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GEGENSTAND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum
Verringern der IgE-Niveaus und zum Lindern allergischer Symptome
in Kaninen bereit. Die Zusammensetzungen umfassen chimäre kanine
anti-IgE mAb's,
und die Verfahren sind zum Behandeln von Allergien in Kaninen verwendbar.
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HINTERGRUNDINFORMATIONEN
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Es
wird geschätzt,
dass bis zu 30% aller Hunde an Allergien oder allergiebezogenen
Hauterkrankungen leiden. Es wurde insbesondere geschätzt, dass
die allergische Dermatitis zwischen 3% und 15% der gesamten kaninen
Population betrifft. Aufgrund der Verbreitung von Allergien in Hunden
besteht ein Bedarf für das
Entwickeln von Verfahren und Zusammensetzungen zur geeigneten Diagnose
und Behandlung kaniner Allergien.
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Die
Substanzen, die am wahrscheinlichsten eine allergische Reaktion
verursachen, variieren von Art zu Art. Übliche kanine Allergene schließen Flöhe, Pollen,
Schimmelpilze und Staub ein. Man glaubt, dass die Allergie gegenüber Flöhen die
am weitesten verbreiteste Hundeallergie ist. Für gewöhnlich ist der Flohspeichel das
Allergen und ein einzelner Flohbiss kann einen erheblichen Juckreiz
verursachen. Eine zusätzliche
Form der Allergie in Hunden wird Atopie genannt. Die Atopie ist
ein Zustand, in dem der Hund allergisch gegenüber Inhalationssubstanzen ist,
wie zum Beispiel Pollen, Schimmelpilze oder mikroskopische Milben,
die im Hausstaub zu finden sind. Derzeitige Behandlungen kaniner
Allergien konzentrieren sich häufig
auf die Verwendung von Steroiden, die unerwünschte Nebenwirkungen oder
allergenvermittelte Desensibilisierung verursachen, was eine andere
Behandlung für
jeden Allergietyp erforderlich macht.
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In
Säugetieren
werden Antikörpermoleküle nach
zahlreichen Isotypen klassifiziert, die als IgA, IgD, IgE, IgG und
IgM bezeichnet werden. Antikörpermoleküle bestehen
aus schweren und leichten Kettenkomponenten. Die schweren Ketten
der Moleküle
eines bestimmten Isotyps haben extensive Bereiche mit Homologie in
der Aminosäuresequenz
und haben umgekehrt Bereiche mit Unterschieden zu Antikörpern, die
zu anderen Isotypen gehören.
Die miteinander geteilten Bereiche der schweren Ketten verleihen
den Mitgliedern jedes Isotyps die allgemeinen Fähigkeiten an einen bestimmten
Zelloberflächenrezeptor
oder an andere Makromoleküle,
wie zum Beispiel das Komplement, zu binden und dadurch bestimmte
Immuneffektorfunktionen zu aktivieren. Daher dient die Trennung
von Antikörpermolekülen in Isotypen
auch dem Trennen der Antikörper
nach verschiedenen Effektorfunktionen, die sie für gewöhnlich aktivieren. Beim Menschen
und bei Hunden ist das Immunoglobulin E (IgE) an Allergien beteiligt
und erkennt ein Antigen in der Überempfindlichkeitsreaktion
vom Soforttyp.
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Darüber hinaus
ist IgE ein Antikörpertyp,
der als ein wichtiger Vermittler einer allergischen Reaktion in Säugetieren,
einschließlich
der Typ I Überempfindlichkeitsreaktion
vom Soforttyp, bekannt ist. IgE-Moleküle binden an Rezeptoren auf
Mediatorzellen, wie zum Beispiel Mastzellen. Diese Bindung tritt
auf, wenn der Fc-Bereich des IgE-Moleküls an Fc-Rezeptoren auf der
Mastzelle gebunden wird. Wenn solche zellgebundenen IgE-Antikörper dann
an ein Allergen binden, vernetzt das Allergen mehrere IgE-Antikörper auf
der Mastzellenoberfläche.
Diese Quervernetzung vermittelt die Typ I Überempfindlichkeitsreaktion
vom Soforttyp und verursacht die Freisetzung von Histaminen und
anderen Molekülen,
die Symptome erzeugen, die mit einer Allergie in Verbindung stehen.
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Beim
Menschen dient das Serumniveau des Gesamt-IgE's zur Diagnostik einer allergischen
Erkrankung. Um die Möglichkeit
zu untersuchen, ob das Serumniveau an IgE ebenfalls zur Diagnostik
für Allergien
in Hunden dienen könnte,
führten
DeBoer und Hill zusätzliche
Studien durch. (Hill und DeBoer, Am. J. Vet. Res. 55(7): 944–48 (1994)).
Sie verwendeten monoklonale Antikörper ("mAb")
D9 in einem ELISA-Assay mit folgender Konfiguration: D9 war an ein
Substrat gebunden, die Antikörper
wurden durch D9 gefangen und dann wurde D9, der einen Marker aufwies,
verwendet, um die gefangenen Antikörper zu markieren.
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Der
Hill und DeBoer-ELISA wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Serum-IgE
von Kaninen zu ermitteln, um kanine Allergien zu diagnostizieren.
Man fand jedoch heraus, dass das Quantifizieren von IgE zur Diagnose
von Allergien in Hunden nicht geeignet war. (Siehe, z.B., Zusammenfassung
und Diskussionsabschnitte von Hill und DeBoer). Dieser Befund stand
im direkten Gegensatz zur Situation in der menschlichen Immunologie.
Dieses Ergebnis weist auf die Schwierigkeiten jedes Ansatzes hin,
Daten zwischen Tieren von zwei verschiedenen Gattungen aufeinander
abzustimmen.
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Diese
Schwierigkeit wird weiterhin beispielhaft durch die Tatsache verdeutlicht,
dass Hunde gegenüber
anderen Antigenen allergisch sein können als Menschen. Allergien
gegenüber
Flöhen
zum Beispiel sind ein ernstes Problem für Hunde jedoch nicht für Menschen.
Darüber
hinaus zeigten Studien der Doktoren Esch und Greer der Greer Laboratories
(Lenior, NC) in Beispielen, in denen Hunde und Menschen anscheinend
gegenüber
den gleichen allergenen Extrakten allergisch sind, dass die spezifischen
Allergene in einem Allergenextrakt, die eine kanine Erkrankung erzeugen,
nicht notwendigerweise die gleichen Allergene sind, die Erkrankungen
beim Menschen erzeugen. Zum Beispiel ist bekannt, dass die immunodominanten
Bestandteile von Staubmilbenextrakten bei Hunden anders sind als
bei Menschen.
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Zusätzlich zu
den Schwierigkeiten beim Studium von allergischen Mechanismen und
Reaktionen über Gattungen
hinaus, werden Allergien in Hunden hauptsächlich in der Haut exprimiert,
während
Menschen allergische Symptome primär im Atmungssystem zeigen.
Zusätzlich
steht Eosinophilia in Korrelation zu Allergien beim Menschen, jedoch
nicht bei Hunden.
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Wenn
an eine Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung zum
Behandeln eines physiologischen Zustandes gedacht wird, sollte berücksichtigt
werden, das, wenn rekombinante oder chimäre Moleküle in vivo einem Tier verabreicht
werden, diese schnell aus dem Tier entfernt werden. Rekombinante IgG-Moleküle sind
verwendet worden, um die Halbwertszeit rekombinanter Moleküle zu erhöhen, wenn
die Rekombinanten einem Tier verabreicht werden. Z.B. Capon, D.,
Chamow, S., et al., "Designing
CD4 immunoadhesins",
Nature 337: 525 (1989); Byrn, R., Mordenti, C., et al., "Biological Properties
of a CD4 Immunoadhesion",
Nature 344: 667 (1990); Haak-Frendscho, M., Ridgway, J., et al., "Human IgE Receptor
Alpha-Chain IgG Chimera Blocks Passive Cutaneous Anaphylaxis Reaction
in vitro", Journal
of Immunology 151: 351–53 (1993);
U.S. Patent Nr. 5,116,964, das am 26. Mai 1992 für Capon, D. J., et al., unter
dem Titel "Hybrid
Immunoglobulins" erteilt
wurde.
