DE69637217T2

DE69637217T2 - Meltrine

Info

Publication number: DE69637217T2
Application number: DE69637217T
Authority: DE
Inventors: Atsuko Koganei-shi FUJISAWA; Toru Yamakawa; Kamon Shirakawa; Chitose Mizushima; Naoki Ogawa
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2016-10-18
Also published as: US20020147132A1; AU7333296A; CA2247067A1; EP0933423A4; JP4118336B2; CA2247067C; US7605226B2; US20060247164A1; US7060791B2; EP0933423A1; WO1997031109A1; EP0933423B1; DE69637217D1; ATE371030T1

Description

Bereich der Technik
Diese Erfindung betrifft Meltrine und Polypeptide der jeweiligen Domänen davon; DNAs, welche dieselben kodieren; Antisense-Oligonucleotide für diese DNAs; verschiedene Antikörper gegen diese Meltrine und die Polypeptide der jeweiligen Domänen davon; Expressionsvektoren, welche die DNAs umfassen; Transformanten, welche unter Verwendung dieser Expressionsvektoren aufgebaut wurden; ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten Meltrine und der Polypeptide der jeweiligen Domänen davon mittels den Transformanten; und Arzneimittel, welche die Meltrine oder Meltrin-Antagonisten als einen Wirkstoff umfassen.
Stand der Technik
Im Laufe der Myotube-Bildung beginnen Myoblasten, welche sich von myogenen Zellen abgespalten haben, welche in nicht differenzierten mesodermalen Zellen ihren Ursprung haben, und wachsen, um zu differenzieren, Muskel-spezifische Substanzen wie Myosin und Actin nach ihrer letzten Teilung zu synthetisieren und sie werden Zellgrenzen an der Fusionsoberfläche verlieren, wobei sie zu vielkernigem Syncytium transformiert werden, was Myotube genannt wird, durch Adhäsion und Fusion der Cytoplasmamembrane mit benachbarten Zellen der selben Art.
Es wurde bereits von mehreren Arten von Membranproteinen berichtet, welche in die Myotube-Bildung einbezogen sind, wie N-Cadherin (Knudsen, K.A. et al., Expl. Cell Res., 188, 175-184 (1990), Merge, R.M. et al., J. Cell Sci., 103, 897-906 (1992)), M-Cadherin (Donalies, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 88, 8024-8028 (1991)), N-CAMs (Merge, R.M. et al., J. Cell Sci., 103, 897-906 (1992) und Andere), V-CAMs und Integrine (Rosen, G.D. et al., Cell 69, 1107-1119 (1992) und Andere).
Jedoch wurde der molekulare Mechanismus, betreffend den Verlauf der Bildung des vielkernigen Syncytiums, welches Myotube genannt wird, durch Adhäsion und Fusion der Cytoplasmamembrane der Myoblasten miteinander, noch nicht ausreichend verstanden.
Auf der anderen Seite sind die Substanzen, welche „Fusionspeptide" genannt werden, als ein Adhäsionsfaktor, der in den Verlauf einer Infektion von Zellen mit Viren einbezogen ist, bekannt (Morrison, T.G. Virus Res., 10, 113-136 (1988) und die Anderen). Es wurde gefunden, dass Fertilin, welches kürzlich als ein Faktor isoliert wurde, der in die Sperma-Ei-Adhäsion einbezogen ist, eine Sequenz enthält, welche ähnlich zum Fusionspeptid des Rubella-Virus ist (Biobel, C.P. et al., Nature 356, 248-252 (1992) und die Anderen).
Viele Substanzen mit Adhäsionsaktivität sind bekannt, wie vorstehend erwähnt, und Substanzen, welche die Aktivität von Integrinen und dergleichen inhibieren können, wurden entwickelt und als mögliche Arzneistoffe untersucht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun neue Substanzen isoliert, welche in die Adhäsion einbezogen sind. Insbesondere unter der Annahme, dass ein Fusionspeptidähnlicher Adhäsionsfaktor, wie bei der Sperma-Ei-Adhäsion, in die Adhäsion und Fusion der Myoblasten miteinander im Laufe der Myotube-Bildung einbezogen sein kann, wurden die neuen Substanzen, welche in die Zelladhäsion einbezogen sind, kloniert und „Meltrine" genannt, wobei stark konservierte Sequenzen in Fertilin α und β als eine Sonde verwendet wurden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues „Meltrin". „Meltrine" werden als Proteine charakterisiert, welche im Laufe der Differenzierungsinduktion von Muskelzellen exprimiert werden und welche stark konservierte Sequenzen in Fertilin α und β enthalten. Meltrine werden auch als Proteine charakterisiert, welche in die Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Zellen einbezogen sind. Folglich können einige Arten von Zellen wie Muskelzellen über Meltrine fusionieren, aggregieren oder adhärieren.
Zellfusion bedeutet, dass mehr als zwei Zellen miteinander fusionieren, wobei ein vielkerniges Syncytium gebildet wird. Adhäsion von Zellen bedeutet, dass mehr als zwei Zellen aneinander adhärieren. Aggregation von Zellen bedeutet, dass mehr als zwei Zellen (insbesondere die Zellen, welche in Flüssigkeit vorliegen) zusammen eine Flocke bilden, wobei sie eine Masse von Zellen bilden. Man kann annehmen, dass Zellen aneinander adhärieren, gefolgt von Zellfusion und -aggregation.
Gemäß der Erfindung wird so ein lösliches Meltrin-Polypeptid bereitgestellt, welches keine Transmembrandomäne oder intrazelluläre Domäne umfasst und welches die Aminosäuresequenz von Gly (Nr. 1) bis Ile (Nr. 686) von dem N-Terminus in 15a bis 15f oder die Aminosäuresequenz von Glu (Nr. 156) bis Ile (Nr. 686) von dem N-Terminus in 15a bis 15f umfasst.
Die Erfindung stellt auch bereit:

– eine DNA, umfassend eine Rasensequenz, welche das Polypeptid der Erfindung kodiert;
– eine DNA der Erfindung, welche die Basensequenz von Nr. 1 bis Nr. 2058 von dem 5'-Terminus in 15a bis 15f umfasst;
– eine DNA der Erfindung, welche die Basensequenz von Nr. 1 bis Nr. 2848 von dem 5'-Terminus in 15a bis 15f umfasst;
– ein Antisense-Oligonucleotid, welches mit einem Teil der Sequenz von Nr. 1957 bis Nr. 2848 von dem 5'-Terminus in 15a bis 15f hybridisiert;
– einen Antikörper, welcher die C-terminale Region eines Meltrins erkennt, wobei sich die C-terminale Region von Aminosäure Nr. 653 bis Nr. 686 von dem Aminoterminus in 15a bis 15f erstreckt;
– einen Vektor, umfassend eine DNA der Erfindung;
– einen Transformanten durch den Vektor der Erfindung;
– ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung, wobei das Verfahren Kultivieren des geeigneten Transformanten der Erfindung umfasst;
– ein Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid, ein Antisense-Oligonucleotid oder einen Antikörper der Erfindung;
– die Verwendung eines Polypeptids, eines Antisense-Oligonucleotids oder eines Antikörpers der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes, der mit krankhafter gesteigerter Knochenresorption in Zusammenhang steht; und
– die Verwendung eines Polypeptids, eines Antisense-Oligonucleotids oder eines Antikörpers der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Metastasierung von Krebszellen.

Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, wurden mindestens drei Arten von Molekülen (α, β und γ) aus einer Tierspezies isoliert.
Die Meltrine können die Maus-Meltrine α, β und γ sein, welche durch die Aminosäuresequenzen, die in 2a bis 2j, 3a bis 3j beziehungsweise 4a bis 4i gezeigt werden, oder durch Teilsequenzen davon charakterisiert sind.
Andere Beispiele sind die humanen Meltrine α, β und γ, welche durch die Aminosäuresequenzen, die in einer von 12a bis 12b, 15a bis 15f oder 23a bis 23b; einer von 16 oder 17a bis 17c; beziehungsweise 13a bis 13d gezeigt werden, oder durch Teilsequenzen davon charakterisiert sind.
Die vorstehenden Aminosäuresequenzen sollten nur als Beispiele von Meltrinen angesehen werden. Jedwede Variante der vorstehenden Aminosäuresequenzen, wobei ein Teil der Sequenzen aufgrund von Deletion, Substitution, Addition, Insertion und dergleichen von Aminosäuren verändert wurde, ist deshalb ein Meltrin, solange sie in Muskelzellen exprimiert wird und die stark konservierten Sequenzen in Fertilin α und β aufweist oder in die Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Zellen einbezogen ist. Wie nun von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gezeigt, wird eine hohe Homologie im Teil von der Disintegrindomäne zur Cystein-reichen Region der Mausaminosäuresequenzen, welche in 2a bis 2j gezeigt werden, und der humanen Aminosäuresequenzen, welche in 12a bis 12b gezeigt werden, gesehen. Man nimmt an, dass solche Substanzen, wenn sie eine Homologie von etwa 80% oder mehr, bevorzugt etwa 90% oder mehr, zu den vorstehenden Aminosäuresequenzen zeigen, die Funktion als Meltrin erhalten können. Insbesondere nimmt man an, dass die Substanzen mit den Sequenzen mit einer Homologie von etwa 80% oder mehr, bevorzugt etwa 90% oder mehr, zu der Region von der Metallproteinasedomäne zur Disintegrindomäne von Maus- oder humanen Meltrinen α, β und γ im Wesentlichen die gleiche Aktivität aufweisen werden, sogar wenn alle anderen Sequenzen von ihnen unterschiedlich sind. Demgemäß können Meltrine Substanzen mit einer hohen Homologie zu den vorstehenden Aminosäuresequenzen oder zu einem Teil davon einschließen und im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie Maus- oder humane Meltrine zeigen.
Mit anderen Worten, Meltrine können durch das Aufweisen von Aminosäuresequenzen charakterisiert sein, welche durch Rasensequenzen kodiert werden, die die Sequenzen hybridisieren, welche zu den Rasensequenzen komplementär sind, die eine der Aminosäuren kodieren, welche in 2a bis 2j, 3a bis 3j, 4a bis 4i, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c oder 23a bis 23b gezeigt sind.
Meltrine liegen in Körpern als ein Membranprotein, welches aus einer intrazellulären Domäne, Transmembrandomäne und extrazellulären Domäne besteht; und als ein lösliches Protein ohne Transmembrandomäne vor. Die extrazelluläre Domäne enthält eine Vorläuferdomäne, Metallproteinasedomäne, Disintegrindomäne und Cystein-reiche Region. Meltrin α weist eine Fusionspeptid-ähnliche Sequenz in ihrer Cystein-reichen Region auf (siehe 8).
Die Disintegrindomäne ist für die Funktion der Meltrine wie Adhäsion, Fusion und Aggregation von Zellen unentbehrlich. Auf der anderen Seite nimmt man an, dass die Vorläufer- und Metallproteinasedomänen regulierende Sequenzen für Meltrine sind, damit sie die Aktivität in einem speziellen Organ oder Gewebe oder unter speziellen Bedingungen zeigen. Es ist bekannt, dass das Disintegrin, welches in Schlangengift gefunden wird, an Plättchen IIb/IIIa adhäriert. Es wird deshalb angenommen, dass die Disintegrindomäne selbst die Funktion zum Adhärieren an Zellen aufweisen kann. Die Metallproteinasedomäne kann selbst als eine Protease als solche wirken.
Ein Polypeptid kann jedweden Teil eines Meltrins umfassen. Solche Polypeptide schließen die jeweilige Domäne der Meltrine per se, Polypeptide, welche mindestens die jeweilige Domäne der Meltrine umfassen, jedweden Teil der Sequenzen der Meltrine, Polypeptide, welche mindestens jedweden Teil der Sequenzen der Meltrine umfassen, und Polypeptide, welche mindestens die Sequenz mit der Kombination von jedweder der jeweiligen Domänen der Meltrine und jedwedem Teil der Meltrine in jedweder Reihenfolge umfassen, ein. Die vorstehenden Polypeptide, welche chemisch modifiziert oder in Salze davon umgeformt wurden.
Die bevorzugten Beispiele von solchen Polypeptiden schließen Polypeptide, welche aus einem Teil der Disintegrindomäne bestehen, Polypeptide, welche aus der Disintegrindomäne per se bestehen, Polypeptide, welche mindestens die Disintegrindomäne umfassen, Polypeptide, welche mindestens die Disintegrin- und Cystein-reichen Regionen umfassen, Polypeptide, welche mindestens die Metallproteinase-, Disintegrin- und Cystein-reichen Regionen umfassen, Polypeptide, welche aus einem der Teil der Metallproteinasedomäne bestehen, und Polypeptide, welche aus der Metallproteinasedomäne per se bestehen, ein.
Als andere bevorzugte Beispiele der vorliegenden Polypeptide können jene erwähnt werden, welche mindestens die Disintegrin- und Cystein-reichen Regionen umfassen, aber nicht die Transmembrandomäne umfassen, oder weder die Transmembrandomäne noch die intrazelluläre Domäne umfassen; und jene, welche mindestens die Metallproteinase-, Disintegrin- und Cystein-reichen Regionen umfassen, aber nicht die Transmembrandomäne umfassen oder weder die Transmembrandomäne noch die intrazelluläre Domäne umfassen. Solche Polypeptide, welche keine Transmembrandomäne umfassen, sind ein lösliches Polypeptid, welches durch eine Zellmembran in den extrazellulären Bereich sekretiert wird. Die löslichen Polypeptide können aus dem Überstand des Kulturmediums von Zellen gesammelt werden. Wenn gegebenenfalls strangabwärts einer geeigneten Signalsequenz kombiniert und durch Zellen in einem gentechnischen Verfahren exprimiert wird, werden sie in den Kulturüberstand sekretiert und vorteilhafterweise daraus mit einer hohen Effizienz gesammelt.
Die Aminosäuresequenzen in 2a bis 2j, 3a bis 3j, 4a bis 4i, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c und 23a bis 23b, welche der Vorläuferdomäne, Metallproteinasedomäne, Disintegrindomäne, Cystein-reichen Region, intrazellulären Domäne und Transmembrandomäne von Maus- und humanen Meltrinen α, β und γ entsprechen, werden in den Beispielen erörtert. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Polypeptide mit den vorstehenden entsprechenden Aminosäuresequenzen nur Beispiele darstellen. Das heißt, es können auch Polypeptide, welche im Wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen umfassen, hergestellt werden. Folglich sind die Grenzen jeder Domäne nicht auf jene, welche in den Beispielen definiert sind, eingeschränkt. Polypeptide, welche die Domänen umfassen, wobei die Grenzen zu den N-, C-Termini oder Beiden um 1 bis etwa 20 Aminosäuren von den Grenzen, welche in den Beispielen definiert sind, verschoben sind, können auch hergestellt werden, solange sie im Wesentlichen die gleiche Funktion wie die der vorstehenden Polypeptide aufweisen. In ähnlicher Weise können auch die Polypeptide, wobei ein Teil der Aminosäuresequenzen aufgrund von Deletion, Substitution, Addition, Insertion und dergleichen von Aminosäuren verändert wurde, hergestellt werden, solange sie im Wesentlichen die gleiche Funktion wie die von jeder Domäne aufweisen.
Man nimmt an, dass die Polypeptide, welche solche Aminosäuresequenzen umfassen, die eine Homologie von etwa 80% oder mehr, bevorzugt etwa 90% oder mehr, zu den Aminosäuresequenzen in jeder Domäne der vorstehenden Figuren zeigen, die gleiche Funktion wie die des Polypeptids der vorliegenden Erfindung aufweisen können.
Das Meltrin der vorliegenden Erfindung kann zum Binden von Zellen aneinander oder an Geräte wie eine Platte verwendet werden. Es kann auch mit jedweden anderen Substanzen fusioniert werden, um die Substanzen an Muskelzellen über ihre Verwendung in Kultursystemen der Muskelzellen, Geweben oder Körpern wirksam bereit zu stellen.
Auf der anderen Seite können die Polypeptide, welche mindestens einen Teil von Meltrinen umfassen, zu den Kultursystemen gegeben werden, um die Adhäsion, Fusion oder Aggregation von Zellen kompetitiv zu inhibieren. Insbesondere kann die Disintegrindomäne per se, ein Teil davon oder ein lösliches Polypeptid, welches die Disintegrindomäne umfasst, als ein Wirkstoff in einem Arzneimittel zur Inhibierung der Adhäsion von Zellen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein solches Arzneimittel als ein Antikoagulanz zur Inhibierung von Thrombusbildung oder Blutgerinnung verwendet werden und kann zur Behandlung von Thrombose, DIC und Multiorganversagen verwendet werden. Da man annimmt, dass Adhäsionsfaktoren wie die Integrinfamilie in die Metastasierung von Krebszellen einbezogen sind, können darüber hinaus die Polypeptide, welche die Disintegrindomäne umfassen, als ein Arzneistoff zur Inhibierung des Wachstums von Krebs oder der Adhäsion von Krebszellen an anderen Zellen, um so ihre Metastasierung zu verhindern, verwendet werden. Zusätzlich zum Vorstehenden ist bekannt, dass die Adhäsion von Zellen eine wichtige Rolle bei der Bildung von Osteoclasten spielt. Die Beispiele zeigen, dass Meltrin in die Adhäsion bei der Bildung von Osteoclasten einbezogen sind und dass anti-Meltrin-Antikörper die Bildung von Osteoclasten und den Anstieg von Knochenresorption inhibieren können. Demgemäß kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung als ein Wirkstoff in einem Arzneimittel zur Inhibierung des Anstiegs von Knochenresorption, wie anti-Meltrin-Antikörper, verwendet werden.
Unter den Polypeptiden, welche mindestens einen Teil des Meltrin der vorliegenden Erfindung umfassen, können jene, welche die Metallproteinasedomäne umfassen, selbst als ein Protease wirken oder zur kompetitiven Inhibierung der Aktivität von anderen Proteasen verwendet werden, so dass sie als ein Arzneistoff zur Behandlung von Entzündungserkrankungen verwendet werden können.
Das Meltrin-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Antigen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNAs, welche die Basensequenz umfassen, die die Aminosäuresequenzen des Meltrins der vorliegenden Erfindung oder die Polypeptide, welche jedwede Teile davon umfassen, kodiert.
Die vorstehenden DNAs schließen jeden Typ von DNAs wie Genom-DNAs und cDNAs ein.
Beispiele von DNAs, welche Meltrin kodieren, sind jene, welche die Maus-Meltrin α, β und γ kodieren oder die Polypeptide, welche jedwede Teile davon umfassen, die durch die Kodierregionen charakterisiert sind, welche als die Rasensequenzen in 5a bis 5j, 6a bis 6h beziehungsweise 7a bis 7e gezeigt sind, oder Teilsequenzen davon. Andere Beispiele sind jene, welche die humanen Meltrin α, β und γ kodieren oder die Polypeptide, welche jedwede Teile davon umfassen, die durch die Kodierregionen der Sequenzen charakterisiert sind, welche als die Rasensequenzen in irgendeiner von 12a bis 12b, 15a bis 15f oder 23a bis 23b; irgendeiner von 16 oder 17a bis 17c; beziehungsweise 13a bis 13d gezeigt sind, oder Teilsequenzen davon.
Die Rasensequenzen in den vorstehenden Figuren, welche der Vorläuferdomäne, Metallproteinasedomäne, Disintegrindomäne, Cystein-reichen Domäne, intrazellulären Domäne und Transmembrandomäne von Maus- und humanen Meltrinen α, β und γ entsprechen, werden in den Beispielen erörtert. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass sie nur Beispiele von solchen DNAs darstellen. DNAs, welche im Wesentlichen die gleichen Rasensequenzen umfassen, können auch hergestellt werden. Folglich sind die Grenzen von jeder Domäne nicht auf jene, welche in den Beispielen definiert sind, eingeschränkt. Und die DNAs, welche Sequenzen umfassen, die die Domänen kodieren, wobei die Grenzen zu den 5'- und/oder 3'-Enden um 1 bis etwa 60 Basenpaare von den Grenzen, welche in den Beispielen definiert sind, verschoben sind, können auch hergestellt werden, solange sie die Polypeptide mit im Wesentlichen der gleichen Funktion wie die von jeder Domäne kodieren.
Zusätzlich zu den vorstehenden Rasensequenzen können DNAs hergestellt werden, welche die Rasensequenzen oder Teilsequenzen davon umfassen, die die gleichen Aminosäuresequenzen kodieren, wie vorstehend mittels chemischer Synthese oder Gentechnik hergestellt, unter Berücksichtigung der Degeneriertheit von Codons.
Wie nun durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, wird eine hohe Homologie in Maus- und humanen Meltrinen gesehen. Man nimmt deshalb an, dass die Substanzen, welche eine Homologie von etwa 80% oder mehr, bevorzugt etwa 90% oder mehr, zu den vorstehenden Aminosäuresequenzen zeigen, die Funktion als Meltrin erhalten können und dass DNAs, welche solche homologen Polypeptide kodieren, miteinander hybridisieren. Demgemäß können DNA-Fragmente durch Hybridisieren unter strengen Bedingungen unter Verwendung der DNAs mit den Rasensequenzen, welche zu jenen in den vorstehenden Figuren komplementär sind, als eine Sonde erhalten werden.
Die DNAs der Maus- oder humanen Meltrine α, β und γ oder Teilsequenzen davon können in Plasmidvektoren eingesetzt werden. Stämme von E. coli, welche mit den gleichen Plasmidvektoren transformiert wurden, wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Die hier beschriebenen DNAs können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Die cDNAs können zum Beispiel durch die Verwendung einer cDNA-Bibliothek und bekannter PCR (z.B. Michael A.I. et al., PCR Protocols, a guide to method and application, Acadmic Press, 1990) mit degenerativen Primern für einen Teil der Aminosäuresequenzen (zum Beispiel der degenerative Primer, der die Aminosäuresequenzen der Disintegrindomäne kodiert), welche in 2a bis 2j, 3a bis 3j, 4a bis 4i, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c und 23a bis 23b gezeigt werden, hergestellt werden. Die hier beschriebenen DNAs können auch durch Hybridisierverfahren unter Verwendung einer Sonde, welche auf der Basis der Rasensequenzen der vorstehend amplifizierten DNA-Fragmente hergestellt wurde, hergestellt werden.
Wie in den Beispielen gezeigt, schließt die bevorzugte Quelle einer cDNA-Bibliothek Zellen, welche durch Induzieren einer Differenzierung von Myoblasten erhalten werden, Knochenmark- und fötale pulmonale Zellen ein. Bekannte cDNA-Bibliotheken, welche aus Plazenta, Chorionzellen und fötalen Zellen hergestellt wurden, können auch als die Quelle der cDNA-Bibliothek in der vorliegenden Erfindung dienen.
Unter den hier beschriebenen DNAs können diejenigen, welche das Polypeptid kodieren, in welchem jedwede Teile der Meltrine in jedweder Reihenfolge kombiniert sind, durch die folgenden Schritte hergestellt werden. Das heißt, jedes DNA-Fragment, welches jedweden Teil der Meltrine kodiert, wird durch PCR amplifiziert, wobei die Primer gegebenenfalls modifiziert sein können, um eine geeignete Restriktionsenzymstelle bereit zu stellen. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden miteinander durch DNA-Ligase ligiert, so dass ein Leserahmen nicht verschoben werden sollte.
Die hier beschriebenen DNAs können zur Herstellung der Meltrine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung mittels Gentechnik verwendet werden. Eine solche Herstellung kann mit Bezug auf bekannte Verfahren (zum Beispiel Sambrook J. et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) durchgeführt werden.
Die hier beschriebenen DNAs, welche in geeignete Vektoren eingesetzt werden, können auch bei Gentherapie verwendet werden. Die Basensequenz, welche jedwede physiologisch aktive Substanzen kodiert, wird strangabwärts der vorliegenden DNAs fusioniert, gefolgt von Einsetzen der resultierenden fusionierten DNA in einen Vektor mit einem geeigneten Virus als Ursprung, und Zellen in einem lebenden Körper werden mit dem resultierenden Vektor transformiert, so dass die physiologisch aktiven Substanzen als ein fusioniertes Protein mit dem Meltrin der vorliegenden Erfindung exprimiert werden können. Die so exprimierten physiologisch aktiven Substanzen werden nahe den Zellen, an welchen Meltrine adhärieren, bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antisense-Oligonucleotide und Derivate davon für die DNAs, welche das Meltrin der vorliegenden Erfindung kodieren, oder für die Polypeptide, welche jedweden Teil davon umfassen.
Die vorliegenden Antisense-Oligonucleotide und Derivate davon sind durch ihre Rasensequenzen, welche zu jenen komplementär sind, die Meltrin oder einen Teil davon kodieren, oder durch ihre Funktion zur Inhibierung der Expression von Meltrinen oder der Polypeptide, welche jedweden Teil davon umfassen, charakterisiert. Die Antisense-Oligonucleotide und Derivate davon, welche durch letzteres Merkmal charakterisiert sind, schließen jene, welche komplementär an die nicht-kodierenden Regionen binden, die strangaufwärts oder strangabwärts zu den Kodierregionen der Meltrin vorhanden sind, sowie jene, welche komplementär an die Kodierregionen der Meltrin oder jedweden Teil davon binden, ein.
Beispiele der hier beschriebenen Antisense-Oligonucleotide und Derivate davon schließen die Rasensequenzen, welche komplementär zu den DNAs der vorliegenden Erfindung oder jedwedem Teil davon sind, insbesondere zu jenen, welche in 5a bis 5j, 6a bis 6h, 7a bis 7e, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c und 23a bis 23b gezeigt werden, ein. Uracil (U) kann anstelle von Thymin (T) als eine komplementäre Base zu Adenin (A) verwendet werden.
Die Derivate der vorliegenden Antisense-Oligonucleotide schließen jedwedes ein, welches zu den Antisense-Oligonucleotiden in der sterischen Struktur und Funktion ähnlich ist, wie jene, wobei andere Substanzen an das 3'- oder 5'-Ende der Oligonucleotide gebunden sind; jene, wobei mindestens eines von Basen, Zuckern oder Phosphorsäuren in den Oligonucleotiden eine Substitution oder Modifizierung aufweist; jene mit nicht natürlich vorkommenden Basen, Zuckern oder Phosphorsäuren; und jene mit einem Gerüst, welches verschieden von Zuckern-Phosphorsäuren ist.
Das Antisense-Oligonucleotid der Erfindung und Derivate davon können durch bekannte Verfahren hergestellt werden (zum Beispiel, Aut., Stanley T. Crooke und Bernald Lebleu, in Antisense Research and Applications, CRC Publishing, Florida, 1993).
Das vorliegende Antisense-Oligonucleotid eines natürlich vorkommenden Typs kann durch das chemische Synthetisieren von Sense-Primern und Antisense-Primern mit den Rasensequenzen, welche zum 3'- oder 5'-Ende der Antisense-Oligonucleotidsequenzen komplementär sind, gefolgt von PCR unter Verwendung der Meltringene oder RNAs, welche Meltrine kodieren, als ein Templat hergestellt werden. Ansonsten können die Derivate der Antisense-Oligonucleotide wie ein Methylphosphonat und Phosphorthionat-Typen mittels einer chemischen Synthetisiervorrichtung (z.B. Perkin Elmer Japan Co., Typ 394) gemäß der Gebrauchsanweisung, welche der chemischen Synthetisiervorrichtung beigefügt ist, gefolgt von, falls notwendig, Reinigung der synthetisierten Produkte in einem HPLC-Verfahren unter Verwendung von Umkehrphasenchromatografie und dergleichen hergestellt werden.
Das vorliegende Antisense-Oligonucleotid und Derivate davon können mit Radioisotopen, fluoreszenten Substanzen, Enzymen oder lumineszenten Substanzen markiert und als eine Sonde zum Nachweisen der Existenz von Meltrinen oder jedwedem Teil davon in einer Probe verwendet werden. Das vorliegende Antisense-Oligonucleotid kann auch als ein Arzneimittel zur Inhibierung der Expression von Meltrinen in einem lebenden Körper verwendet werden.
Für den Zweck der Inhibierung der Expression von Meltrinen unter Verwendung des vorliegenden Antisense-Oligonucleotids und von Derivaten können sie in einem geeigneten Lösungsmittel löslich gemacht oder suspendiert, in ein Liposom eingeschlossen oder in einen geeigneten Vektor eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, dass das vorliegende Antisense-Oligonucleotid und Derivate davon, welche in dem Arzneimittel verwendet werden, eine pharmazeutisch verträgliche Reinheit aufweisen und in einem pharmazeutisch verträglichen Weg verwendet werden sollen.
Wie bereits vorstehend erwähnt, nimmt man an, dass Meltrine in die Bildung von Osteoclasten, das Wachstum und die Metastasierung von Krebs sowie die Skelettmuskelentwicklung einbezogen sind. Demgemäß können das vorliegende Antisense-Oligonucleotid und seine Derivate, welche zur Inhibierung der Expression von Meltrinen in der Lage sind, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Vorbeugung von Krebs, Behandlung von Osteoporose und Hyperkalzämie durch Inhibierung der Knochenresorption verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, welche das Meltrin der vorliegenden Erfindung oder die Polypeptide, welche mindestens einen Teil davon umfassen, erkennen. Mit anderen Worten, sie schließen jene, welche nur Meltrin der vorliegenden Erfindung erkennen, jene, welche nur die Polypeptide der vorliegenden Erfindung erkennen, und jene, welche beide von ihnen erkennen, ein.
Die hier beschriebenen Antikörper schließen jene ein, welche mit anderen Polypeptiden eine Kreuzreaktivität aufweisen, zusätzlich zu jenen, welche spezifisch Meltrin und die Polypeptide der vorliegenden Erfindung erkennen. Sie schließen auch jene, welche spezifisch eines der Meltrin α, β und λ erkennen, und jene, welche spezifisch mehr als zwei der Meltrine α, β und λ erkennen, sowie jene, welche nur Meltrin, die ihren Ursprung in einem besonderen Tier wie Mensch und Maus haben, oder nur die Polypeptide, welche mindestens einen Teil davon umfassen, erkennen, und jene, welche Meltrin, die ihren Ursprung in mehr als zwei Arten von Tieren haben, oder die Polypeptide, welche mindestens einen Teil davon umfassen, erkennen, ein.
Solche Antikörper schließen jene ein, welche die Aminosäuresequenzen in 2a bis 2j, 3a bis 3j, 4a bis 4i, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c oder 23a bis 23b oder jedweden Teil davon erkennen.
Stärker bevorzugt sind die hier beschriebenen Antikörper jene, welche durch Immunisierung von Tieren mit den Polypeptiden, die die Aminosäuresequenzen oder jedweden Teil davon als ein Antigen umfassen, wobei gegebenenfalls mit einem geeigneten Träger konjugiert werden kann, erhalten werden.
Solche Antikörper können durch Einsetzen von DNA, welche die in 5a bis 5j, 6a bis 6h, 7a bis 7e, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c oder 23a bis 23b gezeigten Rasensequenzen oder jedweden Teil davon umfasst, in einen geeigneten Expressionsvektor und Transformieren einer geeigneten Wirtzelle durch den Vektor hergestellt werden, wobei Meltrin hergestellt werden, welche aus den Zellkörpern des Transformanten oder dem Kulturmedium aufgereinigt werden und als ein Antigen verabreicht werden. Die Zellkörper per se des Transformanten oder jedwede Zelle, welche Meltrin per se exprimiert, können als ein Antigen verabreicht werden. Ein solcher Transformant oder Zellen können eines der Meltrine α, β und λ oder mehr als zwei Arten von ihnen exprimieren. Die Antikörper können auch durch chemisches Synthetisieren der Polypeptide mit einem Teil der Aminosäuresequenzen der Meltrine, Konjugieren von ihnen mit einem Träger wie KLH (Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin) und Verabreichen von ihnen als ein Antigen hergestellt werden.
Es ist möglich, den vorliegenden Antikörper herzustellen, der alle Meltrine erkennen kann, sogar wenn der Teil der Meltrine als ein Antigen verwendet wird, welches verabreicht wird. Es ist auch möglich, den vorliegenden Antikörper herzustellen, der humane Meltrine oder jedweden Teil davon erkennen kann, sogar wenn Maus-Meltrine oder jedweder Teil davon als ein Antigen verwendet werden, welches verabreicht wird.
Die hier beschriebenen Antikörper schließen monoklonale und polyklonale Antikörper ein und können zu jedweder Klasse oder Unterklasse gehören.
Die Antikörper können gemäß bekannten Verfahren (z.B. „Meneki jikkenho (Laboratory manual of Immunology)", veröffentlicht von der Japan Immunological Society) hergestellt werden. Ein Beispiel der bekannten Verfahren wird nachstehend beschrieben.
Eine geeignete Zelle wird durch einen Expressionsvektor, welcher die Kodierregionen der Rasensequenzen, welche in 5a bis 5j, 6a bis 6h, 7a bis 7e, 12a bis 12b, 13a bis 13d, 15a bis 15f, 16, 17a bis 17c oder 23a bis 23b gezeigt sind, oder jedweden Teil davon umfasst, transformiert und als ein Antigen als solches verwendet. Alternativ werden Meltrine, welche durch den Transformanten hergestellt werden, aus den Zellkörpern des Transformanten oder dem Kulturmedium aufgereinigt, um sie als ein Antigen zu verwenden, oder Polypeptide, welche aus Aminosäuresequenzen bestehen, welche in den vorstehenden Figuren gezeigt werden, werden chemisch synthetisiert, mit einem Träger wie KLH (Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin) konjugiert und gereinigt, um sie als ein Antigen zu verwenden.
