DE69734464T2

DE69734464T2 - Verfahren zur expression und herstellung von rekombinantem, menschlichem beta-cis-interferon

Info

Publication number: DE69734464T2
Application number: DE69734464T
Authority: DE
Inventors: Paulo Cesar Peregrino Ferreira; Erna Geessien Kroon; Rolland Romain GOLGHER; Antonio Cláudio BONJARDIM; Fiorini Alex DE CARVALHO
Original assignee: Universidade Federal de Minas Gerais
Current assignee: Universidade Federal de Minas Gerais
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2017-12-20
Also published as: WO1998027211A1; EP0963437B1; US6323006B1; DE69734464D1; BR9606270A; EP0963437A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das allgemeine Gebiet rekombinanter Proteine zur Herstellung des menschlichen mutierten Proteins Interferon-beta-cis, das für klinische Anwendungen am Menschen oder in der Tiermedizin oder in der Forschung zu verwenden ist.
Hintergrund der Erfindung
Interferone (IFN) sind eine Familie von Proteinen, deren erste beschriebene biologische Aktivität die Fähigkeit zur Hemmung der viralen Replikation war. Neben ihrer antiviralen Wirkung besitzen die IFNs eine Vielzahl anderer biologischer Aktivitäten, Kontrolle des Zellwachstums, Differenzierung und Modulierung des Immunsystems (Vilcek, J. & Sem, G.C. In Virology(Ed.) Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. 375–399, PA: Lippincott-Raven Publishers, 1996).
Menschliche IFNs werden auf der Basis ihrer biologischen und physikalischen Eigenschaften in zwei Haupt-Unterfamilien klassifiziert. Zu der IFN-Familie Typ I gehören Fibroblasten-β-Interferon (IFN-β), Leukozyten-α-Interferon (IFN-α) mit 15 oder mehr Genen und Pseudogenen, und IFN-ω und IFN-τ. Die IFN-Familie Typ II wird von IFN-γ repräsentiert, das von T-Lymphozyten und NK-Zellen als Reaktion auf Mitogene und Antigenreize erzeugt wird (Vilcek, J. & Sem, G.C. In Virology (Ed.) Fields, B.N. Knipe, D.M., Howley, P.M. 375–399, PA: Lippincott-Raven Publishers, 1996).
Wie beim Menschen haben die meisten der Säugetierspezies große IFN-α-Genfamilien. Das Vorliegen vielfältiger IFN-β-Genfamilien wurde bei Rindern (drei Gene) gezeigt, während Menschen und die meisten anderen Säugetierspezies wahrscheinlich nur ein Gen enthalten (Ryan, A.M. Gallagher, D.M., Womack, J.E. Mammalian Genome, 3(19): 575–578, 1992).
Plazentagewebe können IFNs erzeugen. IFN-Aktivität wurde in Fruchtwasser, in Nabelschnüren und im Blut menschlicher Plazenten während der Schwangerschaft ohne klinische Anzeichen von Virusinfektionen (Lebon, P., Girard, S., Thepot, F. & Chany, C. Journal of General Virology, 59: 393–396, 1982) und auch in Plazentageweben von Mäusen (Fowler, A.K., Reed, C.D. & Giron, D.J. Nature, 285: 266–267, 1980) nachgewiesen. Schaf- und Rinder-Trophoblastenzellen erzeugen während der Embryo-Einnistung in den Uterus einen anderen Typ von IFN, IFN-τ genannt (Imakawa, K., Anthony, R.V., Kazemi, M., Mariotti, H., Poltes, H.G. & Robers, R.M. Nature, 330: 377–379, 1987). Dieses IFN ist zur Fötus-Einnistung notwendig, wobei es als ein Anti-Luteolysin wirkt, was zur dauernden Sekretion von Progesteron führt (Cross, J.C. & Roberts, R.M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 88: 3817–3820, 1991). Kürzlich wurde eine cDNA von menschlichem Trophoblasten-IFN (hTIFN) von Whaley, A.E. Meka, C.S.R., Harbison, L.A., Hunt, J.S. & Imakawa, K. The Journal of Biological Chemistry, 269: 10864–10868, 1994) beschrieben, deren Nucleotidsequenz IFN-τ von Schaf und Rind ähnlich ist (85%). Die HuIFN-τ- und HuIFN-ω- mRNAs wurden während der gesamten Schwangerschaft in den Zytotrophoblasten-Zellen nachgewiesen. Diese Tatsache legt nahe, dass diese IFNs als eine erste Verteidigungslinie wichtig sind, wobei sie den Fötus vor Virus-Ansteckung schützen und auch an den fortschreitenden Veränderungen der Plazentaentwicklung teilnehmen (Whaley, A.E., Meka, C.S.R., Harbison, L.A., Hunt, J.S. & Imakawa, K The Journal of Biological Chemistry, 269: 10864–10868, 1994). Kulturen menschlicher Trophoblasten erzeugten IFN-β, IFN-αI und Tau-Interferon, wenn sie mit einem Virus infiziert wurden (Aboagye-Mathiesen, G., Thoth, F.D. Juhl, C.H., Norskov-Lauritsen, N.N., Petersen, P.M. & Ebbesen, P. Journal of General Virology, 71: 3061–3066, 1990 und Thoth, F.D., Norskov-Lauritsen, N.N., Juhl, C.H. Aboagye-Mathiesen, G. & Ebbesen, P. Journal of General Virology, 71: 3067–3069, 1990).
IFNs binden an Rezeptoren, die an der Zellenoberfläche gelegen sind, wobei sie auf diese Weise die Übermittlung zytoplasmatischer Signale aktivieren, die im Kern Gene, die für die Aktivitäten von IFN verantwortlich sind, induzieren (Joklik, W.K. Interferons, in: Fields, B.N. and Knipe, D.M. (Ed.) Virology, 2a, Ed. – New York, Raven Press Ltd., Kap. 16, S. 383–410, 1990).
Alle Mitglieder der IFNs α-Familie besitzen eine Sequenz von 165 bis 166 Aminosäuren, von denen 4 Cyteine (Cys) in den Positionen 1; 29; 98; 99 oder 100; 138 oder 139 hochgradig konserviert werden; und sie sind für die Disulfid-Bindungen (S-S) verantwortlich. Die S-S-Bindungen zwischen Cys 1; 98; 99 oder 100 und zwischen Cys 29 und 138 oder 139 sind wichtig bei der Stabilisierung der IFN-Struktur (Wetzel, R. et al., J. Interferon Res., 1: 381–389, 1981). Die Bindung zwischen diesen zwei Cys ist für die Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität dieses IFN unentbehrlich (Path, T., Embo J., 11: 3193–3201 et al., 1992).
IFN β wird von Fibroblasten erzeugt, und es ist ein Glycoprotein mit einer relativen Molekülmasse von 22–23 kDa und einer spezifischen antiviralen Aktivität von 2 – 5 × 10⁸ internationalen Einheiten (Protein-Ul)/mg. Ein auf Chromosom 9 gelegenes Gen kodiert dieses IFN mit 166 Aminosäuren, das keine Introns besitzt. IFN β von Rind, Schwein und Ziege wird von mehreren Genen kodiert (OF Maeyer, E.M. und OF Maeyer-Guignard, J. – Interferon and other regulatory cytokines, John Wiley and Sons, New York, 1988).
IFN β besitzt 3 Cystein-Reste (Cys) in den Positionen 17, 31 und 141. Zwei Cys, 31 und 141, bilden eine Disulfid-Bindung, während Cys 17 frei bleibt. Die Studien (Mark, D.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. it Uses, 81: 5662–5666 1984), in denen das Cys 17 gegen ein Serin ausgetauscht wurde, zeigten, dass dieses IFN dasselbe Spektrum biologischer Aktivitäten von IFN β aufwies, wie antizelluläre und antiproliferative Aktivität, Aktivierung von NK-Zellen und Neutralisierung von Anti-HuIFN-Antikörpern, und eine größere Stabilität als natürliches HuIFN β aufweist, wenn es bei –70° C inkubiert wird.
