DE69632681T2 - Lymphotoxin-alpha/beta komplexe und antikörper gegen den lymphotoxin-beta rezeptor als agenzien gegen tumoren - Google Patents

Lymphotoxin-alpha/beta komplexe und antikörper gegen den lymphotoxin-beta rezeptor als agenzien gegen tumoren Download PDF

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Description

  • TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen und die Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Aktivierung der Lymphotoxin-β-Rezeptor-Signalgebung, die dann wieder starke antiproliferative Wirkungen auf Tumorzellen hervorruft. Insbesondere betrifft diese Erfindung heteromere Lymphotoxin-Komplexe, die zwischen Lymphotoxin-α und multiplen Untereinheiten von Lymphotoxin-β gebildet werden, die cytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen in der Anwesenheit von Lymphotoxin-β-Rezeptor aktivierenden Agenzien induzieren. Ebenso im Bereich dieser Erfindung liegen gegen den Lymphotoxin-β-Rezeptor gerichtete Antikörper, die als Lymphotoxin-β-Rezeptor aktivierende Agenzien, allein oder in Kombination mit anderen Lymphotoxin-β-Rezeptor aktivierenden Agenzien, entweder in An- oder Abwesenheit von Lymphotoxin-α/β-Komplexen fungieren. Es wird ein Überprüfungsverfahren zur Selektion solcher Antikörper bereitgestellt. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und die Anwendung dieser Zusammensetzungen unter Verwendung quer verknüpfter anti-Lymphotoxin-β-Rezeptor-Antikörper in Anwesenheit von anderen Lymphotoxin-β-Rezeptor aktivierenden Agenzien, um die Tumorzellcytotoxizität zu ermöglichen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-Familie besitzt mehrere Mitglieder, deren Signalgebung den Tumorzelltod durch Nekrose oder Apoptose (programmierter Zelltod) auslösen können. Die Liganden TNF und Lymphotoxin-α (LT-α; früher TNF-β genannt) binden an und aktivieren TNF-Rezeptoren (p60 und p80; hier „TNF-R." genannt). Die TNF-R-Signalgebung induziert allgemeine Immunantworten auf eine Infektion oder Stress in normalen Zellen, ist aber gegenüber Zellen mit transformierten Phänotypen oder Tumorzellen cytotoxisch. TNF-R Signale-können Tumorzellen und virusinfizierte Zellen selektiv lysieren. Die cytotoxischen Wirkungen der TNF-R-Signale auf Tumorzellen werden durch Interferon-γ (IFN-γ) und durch eine Vielzahl von konventionellen chemotherapeutischen Agenzien verstärkt.
  • Es wäre zweckdienlich, den Vorteil der durch TNF-R-Signale ausgelösten antiproliferativen oder cytotoxischen Wirkungen in Tumorzellen für therapeutische Zwecke zu nutzen. Die TNF-R-Aktivierung hat jedoch vielfältige Wirkungen auf eine Reihe von immunregulatorischen Antworten, einschließlich der Einleitung der Vorentzündungs-Kaskaden. Deshalb war es nicht möglich, die cytotoxischen Wirkungen von TNF-R Signalen gegen Tumorzellen zu richten, ohne gleichzeitige Stimulierung von Entzündungsantworten, die zur allgemeinen Toxizität im Menschen führen.
  • Gleichermaßen kann die Stimulierung eines anderen TNF-verwandten, als Fas-Rezeptor (FasR) bezeichneten Rezeptors Cytotoxizität durch programmierten Zelltod in einer Reihe von sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumor-Zelltypen auslösen. Von der FasR-Aktivierung wurde jedoch gezeigt, dass sie eine rasche Lebernekrose bewirkt; deshalb ist eine therapeutische Anwendung im Menschen ausgeschlossen.
  • Kürzlich wurde ein anderer Rezeptor in der TNF-Familie, genannt der LT-β-Rezeptor (LT-β-R), identifiziert (Crowe et al., Science, 264, S. 707–10 (1994)). Der LT-β-R bindet heteromere Lymphotoxin-Komplexe (LT-α/β), die LT-α-Untereinheiten in Verbindung mit einem anderen TNF-verwandten Polypeptid, das Lymphoxin-β (LT-β) genannt wird, beinhalten. Diese LT-α/β-Komplexe sind Membranassoziiert, und die meisten besitzen eine LT-α1/β2-Stöchiometrie (Browning et al., Cell, 72, S. 847–56 (1993); Browning et al., J. Immunol., 154, S. 33–46 (1995)).
  • Aufgrund der Ähnlichkeit zu TNF-R und anderen TNF-ähnlichen Rezeptoren nimmt man an, dass sich die Aktivierung des LT-β-R Signals ereignet, wenn multiple Rezeptoren auf der Zelloberfläche in enge Nähe gebracht werden (Crowe et al., Science, 264, S. 707–10 (1994)). Dieser Prozess wird als Rezeptor-Clusterbildung bezeichnet. Die TNF und LT-Liganden sind multivalente Komplexe, die gleichzeitig an mehr als einen Rezeptor binden können und deshalb mehr als einen Rezeptor vereinigen. Die Rezeptor-Clusterbildung als Mittel zur Rezeptoraktivierung in anderern Systemen wurde gut dokumentiert, insbesondere für Rezeptor-Tyrosinkinasen (Ullrich und Schlessinger, Cell, 61, S. 203–212 (1990); Kolanus et al., Cell, 74, S. 171–83 (1993)). Demzufolge würde die Verabreichung von LT-α1/β2-Liganden und/oder LT-β-R aktivierenden Agenzien, die die Clusterbildung und die stromabwärtige Signalgebung von LT-β-R-Molekülen auf der Oberfläche von Zieltumorzellen induzieren können, nützlich für die direkte Stimulation des LT-β-R-Pfades in diesen Zellen sein.
  • Die Signalgebung durch LT-β-R wie TNF-R, kann Pfade aktivieren, die zur Cytotoxozität und Zelltod in Tumorzellen führen. Wichtig ist, dass die LT-α1/β2-Liganden nicht mit irgendeiner signifikanten Affinität an TNF-R binden. Aus diesem Grund würde die direkte LT-β-R-Aktivierung in Tumorzellen Cytotoxizität in diesen Zellen ohne Stimulierung der mit der TNF-R Aktivierung verbundenen Entzündungspfade auslösen. Die Behandlung mit LT-α1/β2 und/oder anderen LT-β-R aktivierenden Agenzien würde deshalb nützlich für die Behandlung oder die Reduzierung des Fortschreitens, der Heftigkeit oder der Wirkungen von tumorbildenden Zellen (Neoplasie) sein, während die starken Probleme von Nebenwirkungen, denen man begegnete, als TNF-R- oder FasR-Aktivierung als eine Anti-Tumor-Behandlung versucht wurde, überwunden werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung löst die Probleme, auf die vorstehend hingewiesen wurde, durch die Bereitstellung von Arzneimitteln und deren Verwendung für die Behandlung von Tumorzellen durch Stimulation der LT-β-R Signalgebung ohne die gleichzeitige Stimulation der mit TNF-R verbundenen Entzündungsantworten. In einer Ausführungsform werden Lymphotoxin-Komplexe, die zwischen LT-α und multiplen Untereinheiten von LT-β gebildet werden, bereitgestellt (heteromere LT-α/β-Komplexe), die cytotoxische Wirkungen auf den LT-β-R tragende Zellen in Anwesenheit eines LT-β-R aktivierenden Agens induzieren. Die bevorzugten Zusammensetzungen und die Verwendung dieser Ausführungsform beinhaltet LT-α1/β2-Komplexe in der Anwesenheit eines LT-β-R aktivierenden Agens. Stärker bevorzugt liegen die LT-α1/β2-Komplexe in einer löslichen und nicht in einer Membran gebundenen Form vor, und das LT-β-R aktivierende Agens ist IFN-γ.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wird mindestens ein gegen LT-β-R gerichteter Antikörper (anti-LT-β-R-Ak) als ein zweites LT-β-R aktivierendes Agens in Verbindung mit dem heteromeren LT-α/β-Komplex verwendet. Die bevorzugten Zusammensetzungen und die Verwendung dieser Ausführungsform sind durch LT-α1/β2 in Gegenwart von IFN-γ als ein erstes aktivierendes Agens und mindestens einem anti-LT-β-R-Ak als zweites LT-β-R aktivierendes Agens charakterisiert. Mehr bevorzugt sind die LT- α1/β2-Komplexe löslich, und der Antikörper ist ein monoclonaler Antikörper (anti-LT-β-R-mAk).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wird mindestens ein anti-LT-β-R-Ak in der An- oder Abwesenheit eines zweiten LT-β-R aktivierenden Agens ohne einen exogenen heteromeren LT-α/β-Komplex verwendet. Die bevorzugten Zusammensetzungen und die Verwendung dieser Ausführungsform beinhalten mindestens zwei monoclonale anti-LT-β-R-Antikörper (anti-LT-β-R-mAk), die nicht überlappende Epitope von LT-β-R in Kombination mit IFN-γ erkennen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung Arzneimittel und deren Verwendung zur Verstärkung der Tumorzellcytotoxizität, die durch die quer verknüpfte, in Verbindung mit einem zweiten LT-β-R aktivierenden Agens verwendete, anti-LT-β-R-Ak charakterisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen anti-LT-β-R-Ak durch ihre Querverknüpfung auf einer Oberfläche immobilisiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die anti-LT-β-R-Ak in Lösung quer verknüpft. Mehr bevorzugt sind die anti-LT-β-R-Ak monoclonale Antikörper, und das zweite LT-β-R aktivierende Agens ist IFN-γ.
  • Diese Erfindung stellt außerdem ein neues Überprüfungsverfahren zur Selektion von LT-β-R aktivierenden Agenzien bereit, wie anti-LT-β-R-Ak, die in Kombination mit heteromeren LT-α/β-Komplexen funktionieren, um den Tumorzelltod zu fördern. Der Test macht Gebrauch von der erhöhten Sensitivität von menschlichen Adenokarzinomzellen gegenüber heteromeren LT-α/β-Komplexen in der Anwesenheit von LT-β-R aktivierenden Agenzien in einem Cytotoxizitätstest. Das Verfahren, das verwendet wird, um mutmaßliche LT-β-R aktivierende Agenzien zu testen, wird durch Beispiele für den Fall von anti-LT-β-R Antikörper veranschaulicht und beinhaltet folgende Schritte:
    • 1) Tumorzellen (z. B. menschliche HT29-Adenokarzinomzellen) werden für mehrere Tage in IFN-γ enthaltendem Medium kultiviert, und gereinigtes LT-α1/β2 wird in An- oder Abwesenheit von den besonderen anti-LT-β-R-Ak getestet.
    • 2) Die Zellen werden mit einem Farbstoff, der lebende Zellen anfärbt, behandelt; und
    • 3) Die Anzahl der gefärbten Zellen wird quantifiziert, um die Fraktion von in Anwesenheit von LT-α1/β2, IFN-γ und dem Test-anti-LT-β-R-Ak getöteten Tumorzellen in jeder Probe zu bestimmen. Alternativ kann die Anzahl an überlebenden Zellen durch eine Anzahl gut bekannter Tests bestimmt werden, die die Zell-Lebensfähigkeit wie den 3H-Thymidin-Einbau in DNA messen.
  • Ein anti-LT-β-R-Ak (oder eine Ak-Kombination), die den Prozentsatz von in diesem Test getöteten Tumorzellen signifikant erhöht, ist ein LT-β-R aktivierendes Agens innerhalb des Bereichs dieser Erfindung. Dieser cytolytische Test kann angepasst werden, um neue LT-β-R aktivierende Agenzien zu identifizieren, die in Kombination mit heteromeren LT-α/β-Komplexen funktionieren.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER SKIZZEN
  • 1A. Größenanalysen der gereinigten, durch TNF-R und LT-β-R Immunaffinitäts-Chromatographie aufgetrennten heteromeren LT-α/β-Komplexformen. Die gereinigten Proteine wurden auf einem TSK 3000 HPLC-Harz in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung analysiert. Die Position der verschiedenen Größenmarker wird gezeigt.
  • 1B. Ionenaustauschanalysen von gereinigten LT Formen unter Verwendung einer Poros-Carboxymethyl-Säule (4,6 mm × 100 mm) auf einem BioCad-Apparat (Perceptive Biosystems). 27 μg jeder Proteinprobe wurden auf eine Säule geladen und in einem Gradienten von 0 bis 1 M NaCl über 20 Säulenvolumina bei 5 ml/min in einem 16,66 μM Hepes, 16,66 μM Na-Acetat und 16,66 μM Mes-Puffer (pH 6,5) enthaltendem Puffer eluiert.
  • 2A. Vergleich der cytotoxischen Aktivität von: Anti-Fas-Rezeptor-mAk CH-11 (-⦁-); TNF (-
    Figure 00050001
    -); LT-α (-
    Figure 00050002
    -); LT-α1/β2 (-
    Figure 00050003
    -); und LT-α2/β1 (-♦-) auf menschlichen HT29-Adenokarzinom-Zellen entweder in An- oder Abwesenheit von 80 U/ml IFN-γ.
  • 2B. Vergleich der Fähigkeit von 5 μg/ml menschlichem IgG (-⦁-), löslichem p60TNF-R-Fc (-
    Figure 00050001
    -) und löslichen LT-β-R-Fc Rezeptor-Immunglobulin-Chimären (-
    Figure 00050002
    -), die cytotoxischen Wirkungen in 2A in Anwesenheit von 80 U/ml IFN-γ zu hemmen.
  • 3. Anti-LT-β-R mAk verstärken die cytotoxische Wirkung von LT-α1/β2 auf menschliche HT29-Adenokarzinom-Zellen. (A) Die LT-α1/β2 cytolytischen Wirkungen auf HT29-Zellen werden durch die Anwesenheit des anti-LT-β-R-mAk CDH10 vermöglicht. LT-α1/β2-Wirkungen wurden ohne mAk (-⦁-) und in Anwesenheit von 0,5 μg/ml Kontroll-IgG1 (-
    Figure 00050003
    -), 0,05 μg/ml CDH10 (-
    Figure 00050001
    -) und 0,5 μg/ml (-
    Figure 00050002
    -) CDH10 gemessen. (B) Die cytolytischen LT-α1/β2-Wirkungen auf HT29-Zellen wurden durch die Anwesenheit des anti-LT-β-R-mAk BDA8 gehemmt. LT-α1/β2-Wirkungen wurden in Anwesenheit von 2 μg/ml Kontroll-IgG1 (-
    Figure 00050003
    -) oder anti-LT-β-R-mAk BDA8 (-
    Figure 00050002
    -) gemessen. Die Differenz zwischen dem Verhalten des CDH10- und BDA8-anti-LT-β-R-mAk in diesem Test ist ein Hinweis darauf, dass sie gegen verschiedene Epitope des LT-β-R gerichtet sind.