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Es
wird allgemein anerkannt, dass beim Menschen IgG der Immunoglobulinisotyp
mit der längsten Halbwertszeit
im Serum ist. Bei Hunden ist der Isotyp mit der längsten Halbwertszeit
nicht bekannt. Obwohl die Sequenzen, von denen man glaubt, dass
sie einem Abschnitt auf dem Exon 1 und 3 von wenigstens zwei und möglicherweise
allen vier schweren Ketten der kaninen IgG-Immunoglobulinsequenzen
entsprechen, im U.S. Patent Nr. 5,593,861 von Maeda et al. beschrieben
worden sind, ist nicht bekannt, welche der Sequenzen dieser schweren
Ketten Teil der IgG-Struktur mit der längsten Halbwertszeit in Hunden
ist.
EP 0 957 111 offenbart spezifische
Bindungsproteine zum Behandeln kaniner Allergien, insbesondere offenbart
es einen Mäuseantikörper 15A.2,
der kanines IgE bindet. Der chimäre
Antikörper
zeigt keine weiteren vorteilhaften Wirkungen.
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WO
97/20859 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen, die Allergien
bei Hunden betreffen. Es werden monoklonale Antikörper offenbart,
z.B. D9, 14K2, 1B1 oder 11B11, die für das Binden an kanines IgE spezifisch
sind.
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IgE-Niveaus
sind bei menschlichen Patienten, die eine allergische Erkrankung
durchlaufen, erhöht und
man glaubt, dass IgE allergische Symptome vermittelt. Obwohl die
Niveaus von Serum-IgE nicht mit einer allergischen Erkrankung in
Hunden korrelieren, kann es nichtsdestotrotz wünschenswert sein, IgE-Niveaus
als Mechanismus zum Lindern allergischer Symptome zu verringern.
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Darüber hinaus
gibt es einen Bedarf für
Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln von kaninen Allergien,
die die Nachteile herkömmlicher
Zusammensetzungen und Verfahren vermeiden, und dennoch eine wirksame
Behandlung kaniner Allergien ermöglichen.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen der Verwendung
eines Antikörpers
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung kaniner Allergien
mit im Wesentlichen weniger Nebenwirkungen als die, die man von
Behandlungen mit Steroiden kennt.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen der
Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung
eines Arzneimittels zum Lindern von kaninen Allergiesymptomen, die
unabhängig
von der Art des Allergens wirksam sind, und Zusammensetzungen und
Verfahren, bei denen die Behandlung eher auf das Vorhandensein einer
allergischen Reaktion als einem spezifischen Allergen beruht.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen der
Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung
eines Arzneimittels zum Lindern kaniner Allergiesymptome durch das
Beeinflussen der IgE-Synthese.
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Diese
und andere Ziele werden dem Fachmann anhand der folgenden Offenbarung
und der angehängten
Ansprüche
deutlicher gemacht.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum
Behandeln von Allergien bei Hunden. Insbesondere stellt die Erfindung
Verfahren und Zusammensetzungen zum Verabreichen an Hunde bereit,
wobei die Zusammensetzungen die Immunoglobulin E Moleküle der Hunde
binden, so dass das Binden des freien seralen IgE's das Binden dieses
IgE's an die hoch
affinen IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen verhindert.
Die Zusammensetzungen und Verfahren, die bereitgestellt werden,
können
die Niveaus an freiem seralen IgE verringern oder das IgE beseitigen.
Niedrige freie serale IgE-Niveaus können die Synthese und Expression
des hoch affinen IgE-Rezeptors auf Basophilen und Mastzellen herabregulieren.
Das Ergebnis kann die Verringerung oder Eliminierung von freiem
und/oder des gesamten seralen IgE's und die Verringerung oder Eliminierung
der IgE-Reaktion gegenüber
dem Allergen auf Hautmastzellen sein. Mit "freiem Serum-IgE" ist das IgE gemeint, das an den hoch
affinen IgE-Rezeptor
binden kann und ungebundenes IgE im Serum ist.
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Wir
haben dargestellt, dass die fortwährende Eliminierung von detektierbarem
freien und/oder dem gesamten Serum-IgE für 7 Tage und einem möglicherweise
kürzeren
Zeitraum zu einer negativen Feedbackschleife führt, die nachfolgend die IgE-Synthese supprimiert.
Die fortwährende
Supprimierung der IgE-Synthese
wird zur Eliminierung einer Hautreaktion gegenüber dem Allergen führen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Spezifität
und Struktur eines chimären
Anti-IgE-Moleküls
der vorliegenden Erfindung das direkte Ansteuern der IgE+ B-Zelle
ermöglichen.
Diese Bindung kann entweder durch negative Stimulation der reifen
B-Zelle oder durch Zerstören
der B-Zelle durch Apoptose oder komplementvermittelte Lyse zu einer
Verringerung oder Eliminierung der IgE-Synthese führen.
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Die
vorliegende Erfindung kann daher ein IgE-Rezeptormolekül umfassen, das eine Chimäre umfasst und
das kanines IgE spezifisch bindet. Das Rezeptormolekül kann ein
Antikörpermolekül sein,
bevorzugt ein monoklonaler Antikörper
("mAb") und das mAb sollte
bevorzugt eine Affinität
zum Exon 3 des kaninen IgE's aufweisen.
Die Chimäre
kann Kanines und Mäuse-Immunoglobulin
umfassen. Die Chimäre
kann weiter kanine konstante schwere und leichte Domänen umfassen,
die mit variablen Bereichen schwerer und leichter Ketten von Mäusen fusioniert
sind. Rezeptoren und Antikörpermoleküle der vorliegenden
Erfindung können
auch Sequenzen der schweren Ketten von IgE umfassen.
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Die
Rezeptoren und Antikörpermoleküle der vorliegenden
Erfindung können
das Binden von IgE an einen zweiten IgE-Rezeptor verhindern und der zweite IgE-Rezeptor
kann auf einer oder mehreren Mastzellen oder Basophilen angeordnet
sein. Die Rezeptoren und Antikörpermoleküle der vorliegenden
Erfindung können Proteine,
Peptide oder andere organische Moleküle umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung kaniner Allergien bereit, die das
Verabreichen eines Rezeptors oder monoklonalen Antikörpers, der
eine Chimäre
der vorliegenden Erfindung umfasst, und spezifisch an kanines IgE
bindet, umfassen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können zu
einem Verringern des seralen IgE-Niveaus in behandelten Kaninen
führen,
oder zum Binden von IgE an B-Zellen
und die nachfolgende Eliminierung einer klonalen Population von
B-Zellen. Die Verfahren können
auch zum Binden von seralen IgE im Plasma oder zu einer Inhibierung
der IgE Produktion in behandelten Kaninen führen. Das Verringern des Serum-IgE-Niveaus nach
den vorliegenden Verfahren kann durch ein Zerstören der Blockierung der Interaktion
zwischen IgE und Rezeptoren für
IgE, die auf Mastzellen oder Basophilen angeordnet sein können, verursacht
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter pharmazeutische Formulierungen
bereit, die therapeutische Mengen der Rezeptoren der vorliegenden
Erfindung umfassen.
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BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 beschreibt
die Fähigkeit
von chimären
15A.2 die Bindung des IgE mit dem rekombinanten kaninen IgE-Rezeptor
zu inhibieren.
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2A-1 bis
2A-3 und
2B-1 bis
2B-2 zeigen
die Daten zum zeitlichen Verlauf für (freies und Gesamt-IgE) im
Kreislauf befindliche IgE-Niveaus in 2 Kontroll- und 3 Versuchshunden
nach der Verabreichung eines rekombinanten chimären Anti-IgE mAb, der c15A.2
genannt wird. Der mAb 15A.2 und seine Spezifität werden in
U.S. 6,734,287 , die am 30. März 1999
angemeldet worden ist, offenbart.
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3 stellt
die Daten für
den zeitlichen Verlauf der c15A.2 Aktivität in Hunden nach dem Verabreichen eines
chimären
Antikörpers
dar.
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4 stellt
die Daten zum zeitlichen Verlauf für im Kreislauf befindliches
IgE, das mit c15A.2 komplexiert ist, in drei Hunden nach 8 Verabreichungszyklen
mit chimären
Antikörpern
dar.
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5 stellt
die Daten für
den zeitlichen Verlauf der Aktivität des anti-chimären 15A.2
dar, die im Serum von Versuchhunden für den Verabreichungszyklus
der chimären
Antikörper
beobachtet wurden.
