DE69534596T2

DE69534596T2 - Epil/plazentin

Info

Publication number: DE69534596T2
Application number: DE69534596T
Authority: DE
Inventors: Ahmet Koman; Dorine Chassin; Dominique Bellet
Original assignee: Universite Paris 5 Rene Descartes
Current assignee: Universite Paris 5 Rene Descartes
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1995-06-12
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2015-06-13
Also published as: EP0763111A1; US5910480A; FR2721033B1; ATE309359T1; WO1995034653A1; US6362318B1; CA2225499A1; FR2721033A1; DE69534596D1; US6180364B1; EP0763111B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein, genannt Plazentin oder EPIL, dessen Analoga, deren Herstellungsverfahren sowie deren Anwendungen.
Insulin, IGF-1, IGF-2 und Relaxin gehören einer Familie von Peptidhormonen an, die bestimmte Strukturen und Funktionen gemeinsam haben, insbesondere ihre Wirkung auf die Proliferation, die Entwicklung, die Differenzierung und den Zellmetabolismus.
Insulin ist als ein endokrines Pankreashormon bekannt, das den Energiemetabolismus reguliert. Die Wachstumsfaktoren vom Typ Insulin-IGF-1 sind wachstumsaktivierende Peptide, die an der endokrinen, parakrinen und autokrinen Regulierung des Zellwachstums beteiligt sind und die in zahlreichen Geweben exprimiert werden. IGF-2 hat ähnliche Eigenschaften, wird aber in der Pränatalzeit in größerer Menge exprimiert und gilt als ein fötaler Wachstumsfaktor.
Relaxin induziert eine Umgestaltung der Bindegewebe im Fortpflanzungstrakt und inhibiert Uteruskontraktionen. Seine funktionelle Rolle im Gehirn, wo eine sehr starke Expression erhalten wurde, bleibt zu klären.
Vor kurzem wurden zu dieser Familie die Ley I-L hinzugenommen, die derzeit in Form von cDNA kloniert werden und deren biologische Aktivität noch zu bestimmen ist. Diese Peptidfamilie weist gemeinsame Strukturmerkmale auf, die durch die Position verschiedener essentieller Cysteine zur Bildung einer Tertiärstruktur definiert sind.
Insulin, das der Prototyp dieser Familie ist, umfasst zwei Peptidketten A und B, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Es wird durch eine mRNA kodiert, die in Preproinsulin übersetzt wird. Das Signalpeptid sowie das C-Verbindungspeptid werden durch posttranslationelle Modifikation herausgeschnitten; dies gilt ebenso für Relaxin, wohingegen die Reifung der IGFs auf andere Art ohne Entfernung des C-Peptids erfolgt und die IGFs die Form einer Einzelkette beibehalten. Es konnte gezeigt werden, dass alle Mitglieder dieser Familie an Zelloberflächenrezeptoren binden. Diese Rezeptoren wurden durch molekulare Klonierung identifiziert und für Insulin und IGF ausführlich charakterisiert. Sie gehören zu der Superfamilie der Tyrosinkinase-Rezeptoren (TKRs), die Wachstumsfaktor-Rezeptoren und deren onkogene Analoga, wie zum Beispiel c-erbB2/neu (EGF-Rezeptor), c-met (Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor), fms (CSF-1-Rezeptor) und trk (NGF-Rezeptor) umfasst.
Der intrazelluläre Signaltransduktionsweg für diese Rezeptoren ist durch eine Tyrosinkinaseaktivität gekennzeichnet, die eine Autophosphorylierung der Tyrosinreste auf dem Rezeptor bewirkt, gefolgt von einer Kette von Ereignissen, die Phosphorylierungen entsprechen. Dies schließt insbesondere die Aktivierung von IRS-1 (insbesondere bei Insulin und IGF), PI3K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf und der Mitogen-aktivierten Protein (MAP)-kinase mit ein, insbesondere wenn die Phosphorylierungskaskade verschiedene zelluläre Prozesse, wie zum Beispiel die Transkription, beeinträchtigt.