  • 4. Immobilisierte anti-LT-β-R-mAk sind cytotoxisch gegen menschliche Adenokarzinom HT29-Zellen. (A) Die anti-LT-β-R-mAk besitzen eine direkte cytotoxische Wirkung auf HT29-Zellen, wenn sie auf einer Oberfläche immobilisiert sind. Es wurden Platten mit IgG1 (-⦁-), einem gegen ein nichtverwandtes, abundantes Zelloberflächen-Antigen HT29/26 gerichteten mAk (-
    Figure 00050003
    -), BDA8 (-
    Figure 00050001
    -) und CDH10 (-
    Figure 00050002
    -) beschichtet. (B) Die Wirkungen von löslichem anti-LT-β-R-mAk allein auf das Wachstum von HT29-Zellen. Symbole wie in (A). Diese anti-LT-β-R-mAk in ihrer löslichen Form haben keine signifikanten cytotoxischen Wirkungen auf HT29-Zellen, wenn sie einzeln verabreicht wurden.
  • 5. Repräsentative Quantifizierung der verstärkten Cytotoxizität gegen Tumorzellen durch die Behandlung mit Paaren löslicher anti-LT-β-R-mAk. (A) Die cytotoxischen Wirkungen auf HT29-Zellen von Kontroll-IgG1 (100 ng/ml), anti-LT-β-R-mAk BHA10 (100 ng/ml), anti-LT-β-R-mAk CBE11 (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml) und BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-γ war bei 80 U/ml vorhanden. (B) Die cytotoxischen Wirkungen von Kontroll-IgG1 (100 ng/ml), anti-LT-β-R-mAk CDH10 (100 ng/ml), anti-LT-β-R mAk CBE11 (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + IgG1 (100 ng/ml) und CDH10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml) auf HT29-Zellen. IFN-γ war mit 80 U/ml vorhanden. (C) Die cytotoxischen Wirkungen von Kontroll-IgG1 (100 ng/ml), anti-LT-β-R-mAk CDH10 (33 ng/ml), anti-LT-β-R-mAk AGH1 (50 ng/ml) und CDH10 (33 ng/ml) + AGH1 (50 ng/ml) auf HT29-Zellen; IFN-γ war mit 80 U/ml anwesend. (D) Wie in (C), mit der Ausnahme dass menschliche WiDr-Adenokarzinomzellen in dem cytolytischen Test verwendet wurden (Raitano und Korc, J. Biol. Chem., 265, S. 10466–472 (1990)).
  • 6. Tumorgröße in mit einem anti-LT-β-R-mAk behandelten SCID Mäusen. (A) Größe des menschlichen WiDr-Adenokarzinom-Tumors in SCID Mäusen 30 Tage nach Inokulation mit einer gleichzeitigen Antikörper-Behandlung. Mäuse wurden an den Tagen 1 und 2 mit Kochsalzlösung, IFN-γ allein, einem anti-LT-β-R-mAk (CBE11) mit und ohne IFN-γ und einem Kontroll anti-Mensch-LFA-3-mAk (1E6) mit IFN-γ behandelt. Der Mittelwert jeder Gruppe wird durch einen Querbalken angezeigt. Mittelwerte, Standardabweichungen und Anzahl der Tiere (in Klammern) für die fünf Gruppen (von links nach rechts) waren: 0,88 +/– 0,59 (14), 1,21 +/– 0,7 (21), 0,041 +/– 0,052 (16), 0,11 +/– 0,1 (12) und 0,98 +/– 1,16 (12). (B) Größe des menschlichen WiDr-Adenokarzinom-Tumors in SCID Mäusen von 14 bis 49 Tagen nach Tumorzell-Inokulation mit einer am Tag 15 nach der Inokulation erfolgten Antikörper-Behandlung. Die Tumore wuchsen bis zu einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,53 cm (0,076 ccm) ohne jede Behandlung und am Tag 15 wurde mit i. p.-Injektionen begonnen und wie durch die Pfeile angezeigt fortgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen werden für eine Gruppe von 12 Tieren, die entweder mit IFN-γ allein (1 × 106 U/Injektion) (-
    Figure 00050002
    -), IFN-γ mit 50 μg 1E6-anti-LFA-3-mAk (-
    Figure 00050001
    -), IFN-γ mit 50 μg CBE11-anti-LT-β-R-mAk (-Δ-) oder 50 μg CBE11-anti-LT-β-R-mAk allein (nicht gezeigt) behandelt wurden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Damit die hier beschriebene Erfindung vollständig verstanden werden kann, wird die folgende, detaillierte Beschreibung voran gestellt.
  • Der Begriff „Anti-Tumor-Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz oder Zusammensetzung, die Proliferation von Tumorzellen zu blockieren oder den Tod von Tumorzellen zu induzieren, die mit dieser Substanz oder Zusammensetzung interagieren.
  • Der Begriff „Apoptose" bezieht sich auf den Prozess des programmierten Zelltodes.
  • Der Begriff „cytotoxische Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz oder Zusammensetzung, den Tod von Zellen, die mit dieser Substanz oder Zusammensetzung interagieren, zu induzieren.
  • Der Begriff „Epitop" (oder antigene Determinante) ist als Teil eines Moleküls definiert, dass sich mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle auf einem Antikörpermolekül vereinigt. Ein einzelnes Epitop wird durch einen monoclonalen Antikörper (mAk) erkannt. Multiple Epitope werden normalerweise von polyclonalen Antikörpern (Ak) erkannt.
  • Die „Fc-Domäne" eines Antikörpers betrifft einen Teil des Moleküls, der CH2-, CH3- und Hingeregionen umfasst, dem aber die Antigen-Bindungsstellen fehlen.
  • Der Begriff „Interferon induzierendes Agens" bezieht sich auf jedes Agens, das in der Lage ist, die endogene Produktion von entweder Typ I-(IFN-α, IFN-β) oder Typ II-(IFN-γ) Interferonen direkt oder indirekt zu stimulieren. Beispiele für Interferon induzierende Agenzien schließen Doppelstrang-RNA-Moleküle und eine Vielzahl von Pflanzen oder pharmazeutisch abgeleiteten Verbindungen ein.
  • Die Begriffe „LT-α-Mutein" und „LT-β-Mutein" beziehen sich auf LT-α- oder LT-β-Polypeptide, die im Vergleich zur Aminosäuresequenz des korrespondierenden, nativen Polypeptids eine oder mehrere Aminosäureveränderungen besitzen.
  • Der Begriff „LT-β-R aktivierendes Agens" betrifft jedes Reagens, das die Ligandenbindung an LT-β-R, die Zelloberflächen-LT-β-R-Clusterbildung oder die LT-β-R-Signalgebung steigern kann oder das darauf Einfluss nehmen kann, wie das LT-β-R Signal innerhalb der Zelle ausgewertet wird. Beispiele für LT-β-R aktivierende Agenzien schließen IFN-α, IFN-γ, TNF, Interferon induzierende Agenzien, lösliche anti-LT-β-R-Ak, quer verknüpfte anti-LT-β-R-Ak und multivalente anti-LT-β-R-Ak ein.
  • Der Begriff „LT-β-R-Signalgebung" bezieht sich auf alle molekularen Reaktionen, die mit dem LT-β-R-Pfad verknüpft sind, und auf nachfolgende, molekulare Reaktionen, die daraus resultieren.
  • Der Begriff „anti-LT-β-Rezeptor-Antikörper" („anti-LT-β-R-Ak") bezieht sich auf jeden Antikörper, der mindestens ein Epitop des LT-β-Rezeptors erkennt und bindet.
  • Der Begriff „monoclonaler anti-LT-β-Rezeptor-Antikörper" („anti-LT-β-R-mAk") betrifft jeden monoclonalen Antikörper, der ein einzelnes Epitop des LT-β-R erkennt und bindet.
  • Der Begriff „quer verknüpfte anti-LT-β-R-(m)Ak" betrifft gegen den LT-β-R gerichtete Antikörper, die entweder miteinander quer verknüpft wurden, um in Lösung unter der Verwendung eines anti-LT-β-R-Antikörper (Ak) oder (mAk) quer verknüpfenden Agens Antikörper-Agglomerate zu bilden, oder die in enger Nähe zueinander auf einer Oberfläche oder einer Matrix immobilisiert wurden.
  • Der Begriff „anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) quer verknüpfendes Agens" betrifft jedes Agens, das in Lösung kovalent oder nicht kovalent anti-LT-β-R-Ak aggregieren kann, so dass die Ak binden und die LT-β-Rezeptor-Clusterbildung an der Oberfläche der Zielzelle verstärken können. Solche quer verknüpfenden Agenzien schließen chemische quer verknüpfende Agenzien, zweite Antikörper, die mit Teilen der anti-LT-β-R-Ak oder -mAk reagieren und lösliche oder Oberflächen gebundene Fc-Rezeptoren – entweder endogen oder exogen zugegeben – die an anti-LT-β-R-Ak binden können, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Begriffe „biologische LT-α-Aktivität", „biologische LT-β-Aktivität" und „biologische LT-α/β-Aktivität" sind definiert als: 1) immunologische Kreuz-Reaktivität mit einem Antikörper, der gegen mindestens ein Epitop der entsprechenden nativen Untereinheit oder einen Komplex von Untereinheiten gerichtet ist; oder 2) die Fähigkeit der LT-Untereinheit oder des Untereinheitenkomplexes, um die Liganden-Bindungsstellen auf einem LT-spezifischen Rezeptor wie TNF-R oder LT-β-R zu konkurrieren; oder 3) der Besitz der Fähigkeit, eine regulatorische Immunantwort oder cytotoxische Aktivität qualitativ gemeinsam mit einer nativen LT-Untereinheit oder einem Komplex zu stimulieren.
  • Der Begriff „heteromerer LT-α/β-Komplex" betrifft eine stabile Verbindung zwischen mindestens einer LT-α-Untereinheit und mehr als einer LT-β-Untereinheit. Die Untereinheiten können sich durch elektrostatische, van der Waals oder kovalente Wechselwirkungen verbinden. Der heteromere LT-α/β-Komplex besitzt bevorzugt mindestens zwei aneinandergrenzende LT-β-Untereinheiten, und ihm fehlen aneinandergrenzende LT-α-Untereinheiten. Am meisten bevorzugt besitzt der Komplex die Stöchiometrie LT-α1/β2.
  • Der Begriff „multivalenter Ligand" betrifft ein Molekül oder einen Komplex, der mehr als eine Rezeptor-Bindungsstelle besitzt und der fähig ist, mindestens zwei Rezeptor-Moleküle gleichzeitig zu binden und in enge Nähe zu bringen.
  • Eine „Typ 1-Leader-Sequenz" ist ein aminoterminaler Teil eines eukaryontischen Proteins, der als ein Signal dient, das Protein zur Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) und oft durch den gesamten Sekretions-Weg zu lenken. Die Leader-Sequenz wird gewöhnlich durch eine Signalpeptidase in der ER-Membran abgespalten.
  • Eine „Signal-Sequenz" ist das funktionale Äquivalent einer eukaryontischen Leader-Sequenz von Typ 1 in prokaryontischen Wirten und lenkt die Translokation von Proteinen in oder durch zweischichtige Lipid-Membranen eines Bakteriums hindurch.
  • Ein „löslicher heteromerer LT-α/β-Komplex" ist ein heteromerer LT-α/β-Komplex, der lösliche LT-β-Untereinheiten beinhaltet, in welchen die Aminosäuresequenzen, die die Polypeptide an der Membran örtlich festlegen, entfernt oder inaktiviert wurden, wodurch die LT-β-Untereinheit löslich gemacht wird. Lösliche heteromere LT-α/β-Komplexe können durch eine geeignete Wirtszelle abgesondert werden, die konstruiert wurde, um beide Untereinheiten zu exprimieren.
  • Ein „Oberflächen-LT-α/β-Komplex" ist ein LT-α und Membran gebundene LT-β-Untereinheiten beinhaltender Komplex, der an der Zelloberfläche präsentiert wird.
  • Herstellung von membrangebundenen LT-α/β-Komplexen
  • Zelloberflächen-Lymphotoxin-Komplexe wurden in CD4+-T-Zell-Hybridomzellen (II-23.D7), die hohe Spiegel von LT exprimieren charakterisiert (Browning et al., J. Immunol., 147, S. 1230–37 (1991); Androlewicz et al., J. Biol. Chem., 267, S. 2542–47 (1992)). Reifem LT-α fehlt eine Transmembran-Domäne, und es ist an der Zelloberfläche durch Wechselwirkung mit mindestens einer membrangebundenen LT-β-Untereinheit lokalisiert. Membrangebundene (Oberflächen) heteromere LT-α/β-Komplexe haben vorwiegend eine LT-α1/β2-Stöchiometrie.
  • Als ein Zellmembranprotein bindet LT-β an LT-α während der Synthese und „lenkt" das LT-α zur Zellmembran. In der Abwesenheit von LT-β wird LT-α in das extrazelluläre Medium abgesondert. LT-Untereinheiten lagern sich normalerweise innerhalb der Zelle vor dem Proteinexport in die Membran zu Komplexen zusammen. Sind LT-β-Untereinheiten einmal in der Membran eingefügt, bilden sie keine stabilen Komplexe mit abgesondertem LT-α. Deshalb wird bevorzugt, wenn die membrangebundene Form eines heteromeren LT-α/β-Komplexes gewünscht wird, die gewünschten LT-α- und LT-β-Untereinheiten innerhalb derselben Zelle zu coexprimieren.
  • Der heteromere Oberflächen-LT α/β-Komplex kann durch Cotransfektion von Wirtszellen mit sowohl LT-α- als auch LT-β-Genen rekonstruiert werden. Oberflächen-LT-Komplexe können auf stabilen Zell-Linien, die jedes LT-Gen allein exprimieren, nicht beobachtet werden. Wenn die Wirtszelle normalerweise jedoch große Mengen an LT-α (z. B. RPMI 1788-Zellen, vgl. Nachstehendes) produziert, dann sollte die Transfektion mit einem LT-β-Gen, das das gewünschte LT-β-Polypeptid codiert, ausreichend sein, LT-α/β-Komplexe, die LT-α-Untereinheiten voller Länge beinhalten, zu erzeugen.