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6 stellt
Daten zur Durchflusszytometrie von einem Hund dar, doppelt gefärbt mit
PE-markiertem anti-Exon 4 kaninem IgG mAb 14K.2 und FITC-marktiertem
anti-kaninen IgE-Rezeptor
mAb 9L.4, vier Tage nach einem ersten Behandlungszyklus, und drei
Tagen nach einem zweiten Behandlungszyklus und fünf Tagen nach einem fünften Behandlungszyklus
der Verabreichung mit chimärem
Anti-15A.2 mAb.
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7A–7B zeigen
Daten zum zeitlichen Verlauf der Traubenkraut Hauttestreaktivität in Hunden, vor,
und 3 Tage und 7 Tage nach acht Verabreichungszyklen mit c15A.2
mAb.
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8 stellt
die Menge an c15A.2 dar, die erforderlich ist, um IgE im Serum von
drei Hunden, die mit 2002, 2003 und 2103 bezeichnet wurden, zu neutralisieren,
wie es durch ein Serumneutralisierungsassay bestimmt wurde.
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9 zeigt
Daten zum zeitlichen Verlauf für
im Kreislauf befindliche IgE-Niveaus in den Hunden 1001 und 1002
nach dem Verabreichen eines rekombinanten Rezeptor-IgG Antagonisten,
der mit cRcIg bezeichnet wurde.
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10A–E
zeigen die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 8) des rekombinanten IgE-Rezeptors
cRcIg mit der entsprechenden Translation (SEQ ID NO: 9).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Definitionen:
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Affinität: eine
Anziehungskraft oder Bindungsstärke
zwischen einem Liganden und seinem Rezeptor oder zwischen zwei Bindungsresten.
Die Affinität
hält das
Bindungspaar im Gleichgewicht gebunden.
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Aminosäuren: Organische
Moleküle,
die eine Aminogruppe enthalten, die in linearen Arrays kombiniert werden
können,
um Polypeptide, Peptide oder Proteine zu bilden. Die zwanzig üblichen
Aminosäuren
sind Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin,
Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin,
Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Der Fachmann
wird feststellen, dass in Ausführungsformen
der Erfindung mit konservativen Varianten sowohl alle üblichen
Aminosäuren
als auch solche, die nicht aufgelistet worden sind, in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
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Kaniner
IgE-Rezeptor: Ein hierin definierter rekombinanter oder chimärer Rezeptor,
der eine Affinität für kanines
IgE zeigt oder auf andere Art dazu führt das IgE aus dem kaninen
Serum in vivo oder in vitro entfernt wird.
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cDNA
Klon: Eine Duplex-DNA-Sequenz, die eine RNA darstellt, die in einem
Klonierungsvektor getragen wird.
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Chimäres mAb:
Ein Immunoglobulinmolekül
mit einer Hybridaminosäuresequenz,
die sich aus der Kombination von Aminosäuren aus wenigstens zwei verschiedenen
kaninen Ig-Quellen
ergab. Im Allgemeinen findet man die Aminosäuresequenzen normalerweise
in der Natur nicht zusammen. "mRb" zeigt einen monoklonalen
Antikörper
an.
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Klonierungsvektor:
Ein Plasmid, Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die sich in
einer Wirtszelle replizieren kann und die exogen zugegebene DNA-Sequenz
zum Zwecke der Amplifikation oder Expression der zugegebenen DNA-Sequenz
tragen kann.
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Konservative
Variante: Konservative Varianten von Nukleotidsequenzen schließen sowohl
Nukleotidsubstitutionen ein, die zu keiner Veränderung der Aminosequenz führen, als
auch Nukleotidsubstitutionen, die zu konservativen Aminosäuresubstitutionen
führen
oder Aminosäuresubstitutionen,
die den Charakter des Polypeptids, das sich aus diesen Nukleotiden
ergibt, nicht wesentlich beeinflussen. Zum Beispiel wird der Polypeptidcharakter
nicht wesentlich beeinflusst, wenn die Substitutionen nicht die
spezifische Bindung des Peptids an den kaninen IgE-Rezeptor oder
an andere kanine IgE-Liganden ausschließt.
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Konservative
Varianten von Aminosäuresequenzen
schließen
Aminosäuresubstitutionen
oder Deletionen ein, die den Charakter des abgeänderten Polypeptids relativ
zum Ausgangspeptid nicht wesentlich beeinflussen. Zum Beispiel wird
der Polypeptidcharakter nicht wesentlich beeinflusst, wenn die Substitutionen oder
Deletionen die spezifische Bindung des abgeänderten Peptids an einen spezifischen
Bindungspartner des Ausgangspeptids nicht wesentlich beeinflussen.
Von dieser Definition eingeschlossen werden auch glykosylierte und
andere Varianten und Derivate, die dem Fachmann bekannt sind und
die als in dem Schutzumfang dieser Erfindung fallend erachtet werden.
Von dieser Definition eingeschlossen werden auch Aminosäureinsertionen,
-substitutionen, -deletionen und -abänderungen, die den Polypeptidcharakter
relativ zum Ausgangspeptid im Wesentlichen nicht beeinflussen.
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Expressionskontrollsequenz:
Eine DNA-Sequenz von Nukleotiden, die die Expression von Strukturgenen
kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen operativ verknüpft sind.
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Exon:
Eine benachbarte DNA-Region, die für einen Abschnitt eines Polypeptids
kodiert. Die Bezugnahme auf irgendein Exon, z.B. "DNA-Sequenz des Exons
6" bezieht sich
auf das ganze Exon oder irgendeinen Abschnitt davon.
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Freies
IgE oder Serum-IgE: Im Kreislauf eines Patienten befindliches IgE,
das nicht mit einem nativen oder verabreichten Rezeptor, der eine
Affinität
für IgE
oder andere IgE-Moleküle
aufweist, komplexiert oder gebunden ist.
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Genom:
Die gesamte DNA einer Substanz. Es schließt neben anderen Dingen die
Strukturgene ein, die für
die Polypeptide der Substanz als auch den Operator, Promoter oder
die ribosomalen Bindungs- und Wechselwirkungssequenzen, wie zum
Beispiel die Shine-Dalgarno-Sequenzen, kodieren.
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Spezifische
Bindung: Binden einer Substanz an eine andere mit größerer Bindungsaffinität als die
Hintergrundbindung. Zwei Substanzen, die eine spezifische Bindung
ausüben,
werden als spezifische Bindungspartner oder als ein spezifisches
Bindungspaar bezeichnet. Ein Antikörper und sein Antigen sind
ein Beispiel für
ein spezifisches Bindungspaar.
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Strukturgen:
Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Matrize oder messenger-RNA ("mRNA") für eine Sequenz
von Aminosäuren
kodiert, die für
ein spezifisches Polypeptid charakteristisch sind.
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Therapeutische
Menge: Eine "therapeutische
Menge" ist die Menge
eines mAb, die Serum-IgE-Niveaus verringert, oder die IgE Herstellung
oder Aktivität
in dem behandelten Tier supprimiert und die Wirkung hat Symptome
einer Erkrankung oder eines physiologischen Zustandes zu lindern
oder ihnen vorzubeugen.
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Gesamt-IgE:
Mit "Gesamt-IgE" ist das gesamte
Serum-IgE gemeint, ob durch ein anderes Molekül gebunden oder nicht.
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Wie
hierin offenbart wurde ein neuer chimärer kaniner Anti-IgE mAb erzeugt
und an mit Traubenkraut ("Ragweed") sensibilisierte
Hunde verabreicht. Dieses chimäre
Molekül,
das als c15A.2 bezeichnet wird, besteht aus kaninen konstanten schweren
und leichten Domänen,
das mit schweren und leichten variablen Bereichen aus Mäusen fusioniert
wurde. In allen Fällen
führte
das Verabreichen zu einer fortwährenden
Verringerung der freien IgE-Niveaus im Kreislauf unter das detektierbare
Niveau. Zusätzlich
wurde das Gesamt-IgE, einschließlich
dem, das mit chimären
15A.2 komplexiert war und sich immer noch im Kreislauf befand und
sofort nach der Verabreichung von c15A.2 detektierbar war, über die
Zeit verringert. Nach 28 Tagen der Verabreichung war freies c15A.2
im Serum detektierbar, jedoch waren sowohl freies als auch das gesamte
IgE aus dem Serum nicht detektierbar. Die Verwendung eines humanisierten
anti-IgE monoklonalen Antikörpers
als therapeutisches Agens für
humane Allergien war im U.S. Patent Nr. 5,593,861 von Maeda et al.
offenbart. Es wird geglaubt, dass das Entfernen von IgE durch Verabreichen
von rekombinantem Anti-IgE mAb in Hunden bisher nicht gezeigt worden
ist. Der Fachmann wird feststellen, dass die vorliegende Erfindung
und die Diskussion hierin, die den mAb betreffen, gleichermaßen auf
Rezeptoren anwendbar ist, die Teile von Antikörpermolekülen umfassen. Daher ist mit
der hierin gegebenen Diskussion beabsichtigt auf Zusammensetzungen
von Rezeptoren und nicht nur auf Antikörper Bezug zu nehmen.