Die pleiotropen physiologischen Wirkungen dieser Signalkaskade im Allgemeinen sind Gegenstand intensiver Forschung.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein neues Molekül dieser Familie des Insulins, das nachstehend Plazentin oder EPIL (Early Placenta Insulin Like peptide) genannt wird und dessen Aminosäure- und DNA-Sequenz, die für dieses Protein kodiert, der Sequenz ID 1 entsprichen.
Plazentin oder EPIL wurde aus einer cDNA-Bank zytotrophoblastischer Zellen isoliert, die aus Plazenta gewonnen wurden, welche während des ersten Schwangerschaftstrimesters entnommen wurde. Die Northern-Blot-Analyse (an einer sehr großen Stichprobe normaler Gewebe durchgeführt) hat nur im Plazentagewebe nachweisbare Mengen an RNA ergeben.
Die Aminosäuresequenz, die erhalten wurde, zeigt für das erfindungsgemäße Protein eine für die Insulinfamilie charakteristische Anordnung von Cysteinresten.
Die Behandlung von Zielzellen mit konditionierten Medien von kultivierten Zellen, die das rekombinante Protein exprimieren, scheint zu einem Tyrosin-Phosphorylierungsmuster zu führen, das dem ähnlich ist, welches nach der Behandlung mit Insulin beobachtet wird.
Vorversuche legen schließlich nahe, dass EPIL/Plazentin die DNA-Synthese induziert.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung speziell ein EPIL/Plazentin genanntes Protein, dessen Formel der Sequenz ID 1, auch in 1 dargestellt, entspricht und dessen Analoga, die eine Aktivität vom Typ EPIL/Plazentin aufweisen und durch Deletion und/oder Substitution erhalten werden.
In der Sequenz ID 1 entspricht die Struktur von EPIL/Plazentin der Aminosäurestruktur vom Methionin in Position 36 bis zur Aminosäure in Position 174.
Die Bezugnahmen auf die DNA-Sequenzen von EPIL/Plazentin entsprechen dieser Sequenz.
Die Nukleinsäuresequenzen vor dem ersten mutmaßlichen ATG (unterstrichen) und nach dem Stop-Codon sind kleingeschrieben.
Die Analoga von EPIL/Plazentin sind die Proteine oder Peptide, die eine starke Aminosäurehomologie, insbesondere über 60% Aminosäurehomologie, bevorzugt 80%, mit der der Sequenz ID 1 entsprechenden Verbindung aufweisen und die durch Deletion oder durch Substitution unter Beibehaltung der wesentlichen Eigenschaften von EPIL/Plazentin erhalten werden konnten. Diese Analoga werden manchmal "Verbindungen vom Typ EPIL/Plazentin" genannt.
Insbesondere können Fragmente angeführt werden, die bestimmte der für die Aktivität von EPIL/Plazentin charakteristischen Epitope aufweisen, insbesondere die Proteine vom Typ EPIL/Plazentin, die mindestens die 20 ersten Aminosäuren des N-terminalen Endes der Sequenz ID 1 aufweisen.
Wohlbemerkt betrifft die vorliegende Erfindung EPIL/Plazentin oder dessen Analoga in glykosilierter oder nicht glykosilierter Form. Es können auch die Proteine angeführt werden, welche die Disulfidbrücken des Ausgangsproteins aufweisen oder nicht. Dieses Protein kann durch Extraktion aus biologischen Proben gewonnen werden, wird aber bevorzugt durch Verfahren erhalten, die Gentechnik anwenden und deren Sekundärstrukturen in Abhängigkeit vom Wirtsorganimus variieren können.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Molekül, das ausgewählt ist aus:

(a) der DNA-Sequenz der Sequenz ID 1, und
(b) den DNA-Sequenzen, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes den Sequenzen (a) oder (b) entsprechen und die für ein Polypeptid vom Typ EPIL/Plazentin oder dessen Analoga gemäß der Erfindung kodieren.

