschen, bis die UV-* Absorption im Eluat konstant war. Die Säule wurde dann mit 25 mM Ammoniumacetat/0,12 M Natriumchlorid eluiert und das Eluat wurde in üblicherweise aufgearbeitet.

35 Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. J78/ 1848-52 ( 1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Reinigung « - 46 - und Bindung der monoklonalen Antikörper an Affigel-10 wird im folgenden beschrieben.

Gewinnung und Reinigung monoklonaler Antikörper aus 5 Aszites-Flüssigkeit Fünf weibliche Balb/c Mäuse wurden jeweils mit 5-10 ^ 6 x 10 Hybriddomzellen aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) 10 wurden jeweils mit 5 x 10^ lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert.

Die Aszites-Flüssigkeit jeder Maus wurde gesammelt.

15 Die Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten mit 500-1000 x g und dann 90 Minuten mit 18000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Ueberstand wurde gefroren und bei -20°C aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde weitëres festes Material durch 90 minütiges Zentrifugieren mit 35000 Umdrehungen 20 pro Minute entfernt. Die von jeder Maus erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikörperbindungstest (Staehelin et al. , siehe oben) getestet und, wenn möglich, zusammengefasst.

25

Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, dass in einer 1 cm-Küvette 1 mg Protein eine Absorption von 1,2 bei 280 nm lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit einem 30 hohen Antikörpergehalt enthielten 30-35 mg Protein/ml.

* Dies entspricht etwa 4-7 mg spezifischem Antikörper/ml.

Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3, 0,15 M NaCl) auf eine Proteinkonzentration von 10-12 mg/ml.

Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0°C unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Die Suspension 35 - 47 - wurde während 40-70 Minuten in Eis aufbewahrt, dann während 15 Minuten bei 4°C mit 10,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Ueberstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9)/0,04 M NaCl 5 (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16-18

Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers .. I dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa 30-35% des ursprünglichen Gesamtproteingehalts der Aszites-Flüs-10 sigkeit wurde wiedergefunden mittels Messung der Absorption bei 280 nm.

Eine Lösung, enthaltend 30-40 mg Protein/ml wurde dann auf eine DEAE-Cellulosesäule, die mit Puffer I äquilibriert 15 war, gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Säulenvolumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen NaCl-Gra-dienten (0,04 M - 0,5 M) in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem NaCl-Gehalt von 0,06-20 0,1 M wurden zusammengefasst, konzentriert und mit bei

Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt.

Es wurde zentrifugiert, der Proteinkuchen wurde in 0,2 M NaHCO^ (pH etwa 8,0)/0,3 M NaCl (Puffer II) gelöst und bei Raumtemperatur gegen diesen Puffer dialysiert. Die dia-25 lysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20,000 x g zentrifugiert und der Proteingehalt wurde auf 20-25 mg/ml mit Puffer II eingestellt.

Herstellung von Immunadsorbentien 30 * Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wassser gewaschen. Das Gel, das noch etwa 50% Wasser enthielt, wurde 35 in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert. Der Ueberstand wurde verdunstet. Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4°C Ende-über- - 48 -

Ende rotieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M NaHCO^/ 0,15 M NaCl) gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen. Die Proteinbestimmung zeigte, dass mehr als 5 90% des Antikörpers an das Gel gebunden worden war.

• Um noch freie, reaktive Bindungsstellen abzusättigen, wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gemischt und wahrend 60 Minuten bei Raum-10 temperatur Ende-über-Ende rotieren gelassen. Schliesslich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4°C in PBS in Gegenwart von 0,02% (w/v) Natriumazid aufbewahrt.

N. Parenterale Applikation 15

LelF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immunsuppresive Zustände aufweisen.

Die Dosierung der erfindungsgemässen Interferone kann sich 20 an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen

Materials, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wurde, g anlehnen und kann z.B. etwa 1-10 x 10 Einheiten pro Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die grösser ist 7 als 1%, bis zu etwa 5 x 10 Einheiten pro Tag betragen.

25

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man 3 mg bakteriell hergestelltes LelF mit einer spezifischen g

Aktivität von etwa 2 x 10 Einheiten pro mg in 25 ml 5 N 00 humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriolo-* gisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch g in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 x 10 Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20°C) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die er-findungsgemässe Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung 35 - 49 - der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

5

W

r 10 ; 15 20 25 30 m ' 35

Claims (25)

50. DS 4100/15

1. Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons ohne Präsequenz. 5 V

2. Polypeptide gemäss Anspruch 1, dadurch gekenn- r zeichhet, dass sie keine Glykosylgruppen enthalten.

3. Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines amino- 10 endständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons .

4. Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines amino-endständig um ein abspaltbares Konjugat oder mikrobielles

5. Polypeptide gemäss einem der Ansprüche 1-4 mit der Aminosäurepartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-

6. Polypeptide gemäss einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass sie die in Figur 4 in Zeile "All" angegebenen Aminosäuren an den angegebenen Stellen der Amino- 25 säuresequenz enthalten.

7. Ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1-6 aus der Gruppe der Human-Leukozyten-Interferone (LelF) A, B, C, D, F, H, I und J. 30

8. Human-Leukozyten-Interferon A (LelF A).

9. Human-Leukozyten-Interferon B (LelF B).

10. Human-Leukozyten-Interferon C (LelF C).

11. Human-Leukozyten-Interferon D (LelF D).

51. DS 4100/15

12. Human-Leukozyten-Interferon F (LelF F).

13. Human-Leukozyten-Interferon H (LelF H).

14. Human-Leukozyten-Interferon I (LelF I).

15. Human-Leukozyten-Interferon J (LelF J).

15 Signalprotein verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons .

16. Ein mikrobiell hergestelltes Polypeptid oder Human- Ί0 Leukozyten-Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-15.