  • Die Co-Expression von LT-α- und LT-β-Polypeptiden in einer Anzahl von eukaryontischen Expressions-Systemen führt zu ihrer Zusammensetzung und ihrem Export als aktiver Ligand (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, 79–89 (1994)). Wirtssysteme, die verwendet werden können, umfassen CHO-Zellen, COS-Zellen, B-Zellen einschließlich Myelomzellen, Baculovirus infizierte Insektenzellen und Hefe, beschränken sich aber nicht auf diese.
  • Die LT-α-Untereinheit der heteromeren LT-α/β-Komplexe dieser Erfindung kann aus Lymphotoxin-α, nativem menschlichem oder tierischem Lymphotoxin-α, rekombinantem Lymphotoxin-α, löslichen Lymphotoxin-α, abgesondertem Lymphotoxin-α, Lymphotoxin-α-Muteinen, die eine biologische LT-α-Aktivität besitzen, oder Lymphotoxin-α-Fragmenten von jedem der vorstehenden Verbindungen, die eine biologische LT-α-Aktivität besitzen, ausgewählt werden.
  • Das LT α-Polypeptid kann jede lösliche Form des Moleküls, einschließlich aktiver Fragmente davon, sein, die in eukaryontischen Systemen hergestellt werden kann, in welchen die natürliche LT-α-Leader-Sequenz abgespalten sein wird.
  • Alternativ kann die Fusion der reifen LT-α-Sequenz mit einer heterologen Siganlsequenz verwendet werden, um die Sekretion von LT-α in anderen Wirtssystemen zu maximieren. Die Auswahl der Signale basiert auf der gewünschten Wirtszelle und kann bakterielle, Hefe-, Säuger- und virale Sequenzen einschließen. Das native Signal oder die vaskuläre Zelladhäsions-Molekül-1 (VCAM-1)-Signalsequenz ist für die Verwendung in Säuger-Expressionssystemen geeignet.
  • LT-α-Polypeptide können ebenso mit Polypeptiden fusioniert werden, die eine verlängerte Plasma-Halbwertszeit besitzen, wie Immunglobulinketten oder Fragmente davon. Plasmaproteine, die verwendet werden können, um die Plasma-Halbwertszeit zu erhöhen, umfassen Serumalbumin, Immunglobuline, Apolipoproteine und Transferrin. Die Verknüpfung mit Polyethylenglykol (PEG) kann das Polypeptid stabilisieren und seine Immunogenität senken. Vorzugsweise ist in den Anwendungen gemäß Anspruch 3 das LT-α-Fusionsprotein nicht signifikant immunogen in dem zu behandelnden Patienten, und das Plasmaprotein verursacht keine unerwünschten Nebenwirkungen auf Grund seiner normalen biologischen Aktivität in Patienten.
  • Menschliches LT-α ist an N- und O-Resten glycosyliert und zeigt, abhängig von der Quelle, eine beträchtliche auf Zucker basierende Mikroheterogenität. Die Oligosaccharid-Zusammensetzung des besonderen LT-α, das gewählt wurde, um den LT-Komplex zu bilden, kann in vivo die Clearanceraten beeinträchtigen (Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, S. 144–53 (1993)). Seit Glycosylierungs-Varianten durch die Expression in verschiedenen Wirtszellen hergestellt werden können, ist dies ein Faktor, der bei der Auswahl einer Quelle von LT-α bedacht werden soll.
  • LT-α kann von der B-Lymphoblastom-ähnlichen Linie RPMI 1788 gereinigt werden, die konstitutionell LT-α absondert und die durch die Behandlung mit Phorbolester PMA (Aggarwal et al., J. Biol. Chem., 259, S. 689–91 (1984)) induziert werden kann, höhere Spiegel abzusondern: Alternativ kann das clonierte menschliche LT-α-Gen verwendet werden, um LT-α-Polypeptide rekombinant in verschiedenen Wirtssystemen einschießlich Bakterien (Schoenfeld et al., J. Biol. Chem., 266, S. 3863–69 (1991)); Baculovirus infizierten Insektenzellen (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, S. 70–89 (1994)); Säugerzellen (Browning und Ribolini, J. Immunol., 143, S. 1859–67 (1989)); Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, S. 144–53 (1993)) herzustellen.
  • Teile des LT-α-Genes, das Polypeptid-Fragmente, die eine biologische LT-α-Aktivität besitzen, codiert, können unter Verwendung von Routine-Überprüfungstests bestimmt werden. Nützliche Überprüfungstests für eine biologische LT-α-Aktivität umfassen kompetitive Hemmtests mit an TNF-R gebundenem nativen LT-α oder die direkte oder indirekte Messung durch die Hemmung der Fähigkeit des LT-α, Cytotoxizität in Tumorzellen in auf dem Fachgebiet bekannten Untersuchungen zu induzieren. Vorzugsweise sind LT-α-Fragmente in heteromeren Komplexen mit LT-β verknüpft, und die Komplexe werden auf ihre biologische LT-α/β-Aktivität durch kompetitive Hemmung mit an LT-β-R gebundenem LT-α/β, oder auf ihre Fähigkeit, Cytotoxizität von Tumorzellen in den hierin offenbarten Tests zu induzieren, untersucht.
  • Lymphotoxin-β, auch als p33 benannt, wurde auf der Oberfläche von T-Lymphocyten, T-Zell-Linien, B-Zell-Linien und Lymphokin aktivierten Killer-Zellen identifiziert. LT-β ist der Gegenstand der gemeinsam anhängigen internationalen Anmeldungen: PCT/US91/04588, veröffentlicht am 9. Januar, 1992 als WO 92/00329; und PCT/US93/11669, veröffentlicht am 23. Juni, 1994 als WO 94/13808 der Anmelder, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • Das LT-β-Gen codiert ein Polypeptid von 240–244 Aminosäuren (Browning et al., Cell, 72, S. 847–56 (1993)). LT-β ist ein Typ II-Membranprotein mit einer kurzen N-terminalen cytoplasmatischen Domäne, gefolgt von einer Membran-Anker-Domäne von 30 hydrophoben Aminosäuren. Es besitzt eine einzelne N-gebundene Glycosylierungsstelle und hat nur einen Cysteinrest, der anscheinend nicht an der Bildung von Disulfid-Bindungen zwischen den Untereinheiten beteiligt ist.
  • Die LT-β-Untereinheiten, die die heteromeren LT-α/β-Komplexe der vorliegenden Erfindung beinhalten, können aus Lymphotoxin-β, nativem menschlichen oder tierischen Lypmhotoxin-β, rekombinantem Lymphotoxin-β, löslichem Lymphotoxin-β, abgesondertem Lymphotoxin-β, Lymphotoxin-β Muteinen, die eine biologische LT-β-Aktivität besitzen, oder Lymphotoxin-β-Fragmenten von jedem der Vorstehenden, die eine biologische LT-β-Aktivität haben, ausgewählt werden.
  • Wie vorstehend für das LT-α-Polypeptid diskutiert, können die LT-β-Polypeptide ebenfalls unter Verwendung derselben Methoden modifiziert werden, um ihre Löslichkeit oder Plasma-Halbwertszeit zu steigern. Ebenso können Teile des LT-β-Genes, die Polypeptid-Fragmente codieren, die eine biologische LT-β-Aktivität besitzen, unter Verwendung von Routine-Überprüfungstests, wie für LT-α diskutiert, bewertet werden.
  • Herstellung löslicher Komplexe
  • Lösliche (nicht membrangebundene) heteromere LT-α/β-Komplexe beinhalten LT-β-Untereinheiten, die von einer membrangebundenen zu einer löslichen Form verändert wurden. Diese Komplexe werden ausführlich in der gemeinsam, anhängigen internationalen Anmeldung der Anmelder (PCT/US93/11669, veröffentlicht am 9. Januar, 1992 als WO 94/13808) beschrieben. Lösliche LT-β-Peptide werden durch die Aminosäuresequenz von Lymphotoxin-β definiert, in welcher die Sequenz an jedem Punkt zwischen dem Ende des Transmembran-Bereichs (d. h. bei ungefähr Aminosäure #44) und der ersten TNF-Homologie-Region (d. h. bei Aminosäure #88) gemäß dem Numerierungssystem von Browning et al., Cell, 72, S. 847–56 (1993) gespalten wird.
  • Lösliche LT-β-Polypeptide können durch Verkürzung des N-Terminus von LT-β, um den cytoplasmatischen Schwanz und den Transmembran-Bereich zu entfernen, hergestellt werden (Crowe et al., Science, 264, S. 707–710 (1994)). Alternativ kann die Transmembran-Domäne durch Deletion oder durch Substitution der normalerweise hydrophoben Aminosäurereste, die eine Transmembran-Domäne beinhalten, mit hydrophilen inaktiviert werden. In jedem Fall wird ein im Wesentlichen hydrophiles, hydropathisches Profil geschaffen, das die Lipid-Affinität reduzieren und die Wasserlöslichkeit verbessern wird. Die Deletion der Transmembran-Domäne wird der Substitution mit hydrophilen Aminosäureresten vorgezogen, da sie die Einführung potentieller immunogener Epitope vermeidet.
  • Die deletierte oder inaktivierte Transmembran-Domäne kann ersetzt werden mit oder verknüpft werden mit einer Typ I-Leader-Sequenz (z. B. dem VCAM-1-Leader), so dass das Protein abgesondert wird, beginnend mit einer Sequenz irgendwo zwischen Val40 bis Pro88. Lösliche LT-β-Polypeptide können jede Anzahl an gut bekannten Leader-Sequenzen am N-Terminus beinhalten. So eine Sequenz würde den Peptiden erlauben, exprimiert und auf den Sekretionsweg in einem eukaryontischen System gelenkt zu werden. Vgl. z. B. Ernst et al., Patent Nr. 5,082,783 der Vereinigten Staaten (1992).
  • Lösliche heteromere LT-α/β-Komplexe können durch Co-Transfektion einer geeigneten Wirtszelle mit LT-α und lösliches LT-β codierender DNA hergestellt werden (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, S. 79–89 (1994)). Lösliches LT-β, das in der Abwesenheit von LT-α abgesondert wird, ist hoch oligomerisiert. Wenn es jedoch mit LT-α coexprimiert wird, wird eine 70 kDa trimerähnliche Struktur gebildet, die beide Proteine enthält. Es ist ebenfalls möglich, lösliche heteromere LT α/β-Komplexe durch Transfektion einer Zell-Linie, die normalerweise nur LT-α exprimiert (wie die RPMI 1788-Zellen, die vorstehend diskutiert wurden), mit einem Gen, das ein lösliches LT-β-Polypeptid codiert, herzustellen.
  • LT-α- und LT-β-Polypeptide können getrennt synthetisiert werden, unter der Verwendung von milden Detergenzien denaturiert, zusammen gemischt und durch Entfernung des Detergenz renaturiert werden, um gemischte heteromere LT-Komplexe zu erzeugen, die getrennt werden können (vgl. Nachstehendes).
  • Reinigung der LT α1/β2-Komplexe
  • Lösliche heteromere LT-α1/β2-Komplexe werden von Co-Expressions-Komplexen, die eine Stöchiometrie aus verschiedenen Untereinheiten umfassen, durch Chromatographie unter Verwendung von TNF- und LT-β-Rezeptoren als Affinitäts-Reinigungs-Reagenzien getrennt. Die TNF-Rezeptoren binden nur innerhalb von α/α-Spalten von LT-Komplexen. Der LT-β-Rezeptor bindet mit hoher Affinität an β/β-Spalten und mit niedrigerer Affinität an α/β-Spalten von heteromeren LT-α/β-Komplexen. Folglich werden LT-α3 und LT-α2/β1 an TNF-R binden. Der LT-β-R kann ebenfalls LT-α1/β2-Trimere (innerhalb der. α/β Spalten) binden, aber nicht LT-α3. Zusätzlich bindet der LT-β-R (aber nicht TNF-R) LT α1/β2 und LT-βn (die genaue Zusammensetzung von solchen Präparationen ist unbekannt, es handelt sich jedoch um große Aggregate).
  • Die Rezeptor Affinitäts-Reagenzien können entweder als lösliche extrazelluläre Domäne (vgl. z. B. Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, S. 18324–29 (1991)) hergestellt werden, oder als chimäre Proteine mit Kopplung der extrazellulären Liganden-Bindungsdomäne an eine Immunglobulin Fc-Domäne (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, S. 18324–29 (1991); Crowe et al., Science, 264, S. 707–710 (1994)). Die Rezeptoren sind an Affinitätsmatrizen durch chemische Querverknüpfung unter Verwendung von Routineverfahren gekoppelt.
  • Es gibt zwei Schemata, durch die der LT-α1/β2-Ligand unter der Verwendung von Rezeptoren und Immuno-Affinitätschromatographie gereinigt werden kann. Im ersten Schema wird ein Überstand von einem geeigneten Expressionssystem, das sowohl LT-α als auch die verkürzte LT-β Form gemeinsam exprimiert, über eine TNF-R-Säule gegeben. Der TNF-R wird LT-α3- und LT-α2/β1-Trimere binden. Der Durchfluss von der TNF-R-Säule wird LT-β(n) und LT-α1/β2 enthalten.
  • Im zweiten Schema werden alle LT-β enthaltenden Formen (LT-β(n), LT-α1/β2 und LT-α2/β1) gebunden und von einer LT-β-R-Säule unter der Verwendung klassischer Methoden wie chaotrope oder pH-Wert-Änderung eluiert (LT-α3 fließt durch diese Säule). Das Eluat wird neutralisiert oder das chaotrope Mittel entfernt, und das Eluat wird dann über eine TNF-R-Säule gegeben, die nur die LT-α2/β1-Trimere bindet. Der Durchfluss dieser Säule wird LT-β(n)- und LT-α1/β2-Trimere enthalten.
  • In beiden Fällen können reine LT-α1/β2-Trimere von LT-β durch nachfolgende, auf dem Fachgebiet bekannte Gelfiltrations- und/oder Ionenaustausch-Chromatographie-Verfahren getrennt werden.
  • Alternativ können verschiedene Formen von heteromeren LT-α/β-Komplexen auf eine Reihe von konventionellen, chromatographischen Wegen getrennt und gereinigt werden. Es kann auch bevorzugt werden, eine Reihe von konventionellen Reinigungs-Schemata mit einem der vorstehend beschriebenen Immunoaffinitäts-Reinigungsschritten zu kombinieren.