Die Erfindung betrifft insbesondere die der Sequenz ID 1 entsprechende DNA-Sequenz.
Wohlbemerkt können die zuvor genannten DNA-Sequenzen genomische Sequenzen oder Sequenzen genomischer Art sein, das heißt, dass einige der Elemente durch Introns getrennt sein können, die herausgeschnitten werden, um zur Expression des reifen EPIL/Plazentin zu führen.
Die vorstehenden DNA-Sequenzen können dann unter der Kontrolle von Elementen, die ihre Expression in einer bestimmten Wirtszelle gewährleisten, in Klonierungs- oder Expressionsvektoren für EPIL/Plazentin oder dessen Analoga eingebaut werden, wobei diese Vektoren Bestandteil der Erfindung sind.
Die Expressionssysteme in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen sind dem Fachmann bekannt, es kann sich unter anderem um Plasmid-Systeme oder virale Systeme handeln, die Promotoren umfassen, welche die Expression in der Wirtszelle gewährleisten, und die auch mit den erforderlichen Terminationselementen versehen sind.
Es kann sich aber auch um Integrationsvektoren handeln, die ihr eigenes Expressionssystem aufweisen können oder aber ausgelegt sind, um sich unter Verwendung der Technik der homologen Rekombination an Orten in die Chromosomen zu integrieren, an denen sie sich unter der Aktivierung durch einen chromosomalen Promotor befinden, insbesondere im Fall prokaryotischer Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Wirtszellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen selbstreplizierenden Vektor umfassen, der EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin gemäß der Erfindung exprimiert.
Wie vorstehend erwähnt, kann es sich um eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen der Art CHO-Zelle, oder um Zellen in Kultur anderer Arten handeln, die für die Herstellung von EPIL/Plazentin in reifer Form besser geeignet sind; aber es ist ebenso möglich, zum Beispiel die Verwendung von Bakterienzellen in Betracht zu ziehen: in diesem Fall kann es nützlich sein, das auf diese Weise erhaltene Protein zusätzlichen Umgestaltungen zu unterziehen.
Es handelt sich auch hier wieder um Techniken, die dem Fachmann bekannt sind und die, außer im Rahmen einiger der nachstehenden Beispiele, nicht ausführlicher beschrieben werden.
Die Zellen, die auf diese Weise mit einem selbstreplizierenden Vektor transformiert wurden, der das Protein exprimiert, können durch Kultur in einem Verfahren verwendet werden, das die Herstellung von EPIL/Plazentin oder dessen Analoga ermöglicht.
Es handelt sich insbesondere um ein Verfahren zur Herstellung von EPIL/Plazentin oder dessen Analoga, das durch das In-Kultur-Bringen von Zellen gekennzeichnet ist, aus denen man direkt oder ausgehend vom Kulturmedium EPIL/Plazentin oder dessen Analoga extrahiert.
EPIL/Plazentin kann insbesondere durch Immunreinigung extrahiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Rekombinationsprodukte, die durch das vorstehend ausgeführte Verfahren erhalten wurden.
In einigen Fällen kann das Protein in fusionierter Form hergestellt werden, insbesondere wenn es sich um ein Peptidanalogon von EPIL/Plazentin handelt, oder auch wenn die Fusion mit diesem Protein es ermöglicht, den Wirkort von EPIL/Plazentin oder dessen Analoga leichter zu erreichen, oder wenn dieses Protein es in einigen Fällen ermöglicht, manche natürliche Systeme zu täuschen, indem es eine längere Lebensdauer des fraglichen Proteins gewährleistet.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die EPIL/Plazentin oder dessen Analoga als Wirkstoff verwenden.
Wie bereits erwähnt wurde, kann EPIL/Plazentin eine Vielzahl von Wirkungen aufweisen, insbesondere kann es wie andere humane Wachstumsfaktoren vom Typ 1 eine Wirkung auf das Herz aufweisen, vor allem bei der Behandlung und Prävention bestimmter Herzbeschwerden, wie zum Beispiel akuter Herzinsuffizienzen.