Tiere werden mit dem so hergestellten Antigen geimpft, alleine oder zusammen mit einem geeigneten Adjuvans wie komplettes Freund-Adjuvans (FCA) oder nicht komplettes Freund- Adjuvans (FIA), wobei einem Verstärken für Zwei- bis Vierwochenintervallen ausgesetzt wird. Nach dem Verstärken wird den Tieren Blut abgenommen und Antiserum wird davon erhalten. Tiere, welche immunisiert werden, können aus Ratte, Maus, Kaninchen, Schaf, Pferd, Geflügel, Ziege, Schwein, Rind und dergleichen ausgewählt werden, abhängig von der Art des Antikörpers, der gewünscht ist. Polyklonale Antikörper können durch Reinigung des Antiserums durch bekannte Verfahren wie Aussalzen, Ionenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie und jedwede Kombination davon erhalten werden.
Monoklonale Antikörper können wie folgt hergestellt werden. Antikörper-herstellende Zellen wie Milzzellen und Lymphozyten werden von den immunisierten Tieren gesammelt und mit Myelom und dergleichen durch bekannte Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol, Sendai-Virus, elektrischen Puls fusioniert, um Hybridoma zu ergeben. Klone, welche einen Antikörper herstellen, der an das Meltrin der vorliegenden Erfindung bindet, werden dann selektiert und kultiviert. Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung werden aus dem Kulturüberstand der selektierten Klone durch bekannte Verfahren wie Aussalzen, Ionenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie und jedwede Kombination davon aufgereinigt.
Die vorliegenden Antikörper können neutralisierende Antikörper sein, welche die Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Zellen durch Meltrin inhibieren. Die neutralisierenden Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen jene, welche vollständig die Aktivität von Meltrinen inhibieren können, und jene, welche dieselbe teilweise inhibieren, ein.
Die neutralisierenden Antikörper können durch Geben von Antiserum oder Kulturüberstand der Hybridoma zu dem Kultursystem der Meltrin-exprimierenden Zellen durchgemustert (engl. screened) werden, um den Grad der Inhibierung der Fusion oder Aggregation der Zellen zu bewerten. Nach dem Durchmustern können die gewünschten Antikörper aus dem so ausgewählten Antiserum oder Kulturüberstand der Hybridoma durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen Fab, F(ab'), F(ab')₂ und Fv ein, solange sie die vorliegenden Polypeptide oder jedweden Teil davon erkennen und daran binden. Eine einzelne Kette Fv kann auch in die vorliegenden Antikörper eingeschlossen sein, welche durch Aufbauen eines Gens erhalten wird, das die einzelne Kette Fv kodiert, wobei die H und L-Ketten zu einer einzelnen Kette verbunden sind und durch eine geeignete Wirtzelle exprimiert werden. Chimäre Antikörper, humane Antikörper und humanisierte Antikörper sind auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange sie die vorliegenden Polypeptide oder jedweden Teil davon erkennen und daran binden.
Zum Beispiel können die chimären Antikörper durch Substituieren eines Gens, welches die konstante Region von humanen Antikörpern für ein Gen kodiert, das die konstante Region der Maus-Antikörper kodiert, welche Meltrine oder die Polypeptide der vorliegenden Erfindung erkennen, und Exprimieren des so rekonstituierten Gens in Tierzellen hergestellt werden. Die humanen Antikörper können durch zum Beispiel ein in vitro-Verfahren zum Empfindlichmachen (Borrebaeck, C.A.K.J. Immunol., Meth., 123, 157, 1989) oder das Verfahren unter Verwendung der SCID-Maus (Toshio KUDO, Tissue Culture, 19, 61-65, 1993) hergestellt werden. Die humanisierten Antikörper können durch Rekonstituieren eines Gens, so dass komplementäre bestimmende Regionen (CDR) der humanen Antikörper mit jenen der Maus-Antikörper ersetzt sind, und Exprimieren des Gens in Tierzellen (Carter et al., Pro. Nat. Acad. Sci., 89, 4285, 1992) hergestellt werden.
Falls notwendig, können Aminosäuren in einem Rahmen der variablen Region der so rekonstituierten humanisierten Antikörper ersetzt werden, so dass der Rahmen eine hohe Homologie zu dem der Maus-Antikörper aufweisen sollte, und die CDR der humanisierten Antikörper können eine geeignete Antigen-bindende Stelle bilden. Die bevorzugten Beispiele der humanisierten Antikörper sind jene mit der gleichen CDR wie die neutralisierenden Antikörper F932-15-2 und F937-9-2. Für die Herstellung dieser bevorzugten humanisierten Antikörper wird die DNA, welche die Antikörper kodiert, aus dem Hybridom F932-15-2 oder F937-9-2 hergestellt und mit den DNAs verbunden, welche humane Antikörper kodieren, so dass die Sequenzen, welche verschieden von den CDRs sind, ihren Ursprung in den humanen Antikörpern haben sollten. Jedwede Variation kann gegebenenfalls in die DNA, welche den Rahmenteil kodiert, eingebracht werden. Die so erhaltene DNA wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt, um eine geeignete Zelle zu transformieren, und die humanisierten Antikörper werden aus dem Kulturüberstand des Transformanten aufgereinigt.
Die vorliegenden Antikörper können mit fluoreszenten Substanzen, Enzymen, lumineszenten Substanzen oder Radioisotopen markiert werden, um Meltrine oder ihre zersetzten Produkte, welche in Körperfluid oder Geweben vorhanden sind, nachzuweisen. Da man annimmt, dass Meltrine in die Bildung von Myotube, die Knochenresorption und die Metastasierung von Krebs einbezogen sind, wie vorstehend bereits erwähnt, wird der Nachweis der Existenz von Meltrinen in Körperfluid oder Geweben möglich machen, das Fortschreiten der Erkrankungen und die Prognose einzuschätzen und die Wirkungen von Behandlungen zu bestätigen. Die vorliegenden Antikörper können auch zur Bereitstellung einer Antikörperaffinitätssäule oder zum Nachweisen von Meltrinen in einer Fraktion während dem Verlauf der Reinigung von Meltrinen verwendet werden.
Die neutralisierenden Antikörper der vorliegenden Erfindung können als ein Wirkstoff eines Arzneimittels zum Inhibieren von Knochenresorption, Entzündungserkrankungen, Blutgerinnung und Metastasierung von Krebs aufgrund ihres Vermögens zur Inhibierung der Fusion oder Adhäsion von Zellen dienen. Sie können als ein Mittel dienen, welches in Kultur zum Inhibieren der Aggregation von kultivierten Zellen verwendet wird. Wenn sie als der Wirkstoff des Arzneimittels verwendet werden, sind die humanen oder humanisierten Antikörper im Hinblick auf ihre Antigeneigenschaft bevorzugt.
Auch betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, welcher die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst. Der vorliegende Vektor kann ferner, falls notwendig, eine Enhancer-Sequenz, eine Promotor-Sequenz, eine Ribosomen-bindende Sequenz, eine Basensequenz zur Amplifizierung der Anzahl von Kopien, eine Sequenz, welche Signalpeptide kodiert, Sequenzen, welche andere Polypeptide kodieren, eine Poly(A)-Zusatzsequenz, eine Splicing-Sequenz, einen Replikationsursprung, eine Basensequenz des Gens für selektive Marker und so weiter enthalten.
Der vorliegende Vektor kann durch Einsetzen der DNAs der vorliegenden Erfindung in jedwede Vektoren gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden (z.B. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Die bevorzugten Beispiele der DNAs, welche Meltrine oder jedweden Teil davon kodieren, wurden bereits in der vorliegenden Beschreibung offenbart. Die vorliegenden Vektoren schließen einen Plasmidvektor, Phagenvektor und Virusvektor ein, wobei pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, pBluescriptII, PHIL-S1, λZap II, λgt10, pAc700, YRP17, pEF-BOS und pEFN-II bevorzugt sind.
Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls den Replikationsursprung, selektive Marker und einen Promotor zusätzlich zu den DNAs, welche Meltrine oder die Polypeptide, welche mindestens einen Teil davon umfassen, kodieren, so dass sie zum Exprimieren von Meltrinen oder den gleichen Polypeptiden verwendet werden können, umfassen. Als der Replikationsursprung können Co1E1, Faktor R, Faktor F und so weiter in den Vektoren für E. coli; welche, die von SV40 oder Adenvirus abgeleitet sind, in den Vektoren für Tierzellen; und welche, die von ARS1 abgeleitet sind, in den Vektoren für Hefe verwendet werden. Als der Promotor können trp-, lac- und tac-Promotoren in den Vektoren für E. coli; welche, die von SV40, Cytomegalovirus und Adenvirus abgeleitet sind, und jene, welche intrinsisch in den Genen des Menschen oder von Tieren vorhanden sind, wie die Promotorregion eines Elongationsfaktors 1α in den Vektoren für Tierzellen; und ein α-Promotor in den Vektoren für Hefe, insbesondere der AOX1-Promotor im Falle von Pichia-Hefe, verwendet werden. Zusätzlich zu den vorstehenden Sequenzen können die vorliegenden Vektoren ferner eine RNA-Splicingstelle, ein Signal für Polyadenylierung und dergleichen für die Transformation von eukaryotischen Zellen umfassen. Die vorliegenden Vektoren können zur Herstellung von Meltrinen oder jedwedem Teil davon mittels Gentechnik verwendet werden und sie können in der Gentherapie für mit Meltrinen in Zusammenhang stehende Erkrankungen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb Transformanten, welche mit den vorstehenden Vektoren transformiert wurden.
Die vorliegenden Transformanten können durch Transformieren von geeigneten Wirtzellen mit den vorstehenden Vektoren gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden (z.B. Idenshi Kogaku Handbook (Handbook of gene technology), Extraausgabe von Jikkenigaku, Yodo, 1991). Die Wirtzellen können aus Prokaryoten wie E. coli und Bacillus oder eukaryotischen Zellen wie Hefe, Insektenzellen und Tierzellen ausgewählt werden. Die bevorzugten Transformanten der vorliegenden Erfindung sind jene, welche von E. coli, Hefe oder einer CHO-Zelle abgeleitet sind, als eine Wirtzelle zum Exprimieren von Meltrinen oder den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Meltrinen oder der vorliegenden Polypeptide, welche mindestens einen Teil davon umfassen, umfassend den Schritt der Kultivierung der vorstehenden Transformanten.
Im vorliegenden Herstellungsverfahren werden die Transformanten der vorliegenden Erfindung kultiviert, gegebenenfalls mit Amplifizierung des Gens oder Expressionsinduktion, falls notwendig, gemäß bekannten Verfahren (z.B. Biseibutsugaku Jikkenho (Laboratory manual of microbiology), Tokyo Kagaku Dojin, 1992). Das Kulturgemisch, d.h. die Zellen und der Kulturüberstand, wird gesammelt und gegebenenfalls einer Konzentration, Löslichmachung, Dialyse und verschiedenen Chromatografien unterworfen, um die Meltrine oder die vorliegenden Polypeptide, welche jedweden Teil davon umfassen, zu reinigen. Die Reinigung der vorliegenden Polypeptide kann durch eine optionale Kombination der vorstehenden bekannten Verfahren zur Reinigung von Proteinen durchgeführt werden und eine wirksame Reinigung konnte unter Verwendung einer Affinitätssäule mit den Antikörpern der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
In dem vorliegenden Herstellungsverfahren können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch die Transformanten als ein fusioniertes Protein mit anderen Proteinen wie β-Galactosidase hergestellt werden. In einem solchen Fall sollte das fusionierte Protein mit Chemikalien wie Cyanogenbromid oder Enzymen wie Protease in einem bestimmten Schritt in dem Reinigungsverfahren behandelt werden, so dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung ausgeschnitten werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel, welche einen neuen Wirkstoff, der Meltrine der vorliegenden Erfindung oder ein Meltrin-Antagonist ist, umfassen. Der „Meltrin-Antagonist" bedeutet ein Molekül, welches zum Inhibieren der Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Zellen durch Meltrine in der Lage ist. Er schließt zum Beispiel die vorliegenden Antikörper, welche Meltrine erkennen und eine neutralisierende Aktivität aufweisen, die Fragmente der gleichen Antikörper, die Polypeptide, welche aus jedwedem Teil der Meltrine oder irgendeiner Kombination davon in irgendeiner Reihenfolge bestehen, die Antisense-Oligonucleotide für die DNAs, welche Meltrine oder Derivate davon kodieren, ein.
Die Antikörper, welche Meltrine erkennen, können durch die bereits vorstehend erwähnten Verfahren hergestellt werden und aus diesen werden die Antikörper, welche vollständig oder teilweise die Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Muskelzellen, Osteoclasten oder Krebszellen neutralisieren können, als der Wirkstoff der vorliegenden Arzneimittel ausgewählt und verwendet. Die Antikörper, welche als der Wirkstoff verwendet werden, schließen jene ein, welche durch Verabreichen von jedweden Polypeptiden als das Antigen an jedwede Tiere hergestellt werden, solange sie humane Meltrine erkennen und die Fusion, Adhäsion oder Aggregation von humanen Muskelzellen, Osteoclasten oder Krebszellen inhibieren können. Sie können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein, wobei unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Arzneimittel an Menschen verabreicht werden, die humanen oder humanisierten Antikörper bevorzugt sind. Die humanen oder humanisierten Antikörper können gemäß den bereits vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die vorstehenden Fragmente, welche als der Wirkstoff in den vorliegenden Arzneimitteln verwendet werden, schließen Fab, F(ab'), F(ab')₂ und Fv ein.
Die Polypeptide mit jedwedem Teil der Meltrine oder jedwede Kombination davon in jedweder Reihenfolge können als der Wirkstoff der Arzneimittel verwendet werden, solange sie die Aktivität zur Inhibierung der Fusion, Adhäsion oder Aggregation von Zellen aufweisen.
Die bevorzugten Beispiele der vorstehenden Polypeptide schließen jene, welche einen Teil oder die gesamte Disintegrindomäne von Meltrinen umfassen, jene, welche die Metallproteinase-, Disintegrin- und Cystein-reichen Regionen von Meltrinen umfassen, jene, welche die Disintegrindomäne umfassen, aber nicht die Transmembrandomäne von Meltrinen umfassen, und jene, welche mindestens die Metallproteinase- und Disintegrindomänen umfassen, aber nicht die Transmembrandomäne von Meltrinen umfassen, ein. Diese Polypeptide können chemisch synthetisiert oder mittels Gentechnik hergestellt werden, wie bereits vorstehend erwähnt.
Die Antisense-Oligonucleotide oder Derivate davon, welche als der Wirkstoff der Arzneimittel verwendet werden, können jedwede Rasensequenzen oder jedwede Struktur aufweisen, solange sie zur Verabreichung an Menschen geeignet sind, und werden komplementär an das Gen für Meltrine binden, um ihre Expression vollständig oder teilweise zu inhibieren.
Wie bereits erwähnt, Meltrine sind in die Bildung von Osteoclasten und die Metastasierung von Krebszellen einbezogen. Demgemäß können die Arzneimittel, welche den Meltrin-Antagonisten als den Wirkstoff umfassen, für den Zweck der Inhibierung von Knochenresorption oder der Metastasierung von Krebs verwendet werden. Der Antagonist gegen humanes Meltrin α oder β wird stärker bevorzugt als der Wirkstoff in dem Arzneimittel zur Inhibierung von Knochenresorption verwendet, während der Antagonist gegen humanes Meltrin γ stärker bevorzugt als der Wirkstoff in dem Arzneimittel zur Inhibierung von Krebsmetastasierung verwendet wird.
Die Meltrine oder der Meltrin-Antagonist, welche als der Wirkstoff im vorliegenden Arzneimittel verwendet werden, können in ihre Salze umgeformt werden oder mit pharmazeutisch verträglichen chemischen Mitteln modifiziert werden, solange sie ihre wesentlichen Aktivitäten nicht verlieren. Als die Salze können als beispielhaft jene mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure; und jene mit organischen Säuren wie Maleinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure und Weinsäure angegeben werden.
Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung schließen jene, welche über jedweden Weg verabreicht werden, wie orale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrakutane und intraintestinale Arzneimittel, ein.
Jedwede Verabreichungsverfahren und -intervalle können übernommen werden. Die vorliegenden Arzneimittel können abhängig vom Verabreichungsweg pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe wie Füllstoffe, Packungsmittel, Verdickungsmittel, Bindemittel, Befeuchtungsmittel, Sprengmittel, grenzflächenaktive Mittel, Lösungshilfsmittel, Puffer, Mittel zur Linderung von Schmerz, Konservierungsstoffe und Stabilisatoren umfassen. Im Falle von Injektionen können sie zum Beispiel Stabilisatoren wie Gelatine, humanes Serumalbumin (HSA) und Polyethylenglykol; Alkohole und Saccharide wie D-Mannitol, D-Sorbitol und Glucose; und grenzflächenaktive Mittel wie Polysorbate 80 (TM) umfassen.
Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung können hauptsächlich zur Vorbeugung und Behandlung von Osteoporose und Hyperkalzämie oder zur Vorbeugung der Infiltration und Metastasierung von Krebs verwendet werden.
Die vorliegenden Arzneimittel können in einer Menge von etwa 0,1 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt etwa 1 bis 50 mg/kg/Tag, stärker bevorzugt etwa 1 bis 10 mg/kg/Tag, abhängig von den Bedingungen oder dem Alter der Patienten oder den Verabreichungswegen verabreicht werden. Sie können auch kontinuierlich durch eine intravenöse Tropfinfusion verabreicht werden oder durch eine einzelne Dosis oder Dosen in geeigneten Intervallen pro Tag verabreicht werden.
Die vorliegenden Arzneimittel können gemäß den herkömmlichen Weisen formuliert werden. Die Injektion kann zum Beispiel durch Lösen der Meltrine oder ihrer Antagonisten in aseptischer Weise, wobei in einer pharmazeutisch akzeptablen Reinheit in physiologischer Salzlösung, Puffer und dergleichen hergestellt wird, gefolgt von der Zugabe von Gelatine oder HSA, falls notwendig, formuliert werden. Solche Injektionen können auch lyophilisiert werden, wobei in destilliertem Wasser für Injektionen, physiologischer Salzlösung und dergleichen gelöst wird, wenn sie verwendet werden.
Das Durchmustern der Substanzen, welche an Meltrine binden, die Aktivität von Meltrinen inhibieren oder ihre Expression regulieren können, kann unter Verwendung der Meltrine, verschiedenen Polypeptiden, DNAs, welche sie kodieren, und dergleichen durchgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1a bis 1b zeigen den Vergleich zwischen Teilen der Maus-Meltrine α, β, γ (welche als „Mα", „Mβ", „Mγ" bezeichnet werden) und den bekannten Sequenzen (Makrophagen-spezifisches Antigen (MS2), Jararhagin (JR), Fertilin α (fα)).
Die 2a bis 2j zeigen die Aminosäuresequenz von Maus-Meltrin α und seine entsprechende DNA-Sequenz.
Die 3a bis 3j zeigen die Aminosäuresequenz von Maus-Meltrin β und seine entsprechende DNA-Sequenz, wobei „N" eine nicht identifizierte Base bedeutet.
Die 4a bis 4i zeigen die Aminosäuresequenz von Maus-Meltrin γ und seine entsprechende DNA-Sequenz. „N" bedeutet nicht identifizierte Base.
Die 5a bis 5j zeigen das Ergebnis einer DNA-Sequenzanalyse der DNA, welche in pBSMelα eingesetzt wurde, welcher die Basensequenz, die Maus-Meltrin α kodiert, umfasst. „N", „M", „W" und „S" bedeuten nicht identifizierte Basen.
Die 6a bis 6h zeigen das Ergebnis einer DNA-Sequenzanalyse der DNA, welche in pBSMelβ eingesetzt wurde, welcher die Basensequenz, die Maus-Meltrin β kodiert, umfasst. „N", „M", „W" und „S" bedeuten nicht identifizierte Basen.
Die 7a bis 7e zeigen das Ergebnis einer DNA-Sequenzanalyse der DNA, welche in pBSMelγ eingesetzt wurde, welcher die Basensequenz, die Maus-Meltrin γ kodiert, umfasst. „N", „M", „W" und „S" bedeuten nicht identifizierte Basen.
8 zeigt schematisch die Strukturen der Meltrin α, β, γ, δMP, δPro.
9 ist eine Fotografie der Elektrophorese, welche das Ergebnis von Western-Blotting zeigt.
10 ist eine Fotografie der Elektrophorese, welche das Ergebnis von Northern-Blotting zeigt.
Die 11a bis 11b zeigen die Fusions-fördernde Aktivität der Meltrin für Myoblasten.
Die 12a bis 12b zeigen das Ergebnis einer Basensequenzanalyse der DNA, welche in pBShuMα300 eingesetzt wurde, welcher humanes Meltrin α kodiert. „N" und „X" bedeuten nicht identifizierte Basen beziehungsweise nicht identifizierte Aminosäuren.
Die 13a bis 13d zeigen das Ergebnis einer Basensequenzanalyse der DNA, welche in pBShuMγG238 eingesetzt wurde, welcher humanes Meltrin γ kodiert.
14a zeigt schematisch die Klonierregion beim Klonieren von humanem Meltrin α.
14b zeigt schematisch die Klonierregion beim Klonieren von humanem Meltrin β.
Die 15a bis 15f zeigen eine Teilaminosäuresequenz und ihre entsprechende Rasensequenz von humanem Meltrin α, welche bezogen auf das Ergebnis der Analyse der DNA, welche in pMelα-26N, pMelα-25C eingesetzt wurde, bestimmt wurden.
16 zeigt die Aminosäuresequenz und ihre entsprechende Basensequenz von humanem Meltrin β.
Die 17a bis 17c zeigen eine Teilaminosäuresequenz und ihre entsprechende Basensequenz von humanem Meltrin β, welche bezogen auf das Ergebnis der Analyse der DNA, welche in pMelβ-24C, pMelβ-24N eingesetzt wurde, bestimmt wurden.
18a zeigt schematisch die Stellen der Peptide, welche als die Antigene verabreicht werden, in Maus-Meltrin α.
18b zeigt Aminosäuresequenzen der Peptide, welche als die Antigene verabreicht werden.
19 ist eine Fotografie der Elektrophorese, welche das Ergebnis von Western-Blotting mit anti-Maus-Meltrin α-Antikörpern zeigt.
20 ist ein Graph, der die Inhibierung der Myotube-Bildung durch anti-Maus-Meltrin-Antikörper zeigt.
21 ist ein Graph, der die Wirkungen von anti-Maus-Meltrin-Antikörpern auf die Bildung von Pit (Knochenresorptionsbereich) durch alle Mausknochenzellen zeigt.
22 ist ein Graph, der die Wirkungen von anti-Maus-Meltrin-Antikörpern auf die Serum-Ca-Werte der Maus, welche mit einem Futter mit niedrigem Ca-Gehalt gefüttert wird, zeigt.
Die 23a bis 23b zeigen die Aminosäuresequenz, welche die Transmembrandomäne von humanem Meltrin α umfassen, und ihre entsprechende Basensequenz.
Die 24a bis 24e zeigen das Ergebnis einer Basensequenzanalyse der DNA, welche in pMelβ-24C, pMelβ-24N eingesetzt wurde.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele, welche nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken, veranschaulicht.
Beispiele
Die in der folgenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen beziehen sich auf die herkömmlichen Abkürzungen auf dem Fachgebiet.
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Verfahren beziehen sich auf Sambrook J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; E. Harlow, D. Lane et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory und dergleichen.
Beispiel 1: Erlangung der DNAs, welche Maus-Meltrine kodieren, durch RT-PCR
(1) Herstellung von RNA, cDNA
Eine myogene Zelllinie, welche vom fötalen Fibroblasten C3H10T1/2 (ein Klon, der mit dem Gen transfiziert wurde, welches „Myogenin", einen Muskeldifferenzierung-kontrollierenden Faktor, kodiert und das Myogenin exprimiert) abgeleitet ist, wurde bis zum Umfang von 10⁶ Zellen/Platte mit 10 cm Durchmesser in DMEM, welches mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt worden war, (MOREGATE) proliferiert und bei 37°C für 2 Tage in Differenzierungsmedium (DMEM, welches 2% Pferdeserum enthält, von GIBCO) zur Differenzierung und Induktion kultiviert. Die gesamte RNA wurde gemäß dem Guanidinisothiocyanat/Säure-Phenol-Verfahren (Chomczynski P. und Sacchi N., Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987) abgetrennt und Poly(A)-RNA wurde selektiv durch zweifaches Wiederholen von Oligo(dT)-Cellulose-Säulenchromatografie abgetrennt. Durch die Verwendung der Poly(A)-RNA als ein Templat und von beliebigen Primern (N6, Pharmacia) wurden cDNAs mit reverser MLV-Transkriptase (GIBCO BRL) gemäß ihrer Gebrauchsanweisung für Synthese synthetisiert. Die erhaltenen cDNAs wurden dann als ein Templat für die nächste PCR verwendet und doppelsträngige DNAs wurden synthetisiert und in einen Phagen (λZapII (Stratagene)) eingesetzt, wobei eine cDNA-Bibliothek erhalten wurde.
(2) RT-PCR
RT-PCR wurde unter Verwendung der cDNAs, welche in vorstehendem (1) hergestellt wurden, als ein Templat in den folgenden Schritten durchgeführt:
Ein degenerativer Primer, welcher die Aminosäuresequenz EDCDCG oder EECDCG kodiert, wurde synthetisiert und als ein Sense-Primer verwendet und ein degenerativer Primer, welcher die Aminosäuresequenz KCGKLIC kodiert, wurde synthetisiert und als ein Antisense-Primer verwendet.
Die Primer wurden mit den vorstehenden cDNAs, Taq-Polymerase und den Reaktionsmitteln (Boehringer Mannheim) gemischt und 36 Reaktionszyklen von 95°C für 1 min, 55°C für 2 min und 72°C für 3 min ausgesetzt. Das Amplifizierungsprodukt mit etwa 450 bp wurde dann durch 1,5% Agarose-Gelelektrophorese gesammelt.
Die so erhaltenen amplifizierten Fragmente wurden in eine SmaI-Stelle im Plasmid pBS-SKII(-) (Stratagene) eingesetzt und einer DNA-Sequenzanalyse mittels einer DNA-Sequenziervorrichtung (Typ 370A, Applied Biosystems) unterworfen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass drei Arten von Molekülen (DNA-Fragmenten) existieren (1), welche dann als eine Sonde zum Durchmustern der cDNA-Bibliothek verwendet wurden, um so cDNAs zu isolieren, welche einen offenen Leserahmen mit 903, 920 beziehungsweise 845 Aminosäureresten (2a bis 2j, 3a bis 3j, 4a bis 4i) umfassen. Die Produkte der jeweiligen Gene wurden Meltrine α, β und λ (5a bis 5j, 6a bis 6h, 7a bis 7e) genannt. Diese cDNAs wurden in pBS-SKII(-) eingesetzt, wobei die Plasmide „pBSMelα", „pBSMelβ" beziehungsweise „pBSMelγ" erhalten wurden.