  • Quelle der Anti-LT-β-R-Antikörper
  • Polyclonale, gegen den menschlichen LT-β-Rezeptor gerichtete Antikörperseren werden unter Verwendung konventioneller Techniken durch subcutane Injektion eines menschlichen LT-β Rezeptor-Fc-Fusionsproteins (Beispiel 2) in kompletten Freundschen Adjuvans in Tiere wie Ziegen, Kaninchen oder Mäuse, gefolgt von einer intraperitonealen oder subcutanen Booster-Injektion in kompletten Freundschen Adjuvans, hergestellt. Die die gewünschten, gegen den LT-β-Rezeptor gerichtete Antikörper enthaltenden polyclonalen Seren werden durch herkömmliche Verfahren überprüft.
  • Monoclonale, gegen ein menschliches LT-β-Rezeptor-Fc-Fusionsprotein gerichtete Maus-Antikörper (mAk) werden durch wiederholte intraperitoneale Immunisierung von RBF-Mäusen mit einem von CHO-Zellen stammenden rekombinanten LT-β-Rezeptor-Fc-Fusionsprotein (LT-β-R-Fc), das an Protein A-Sepharosekügelchen geknüpft ist, in Abwesenheit von Adjuvans hergestellt. Bei den Tieren wird schließlich mit löslichem LT-β-R-Fc (sowohl i. p., als auch i. v.) eine Boosterung durchgeführt, die Milzzellen werden unter Verwendung klassischer Verfahren verschmolzen und die Hybridome durch ELISA getestet (Ling et al., J. Interferon and Cytokine Res., 15, S. 53–59 (1995)). Die Hybridome wurden weiterhin auf ihre Fähigkeit, die Bindung von aktivierten II-23-Hybridomzellen – die Oberflächen-LT-α1/β2 exprimieren – an LT-β-R-Fc beschichtete Platten zu blockieren, in einem Zell-Panning-Test überprüft. Reine mAk werden durch Protein A-Sepharose-Reinigung von IgG aus Hybridomkultur-Überständen hergestellt.
  • Verschiedene Formen von anti-LT-β-R-Antikörpern können ebenfalls unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinations-Techniken hergestellt werden (Winter und Milstein, Nature, 349, S. 293–99 (1991)). Es können z. B. „chimäre" Antikörper konstruiert werden, in denen die Antigen-Bindungs-Domäne von einem tierischen Antikörper an eine konstante menschliche Domäne geknüpft ist (z. B. Cabilly et al., US 4,816,567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, S. 6851–55 (1984)). Chimäre Antikörper reduzieren die beobachteten immunogenen Antworten, die durch tierische Antikörper bei der Verwendung in klinischen Behandlungen von Menschen hervorgerufen werden.
  • Zusätzlich können rekombinante „humanisierte Antikörper", die den LT-β-R erkennen, synthetisiert werden. Humanisierte Antikörper sind Chimären, die größtenteils menschliche IgG-Sequenzen beinhalten, in die die Bereiche, die für die spezifische Antigen-Bindung verantwortlich sind, inseriert wurden (z. B. WO 94/04679). Es werden Tiere mit dem gewünschten Antigen immunisiert, die entsprechenden Antikörper werden isoliert, und der Anteil an Sequenzen des variablen Bereichs, die für die spezifische Antigen-Bindung verantwortlich sind, wird entfernt. Die aus Tieren stammenden Antigen-Bindungs-Bereiche werden dann in die geeignete Position des menschlichen Antikörper-Genes, in dem die Antigen-Bindungsbereiche deletiert wurden, cloniert. Humanisierte Antikörper minimieren die Verwendung von heterologen Sequenzen (zwischen den Spezies) in menschlichen Antikörpern und werden weniger wahrscheinlich im behandelten Patienten Immunantworten hervorrufen.
  • Die Konstruktion verschiedener Klassen rekombinanter anti-LT-β-R-Antikörper kann ebenfalls durch die Herstellung von chimären oder humanisierten Antikörpern erreicht werden, die variable anti-LT-β-R-Domänen und menschliche konstante Domänen (CHI, CH2, CH3), die von verschiedenen Klassen von Immunglobulinen isoliert wurden, enthalten. z. B. können anti-LT-β-R-IgM-Antikörper, mit erhöhten Valenzen der Antigen-Bindungsstellen, rekombinant durch Clonierung der Antigen-Bindungsstelle in Vektoren, die die Bereiche der konstanten Regionen der menschlichen μ Kette tragen, hergestellt werden (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, S. 1439–50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, S. 2573–78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, S. 68–70 (1989)).
  • Außerdem können Standard-Techniken der DNA-Rekombination verwendet werden, um die Bindungs-Affinitäten der rekombinanten Antikörper zu ihren Antigenen durch Abänderung von Aminosäureresten in der Nähe der Antigen-Bindungs-Stellen zu verändern. Die Antigen-Bindungs-Affinität eines humanisierten Antikörpers kann durch auf molekularem Modulieren basierender Mutagenese erhöht werden (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, S. 10029–33 (1989); WO 94/04679).
  • Es kann erwünscht sein, die Affinität von anti-LT-β-R-Ak für den LT-β-R zu erhöhen oder zu senken, abhängig vom Zielgewebetyp oder des besonderen, ins Auge gefassten Behandlungsplans. Es kann z. B. in der Verwendung der Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 2 bis 6 vorteilhaft sein, einen Patienten mit konstanten Spiegeln an anti-LT-β-R-Ak mit reduzierter Fähigkeit zur Signalgebung durch den LT-β-Weg für halb-prophylaktische Behandlungen zu behandeln. Ebenso können anti-LT-β-R-Ak mit erhöhter Affinität für den LT-β-R für kurzzeitige, Tumor-gerichtete Behandlungen vorteilhaft sein.
  • Überprüfung von anti-LT-β-R-Antikörpern auf LT-β-R aktivierende Agenzien
  • Die anti-LT-β-R-Antikörper dieser Erfindung können die anti-Tumor-Aktivität von heteromeren LT-α/β-Komplexen (bevorzugt LT-α1/β2) in der Anwesenheit eines LT-β-R aktivierenden Agens wie IFN-γ verstärken. Diese anti-LT-β-R-Antiköper werden hierin auch als LT-β-R aktivierende Agenzien bezeichnet. Die Antikörper, die als LT-β-aktivierende Agenzien wirken, werden wie folgt ausgewählt:
    • 1) Eine Reihe von Gewebekultur-Vertiefungen, die Tumorzellen wie HT29 enthalten, werden für drei bis vier Tage in ein LT-β-R aktivierendes Agens wie IFN-γ und gereinigten heteromeren LT-α/β-Komplex – vorzugsweise LT-α1/β2 – enthaltenden Medien in der An- oder Abwesenheit von Verdünnungsreihen der getesteten anti-LT-β-R-Ak kultiviert;
    • 2) Ein Vitalfarbstoff, der die mitochondriale Funktion misst, wie MTT wird zum Zellgemisch zugegeben und wird für mehrere Stunden umgesetzt;
    • 3) Die optische Dichte des Gemisches in jeder Vertiefung wird bei Licht der Wellenlänge 550 nm (OD 550) quantifiziert. Die OD 550 ist umgekehrt proportional der Anzahl, der in jeder Vertiefung getöteten Tumorzellen in Anwesenheit des heteromeren LT-α/β-Komplexes, des LT-β-R aktivierenden Agens und des anti-LT-β-R-Test-Ak.
  • Die bevorzugten Antikörper dieser Erfindung, die einzeln als LT-β-R aktivierende Agenzien in Anwesenheit von LT-α1/β2 und IFN-γ agieren, umfassen die anti-LT-β-R mAk BKA11, CDH10, BHA10 und BCG6 (Tabelle 2, nachstehend).
  • Quer verknüpfende Anti-LT-β-R-Antikörper
  • Die quer verknüpften anti-LT-β-R-Antikörper dieser Erfindung agieren einzeln als LT-β-R aktivierende Agenzien ohne exogene heteromere LT-α/β-Komplexe in Anwesenheit eines zweiten LT-β-R aktivierenden Agens wie IFN-γ. Quer verknüpfte anti-LT-β-R Ak binden anscheinend an Zelloberflächen-LT-β-Rezeptoren und induzieren deren Clusterbildung und aktivieren dabei einen LT-β vemittelten, zielgerichteten Zelltod.
  • In einer Ausführungsform werden ein oder mehrere Typen von anti-LT-β-R-Antikörper durch Immobilisation auf einer wasserunlöslichen Matrix oder Oberfläche quer verknüpft. Derivatisierung mit einem bifunktionellen Agens ist für die über Querverknüpfung der Antikörper mit der wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche nützlich. Die normalerweise verwendeten Agenzien zur Querverknüpfung von Antikörpern mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche umfassen 1,1-Bis-(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinamidester einschließlich Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschließlich Disuccinimidylester und bifunktionelle Maleimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierende Agenzien wie Methyl-3-[(p-azidophenyldithiopropioimidat erzeugen photoaktivierbare Zwischenprodukte, die selektiv quer verknüpft werden können, wenn sie mit Licht stimuliert werden. Reaktive wasserunlösliche Matrizes wie Cyanbromid aktivierte Kohlenwasserstoffe und die in den Patenten Nr. 3,959,080; 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 4,055,635; und 4,330,440 der Vereinigten Staaten beschriebenen Substrate können ebenfalls zur Protein-Immobilisierung und Querverknüpfung verwendet werden.
  • Die Oberflächen, mit denen die Antikörper verbunden werden, können nicht proteinartige Polymere, üblicherweise ein hydrophiles Polymer, entweder aus natürlichen oder synthetischen Quellen, sein. Hydrophile Polyvinyl-Polymere wie Polyvinylalkohol (PVA) und Polyvinylpyrrolidon (PVP) können verwendet werden. Ebenso nützlich sind Polyalkylen-Ether wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyethylenester oder Methoxypolyethylenglykol, Polyoxyalkylene wie Polyoxyethylen und Polyoxypropylen und Block-Copolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethacrylate; Carbomere, verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, die die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose; D-Glukuronsäure, Sialinsäure; D-Galakturonsäure, D-Mannuronsäure (z. B. Poly-Mannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure umfassen, einschließlich Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide wie Lactose, Amylopektin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glycogen oder die Polysaccharid-Untereinheit der sauren Mucopolysaccharide, z. B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen wie Polysorbit und Polymannit; und Heparin oder Heparon.
  • Vor der Querverknüpfung ist das Polymer bevorzugt wasserlöslich und enthält vorzugsweise nur eine einzelne reaktive chemische Gruppe, um multiple quer verknüpfende Ereignisse mit dem Antikörper zu vermeiden. In jedem Fall sollten die Reaktionsbedingungen optimiert werden, um eine Querverknüpfung zu reduzieren und um die Produkte zu gewinnen – entweder direkt oder durch einen nachfolgenden Gelfiltrations- oder Chromatographieschritt-, die im wesentlichen einen homogenen Molekulargewichtsbereich aufweisen. Das optimale Molekulargewicht der quer verknüpften Antikörper-Matrix wird durch Routine-Versuche unter Verwendung der hierin offenbarten Cytotoxizitäts- und Rezeptor-Bindungs-Tests, bestimmt werden.
  • Das End-Konjugat nach der über Querverknüpfung ist vorzugsweise in physiologischen Flüssigkeiten wie Blut löslich. Das Polymer sollte in der Konjugat-Form nicht sehr immunogen sein und sollte eine mit einer intravenösen Infusion oder Injektion vereinbare Viskosität besitzen, wenn dies ein beabsichtigter Weg der Verabreichung ist.
  • Das Polymer kann außerdem wasserunlöslich sein. Stoffe, die verwendet werden können, umfassen hydrophile Gele oder geformte Gegestände, die Oberflächen besitzen, an denen die Antikörper immobilisiert werden können, wie chirurgische Röhrchen, Katheder oder Dränage-Röhren. Die Verwendung fester Trägerstoffe, die biologisch verträglich und im Wesentlichen inaktiv in physiologischen Umgebungen sind, wird bevorzugt. Ein Stoff ist biologisch verträglich, wenn er keine wesentlichen Immunantworten einschließlich einer Entzündung stimuliert oder fibrotische Zellen anzieht, wenn er im Körper eines Patienten platziert wird.
  • Anti-LT-β-R-Ak können auch auf Oberflächen immobilisiert werden, die kovalent oder nicht kovalent mit zweiten Antikörpern, die an die ersten anti-LT-β-R-Ak (z. B. Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper; vgl. Beispiel 7) binden werden, beschichtet wurden. Jeder einzeln getestete anti-LT-β-R-mAk agiert als ein LT-β-R aktivierendes Agens in Anwesenheit von IFN-γ, wenn er auf Oberflächen mit zweiten Antikörpern immobilisiert ist (4 und 7).
  • In einer alternativen Ausführungsform agieren quer verknüpfte anti-LT-β-R-Ak in Lösung als LT-β-R aktivierende Agenzien. Anti-LT-β-R-Ak können mittels eines anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) quer verknüpfenden Agens, quer verbunden werden. Ein anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) quer verknüpfendes Agens gemäß dieser Erfindung ist jedes Agens, das entweder in der Lage ist, die anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) in Lösung kovalent zu verknüpfen oder nicht kovalent zu vereinigen, so dass die quer verknüpften anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) an Zelloberflächen-LT-β-R binden und die zielgerichtete Zelloberflächen-LT-β-R-Clusterbildung ermöglichen können. Solche Anti-LT-β-R-Ak (oder mAk) quer verknüpfenden Agenzien schließen chemische quer verknüpfende Reagenzien, die mit den Antikörpern in einer kontrollierten Art, wie vorstehend beschrieben, zur Reaktion gebracht werden können, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Alternativ können zweite Antikörper, Sepharose A, Fc-Rezeptoren oder andere Agenzien, die multiple erste anti-LT-β-R-Ak binden und vereinigen, ohne ihre Aktivität zu blockieren, verwendet werden, um anti-LT-β-R-Ak-Agglomerate in Lösung zu erzeugen.
  • Multiple anti-LT-β-R-Ak in Lösung agieren als LT-β-R aktivierende Agenzien
  • Durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, die multiple anti-LT-β-R-Ak in Lösung enthalten, die als LT-β-R aktivierende Agenzien durch das Ermöglichen der Oberflächen-LT-β-R-Clusterbildung agieren, bereitgestellt. Gegen verschiedene Epitope des LT-β-R gerichtete polyclonale anti-LT-β-R-Ak können verwendet werden. Die anti-LT-β-R-Ak sind vorzugsweise monoclonal und sind gegen verschiedene und nicht überlappende Epitope des LT-β-R gerichtet.