Dieses Protein oder einige seiner Analoga können eine Wirkung vom Typ Wachstumsfaktor und Laktationspromotor aufweisen. Die Produkte können ebenfalls im Prozess der Regenerierung von Nerven-, Muskel-, Haut- oder Knochengewebe verwendet werden, insbesondere im Fall von degenerativen oder endokrinen Erkrankungen, traumatischen Läsionen oder Viruserkrankungen.
Schließlich können EPIL/Plazentin oder dessen Analoga eine Wirkung auf der Ebene der Kontrolle der Gesamtheit der Ereignisse der Empfängnis beim Menschen oder bei Tieren aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper und insbesondere für dieses Protein oder dessen Analoga spezifische monoklonale Antikörper sowie ein in-vitro-Diagnoseverfahren, das es ermöglicht, mit Hilfe von EPIL/Plazentin oder dessen Analoga und/oder der entsprechenden Antikörper in physiologischen oder nicht-physiologischen Proben anormale EPIL/Plazentin-Gehalte nachzuweisen.
DNA-Fragmente, die den vorstehend angegebenen Sequenzen entsprechen, können in eine therapeutische "sense-" oder "antisense-" Strategie integriert werden; was EPIL/Plazentin oder dessen Analoga betrifft, so können diese auch in eine Strategie zur Ausrichtung bestimmter pharmazeutisch aktiver Moleküle gegen die Rezeptoren von EPIL/Plazentin oder dessen Analoga integriert werden.
Die detaillierte Struktur von EPIL/Plazentin entspricht der 2, das heißt einem Signalpeptid in Position –17 bis –1, einer B-Kette von 1 bis 41, einem Verbindungspeptid C von 42 bis 92, gefolgt von einer A-Kette von 93 bis 122.
Diese Struktur macht EPIL/Plazentin dem Proinsulin oder dem Prorelaxin ähnlich.
Insbesondere muss die Position der Disulfidbrücken zu einer dreidimensionalen Struktur vom Typ des Insulins führen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Betrachtung der nachfolgenden Beispiele hervor, die unter Bezugnahme auf die Sequenzen ID 1 und 2 erfolgt, welche der Sequenz von EPIL/Plazentin und des menschlichen Gens entsprechen, das für dieses Protein kodiert.
BEISPIELE
Die Entdeckung von EPIL/Plazentin ist das Ergebnis einer speziellen Forschung, die versucht, die am Zellwachstum und/oder am neoplastischen Prozess beteiligten Moleküle aufzudecken.
Obwohl die Plazenta ein normales Gewebe ist, weisen die Zellen, aus denen sie besteht, zahlreiche gemeinsame Eigenschaften mit neoplastischen Zellen auf, insbesondere die invasiven und stark mitotischen Zytotrophoblasten, die in das mütterliche Gewebe eindringen können. Diese Trophoblasten sind eine Quelle insbesondere für Wachstumsfaktoren, Hormone und Wachstumsfaktor-Rezeptoren.
Die aktuellen Studien zeigen, dass die bevorzugt in den Trophoblastenzellen exprimierten Gene auch in den neoplastischen Zellen bevorzugt exprimiert werden können.
Aber in Anbetracht der Tatsache, dass die Plazenta und insbesondere die Trophoblasten während der normalen Schwangerschaft unter vollständiger Kontrolle bleiben, sind die trophoblastischen Moleküle, die dieser Kontrolle entsprechen, sehr interessante Kandidaten für Mittel gegen Krebs oder solche, die fähig sind, den Prozess der Kanzerisierung zu kontrollieren.
Deshalb ist die Isolierungsmethode, die verwendet wurde, eine cDNA-Subtraktionsmethode, welche die PCR-Technik auf junge Trophoblasten anwendet. Dies hat es ermöglicht, Gene aufzudecken, die in diesen Zellen überexprimiert werden und die eine Rolle im Zellwachstum und in der Regulierung dieses Wachstums spielen könnten.