In anderen Experimenten tauschten Shepard, H.M. et al., Nature, 294: 563–565, 1981, das Cys 141 gegen ein Tyrosin aus, was ein biologisch inaktives Molekül ergab.
Es wird angenommen, dass die Aktivierung des Enzyms 2'5' Oligoadenylat-Synthethase und der RNA-abhängigen Protein-Kinase (dsRNA) bei der antiviralen Wirkung wichtig sind (Pestka, S., et al., Ann. Rev. Biochem., 56: 727–777, 1987).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues menschliches Protein, Interferon beta-cis, das aus Primärkulturen menschlicher amniotischer Zellen isoliert wurde, das entsprechende rekombinante DNA-Molekül, das es kodiert, und das Verfahren zur Herstellung des menschlichen rekombinanten Proteins Interferon beta-cis, das durch gentechnologische Techniken hergestellt wurde, um in klinischen Anwendungen in der Humanmedizin oder Tiermedizin oder in der Forschung verwendet zu werden, zu beschreiben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und viele begleitende Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der folgenden genauen Beschreibung besser verstanden werden, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, worin:
1: Den zur Expression von Interferon beta-cis verwendeten Vektor zeigt.
2: Die Nucleotidsequenz und die vorhergesagte Translation der cDNA von Interferon beta-cis (SEQ ID NOS 1 und 2) zeigt.
3: Expression von beta-cis-Interferon in E.coli
4: Reinigung von beta-cis-Interferon
5A und 5B: Induktion von Genen
Genaue Beschreibung der Erfindung
Damit diese Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele nur zu Veranschaulichungszwecken beschrieben. Die Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung und sind nicht dazu gedacht, sie hinsichtlich Sinn oder Umfang zu beschränken. Das Verfahren kann durch die folgende Beschreibung zusammen mit den Beispielen besser verstanden werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Interferon beta-cis-Proteins bereit, das die Sequenz (SEQ ID NO. 2)
MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI
PEEIKQLQQFQKEDAALTIC EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN
VYHQINHLKTVLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH
CAWTIVRVEILRNFYFINRL TGYLRN
hat, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Primärkultur menschlicher amniotischer Zellen
(b) Infektion mit dem Virus
(c) Erhalten von RNA
(d) Lyse der Zellen
(e) Fraktionierung von RNA
(f) Ausfällung von RNA
(g) Extraktion von RNA
(h) Ausfällung von RNA
(i) Synthese von Erststrang-cDNA
(j) Amplifikation der DNA mit den Primern (5' GCCGGATCCTACAACTTGCTTGGATTCCTA3' und 5' GCCAAGCTTAGTTTCGGTCATTCCTGTAAGTC3' oder anderen spezifischen Primern
(k) Fraktionierung der DNA
(l) Reinigung der DNA
(m) Verdau der DNA
(n) Klonierung
(o) Ligation der DNA an den Vektor
(p) Transformation der kompetenten Bakterien
(q) Selektion der positiven Klone
(r) Sequenzierung der Klone
(s) Herstellung des Proteins
(t) Induktion von Bakterien
(u) Lyse der Bakterien
(v) Reinigung des Proteins

In dem obigen Verfahren können die Schritte a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, t, u optional sein.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Interferon beta-cis-Proteins bereit, bei dem die Primärkultur amniotischer Zellen (a) durch Abtrennung der Zellen von der Amnionmembran durch die Wirkung von Trypsin oder eines anderen proteolytschen Mittels erhalten wird.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Infektion von Zellen mit dem Sendai-Virus oder einem anderen Virus oder unter Verwendung von Arzneimitteln, die die Interferon-Herstellung in der Zelle stimulieren, durchgeführt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die mRNA erhalten durch Waschen der Zellen mit Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen Puffer mit physiologischem pH und physiologischer Kochsalzlösung-Konzentration, und die Lyse der Zellen (d) wird unter Verwendung von Guanidin-isothiocyanat oder eines anderen physikalisch-chemischen Verfahrens mit lytischen Eigenschaften durchgeführt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Transformation der kompetenten Bakterien (p) unter Verwendung von Escherichia coli oder irgendeines anderen Mikroorganismus durchgeführt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Reinigung des Proteins (v) in einer Nickelchelat-Säule oder unter Verwendung irgend eines anderen Verfahrens, das die Reinigung des Proteins erlaubt, durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein menschliches rekombinantes Interferon beta-cis bereit, das durch das obige Verfahren hergestellt wurde.