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Die
kaninen anti-IgE mAb Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
können
rekombinante oder chimäre
Strukturen von Kaninen und Mäuseimmunoglobulinen
sein. Die Moleküle
können
Chimären
umfassen, die aus konstanten schweren und leichten Domänen des
kaninen IgE's und
schweren und leichten variablen Bereichsdomänen von murinem Immunoglobulin,
die eine Affinität
für das
Exon 3 des kaninen IgE's aufweisen,
erzeugt wurden.
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Die
hierin verwendeten Begriffe anti-kaniner IgE mAb, chimärer mAb,
rekombinanter mAb und Rezeptor umfassen irgendeine und alle konservative
Varianten davon und werden als im Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung liegend erachtet.
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Es
ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass das Verabreichen
des chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder Rezeptor's
im Verfahren zum Behandeln von kaninen Allergien nützlich ist.
Es ist auch ein Merkmal der Erfindung, dass das Verabreichen von
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die Serum IgE Niveaus
in Kaninen verringert.
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Die
chimären
kaninen anti-IgE mAb's
und Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können die Wechselwirkung zwischen
IgE und seinen Rezeptoren zerstören
oder blockieren. Im Allgemeinen ist die Interferenz zwischen IgE
und seinen Rezeptoren unabhängig
vom Typ des Allergens, das allergische Symptome verursacht oder
wahrscheinlich verursacht.
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In
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
chimäre
kanine anti-IgE mAb's
und Rezeptoren der vorliegenden Erfindung durch Blockieren des Bindung
von IgE an seine Rezeptoren auf Mastzellen oder Basophilen, durch
Blockieren der Bindungsstelle an IgE-Molekülen oder anderweitig durch
stören
der Bindung von IgE mit seinen Rezeptoren wirken. Die chimären kaninen
anti-IgE mAb's und
Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können auch durch das Binden
löslichen
IgE's im Plasma
wirken, wobei der Komplex dann aus dem Kreislauf durch die körpereigenen
normalen Mechanismen entfernt wird. In anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
die chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder Rezeptoren durch Binden von IgE an B-Zellen und Eliminieren
von klonalen Populationen von IgE+ B-Zellen wirken. Die chimären kaninen
anti-IgE mAb's oder
Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können auch durch Inhibieren
der IgE-Produktion
wirken. Obwohl nicht gewünscht
wird durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird geglaubt,
dass der mAb oder der Rezeptor an B-Zellen binden kann und ein Vernetzungsereignis
induzieren kann, das die Apoptose von Zellen induzieren kann oder
zu inhibitorischen Signalen führen
kann, die die IgE-Synthese herabregulieren und eliminieren. Zusätzlich kann
das Binden von IgE aus dem Serum, das freies IgE ist, es einem anderen
regulatorischen Molekül,
das normalerweise IgE aus dem Serum im Exon 3 Bereich bindet, ermöglichen
IgE auf der B-Zelle zu binden und nachfolgend durch negative Signale,
die von einer solchen Bindung verursacht werden oder damit in Zusammenhang
stehen, die IgE-Synthese
zu bewirken.
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In
einer anderen Ausführungsform
können
die chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder Rezeptoren der vorliegenden Erfindung mit schweren Kettensequenzen
des IgG's formuliert
werden oder diese umfassen, um die Halbwertszeit der Moleküle in vivo
zu erhöhen
oder ihre Aktivität
zu steigern.
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Das
Verfahren zum Behandeln von Hunden, die unter allergischen Symptomen
leiden oder das Verhindern von allergischen Symptomen bei Hunden
kann im Allgemeinen das Verabreichen einer therapeutischen Menge
eines chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder Rezeptor's
an die behandelten Tiere umfassen. Präzise Dosierungen von chimärem kaninen
anti-IgE mAb oder
Rezeptor und Verabreichungsparametern werden auf eine Art und Weise
etabliert, die mit der übereinstimmt,
die dem Fachmann bekannt sind. Dies kann das Berücksichtigen eines oder mehrerer
der folgenden Faktoren einschließen, obwohl diese Liste nur
als Beispiel gedacht ist und andere Parameter, die dem Fachmann
bekannt sind oder diesem bekannt werden könnten, ausschließen sollen:
Die Gegenwart oder Schwere der allergischen Symptome, die Hundeart,
der Zustand des individuellen Patienten, die Verabreichungsart,
das Verfahren und die Länge
der Verabreichung und andere Faktoren, die dem Fachmann bekannt
sind oder diesen in der Zukunft bekannt werden.
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Vergleichsweise
kann die Dosierung des chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder Rezeptors, der verabreicht wird, von der Betrachtung der Eigenschaften
der verwendeten schweren Kettenisotope des IgE und anderer Faktoren
abhängen.
Zum Beispiel können
diese Betrachtungen die Bindungsaktivität und in vivo Plasmahalbwertszeit,
die Konzentration des chimären
kaninen anti-IgE mAb's
oder des Rezeptors in der Formulierung, den Verabreichungsweg, die
Art und Rate der Dosierung, und die klinische Toleranz des involvierten
Patienten einschließen.
Diese Liste soll keine begrenzende Funktion haben und der Fachmann
wird erkennen, dass andere Faktoren ebenfalls zur Berücksichtigung
relevant und vorteilhaft sein können.
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Die
therapeutische Menge des derzeitigen chimären kaninen anti-IgE mAb's oder Rezeptors
kann in Dosierungen und über
einen Zeitraum verabreicht werden, die zum Lindern oder Supprimieren
allergischer Symptome und/oder zum Verringern der Serum-IgE Niveaus
und/oder Supprimieren der IgE Herstellung oder Aktivität ausreichend
ist.
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Im
Allgemeinen kann die Formulierung der vorliegenden Erfindung andere
Bestandteile in Mengen enthalten, die nicht mit der Herstellung
von stabilen und wirksamen Formen des kaninen anti-IgE mAb's oder Rezeptors
interferieren. Alle zusätzlichen
Bestandteile, die mit dem chimären
kaninen anti-IgE
mAb oder Rezeptor verabreicht werden, können in Mengen vorhanden sein,
die für
die wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.
Pharmazeutische Hilfsstoffe, die dem Fachmann bekannt sind, können einen
Teil der entsprechenden Zusammensetzungen bilden. Zum Beispiel können solche
Hilfsstoffe Salz und andere parenterale Lösungen, Puffer und Stabilisatoren
als auch eines der vielen verschiedenen geeigneten Bulkmittel, Pufferagenzien,
Antioxydantien, Verschnittmittel und andere Bestandteile, die dem
Fachmann für
das mit Aufnehmen als vorteilhaft bekannt sind, einschließen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann der kanine Anti-IgE mAb oder Rezeptor als eine Lösung von
Proteinen in sterilem PBS formuliert werden.
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Der
chimäre
kanine anti-IgE mAb oder Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann
auf eine Art verabreicht werden, die für das Zerstören, Blockieren oder sonstige
Interferieren mit der Bindung zwischen IgE und seinem Rezeptor oder
auf eine Art, die die Bindung zwischen dem verabreichten mAb oder
Rezeptor und IgE erhöht,
wirksam ist. Diese Verfahren werden für den Fachmann offensichtlich
sein. In bevorzugten Ausführungsformen
kann der kanine anti-IgE mAb oder Rezeptor subkutan, intramuskulär oder intravenös verabreicht werden.
Alternativ dazu kann der mAb oder Rezeptor über Suspensionen, Tabletten,
Kapseln oder Zäpfchen für die orale,
rektale oder vaginale Verabreichung formuliert werden.
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Die
folgenden Beispiele illustrieren weiter das Klonieren, Exprimieren
und Reinigen des 15A.2 mAbs und sind nicht zur Begrenzung gedacht.