Der E. coli-Stamm JM109 wurde gemäß einem bekannten Verfahren mit den vorstehenden Plasmiden „pBSMelα", „pBSMelβ" beziehungsweise pBSMelγ" transformiert und die resultierenden Transformanten „JM109(pBSMelα)", „JM109(pBSMelβ)" und „JM109(pBSMelγ)" wurden im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken 350 Japan) am 19. Februar 1996 unter den Zugangsnummern FERM P-15451, FERM P-15452 beziehungsweise FERM P-15453 hinterlegt und dann gemäß dem Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulation am 08. Oktober 1996 in die Hinterlegung unter – den Zugangsnummern FERM BP-5701, FERM BP-5702 beziehungsweise FERM-BP5703 überführt.
(3) Analyse der Struktur der Meltrine
Aufgrund der Strukturanalyse der Meltrine bezogen auf die in vorstehendem (2) bestimmten DNA-Sequenzen wurde angenommen, dass die Meltrine α, β und γ ein Protein vom Transmembran-Typ sind, welches aus einer extrazellulären Domäne, Transmembran (TM)-Domäne und intrazellulären Domäne besteht, und dass die extrazelluläre Domäne aus einer Vorläuferdomäne (Proregion), welche eine Signalpeptid-ähnliche Sequenz umfasst, Metallproteinasedomäne, Disintegrindomäne und der folgenden Cystein-reichen Region besteht. Eine Fusionspeptid-ähnliche Sequenz war in der Cystein-reichen Domäne von Meltrin α enthalten (8).
Bezogen auf ihre Homologie zum Schlangengift Jararhagin wurde angenommen, dass in Meltrin α die Vorläuferdomäne der Sequenz vom N-Terminus zu Arg (Nr. 205) und den Basen Nr. 221 bis 835, die Metallproteinasedomäne der Sequenz von Glu (Nr. 206) bis Pro (Nr. 414) und den Basen Nr. 836 bis 1462, die Disintegrindomäne der Sequenz von Phe (Nr. 420) bis Gly (Nr. 509) und den Basen Nr. 1478 bis 1747, die Cystein-reiche Region der Sequenz von His (Nr. 510) bis Gly (Nr. 706) und den Basen Nr. 1748 bis 2338, die Fusionspeptid-ähnliche Sequenz der Sequenz von Gly (Nr. 585) bis Glu (Nr. 607) und den Basen Nr. 1973 bis 2041, die Transmembrandomäne der Sequenz von Leu (Nr. 707) bis Leu (Nr. 727) und den Basen Nr. 2339 bis 2401 entspricht.
In ähnlicher Weise wurde angenommen, dass in Meltrin β die Vorläuferdomäne der Sequenz vom N-Terminus zu Arg (Nr. 204) und den Basen Nr. 63 bis 674, die Metallproteinasedomäne der Sequenz von Glu (Nr. 205) bis Pro (Nr. 409) und den Basen Nr. 675 bis 1289, die Disintegrindomäne der Sequenz von Tyr (Nr. 415) bis Gly (Nr. 504) und den Basen Nr. 1305 bis 1574, die Cystein-reiche Region der Sequenz von Thr (Nr. 505) bis Pro (Nr. 706) und den Basen Nr. 1575 bis 2180, die Transmembrandomäne der Sequenz von Val (Nr. 707) bis Arg (Nr. 729) oder bis Leu (Nr. 724) und den Basen Nr. 2181 bis 2249 oder 2181 bis 2234 entspricht.
In ähnlicher Weise wurde angenommen, dass in Meltrin γ die Vorläuferdomäne der Sequenz vom N-Terminus zu Arg (Nr. 205) und den Basen Nr. 69 bis 683, die Metallproteinasedomäne der Sequenz von Ala (Nr. 206) bis Pro (Nr. 406) und den Basen Nr. 684 bis 1292, die Disintegrindomäne der Sequenz von Tyr (Nr. 412) bis Gly (Nr. 502) und den Basen Nr. 1302 bis 1574, die Cystein-reiche Region der Sequenz von Tyr (Nr. 503) bis Ala (Nr. 694) und den Basen Nr. 1575 bis 2150, die Transmembrandomäne der Sequenz von Leu (Nr. 695) bis Ile (Nr. 714) und den Basen Nr. 2151 bis 2210 entspricht.
Beispiel 2: Etablierung von anti-Meltrin α-Antikörpern
(1) Herstellung eines Immungens
Ein chimäres Polypeptid, welches aus Glutathion-S-Transferase (GST) (Smith, D.B. & Johnson, K.S., Gene, Bd. 67, 31-40, 1998) und dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Ser (Nr. 483) bis Lys (Nr. 635) von Meltrin α in 2a bis 2j bestand, wobei das Polypeptid an den C-Terminus von GST gebunden war, wurde wie folgt hergestellt. Zuerst wurde das Plasmid pGEX2T (Pharmacia), welches die cDNA umfasst, die GST kodiert, an einer BamHI-Stelle verdaut und als ein Vektor verwendet. Auf der anderen Seite wurde die cDNA, welche der Aminosäuresequenz von Ser (Nr. 483) zu Lys (Nr. 635) von Meltrin α in 2a bis 2j entspricht, von pBSMelα durch PCR amplifiziert und mit einem BamHI-Linker durch eine DNA-Ligase ligiert. Die resultierende cDNA wurde dann mit dem vorstehenden Vektor durch eine DNA-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid erhalten wurde, welches dann in den E. coli-Stamm NM522 transformiert wurde.
Die transformierten E. coli wurden in L-Nährmedium mit 1 mM IPTG kultiviert, um eine große Menge des chimären Polypeptids in den Einschlusskörpern über Expressionsinduktion herzustellen. Der Stamm wurde in MTPBS (150 mM NaCl, 16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, 0,1 mM PMSF) suspendiert, Ultraschall ausgesetzt und mit 1% Triton löslich gemacht. Der Überstand des so behandelten Gemisches wurde gesammelt. Glutathionagarose (Sigma) wurde mit dem Überstand gemischt, um das chimäre Polypeptid zu adsorbieren, welches dann mit einem Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,5 mM Glutathion) eluiert und als ein Immungen verwendet wurde.
(2) Herstellung von Antiserum
Das in vorstehendem (1) hergestellte Antigen (1 mg) in 0,5 ml PBS und RIBI in 0,5 ml PBS (MPL + TDM + CWS-Emulsion, Funakoshi) wurden miteinander gemischt und subkutan oder intrakutan an ein Kaninchen (12 Wochen alt, weiblich) verabreicht. Nach dem dreifachen Verstärken mit einer Dosis von 500 μg in 4-Wochen-Intervallen wurde das Blut gesammelt und Serum wurde abgetrennt, wobei Antiserum erhalten wurde.
(3) Affinitätsreinigung des Antiserums
Das chimäre Polypeptid, welches in E. coli exprimiert und in vorstehendem (1) löslich gemacht wurde, oder GST ohne fusioniertes Polypeptid wurden an die Glutathionagarose-Kügelchen gebunden. Die resultierenden Kügelchen wurden mit 0,2 M Natriumborat (pH-Wert 9,0) gewaschen und mit Dimethylpimelidiat (eine Endkonzentration von 20 mM) gemischt, so dass das Antigen irreversibel an die Kügelchen gebunden wurde, um so chimäres Polypeptid-Affinitätskügelchen beziehungsweise GST-Affinitätskügelchen zu ergeben.
Das Antiserum, welches zehnfach mit 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) verdünnt worden war, wurde zuerst mit den GST-Affinitätskügelchen, um anti-GST-Antikörper zu absorbieren und zu entfernen, gemischt und dann mit chimäres Polypeptid-Affinitätskügelchen, um daran anti-Meltrin α-Antikörper zu adsorbieren, gemischt. Die resultierenden chimäres Polypeptid-Affinitätskügelchen wurden mit 10 mM Tris (pH-Wert 7,5) und 500 mM NaCl gewaschen und die anti-Meltrin α-Antikörper wurden mit 100 mM Glycin eluiert und als gereinigte anti-Meltrin α-Antikörper gesammelt.
(4) Western-Blotting
C2-Zellen wurden bis zu einem Umfang von 10⁶ Zellen/Platte mit 10 cm Durchmesser in DMEM, welches mit 15% fötalem Kälberserum ergänzt worden war, proliferiert, dann bei 37°C in Differenzierungsmedium (DMEM, welches mit 2% Pferdeserum ergänzt worden war) kultiviert und am zweiten Tag (C2DM d2) und am 4. Tag (C2DM d4) gesammelt.
Ferner würden C2-Zellen, welche durch im folgenden Beispiel 5 (3) hergestellten pBOSMelα(+) transformiert worden waren, in DMEM, welches mit 15% fötalem Kälberserum ergänzt worden war, bei 37°C für drei Tage kultiviert, in eine Kunststoffschale (Durchmesser 6 cm) in einer Dichte von 2 × 10⁵/Schale überimpft, ferner für einen Tag kultiviert und in das vorstehende Differenzierungsmedium zur Differenzierungsinduktion überführt. Nach einer Zwei-Tages-Kultur in dem Differenzierungsmedium wurden die Zellen gesammelt.
Die gesammelten C2DM d2, C2DM d4 oder die Transformanten durch pBOSMelα(+) wurden mit SDS-Lölichkeitspuffer (100 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8), 4% SDS, 20% Glycerol) gemischt, Ultraschall ausgesetzt und zentrifugiert, wobei ihr Überstand als eine Probe erhalten wurde.
Eine Membran wurde zweimal mit einer Waschlösung gewaschen. Das in vorstehendem (3) hergestellte Antiserum wurde 20-fach mit 5% Magermilchlösung in TBS-T verdünnt, worin die Membran eingeweicht und bei 37°C für eine Stunde inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde die Membran zweimal mit der Waschlösung gewaschen. Die Membran wurde dann in einen Biotin-markierten anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörper (Daco), 4.000-fach mit der vorstehenden Magermilchlösung verdünnt, eingeweicht und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran zweimal mit der Waschlösung gewaschen. Die Membran wurde für eine Stunde mit einem Peroxidase-markierten Streptoavidin umgesetzt, zweimal gewaschen, mit MB-Reagenz (Kat. TM912, Shic) angefärbt und mit dem ECL-System (Amersham) nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Das Western-Blotting enthüllte die Banden bei etwa 115 KD, 86 KD, 67 KD und 58 KD, was darauf hinweist, dass Meltrin α als ein Glycoprotein exprimiert wurde. Es wurde auch angenommen, dass die Vorläuferdomäne im Molekül mit 86 KD deletiert war und dass sowohl die Vorläufer- als auch die Metallproteinasedomänen im Molekül mit 67 KD oder 56 KD deletiert waren.
Beispiel 3: Northern-Blotting
Poly(A)⁺-RNAs wurde aus verschiedenen Geweben der Maus (Knochen, Gehirn, Leber, Herz und Skelettmuskel der erwachsenen Maus; Knochen und Skelettmuskel der neugeborenen Maus; und Knochen und Skelettmuskel der fötalen Maus) unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits von Pharmacia gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die RNAs wurden durch Erwärmen bei 65°C für 5 min in 50% Formamid denaturiert, einer Elektrophorese auf 1,5% Agarosegel, welches 6,6% Formalin umfasste, ausgesetzt und auf eine Nylonmembran (Highbond-N, Amersham) überführt.
Auf der anderen Seite wurden cDNAs, welche einen Teil der Disintegrin- und Cysteinreichen Regionen kodieren, (Glu (Nr. 434) bis Cys (Nr. 583) in 2a bis 2j, Glu (Nr. 429) bis Cys (Nr. 578) in 3a bis 3j, Glu (Nr. 426) bis Cys (Nr. 575) in 4a bis 4i) durch PCR hergestellt und mit ³²P unter Verwendung eines Kits zum Markieren mit einem beliebigen Primer (Megaprime, Amersham) markiert. Als eine Kontrollsonde wurde auch eine cDNA, welche G3PDH (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) kodiert, mit ³²P in der gleichen Weise markiert. Die vorstehenden mRNAs wurden mit den radiomarkierten cDNAs unter Bedingungen von hoher Strenge gemäß dem Verfahren von Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) hybridisiert.
Ihre Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
10 enthüllt, dass Meltrin α und β nur in den Knochen von erwachsenen und neugeborenen Mäusen und Skelettmuskeln von neugeborenen und fötalen Mäusen exprimiert wurden (die Ergebnisse der fötalen Maus sind in 10 nicht gezeigt). Es gab keine Gewebespezifität bei der Expression von Meltrin γ, da es universell in allen Geweben exprimiert wurde.
Beispiel 4: Bestätigung der Adhärierungsaktivität von Meltrin α
(1) Aufbau der Plasmide pBOSMelαδMP(+) und pBOSMelαδMP(-)
Ein Meltrin δMP vom Deletions-Typ, wobei die Vorläufer- und Metallproteinasedomänen in der extrazellulären Domäne von Meltrin α deletiert worden waren, wurde im folgenden Verfahren hergestellt.
Das Plasmid pBSMelα wurde teilweise bei MscI verdaut und einer Elektrophorese auf 1% Agarosegel unterworfen, wobei eine lineare Plasmid-DNA erhalten wurde. Die resultierende DNA wurde teilweise bei NheI verdaut, mit einem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Ende zu erzeugen, und einer intramolekularen Ligation unterworfen. Vektoren mit der richtigen Deletion wurden ausgewählt und ihre DNA-Sequenzen wurden bestätigt. Nach einer Verdauung an Mehrfachklonierstellen von EcoRV und NotI in den Vektoren wurde ein δMP-Fragment vom Deletions-Typ mit etwa 5,8 kb erhalten.
Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pEFBOS (Mizushima S. & Nagata S., Nucleic Acid Res., Bd. 18, S. 5322, 1990) durch ein Restriktionsenzym XbaI verdaut, dephosphoryliert, mit einem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und einer Elektrophorese auf 1% Agarosegel unterworfen, wobei eine lineare Plasmid-DNA erzeugt wurde. Die resultierende lineare DNA wurde dann mit dem vorstehenden Fragment mit etwa 5,8 kb durch eine DNA-Ligase ligiert, wobei die Plasmide pBOSMelαδMP(+) und pBOSMelαδMP(–) erhalten wurden. Sie waren die Konstrukte, welche die eingesetzte DNA umfassten, die das δMP-Fragment kodierte, wobei die Aminosäuresequenz von Ile(55) bis Glu(399) von Meltrin α deletiert war, in der Sense-Richtung beziehungsweise der Antisense-Richtung.
(2) Aufbau des Plasmids pBOSMelα(+)
Das Plasmid pBSMelα wurde teilweise mit EcoRV und NotI verdaut, wobei ein Fragment mit etwa 7 kb erhalten wurde. Das vorstehende Plasmid pEFBOS wurde mit einem Restriktionsenzym XbaI verdaut, dephosphoryliert, mit einem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und Elektrophorese auf 1% Agarosegel unterworfen, wobei eine lineare Plasmid-DNA erhalten wurde. Die resultierende lineare DNA wurde dann mit dem vorstehenden Fragment mit etwa 7 kb durch eine DNA-Ligase ligiert, wobei das Plasmid pBOSMelα(+) erhalten wurde.
(3) Herstellung des Plasmids pBOSMelαδPro(+)
Es gab eine AflII-Stelle in der Grenzregion zwischen den Vorläufer- und Metallproteinasedomänen von Meltrin α und es gab eine NheI-Stelle in der Grenzregion zwischen den Metallproteinase- und Disintegrindomänen von Meltrin α. Auf der anderen Seite verblieb die NheI-Stelle in der Grenzregion zwischen der Signalpeptid-ähnlichen Sequenz und der Disintegrindomäne in im vorstehenden (1) hergestellten pBOSMelαδMP(+). Demgemäß wurde pBOSMelα bei AflII verdaut, mit einem NheI-Linker direkt vor seiner Metallproteinasedomäne ligiert und bei NheI verdaut, so dass die Metallproteinase ausgeschnitten wurde. Die ausgeschnittene Domäne wurde in die NheI-Stelle zwischen der Signalpeptid-ähnlichen Sequenz und der Disintegrindomäne von pBOSMelαδMP(+) eingesetzt, wobei das Expressionsplasmid pBOSMelαδPro(+) erhalten wurde, welches δPro kodiert, wobei darin eine Deletion um die Vorläuferdomäne gefunden wurde (die Aminosäuresequenz von Ile (Nr. 55) bis Glu (Nr. 206) von Meltrin a).
(4) Bestätigung der Myoblastenfusion-fördernden Aktivität
Die Myoblastenzelllinie C2 wurde mit dem Gemisch, welches das Plasmid pBOSMelα(+) oder pBOSMelαδMP(+) und das Plasmid pSV2NEO in einem Molverhältnis von 20:1 umfasste, unter Verwendung von LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) gemäß seinem Protokoll transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden verdünnt und auf eine Platte (Durchmesser 10 cm), welche mit Kollagen (IWAKI) beschichtet war, überimpft, so dass die Transformanten in einer Dichte von 10 bis 20 Klonen pro Platte erhalten wurden. Die angeimpften Zellen wurden für 12 Tage in DMEM, welches 20% fötales Kälberserum und 5 ng/ml bFGF (Gibco BRL) enthielt, kultiviert, gefolgt von einer Isolierung davon.
Für den Zweck der Untersuchung der Myoblastenfusion-fördernden Aktivität wurden die resultierenden Transformanten und der Elternstamm C2 für 3 bis 4 Tage in der Abwesenheit von bFGF kultiviert, auf eine Kunststoffschale (Durchmesser 6 cm) in einer Dichte von 2 × 10⁵/Schale überimpft und ferner für einen Tag kultiviert, gefolgt von der 4-Tage-Kultur im vorstehenden Differenzierungsmedium zur Differenzierungsinduktion. Durch die Differenzierungsinduktion begann C2 Myotube zu bilden. Nach der 4-Tage-Kultur, gefolgt von Fixierung mit Methnol und Anfärben mit Giemsa und Wright-Reagenz (Merck) wurde die Anzahl der Kerne in jedem der vier unabhängigen Felder von 1 mm² auf der Schale bestimmt und der Fusionsindex wurde wie folgt berechnet:
Fusionsindex = 100·(Die Anzahl der Kerne in vielkernigem Syncytium mit drei oder mehr Kernen)/(Die Anzahl der gesamten Kerne)
Ferner wurde der Zeitverlauf des Fusionsindex nach der Differenzierungsinduktion an jedem Tag für fünf Tage beobachtet.
Die Ergebnisse sind in 11a bis 11b gezeigt. Wie in diesen Figuren gesehen wird, wurde die Fusionsaktivität des Transformanten, welcher die volle Länge von Meltrin α exprimierte (pBOSMelα(+), welches in 11a als die „volle Länge" bezeichnet wurde), niedriger als die der Mutterzelle und es wurde deshalb angenommen, dass die volle Länge von Meltrin α die Zellfusion in irgendeiner Weise supprimiert. Auf der anderen Seite förderte der Transformantenhafen pBOSMelαδMP(+), welcher in den Figuren als „ΔMP" bezeichnet wurde, die Zellfusionsaktivität wesentlich. Es wurde auch beobachtet, dass der Transformantenhafen pBOSMelαδPro(+) die Zellfusionsaktivität förderte.
Auf der anderen Seite konnte die C2-Zelle, welche mit dem Plasmid pBOSMelβ(+) transformiert wurde, welches durch das Einsetzen der DNA, die die volle Länge von Meltrin β kodiert, in der gleichen Weise wie in vorstehendem (2) hergestellt wurde, keine wesentliche Änderung bei der Fusionsaktivität für Muskelzellen verursachen. Jedoch förderte der C2-Transformant, welcher mit pBOSMelα(+) und pBOSMelβ(+) cotransfiziert wurde, die Zellfusionsaktivität im Vergleich mit der der Mutterzelle.
Auf der anderen Seite konnten weder die C2-Zelle, welche mit dem Plasmid pBOSMelγ(+) transformiert wurde, welches durch das Einsetzen der DNA, die die volle Länge von Meltrin γ kodiert, in der gleichen Weise wie in vorstehendem (2) hergestellt wurde, noch der C2-Transformant, welcher mit pBOSMelα(+) und pBOSMelγ(+) cotransfiziert wurde, jedwede signifikante Änderung in der Fusionsaktivität für Muskelzellen verursachen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Meltrin α in die Fusion von Muskelzellen einbezogen ist, und sie werden seine Aktivität zur Förderung der Zellfusion durch sein Verarbeiten zeigen. Man vermutet, dass Meltrin α oder Meltrin β nicht alleine wirken, sondern in der Form eines Heteromers zwischen ihnen wirken, da der Transformant, welcher sowohl Meltrin α als auch Meltrin β exprimierte, die Fusion von Muskelzellen förderte.
(5) Untersuchung der Funktion von Meltrinen in Nicht-Muskelzellen
Der Maus-Fibroblast L929 wurde mit pBOSMelα(+) oder pBOSMelβ(+) transformiert und die Transformanten, welche Meltrin α oder Meltrin β exprimierten, wurden isoliert. Diese Transformanten aggregierten nicht, noch fusionierten sie miteinander. Dies galt auch für den Fall des Transformanten, der sowohl Meltrin α als auch Meltrin β exprimierte.
Auf der anderen Seite konnten die L929-Zellen, welche mit pBOSMelγ(+) transformiert wurden, eine wesentliche Aggregationsaktivität durch die Zugabe von Calciumionen zeigen, nachdem die Zellen von einer Platte in ein Medium, welches keine Calciumionen umfasste, überführt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass Meltrin γ eine Zellaggregationsaktivität aufweist, und unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit dieser Moleküle führt dies zu dem Vorschlag, dass die Myoblastenfusions-fördernde Aktivität von Meltrin α und Meltrin β ihrer Myoblastenaggregations-fördernden Aktivität zugeschrieben werden kann.
Beispiel 5: Inhibierung der Adhärierungsaktivität durch Antisense
Das in Beispiel 4 (1) hergestellte Plasmid BOSMelαβMP(-) wurde mit dem Plasmid PSV2NEO in einem Molverhältnis von 20:1 gemischt, wobei C2-Zellen gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 (4) transformiert wurden, gefolgt von einer Isolierung der Transformanten, welche Antisense-RNA exprimierten. Die Adhärierungsaktivität der so isolierten Transformanten wurde durch das Verfahren von Beispiel 4 bestimmt. Die Ergebnisse sind in 11a bis 11b gezeigt, wobei gezeigt wird, dass die Fusion von C2-Zellen durch die Expression von Antisense-RNA für δMP (in den Figuren als „AS" bezeichnet) inhibiert wurde.
Die vorstehenden Ergebnisse haben enthüllt, dass Meltrin α eine wesentliche Rolle in der Zellfusion von Muskelzellen spielt.
Beispiel 6: Herstellung von cDNA-Fragmenten, welche die humanen Meltrine α und γ kodieren
Unter Verwendung von mRNA, welche aus humanen Myelozyten (Clonetech Co.) aufgereinigt worden war, als ein Templat wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 (1) cDNAs hergestellt und 36 PCR-Zyklen wurden dann unter Verwendung des in Beispiel 1 (2) erhaltenen degenerativen Primers und der cDNAs als ein Templat durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde in eine EcoRV-Stelle von pBS-SKII(-) eingesetzt und „pBShuMα300" genannt. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung sind in 12a und 12b gezeigt.
Es wurde gefunden, dass die DNA-Sequenz die Basensequenz umfasste, welche den Teil von einer Zwischenposition der Disintegrindomäne zu einer Zwischenposition der Cystein-reichen Region von humanem Meltrin α kodierte (die Disintegrindomäne ist bei Gly (Nr. 36) lokalisiert, gefolgt von der Cystein-reichen Region in 12a und 12b).
Auf der anderen Seite wurden unter Verwendung eines Teils einer humanen Sequenz (D-14665), welche in einer Datenbank registriert ist, deren Funktion noch nicht identifiziert wurde, ein Sense-Primer (5'-CACGATGATGGGAGAGATTG-3') und Antisense-Primer (3'-CACTCTGATTTCCTATGCCTC-5') synthetisiert. PCR wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren durchgeführt, wobei das amplifizierte Produkt erhalten wurde, welches dann in die EcoRV-Stelle von pBS-SKII(-) eingesetzt und „pBShuMγG238" genannt wurde. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung sind in 13a und 13b gezeigt.
Es wurde gefunden, dass die DNA-Sequenz die Basensequenz umfasste, welche den Teil von einer Zwischenposition der Metallproteinasedomäne zu einer Zwischenposition der Cysteinreichen Region des humanen Meltrins γ (die Metallproteinasedomäne ist lokalisiert vom N-Terminus bis Pro (Nr. 40), die Disintegrindomäne von Lys (Nr. 41) bis Gly (Nr. 136) oder von Tyr (Nr. 46) bis Gly (Nr. 136), gefolgt von der Cystein-reichen Region von Tyr (Nr. 137)) kodierte. Der E. coli-Stamm JM109 wurde mit jenen Plasmiden transformiert, wobei JM109 (pBShuMα300) und JM109(pBShuMγG238) erhalten wurden, welche im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 350 Japan) am 19. Februar 1996 unter den Zugangsnummern FERM P-15454 beziehungsweise 15455 hinterlegt wurden und dann gemäß dem Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulation am 08. Oktober 1996 in die Hinterlegung unter den Zugangsnummern FERM BP-5704 beziehungsweise 5705 überführt wurden.
Beispiel 7: Herstellung eines cDNA-Fragments, welches humanes Meltrin α kodiert, unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, welche von humaner Plazenta abgeleitet ist-1
(1) Erstes Durchmustern
Bezogen auf die in Beispiel 6 erhaltene cDNA-Sequenz von Meltrin α wurden ein Sense-Primer MA-1 und Antisense-Primer MA-2 synthetisiert (siehe Tabelle 1). Die humane Plazenta-λgt11-cDNA-Bibliothek (Clonetech Co., Code Nr. CLHL1008b) wurde auf eine LB-Platte (Durchmesser 10 cm) in einer solchen Dichte überimpft, dass 10.000 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung von Plaques wurden 5 ml SM-Puffer zu jeder Platte gegeben, die Platten wurden einer Inkubation bei Raumtemperatur für 4 Stunden unterworfen und Phagen wurden von jeder Platte gesammelt (Plattenlysatverfahren). PCR wurde unter Verwendung der gesammelten Phagenlösung als ein Templat durchgeführt. Dann wurden die Primer MA-1 und MA-2, Ex Taq-Polymerase (TakaRa Co.) und ihre Reagenzien (TakaRa Co.) gemischt, gefolgt von 35 Reaktionszyklen bei 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec und 72°C für eine min. Ein Teil der amplifizierten Produkte wurde einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und eine Phagenlösung des Klons, welcher Meltrin αcDNA umfasste, wurde ausgewählt.
(2) Zweites Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im ersten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 400 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(3) Drittes Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im zweiten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 40 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(4) Viertes Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im dritten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 10 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(5) Letztes Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im vierten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 20 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurde jede Plaque mit einem Zahnstocher aufgenommen und das anhaftende Material wurde als ein Templat in PCR-Lösung suspendiert. Die vorstehenden 35 PCR-Zyklen mit den Primern MA-1 und MA-2 ergaben schließlich zwei positive Klone. Eine einzelne positive Plaque, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde in SM-Puffer gesammelt und der Phage wurde darin lysiert.
PCR wurde unter Verwendung von λgt11-Vorwärtsprimer und λgt11-Umkehrprimer durchgeführt (Tabelle 1), um ein Fragment von humaner Meltrin α-cDNA in dem Phagenvektor zu erhalten.
Aus einer teilweisen DNA-Sequenzierung der terminalen Basen der resultierenden Fragmente wurde abgeschätzt, dass diese cDNAs die in Beispiel 6 erhaltenen Rasensequenzen, welche humanes Meltrin α kodieren, umfassten und den etwa 650 Aminosäuren (Klon 23) oder etwa 500 Aminosäuren (Klon 25) von Maus-Meltrin entsprachen (14).
Beispiel 8: Herstellung eines cDNA-Fragments, welches humanes Meltrin α kodiert, unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, welche von humaner Plazenta abgeleitet ist-2