Beispiel 1
Primärkultur der menschlichen amniotischen Zellen (a)
Die Primärkultur der menschlichen amniotischen Zellen wurde durchgeführt unter Verwendung von Amnionmembranen, die von der Placenta getrennt wurden, in einer Kochsalzlösung gewaschen und in Stücke von näherungsweise 1 cm² geschnitten wurden. Die Stücke wurden mit Trypsin (0,25–0,30%) im Verhältnis von 5 bis 7 ml pro Gramm Gewebe verdaut. Nach jeder Behandlungsstufe mit Trypsin wurden die Zellen zentrifugiert und in Minimal-Essenzialmedium, das Eagle's-Salze enthielt, in einer Dichte von 15 – 25 × 10⁶ Zellen pro Petrischale kultiviert.
Beispiel 2
Induktion von Interferon (b)
Eine Woche nach der Implantation wurden die Zellen mit Sendai-Virus oder Newcastle Disease-Virus im Verhältnis von 3,0 bis 4,8 × 10^–6 Hämagglutinationseinheiten des Virus pro Zelle infiziert für eine Stunde, und sie wurden wieder 4 bis 8 Stunden inkubiert.
Beispiel 3
Extraktion und Reinigung von RNA (c, d, e, f, g, h)
Zur RNA-Extraktion wurden die infizierten Zellen mit Kochsalzlösung gewaschen und mit 3,5 bis 4,5 ml einer 3 bis 4 M Guanidin-isothiocyanat-Lösung 10 bis 20 min lang auf Eis zerstört. Zur Reinigung der RNA wurden 1,5 bis 2,0 ml einer Cäsiumchlorid-Lösung (5,7 bis 5,8 M) zugegeben und 18 bis 24 Stunden lang bei 20° C bis 24° C mit 114.000 g zentrifugiert. Die RNA wurde in einer Tris-EDTA-Lösung homogenisiert, und die Extraktion wurde mit demselben Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol im Verhältnis von 25:24:1 durchgeführt, in einem Vortex-Mischer geschüttelt und zentrifugiert. RNA wurde mit 1/10 des Volumens an Natriumacetat (2 bis 3 M, pH 5,5 bis 6,0) und Ethanol ausgefällt, zentrifugiert, und das Pellet wurde in Wasser gelöst.
Beispiel 4
cDNA-Synthese (i, j)
5 bis 10 μg RNA wurden als Matrize zur Synthese des ersten cDNA-Strangs verwendet, wobei 0,5 bis 1 μg Primer T15, 40 bis 50 mM Pyrophosphat, 20 bis 30 U reverse Vogel-Transcriptase und ihr Puffer verwendet wurden.
Die Amplifikation des dem Interferon entsprechenden Fragments, ausgehend von der in den Schritten a, b, c, d, e, f, g, h, i erhaltenen cDNA oder ausgehend von dem Vektor, der die geklonte DNA des Interferon Beta-cis Gens enthält, wurde unter Verwendung spezifischer Oligonucleotide (5'GCCGGATCCTACAACTTGCTTGGATTCCTA3 (SEQ ID NO 3) und 5'GCCAAGCTTAGTTTCGGTCATTCCTGTAAGTC3 (SEQ ID NO. 4)) für den Bereich des entsprechenden Fragments des Proteins (Interferon β), das die Stellen für die Restriktionsenzyme BamH 1 und Hind III enthält, in der Polymerasekettenrekation (PCR, polymerase chain reaction) durchgeführt.