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Beispiel I: Klonieren des variablen Bereich
des 15A.2 von der Maus
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Der
variable Bereich des 15A.2 von der Maus wurde durch RT-PCR von 15A.2
Hybridomazellen kloniert. Ein kommerziell erhältliches Kit (Novagen, Madison,
WI, Ig-Prime Kit), das aus einem Satz von degenerierten PCR-Primern
für die
reverse Transkription und Amplifikation von IgVh und IgV1 mRNA's von Mäusehybridomazelllinien
besteht, wurde als Quelle für
Primer verwendet, um die 15A.2 mRNA's, die für die leichten und schweren
variablen Domänen
kodieren, zu klonieren. Die 5' und 3'-Primer für die IgVh-Domäne waren MuIgVh5'-B bzw. MuIgMvh3'-1. MuIgVh5'-B ist eine Mischung aus zwei Primern
in einem Röhrchen
(bereitgestellt von Novagen), mit den Sequenzen
GGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT
(SEQ. ID NO: 1) und
ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT
(SEQ. ID NO: 2)
MuIgMvh3'-1
hat die Sequenz
CCCAAGCTTACGAGGGGGAAGACATTTGGGAA (SEQ ID NO:
3)
Die 5' und
3'-Primer der IgV1-Domäne waren
MuIgλV15'-A bzw. MuIgλV13'-1. Die mRNA, die
für die
15A.2 IgVh und IgV1 variablen Domänen kodieren, wurde revers
transkribiert, amplifiziert und kloniert. MuIg(lambda)V15'-A hat die Sequenz
GGGAATTCATGGCCTGGAYTYCWCTYWTMYTCT
(SEQ ID NO: 4)
MuIg(lambda)V13'-1 hat die Sequenz
CCCAAGCTTAGCTCYTCWGWGGAIGGYGGRAA
(SEQ ID NO: 5)
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Die
PCR-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt:
-
-
Geeignete
Klone der variablen Domänen
von 15A.2 IgVh und IgV1 wurden unter Verwendung von Restriktionsendonukleaseanalysen
und DNA-Sequenzanalysen identifiziert. Der Vergleich dieser DNA-Sequenzen
mit bekannten Mäuse
IgVh- und IgV1-Genen bestätigte,
dass sie für
die variablen Domänen
eines monoklonalen Antikörpers
von der Maus kodieren.
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Beispiel II: Klonieren von konstanten
Bereich des kaninen IgG
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Die
leichten und schweren konstanten Bereiche von kaninen Immunoglobulinen
wurden durch RT-PCR aus Hundelymphozytenzellen kloniert. PCR-Primer,
die auf der Sequenz der konstanten Domäne von kaninem IgG aufbauten,
wurden für
die reverse Transkription und PCR-Amplifikation von mRNA, die für die konstanten
Domänen
von Immunoglobulinen (offenbart im U.S. Patent Nr. 5,593,861 von
Maeda et al.) kodieren, verwendet. Die PCR-Reaktion war die gleiche
wie weiter oben aufgeführt.
Die PCR-Produkte wurden kloniert und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen.
Geeignete Klone der konstanten Domänen von Immunoglobulinen wurden
unter Verwendung von Restriktionsendonukleaseanalysen und DNA-Sequenzanalysen identifiziert.
Der Vergleich dieser DNA-Sequenzen
mit bekannten Immunoglobulingenen bestätigte, dass sie für die konstanten
Domänen
eines kaninen Immunoglobulins kodieren.
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Beispiel III: Klonieren von Volllängen Maus/Kanin
chimäre
15A.2
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Das
herkömmliche
Verfahren zum Herstellen von chimären monoklonalen Antikörpern wurde
verwendet, um Volllängen
Maus/Kanin chimäre
15A.2 monoklonale Antikörpergene
herzustellen. Die Sequenz, die für den
variablen Bereich des 15A.2 der Maus kodiert, und die kanine Sequenz,
die für
den konstanten Bereich kodiert, wurden mittels PCR miteinander verknüpft und
kloniert. Nach dem Verifizieren der chimären Gene durch DNA-Sequenzanalysen
wurde ein geeignetes Gen einer leichten Kette vom chimären Maus/Kanin
15A.2 und ein Gen einer schweren Kette vom chimären Maus/Kanin 15A.2 für die Expression
und Proteinproduktion des chimären
Proteins ausgewählt.
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Identifikation funktionaler Klone
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Funktionale
Klone der schweren und leichten Kette von chimärem 15A.2 wurden unter Verwendung eines
COS- zelltransienten
Expressionssystems identifiziert. Die Volllänge der schweren Kette und
die Volllänge
der leichten Kette wurden stromabwärts in korrekter Orientierung
des CMV-Promotors
auf den pcDNA3.1 Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die
Immunoglobulinführungssignale
auf den Proteinen würden
bei den Proteinen dazu führen,
dass diese aus den Zellen in den Kulturüberstand sekretiert werden.
Die Kotransfektion beider DNA's
in COS-Zellen ermöglicht
die transiente Genexpression, Proteinproduktion und Zusammensetzung
funktionaler chimärer
Antikörper
in der Zelle. IgE bindendes ELISA und ein anti-kanines IgG ELISA
wurden verwendet, um die funktionale Antikörperaktivität in Zellkulturüberständen zu
detektieren. Die Klone, die die beste Bindungsaktivität ergaben,
wurden verwendet, um Vektoren für
die chimäre
monoklonale Antikörperproduktion
in einem Bakulovirus-Expressionssystem zu konstruieren. Die Sequenzen
sowohl für
die schwere Kette als auch für
die leichte Kette werden wie folgt dargestellt:
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Chimäre DNA-Sequenz
der schweren Kette von 15A.2 (SEQ ID NO: 6)
-
-
Chimäre DNA-Sequenz
der leichten Kette von 15A.2 (SEQ ID NO: 7)
-
-
Beispiel IV: Expression von chimärem 15A.2
in Insektenzellen
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Ein
Bakulovirusexpressionssystem wurde für die Produktion des chimären Maus/Kanin
15A.2 monoklonalen Antikörpers
im größeren Maßstab verwendet.
Die Bakulovirusexpression ist eine übliche Technik und die Verfahren
sind dem Fachmann gut bekannt. Die DNA der schweren Kette von 15A.2
wurde in den PharMingen's
(San Diego, CA) pAc LIC Bakulovirusübertragungsvektor für die Rekombination
in Bakuloviren kloniert. Die DNA der leichten Kette des chimären 15A.2
wurde in den PharMingen's
pAcHis NT-A
TM Bakulovirusübertragungsvektor
für die
Rekombination in Bakuloviren kloniert. Rekombination und Amplifikation
beider Viruskonstrukte wurde in Insekten sf-9-Zellen amplifiziert.
Das chimäre
15A.2 wurde unter Verwendung von Insekten High Five-Zellen exprimiert.
Die Infektionsbedingungen waren die folgenden:
| Hi
Five-Zellendichte für
die Infektion: | 1,5 × 106/ml |
| MOI
für die
Virusinfektion mit der schweren Kette: | 10 |
| MOI
für die
Virusinfektion mit der leichten Kette: | 3 |
| Zeit
für die
Proteinexpression: | 72
Stunden |
15A.2 wurde exprimiert und in das Zellkulturmedium
sekretiert.
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Reinigung des chimären 15A.2 Proteins
-
Das
allgemeine Reinigungsschema war das Folgende:
-
1. Zellklärung:
-
Der
Zellkulturüberstand,
der das 15A.2 Protein enthielt, wurde 72 Stunden nach der Infektion
gewonnen. Der Überstand
wurde durch Millipore's
(Bedford, MA) MILLIGUARDTM – Kassettenfiltrationssystem
für die Zellklärung gefiltert.
Andere Filtrationssysteme, die eine Porengröße von 0,2 μm aufweisen, die hoch kapazitive
Filter mit niedriger Proteinbindung sind und in der Lage sind hohen
Drücken
zu widerstehen, sind ebenfalls geeignet. Der geklärte Überstand
wurde dann für
die Säulenchromatographie
auf konzentriert.
-
2. Protein A Säulenchromatographie:
-
Die
konzentrierte Probe wurde auf eine Protein A Säule geladen und mit PBS-Puffer äquilibriert.
Das 15A.2 Protein wurde mittels eines pH-Gradienten eluiert, der
durch Mischen von 4% Glycerol, PBS, pH 7,2 und 4% Glycerol, 25 mM
Natriumcitratpuffer, pH 2,5 erzeugt wurde. Das Protein wurde bei
etwa pH 4 eluiert.
