CZ298711B6

CZ298711B6 - Farmaceutické prostredky aktivující LT-beta receptor pro lécení nebo omezení pokracování, závažnosti nebo úcinku neoplazie, zpusob selekce LT-beta receptor aktivujícího cinidla a protilátky proti LT-beta receptoru

Info

Publication number: CZ298711B6
Application number: CZ0236197A
Authority: CZ
Inventors: L. Browning@Jeffrey; Meier@Werner; D. Benjamin@Christopher
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2008-01-02
Also published as: HK1006356A1; NO973385D0; EA000096B1; BG101855A; FI973118A0; CN1900116A; KR20040102364A; DE69632681T2; BR9606808A; KR100470739B1; HUP9801746A2; PL321758A1; SK98697A3; NO322744B1; KR19980701816A; WO1996022788A1; DE69632681D1; EP0809510B1; EE9700255A; NO973385L

Abstract

Jsou popsány farmaceutické prostredky použitelné pro aktivaci signalizace receptoru lymfotoxinu-beta, který pak vyvolává silné antiproliferativní úcinky na nádorové bunky, konkrétne prostredky obsahující heteromerní lymfotoxinové kompexy vytvorené mezi lymfotoxinem-alfa a cetnými podjednotkami lymfotoxinu-beta, které indukují cytotoxické úcinky nanádorové bunky za prítomnosti cinidel aktivujících receptor lymfotoxinu-beta. Dále se popisují protilátky zamerené proti receptoru lymfotoxinu-beta, které pusobí jako cinidla aktivující receptor lymfotoxinu-beta samotná nebo v kombinaci s jinými cinidly aktivujícími receptor lymfotoxinu-beta. Dále se popisuje screeningová metoda pro selekci cinidel aktivujících receptor lymfotoxinu-beta, které pusobí v prítomnosti heteromerních komplexu LT-alfa/beta.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických prostředků použitelných pro aktivaci signalizace receptoru lymfotoxinu-beta, který pak vyvolává silné antiproliferativní účinky na nádorové buňky, kon10 krétně prostředků obsahujících heteromemí lymfotoxinové komplexy vytvořené mezi lymfotoxinem-alfa a více podjednotkami lymfotoxinu-beta, které indukují cytotoxické účinky na nádorové buňky za přítomnosti lymfotoxin-beta receptor aktivačních činidel. Do rozsahu vynálezu spadají též protilátky zaměřené proti lymfotoxin-beta receptoru, které působí jako lymfotoxin-beta receptor aktivující činidla samotná nebo v kombinaci s jinými lymfotoxin-beta receptor aktivují15 čími činidly buď v přítomnosti nebo v nepřítomnosti komplexů lymfotoxinu-alfa/beta. Předmětem vynálezu je též screeningová metoda pro selekci činidel aktivujících receptor lymfotoxinubeta. Vynález se také týká prostředků využívajících zesítěných protilátek anti-lymfotoxin-beta receptor za přítomnosti jiných lymfotoxin-beta receptor aktivujících činidel za účelem potencování cytotoxicity buněk.

Dosavadní stav techniky

Rodina receptoru faktoru nekrotizujícího nádory (TNF) má několik členů, jejichž signalizace může vyvolat smrt buňky nekrózou nebo apoptózou (programovaná smrt buňky). Ligandy TNF a lymfotoxinu-alfa (LT-alfa, dříve nazývaný TNF-beta) se vážou na a aktivují TNF receptory (p60 ap80, zde nazývané „TNF-R“). Signalizace TNF-R iniciuje obecné imunitní odpovědi na infekce nebo stres v normálních buňkách, je ale cytotoxická vůči buňkám s transformovanými fenotypy nebo vůči nádorovým buňkám. TNF-R signalizace může způsobit selektivní lýzu nádorových buněk a buněk infikovaných viry. Cytotoxické účinky signalizace TNF-R na nádorové buňky se zvětší interferonem-gama (IFN-gama) a různými obvyklými chemoterapeutickými prostředky.

Bylo by užitečné využít antiproliferativní nebo cytotoxické aktivity indukované TNF-R signali35 žací v nádorových buňkách pro terapeutické účely. Aktivace TNF-R však má pleiotropní účinky na řadu imunoregulačních odpovědí včetně iniciace prozánětlivých kaskád. Nebylo tedy možné zaměřit cytotoxické účinky signalizace TNF-R na nádorové buňky bez současné stimulace zánětlivých odpovědí, které vedou u lidí k celkové toxicitě.

Podobně může stimulace jiného s TNF příbuzného receptoru nazvaného Fas receptor (FasR) aktivovat cytotoxicitu programovaným úmrtím buněk u různých typů jak nádorových tak nenádorových buněk. Bylo však prokázáno, že aktivace FasR způsobuje rychlou nekrózu jater, čímž znemožňuje jeho terapeutickou aplikaci u lidí.

Nedávno byl identifikován jiný receptor v rodině TNF, nazývaný LT-beta receptor (LT-beta-R) (Crowa a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). LT-beta-R váže heteromemí lymfotoxinové komplexy (LT-alfa/beta), které obsahují LT-alfa podjednotky v kombinaci s jiným s TNF příbuzným polypeptidem zvaným lymfotoxin-beta (LT-beta). Tyto LT-alfa/beta komplexy jsou spojeny membránou a většinou mají stechiometrii LT-alfal/beta2 (Browning a spol., Cell, 72, str. 847 až 856 (1993), Browning a spol., J. Immunol., 154, str. 33 až 46 (1995)).