Die Reaktion wurde mit Taq-Polymerase-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0–9,5, 1,5–2,5 mM MgCl₂ und 1–2% Triton X-100), 0,1–1 U Taq-Polymerase (Promega, USA, Cat. No. M186A), 0,5–1,5 mM MgCl₂, 20–50 mM jedes Nucleotids (dATP,dCTP,dGTP,DTTP), 10–30 pmol jedes Primers, und 0,01 bis 0,1 ng cDNA und destilliertem H₂O und sterilem Wasser q.s.p. 50–100 μl, ausgeführt. Die Reaktion wurde 1 bis 2 Zyklen bei 94–96° C/1 bis 2min; 53 bis 55° C/1–2 min; 70–72° C/1–2 min; 30 Zyklen bei 94–96° C/1–2 min; 36–38° C/1–2 min; 70–72° C/1–2 min und außerdem ein Zyklus bis 94–96° C/1–2 min; 36–38° C/1–2 min; 70–72°C/10–15 min durchlaufen lassen.
Beispiel 5
Fraktionierung und Reinigung von DNA (k, l)
sDie Fraktionierung der DNA wurde in Agarosegel (1,5–2,0%) bewerkstelligt. Die Reinigung der amplifizierten DNA wurde durch Ausschneiden der Bande des Gels ausgeführt. Die Bande wurde in 2–3 Volumina Nal-Lösung (Nal 8M + 0,022 M DTT) und Natriumphosphat-Puffer (1 M, pH 6,0–6,5) verdünnt und 5 bis 10 min bei 50–56° C inkubiert. Zu der Suspension wurden Glaskugeln zugegeben, gemischt, 1 bis 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und 10 bis 30 Sekunden lang zentrifugiert. Die Kugeln wurden mit Ethanol-Puffer (75% Ethanol, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,0–7,6, 0,01 M EDTA, pH 8,0–8,5) gewaschen. Die DNA wurde von den Glaskugeln mit Puffer (Tris, pH 7,0–7,4, 10 mM, 1–3 mM EDTA) bei 50–56° C 1 bis 5 min lang eluiert.
Beispiel 6
Verdau des DNA-Fragments und Klonierung (m, n)
Für den Verdau der DNA wurde das Produkt zuerst mit dem Enzym Hind III in einer Reaktion mit 10–20 U Hind III (Biolabs, England), 3,5 μl Puffer I (Promega, EUA) und destilliertem H₂O, Wasser qsp 30–50 μl, mit Inkubation bei 37° C für 2 bis 4 h behandelt. Danach wurden 10–20 U Bam HI (Biolabs, England), 5–10 μl REACT III (BRL, USA), H₂O (dd) qsp 50–100 μl, zu dem Röhrchen zugegeben und bei 37° C für 2–4 h inkubiert. Zur Klonierung des DNA-Fragments in dem Plasmid PDS-56 (1) wurde der Verdau des Vektors mit den Restriktionsenzymen Hind III und Bam HI in einer Reaktion, die den Vektor, 10–20 U des Enzyms Hind III (Promega, USA), 2–5 μl Puffer (Promega, USA) und destilliertes Wasser qsp 20–50 μl enthielt, mit Inkubation bei 37° C für 2–4 h ausgeführt. Später wurden 10–20 U des Enzyms Bam HI (Promega, USA), 5–10 μl REACT III (BRL, USA) und destilliertes Wasser qsp 50–100 μl, zu der Reaktion zugegeben und bei 37° C für 2–4 h inkubiert. Das Produkt dieses Verdaus wurde in einer 1 % Agarose-TAE-Gelelektrophorese analysiert. Die dem verdauten Plasmid entsprechende Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml) überführt und gereinigt.