17. Ein bakteriell hergestelltes Polypeptid oder Human- . Leukozyten-Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-15.

18. Ein durch E. coli hergestelltes Polypeptid oder Human-Leukozyten-Interferon gemäss einem der Ansprüche 1-15.

19. Eine DNS-Sequenz, die die Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons ohne Präsequenz codiert. 20

20. Eine DNS-Sequenz, die die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons codiert.

20 Glu-Ile-Met-Arg-Ser.

21. Eine DNS-Sequenz, die die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder mikrobielles Signalprotein verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons codiert.

22. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-21, * die eine die Aminosäuresequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg- Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser codierende Partialsequenz enthält.

23. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-21, 35 die Codons enthält, die die in Zeile "All" der Figur 4 angegebenen Aminosäuren an den entsprechenden Stellen der Aminosäuresequenz codieren.

52. DS 4100/15

24. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-23, die ein Polypeptid aus der Gruppe der Human-Leukozyten-Interferone (LelF) A, B, C, D, F, H, I und J codiert.

25. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon A (LelF A) codiert. \

26. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon B (LelF B) codiert. 10

27. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon C (LelF C) codiert.

28. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon D 15 (LelF D) codiert.

29. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon F (LelF F) codiert.

30. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon H (LelF H) codiert.

31. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon I (LelF I) codiert. 25

32. Eine DNS-Sequenz, die Human-Leukozyten-Interferon J (LelF J) codiert.

33. Eine DNS-Sequenz aus der Gruppe der Sequenzen A, B, 30 c, D, F und H der Figur 3.

34. Eine DNS-Sequenz aus der Gruppe der Sequenzen A, C, H, I und J der Figur 8.

35. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-34, die operabel verbunden ist mit einer DNS-Sequenz, die die mikrobielle Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1-15 bewirken kann.

53. DS 4100/15

36. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-34, die operabel verbunden ist mit einer DNS-Sequenz, die die bakterielle Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1-15 bewirken kann. 5 x«, i

37. Eine DNS-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 19-34, i die operabel verbunden ist mit einer DNS-Sequenz, die die Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1-15 in E. coli bewirken kann. 10

38. Ein replikabler Vektor, der in einem transformierten Mikroorganismus ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche . 1-15 zur Expression bringen kann.

39. Ein replikabler Vektor, der in einem transformierten Bakterium ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1-15 zur Expression bringen kann.

40. Ein replikabler Vektor, der in transformierten 20 E. coli ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1-15 zur Expression bringen kann.

41. Ein Vektor gemäss einem der Ansprüche 38-40, der ein Plasmid ist. 25

42. Ein Plasmid aus der Gruppe pLelF A trp 25, pLelF B trp 7 und pLelF F trp 1.

43. Ein Plasmid aus der Gruppe pLelF C trp 35 und Of) · pLelF D trp 11.

44. Ein Plasmid aus der Gruppe pLelF G und pLelF H.

45. Ein Plasmid aus der Gruppe pLelF I trp 1 und pLelF J trp 1.

46. Ein mit einem Vektor gemäss den Ansprüchen 38-45 transformierter Mikroorganismus. £*

54. DS 4100/15

47. Ein mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 38-45 transformiertes Bakterium.

48. Ein mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 5 38-45 transformierter Stamm von E. coli. k. .. 49. E. coli K-12 Stamm 294 transformiert mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 38-45.

50. Bakterienextrakt mit einem Gehalt von mindestens 95% eines Polypeptids, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-18 besteht. *

51. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines reifen Human-Leukozyten-Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-18.

52. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 51 zur 20 parenteralen Applikation.

53. Eine Kultur von Mikroorganismen, die zur Produktion von reifem Human-Leukozyten-Interferon befähigt sind.

54. Eine Kultur von Mikroorganismen gemäss einem der Ansprüche 46-49.

55. Die Verwendung von Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1-18 zur Behandlung von Tumoren und viralen In- 30 fektionen oder zur Herstellung pharmazeutischer Präparate, » die fur derartige Behandlungen geeignet sind.

56. Die Verwendung von DNS-Sequenzen gemäss einem der Ansprüche 19-37 zur mikrobiellen Herstellung von Verbindungen 35 gemäss einem der Ansprüche 1-15.

57. Die Verwendung eines Vektors gemäss einem der Ansprüche 38-45 zur mikrobiellen Herstellung einer Verbindung r*. v ~ 55 “ DS 4100/15 gemäss einem der Ansprüche 1-15.

58. Die Verwendung eines Mikroorganismus gemäss einem der Ansprüche 46-49 oder einer Mikroorganismen-Kultur gemäss , 5 Anspruch 53 oder 54 zur Herstellung einer Verbindung gemäss V einem der Ansprüche 1-15. \ -

59. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass man 10 eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Expression einer solchen Verbindung befähigten replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und diese Verbindung isoliert.

60. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, der zur Expression einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1-15 fähig ist, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus mit einem die Expression dieser Verbindung bewirkenden, replikablen Vektor transformiert und kultiviert. 20

61. Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem Mikroorganismus die Expression einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1-15 bewirkenden Vektors, dadurch gekennzeichnet, dass man eine diese Verbindung codierende DNS-

25 Sequenz operabel mit einer DNS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Codons enthält, verbindet. •k'k'k 30 r fr' « 35