  • Der kombinierte anti-LT-β-R-mAk Ansatz zur LT-β-Rezeptor-Aktivierung erfordert das Verbinden zweier nicht überlappender Epitope. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass eine leistungsfähige Rezeptor-Aggregation nur mit bestimmten Epitopen erreicht wird. Wir haben die Abwesenheit mindestens vier einmaliger LT-β-R immunreaktiver Epitope identifiziert. Zusätzliche Epitope (wie durch neue mAk definiert) können durch das Fortsetzen, immunisierte Maus-Milzzellen zu fusionieren, durch die Immunisierung verschiedener Tierarten und durch die Verwendung verschiedener Wege der Immunisierung, identifiziert werden.
  • Epitope können ebenfalls direkt durch die Bewertung der Fähigkeit verschiedener mAk, miteinander um die Bindung an den LT-β-R zu konkurrieren, unter Verwendung der BIAcore-Chromatographie-Techniken (Pharmacia BIATechnologie Handbuch, „Epitope Mapping", Abschnitt 6.3.2, (Mai 1994); vgl. auch Johne et al., J. Immunol. Methods, 160, S. 191–8 (1993)), kartiert werden.
  • Einzelne LT-β-R-mAk können nach ihrer Fähigkeit, in Kombination mit anderen LT-β-R-mAk beim Abtöten von Tumorzellen in cytolytischen Tests (Beispiel 8; Tabelle 1) zusammenzuarbeiten, in mindestens vier Klassen gruppiert werden. z. B. wirkt der BDA8-mAk in Gruppe I nicht in Kombination mit dem AGH1-mAk in Gruppe I, um die Tumorzell-Cytotoxizität zu fördern. Ebenso kooperieren die Gruppe III-BKA11- und -CDH10-mAk in einem Tumorzell-Cytotoxizitätstest nicht.
  • 5A–5C zeigt die Wirkungen der Verabreichung repräsentativer anti-LT-β-R-mAk allein und in paarweiser Kombination an Tumorzellen in Cytotoxizitätstests in Anwesenheit von IFN-γ als einem LT-β-R aktivierenden Agens. Der Gruppe IV-anti-LT-β-R-mAk CBE11 hat, allein verwendet, einen leichten cytotoxischen Effekt, der in Kombination mit dem Gruppe II-mAk BHA10 (5A) gesteigert wird. CBE11 ruft einen ähnlichen Effekt mit dem Gruppe III-mAk CDH10 (5B) hervor.
  • Die durch die Verabreichung einer Kombination von anti-LT-β-R-mAk in Lösung verursachte Cytotoxizität ist keine Besonderheit der HT29-Tumorzell-Linie. 5C zeigt, dass der Gruppe I-AGH1-mAk and der Gruppe III-CDH10-mAk synergistisch beim Abtöten zweier verschiedener, von menschlichen Adenokarzinom-Tumoren stammenden Tumorzell-Linien (HT29-Zellen und WiDr-Zellen) agieren.
  • Zusammenfassung der Anti-LT-β-R-mAk-Charakteristika
  • Alle anti-LT-β-R-mAk dieser Erfindung agieren, wenn sie durch Immobilisierung quer verknüpft sind, als LT-β-R aktivierende Agenzien in der Anwesenheit eines zweiten LT-β-R aktivierenden Agens wie IFN-γ. Die Fähigkeit von anti-LT-β-R-mAk als LT-β-R aktivierende Agenzien in der An- oder Abwesenheit von LT-α1/β2 in Lösung zu agieren, variiert oft in Abhängigkeit von dem Stadium der Zellen zum Zeitpunkt des Tests. Tabelle 2, nachstehend, fasst die Eigenschaften der durch diese Erfindung charakterisierten anti-LT-β-R-mAk zusammen.
  • Die Gruppe I-mAk BDA8 und AGH1 funktionieren nicht als LT-β-R aktivierende Agenzien in Lösung mit LT-α1/β2. Der BDA8-mAk blockiert sogar den anti-Tumor Effekt von LT-α1/β2 (3B und Tabelle 2). Im Gegensatz dazu, besitzen die Gruppe II-anti-LT-β-R-mAk BCG6 und BHA10 gemischte agonistische und antagonistische Wirkungen, wenn sie mit LT-α1/β2 verabreicht werden. Die Gruppe III anti-LT-β-R-mAk BKA11 und CDH10 sind einmalig in ihrer Fähigkeit, als LT-β-R aktivierende Agenzien zu agieren, die anti-Tumor-Effekte in Anwesenheit von LT-α1/β2 und einem zweiten LT-β-R aktivierendem Agens wie IFN-γ verstärken, ohne die antagonistischen Wirkungen, die oft mit den Gruppe II-mAk BCG6 und BHA10 gesehen werden, aufzuweisen.
  • Es ist wichtig in Erinnerung zu behalten, dass die Klassifizierung der anti-LT-β-R-mAk, die auf ihrer Fähigkeit basiert, in Tumorzell-Cytotoxizitätstests zusammenzuarbeiten, widerspiegelt, dass sie mit verschiedenen Epitopen auf dem LT-β-R interagieren. Die mAk, die von einer einzelnen Gruppe umfasst werden, besitzen jedoch nicht notwendigerweise die gleichen Bindungsaffinitäten für ihre verwandten Epitope. Deshalb können die unterschiedlichen Ergebnisse beim Vergleich der Wirkungen von verschiedenen mAk, die zur selben oder zu verschiedenen Gruppen gehören, Unterschiede in den Bindungsaffinitäten darstellen. Demzufolge ist es möglich, dass ein Gruppe I- oder ein Gruppe IV-mAk mit einer höheren Bindungsaffinität für den LT-β-R isoliert werden könnte, der wie die Gruppe III-mAk wie ein LT-β-R aktivierendes Agens in der Anwesenheit von LT-α1/β2 funktionieren würde.
  • Die Hybridomzell-Linien oder Subclone davon, die die vorstehend beschriebenen anti-LT-β-R-mAk produzieren, wurden am 12. Januar, 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt, und ihnen wurden die wie folgenden ATCC-Eingangsnummern zugewiesen:
  • Figure 00220001
  • Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit der vorstehenden ATCC-Hinterlegungen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich bei Bewilligung eines Patents dieser Anmeldung beseitigt werden.
  • Monoclonale Anti-LT-β-R-IgM Antikörper fungieren als LT-β-R aktivierende Agenzien
  • Anti-LT-β-R-mAk, die mehr als die üblichen zwei IgG-Antigen-Bindungsstellen umfassen, werden ebenfalls in Lösung als Zelloberflächen-LT-β-R quer verknüpfende Agenzien fungieren und werden demzufolge in den Bereich der Definition eines LT-β-R aktivierenden Agens gemäß dieser Erfindung fallen. Die Antigen-Bindungstellen eines anti-LT-β-R-mAk können in IgM-Moleküle eingebaut werden – die zehn Antigen-Bindungsstellen besitzen – unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinations- und -Hybridom-Techniken (Beispiel 12).
  • Alternativ kann man vollständige Maus-(oder andere tierische)IgM-Moleküle gewinnen und anreichern, die durch Hybridom-Fusions-Techniken nach einer einzelnen Immunisierung mit Antigen isoliert wurden. Ein Weg, IgM-Moleküle anzureichern, wäre, CD40-Signalgebungsdefiziente Mäuse (Kawabe et al., Immunity, 1, S. 167–78 (1994); Xu et al., Immunity, 1, S. 423–31 (1994)) zu immunisieren. Diese Mäuse können IgGs nicht effizient produzieren, und deshalb reichern sie als Antwort auf einen Antigenreiz IgM-Isotypen an.
  • Anti-LT-β-R-IgM-Antikörper können, auf Grund ihrer erhöhten Valenzen, effektiv LT-β-R Moleküle innerhalb der Membranebene aggregieren und die LT-β-R-Signalgebung, verglichen zu ihren IgG-Gegenstücken, die zwei Antigen-Bindungs-Stellen besitzen, verstärken. Ein dramatisches Beispiel für die erhöhte Effektivität von multivalenten Antikörpern in der Rezeptor-Clusterbildung wird mit Antikörpern gegen den Fas-Rezeptor gesehen, wobei die IgM-Form sehr wirksam ist und normale bivalente IgGs in Lösung nicht wirksam sind (Yonihara und Yonihara, J. Exp. Med., 169, S. 1747–56 (1989); Alderson et al., Int. Immunol., 6, S. 1799–1806 (1994)).
  • Ebenso ist der apo-1-mAk gegen den Fas Rezeptor ein IgG3-mAk. Dieser mAk ist ein starkes cytotoxisches Agens, das sich auf für IgG3-Subtypen einmalige Fc-Wechselwirkungen stützt, um in größere polyvalente Formen zu aggregieren. Das Entfernen des Fc-Bereichs erzeugt eine F(ab)2-Form, die sich nicht zu größeren Aggregaten zusammenlagern kann und die inaktiv ist (Dhein et al., J. Immunol., 149, S. 3166–73 (1992)). Deshalb wird analog vorhergesagt, dass IgM-Versionen der anti-LT-β-R-mAk starke anti-Tumor-Agenzien sein werden.
  • Anti-LT-β-R-mAk hemmen Tumorwachstum in Mäusen
  • Die Fähigkeit eines LT-β-R aktivierenden Agens wie eines anti-LT-β-R-mAk, das Wachstum menschlicher Tumorzellen in vitro zu hemmen (Beispiele 6–8 und 13) kann auf eine antitumorigene in vivo-Aktivität hinweisen. In immundefizienten Mäusen (SCID) durchgeführte Experimente zeigen, dass ein anti-LT-β-R-mAk (CBE11) effizient Tumorbildung durch menschliche Adenokarzinom-WiDr-Zellen hemmen kann (Beispiel 14; 6). Mit WiDr-Zellen subcutan (s. c.) inokulierte Mäuse bilden messbare Tumore innerhalb von zwei Wochen. Wenn die Mäuse i. p. mit dem CBE11-mAk zur gleichen Zeit wie die s. c.-Inokulation mit den WiDr-Zellen behandelt wurden, wurde der Tumorwuchs dramatisch gehemmt (6A). Die anti-Tumor-Wirkung des CBE11-anti-LT-β-R-mAk wurde durch Zugabe von IFN-γ verstärkt; CBE11 war jedoch sogar ohne exogenes IFN-γ effektiv. In der CBE11 + IFN-γ-Gruppe wiesen 7 von 16 Tieren überhaupt keine Tumore auf, wohingegen die verbleibenden Tiere kleine Knötchen, die nach 2 Monaten nicht fortgeschritten waren, aufwiesen. Die mit CBE11 allein behandelten Mäuse waren der CBE11 + IFN-γ-Gruppe nach 30 Tagen ähnlich. Die mit CBE11 allein behandelten Mäuse entwickelten dagegen schließlich langsam wachsende Tumore. Es gab statistisch signifikante Unterschiede zwischen den CBE11 (+/– IFN-γ)-Gruppen und den Kontrollgruppen (Kochsalzlösung, IFN-γ allein und anti-Mensch-LFA-3-Kontroll-mAk (1E6) + IFN-γ), aber keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen. Die 1E6- und CBE11-mAk sind beide IgG1-Antikörper. Der 1E6-mAk umhüllt wirksam die Tumorzellen, hemmt aber nicht das Tumorwachstum. Daher sind Komplement oder von natürlichen Killerzellen vermittelte Ereignisse nicht die einzige Basis für die anti-Tumorwirkung des CBE11-anti-LT-β-R-mAk.
  • Die Wirksamkeit des CBE11-mAk, Tumorwachstum in vivo in der Anwesenheit von exogenem IFN-γ zu hemmen, war unerwartet, da es eine Abhängigkeit von IFN-γ für messbare auf LT-β-R basierende cytotoxische Effekte in vitro gab. Entweder liegt eine gewisse Kreuzreaktion zwischen Maus-IFN-γ und menschlichen IFN-γ-Rezeptoren vor, oder andere Mechanismen können in vivo beteiligt sein.
  • Der CBE11-anti-LT-β-R-mAk kann ebenfalls das Wachstum eines etablierten Tumors in Mäusen hemmen (6B). Mäuse wurden s. c. mit menschlichen WiDr-Adenokarzinomzellen am Tag 1 inokuliert, und die Tumore konnten sich 15 Tage entwickeln (Beispiel 14). Die Tumore, die in den Tieren mit IFN-γ i. p. oder mit dem Kontroll-anti-Mensch-LFA-3-mAk (1E6) + IFN-γ behandelt wurden; setzten die Größenzunahme über den Verlauf des 7-wöchigen Experiments fort. Im Gegensatz dazu hörten die mit dem CBE11-anti-LT-β-R-mAk (+ IFN-γ oder alleine) behandelten Tumore das Wachsen auf und nach drei folgenden Injektionen von CBE11-Antikörper über ein Zeitraum von drei Wochen fand kein Tumorwachstum bis zu 49 Tagen post-inokulum, als das Experiment beendet wurde, statt (6B).
  • Diese Experimente zeigen, dass ein anti-LT-β-R-mAk, der die LT-β-R-Signalgebung aktiviert, wirksam eine Tumorbildung in frühen Stadien hemmen kann und außerdem fortgesetztes Tumorzell-Wachstum in späteren Stadien der Tumorgenese in vivo blockieren kann. Diese Experimente zeigen ebenfalls, dass die Verabreichung eines einzelnen LT-β-R aktivierenden Agens wirksam für die Behandlung oder Reduzierung des Wachstums, der Schwere oder der Wirkungen von Neoplasie in einem betroffenen Tier sein kann.
  • Die in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um LT-β-R aktivierende Agenzien gemäß dieser Erfindung zu identifizieren, die allein oder in Kombination funktionieren, um Tumorzell-Wachstum in vivo zu hemmen. Man stellt sich vor, dass andere LT-β-R aktivierende Agenzien – einschließlich, aber nicht auf jene beschränkt, die unter Verwendung von in vitro Tumorzell-Cytotoxizitäts-Tests identifiziert wurden – ähnliche Anti-Tumor Wirkungen in vivo besitzen, wenn sie allein oder in Kombination Tieren oder Menschen verabreicht werden.