Beispiel 7
Ligation, Transformation und Klon-Selektion (o, p, q)
Bei der Ligationsreaktion des DNA-Fragments wurden 20–50 ng der Einfügung (Insert) zu 5–15 ng des Vektors, 0,5–2,0 U T4-Ligase (Promega, USA), ATP 5 mM (Promega, USA), Ligationspuffer (Promega, USA), H₂O (dd) qsp 15 μl, mit Inkubation bei 14–16° C (BOD, FANEN, Brasilien) für 12–18 h, zugegeben.
Die Bakterientransformation wurde mit Escherichia coli-Bakterien durchgeführt. Das Volumen der Ligationsreaktion wurde mit Puffer (Tris 10 mM, pH 7,2–7,4, EDTA 1 mM) auf 40–60 μl aufgefüllt, und 100 μl einer Suspension kompetenter Bakterien wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden leicht gedreht und sofort im Eisbad für 20–40 min inkubiert, einem Hitzeschock bei 40–42° C für 1–3 min unterzogen, und wieder im Eisbad für 20–40 Sekunden. LB-Medium (Bacto Tripton 1 p/v, Hefeextrakt 0,5% p/v, NaCl 171 mM) ohne Antibiotika wurde im doppelten Volumen zugegeben und bei 37° C für 1–2 h inkubiert. Die Bakterien wurden zentrifugiert, in LB homogenisiert und in Petrischalen mit LB-Agar (Agar 1,5% p/v, Hefe extrakt 0,5% p/v, Tripton 0,1% p/v, NaCl 0,5% p/v, pH 7,2–7,5) mit 50–200 μg/ml Ampicillin und 20–100 μg/ml Kanamicin inokuliert. Die Platten wurden bei 37° C 15–24 h lang inkubiert. Zur Selektion der positiven Klone wurden sie in LB mit 50–200 μg/ml Ampicillin und 20–100 μg/ml Kanamicin bei 37° C unter Bewegung 15–20 h lang wachsen lassen. Nach Inkubation PCR unter Verwendung spezifischer Primer des Vektors (zur Amplifikation des der Einfügung entsprechenden Bereichs), wobei der Primer (Sinn) 5'-TTCATTAAAGAGGAGAAATT-3' (SEQ ID NO:5) und der Primer (anti-Sinn) 5'-CTATCAACAGGAGTCCAAGC-3' (SEQ ID NO:6) war. Die Reaktion wurde mit Taq-Polymerase 10 × Puffer (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM pH 9,0–9,5, MgCl₂ 15–25 mM und Triton X-100 1–2%), 0,5–1,0 U Taq-Polymerase (Promega, USA), 0,5–1,5 mM MgCl₂, 20–50 mM jedes Nucleotids (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10–30 pmol jedes Primers, 0,5–1 μl Bakterien-Suspension und sterilem dd-Wasser qsp 20–40 μl gemacht. Die Reaktion wurde mit 1–3 Zyklen für 94–96° C/5 min., 50–55° C/1–2 min, 70–72° C/1–2 min.; 30 Zyklen bei 94–96° C/30–45 s, 45–50° C/30–45 s, 70–72° C/30–45 s und ein Zyklus bei 94–96° C/1–2 min., 45–50° C/1–2 min., 70–72° C/10–15 min durchgeführt. Das Produkt dieser Reaktion wurde einer Elektrophorese in Agarosegel bei 1–2% unterzogen.
Beispiel 8
Sequenzierung (r)
Die positiven Klone wurden sequenziert, um das mutierte Interferon beta-cis (2) zu identifizieren.
Beispiel 9
Protein-Herstellung, Induktion und Lyse von Bakterien (s, t, u)
Die positiven Klone für das mutierte Interferon beta-cis wurden zur Herstellung des Proteins verwendet, und sie wurden in LB-Medium mit 50–200 μg/ml Ampicillin und 50–200 μg/ml Kanamicin wachsen lassen und bei 37° C unter Bewegung bis zur optischen Dichte (OD 600 nm) von 0,5–0,7 inkubiert. Dann wurden zur Induktion des Proteins (t) 0,2–0,4 M IPTG (Isopropyl-(-D-thiogalactosid)) zugegeben und 3–5 h lang inkubiert. Die Bakterien (21) wurden zentrifugiert, der Überstand abgetrennt und das Pellet in Puffer A (Guanidin-HCl 5–6 M, Natriumphosphat 0,1–0,2 M, Tris 0,01–0,02 M, pH 7,8–8,0) unter Bewegung für 1–2 h homogenisiert.