MATERIAL UND METHODEN
Gewebe
Plazenten aus der 5. bis 12. Woche und Plazenten aus der Endphase der Schwangerschaft sowie chirurgische Proben normaler und tumoröser Gewebe wurden unverzüglich (innerhalb der ersten 10 Minuten nach dem chirurgischen Eingriff) gekühlt und bis zur Präparation der RNAs in flüssigem Stickstoff konserviert. Diese Gewebesammlungen wurden gemäß den von den Gremien der verschiedenen Krankenhäuser genehmigten Protokollen erhalten.
Zellen
Die in dieser Studie verwendeten menschlichen Zelllinien und ihre histologischen Abstammungen sind die folgenden: gestationelles Chorionkarzinom (JAr und JEG-3); hepatozelluläres Karzinom (PLC/PRF/5 und HepG2); Adenokarzinom des Kolons (LS180), Ovarialkarzinom (OV1/p, OV1/VCR), die Zelllinie OV1/VCR ist von OV1/p abgeleitet und ist gegenüber Vincristin resistent; Epidermoidkarzinom (A431); Lungenkarzinom (A427); Epithelkarzinom der Zervix (HeLa); Mammakarzinom (McF7, MDA-MB-361, SK-BR-3, BT-20 und BT-474); SV-40-transformierte Brustzellen (HBL-100); Neuroblastomzelllinie (SHSY-5Y); normale Fibroblastenzelllinie (CCL-137).
Alle diese Zelllinien, ausgenommen IGR/OV1 (OV1/p) und OV1/VCR, sind von ATCC erhältlich.
Diese Zelllinien werden in einem DMEM- oder RPMI-1460-Medium (Gibco-BRL Laboratories, Gaithersburg, MA), supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 10 μM nicht-essentiellen Aminosäuren, 4mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 37°C mit 5% CO2 zum Wachstum gebracht.
Isolierung der Zytotrophoblasten
Die Zytotrophoblasten werden so gereinigt, wie es von Kliman et al. Endocrinology, 118: 1567–1582, 1986 beschrieben wird. Zusammengefasst werden die Zottengewebe der Plazenta aus dem ersten Trimester mit Trypsin und Desoxyribonuclease I dispergiert. Die dispergierten Zellen werden dann über einen 5–70%-igen Percollgradienten (Pharmacia) gereinigt. Die Bande bei 1 040-1 060 mg/ml Dichte wird gesammelt. Die mikroskopische Untersuchung zeigt, dass sie zytotrophoblastische Zellen enthält, mit weniger als 5% Kontaminierung durch nicht-trophoblastische Zellen, wie zum Beispiel Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen.
Präparation der RNA
Die Gesamt-RNA wird unter Anpassung des Protokolls von Chirgwin et al. aus präkonfluenten Zellkulturen oder gekühlten Geweben unter Verwendung von Guanidinisothiocyanat und durch Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Gradienten präpariert. Die RNAs der mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums assoziierten Polysomen (MB-RNAs) werden wie zuvor beschrieben gereinigt. Nach Trypsinierung und Reinigung über einen Percollgradienten werden die zytotrophoblastischen Zellen homogenisiert, und dann werden die MB-RNAs im Saccharosegradienten unter Hinzunahme eines Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexes als Ribonucleaseinhibitor isoliert.
cDNA-Synthese und Amplifizierung mittels PCR
0,1 μg MB-RNA werden in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser gelöst und mit 0,1 M McHgOH und β-Mercaptoethanol denaturiert. Der erste cDNA-Strang wird mit der Reversen Transkriptase des Vogel-Myoblastose-Virus (Kit Invitrogen, San Diego) unter Verwendung des nachstehend angegebenen modifizierten dT-Primer synthetisiert (Frohman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998–9002, 1988). Die RNA-cDNA-Heteroduplexe mit einer Größe zwischen 0,5 und 2 kb werden nach Migration in einem 2%-igen Agarosegel elektroeluiert. Ein oligo-dG-Schwanz wird mit der terminalen Desoxynucleotidyltransferase an das 3'-Ende des ersten cDNA-Stranges angehängt, und die RNA wird durch Alkalihydrolyse entfernt. Die cDNAs werden mit unspezifischen Primern, welche die Restriktionsstellen für die Enzyme Notl und Sall umfassen, amplifiziert.