Má se za to, že analogicky s TNF-R a jinými receptory podobnými TNF dochází k aktivaci signalizace LT-beta-R, když je přivedeno více receptorů na povrchu buňky do těsné blízkosti (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Tento proces je nazýván kumulace receptorů. Ligandy TNF a LT jsou multivalentní komplexy, které mohou současně vázat, a tak

-1 CZ 298711 B6 tvořit agregát více než s jedním receptorem. Kumulace receptorů jako prostředek pro aktivaci receptorů v jiných systémech byla dobře dokumentována, zejména pro tyrosinkinázový receptor (Ullrich a Schlesinger, Cell, 61, str. 203 až 212 (1990), Kolanus a spol., Cell, 74, str. 171 až 183 (1993)). Aplikace ligandů ίΤ-α1/β2 nebo/a LT-p-R aktivujících činidel, která může indukovat na povrchu cílových nádorových buněk kumulaci a signalizaci molekul LT-P-R ve směru exprese genu, by tedy byla užitečná pro přímou stimulaci cesty LT-P-R v těchto buňkách.

Signalizace pomocí LT-P-R, podobně jako TNF-R, může aktivovat cesty, které vedou k cytotoxicitě a smrti buňky u nádorových buněk. Důležité je, že ligandy LT-al/p2 se nevážou na ío TNF-R s žádnou významnou afinitou. Z toho důvodu řízená aktivace LT-P-R v nádorových buňkách by vyvolala cytotoxicitu v těchto buňkách bez stimulace zánětlivých cest spojené s aktivací TNF-R. Léčba s LT-al/p2 nebo/a s jinými LT-P-R aktivujícími činidly by tedy byla užitečná pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků nádorových buněk (neoplazie) za současného překonání problémů se závažnými vedlejšími účinky, které se vyskytovaly, když byla zkoušena aktivace TNF-R nebo FasR jako protinádorová léčba.

Podstata vynálezu

Vynález řeší shora uvedené problémy tím, že poskytuje farmaceutické prostředky pro léčbu nádorových buněk stimulací signalizace LT-P-R bez současné stimulace zánětlivých odpovědí spojených s TNF-R. Podle jednoho provedení jsou k použití poskytnuty komplexy lymfotoxinu vytvořené mezi LT-α a více podjednotkami LT-p (LT-α/β heteromemí komplexy), které indukují cytotoxické účinky na buňky, které nesou LT-P-R v přítomnosti LT-P-R aktivujícího činidla. Výhodné jsou komplexy LT-al/p2 v přítomnosti LT-P-R aktivačního činidla. Výhodněji jsou komplexy LT-al/p2 v rozpustné formě spíše než ve formě vázané na membránu a LT-P-R aktivačním činidlem je IFN-gama.

Podle jiného provedení vynálezu je nejméně jedna protilátka, zaměřená proti LT-P-R (anti-LT30 β-R protilátka), použita jako druhé LT-P-R aktivující činidlo ve spojení s heteromemím komplexem LT-α/β. Výhodné prostředky se vyznačují LT-al/p2 v přítomnosti IFN-gama jako prvního aktivujícího činidla a nejméně jedné anti-LT-P-R protilátky jako druhého LT-P-R aktivujícího činidla. Výhodněji jsou LT-al/p2 komplexy rozpustné a protilátka je monoklonální protilátka (anti-LT-p-R Amb).

Podle jiného provedení je použita nejméně jedna anti-LT-P-R protilátka v přítomnosti nebo nepřítomnosti druhého LT-P-R aktivujícího činidla bez exogenního LT-α/β heteromemího komplexu. Výhodně se podle tohoto provedení použijí nejméně dvě monoklonální protilátky anti-LT-P-R (anti-LT-P-R mAbs), které rozpoznávají nepřekrývající se epitopy LT-p-R v kombinaci s IFN-gama.

Podle dalšího provedení vynálezu se pro přípravu farmaceutických prostředků pro potencování cytotoxicity pro nádorové buňky použijí zesítěné anti-LT-P-R protilátky ve spojení s druhým LT-P-R aktivačním činidlem. Podle výhodného provedení jsou jednotlivé anti-LT-P-R proti45 látky imobilizovány zesítěním na povrch. Podle jiného výhodného provedení jsou anti-LT-p-R protilátky zesítěny v roztoku. Výhodněji jsou anti-LT-P-R protilátky monoklonální protilátky a druhým LT-p-R aktivujícím činidlem je IFN-gama.

Předmětem vynálezu je dále nový screeningový proces pro selekci LT-P-R aktivujících činidel, jako například anti-LT-P-R protilátek, které působí v kombinaci s LT-α/β heteromemími komplexy k urychlení smrti nádorových buněk. Test využívá zvýšené senzitivity humánních adenokarcinomatózních buněk vůči LT-α/β heteromemím komplexům v přítomnosti LT-P-R aktivuj í-2CZ 298711 B6 cích činidel v testu na cytotoxicitu. Postup použitý k testování předpokládaným LT-P-R aktivujících činidel je popsán na příkladu protilátek anti-LT-P-R a sestává z následujících operací:

1) Nádorové buňky (například lidské adenokarcinomatózní buňky HT29) se kultivují několik dní v médiu obsahujícím IFN-gama a purifikovaný LT-<xl/p2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti příslušné testované anti-LT-P-R protilátky.

2) Na buňky se působí barvivém, které obarví živé buňky.

3) Spočítají se obarvené buňky, aby se stanovil podíl nádorových buněk usmrcených za přítomnosti LT-al/p2, IFN-gama a testované anti-LT-p-R protilátky v každém vzorku. Alternativně se může stanovit počet přežívajících buněk libovolným z řady dobře známých testů, kterými se ío měří životaschopnost buněk, jako například inkorporaci ³H-thymidinu do DNA.