  • Die Verwendung von IFN-γ und anderen LT-β-R aktivierenden Agenzien
  • Die cytotoxischen Effekte von heteromeren LT-α/β-Komplexen und von quer verknüpften oder multiplen anti-LT-β-R-Ak auf Tumorzellen wird durch die Anwesenheit eines LT-β-R aktivierenden Agens, insbesondere IFN-γ, verstärkt. Von menschlichen Adenokarzinomzellen intestinalen Ursprungs (HT29-Zellen) wurde kürzlich gezeigt, dass sie sensitiv gegenüber einer FasR-Signalgebung sind (Yonehara und Yonehara, J. Exp. Med., 169, S. 1747–56 (1989)); und gegenüber TNF und LT-α in Anwesenheit von IFN-γ (Browning et al., J. Immunol., 143, S. 1859–67 (1989)).
  • In den Anwendungen der Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 2–6 und 9 wird die Menge an LT-β aktivierendem Agens, die erforderlich ist, um die anti-Tumor-Aktivität heteromerer LT-α/β-Komplexe, anti-LT-β-R-Ak oder anderer LT-β-R aktivierender Agenzien dieser Erfindung zu steigern, vom Zell- oder Gewebe-Typ, der behandelt wird, und auch von der Art der Behandlung abhängen und kann empirisch unter Verwendung von Routineverfahren bestimmt werden. Das LT-β-R aktivierende Agens kann bei einer Konzentration bereitgestellt werden oder in einem Verhältnis geliefert werden, die oder das in Verbindung mit anderen verabreichten LT-β-R aktivierenden Agenzien in Anbetracht der vorstehend aufgelisteten Faktoren als wirksam bestimmt wurde.
  • Alternativ kann sich auf endogene LT-β-R aktivierende Agenzien wie Interferone, z. B. IFN-γ, die durch den Zieltumor umgebende Zellen oder Gewebe produziert werden, gestützt werden. Endogenes IFN-γ wird normalerweise nach einer viralen Infektion produziert und wird ebenfalls in der Nähe von Tumoren gefunden (Dinge et al., Immunity, 1, S. 447–56 (1994)).
  • Jedes Agens, das in der Lage ist, Interferone, vorzugsweise IFN-γ, zu induzieren und die cytotoxischen Effekte heteromerer LT-α/β-Komplexe und anti-LT-β-R-mAk auf Tumorzellen verstärkt, fällt in die Gruppe LT-β-R aktivierender Agenzien dieser Erfindung. Während eine Virusinfektion normalerweise eine IFN-γ-Produktion induziert, können die Spiegel an endogenem IFN-γ durch andere Agenzien erhöht werden (Beispiel 10). Z. B. haben klinische Experimente eine Interferon-Induktion durch Behandlung mit Doppelstrang-RNA (dsRNA) gezeigt. Folglich sind Polyriboguanyl/Polyribocytidylsäure (Poly-rG/rC) und andere Formen von dsRNA als Interferon-Induktoren wirksam (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, S. 107–11 (1992)).
  • Der Interferon-Stimulator von Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, S. 69–74 (1993)) und pharmazeutische Agenzien, von denen viele oral verabreichbar sind, können ebenfalls verwendet werden, um endogene Interferon-Spiegel hochzutreiben. Solche Interferon Induktoren schließen ein: Imiquimod (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, S. 45–55 (1994)); Saparal (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, S. 131–34 (1994)); Arylpyrimidone wie Bropirimin (Onishi und Machida, Hinyokika Kiyo, 40, S. 195–200 (1994)); Ridostin (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, S. 125–28 (1994)).
  • Mehrere dieser Interferon induzierenden Agenzien wurden als Induktoren von Typ I-Interferonen wie IFN-α charakterisiert. Typ I-Interferone können auch als LT-β-R aktivierende Agenzien fungieren, sind aber weniger wirksam wie IFN-γ.
  • Behandlungen unter Verwendung von LT-α/β-Komplexen und LT-β-R aktivierender Agenzien
  • In den Anwendungen der Zusammensetzungen werden die Zusammensetzungen bei einer wirksamen Dosis verabreicht, um den klinischen Zustand, an den sie sich richten, zu behandeln. Die Bestimmung einer bevorzugten pharmazeutischen Formulierung und eines therapeutisch wirksamen Dosis-Schemas für eine gegebene Anwendung ist Stand der Technik, wobei z. B. der Zustand und das Gewicht des Patienten, der Umfang der gewünschten Behandlung und die Toleranz des Patienten für die Behandlung berücksichtigt werden.
  • Typischerweise können Menschen bis zu 100 bis 200 μ/m2 TNF tolerieren, bevor sich eine ernsthafte Toxizität manifestiert (Schiller et al., Cancer Res., 51, S. 1651–58 (1991)). In Mäusen verursachten Dosierungen im Bereich von 1–5 μg/Maus/Tag, gegeben mit 5 × 104 Einheiten rekombinantem menschlichem IFN-γ, eine Regression menschlicher Primärtumore (Balkwill et al., CIBA Foundation Symposium (1987); Havell et al., J. Exp. Med., 167, S. 1067–85 (1988)). Basierend auf der relativen Wirksamkeit von TNF und LT-α1/β2 in den cytolytischen HT29-Tests werden etwa 5–25 μg/Maus/Tag von LT-α1/β2 einen therapeutischen Dosisbereich liefern. Auf den Menschen extrapoliert wird erwartet, dass LT-α1/β2-Dosen von mindestens 1 mg/m2 in Kombination mit einem LT-β-R aktivierendem Agens wie IFN-γ erforderlich sein werden.
  • Ursprünglich wurde eine IFN-γ-Therapie entweder beim Maximum tolerierter Dosen im Bereich von 100–250 μg/m2 oder bei „immunmodulierenden" Spiegeln im Bereich von 10–25 μg/m2 (vgl. z. B. Kopp et al., J. Immunother., 13, S. 181–90 (1993)) unternommen. Kombinationstherapien mit zwei Interferonen haben 4 × 106 Einheiten/m2 von IFN-α und etwa 250 μg/m2 IFN-γ verwendet (Niederle et al., Leuk. Lymphoma, 9, S. 111–19 (1993)). Von dazwischenliegenden Dosen von etwa 25–100 μg/m2 IFN-γ in Kombination mit den heteromeren LT-α/β-Komplexen oder hierin beschriebenen gereinigten anti-LT-β-R-Ak wird erwartet, dass sie geeignete Startpunkte für die Optimierung von Behandlungsdosen sind.
  • Die Verabreichung der heteromeren LT-α/β-Komplexe und quer vernetzter anti-LT-β-R-Ak dieser Erfindung, einschließlich isolierter und gereinigter Formen der Antikörper oder Komplexe, ihrer Salze oder pharmazeutisch verträglicher Derivate davon, kann unter Verwendung von herkömmlich anerkannten Arten der Verabreichung von Agenzien, die Anti-Tumor Aktivität zeigen, erreicht werden.
  • Die in diesen Therapien verwendeten Arzneimittel können ebenfalls in einer Reihe von Formen vorliegen. Diese schließen z. B. feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Puder, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen und injizierbare und infundierbare Lösungen ein. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Art der Verabreichung und der therapeutischen Anwendung ab. Die Verabreichungsarten können orale, parenterale, subcutane, intravenöse, intraläsionale oder lokale Verabreichung einschließen.
  • Die heteromeren LT-α/β-Komplexe, IFN-γ und anti-LT-β-R-Ak können z. B. in sterile isotonische Formulierungen mit oder ohne Cofaktoren, die die Aufnahme oder die Stabilität anregen, eingebracht werden. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig oder kann lyophilisierter Puder sein. Z. B. können die LT.-Komplexe und/oder die anti-LT-β-R-Ak und IFN-γ mit einem Formulierungspuffer verdünnt sein, der 5,0 mg/ml Zitronensäuremonohydrat, 2,7 mg/ml Trinatriumcitrat, 41 mg/ml Mannit, 1 mg/ml Glycin und 1 mg/ml Polysorbat 20 enthält. Diese Lösung kann lyophilisiert werden, unter Kühlung gelagert werden und vor der Verabreichung mit sterilem Wasser für Injektionen (USP) rekonstituiert werden.
  • Die Zusammensetzungen werden auch bevorzugt konventionelle, pharmazeutisch verträgliche, im Fachgebiet gut bekannte Träger beinhalten (vgl. z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, 1980, Mac Publishing Company). Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können andere medizinische Agenzien, Trägerstoffe, genetische Träger, Adjuvanzien, Exzipienten, etc., wie menschliches Serumalbumin oder Plasmapräparationen einschließen. Die Zusammensetzungen liegen bevorzugt in Form einer Einheitsdosis vor und werden üblicherweise einmal oder mehrmals am Tag verabreicht.
  • Die Arzneimittel in ihrer Verwendung gemäß den Ansprüchen 2–6 und 9 können auch unter Verwendung von Mikrosphären, Liposomen, anderen Mikropartikel-Zuführungssystemen oder als Formulierungen mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden, die in nahe oder anderweitig in Verbindung mit betroffenen Geweben oder dem Blutstrom platziert werden. Geeignete Beispiele für Träger mit verzögerter Freisetzung umfassen semipermeable Polymermatrizen in Form von geformten Artikeln wie Suppositorien oder Mikrokapseln. Implantierbare oder mikrokapsuläre Matrizen mit verzögerter Freisetzung schließen Polylactide (U.S.-Patent Nr. 3,773,319; EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, S. 547–56 (1985)); Poly-(2-hydroxyethyl-methacrylat) oder Ethylenvinylacetat (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, S. 167–277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, S. 98–105 (1982)) ein.
  • Heteromere LT-α/β-Komplexe und/oder anti-LT-β-R-Ak und IFN-γ enthaltende Liposome können durch gut bekannte Verfahren hergestellt werden (vgl. z. B. DE 32 18 121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, S. 3688–92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, S. 4030–34 (1980); U.S.-Patent Nr. 4,485,045 und 4,544,545). Gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (circa 200–800 Angström) unilamellären Typ, in dem der Lipidgehalt größer als circa 30 Mol-% Cholesterin ist. Der Anteil von Cholesterin wird entsprechend gewählt, um die optimale Rate der LT-Komplex- und/oder anti-LT-β-R-Ak und IFN-γ-Freigabe zu kontrollieren.
  • Die heteromeren LT-α/β-Komplexe und anti-LT-β-R-Ak dieser Erfindung können auch mit Liposomen verbunden werden, die andere LT-β-R aktivierende Agenzien, chemotherapeutische Agenzien oder IFN-γ enthalten, um das IFN-γ, das typischerweise in dem Bereich des Tumors gefunden wird, zu ergänzen. Das Anheften von LT-Komplexen und anti-LT-β-R-Ak an Liposome kann durch jedes bekannte, quer verknüpfende Agens, wie heterobifunktionelle quer verknüpfende Agenzien, die verbreitet verwendet wurden, um Toxine oder chemotherapeutische Agenzien an Antikörper für eine zielgerichtete Zuführung zu koppeln, erreicht werden. Die Konjugation an Liposome kann auch unter Verwendung des Kohlenwasserstoff-gerichteten quer verknüpfenden Agens 4-(4-Maleimidophenylbuttersäurehydrazid (MPBH) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Zus. Erg. 16E 77 (1992)) erreicht werden.
  • Vorteile von auf anti-LT-β-R-Aktivierung basierenden Arzneimitteln
  • Eine auf LT-β-R-Aktivierung basierende anti-Tumor-Therapie würde mehrere Vorteile besitzen. Der LT-β-R bindet mit hoher Affinität an heteromere LT-α/β-Komplexe in β/β-Spalten und mit geringer Affinität an α/β-Spalten, die an den Schnittstellen zwischen benachbarten LT-α- und LT-β-Untereinheiten erzeugt werden. Im Gegensatz dazu binden TNF-Rezeptoren an heteromere LT-α/β-Komplexe mit hoher Affinität nur in α/α-Spalten. Folglich binden gereinigte LT-α1/β2-Komplexe mit hoher Affinität an LT-β-R zwischen benachbarten LT-β-Untereinheiten, aber es fehlen α/α-Spalten, und deshalb kreuzaktivieren sie nicht die Signalgebung durch die TNF-Rezeptoren. Daher werden die heteromeren LT-α/β-Komplexe dieser Erfindung TNF-assoziierte Entzündungsantworten nicht stimulieren.
  • Verabreichbares LT-α1/β2 in den Verwendungen der Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 2–6 und 9 aktiviert nicht endotheliale Zellveränderungen, die mit einer Entzündungsantwort assoziiert sind, sogar bei relativ hohen Spiegeln. Aus diesem Grund sollten die Nebenwirkungen, die auf eine mit TNF beobachteten Aktivierung der Entzündungskaskade zurückzuführen sind, bei Verwendung der Arzneimittel und Behandlungsmethoden zur Aktivierung des LT-β-R, kein Problem sein.
  • Menschliches LT-α1/β2 bindet an den Maus LT-β-R im Wesentlichen so gut wie an den menschlichen LT-β-R. Eine Injektion von 100 μg menschlichem LT-α1/β2 pro Maus ist nicht tödlich (Beispiel 11) und deutet darauf hin, dass die Stimulierung des LT-β-R im ganzen Tier nicht die offenkundige Toxizität besitzt, die gesehen wird, wenn ähnliche Experimente mit FasR oder p60-TNF-R-Aktivierung versucht wurden.
  • Die Verwendung von spezifischen monoclonalen anti-LT-β-R-Antikörpern oder Antikörper-Kombinationen, um diesen Weg in Menschen auszulösen, kann mehrere Vorteile gegenüber der Behandlung mit heteromeren LT-α/β-Komplexen besitzen. Eine anti-Rezeptor-Antikörper-Therapie wird selektiver als die Behandlung mit dem Liganden sein. Außerdem würden rekombinante Formen von anti-LT-β-R-mAk einfacher zu konstruieren und in größerem Maßstab herzustellen sein als die löslichen heteromeren LT-α/β-Komplexe.
  • Man stellt sich vor, dass die mAk oder die heteromeren LT-α/β-Komplexe in den Anwendungen der Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 2–6 und 9 an tumortragende Personen in Verbindung mit einer konventionellen anti-Tumortherapie (d. h. Bestrahlung und Chemotherapie) verabreicht würden. Eine kombinierte Behandlung von LT-β-R-Aktivierung mit herkömmlichen Chemotherapien kann einen zusätzlichen Faktor einer Tumor-Abtötungs-Aktivität bereitstellen, der es wahrscheinlicher machen würde, einen Patienten von tumorbildenden Zellen zu befreien, als eine alleinige Anwendung einer konventionellen anti-Tumortherapie.