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3. Ionenaustausch Säulenchromatographie:
-
Das
Protein A gereinigte 15A.2 wurde auf die Q SepharoseTM (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) Säule geladen,
und mit 4% Glycerol, PBS, pH 7,2 äquilibriert, um kontaminierte
Proteine, DNA, RNA, Viren etc. zu entfernen. ein vergleichbares
Ionenaustauschharz zum Entfernen von DNA, RNA, Endotoxinen und anderen negativ
geladenen Materialien von gereinigten Proteinen wurden ebenfalls
verwendet. Der Durchfluss wurde gesammelt.
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4. Sterilisierung:
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Das
Q Durchfluss 15A.2 wurde auf konzentriert und durch Filtern durch
eine 0,2 μm
Filtereinheit sterilisiert. Die letztendliche Pufferzusammensetzung
ist die folgende:
0,7 × PBS
6,5
mM Natriumcitrat
4% Glycerol
pH: ~7, 0
-
Das
Protein hat mindestens eine Reinheit von 95%, die durch SDS-PAGE
Proteingel angegeben wurde, und wurde bei –80°C für die weitere Verwendung gelagert.
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Beispiel V: Rekombinanter kaniner Anti-IgE
mAb (c15A.2): Wirkungen auf die IgE Aktivität in vitro und in vivo
-
Das
gemäß Beispiel
V erhaltene gereinigte c15A.2 wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des
kaninen IgE an den kaninen IgE Rezeptor in vitro (1)
zu verhindern. Die zum Neutralisieren von IgE im Serum von drei
Hunden, die mit 2002, 2003 und 2103 bezeichnet wurden, erforderliche
Menge von c15A.2 wurde durch das Serumneutralisierungsassay bestimmt
und wird in 8 dargestellt. Der zeitliche
Verlauf und die Ereignisse des 40-tätigen experimentellen Zeitraums
werden in den 2a und 2b zusammengefasst.
Die Hunde wurden bei der Geburt am Lovelace Respiratory Research
Institute (Albuquerque, MNM) gegenüber Traubenkraut sensibilisiert
und in Studien zum Testen der Wirksamkeit, die durch die Fähigkeit
eines Hundes eine subkutane Hautreaktion nach der Verabreichung
eines Allergens zu entwickeln, abgeschätzt wird, verwendet.
-
Das
c15A.2 wurde den Hunden 2002, 2003 und 2103 alle fünf Tage
für acht
aufeinander folgende Behandlungen verabreicht. Die Menge des verabreichten
c15A.2 in der ersten Behandlung entsprach 10-fachen Konzentration
der messbaren Konzentration an freiem Serum-IgE drei Tagen vor dem
Beginn der Verabreichung. Die Dosen 1 und 2 erhielten die 10-fache
freie Serum-IgE Konzentration. Alle nachfolgenden Dosierungen wurden
auf 5-fache freie Serum IgE-Konzentration eingestellt. Der Testgegenstand
wurde in sterilem PBS bei der Konzentration, die für das Zuführen des
10-fachen oder 5-fachen der Serum IgE-Konzentration durch intravenöse Infusion über eine
30-minütige Periode
erforderlich ist, verdünnt.
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2A-1 bis 2A-3 folgt
dem Niveau des freien und gesamten Serum-IgE's in jedem Hund gegen die Zeit, basierend
auf der Dosierung des verabreichten c15A.2 mAb. Zusätzlich wurde
c15A.2 dann alle fünf Tage
für insgesamt
40 aufeinander folgende Tage verabreicht. Serum-IgE-Niveaus werden
durch Standard ELISA-Techniken untersucht, die dem Fachmann gut
bekannt sind. IgE-Niveaus werden in der ELISA-Technik bei etwa unter
1 ng/ml im Allgemeinen als undetektierbar erachtet.
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2A-1 bis 2A-3 zeigen
auch, dass freies IgE in den Versuchshunden innerhalb von 60 Minuten auf
undetektierbare Niveaus abfiel und sich während der gesamten 40-tägigen Behandlungsperiode
nicht wieder erholte. Die Niveaus an freiem Serum-IgE in den Versuchshunden
1101 und 1102, die nur Salzlösung
erhielten, veränderten
sich nicht signifikant während
dieses Zeitraums (2B-1 bis 2B-2).
Das in diesem Experiment verwendete Assay stammt aus einem ELISA
Festphaseneinfangreatkion mit einem 15A.2 Antikörper von der Maus und Detektion
mit einem anderen HRPO-konjugierten mAb, 14K.2, der das Exon 4 des
kaninen IgE erkennt. Das Assay detektiert das gesamte Serum IgE,
das nicht an c15A.2 gebunden ist.
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Das
durch c15A.2 gebundene Gesamt-IgE fiel in den Versuchshunden langsamer
ab als das freie IgE, wahrscheinlich weil es wieder in den Kreislauf
gelangte und letztendlich aus dem Kreislauf entfernt wurde. Das hier
verwendete Assay bestand aus einer ELISA-Einfangreaktion mit dem
mAb 14K.2 und der Detektion mit einem anderen anti-kaninen IgE mAb,
der durch c15A.2 nicht an der Bindung gehindert wird. In den Hunden 2003
und 2103 blieb das freie und das gesamte Serum-IgE in Assays für mehr als
60 Tage nach der letzten Verabreichungsdosis von rekombinantem Antikörper undetektierbar.
Im Hund 2002 war 30 Tage nach Beendigung der Verabreichung des chimären Antikörpers freies
Serum-IgE mit etwa 20 ng/ml detektierbar und verblieb auf diesem
Niveau für
die restlichen 30 Tage der Beobachtung.
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Diese
Daten zeigen die Wirkungen eines rekombinanten Antikörpers auf
die vorliegende Erfindung: (1) Entfernen von im Kreislauf befindlichem
IgE au dem Serum; (2) Bereitstellen eines Verfahrens zum Beeinflussen
des Prozesses durch das IgE wieder aufgefüllt wird. Diese Ergebnisse
sind überraschend,
wenn man bedenkt, dass bei Serum-IgE bekannt ist, dass es eine kurze
Halbwertszeit hat, vermutlich in einer Größenordnung von etwa 2 Tagen,
und dass rekombinante oder chimäre
Moleküle
ebenfalls relativ kurze Halbwertszeiten in vivo zeigen. Bei unbehandelten
Tieren nimmt man an, dass sich im Kreislauf befindliches Serum IgE
alle 4 bis 5 Tage erneuert, wohingegen nach der Verabreichung eines
kaninen anti-IgE mAb's
15A.2 der vorliegenden Erfindung 18 Tage nach der Verabreichung
des chimären
Antikörpers
die Serum-IgE Niveaus unterhalb der detektierbaren Mengen supprimiert
blieben.
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Beispiel VI: Entfernen des c15A.2
-
Die
Anwesenheit von freiem chimären
15A.2 im Serum der Hunde 2002, 2003 und 2103 wurde mittels eines
ELISA unter Verwendung einer rekombinanten kaninen IgE Festphase
und der Detektion mit einem polyklonalen anti-kaninen IgE Konjugat
von der Ziege bestimmt. 3 zeigt, dass die Niveaus von
c15A.2 im Serum mit dem Beginn und dem Ende jedes 5-tägigen Verabreichungszeitraums
fortwährend
ansteigen und fallen. Freies c15A.2 ist im Serum von Versuchsunden
24 Tage nach der Infusion immer noch detektierbar (X μg/ml).
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Die
Immunkomplexe von c15A.2 und kaninem IgE wurden durch einen ELISA
auf einer 14K.2 Festphase gemessen und durch ein polyklonales anti-Hunde
IgGfc-Konjugat detektiert. Diese in 4 zusammengefassten
Daten zeigen, dass komplexiertes IgE in hoher Konzentration zu einem
frühen
Zeitpunkt im Behandlungszyklus detektiert wurde, dass jedoch das
Niveau der Komplexe fortwährend
abfällt.
Am 28 Tag wurden in den Hunden, die c15A.2 erhielten, keine Immunkomplexe
gemessen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Komplexe aus dem Pool
des Kreislaufsystems für
Serumimmunoglobulin entfernt wurden, und dass die Synthese von neuen
IgE in diesem Zeitrahmen verringert oder eliminiert wurde. Es wurden
keine Veränderungen bei
den Versuchshunden beobachtet. Es wurde keine Immunantwort auf den
chimären
monoklonalen Antikörper
c15A.2 in den Hunden 2003 und 2103 beobachtet. Nach 28 Tagen der
primären
Infusion wurde eine Immunantwort auf den Testgegenstand im Hund
2002 beobachtet. Die Daten in 5 zeigen,
dass diese Reaktion zunimmt, wenn mehr chimäres 15A.2 verabreicht wird
und kann eine Rolle bei der kürzeren
Serumhalbwertszeit des c15A.2 im Hund 2002 (3) spielen.