Jednou z anti-LT-P-R protilátek (nebo kombinace protilátek), která zvyšuje významně procento nádorových buněk usmrcených v tomto testu, je LT-P-R aktivující činidlo v rámci tohoto vynálezu. Tento cytolytický test může být přizpůsoben pro identifikaci nových LT-P-R akti15 vujících činidel, která fungují v kombinaci s LT-α/ρ heteromemími komplexy.

Konkrétně jsou v rámci předkládaného vynálezu nárokována následující provedení:

Použití LT-α/ρ heteromemího komplexu pro přípravu farmaceutické kompozice určené k aplikaci v přítomnosti nebo společně s alespoň jedním LT-p-R aktivujícím činidlem pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie. Výhodně při tomto použití alespoň jedno LT-p-R aktivující činidlo zahrnuje terapeuticky účinné množství IFN-γ, výhodněji alespoň jedno LT-P-R aktivující činidlo zahrnuje terapeuticky účinné množství protilátky anti-LT-p-R. Výhodně je protilátkou anti-LT-p-R monoklonální protilátka, která se ještě výhodněji vybere ze skupiny sestávající z anti-LT-p-R mAb BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

Dalším předmětem vynálezu je použití alespoň jednoho LT-P-R aktivujícího činidla pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie, při němž jedno LT-P-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-p-R. Výhodně je protilátkou anti-LT-P-R monoklonální protilátka. Výhodněji se protilátka vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky. Ještě výhodněji protilátka obsahuje variabilní domény anti-LT-P-R. V rámci dalších výhodných provedení je protilátkou anti-LT-p-R CBE11. Dále může být protilátka anti-LT-p_R zaměřena na stejný epitop jako CBE11. Výhodně se protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající zBKAll, CDH10, BCG6 a BHA10. Výhodně je připravená kompozice určena kaplikaci v přítomnosti nebo společně s protinádorovou terapií, kterou je výhodně ozařování nebo chemoterapie. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s dalším LT-P-R aktivujícím činidlem obsahujícím IFN-γ, výhodně je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým činidlem, vybraným ze skupiny sestávající z IFN-α, TNF a multivalentních protilátek anti-LT-P-R.

V rámci vynálezu může být dále protilátkou anti-LT-P-R agonista LT-P-R nebo antagonista LT-P-R. Výhodně se při tom protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající zCBEll, BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10. I takto připravená kompozice je výhodně určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s protinádorovou terapií, kterou je ozařování nebo chemoterapie, k aplikaci v přítomnosti nebo společně s IFN-γ nebo k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým činidlem, vybraným ze skupiny sestávající z IFN-α, TNF a multivalentních protilátek anti-LT-P-R.

Dalším předmětem vynálezu je použití alespoň dvou monoklonálních protilátek anti-LT-p-R, které jsou zaměřeny proti nepřekrývajícím se epitopům LT-P-R, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie. Výhodně se

-3 CZ 298711 B6 jedna monoklonální protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-p-R se vybere ze skupiny sestávající zBCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11. Výhodněji se jedna monoklonální protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z BCG6 a BHA10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-p-R se vybere ze skupiny sestávající zAGHl, BDA8, BKA11, CDH10 a CBE11. Ještě výhodněji se jedna monoklonální protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11 a CDH10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-p-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, BCG6, BHA10 a CBE11. Ještě výhodněji je jednou monoklonální protilátkou anti-LT-P-R CBE11, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-P-R se vybere ze skupiny sestávající zAGHl, BDA8, ío BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11. Nejvýhodnější jsou provedení, při nichž jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-p-R CBE11 a BHA10, nebojsou monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R CBE11 a CDH10, nebo jsou monoklonální protilátkami anti-LT-P-R AGH1 a

CDH10.

V rámci dalšího výhodného provedení výše uvedených použití je jiným LT-P-R aktivujícím činidlem IFN-γ.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je použití zesítěných protilátek anti-LT-p-R jako prvního o LT-P-R aktivujícího činidla pro přípravu farmaceutické kompozice určené k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým LT-P-R aktivujícím činidlem, jiným než je první, pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie. Výhodně jsou zesítěné protilátky anti-LT-P-R nekovalentně nebo kovalentně imobilizovány na povrchu. Výhodněji jsou zesítěné protilátky anti-LT-P-R nekovalentně agregovány v roztoku pomocí činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-P-R. Výhodně činidlo zesíťující protilátky anti-LT-p-R zahrnuje sekundární protilátku zaměřenou proti protilátce anti-LT-P-R, výhodněji činidlo zesíťující protilátky anti-LT-P-R zahrnuje Fc receptor, který se váže na protilátku anti-LT-p-R. Výhodně jsou zesítěné protilátky anti-LT-p-R kovalentně agregovány v roztoku pomocí chemického činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-p-R. Druhým anti-LT-p-R aktivujícím činidlem je výhodně IFN-γ.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je způsob selekce LT-P-R aktivujícího činidla, které působí v přítomnosti LT-α/ρ heteromemích komplexů, který zahrnuje stupně:

a) kultivace nádorových buněk v přítomnosti heteromemích komplexů LT-α/ρ, účinného množství prvního LT-P-R aktivujícího činidla a druhého předpokládaného LT-P-R aktivujícího činidla; a

b) zjištění, zda druhé předpokládané LT-p-R aktivující činidlo zvyšuje protinádorovou aktivitu heteromemího komplexu LT-a/p v přítomnosti prvního LT-P-R aktivujícího činidla.