Die Sequenz des Primers T, der für die reverse Transkription und die PCR verwendet wird, ist die folgende:
5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
Der Primer C ist identisch mit dem in Loh et al., (Science, 243:217–220, 1989) beschriebenen:
5'-GCATCGGCGCGGCCGCGGAGGCCCCCCCCCCCCCC-3'
Das Reaktionsgemisch umfasst 1,25 mM von jedem der 4 Desoxyribonucleotidtriphosphate, 0,5 μM von jedem Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase in 50 mM KCI – 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) – 3,5 mM MgCl₂ – 0,01% Gelatine. Die Amplifizierung wird in einem Thermocycler in 25 Zyklen mit 20 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C durchgeführt. Die Produkte werden auf ein 1%-iges Gel von niedrigschmelzender Agarose geladen. Der Bereich 0,5–2 kb wird dann herausgeschnitten und unter den gleichen Bedingungen reamplifiziert. Die Produkte werden gefällt, mit Notl und Sall vollständig verdaut, die Größen werden wie vorstehend selektioniert und von Agarose elektroeluiert, gefällt und quantitativ bestimmt.
Die Gesamt-cDNA von Plazenta aus der Endphase der Schwangerschaft und von T-Lymphozyten, die durch Phytohämagglutinin aktiviert und mehrere Tage in Anwesenheit von IL-2 kultiviert wurden, wurde unter Verwendung eines Synthesesystems für Doppelstrang-cDNA präpariert.
Konstruktion der subtrahierten cDNA-Bank
Die subtraktive Hybridisierung wird so durchgeführt, wie es von Klickstein (Klickstein et al. Current protocols in molecular biology, S. 5.8.9–5.8.15 Wiley Intersience, 1989) beschrieben wird. 0,2 μg PCR-amplifizierte cDNA aus zytotrophoblastischen Zellen werden mit Notl und Sall verdaut, mit 8 μg cDNA von aktivierten T-Lymphozyten und 8 μg cDNA von Plazenta aus der Endphase der Schwangerschaft gemischt, die mit Alul und Rsal verdaut wordensind, in 40 μl Hybridisierungspuffer (50% entionisiertes Formamid; 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7; 5 ×7 SSC; 0,1% SDS; 10 mM EDTA) gelöst, 5 Minuten bei 98°C denaturiert und 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die gemeinsamen Sequenzen zwischen Ziel-DNA und Kompetitor werden wieder aufgenommen, um unter Vermeidung der Bildung kohäsiver Enden Duplexe zwischen den kurzen Fragmenten (Alu/Rsa, Kompetitor) und den langen Fragmenten (Not/Sal der Ziel-DNA) zu bilden. Die spezifisch in den jungen Zytotrophoblasten exprimierten komplementären cDNA-Stränge ermöglichen die Wiederherstellung der kohäsiven Notl- und Sall-Enden zur gerichteten Klonierung in die Schnittstellen eines pBSKII + Phagemidvektors (Stratagene).