Ein Sense-Primer Mel α-5'S wurde bezogen auf die Sequenz, welche den N-Terminus der cDNA-Sequenz des in Beispiel 7 enthüllten Klons 23 kodiert, designed. Die humane Plazenta-λgt11-cDNA-Bibliothek (Clonetech Co.) wurde mit dem Sense-Primer Mel α-5'S und dem Antisense-Primer MA-2 durchgemustert, wobei eine cDNA erhalten wurde, welche etwa 700 Aminosäuren kodierte (Klon 26) (14a). Für den Zweck der Analyse der Basensequenz des Meltringens wurden vier Primer λgt11-Vorwärts-Eco, λgt11-Umkehr-Eco, MA-1-Eco und MA-2-Eco synthetisiert (Tabelle 1). [TABELLE 1] Die Basensequenzen der Primer für PCR

MA-1	:5' ACG ATG GGC ACT CAT GTC AG 3'
MA-2	:5' CAT CTC GCA TTT GGC AAA GG 3'
λgt11-Vorwärts	:5' GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG 3'
λgt11-Umkehr	:5' TTG ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG 3'
Melα-5' S	:5' CAC TGA ACA TTC GGA TCG TG 3'
λgt11-Vorwärts-Eco	:5' CCG GAA TTC GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG 3'
λgt11-Umkehr-Eco	:5' CCG GAA TTC TTG ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG 3'
MA-1-Eco	:5' CCG GAA TTC ACG ATG GGC ACT CAT GTC AG 3'
MA-2-Eco	:5' CCG GAA TTC CAT CTC GCA TTT GGC AAA GG 3'
S-hMel α-TM5'	:5' GCA CAA AGT GTG CAG ATG GA
A-mMel α-3'	:5' CAG AGG CTT CTG AGG AGG N