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Beispiel VII: Wirkung auf das Expressionsniveau
des hoch affinen IgE-Rezeptors auf Basophile nach der Verabreichung
von kaninem Anti-IgE mAb 15A.2 (c15A.2)
-
Am
fünften
Tag, 14. Tag und 29. Tag nach dem Beginn der c15A.2 Verabreichung
wurden 10 ml Gesamtblut entnommen. Halb gereinigte Populationen
peripherer Blutleukozyten wurden durch Dichtegradientenzentrifugation
hergestellt und mit Reagenzien für
die zweidimensionale Durchflusszytometrie-analyse angefärbt. Die
in diesen Experimenten verwendeten Reagenzien waren der FITC-konjugierte,
anti-kanine, hoch affine IgE-Rezeptor
mAb 9L.4 und PE-konjugierter 14K.2. Die Zellendoppelfärbung für diese
Antikörper
und die Residenten im Quadranten vier (oberer rechter Quadrant)
des Dotblot-Diagramms
in 6 sind Basophile.
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Die
Daten in 6 sind für den Hund 2002 und sind repräsentativ.
Die Anzahl von doppelgefärbten Zellen
im Quadranten verringert sich über
den Zeitraum der Verabreichung von c15A.2. Die Daten legen nahe, dass
das Expressionsniveau der hoch affinen IgE-Rezeptoren in Basophilen
nach 29 Tagen der Verabreichung von c15A.2 beim Versuchshund 2002
um über
90% verringert wird. Das Eliminieren von Serum-IgE über die Zeit
führt zu
einer Verringerung der Expression der Rezeptoren für IgE auf
Basophilen und könnte
eine vergleichbare Reaktion in Hautmastzellen widerspiegeln. Eine
verringerte Mastzellenexpression für hoch affine IgE-Rezeptoren
wird zu einer Verringerung oder Eliminierung der Hauttestreaktivität gegenüber Allergen
führen.
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Beispiel VIII: Wirkung der Traubenkraut
Hauttestreaktivität
bei Verabreichung von kaninem Anti-IgE mAb 15A.2
-
Mit
Traubenkraut sensibilisierten Hunden wurde eine 0,5% Lösung von
Evans Blue Dye in PBS bei 0,2 ml/kg infusiert und dann 10 Minuten
später
mit dem Allergen konfrontiert. Fünf
und 10-fache Verdünnungsreihen
des Traubenkraut Allergens in PBS, das bei 1000 PMU/ml beginnt,
wurden hergestellt und 100 μl
davon subkutan in den rasierten Abschnitt des Torsos injiziert.
Die Salzlösung
(PBS) diente als Negativkontrolle und Histamin (100 μl einer 0,275 μg/ml Verdünnung von
Histamin in PBS) diente als Positivkontrolle. Die Reaktivität wurde
10 Minuten später
im Vergleich zur Histaminkontrolle als Anschwellen und blaue Farbstoffdiffusion
in der Haut gemessen. Eine Bewertung von Zwei wurde für eine Allergenverdünnung vergeben,
bei der die Reaktion in Größe und Farbe
zur Histaminreaktion äquivalent
war. Eine Bewertung von Eins wurde vergeben für eine Reaktion, die der Hälfte der
Reaktion bei der Histaminkontrolle entsprach und eine Bewertung
von Null wurde vergeben, wenn die Reaktion äquivalent zur Negativkontrolle
mit der Salzlösung
war. Es wurde die Haut von drei Versuchs-, 2002, 2003 und 2103 und
zwei Kontroll-, 1101 und 1102, Hunden getestet, wie weiter oben beschrieben,
eine Woche vor der Verabreichung von c15A.2 und dann 3 Tage und
7 Tage nach der letzten Verabreichung. 7A–B zeigen,
dass in den Kontrollhunden die Hautreaktion gegenüber dem
Traubenkrautallergen über
den Verlauf der gesamten Studie vergleichbar war. Beim Kontrollhund
1102 verstärkte
sich die Traubenkraut Hautreaktion im Verlaufe der Zeit. Bei den
Versuchshunden 2003 und 2103 war die Traubenkraut Sensibilisierung
nach der Verabreichung von c15A.2 über 40 Tage für wenigstens
7 Tage vollständig
verschwunden. Nur der Hund 2002 zeigte irgendeine Traubenkraut Sensibilisierung
bei der höchsten
Traubenkraut Konzentration am dritten Tag nach der Infusion und
für diese
Reaktion wurde aufgrund der Verteilung des Farbstoffs eine Bewertung
von 1 vergeben. Es hatte nicht die charakteristische Schwellung,
die bei einer Einswertung für
die Kontrollhunde beobachtet und aufgenommen wurde. Am 7 Tag nach
der Infusion wurde für
den Hund 2002 eine Reaktionswertung von 1 für die Spots mit 1000 PMU/ml,
100 PMU/ml und 10 PMU/ml vergeben. Es gab wiederum nur eine Farbverteilung
und keine Schwellung. Aufgrund der Tatsache, dass der Hund 2002
kein detektierbares, freies oder Gesamt-IgE während dieser Hauttestperiode
aufwies, scheint es wahrscheinlich, dass die Hautreaktionen, die
beobachtet wurden, nicht die Folge der Querverknüpfung von IgE auf den Mastzellen
hoch affiner IgE-Rezeptoren war. Sie können das Ergebnis einer anderen
Hautreaktion gewesen sein, die mit dem Testverfahren in Zusammenhang
steht.
-
Beispiel IX: Chimärer kaniner anti-IgE mAb, der
für eine
langanhaltende Stabilität
im Serum entworfen wurde, Verlust der Immunogenität und der
IgE+ B-Zellen Ansteuerungsfähigkeit
-
Der
Fachmann wird erkennen, dass man den kaninen anti-IgE mAb der vorliegenden
Erfindung auch in einer Form bereitstellen kann, die einen größeren Abschnitt
des Moleküls
aufweist als das Ig, das von der Hundesequenz stammt, und daher
eine größere Serumstabilität aufweisen,
an Immunogenität
verlieren und wirksamer Ziel-IgE+ B-Zellen ansteuern sollte.
-
Daher
wurde in einem anderen Beispiel ein chimärer kaniner anti-IgE mAb, der
für eine
langanhaltendere Stabilität
im Serum und mit einem Unvermögen
zur Induktion einer Immunreaktion entworfen wurde, einem Hund verabreicht.
Dieser mAb bindet IgE im Serum und an IgE auf der Oberfläche von
IgE-erzeugenden B-Zellen,
jedoch nicht an IgE auf Mastzellen von Basophilen. Die IgE-Synthese
wird konsequenterweise verringert oder eliminiert. Die sich daraus
ergebenden verringerten IgE-Niveaus
verursachen eine Verringerung bei der Mastzellen-IgE-Rezeptor-Expression
und eine Verringerung in der damit in Verbindung stehenden allergischen
Reaktivität.
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Beispiel X: Rekombinanter kaniner IgE-Rezeptor,
der mit cRcIg bezeichnet wurde – Klonierung
und Expression in Insektenzellen
-
Die
Sequenz, von der man ausgeht, dass sie zumindest einen Teil der α-Untereinheit
des kaninen IgE-Rezeptors entspricht, wird in der GENBANK-Datenbank
unter der Zugangsnr. D16413 geführt.
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Der
cRcIg-Rezeptor besteht aus der alpha-Domäne des Rezeptors, die IgE bindet,
das mit den Exons 2 und 3 des kaninen IgE's verbunden ist. Die schweren Kettenabschnitte
des IgE vom Rezeptor sind die gleichen wie die Exons 2 und 3 des
c15A.2.
-
DNA,
die für
den chimären
IgE-Rezeptor cRcIg (SEQ ID NO: 8) kodiert, wurde unter Verwendung
von Standardverfahren in einem Baculovirusgenom eingebracht. High
Five-Insektenzellkulturen
wurde mit Baculovirus-erzeugendem cRcIg infiziert. Das cRcIg-Protein
wurde aus dem Zellkulturmedium durch Chromatographie auf Protein
A gereinigt, anschließend
wurden die kontaminierenden Proteine durch Ionenaustauschchromatographie
entfernt. Die DNA-Sequenz des rekombinanten IgE-Rezeptors cRcIg
mit der entsprechenden Translation wird in 10 (SEQ
ID NO: 8 und 9) dargestellt.