Screening der Bank
Die subtrahierte cDNA-Bank wird auf Agar-Nährboden ausplattiert, und die rekombinanten Kolonien werden entnommen und in LB-Medium überimpft und mittels PCR amplifiziert. Die Plasmid-DNAs, die mittels der Methode der aufgekochten Minipräparate (Del Sal G. et al. Nucleic Acids Res., 16: 9878, 1988) präpariert und mit Notl und Sall verdaut wurden, oder die Produkte der Inserts, die mit Hilfe der ursprünglichen Primer mittels PCR amplifiziert wurden, werden mittels Southern-Blot auf 1,2%-igen Agarosegelen analysiert. Die mittlere Größe der Inserts liegt zwischen 500 und 1000 Nukleotiden. Die Gele werden in einem alkalischen Puffer doppelt auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) transferiert. Die für die Hybridisierung verwendeten Sonden sind Gesamt-cDNAs, die aus den jungen Plazenten, den Plazenten aus der Endphase der Schwangerschaft und den aktivierten T-Lymphozyten synthetisiert wurden und mittels Multi-Random-Priming mit ³²P (Amersham) markiert wurden. Die Hybridisierung erfolgt über 18 Stunden bei 42°C, gefolgt von stringentem Waschen in 0,1 × SSC bei 50°C und Autoradiographie.
Northern-Blot-Analyse
5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben und Zelllinien werden auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert, das 2,2 M Formaldehyd enthält. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel mit bidestilliertem Wasser gewaschen und 30 Minuten mit 10 × SSC behandelt. Die RNA wird dann in 20 × SSC-Transferpuffer während 18 Stunden auf eine verstärkte Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schuell, Dassel) transferiert. Die transferierten RNAs werden vor der Hybridisierung durch UV-Bestrahlung auf den Membranen fixiert. Die Sonden, die zur Hybridisierung der Membranen verwendet werden, sind ausgeschnittene Inserts, die mittels Multi-Random-Priming mit ³²P markiert wurden, oder Einzelstrang-Sonden, die mittels PCR unter Verwendung eines Antisense-Universalprimers hergestellt wurden. Die Hybridisierung wird über Nacht bei 42°C durchgeführt, gefolgt von stringenten Waschbedingungen in 0,1 × SSC bei 50°C und Autoradiographie.
DNA-Sequenzierung und Analyse
Die Plasmid-DNAs werden mittels der Methode der aufgekochten Minipräparate präpariert. Die DNA-Sequenzierung erfolgt mit dem Sequenase-Kit, Version 2.0 (U.S. Biochemical). Die Primer sind entweder Universalprimer M13, T3, T7 oder spezifische interne Primer. Die Reaktionsprodukte werden auf Gelen analysiert, die 6% Acrylamid und 50% Harnstoff enthalten. Die erhaltenen Sequenzen werden mit den Sequenzen aus den verschiedenen Datenbanken verglichen.
Analyse
Die Klone, die mit den normierten Sonden kein Hybridisierungssignal ergeben, werden mittels partieller Sequenzierung und Vergleich mit den Datenbanken analysiert.
Einer der Klone, der EPIL/Plazentin entspricht, entspricht der Aminosäuresequenz der Sequenz ID 1.

Die Gesamt-RNA- und PolyA-Proben, die aus transformierten oder normalen Zelllinien und den entsprechenden Geweben präpariert wurden, werden mittels Northern-Blot mit Hilfe von markierten einzelsträngigen EPIL/Plazentin-Antisense-cDNA-Sonden analysiert. Die Hybridisierungssignale werden nur in den Plazenten, insbesondere zu Beginn der Schwangerschaft, nachgewiesen und sind, wie aus der nachstehenden Tabelle (Tabelle 1) hervorgeht, in den anderen Geweben praktisch nicht vorhanden: TABELLE 1

JUNGE PLAZENTA	++++
PLAZENTA AUS DER ENDPHASE	++
NORMALE LEBER	–
TUMORÖSE LEBER	–
NORMALE BLASE	–
TUMORÖSE BLASE	–
NORMALES EPIPLOON	–
TUMORÖSES EPIPLOON	–
NORMALER ÖSOPHAGUS	–
TUMORÖSER ÖSOPHAGUS	–
NORMALER KOLON	–
TUMORÖSER KOLON	–
NORMALER MAGEN	–
TUMORÖSE ZERVIX	–
NORMALES ENDOMETRIUM	–
NORMALES OVAR	–
TUMORÖSE BRUST	–
TUMORÖSER LYMPHKNOTEN	–
NORMALE MILZ	–
NORMALES REKTUM	–
TUMORÖSES REKTUM	–
NORMALER EILEITER	–
NORMALE HAUT	–
NORMALES MYOMETRIUM	–
NORMALE NEBENNIERE	–
NORMALE SCHILDDRÜSE	–
TUMORÖSE SCHILDDRÜSE	–

An Produkten muriner und simianer Herkunft durchgeführte Studien zeigen Analogien, die auf funktionelle Ähnlichkeiten zwischen den Arten hinweisen.