Výhodně je při tomto způsobu prvním LT-P-R aktivujícím činidlem IFN-γ. Heteromemí komplex LT-α/ρ výhodně vykazuje stechiometrii LT-al/p2.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je farmaceutická kompozice obsahující terapeuticky účinné množství alespoň dvou LT-P-R aktivujících činidel a farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně alespoň jedno LT-p-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-p-R, výhodněji je protilátkou anti-LT-P-R monoklonální protilátka, kterou je ještě výhodněji CBE11. Výhodně alespoň dvě LT-p-R, aktivující činidla zahrnují monoklonální protilátky anti-LT-p-R, které jsou zaměřeny proti nepřekrývajícím se epitopům LT-P-R. Výhodněji se jedna monoklonální protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-p-R se vybere ze skupiny sestávající zBCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a

CBE11, nebo se jedna monoklonální protilátka anti—LT—P—R vybere ze skupiny sestávající z BCG6 a BHA10, a jiná monoklonální protilátka anti—LT—P—R se vybere ze skupiny sestávající

-4CL 298711 B6 z AGH1, BDA8, BKA11, CDH10 a CBE11, nebo se jedna monoklonální protilátka anti-LT-p-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11 a CDH10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-P-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, BCG6, BHA10 a CBE11. Ještě výhodněji jednou monoklonální protilátkou anti-LT-p-R je CBE11, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-p-R se vybere ze skupiny sestávající zAGHl, BDA8, BCG6, BELA10, BKA11, CDH10 a CBE11. Nejvýhodněji jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R CBE11 a BHA10, nebo jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R CBE11 a CDH10, nebo monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R jsou AGH1 a CDH10. Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat IFN-γ jako jedno z LT-p-R aktivujících činidel.

Předmětem vynálezu jsou rovněž farmaceutické kompozice, které obsahují terapeuticky účinné množství zesítěných protilátek anti-LT-p-R jako LT-P-R aktivující činidlo a farmaceuticky přijatelný nosič. Zesítěné protilátky anti-LT-P-R jsou výhodně kovalentně nebo nekovalentně mobilizovány na povrchu. Výhodněji jsou zesítěnými protilátkami anti-LT-P-R nekovalentně agre15 gované protilátky anti-LT-P-R v roztoku pomocí činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-p-R. S výhodou činidlo zesíťující protilátky anti-LT-P-R zahrnuje sekundární protilátku zaměřenou proti protilátce anti-LT-P-R. Zesítěnými protilátkami anti-LT-P-R jsou výhodně kovalentně agregované protilátky anti-LT-P-R v roztoku pomocí chemického činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-P-R. Výhodné jsou farmaceutické kompozice obsahující jako druhé LT-P-R aktivující činidlo dále IFN-γ.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou rovněž farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho LT-P-R aktivujícího činidla a farmaceuticky přijatelný nosič, přičemž jedno LT-P-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-p-R. Výhodně je v těchto kompozicích protilátkou anti-LT-P-R monoklonální protilátka. S výhodou se protilátka vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky. Ještě výhodněji protilátka obsahuje variabilní domény anti-LT-P-R. Výhodné farmaceutické kompozice obsahují jako protilátku anti-LT-p-R CBE11. V těchto kompozicích se může použít protilátka anti-LT-p-R, která se váže na stejný epitop jako CBE11. S výhodou se protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické kompozice obsahující protilátku anti-LT-P-R, přičemž výhodně je protilátkou anti-LT-p-R agonista nebo antagonista LT-P-R. Výhodněji je protilátkou anti-LT-P-R monoklonální protilátka. Dále se protilátka může vybrat ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky. Protilátkou anti-LT-P-R je podle vynálezu dále CBE11. Protilátka anti-LT-p-R může být rovněž zaměřena na stejný epitop jako CBE11. Výhodně se protilátka anti-LT-p-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je protilátka vytvářená hybridomem vybraným ze skupiny sestávající zCB.Ell.l (přírůstkové č. ATCC HB11793), BK.A11.AC10 (přírůstkové č. ATCC HB11799), CD.H10.1 (přírůstkové č. ATCC HB11797), BC.G6.AF5 (přírůstkové č. ATCC HB11794) a BH.A10 (přírůstkové č. ATCC HB11795). Předmětem vynálezu je rovněž buňka hybridomu vybraného ze skupiny sestávající z CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793),

BK.A11.AC10 (přírůstkové č. ATCC HB11799), CD.H10.1 (přírůstkové č. ATCC HB11797),

BC.G6.AF5 (přírůstkové č. ATCC HB11794) a BH.A10 (přírůstkové č. ATCC HB11795).

Výhodnou protilátkou podle vynálezu je protilátka obsahující variabilní domény anti-LT-P-R odpovídající protilátce vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793).

Výhodnou protilátkou podle vynálezu je rovněž protilátka anti-LT-p-R obsahující antigen vázající oblast z myší monoklonální protilátky CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793). Výhodně je protilátka anti-LT-p-R chimérická nebo multivalentní. Protilátka anti-LT-p-R je

-5CZ 298711 B6 s výhodou humanizovaná. Výhodněji protilátka anti-LT-p-R obsahuje konstantní oblast lidského IgG, kterou je výhodně konstantní oblast IgGl. Nejvýhodněji je protilátkou anti-LT-p-R fragment F(ab)₂.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž humanizovaná protilátka anti-LT-p-R obsahující antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793) a konstantní oblast lidského IgG. Výhodně je konstantní oblastí lidského IgG konstantní oblast IgGl.

ío Dalším předmětem vynálezu jsou výše uvedené farmaceutické kompozice, ve kterých protilátka anti-LT-p-R obsahuje antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793). V takových farmaceutických kompozicích může být protilátka s výhodou chimérická nebo multivalentní, výhodněji humanizovaná. Nejvýhodnější jsou farmaceutické kompozice, ve kterých protilátka obsahuje konstantní oblast lidského IgG, přičemž tou je s výhodou konstantní oblast IgGl. Výhodné jsou rovněž farmaceutické kompozice, ve kterých je protilátkou fragment F(ab)₂.