-
Der
in dieser Studie verwendete IgE-Rezeptor war ein rekombinanter chimärer Rezeptorkörper, genannt
cRcIg, der aus der löslichen
hoch affinen IgE-Rezeptor alpha-Untereinheit bestand, die mit der
kaninen IgG CH2- und CH3-Domäne
fusioniert war. Die lösliche
alpha-Untereinheit, der die Transmembrandomäne fehlt, wurde unter Verwendung
der Information, die in GeneBank erhältlich ist, durch PCR kloniert.
Die IgG CH2- und CH3-Domäne
waren Teil der Sequenz von DE94, der durch das Chemo-Sero Patent
beansprucht wird. Der lösliche
Rezeptor von DE94 CH2/CH3 wurden durch PCR miteinander verbunden,
um das Volllängen cRcIg
zu bilden.
-
Das
Volllängen
cRcIg wurde in den PharMingen Baculovirus pAcHisTNA-Vektor kloniert.
Der Virus wurde mittels sf-9-Zellen amplifiziert. Das cRcIg-Protein
wurde in einer Sekretionsform erzeugt und wurde in High Five-Zellen
für 48
Stunden mit einer MOI (Vielzahl der Infektion) von 5 exprimiert.
Das Protein wurde aufbauend auf der Bindung der CH2/CH3-Domäne an Protein
A auf der Säule
gereinigt. Das detaillierte Reinigungsschema ist das gleiche wie
das für
15A.2, wie es im Beispiel IV dargestellt wird.
-
Das
gereinigte cRcIg wurde auf 2,9 mg/ml auf konzentriert und durch
Filtern durch eine 0,2 μm
Filtereinheit sterilisiert. Die letztendliche Pufferzusammensetzung
ist die folgende:
0,7 × PBS
6,5
mM Natriumcitrat
15% Glycerol
pH: etwa 7,0
-
Das
Protein weist eine Reinheit von wenigstens 95% auf, wie es durch
das SDS-PAGE Proteingel angezeigt wurde und wird bei –80°C für die weitere
Verwendung gelagert.
-
Beispiel XI: Wirkung des rekombinanten
kaninen IgE-Rezeptors auf die IgE-Aktivität in vitro und in vivo
-
Die
Serum-IgE-Niveaus wurden wie zuvor bereits beschrieben durch einen
ELISA bestimmt. Das gereinigte cRcIg, wie nach Beispiel X erhalten,
wurde auf seine Fähigkeit
getestet die Bindung von kaninem IgE an den kaninen IgE-Rezeptor
in vitro zu verhindern. Die Menge an erforderlichem cRcIg zum Neutralisieren des
Serum-IgE's wurde
durch Titration von gereinigtem cRcIg gegen das Hundeserum in vitro
gemessen. Das gereinigte cRcIg wurde dann durch I.V. Injektion als
Bolus verabreicht.
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Der
rekombinante kanine IgE-Rezeptor cRcIg wurde demnach intravenös als Bolus
den Hunden 1001 und 1002 verabreicht. Diese Menge an cRcIg war zum
10-fachen (141 mg, 7, 08 ml mit 2 mg/ml bei Hund 2001) oder 20-fachen
(220 mg; 11,04 ml mit 2 mg/ml bei Hund 1001) der Menge, die für die 50%
Neutralisation der rekombinanten Rezeptorbindung in vitro erforderlich
ist, äquivalent.
Zusätzliches
cRcIg wurde dann bei einer Dosis von 5 ml mit 2 mg/ml als Bolus
jedem Hund für
fünf aufeinander
folgende Tage, an den Tagen 13–17, verabreicht. 9 folgt
dem Niveau des freien Serum-IgE's
in jedem Hund gegen die Zeit. In beiden Hunden kehrte IgE nach der
anfänglichen
Dosis von cRcIg am Tag 0 schnell in das Kreislaufsystem zurück. Die
Serum-IgE-Niveaus werden im Allgemeinen durch Standard-ELISA-Techniken, die dem
Fachmann gut bekannt sind, untersucht. Man geht allgemein davon
aus, dass IgE-Niveaus bei der unten beschriebenen ELISR-Technik
bei weniger als etwa 1 ng/ml undetektierbar sind.
-
Beim
Hund 1001 war das Serum-IgE durch das Assay für mehr als zwei Monate nach
der letzten Dosis des rekombinanten IgE-Rezeptors undetektierbar. Beim Hund
1002 kehrten die Serum-IgE-Niveaus über einen
Zeitraum von Tagen nach der letzten Verabreichung des rekombinanten
Rezeptors auf detektierbare Niveaus zurück. Es sollte jedoch festgestellt
werden, dass, obwohl die Serum-IgE-Niveaus sich im Hund 1002 erhöhten, sie
jedoch nicht auf die erhöhten
Niveaus zurückkehrten,
die vor der Verabreichung des rekombinanten Rezeptors am Tag 0 vorhanden
waren. 9 zeigt die Gesamt- und freien Serum IgE-Niveaus
in jedem der Hunde während
des Verabreichungszeitraums. Diese Daten zeigen, dass im Kreislauf
befindliches IgE nicht sofort aus dem Serum entfernt wurde. Freies
Serum IgE ist nicht zugänglich,
jedoch befand sich das gesamt-IgE, vermutlich das mit cRcIg komplexierte,
immer noch im Kreislaufsystem.
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Diese
Daten dokumentieren die Wirkungen eines rekombinanten Rezeptors
der vorliegenden Erfindung bei: (1) Entfernen des im Kreislauf befindlichen
IgE's aus dem Serum;
(2) Bereitstellen eines Verfahrens zum Beeinflussen des Prozesses
durch den IgE wieder aufgefüllt
wird.
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Beispiel XII: Peptide, die an kanines
IgE binden und das Binden an den IgE-Rezeptor verhindern und/oder
an IgE auf B-Zellen binden und die Synthese von IgE beeinflussen
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Der
Fachmann wird erkennen, dass Peptide aus kombinatorischen Peptidbibliotheken
erhalten werden können
und Sequenzen von Aminosäuren
umfassen, die, wenn sie mit IgE kombiniert werden, die Bindung des
IgE-Rezeptors verhindern. Sie sind dann Peptide von irgendeiner
Sequenz von Aminosäuren,
die an IgE binden, bevorzugt Exon 3 von IgE, und die Bindung an
den IgE-Rezeptor verhindern können.
Sie können
auch an IgE auf B-Zellen binden.
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Daher
werden in einem anderen Beispiel Peptide, die kanines IgE binden,
einem Hund verabreicht. Die Peptide binden IgE im Serum und IgE
auf der Oberfläche
der IgE-erzeugenden B-Zellen,
jedoch nicht IgE auf Mastzellen oder Basophilen. Die IgE-Synthese
wird verringert oder eliminiert. Die sich daraus ergebenden verringerten
IgE-Niveaus verursachen eine Verringerung in der Mastzellen IgE-Rezeptorexpression
und eine Verringerung der damit in Verbindung stehenden allergischen
Reaktivität.
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Beispiel XIV: Kleine Moleküle, die
kanines IgE binden, und die Bindung an den IgE-Rezeptor verhindern, und/oder
an IgE auf B-Zellen binden und die Synthese von IgE beeinflussen
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Der
Fachmann wird erkennen, dass kleine organische Moleküle aus kombinatorischen
Bibliotheken ableitbar sind und mit Assays untersuchbar sind, wobei
die kleinen organischen Moleküle
aufgrund ihrer Fähigkeit,
das IgE vor der Bindung an den IgE-Rezeptor zu hindern, isoliert
werden. Sie können
daher an IgE binden, bevorzugt an einen Bereich innerhalb des Exons
3, und Bindung an den IgE-Rezeptor inhibieren.
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In
einem anderen Beispiel wird einem Hund ein kleines Molekül verabreicht.
Das kleine Molekül
bindet IgE im Serum und das IgE auf der Oberfläche der IgE-erzeugenden B-Zellen,
jedoch nicht das IgE auf Mastzellen oder Basophilen. Die IgE-Synthese wird konsequenterweise
verringert oder eliminiert. Die sich daraus ergebenden verringerten
IgE-Niveaus verursachen eine Verringerung in der Mastzellen-IgE-Rezeptor-Expression und eine
Verringerung in der damit in Verbindung stehenden allergischen Reaktivität.
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