  • Es ist außerdem möglich, dass dieser Ansatz relativ wenige Nebenwirkungen hat und deshalb in einem semi-prophylaktischen Sinn in Fällen von Karzinomen, die noch keine Metastasen gebildet haben, oder bei Patienten von Familien, die eine genetische Prädisposition für einen bestimmten Krebstyp zeigen, angewendet werden könnte.
  • Das Folgende sind Beispiele, die die heteromeren LT-α/β-Komplexe und die anti-LT-β-R-mAk dieser Erfindung und die verwendeten Verfahren, um sie zu charakterisieren, veranschaulichen. Diese Beispiele sollten nicht als begrenzend aufgefasst werden: die Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung eingeschlossen und die vorliegende Erfindung wird nur durch die Ansprüche limitiert.
  • BEISPIEL 1
  • Die Erzeugung von Baculovirus-infizierten LT-α/β-Formen enthaltenden Insektenzell-Überständen
  • Rekombinante Baculoviren, die entweder LT-α in voller Länge oder eine abgesonderte Form von LT-β codieren, wurden, wie beschrieben, hergestellt (Crowe et al., Science, 264, S. 707–710 (1994)). High five Insektenzellen (Invitrogen, San Diego, CA.) wurden bei einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml in 7,2 Liter SF 900-II (Gibco)-Medium ohne Serum inokuliert. Die Kultur erreichte 48 Stunden später 1,8 × 106 Zellen/ml und wurde mit 150 ml (3 × 108 PBE/ml) von LT-β und 300 ml von LT-α Baculovirus-Stammlösungen infiziert. Zwei Tage später wurde die Kultur geerntet, und die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Nach Zugabe von EDTA und PMSF (1 mM EDTA und 150 μM PMSF Endkonzentration) wurde der gereinigte Überstand durch Ultrafiltration unter Verwendung einer gewundenen S1YM10 (Amicon)-Patrone 10-fach konzentriert. Das Konzentrat wurde in sechs 120 ml-Portionen aufgeteilt, und die Aliquots wurden vor der Reinigung bei –70°C gelagert.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von löslichen LT-β-Rezeptoren als Immunglobulin-Fc-Chimäre
  • Die extrazelluläre Domäne des LT-β-R bis zum Transmembranbereich wurde durch PCR von einem cDNA-Clon unter Verwendung von Primern, die NotI- und SalI-Restriktionsenzymstellen an den 5'-beziehungsweise 3'-Enden eingebaut hatten, amplifiziert (Browning et al., J. Immunol., 154, S. 33–46 (1995)). Das amplifizierte Produkt wurde mit NotI und SalI geschnitten, gereinigt und in den NotI linearisierten Vektor pMDR901 zusammen mit einem SalI-NotI-Fragment, das den Fc-Bereich von menschlichem Igel codiert, ligiert. Der resultierende Vektor enthielt das Dihydrofolat-Reduktase-Gen und die LT-β-R-Fc-Chimäre, gesteuert durch getrennte Promotoren. Der Vektor wurde in CHO dhfr–-Zellen durch Elektroporation eingebracht und durch Standardverfahren wurden Methotrexat resistente Clone isoliert. LT-β-R-Fc wird in das Medium abgesondert, und es wurde ein ELISA-Test verwendet, um Zell-Linien, die die höchsten Spiegel des chimären Proteins herstellten, zu selektieren. Eine hoch-produzierende Zell-Linie wurde in hoher Zahl gezüchtet und konditioniertes Medium gesammelt. Das reine Protein wurde durch Protein A-Sepharose-Fast Flow-Chromatographie isoliert.
  • BEISPIEL 3
  • Affinitätsreinigung von LT-α1/β2 unter Verwendung von TNF-R und LT-β-R
  • Um Harze für die Rezeptoraffinitäts-Reinigung von LT-Formen herzustellen, wurden gereinigte Präparationen von LT-β-R-Fc (wie hierin in Beispiel 2 beschrieben) und TNF-R-p60-Fc (Crowe et al., Science, 264, S. 707–10 (1994)) auf CNBr-Sepharose (Pharmacia) bei 5 mg/ml Harz, hauptsächlich den Spezifizierungen des Herstellers folgend, immobilisiert. Die Harze wurden vor Gebrauch durch einen Elutionszyklus geführt. Ein Teil (120 ml) des S1Y10-Konzentrats wurde über zwei aufeinander folgende p60-TNF-R-Fc-Säulen gegeben, die LT-α und LT-α1/β2 binden. Der Durchfluss, der LT-α1/β2 und LT-β enthielt, wurde über eine LT-β-R-Fc-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 5 Volumina von je PBS, PBS mit 0,5 M NaCl und PBS gewaschen, und dann wurden die LT-α und LT-α2/β1-Komplexe mit 25 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 3,5 eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden sofort mit 1/20 Volumen von 0,5 M Natriumphosphat, pH 8,6 neutralisiert und auf Eis gelagert. Protein enthaltende Fraktionen wurden durch Absorption bei 280 nm identifiziert, Spitzenfraktionen wurden vereinigt und die Elutions-Vereinigungen von den Säulen wurden durch mit Coomassie Brilliantblau gefärbter SDS-PAGE analysiert. Die vorstehend beschriebene Elution erzielte mehr als 95% reines LT-α1/β2.
  • BEISPIEL 4
  • Charakterisierung der gereinigten LT-α1/β2-Liganden
  • Die Fraktionen von Beispiel 3 wurden durch Gelausschluss-Chromatographie nach der Größe geordnet, um zu beurteilen, ob Trimere gebildet wurden und ob Aggregate vorhanden waren. Es wurde eine TSK G3000 sw × 2-Säule bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min verwendet, um einen BioRad-Gelfiltrations-Proteinstandard und die drei verschiedenen LT-Trimere LT-α3, LT-α2/β1 und LT-α1/β2 nach Größe aufzutrennen. 1A zeigt, dass die LT-α1/β2 Trimere kaum, wenn überhaupt, als Aggregate mit hohem Molekulargewicht zu sehen waren. Ein Vergleich mit Größenstandards zeigt, dass die drei Formen alle als Trimerisch vorliegen, d. h. circa 50–60 kDa. Das Trimer voraussetzend, wurde die Stöchiometrie von in den gereinigten LT-α1/β2- und LT-α2/β1-Fraktionen enthaltenem LT-α zu LT-β entweder durch Densitometrie der Coomassie gefärbten Gele oder durch Analyse der Peakhöhe der zwei Peaks, resultierend aus der Auftrennung durch C4-Umkehrphasen-HPLC, bewertet. Beide Messungen bestätigten die Identität der, wie vorstehend beschrieben, von den Affinitätssäulen eluierten Fraktionen.
  • Die Reinheit der Präparationen wurde weiter durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines BioCAD-Geräts bewertet, um pH-Wert-Karten von LT-α1/β2 und LT-α2/β1 auf dem schwachen Kationen-Austauscher-Harz unter mehreren verschiedenen Puffersystemen zu erstellen. Die Methode, die die größte Fähigkeit zum sauberen Zurückhalten und zur Trennung der drei Trimere zeigte, enthielt: eine POROS CM (Carboxymethyl)-Säule, die bei 5 ml/min mit einem Puffer mit 16,66 mM MES, 16,66 mM HEPES, 16,66 mM Na-Acetat, pH 6,5 lief, wobei mit einem 1 M NaCl-Gradienten über 20 Säulenvolumina eluiert wurde. Die BioCAD-Chromatogramme von LT-α1/β2- und LT-α2/β1-Komplexen werden in 1B gezeigt. Jedes Trimer, LT-α3, LT-α2/β1 und LT-α1/β2, wurde bei verschiedenen Salzkonzentrationen eluiert, und es gab keinen Beweis für eine Kreuzkontamination von mehr als 1–2% in den verschiedenen Präparationen.
  • BEISPIEL 5
  • Abtöten von menschlichen HT29-Adenokarzinomzellen durch lösliche LT-α1/β2-Komplexe
  • Der für HT29 cytolytische Test wurde vorher beschrieben (Browning und Ribolini, J. Immunol., 143, S. 1859–67 (1989)). In einem typischen Test wurden Verdünnungsreihen von LT-α1/β2 (und, wo anwendbar, andereren Cytokinen) in 0,05 ml in Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt, und 5000 trypsinierte HT29-14-Zellen wurden in 0,05 ml, 0 oder 80 U/ml (anti-virale Einheiten) von menschlichem IFN-γ enthaltendem Medium zugegeben. Die HT29-14-Zellen sind von einem Subclon der ursprünglichen, von der ATCC stammenden HT29-Linie, die homogener ist. In den Tests wurden HT29-14-Zellen verwendet; alle diese Ergebnisse können ebenfalls unter Verwendung der ursprünglichen, von der ATCC stammenden HT29-Zell-Linie beobachtet werden. Nach 3–4 Tagen wurde die mitochondriale Reduktion des Farbstoffs MTT wie folgt gemessen: 101 von MTT wurden zugefügt, und nach 3 Stunden wurde der reduzierte Farbstoff mit 0,09 ml Isopropanol mit 10 mM HCl gelöst und die O. D. bei 550 nm gemessen. Lösliche, wie hierin beschrieben, hergestellte Rezeptorformen oder reines menschliches IgG wurden in 10 μl vor den Zellen zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu ergeben.
  • 2A zeigt das Abtöten von HT29-Zellen durch Behandlung mit dem anti-Fas-Rezeptor-mAk CH11 (der die FasR-Signalgebung stimuliert); TNF, LT-α3-, LT-α1/β2- und LT-α2/β1-Liganden in Verbindung mit IFN-γ. Eine visuelle Untersuchung der mit LT-α1/β2 behandelten Zellen enthüllte, dass dieses Agens Zellen eher tötet als nur die Zellproliferation zu blockieren. In Abwesenheit von IFN-γ wurden keine Wirkungen beobachtet, was die ungewöhnliche Fähigkeit von IFN-γ widerspiegelt, die Interpretationsfähigkeit der Signalgebung von Zellen von der TNF-Rezeptorfamilie zu beeinflussen. Die Interferone α und β waren 100-fach weniger wirksam als IFN-γ, wie basierend auf anti-viralen Aktivitätseinheiten quantitativ bestimmt wurde.
  • 2B zeigt die Inhibierung des Abtötens durch LT-α1/β2 durch löslichen LT-β-R-Fc, aber nicht durch p60-R-Fc, was zeigt, dass die Cytotoxizität spezifisch für LT-α1/β2 ist. Der Mangel an Hemmung durch p60-TNF-R-Fc weist darauf hin, dass kontaminierendes LT-α (bekanntermaßen weniger als 1%) nicht für die cytotoxische Aktivität von LT-α1/β2 verantwortlich sein kann.
  • BEISPIEL 6
  • Anti-LT-β-R-mAk verstärken das Abtöten von HT29-Zellen durch LT-α1/β2-Komplexe
  • Es wurden cytolytische Tests, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass IFN-γ und anti-LT-β-R-mAk (Reihen mit 0,01–1000 ng/m) den Zellen bei 2 × Endkonzentration zugefügt wurden und dann 50 μl der Zell-Lösung in die verdünntes LT-α1/β2 enthaltenden Vertiefungen gegeben wurden. Das Wachstum wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, beurteilt. 3 zeigt die unterschiedlichen Wirkungen von zwei verschiedenen anti-LT-β-R-mAk in ihrer Fähigkeit, die cytotoxische LT-α1/β2-Aktivität zu verstärken. 3A zeigt, dass der anti-LT-β-R-mAk CDH10 die cytotoxische LT-α1/β2-Aktivität in einer Dosis abhängigen Weise verstärkt. 3B zeigt die Effekte eines anderen anti-LT-β-R-mAk, BDA8, im gleichen Test. Der BDA8-mAk hemmt die cytotoxische Aktivität von LT-α1/β2 eher, als den Tumorzelltod zu verstärken.
  • BEISPIEL 7
  • Immobilisierte anti-LT-β-R-mAk können HT29-Tumorzellen abtöten
  • Um anti-LT-β-R-mAk auf einer Plastikoberfläche zu immobilisieren, wurden Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 50 μl 10 μg/ml polyclonalem Ziege-anti-Maus-Fc-Antikörper (Jackson ImmunoResearch) beschichtet, gewaschen und mit 5% FKS in PBS blockiert, gefolgt vom Einfangen des angegebenen LT-β-R-mAk und erneutem Waschen. Die HT29-Zellen wurden in die mAk beschichteten Vertiefungen gegeben, und die cytolytischen Tests wurden wie in Beispiel 5 durchgeführt. 4A veranschaulicht die cytotoxischen Wirkungen der immobilisierten anti-LT-β-R-mAk, BDA8 und CDH10 auf HT29-Zellen. Jeder mAk ruft einzeln eine Cytotoxizität bei Tumorzellen hervor, wenn er auf einer Oberfläche immobilisiert ist. 4B zeigt, dass die gleiche anti-LT-β-R-mAk, BDA8 und CDH10 einzeln in Lösung getestet nicht cytotoxisch ist und daher die cytolytische Aktivität eines einzelnen anti-LT-β-R-mAk in vitro eine Funktion seiner Immobilisierung zu sein scheint.
  • BEISPIEL 8
  • Eine Kombination von anti-LT-β-R-mAk in Lösung, die gegen verschiedene Epitope gerichtet sind, tötet HT29-Zellen
  • Das Wachstum von HT29-Zellen wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, beurteilt mit der Ausnahme, dass entweder einer oder zwei anti-LT-β-R-mAk in dem Wachstumsmedium enthalten waren. Tabelle 1 zeigt die Wirkungen auf HT29-Zellen, die beobachtet wurden, wenn verschiedene anti-LT-β-R-mAk in der Lösung enthalten waren (d. h. nicht auf Plastik immobilisiert). Die anti-LT-β-R-mAk können in die Gruppen I–IV eingeteilt werden, basierend auf ihren relativen Fähigkeiten, in Kombination miteinander in einem cytolytischen HT29-Zell-Test zu arbeiten. Die in cytolytischen Tests erhaltenen anti-LT-β-R-mAk Ergebnisse laufen parallel zu Rezeptor-Bindungsdaten, die nahe legen, dass die mAk in jeder verschiedenen Gruppe andere Epitope auf dem LT-β-R erkennen.
  • Tabelle 1. Kombinationen von löslichen anti-LT-β-R-mAk sind cytotoxisch gegenüber menschlichen HT29-Adenokarzinom-Zellen. Die anti-β-R-mAk sind die Gruppen I, II, III und IV eingeteilt, basierend auf ihren Wirkungen in Kombination miteinander in cytolytischen HT29-Zell-Tests. Die Pluszeichen beziehen sich auf das relative Ausmaß cytotoxischer Effekte der mAk-Kombination auf HT29-Zellen in Anwesenheit von 80 U/ml IFN-γ. nr = nicht relevant; nd = nicht bestimmt.