Předmětem vynálezu jsou rovněž výše uvedená použití, při nichž protilátka anti-LT-P-R obsahuje antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové

č. ATCC HB11793). Při takovém použití se protilátka anti-LT-p-R s výhodou vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, multivalentní protilátky a humanizované protilátky. Nejvýhodněji se takto použije jako protilátka fragment F(ab)₂. Výhodná použití podle vynálezu dále zahrnují aplikaci protinádorové terapie, přičemž s výhodou je protinádorovou terapií ozařování nebo chemoterapie. Výhodná použití podle vynálezu dále zahrnují podávání LT-P-R aktivují25 čího činidla, přičemž s výhodou se LT-P-R aktivující činidlo vybere ze skupiny sestávající z IFN-α, TNF, interferon indukujícího činidla a protilátky.

Vynález je ilustrován na přiložených výkresech takto:

Obrázek 1A

Třídicí analýzy purifikovaných forem LT-α/ρ heteromemího komplexu rozdělených pomocí TNF-R a LT-p-R imunoafinitní chromatografie

Purifikované proteiny byly analyzovány na pryskyřici TSK 3000 HPLC ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosfátem. Je znázorněna poloha různých ukazatelů velikosti.

Obrázek 1B

Iontoměničové analýzy purifikovaných LT forem za použití karboxymethylové kolony Poros (4,6 mm x 100 mm) na přístroji BioCad (Perceptive Biosystems) pg každého vzorku proteinu se vneslo na kolonu a eluovalo se v gradientu 0 až 1 M NaCl přes

20 objemů kolony při 5 ml/minuta v pufru obsahujícím 16,66 μΜ Hepes, 16,66 μΜ octanu sodného a 16,66 μΜ pufru Mes (pH 6,5).

Obrázek 2A

Srovnání cytotoxické aktivity Anti-Fas receptoru mAb CH-11 (-·-), TNF (-o-), LT-alfa (-□-).

LT-alfal/beta2 (--) a LT-alfa2/betal (-♦-) na humánní adenokarcinomatózní buňky HT29 jak v přítomnosti tak v nepřítomnosti 80 U/ml IFN-gama.

Obrázek 2B

Srovnání schopnosti 5 pg/ml humánního IgG (-·-), rozpustného p60TNF-R-Fc (-o-) a rozpust50 ných LT-beta-R-Fc receptor-imunoglobulinových chimér (-□-) inhibovat cytotoxické účinky v obr. 2A za přítomnosti 80 U/ml IFN-gama.

-6CZ 298711 B6

Obrázek 3

Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky potencují cytotoxický účinek LT-alfal/beta2 na humánní adenokarcinomatózní buňky HT29.

(A) Cytotoxické účinky LT-alfal/beta2 na buňky HT29 jsou potencovány přítomností anti-LTbeta-R monoklonálních protilátek CDH10.

Účinky LT-alfal/beta2 byly změřeny bez monoklonální protilátky (—·—) a v přítomnosti ío 0,5 pg/ml kontrolního IgGl (--), 0,05 pg/ml CDH10 (-o-) a 0,5 pg/ml (-□-) CDH10.

(B) Cytolytické účinky LT-alfal/beta2 na buňky HT29 jsou inhibovány přítomností anti-LTbeta-R monoklonální protilátky BDA8.

Účinky LT-alfal/beta2 byly změřeny za přítomnosti 2 pg/ml kontrolního IgGl (——), nebo antiLT-beta-R monoklonální protilátky BDA8 (-□-). Rozdíl mezi chováním CDH10 a BDA8 antiLT-beta-R monoklonálních protilátek v tomto testu je jednou z indikací, že jsou zaměřeny na rozdílné epitopy LT-beta-R.

Obrázek 4

Imobilizované anti-LT-beta-R protilátky jsou cytotoxické vůči humánním adenokarcinomatózním buňkám HT29.

(A) Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky mají přímý cytotoxický účinek na buňky HT29, když jsou imobilizovány na povrchu.

Destičky byly pokryty IgGl (-·-), monoklonální protilátkou zaměřenou proti nepříbuznému hojnému antigenu buněčného povrchu HT29/26 (--), BDA8 (-o-) a CDH10 (-□-).

(B) Účinky rozpustných anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek samotných na růst buněk

HT29.

Symboly jako v (A). Tyto anti-LT-beta-R monoklonální protilátky ve své rozpustné formě nemají významné cytotoxické účinky na buňky HT29, když jsou aplikovány individuálně.

Obrázek 5

Reprezentativní kvantifikace zvýšené cytotoxicity vůči nádorovým buňkám působením dvojic rozpustných anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek.

(A) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl (100 ng/ml), anti-LT-beta-R mAb BHA10 (100 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky CBE11 (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml) a BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml) na buňky HT29. IFN-gama byl přítomen s 80 U/ml.

(B) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl (100 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky

CDH10 (100 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky CBE11 (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + IgGl (100 ng/ml) a CDH10 (100 ng/ml + CBE11 (50 ng/ml) na buňky HT29. IFN-gama byl přítomen s 80 U/ml.

(C) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl (100 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky

CDH10 (33 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky AGH1 (50 ng/ml) a CDH10 (33 ng/ml + AGH1 (50 ng/ml) na buňky HT29. IFN-gama byl přítomen s 80 U/ml.

-7CZ 298711 B6 (D) Jako u (C) s tím rozdílem, že v cytotoxickém testu byly použity humánní adenokarcinomatózní WiDr buňky (Raitano a Korc, J. Biol. Chen., 265, str. 10465 až 10472 (1990)).