Die zweite Hälfte des Meltringens wurde durch PCR unter Verwendung von Klon 25 als ein Templat und den Primer MA-1-Eco und λgt11-Umkehr-Eco amplifiziert. Die erste Hälfte des Meltringens wurde durch PCR unter Verwendung von Klon 26 als ein Templat und den Primer MA-2-Eco und λgt11-Vorwärts-Eco amplifiziert. Diese cDNA-Fragmente wurden bei EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von pUC 118 kloniert, wobei die Plasmidvektoren „pMelα-26N" beziehungsweise „pMelα-25C" erhalten wurden. Die Sequenzen der Meltrin α-cDNA, welche in diesen Plasmiden umfasst wurden, wurden durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt.
Der E. coli-Stamm JM109 wurde durch diese Plasmide gemäß dem bekannten Verfahren von Hanahan et al. transformiert, wobei JM109 (pMelα-26N) und JM109 (pMelα-25C) erhalten wurden und im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 350 Japan) am 03. Oktober 1996 gemäß dem Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulation unter den Zugangsnummern FERM BP-5689 beziehungsweise 5688 hinterlegt wurden.
Die Basensequenz und ihre entsprechende Aminosäuresequenz von humanem Meltrin α, welche durch die Basensequenzierung von pMelα-26N und pMelα-25C enthüllt wurden, sind in 15a bis 15f gezeigt.
Ein Vergleich der so erhaltenen DNA-Sequenz mit der in Beispiel 6 erhaltenen zeigte vier Unterschiede in den Rasenpaaren, wobei drei davon stille Mutationen sind und der andere Unterschied eine Substitution von Asp (Nr. 505) in den vorstehenden Figuren für Glu in der Sequenz von Beispiel 6 verursacht.
Die Analyse der Struktur der Basensequenz zeigte, dass die DNA die Sequenz von einem Zwischenteil der Vorläuferdomäne zum C-Terminus von Meltrin α kodierte. So nahm man an, dass in der in 15a bis 15f gezeigten Aminosäuresequenz die Teilsequenz (C-Terminus) der Vorläuferdomäne der Sequenz von Gly-N-Terminus bis Arg (Nr. 155) und den Basen Nr. 1 bis 465, die Metallproteinasedomäne der Sequenz von Glu (Nr. 156) bis Pro (Nr. 364) und den Basen Nr. 466 bis 1092, die Disintegrindomäne der Sequenz von Glu (Nr. 365) oder Phe (Nr. 370) bis Gly (Nr. 459) und den Basen Nr. 1093 oder 1108 bis 1377, die Cystein-reiche Region der Sequenz von His (Nr. 460) bis Gln (Nr. 656) oder Ala (Nr. 652) und den Basen Nr. 1378 bis 1968 oder 1956, die Fusionspeptid-ähnliche Sequenz der Sequenz von Gly (Nr. 535) bis Gln (Nr. 557) und den Basen Nr. 1603 bis 1671 entspricht. Es gab in dieser Sequenz keine Transmembrandomäne, was vorschlägt, dass humanes Meltrin α als ein lösliches Protein ohne eine Transmembrandomäne in einem Körper existiert. Mit anderen Worten, man nimmt an, dass Meltrin α mit der Aminosäuresequenz von 15a bis 15f extrazellulär sekretiert wird und in Blut oder Körperflüssigkeit vorliegt. Man nimmt an, dass ein solches lösliches Meltrin α eine Rolle bei der Regulierung der Adhäsion, Fusion und Aggregation von Zellen im Körper spielt.
Man nimmt an, dass Meltrin α mit der Aminosäuresequenz von 15a bis 15f als ein Ergebnis eines alternativen Splicings des Gens erzeugt wurde. Man nimmt auch an, dass die DNA, welche die Region strangabwärts der Cystein-reichen Region kodiert, und die DNA, welche die Transmembrandomäne und die intrazelluläre Domäne kodiert, auf unterschiedlichen Exons lokalisiert sind und dass das Aufsplicing von jeder DNA zu einem Meltrin vom löslichen Typ oder einem Meltrin vom Membran-bindenden Typ führt.
Beispiel 9: Herstellung von cDNA-Fragmenten, welche humane Meltrin β kodieren
(1) Herstellung eines cDNA-Fragments, welches einen Teil der Disintegrindomäne von humanem Meltrin β kodiert
Unter Verwendung von mRNA, welche aus humanen Myelozyten (Clonetech Co.) aufgereinigt worden war, als ein Templat wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 (1) cDNAs hergestellt und 36 PCR-Zyklen wurden dann unter Verwendung der in Beispiel 1 (2) erhaltenen degenerativen Primer und der cDNAs als ein Templat durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde in pBS-SKII(-) eingesetzt. Die Analyse der resultierenden DNA-Sequenz enthüllte, dass sie eine Teilsequenz von Meltrin β war. Die bestimmte DNA-Sequenz ist in 16 gezeigt.
(2) Erstes Durchmustern unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek mit einem Ursprung von humaner fötaler Lunge
Bezogen auf die in vorstehendem (1) erhaltene cDNA-Teilsequenz von Meltrin β wurden der Sense-Primer MA-3 und der Antisense-Primer MA-4 synthetisiert (siehe Tabelle 2). Die humane fötale Lunge-λgt11-cDNA-Bibliothek (Clonetech Co., Code Nr. CLHL1072) wurde auf eine LB-Platte (Durchmesser 10 cm) in einer solchen Dichte überimpft, dass 10.000 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung von Plaques wurden 5 ml SM-Puffer zu jeder Platte gegeben. Und die Platten wurden für 4 Stunden Raumtemperatur ausgesetzt und Phagen wurden von jeder Platte gesammelt (Plattenlysatverfahren). PCR wurde unter Verwendung der gesammelten Phagenlösung als ein Templat durchgeführt. Dann wurden die Primer MA-3 und MA-4, Ex Taq-Polymerase (TaKaRa Co.) und ihre Reagenzien (TakaRa Co.) gemischt, gefolgt von 35 Reaktionszyklen bei 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec und 72°C für eine min mittels eines DNA-Wärmecyclers (Perkin Elmer Co.). Ein Teil der amplifizierten Produkte wurde einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und eine Phagenlösung des Klons, welcher Meltrin β-cDNA umfasste, wurde ausgewählt.
(3) Zweites Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im ersten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 1000 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(4) Drittes Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im zweiten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 100 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(5) Viertes Durchmustern
Die Phagenlösung des gewünschten Klons, welche im dritten Durchmustern erhalten wurde, wurde mit einer solchen Dichte überimpft, dass 10 Plaques pro Platte erhalten werden konnten. Nach der Bildung der Plaques wurden Phagen in der gleichen Weise wie vorstehend gesammelt und eine Phagenlösung, welche den gewünschten Klon umfasste, wurde ausgewählt.
(6) Sammeln und Bestätigen eines DNA-Fragments, welches eine cDNA-Teilsequenz umfasst
Die PCR wurde unter Verwendung der im vierten Durchmustern erhaltenen (Nr. 24) Phagenlösung des gewünschten Klons als ein Templat und einer Kombination von λgt11-Vorwärtsprimer (Tabelle 1) und Primer MA-4 oder einer Kombination von λgt11-Umkehrprimer (Tabelle 1) und Primer MA-3 durchgeführt, wobei amplifizierte Produkte mit etwa 500 bp (24-F/4) beziehungsweise etwa 5 kbp (24-R/3) erhalten wurden. Aus einer DNA- Teilsequenzierung der terminalen Basen der resultierenden zwei DNA-Fragmente wurde abgeschätzt, dass diese cDNA die in vorstehendem (1) bestimmten Rasensequenzen umfasste.
(7) Analyse von Rasensequenzen
Für den Zweck des Subklonierens der cDNA-Fragmente, welche die cDNA-Teilsequenz von humanem Meltrin β umfassen, wurden zwei Primer MA-3-Eco und MA-4-Eco neu synthetisiert (siehe Tabelle 2).
Die PCR wurde unter Verwendung der Phagenlösung (Nr. 24) als ein Templat und einer Kombination von Primer λgt11-Vorwärts-Eco (Tabelle 1) und Primer MA-4-Eco oder einer Kombination von Primer λgt11-Umkehr-Eco (Tabelle 1) und Primer MA-3-Eco durchgeführt. Die resultierenden amplifizierten Produkte wurden mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von pUC118 eingesetzt, wobei die Plasmide „pMelβ(3-24C" beziehungsweise „pMelβ-24N" erhalten wurden. Die Sequenz der Meltrin β-cDNA, welche in diesen Plasmiden umfasst wurde, wurde durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt.
Der E. coli-Stamm JM109 wurde durch diese Plasmide gemäß dem bekannten Verfahren von Hanahan et al. transformiert, wobei JM109 (pMelβ-24C) und JM109 (pMelβ-24N) erhalten wurden und im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 350 Japan) am 03. Oktober 1996 gemäß dem Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulation unter den Zugangsnummern FERM BP-5690 beziehungsweise 5691 hinterlegt wurden.
Die Basensequenz und ihre entsprechende Aminosäuresequenz, welche durch die Basensequenzierung von pMelβ-24C und pMelβ-24N enthüllt wurden, sind in 24a bis 24e gezeigt.
Ein Vergleich der so erhaltenen DNA-Sequenz mit der in vorstehendem (1) erhaltenen zeigte einen Unterschied in den Rasenpaaren, welcher eine stille Mutation war, die keine Änderung der Aminosäure verursachte.
Die Analyse der Struktur der Basensequenz zeigte, dass die DNA die Sequenz von einem Zwischenteil der Metallproteinasedomäne zum C-Terminus von humanem Meltrin β kodierte.
Folglich nahm man an, dass in der in 24a bis 24e gezeigten Sequenz die Teilsequenz am C-Terminus der Metallproteinasedomäne der Sequenz von Gly (N-Terminus) bis Pro (Nr. 36) und den Basen Nr. 2 bis 109, die Disintegrindomäne der Sequenz von Asp (Nr. 37) oder Tyr (Nr. 42) bis Gly (Nr. 131) und den Basen Nr. 110 oder 125 bis 394, die Cysteinreiche Region der Sequenz von Thr (Nr. 132) bis Pro (Nr. 330) und den Basen Nr. 395 bis 991, die Transmembrandomäne der Sequenz von Val (Nr. 331) bis Met (Nr. 348) oder Arg (Nr. 353) und den Basen Nr. 992 bis 1045 oder 1060 entspricht. Man nimmt an, dass die Sequenz von Tyr (Nr. 349) oder Gin (Nr. 354) der intrazellulären Domäne entspricht. Da jedoch eine Homologieanalyse mit Maus-Meltrin β eine sehr niedrige Homologie in der Sequenz von Pro (Nr. 395) zeigt, wurde abgeschätzt, dass die Sequenz bis zu His (Nr. 394) in die Funktion der extrazellulären Domäne von humanem Meltrin β einbezogen ist. Die Sequenz bis zu Pro (Nr. 395) in 24a bis 24e ist in 17a bis 17c gezeigt. [TABELLE] Die Rasensequenzen der Primer für PCR