Expression von EPIL/Plazentin
Für die eukaryotische Expression von EPIL/Plazentin wurde die cDNA in "sense"- und "antisense"-Orientierung in den Expressionsvektor pBK-CMV inseriert.
Zwei Zelltypen wurden verwendet, um die möglichen Auswirkungen der den Zelltypen eigenen posttranslationellen Modifikationen zu untersuchen. COS-7-Affennierenzellen wurden für eine transiente Expression mit DEAE transfiziert, während menschliche SV40-transformierte trophoblastische Zellen (3AsubE) für eine transiente und stabile Expression mit CaPO₄ transfiziert wurden.
Die COS-7- und 3AsubE-Zellen exprimieren in der Northern-Blot-Analyse keine nachweisbaren Mengen an EPIL/Plazentin-mRNA. Die transfizierten Zellen werden mit einem serumfreien Kulturmedium konditioniert.
Die konditionierten Medien, die von den sense- oder antisense-transfizierten Zellen erhalten wurden, werden auf die Anwesenheit von rekombinanten Proteinen getestet.
Die biologische Aktivität des rekombinanten Proteins wird an verschiedenen Zielzellen getestet, wobei berücksichtigt wird, dass die spezifischen Rezeptoren vorliegen können oder dass bei Molekülen mit ähnlicher Struktur das Protein an andere Rezeptoren binden kann, wie dies für Insulin und IGF gezeigt wurde.
Die beobachteten vorläufigen Ergebnisse legen nahe, dass EPIL/Plazentin die Tyrosinphosphorylierung der Zellproteine induziert und eine biologische Aktivität auf das Wachstum der Trophoblastenzellen hat. SEQUENZPRQTOKOLL

Claims

EPIL/Plazentin, Protein mit der Sequenz ID 1, und dessen Analoga, die eine Aktivität vom EPIL/Plazentin-Typ aufweisen und durch Deletion und/oder Substitution erhalten werden, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 60% Homologie zu der Sequenz ID 1 aufweisen.
EPIL/Plazentin nach Anspruch 1 mit der Sequenz ID 1.
EPIL/Plazentin oder Analoga von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein glycosyliert ist.
DNA-Molekül, ausgewählt aus: (a) der DNA-Sequenz mit der Sequenz ID 1, (b) den DNA-Sequenzen, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes für EPIL/Plazentin oder dessen Analoga nach Anspruch 1 oder 2 codieren.
DNA-Molekül mit der Sequenz ID 1.
Expressionsvektor, der EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 2 unter der Kontrolle von Elementen exprimiert, welche dessen Expression in einer Wirtszelle sicherstellen können.
Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen selbstreplizierenden Vektor umfasst, der EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 2 exprimiert.
Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.
Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Bakterium handelt.
Verfahren zur Herstellung von EPIL/Plazentin oder einem Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 2, gekennzeichnet durch das In-Kultur-Geben von Zellen nach einem der Ansprüche 7 bis 9, aus denen man direkt oder ausgehend vom Kulturmedium EPIL/Plazentin oder dessen Analoga extrahiert.
EPIL/Plazentin oder Analogon von EPIL/Plazentin, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 10.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Monoklonale Antikörper, gerichtet gegen EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
In-vitro-Diagnoseverfahren, das EPIL/Plazentin oder ein Analogon von EPIL/Plazentin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 13 verwendet.