Obrázek 6

Velikost nádoru u myší SCID léčených protilátkou anti-LT-beta-R (A) Velikost humánního adenokarcinomu WiDr u myší SCID 30 dní pro inokulaci se současnou léčbou protilátkou

Myším byl aplikován 1. a 2. den fyziologický roztok, samotný IFN-gama, anti-LT-beta-R ío monoklonální protilátka (CBE11) sa bez IFN-gama a kontrolní anti-humánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) s IFN-gama. Průměr z každé skupiny je naznačen příčnou čarou.

Průměry, standardní odchylky a počet zvířat (v závorkách) pro pět skupin (odleva doprava) byly: 0,88 +/- 0,59 (14), 1,21 +/-0,7(21), 0,041 +/-0,052(16), 0,11 +/-0,1 (12) a 0,98+/-1,16 (12).

(B) Velikost humánního adenokarcinomu WiDr u myší SCID od 14. do 49. dne po inokulaci nádorových buněk s 15 denní postinokulační léčbou protilátkou

Nádory se nechaly narůst do středního průměru 0,53 cm (0,076 cm³) bez jakékoliv léčby a s i.p. injekcemi se započalo 15. den a pokračovalo se, jak naznačeno šipkami. Průměry a standardní odchylky jsou naznačeny pro skupinu 12 zvířat léčených buď samotným IFN-gama (1 x 10⁶

U/injekce) (—IFN-gama s 50 pg 1E6 anti-FFA-3 monoklonální protilátky (—), IFN-gama s pg CBE11 anti-FT-beta-R monoklonální protilátky (—) nebo 50 pg CBE11 anti-LT-betaR monoklonální protilátky samotné (neznázoměno).

Aby byl zde popsaný vynález zcela srozumitelný, je dále uveden následující detailní popis.

Výraz „protinádorová aktivita“ se týká schopnosti substance nebo prostředku blokovat proliferaci nádorových buněk nebo indukovat smrt nádorových buněk, u nichž dochází k interakci s uvedenou substancí nebo prostředkem.

Výraz „apoptóza“ se týká procesu naprogramované smrti buněk.

Výraz „cytotoxická aktivita“ se týká schopnosti substance nebo prostředku vyvolat smrt buněk, u nichž dochází k interakci s touto substancí nebo prostředkem.

Výraz „epitop“ (nebo antigenní determinanta) znamená část molekuly, která se spojuje s jediným místem na molekule protilátky pro vázání antigenu. Jediný epitop se rozpoznává monoklonální protilátkou (mAb). Více epitopů se normálně rozpoznává polyklonálními protilátkami (Ab).

„Fc doména“ protilátky se týká části molekuly obsahující CH₂, CH₃ a pantové oblasti, ale postrádající vazebná místa pro antigen.

Výraz „činidlo indukující interferon“ se týká kteréhokoliv činidla, které je schopno přímo nebo nepřímo stimulovat endogenní produkci libovolného interferonu typu I (IFN-alfa, IFN-beta) nebo typu II (IFN-gama). Příklady činidel indukujících interferon zahrnují molekuly s dvouřetězcovou RNA a řadu sloučenin odvozených od rostlin nebo sloučenin připravených farmaceuticky.

Výrazy „LT-alfa mutein“ a „LT-beta mutein“ se týkají LT-alfa nebo FT-beta polypeptidů, které mají jednu nebo více změn aminokyselin ve srovnání se sekvencí aminokyselin odpovídajícího nativního polypeptidu.

Výraz „LT-beta-R aktivující činidlo“ se týká libovolného činidla, které může zvýšit vazbu ligandů na FT-beta-R, kumulaci FT-beta-R na povrchu buněk nebo signalizaci LT-beta-R nebo které může ovlivnit, jak je signál LT-beta-R interpretován uvnitř buňky. Příklady LT-beta-R aktivujících činidel zahrnují IFN-alfa, IFN-gama, TNF, interferon indukující činidla, rozpustné

-8CZ 298711 B6 anti-LT-beta-R protilátky, zesítěné anti-LT-beta-R protilátky a multivalentní anti-LT-beta-R protilátky.

Výraz „LT-beta-R signalizace“ se týká všech molekulárních reakcí spojených s LT-beta-R cestou a následujících molekulárních reakcí, které z ní vyplývají.

Výraz „protilátka anti-LT-beta-receptoru“ („anti-LT-beta-R Ab“) se týká libovolné protilátky, která rozpoznává a váže se nejméně najeden epitop LT-beta receptoru.

Výraz „monoklonální protilátka anti-LT-beta receptoru“ („anti-LT-beta-R mAb“) se týká libovolné monoklonální protilátky, která rozpoznává a váže se na jediný epitop LT-beta-R.

Výraz „zesítěné anti-LT-beta-R (m)Abs“ se týká protilátek zaměřených proti LT-beta-R, které buď byly zesítěny vzájemně na aglomeráty protilátek v roztoku za použití zesíťovacího činidla anti-LT-beta-R protilátky (Ab) nebo (mAb) nebo které byly imobilizovány ve vzájemné těsné blízkosti na povrchu nebo na matrici.

Výraz „zesíťovací činidlo anti-LT-beta-R protilátky (nebo monoklonální protilátky)“ se týká libovolného činidla, které je schopno kovalentně nebo nekovalentně agregovat anti-LT-beta-R protilátky v roztoku, takže se protilátky mohou vázat na a potencovat kumulaci LT-beta recepto20 rů na cílovém buněčném povrchu. Taková zesíťovací činidla zahrnují, aniž by se na ně omezovala, chemická zesíťovací činidla, sekundární protilátky, které reagují s částmi anti-LT-beta-R protilátek nebo monoklonálních protilátek, a rozpustné nebo na povrch vázané Fc receptory — buď endogenní nebo přidané exogenně--které jsou schopny se vázat na anti-FT-beta-R protilátky.