MA-3 :5' TGC TGC CAC CAG TGT AAG 3'

MA-4 :5' TCC TGG TAG GTG AGG CAC ATG 3'

MA-3-Eco :5' CCG GAA TTC TGC TGC CAC CAG TGT AAG 3'

MA-4-Eco :5' CCG GAA TTC TCC TGG TAG GTG AGG CAC ATG 3'
Beispiel 10: Herstellung von monoklonalen anti-Meltrin α-Antikörpern
(1) Auswahl der Peptide
Bezogen auf die in Beispiel 1 bestimmte Aminosäuresequenz von Maus-Meltrin α wurden ihre Epitope analysiert.
Acht Arten von Peptidsequenzen wurden als ein mögliches Epitop ausgewählt, bezogen auf die Sekundärstruktur, welche aus den Regionen, worin der Unterschied in den Aminosäuren zwischen den Meltrinen α und β gesehen wurde, der abgeschätzten Nicht-RGD-Region und der Region, worin die Metallproteinase gespalten worden war (18a und b), abgeschätzt wurde. Diese acht Arten von Peptiden wurden mit einer Peptidsynthetisiervorrichtung (ABI 432A) derart synthetisiert, dass sie an ihrem C-Terminus Cys aufwiesen, gespalten und durch HPLC mit einer Umkehrphasensäule (YMC-ODS) gereinigt.
(2) Herstellung von Antiserum
Nach der Lyophilisierung der in vorstehendem (1) erhaltenen Peptide wurden jeweils 0,55 mg Peptid in 0,55 μl 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gelöst. 0,77 mg maleimidiertes KLH (Boehringer Mannheim) wurden in 77 μl destilliertem Wasser gelöst. Die zwei resultierenden Lösungen wurden kombiniert und bei Raumtemperatur für zwei Stunden umgesetzt, gefolgt von der Reinigung mit einer Nick-Säule (Pharmacia), welche mit physiologischer Salzlösung äquilibriert worden war, wobei Antigene erhalten wurden, welche in den folgenden Experimenten verwendet wurden.
Jeweils 50 μg Antigen wurden mit physiologischer Salzlösung auf 0,1 ml verdünnt, mit der gleichen Menge an komplettem Freund-Adjuvans (DIFCO) gemischt und an Wistar-Ratten (5 Wochen alt, weiblich) intraperitoneal verabreicht. Das Antigen wurde mit der gleichen Menge an nicht komplettem Freund-Adjuvans (DIFCO) gemischt und zwei Wochen später in der gleichen Weise wie vorstehend verabreicht.
(3) Bewertung von Antiserum (Plattentest)
Eine Woche nach der Verabreichung wurde aus dem Augenhintergrund der Ratte Blut abgenommen und eine Zunahme des Antikörpertiters für die verabreichten Peptide wurde durch die Umsetzung zwischen immobilisierten Peptiden und dem Antiserum gemäß einem Plattentest wie folgt bestätigt.
Zuerst wurde eine 50 mM Phosphat-gepufferte Salzlösung (0,9% NaCl, pH-Wert 7,2), welche 0,5 mg/ml Sulfo-SMCC (Pierce) umfasste, in jede Vertiefung einer Aminoplatte (Sumitomo Bakelite) gegossen. Nach einer Inkubation bei 37°C für 2 Stunden wurden die Vertiefungen fünfmal mit Ionenaustauschwasser gewaschen und der vorstehende Puffer, welcher 0,5 μg/m1 von jedem Peptid umfasste, wurde zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37°C für eine Stunde wurde die Vertiefung mit einer 0,076 M Phosphat-gepufferten Salzlösung (0,45% NaCl, pH-Wert 6,4), welche hier nachstehend als „PBS" bezeichnet wird und 0,1% BSA und 4 mg/ml Cysteamin umfasste, blockiert. Das Blockiermittel wurde entfernt, jedes Antiserum, 1.000- bis 100.000-fach mit PBS verdünnt, wurde zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Nach zwei Wiederholungen von Waschen der Vertiefungen mit 0,9% NaCl, welches 0,005% Tween20 umfasste, wurde ein anti-Ratten-Immunglobulin-Antikörper, welcher mit Peroxidase markiert war (Dako) und mit PBS, welches 10% Kaninchenserum umfasste, verdünnt war, zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Nach der Vollendung der Umsetzung wurden die Vertiefungen fünfmal mit einer Waschflüssigkeit und zweimal mit Ionenaustauschwasser gewaschen. Und 0,1 M McIlvaine-Puffer (pH-Wert 5,0), welcher 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027% Hydroperoxid umfasste, wurde zugegeben und für 5 min umgesetzt. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 1 N HCl abgebrochen und die Extinktion bei 490 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt, wobei (++) eine starke Reaktivität bedeutet und (+) eine schwache Reaktivität bedeutet. TABELLE 3 Umsetzung von Antiserum mit den Peptidantigenen

Peptidantigene Umsetzung des Antiserums

1 ProA ++

2 MP-A ++

3 MP-B ++

4 DC-A +

5 DC-B +

6 DC-C ++

7 DC-D N.D.

8 DEA ++

N. D. (nicht bestimmt)

(4) Bewertung von Antiserum (Western-Blotting)
Für die Bestätigung der Bindung des in vorstehendem (2) hergestellten Antiserums an Meltrine wurde Western-Blotting durchgeführt.
Ein Maus-Myoblast C2 wurde mit pBOSMelαδPro(+) und pBOSMelβ(+) transformiert, welches hier nachstehend als „#9-3" bezeichnet wird, und ein Maus-Myoblast C2 wurde mit pBOSMelαδMP(+) transformiert, welches hier nachstehend als „#3-5" bezeichnet wird.
Die transformierten C2-Zellen, welche 1 × 10⁷ Zellen waren, wurden mit PBS (GIBCO BRL) gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt. Die Dichte der gesammelten Zellen wurde auf 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, gemischt mit einem Proteolyseinhibitor, Complete (Boehringer Mannheim), in einer Menge von einem Fünfundzwanzigstel des Volumens des Zellgemisches und gemischt mit SDS in einer Endkonzentration von 0,2%. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min wurden die Zellen Ultraschall bei 4°C für 10 sec (1 sec × 10) ausgesetzt und zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde gesammelt und als ein Zelllysat verwendet. Ein anderes Zelllysat wurde aus dem Fibroblasten L929 (ATCC Nr. CCL-1) in der gleichen Weise hergestellt und als eine negative Kontrolle verwendet.
Das resultierende Zelllysat (10 μl) wurde mit einer gleichen Menge eines Gelbeladungspuffers (0,25 M Tris-HCl, 2% SDS, 30% Glycerol, 0,01% BPB (pH-Wert 6,8)) gemischt, die resultierende Lösung (6 μl) wurde auf SDS-PAGE von 4-20T% (Tefco) aufgebracht und unter 25 mA bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde elektrophoretisiert. Nach der Vollendung der Elektrophorese wurde der Inhalt auf eine PVDF-Membran (Millipore) unter den Bedingungen 150 mA, 4°C und 45 min überführt. Die Membran wurde durch Schütteln in 4% Magermilch (Meiji Milk Co.) bei Raumtemperatur für eine Stunde blockiert und jede Spur wurde ausgeschnitten. Jede ausgeschnittene Spur wurde in Antiserum (1 ml), welches 500-fach mit 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,2), das 0,05% Tween 20 (hier nachstehend als „T-TBS" bezeichnet) und 4% Magermilch umfasste, verdünnt worden war, bei Raumtemperatur für eine Stunde eingeweicht und geschüttelt. Nach der Vollendung der Umsetzung wurde jede Spur zweimal mit T-PBS gewaschen, in 1 ml eines anti-Ratten-Immunglobulin-Antikörpers, welcher mit HRPO (Dako) markiert war, 500-fach verdünnt mit T-PBS, welche 4% Magermilch umfasste, eingeweicht und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Nach dem fünfmaligen Waschen mit T-PBS wurde sie mit einem ECL-System (Amersham) nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Banden wurden in den drei Arten der Antiseren durch das Western-Blotting nachgewiesen. TABELLE 4 Umsetzung des Antiserums mit dem Zelllysat beim Western-Blotting

Peptidantigene Western-Blotting

1 ProA +

2 MP-A –

3 MP-B –

4 DC-A N.D.

5 DC-B N.D.

6 DC-C +

7 DC-D N.D.

8 DEA +

N.D. (nicht bestimmt)

(5) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
Die Antigene (ProA, MP-B, DC-C, DEA) (jeweils 50 μg) wurden mit 400 μl physiologischer Salzlösung verdünnt und in die Schwanzvene der Ratten, deren Antikörpertiter sich erhöht hatte, injiziert. Drei Tage später wurde unter Verwendung des Myeloms P3X63Ag8U.1 gemäß dem bekannten Verfahren (Monoclonal antibody Jikken Sosa Nyumon (Guide of monoclonal antibody preparation), Tamie Ando und Jo Chiba, Koudan-sha Scientific) Zellfusion durchgeführt. Sechs Tage später wurde der Kulturüberstand gesammelt und dem Plattentest gemäß dem Verfahren von vorstehendem (3) unterworfen. Die Vertiefungen, welche eine Reaktivität mit den Peptidantigenen zeigten, wurden einer Klonierung durch einschränkende Verdünnung unterworfen (Monoclonal antibody Jikken Sosa Nyumon (Guide of monoclonal antibody preparation), Tamie Ando und Jo Chiba, Koudan-sha Scientific). Nach dem Klonieren wurde das Durchmustern mit dem Plattentest wieder durchgeführt, wobei 27 Klone der Hybridoma erhalten wurden, welche einen monoklonalen anti-Maus-Meltrin α-Antikörper herstellten, der mit den Peptidantigenen reagierte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Hybridoma, welche einen monoklonalen anti-Meltrinpeptid-Antikörper herstellen

Peptidantigene Hybridom Nr. Die Anzahl der Hb

ProA F936 10

MP-B F939 4

DC-C F933 4

DEA F934 8
Gereinigte Antikörper wurden aus den so etablierten monoklonalen anti-Meltrin-Antikörperherstellenden Hybridomzelllinien durch das folgende Verfahren erhalten.
Die Hybridoma wurden in RPMI1640, welches mit 10% fötalem Kälberserum und 1 ng/ml humanem IL6 ergänzt worden war, bis zu einer Enddichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml kultiviert.
Das Medium wurde dann mit einem serumfreien Medium (Hybridoma-SFM, GIBCO BRL) ausgetauscht und die Kultur wurde fortgeführt, bis die Zellen starben. Der resultierende Kulturüberstand wurde durch Filterpapier zur Entfernung der Zellen filtriert und einer Reinigung mit einer Protein G-Säule (Prosep-G, Bioprocessing INC) wie folgt unterworfen.
Der Kulturüberstand (1 l) wurde auf eine Prosep-G-Säule (20 ml) mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min aufgebracht, gefolgt von Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5), welcher 0,15 M NaCl umfasste. Nachdem die Extinktion bei 280 nm abgenommen hatte, wurde der gebundene monoklonale Antikörper mit 0,1 M Zitronensäurepuffer (pH-Wert 3,0) eluiert. Nach dem Neutralisieren des pH-Werts wurde das Eluat mit DIAFLO (Grace Japan) konzentriert und gegen 0,076 M Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH-Wert 6,4), welche 0,45% NaCl umfasste, dialysiert. Die Konzentration des gereinigten Antikörpers wurde bezogen auf die Extinktion bei 280 nm berechnet.
(6) Bewertung des monoklonalen Antikörpers
Die Bindungsaktivität von 7 Chargen der gereinigten in vorstehendem (5) erhaltenen Antikörper (jeweils 10 μg/ml) für Meltrin wurde durch Western-Blotting gemäß dem Verfahren des vorstehenden (4) unter Verwendung des Zelllysats der #9-3-Zelle bestätigt. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt. Die Bande mit etwa 67 kDa, welche spezifisch für das Zelllysat der #9-3-Zelle ist, wurde durch die Umsetzung mit F933-4-3 (Unterklasse IgG2a), F933-10-26 (Unterklasse IgG2a), F934-17-6 (Unterklasse IgG2a), F934-3-23 (Unterklasse IgG2a), F934-4-33 (Unterklasse IgG2a), F934-6-3 (Unterklasse IgG2a) und F934-20-5 (Unterklasse IgG2c) nachgewiesen. Da diese Banden nicht im Falle des Zelllysats der L929-Zelle nachgewiesen wurden, wurde bestätigt, dass die in vorstehendem (5) erhaltenen monoklonalen Antikörper an Meltrin gebunden waren.
Beispiel 11: Herstellung des monoklonalen anti-Maus-Meltrin-Antikörpers
(1) Herstellung des Antigens, welches verabreicht wird, und Immunisierung einer Ratte
Ratten wurden mit #9-3- und #3-5-Zellen als das Antigen, welches wie folgt verabreicht wurde, immunisiert. Die Zellen, welche als das Antigen, welches verabreicht wurde, verwendet wurden, wurden in der Abwesenheit von bFGF kultiviert. Zuerst wurden die Zellen, welche in vier Schalen zu einer Dichte von etwa 5 × 10⁵ Zellen/Schale mit 10 cm Durchmesser kultiviert worden waren, in 20 Schalen bis zur gleichen Dichte wie vorstehend subkultiviert, dann in 40 Schalen (Durchmesser 15 cm) bis zu einer Dichte von etwa 5 bis 6 × 10⁶ Zellen/Schale wieder subkultiviert und weiter in einem Differenzierungsmedium (DMEM, ergänzt mit 2% Pferdeserum) für zwei Tage kultiviert, um schließlich Myotube zu bilden. Diese Zellen wurden dann mit einem Siliciumgummi-Policeman abgeschabt, zweimal mit PBS gewaschen und in dem Medium, welches 10% DMSO umfasste, zur Lagerung bei –80°C suspendiert.
Die #9-3- und #3-5-Zellen wurden in physiologischer Salzlösung (200 μl) suspendiert, mit einer gleichen Menge an komplettem Freund-Adjuvans (DIFCO) gemischt und intraperitoneal an eine Wistar-Ratte (5 Wochen alt, weiblich) in einer Menge von 1 × 10⁷ Zellen/Ratte verabreicht. Das Antigen wurde mit der gleichen Menge an nicht komplettem Freund-Adjuvans (DIFCO) gemischt und zwei Wochen später in der gleichen Weise wie vorstehend verabreicht.
(2) Bewertung von Antiserum
Eine Woche nach dem Verstärken wurde aus dem Augenhintergrund der Ratte Blut abgenommen und ein Binden des Antiserums an Meltrin wurde unter Verwendung des Zellextrakts gemäß dem Plattentest von Beispiel 10 (3) bestimmt. Die Zellextrakte der #9-3-, #3-5- und L929-Zellen wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 (4) hergestellt, außer dass NP-40 (Nacarai Tesque Co.) in einer Endkonzentration von 0,5% als ein grenzflächenaktives Mittel verwendet wurde.
Zuerst wurde jeder Zellextrakt mit PBS auf eine Konzentration von 40 μg/ml verdünnt, wobei jeweils 50 μl davon getrennt in jede Vertiefung einer Immunplatte (Maxisorp Nunc) gegossen wurden. Nach einer Inkubation bei 56°C für 30 min zum Binden des Antigens wurden die Vertiefungen fünfmal mit Ionenaustauschwasser gewaschen, mit 100 μl 20% Block Ace (Yukijirushi Milk Co.)/PBS blockiert, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min. Nach dem Entfernen des Blockiermittels wurde jedes Antiserum (50 μl) zugegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Nach zwei Wiederholungen des Waschens der Vertiefungen mit der Waschflüssigkeit wurden 50 μl eines anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörpers, markiert mit Peroxidase (Dako) und 1.000-fach verdünnt mit 10% Block Ace/PBS, zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Nach der Vollendung der Umsetzung wurden die Vertiefungen fünfmal mit der Waschflüssigkeit und zweimal mit Ionenaustauschwasser gewaschen und 50 μl 0,1 M McIlvaine-Puffer (pH-Wert 5,0), welcher 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027% Hydroperoxid umfasste, wurden zugegeben und für 10 min umgesetzt. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 1 N HCl (50 μl) abgebrochen und die Extinktion bei 490 nm wurde gemessen.
Western-Blotting wurde auch unter Verwendung des in vorstehendem (4) beschriebenen Zellextrakts von L4-3 durchgeführt, um seine Bindung an Meltrin zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Es wurde bestätigt, dass sich das Antiserum, welches aus den Ratten erhalten wurde, die mit #9-3- und #3-5-Zellen immunisiert worden waren, mit dem entsprechenden Zellextrakt umsetzte und an Meltrin beim Western-Blotting gebunden wurde. TABELLE 6 Umsetzung des Antiserums der Ratten, welche mit #9-3- und #3-5-Zellen immunisiert worden waren, mit Meltrin

Antiserum Plattentest Western-Blotting

#9-3 #3-5 L929 L4-3

Ratte, welche mit #9-3-Zellen immunisiert wurde + N.D. – +

Ratte, welche mit #3-5-Zellen immunisiert wurde N.D. + – +

N.D. (nicht bestimmt)