Beispiel 10
Protein-Reinigung (v)
Der Überstand wurde auf eine Säule mit Ni-NTA-Harz aufgebracht. Zur Reinigung des Proteins wurde die Säule in Folge mit Puffer A, Puffer B (Harnstoff 7–8 M, Natriumphosphat 0,1–0,2 M, Tris 0,01–0,02 M, pH 7,8–8,0) und mit Puffer C (Harnstoff 7–8 M, Natriumphosphat 0,1–0,2 M, Tris 0,01–0,02 M, pH 7,0–7,2) gewaschen. Das Protein wurde eluiert mit Puffer D (Harnstoff 7–8 M, Natriumphosphat 0,1–0,2 M, Tris 0,01–0,02 M, pH 5,0–5,2) und in Folge mit (Harnstoff 7–8M, Natriumphosphat 0,1–0,2 M, Tris 0,01–0,02 M, pH 4,0–4,2); Fraktionen und eine Probe von 50 μl wurden gesammelt, und jede Fraktion wurde v/v in Proben-Puffer verdünnt, 10 min lang erhitzt und der Elektrophorese in Polyacrylamid-Gel unterzogen (SDS-PAGE). Das Gel wurde hinsichtlich Anwesenheit der Fraktion, die die entsprechende Bande des gereinigten Interferon beta-cis-Proteins enthielt, analysiert.
Sequenz-Protokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung des menschlichen rekombinanten Proteins Interferon-beta-cis, das in seiner Struktur die folgenden Aminosäuren aufweist: MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQQFQKEDAALTIC EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKTVLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEILRNFYFINRL TGYLRN folgende Schritte aufweisend: (1) Primärkultur menschlicher amniotischer Zellen (2) Infektion mit Virus (3) Erhalten von RNA (4) Lyse der Zellen (5) Fraktionierung von RNA (6) Ausfällung von RNA (7) Extraktion von RNA (8) Ausfällung von RNA (9) Synthese von Erststrang-cDNA (10) Amplifikation der DNA mit den Primern (5' GCCGGATCCTACAACTTGCTTGGATTCCTA3' und 5' GCCAAGCTTAGTTTCGGTCATTCCTGTAAGTC3' oder anderen spezifischen Primern (11) Fraktionierung der DNA (12) Reinigung der DNA (13) Verdau der DNA (14) Klonierung (15) Ligation der DNA an den Vektor (16) Transformation kompetenter Bakterien (17) Selektion der positiven Klone (18) Sequenzierung der Klone (19) Herstellung des Proteins (20) Induktion von Bakterien (21) Lyse der Bakterien (22) Reinigung des Proteins
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Primärkultur amniotischer Zellen (1) durch Abtrennung der Zellen von der Amnionmembran durch Wirkung von Trypsin oder eines anderes proteolytischen Mittels erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Infektion von Zellen mit dem Sendai-Virus oder einem anderen Virus oder mit Arzneimitteln, die die Interferon-Herstellung in der Zelle stimulieren, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNA (3) durch Waschen der Zellen mit Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen Puffer mit physiologischem pH und Kochsalzlösung-Konzentrierung und Lyse der Zellen (4) mit Guanidin-isothiocyanat oder durch ein anderes physikalisches-chemisches Verfahren mit lytischen Eigenschaften erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation der kompetenten Bakterien (16) unter Verwendung der Bakterien Escherichia coli oder irgend eines anderes Mikroorganismus durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung des Proteins (22) in einer Nickelchelat-Säule durchgeführt wird.
Menschliches rekombinantes Protein Interferon-beta-cis, das in seiner Struktur die folgenden Aminosäuren aufweist: MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQQFQKEDAALTIC EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKTVLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEILRNFYFINRL TGYLRN, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.