Výrazy „LT-alfa biologická aktivita“, „LT-beta biologická aktivta“ a „LT-alfa/beta biologická aktivita“ jsou definovány jako: 1) imunologická křížová reaktivita s protilátkou zaměřenou proti nejméně jednomu epitopu odpovídající nativní podjednotky nebo komplexu podjednotek nebo 2) schopnost LT podjednotky nebo komplexu podjednotek soutěžit o vazebná místa pro ligandy na LT-specifickém receptoru jako je TNF-R nebo LT-beta-R nebo 3) že jsou schopny stimu30 lovat imunní regulační odpověď nebo cytotoxickou aktivitu kvalitativně společnou s nativní LT podjednotkou nebo komplexem.

Výraz „LT-alfa/beta heteromemí komplex“ se týká stabilního spojení mezi nejméně jednou podjednotkou LT-alfa a více než jednou podjednotkou LT-beta. Podjednotky se mohou spojovat elektrostatickými, van der Waalsovými nebo kovalentními vazbami. Heteromemí komplex LTalfa/beta má s výhodou nejméně dvě sousední podjednotky LT-beta a neobsahuje žádné sousední podjednotky LT-alfa. Nejvýhodněji má komplex stechiometrii LT-alfal/beta2.

Výraz „multivalentní ligand“ se týká molekuly nebo komplexu, který má více než jedno vazebné místo pro receptory a je schopen současně vázat a přivést do těsné blízkosti nejméně dvě receptorové molekuly.

„Vedoucí sekvence typu I“ je amino-terminální část eukaryotického proteinu, která slouží jako signál k řízení proteinu k endoplazmatické retikulámí (ER) membráně a často celou sekreční cestou. Vedoucí sekvence se obvykle odštěpuje signální peptidázou v ER membráně.

„Signální sekvence“ je funkční ekvivalent eukaryotického typu I vedoucí sekvence v prokaryotických hostitelích a řídí translokaci proteinu do nebo přes lipidové dvouvrstvé membrány bakterie.

„Rozpustný LT-alfa/beta heteromemí komplex“ je LT-alfa/beta heteromemí komplex obsahující rozpustné podjednotky LT-beta, ve kterých byly sekvence aminokyselin, které lokalizují polypeptid k membráně, vypuštěny nebo inaktivovány, čímž se LT-beta jednotka stane

-9CZ 298711 B6 rozpustnou. Rozpustné LT-alfa/beta heteromemí komplexy mohou být sekretovány vhodnou hostitelskou buňkou, která byla sestrojena pro expresi obou podjednotek.

„Povrchový LT-alfa/beta komplex“ je komplex obsahující podjednotky LT-alfa a LT-beta, vázané na membránu, která je upravena na povrchu buněk.

Produkce LT-alfa/beta komplexů, vázaných na membránu

Lymfotoxinové komplexy buněčného povrchu byly charakterizovány v CD4⁺ T celulámích hybridomových buňkách (11-23.D7), které exprimují vysoké hladiny LT (Browning a spol., J. ío Immunol., 147, str. 1230 až 1237 (1991), Androlewicz a spol., J. Biol. Chem., 267, str. 2542 až

2547 (1992). Zralý LT-alfa postrádá transmembrální doménu a je umístěn k povrchu buňky interakcí nejméně s jednou k membráně vázanou LT-beta podjednotkou. S membránou vázané (povrchově) heteromemí komplexy mají převážně LT-alfal/beta2 stechiometrii.

LT-beta jako buněčný membránový protein váže LT-alfa během syntézy, tedy „zaměřuje“ LTalfa k buněčné membráně. V nepřítomnosti LT-beta je LT-alfa sekretován do extracelulámího média. LT podjednotky se normálně spojují do komplexů uvnitř buňky před exportem proteinu do membrány. Jakmile jsou LT-beta podjednotky vneseny do membrány, netvoří stabilní komplexy se sekretovaným LT-alfa. Je-li tedy požadována forma LT-alfa/beta heteromemího komplexu vázaná na membránu, je výhodné společně exprimovat žádoucí LT-alfa a LT-beta podjednotky uvnitř téže buňky.

Povrchový LT-alfa/beta heteromemí komplex může být rekonstruován kotransfekcí hostitelských buněk s oběma LT-alfa a LT-beta geny. Povrchové LT komplexy nemohou být pozorová25 ny na stabilních buněčných liniích, které exprimují jeden nebo druhý LT gen samotný. Když však hostitelská buňka produkuje normálně velká množství LT-alfa (například buňky RPMI 1788, viz níže), pak by transfekce LT-beta genem, který kóduje požadovaný LT-beta polypeptid, měla být dostatečná k vytvoření LT-alfa/beta komplexů, obsahujících LT-alfa podjednotky plné délky.

Společná exprese LT-alfa a LT-beta polypeptidů v řadě eukaryotických expresních systémů vede k jejich spojení a exportu jako aktivního ligandu (Crowe a spol., J. Immunol. Methods, 168, 79 až 89 (1994)). K použitelným hostitelským systémům patří, aniž by na ně byly omezeny, CHO buňky, COS buňky, B buňky zahrnující myelomy, bakulovirem infikované hmyzí buňky a kvasinky.