(3) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
Die #9-3- und #3-5-Zellen (jeweils 1 × 10⁷ Zellen) wurden in physiologischer Salzlösung (200 μl) suspendiert und intraperitoneal an die Ratte, deren Antikörpertiter sich erhöht hatte, verabreicht. Drei Tage später wurde unter Verwendung des Myeloms P3X63Ag8U.1 gemäß dem bekannten Verfahren (Monoclonal antibody Jikken Sosa Nyumon (Guide of monoclonal antibody preparation), Tamie Ando und Jo Chiba, Koudan-sha Scientific) Zellfusion durchgeführt. Sechs Tage später wurde der Kulturüberstand auf seine Reaktivität mit den immobilisierten Zellextrakten durchgemustert. Die Vertiefungen, welche mit den Zellextrakten Reaktivität zeigten, wurden einer Klonierung durch einschränkende Verdünnung unterworfen (Monoclonal antibody Jikken Sosa Nyumon (Guide of monoclonal antibody preparation), Tamie Ando und Jo Chiba, Koudan-sha Scientific). Nach dem Klonieren wurde das vorstehende Durchmustern wiederholt, wobei 13 Klone erhalten wurden, 5 Klone von der Ratte, welche mit #9-3 immunisiert worden war (δPro; Hybridom Nr. F932) und 8 Klone von der Ratte, welche mit #3-5 immunisiert worden war (δMP; Hybridom Nr. F937).
(4) Bewertung eines monoklonalen Antikörpers
Die monoklonalen Antikörper F932-15-2 (Unterklasse IgG1) und F937-9-2 (Unterklasse IgG1), welche eine hohe Reaktivität mit den Zellextrakten zeigten, wurden bewertet.
Zuerst wurde das Anfärben von durch C2-Zellen gebildetes Myotube durch ein Zellimmunfluoreszenzanfärbeverfahren untersucht. C2-Zellen wurden in 10% FCS/DMEM in einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert, wobei jeweils 100 μl davon dann getrennt in die Vertiefungen des Kammerobjektträgers (Lab-TEK, Nunc Co.) gegossen wurden. Nach der Kultur bei 37°C und 5% CO₂ für zwei Tage wurde das Medium mit 2% Pferdeserum/DMEM ausgetauscht. Das Zellenanfärben wurde unter Verwendung von zwei Tage später gebildetem Myotube durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS^– gewaschen und 4% Formaldehyd wurden zugegeben, gefolgt von der Umsetzung bei Raumtemperatur für 30 min, um die Zellen zu fixieren. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 20% Block Ace/T-PBS blockiert. Nach der Entfernung des Blockiermittels wurden Antikörper, verdünnt auf 10 μg/ml mit 20% Block Ace/T-PBS, zugegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Nach drei Wiederholungen von Waschen der Vertiefungen mit PBS^– wurde ein anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörper FITC (Dako), 20-fach verdünnt mit 10% Kaninchenserum/T-PBS, in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Vollendung der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS^– gewaschen und Fluoreszenzmikroskopie unterworfen. Es wurde beobachtet, dass Myotube durch beide Antikörper angefärbt wurde, aber nicht durch Ratten-IgG (ZYMED) angefärbt wurde, welches als eine negative Kontrolle verwendet wurde.
Als Nächstes wurden L929-Zellen, welche Maus-Meltrin α oder β exprimieren, hergestellt und Zellenanfärben für den Zweck der Bestätigung der Spezifität der vorstehenden Antikörper unterworfen. So wurde der Fibroblast L929 mit dem Gemisch, welches die in Beispiel 4 hergestellten Plasmide pBOSMelα(+) und pBOSMelβ(+) und das Plasmid pSV2NEO in einem Molverhältnis von 12:12:1 umfasste, unter Verwendung von LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) gemäß seinem Protokoll transfiziert, wobei L4-3-Zellen erhalten wurden, welche die Maus-Meltrin α und β exprimierten. In ähnlicher Weise wurde L929 mit dem Gemisch, welches das Plasmid pBOSMelβ(+) und das Plasmid pSV2NEO in einem Molverhältnis von 20:1 umfasste, transfiziert, wobei L2-10-Zellen erhalten wurden, welche Maus-Meltrin β exprimierten. In ähnlicher Weise wurde L929 mit dem Plasmid pBOSMelαδPro(+) transfiziert, wobei L8-5-Zellen erhalten wurden, welche Maus-Meltrin αδPro exprimierten. Die transfizierten Zellen wurden in 10% FCS/DMEM kultiviert und auf einem Kammerobjektträger subkultiviert. Die Spezifität der Antikörper wurde durch Zellenanfärben unter Verwendung der L929-, L4-3-, L2-10- und L8-5-Zellen bestätigt. Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass F932-15-2 an die Meltrin α und β gebunden war und F937-9-2 an Meltrin α gebunden war.
Das Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper F932-15-2 exprimiert, wurde im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 350 Japan) am 03. Oktober 1996 gemäß dem Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulation unter der Zugangsnummer FERM BP-5687 hinterlegt. TABELLE 7

Zelle Expression F932-15-2 F937-9-2

L929 – – –

L4-3 α und β + +

L2-10 β + –

L8-5 α (δPro) + +
(5) Bestimmung der neutralisierenden Aktivität
Die neutralisierende Aktivität der in vorstehendem (3) erhaltenen monoklonalen Antikörper wurde durch ihre Inhibierung der Bildung von Myotube durch C2-Zellen bestätigt. C2-Zellen wurden in einer Kollagen-beschichteten Schale, welche 10% FCS/DMEM enthielt, bis 80% Konfluenz kultiviert, gefolgt von einem Austausch des Mediums mit 2% Pferdeserum/DMEM, welches mit 0 oder 40 μg/ml der Antikörper, welche getestet wurden, ergänzt worden war. Die Bildung von Myotube wurde dann beobachtet und das Verhältnis der Kerne in dem gebildeten Myotube wurde berechnet. Wie in 20 gesehen wird, wurde die Bildung von Myotube am Tag 2 inhibiert, was zeigt, dass sowohl F932-15-2 als auch F937-9-2 die neutralisierende Aktivität aufwiesen.
Beispiel 12: Die Aktivität von Meltrin-neutralisierenden Antikörpern bei der Inhibierung der Bildung von Knochenresorptionsbereichen (Pit) in nicht fraktionierten Mausknochenzellen
Oberschenkel- und Schienbeinknochen, welche von einer 13 Tage alten ICR-Maus entnommen wurden, wurden in MEM α-Medium (GIBCO), welches mit 5% FBS ergänzt worden war, zerkleinert. Nachdem man für 2 min ruhig stehen gelassen hatte, wurden die abgesetzten Knochenreste entfernt. Der Überstand der suspendierten Zellen wurde auf 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt, worauf 100 μl davon in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen, welche mit Elfenbeinfragmenten bestückt worden war, gegeben wurden. Die Elfenbeinfragmente wurden dünn geschnitten, 6 mm im Durchmesser ausgestanzt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und sterilisiert. Der in Beispiel 11 erhaltene Maus-Meltrinneutralisierende Antikörper (F932-15-2) und Ratten-IgG wurden mit MEM α-Medium (GIBCO), welches mit 5% FBS verdünnt worden war, auf Endkonzentrationen von 5, 50 und 500 μg/ml verdünnt, wobei 100 μl davon dann in jede Vertiefung gegeben wurden. Nach einer Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ für drei Tage wurden die Zellen mit einem Schaber entfernt und der Resorptionsbereich wurde mit einer Säurehämatoxylin-Lösung (SIGMA) für etwa 7 min angefärbt und die Anzahl der angefärbten Resorptionsbereiche wurde unter Verwendung eines Okularmikrometers unter einem Mikroskop durch Zählen der Anzahl der Quadrate, in welchen Resorptionsfossa enthalten waren, berechnet.
Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt, wobei gezeigt wird, dass die Anzahl der gebildeten Resorptionsbereiche in einer dosisabhängigen Weise durch den Maus-Meltrinneutralisierenden Antikörper inhibiert wurde. Demgemäß wurde vorgeschlagen, dass der Meltrin-neutralisierende Antikörper direkt oder indirekt Osteoclasten beeinflusst und Knochenresorption inhibiert.
Beispiel 13: Serum-Ca-erniedrigende Aktivität eines Meltrin-neutralisierenden Antikörpers in einer Maus mit erhöhter Knochenresorption
Sieben Wochen alte ICR-Mäuse (männlich) wurden für fünf Tage mit Futter mit wenig Ca mit einem Ca-Gehalt von 0,02% oder weniger gefüttert. Der in Beispiel 11 erhaltene Maus-Meltrin-neutralisierende Antikörper (F932-15-2) wurde in die Schwanzvene der Mäuse (wobei eine Gruppe aus fünf Mäusen bestand) in Dosen von 0,1 mg und 1 mg pro Maus injiziert. Ratten-IgG (1 mg pro Maus) und Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung wurden auch als eine Kontrolle in der gleichen Weise injiziert. Vor der Injektion und einen Tag später wurde Blut aus der Vene unter den Augen gesammelt und das Serum wurde abgetrennt. Der Wert von Ca im Serum wurde dann durch eine Autoanalysevorrichtung (COBAS, FARAII, ROCHE) unter Verwendung eines Ca-Bestimmungskits (CalciumHR-II, WAKO Pure Pharmaceuticals) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt.
Wie in 22 gesehen wird, war der Serum-Ca-Wert nach einem Tag, ausgehend von der Injektion in die Gruppen, welche mit dem Maus-Meltrin-neutralisierenden Antikörper behandelt wurden, niedriger als der der Gruppen, welche mit Ratten-IgG oder physiologischer Salzlösung behandelt wurden. Diese Ergebnisse schlugen vor, dass der Meltrinneutralisierende Antikörper eine krankhaft gesteigerte Knochenresorption aufgrund von Hyperparathyroidismus oder maligner Hyperkalzämie inhibiert.
Beispiel 14: Herstellung eines cDNA-Fragments, welches humanes Meltrin α, das die Transmembrandomäne umfasst, kodiert
Ein Sense-Primer S-hMelα-TM5' wurde bezogen auf die cDNA-Teilsequenz von in Beispiel 8 erhaltenem humanem Meltrin α synthetisiert und ein Antisense-Primer A-mMelα-3' wurde bezogen auf die cDNA-Sequenz von Maus-Meltrin α synthetisiert (siehe Tabelle 1).
PCR wurde durch Mischen der humanen Plazenta-λgt11-cDNA-Bibliothek (Clonetech Co., Code Nr. CLHL1008b) als ein Templat mit den Primern S-hMelα-TM5' und A-mMelα-3', Ex Taq-Polymerase (TaKaRa Co.) und ihren Reagenzien (TakaRa Co.), gefolgt von 35 Reaktionszyklen bei 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec und 72°C für eine min durchgeführt. Die Basensequenzierung des resultierenden amplifizierten Fragments (Klon TM) schlug vor, dass das Fragment ein humanes cDNA-Fragment war, welches etwa 220 Aminosäuren entsprach, die die Transmembrandomäne von Maus-Meltrin umfassten.
Die erhaltene Basensequenz und ihre entsprechende Aminosäuresequenz sind in 23a bis 23b gezeigt.
Beispiel 15: Test auf akute Toxizität
Der in Beispiel 11 erhaltene Maus-Meltrin-neutralisierende Antikörper (F932-15-2) wurde in sieben Wochen alte männliche ICR-Mäuse (wobei eine Gruppe aus fünf Mäusen bestand) in Dosen von 1 mg und 3 mg pro Maus injiziert. Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung wurde auch in eine Kontrollgruppe in der gleichen Weise injiziert. Es wurde weder eine signifikante Abnahme des Körpergewichts noch eine Nebenwirkung in jeder Gruppe nach der Injektion beobachtet. Auch wurde keine tote Maus beobachtet.
Referenzbeispiel 1: Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der humanes Meltrin erkennt
(1) Herstellung eines Antikörpers unter Verwendung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz, welche von humanem Meltrin abgeleitet ist, als ein Antigen Unter Berücksichtigung der in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse wurde die Sequenz „GKVSKSSFAKCEMRDAKC", welche DC-C in der Aminosäuresequenz von humanem Meltrin α entspricht, welche in Beispiel 8 erhalten wurde, in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 (1) synthetisiert, gereinigt und mit maleimidiertem KLH konjugiert, wobei ein Antigen erhalten wurde, welches verabreicht wurde. 20 μg des Antigens wurden in 0,1 ml physiologischer Salzlösung gelöst und mit einer gleichen Menge an FCA gemischt, gefolgt von einer Injektion in eine ddy-Maus (5 Wochen alt, weiblich). Die gleiche Menge des Antigens wurde mit FIA gemischt und zwei Wochen später injiziert. Das Blut wurde eine Woche später aus dem Augenhintergrund gesammelt und Antiserum wurde hergestellt. Eine Bewertung der Reaktivität des resultierenden Antiserums mit dem verabreichten Peptid gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 (3) enthüllte seine spezifische Reaktivität mit dem verabreichten Peptid. Demgemäß werden Maus, Ratte, Hamster und dergleichen mit dem Peptidantigen immunisiert und ein monoklonaler Antikörper kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 (5) hergestellt werden. Ein solcher Antikörper kann auch bei Western-Blotting verwendet werden.
Da angenommen wird, dass die Aminosäuresequenz in 15a bis 15f Meltrin α von einem löslichen Typ ist, kann ein Antikörper, der wirksam bei der Bestimmung von löslichem Meltrin im Körper verwendet werden kann, durch Immunisierung für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz benachbart zum C-Terminus der vorstehenden Sequenz hergestellt werden.
In ähnlicher Weise können Antikörper, welche humanes Meltrin β und Meltrin γ erkennen, durch chemisches Synthetisieren von Peptiden mit den Aminosäuresequenzen von geeigneten Teilen in den Aminosäuresequenzen in 17a bis 17c oder 13a bis 13d und Injizieren der so synthetisierten Peptide in Tiere hergestellt werden. In jedem Fall wird die Aminosäuresequenz aus der extrazellulären Domäne ausgewählt.
Für die Herstellung eines Antikörpers, welcher zu jeweils einem der Meltrin α, β und γ spezifisch ist, sollte die Aminosäuresequenz aus den Teilen mit einer niedrigen Homologie unter ihnen ausgewählt werden und ein Peptid mit der so ausgewählten Aminosäuresequenz wird synthetisiert und in Tiere wie Maus, Ratte und Hamster in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 (2) injiziert.
In jedem Fall werden monoklonale Antikörper in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 (5) hergestellt.
(2) Herstellung eines monoklonalen anti-Meltrin-Antikörpers unter Verwendung von Zellen, welche humanes Meltrin exprimieren, als ein Antigen
DNA, welche die Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuresequenz, welche strangabwärts der in 23a bis 23b gezeigten Transmembrandomäne lokalisiert ist, strangabwärts der Sequenz der Metallproteinase- oder der Disintegrindomäne bis zur in 15a bis 15f gezeigten Cystein-reichen Region fusioniert wird, wird hergestellt und in einen Expressionsvektor pEFBOS eingesetzt, gefolgt von einer Transformation von C2-Zellen durch den resultierenden Vektor. Der Transformant wird wie in Beispiel 11 (1) behandelt und als ein Antigen zur Immunisierung von Tieren wie Maus, Ratte und Hamster verwendet. Antikörper, welche humanes Meltrin α erkennen, werden wie in Beispiel 11 (2) durchgemustert und monoklonale Antikörper werden wie in Beispiel 11 (3) hergestellt.
In ähnlicher Weise wird DNA, welche die in 17a bis 17c gezeigte Aminosäuresequenz oder die Sequenz, welche strangabwärts der Disintegrindomäne der vorstehenden Sequenz lokalisiert ist, kodiert, hergestellt und in einen Expressionsvektor pEFBOS eingesetzt, gefolgt von einer Transformation von C2-Zellen durch den resultierenden Vektor. Der Transformant wird wie in Beispiel 11 (1) behandelt und als ein Antigen zur Immunisierung von Tieren wie Maus, Ratte und Hamster verwendet. Antikörper, welche humanes Meltrin β erkennen, werden wie in Beispiel 11 (2) durchgemustert und monoklonale Antikörper werden wie in Beispiel 11 (3) hergestellt.
In ähnlicher Weise wird DNA, welche die in 13a bis 13d gezeigte Aminosäuresequenz oder die Sequenz, welche strangabwärts der Disintegrindomäne der vorstehenden Sequenz lokalisiert ist, kodiert, hergestellt und in einen Expressionsvektor pEFBOS eingesetzt, gefolgt von einer Transformation von C2-Zellen durch den resultierenden Vektor. Der Transformant wird wie in Beispiel 11 (1) behandelt und als ein Antigen zur Immunisierung von Tieren wie Maus, Ratte und Hamster verwendet. Antikörper, welche humanes Meltrin γ erkennen, werden wie in Beispiel 11 (2) durchgemustert und monoklonale Antikörper werden wie in Beispiel 11 (3) hergestellt.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Lösliches Meltrin-Polypeptid, nicht umfassend eine Transmembrandomäne oder eine intrazelluläre Domäne und umfassend die Aminosäuresequenz von Glu (Nr. 156) bis Ile (Nr. 686) von dem N-Terminus in 15a–15f.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von Gly (Nr. 1) bis Ile (Nr. 686) von dem N-Terminus in 15a–15f.
DNA, umfassend eine Basensequenz, welche ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
DNA nach Anspruch 3 oder 4, umfassend die Basensequenz von Nr. 1 bis Nr. 2058 von dem 5'-Terminus in 15a–15f.
DNA nach Anspruch 3, umfassend die Basensequenz von Nr. 1 bis Nr. 2848 von dem 5'-Terminus in 15a–15f.
Antisense-Oligonucleotid, welches mit einem Teil der Sequenz von Nr. 1957 bis Nr. 2848 von dem 5'-Terminus in 15a 15f hybridisiert.
Antisense-Oligonucleotid nach Anspruch 6, welches die Expression des Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 inhibiert.
Antikörper, welcher die C-terminale Region eines löslichen Meltrins erkennt, wobei sich die C-terminale Region von Aminosäure Nr. 653 bis Nr. 686 von dem Aminoterminus in 15a–15f erstreckt.
Antikörper nach Anspruch 8, welcher ein polyklonaler Antikörper ist, der von einer Maus erhalten wurde.
Antikörper nach Anspruch 8, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 9, welcher ein monoklonaler Antikörper ist, erhalten aus einem Hybridom unter Verwendung von Mäusemilzzellen und Lymphozyten.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, wobei das Verfahren umfasst: – Immunisieren eines Tieres mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2; und – Erhalten eines Antikörpers aus dem immunisierten Tier.
Vektor, umfassend eine DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5.
Transformant durch den Vektor nach Anspruch 13.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren Kultivieren des geeigneten Transformanten nach Anspruch 14 umfasst.
Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, ein Antisense-Oligonucleotid nach Anspruch 6 oder 7 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 11.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2, eines Antisense-Oligonucleotids nach Anspruch 6 oder 7 oder eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes, der mit krankhafter gesteigerter Knochenresorption in Zusammenhang steht.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der Zustand, der mit krankhafter gesteigerter Knochenresorption in Zusammenhang steht, Osteoporose oder Hyperkalzämie ist.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2, eines Antisense-Oligonucleotids nach Anspruch 6 oder 7 oder eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Metastasierung von Krebszellen.