  • Zweiter mAk
    Figure 00350001
  • 5A–5D quantifiziert die Effekte von in dem cytolytischen HT29-Zell-Test eingeschlossenen, repräsentativen paarweisen Kombinationen kooperierender, gegen verschiedene Epitope von LT-β-R gerichteten, anti-LT-β-R-mAk. 5A zeigt die cytotoxischen Wirkungen von BHA10 und CBE11, 5B von CDH10und CBE11 und 5C von CDH10 und AGH1, allein und in Kombination. 5D zeigt die cytotoxischen Wirkungen der CDH10- und AGH1-mAk-Kombination in einer anderen, WiDr genannten Tumorzell-Linie.
  • Figure 00370001
  • BEISPIEL 9
  • Vertrauen auf endogenes IFN-γ für die Behandlung von Tumorzellen
  • IFN-γ, ein bevorzugtes LT-β-R aktivierendes Agens der vorliegenden Erfindung, ist ein Cytokin, das anti-Tumoraktivität zeigt und das im Menschen toleriert wird. Endogenes IFN-γ, das in der Umgebung eines Tumors vorhanden ist, kann bei genügend hohen Konzentrationen wie ein LT-β-R aktivierendes Agens dieser Erfindung, ohne Zugabe von exogenem IFN-γ funktionieren. Die Konzentration von IFN-γ in der Nähe eines Tumors kann unter Verwendung von immunochemischen Standard-Techniken mit Gewebeproben von der Tumorregion festgestellt werden. Wenn die endogene Konzentration von IFN-γ hoch genug ist, um eine anti-Tumoraktivität in Kombination mit den heteromeren LT-α/β-Komplexen oder anti-LT-β-R-mAk dieser Erfindung (wie durch die hierin beschriebenen cytolytischen Tests bestimmt) hevorzurufen, dann ist es nicht nötig, IFN-γ als ein zweites LT-β-R aktivierendes Agens in den Zusammensetzungen oder deren Anwendungen gemäß den Ansprüchen 5 und 6 zu verabreichen.
  • BEISPIEL 10
  • Induktion von endogenem IFN-γ als ein LT-β-R aktivierendes Agens für die Behandlung von Tumorzellen
  • Verbindungen, die die endogene Produktion von Interferonen wie IFN-γ induzieren, fallen in die Gruppe LT-β-R aktivierender Agenzien dieser Erfindung. Z. B. können Interferone durch Behandlung mit Doppelstrang-RNA-Molekülen wie Polyriboguanin/Polyribocytidin-Säure (Poly-G/C) induziert werden.
  • Weiblichen C57/b16-Mäusen (6–8 Wochen alt) können 18 mg (600 mg/kg) D-Galactosamin injiziert werden, das Mäuse gegenüber den Effekten von TNF und anderen anti-Tumoragenzien sensibilisiert. Eine Reihe von Konzentrationen von Poly-G/C (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, S. 107–11 (1992)) in einer neutralen Kochsalzlösung wird zu gereinigtem LT-α1/β2 (10–100 μg) gegeben und die Lösung Mäusen als eine intraperitoneale (i. p.) Injektion verabreicht. Die anti-Tumoraktivität von LT-α1/β2 wird durch die Anwesenheit von Poly-rG/rC-Doppelstrang-RNA verstärkt.
  • Ähnlich kann der Interferonstimulator der Pflanze Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, S. 69–74 (1993)) Menschen intravenös bei Dosen im Bereich von 40–100 ml/Tag verabreicht werden. Die optimale Dosis für eine LT-β-R-Aktivierung in der Anwesenheit von entweder heteromeren LT-α/β-Komplexen oder anti-LT-β-R-Ak kann empirisch bestimmt werden und wird von Faktoren wie dem Tumortyp, Art der Zuführung und Zuführungsschema abhängen.
  • Imiquimod R-837 (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, S. 45–55 (1994)); Saparal (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, S. 131–34 (1994)); Bropirimin (Onishi und Machida, Hinyokika Kiyo, 40, S. 195–200 (1994)); oder Ridostin (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, S. 125–28 (1994)) können ebenfalls als LT-β-R aktivierende Agenzien in Verbindung mit heteromeren LT-α/β-Komplexen, anti-LT-β-R-Ak oder als Kombination davon verabreicht werden. In jedem Fall können die bevorzugten Arten der Zuführung und die optimalen Dosen empirisch unter Verwendung der veröffentlichten Berichte als Startpunkte für die Optimierung durch klinische Routineverfahren bestimmt werden.
  • BEISPIEL 11
  • Mäuse tolerieren Injektionen von menschlichem LT-α1/β2
  • Weiblichen C57/b16-Mäusen (6–8 Wochen alt), die an die Einrichtung für mehrere Tage gewöhnt waren, wurden 18 mg (600 mg/kg) D-Galactosamin i. p. injiziert, das Mäuse gegenüber den Effekten von TNF und anderen anti-Tumoragenzien sensibilisiert. Entweder menschlicher TNF, LT-α oder LT-α1/β2 wurden dann i. p. gegeben. Tabelle 3 dokumentiert das Überleben der behandelten Mäuse 24 Stunden nach Injektion.
  • Tabelle 3
    Figure 00390001
  • BEISPIEL 12
  • Konstruktion eines rekombinanten monoclonalen anti-LT-β-R-IgM-Antikörpers
  • Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen anti-Tumor-Cytotoxizitäts-Tests, gekoppelt mit Standardmodellen für Tumorwachstum in immundefizienten Mäusen, kann ein anti-LT-β-R-IgG mit geeigneten Eigenschaften ausgewählt werden. Universelle Primer, die mit jeder der variablen Domänen der schweren und leichten IgG-Ketten der gewählten anti-LT-β-R-IgG hybridisieren, können verwendet werden, um variable Domänen-DNA von RNA ausgehend herzustellen, die unter Verwendung von Reverse Transkriptase/PCR-Standard-Methoden aus der sezernierenden Hybridomzelllinie isoliert wurde. Diese Protokolle wurden beschrieben (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, S. 1439–50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, S. 2573–78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, S. 68–70 (1989)).
  • Die amplifizierten Produkte werden dann in Vektoren, die die menschliche CH1-, CH2- und CH3-μ-Kettendomäne enthalten, zusammengesetzt. Eine Co-Expression der zwei Ketten in einem einzigen Wirt wird es erlauben, die schweren und die leichten Ketten zu einem pentamerischen IgM-Molekül zusammenzusetzen. Dieses Molekül ist eine Chimäre, die aus variablen Regionen der Maus gekoppelt mit menschlichen konstanten Bereichen besteht.
  • Alternativ kann ein Verfahren unter Verwendung von PCR verwendet werden, um DNA, die nur die aktuellen Bindungsbereiche der variablen Regionen codiert, zu amplifizieren. Die amplifizierte DNA wird dann in Vektoren inseriert, die alle menschlichen IgG-Sequenzen mit Ausnahme der aktuellen Aminosäuren, die an der Antigenbindung beteiligt sind, enthalten. Solche Konstrukte werden als „humanisierte" Antikörper bezeichnet und die detaillierten Methoden für ihre Herstellung sind gut bekannt (z. B. WO 94/04679).
  • BEISPIEL 13
  • Monoclonale anti-LT-β-R-IgM-Antikörper fungieren wie LT-β-R aktivierende Agenzien
  • Anti-LT-β-R-IgM-Antikörper können in einer rekombinanten Form, wie in Beispiel 12 beschrieben, hergestellt werden. Alternativ können vollständige Maus-IgM durch Hybridom-Fusionstechniken unter Verwendung von primärer Immunisierung von normalen Mäusen oder extensiver Immunisierung von CD40 Signalgebungs-defizienten Mäusen (Kawabe et al., Immunity, 1, S. 167–78 (1994); Xu et al., Immunity, 1 S. 423–31 (1994)) als Quelle für anti-LT-β-R-IgM-mAk verwendet werden.
  • Anti-LT-β-R-IgM-mAk werden signifikant wirksamer als LT-β-R aktivierende Agenzien sein, als ihre normalen bivalenten IgG-Gegenstücke, wie durch Vergleiche der Dosis-Antwort in dem cytolytischen HT29-Zell-Test in Anwesenheit von IFN-γ gemessen wurde. Die anti-LT-β-R-IgM-mAk fungieren als LT-β-R aktivierende Agenzien, sowohl wenn sie immobilisiert sind als auch wenn sie in Lösung verabreicht werden. Außerdem erwarten wir, dass sie die anti-Tumoraktivität von heteromeren LT-α/β-Komplexen vermehren werden.
  • BEISPIEL 14
  • Monoclonale anti-LT-β-R-Antikörper hemmen das Wachstum von menschlichen Tumorzellen in SCID-Mäusen
  • Balb/c-SCID-Mäusen (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) wurden 1 × 106 trypsinierte und gewaschene menschliche Adenokarzinom-WiDr-Zellen in einem Volumen von 0,2 ml PBS subcutan (s. c.) in den Rücken der Tiere injiziert. Die injizierten WiDr-Zellen bilden Tumore in den Mäusen, und die Fähigkeit eines anti-LT-β-R-mAk, das Tumorwachstum zu hemmen, wurde überwacht. In einer Reihe von Experimenten wurden Mäuse mit oder ohne den CBE11-anti-LT-β-R-mAk – entweder mit oder ohne menschliches IFN-γ (106 antivirale Einheiten/Maus) – zur gleichen Zeit wie die s. c. Inokulation der WiDr Zellen behandelt (6A). Antikörper und IFN-γ wurden allein oder zusammen durch i. p. Injektion in 0,2 ml verabreicht. Kontrollmäusen wurde Kochsalzlösung allein, IFN-γ allein oder ein anti-Mensch-LFA-3-Kontroll-mAk (1E6) mit IFN-γ injiziert. Die Größe jedes sich ergebenden Tumors wurde 30 Tage nach Inokulation bewertet. Das Tumorvolumen (in ccm) wurde aus dem durch Greifzirkelmessungen in zwei Dimensionen bestimmtem Radius berechnet. Mit CBE11- oder 1E6-mAk behandelte Tiere erhielten 10 μg/Maus oder 50 μg/Maus an Antikörper (6A; Kreise mit Punkten beziehungsweise offene Kreise).
  • In einer anderen Reihe von Experimenten wurden die Mäuse s. c. mit den WiDr-Zellen inokuliert, und die Tumore konnten 15 Tage wachsen, bevor die Mäuse mit dem CBE11-anti-LT-β-R-mAk behandelt wurden (6B). Am Tag 15 (vor der Antikörperbehandlung) betrug das durchschnittliche Tumorvolumen 0,076 ccm mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,53 cm. Der CBE11-anti-LT-β-R-mAk (50 μg) wurde dann – entweder mit oder ohne menschliches IFN-γ (106 antivirale Einheiten/Maus) – durch i. p. Injektion in 0,2 ml an eine Gruppe von 12 Tieren verabreicht. Die Injektionen wurden weitere drei Male über einen Zeitraum von drei Wochen wiederholt. Kontrollgruppen (12 Mäuse/Gruppe) wurden IFN-γ allein (106 antivirale Einheiten/Maus) oder 50 μg eines Kontroll-anti-Mensch-LFA-3- mAk (1E6) + IFN-γ (106 antivirale Einheiten/Maus) injiziert. Das Wachstum der am Tag 15 vorhandenen Tumore wurde über den Zeitraum aufgeschrieben, von 15 bis 49 Tage post-Inokulation der Tumorzellen bewertet. Die Ergebnisse, die in 6B gezeigt werden, wurden in einem blinden Format bestimmt. Die mit dem CBE11-mAk entweder mit oder ohne IFN-γ behandelten Tumore stellten das Wachstum ein. Nach drei Injektionen von CBE11-mAk (+/– IFN-γ) über drei Wochen wurde das Tumorwachstum für mindestens 7 Wochen post-Inokulation eingestellt; zu diesem Zeitpunkt wurde das Experiment beendet.

Claims (9)

  1. Arzneimittel, umfassend mindestens ein LT-β-R aktivierendes Mittel, wobei ein LT-β-R aktivierendes Mittel einen anti-LT-β-R-Antikörper umfasst.
  2. Verwendung von mindestens einem LT-β-R aktivierenden Mittel für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Reduzierung des Fortschreitens, der Heftigkeit oder der Wirkungen von Neoplasie, wobei ein LT-β-R aktivierendes Mittel einen anti-LT-β-R-Antikörper umfasst.
  3. Verwendung eines heteromeren LT-α/β-Komplexes für die Herstellung eines Arzneimittels, das in Anwesenheit von mindestens einem LT-β-R aktivierenden Mittel zur Behandlung oder Reduzierung des Fortschreitens, der Heftigkeit oder der Wirkungen von Neoplasie verabreicht werden soll.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei ein LT-β-R aktivierendes Mittel einen anti-LT-β-R-Antikörper und/oder IFN-γ umfasst.
  5. Verwendung von vernetzten anti-LT-β-R-Antikörpern als erstes LT-β-R aktivierendes Mittel für die Herstellung eines Arzneimittels, das in Anwesenheit eines zweiten LT-β-R aktivierenden Mittels für die Behandlung oder Reduzierung des Fortschreitens, der Heftigkeit oder der Wirkungen von Neoplasie verabreicht werden soll.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das zweite LT-β-R aktivierende Mittel IFN-γ umfasst.
  7. Verfahren zum Auswählen eines LT-β-R aktivierenden Mittels, das in Anwesenheit von heteromeren LT-α/β-Komplexen wirksam ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Züchten von Tumorzellen in Anwesenheit von heteromeren LT-α/β-Komplexen, eines ersten LT-β-R aktivierenden Mittels und eines zweiten mutmaßlichen LT-β-R aktivierenden Mittels; und (b) Bestimmen, ob das zweite mutmaßliche LT-β-R aktivierende Mittel die Anti-Tumoraktivität des heteromeren LT-α/β-Komplexes in Anwesenheit des ersten LT-β-R aktivierenden Mittels erhöht.
  8. Arzneimittel, umfassend einen anti-LT-β-R-Antikörper.
  9. Verwendung eines anti-LT-β-R-Antikörpers für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Reduzierung des Fortschreitens, der Heftigkeit oder der Wirkungen von Neoplasie.
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