LT-alfa podjednotka heteromemích komplexů LT-alfa/beta podle vynálezu může být selektována z lymfotoxinu-alfa, humánního nebo zvířecího lymfotoxinu-alfa, rekombinantního lymfotoxinu-alfa, rozpustného lymfotoxinu-alfa, sekretovaného lymfotoxinu-alfa, muteinů lymfotoxinu-alfa, které mají LT-alfa biologickou aktivitu, nebo fragmentů lymfotoxinu-alfa kteréhokoliv ze shora uvedených s biologickou aktivitou LT-alfa.

LT-alfa polypeptid může být kterákoliv rozpustná forma molekuly včetně jejích aktivních fragmentů, která může být vytvořena v eukaryotických expresních systémech, kde bude přírodní LT-alfa vedoucí sekvence odštěpena. Alternativně mohou být použity k maximalizaci sekrece

LT-alfa v jiných hostitelských systémech fůze zralé LT-alfa sekvence s heterologickou signální sekvencí. Signály jsou zvoleny na bázi předpokládané hostitelské buňky a mohou zahrnovat bakteriální, kvasinkové, savčí a virové sekvence. Nativní signál nebo vaskulámí buněčná molekulámí-1 (VCAM-1) signální sekvence jsou vhodné k použití v savčích expresních systémech.

LT-alfa polypeptidy mohou být též fúzovány s polypeptidy s prodlouženým plazmatickým poločasem životnosti, jako jsou imunoglobulinové řetězce nebo jejich fragmenty. Plazmatické proteiny, které mohou být použity ke zvýšení poločasu životnosti plazmy, zahrnují sérový albumin, imunoglobuliny, apolipoproteiny a transferin. Připojení polyethylenglykolu (PEG) může stabilizovat polypeptid a snížit jeho imunogenicitu. S výhodou není LT—alfa fúzní protein významně

-10CZ 298711 B6 imunogenní v jedinci, který má být léčen, a plazmatický protein nezpůsobuje u jedinců v důsledku své normální biologické aktivity nežádoucí vedlejší účinky.

Humánní LT-alfa je glykosylován na N a O zbytcích a v závislosti na zdroji se vyznačuje značnou mikroheterogenitou založenou na cukru. Oligosacharidový prostředek příslušného LTalfa zvolený k vytvoření LT komplexu může ovlivnit in vivo rychlosti clearance (Fukushima a spol., Arch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993)). Protože varianty glykosylace mohou být vytvořeny expresí v různých hostitelských buňkách, je to jeden faktor, který má být zvážen při selekci zdroje LT-alfa.

LT-alfa může být purifikován od B lymfoblastoidní linie RMPI 1788, která konstitutivně sekretuje LT-alfa a může být indukována k sekreci vyšších hladin působením forbolesteru PMA (Aggarwal a spol., J. Biol. Chem., 259, str. 686 až 691 (1984)). Alternativně může být použit klonovaný humánní LT-alfa gen, aby produkoval rekombinantně LT-alfa polypeptidy v různých hostitelských systémech včetně bakterií (Schoenfeld a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 3863 až 3869 (1991)), bakulovirem infikovaných hmyzích buněk (Crowe a spol., J. Immunol. Methods, 168, str. 70 až 89 (1994)) a savčích buněk (Browning a Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989), Fukushima a spol., Arch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993)).

Části LT-alfa genu, které kódují polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou LT-alfa, mohou být vyhodnoceny za použití rutinních screeningových testů. K užitečným screeningovým testům na LT-alfa biologickou aktivitu patří kompetitivní inhibiční testy s nativním LT-alfa vázaným na TNF-R nebo měření přímé nebo nepřímé inhibiční schopnosti LT-alfa indukovat cytotoxicitu nádorových buněk v testech o sobě známých v oboru. LT-alfa fragmenty se s výhodou spojí do heteromerních komplexů s LT-beta a komplexy se testují na LT-alfa/beta biologickou aktivitu kompetitivní inhibici s LT-alfa/beta vázaným na LT-beta-R nebo na jejich schopnost indukovat cytotoxicitu nádorových buněk v zde popsaných testech.

Lymfotoxin-beta, označovaný též jako p33, byl identifikován na povrchu T lymfocytů, T buněčných linií, B buněčných linií a lymfokiny aktivovaných smrtících buněk. LT-beta je předmětem souběžné mezinárodní přihlášky PCT/US91/04588 přihlašovatelů této patentové přihlášky, zveřejněné 9. ledna 1992 jako WO 92/00329 a mezinárodní přihlášky PCT/US93/11669, zveřejněné 23. června 1994 jako WO 94/13808.

LT-beta gen kóduje polypeptid o 240 až 244 aminokyselinách (Browning a spol., Cell, 72, str. 847 až 856 (1993)). LT-beta je membránový protein typu II s krátkou N-terminální cytoplazmatickou doménou, následovanou doménou zakotvující membránu s 30 hydrofobními aminokyselinami. Má jediné glykosylační místo vázané na N a má pouze jeden cysteinový zbytek, který, jak se zdá, se nezúčastňuje tvorby disulfidové vazby mezi podjednotkami.

LT-beta podjednotky obsahující LT-alfa/beta heteromemí komplexy podle vynálezu mohou být zvoleny z lymfotoxinu-beta, nativního humánního nebo zvířecího lymfotoxinu-beta, rekombinantního lymfotoxinu-beta, rozpustného lymfotoxinu-beta, sekretovaného lymfotoxinu-beta, muteinů lymfotoxinu-beta s biologickou aktivitou LT-beta nebo fragmentů lymfotoxinu-beta kteréhokoliv ze shora uvedených s biologickou aktivitou LT-beta.

Jak shora uvedeno pro LT—alfa polypeptid, mohou být též LT—beta polypeptidy modifikovány ke zvýšení jejich rozpustnosti nebo poločasu životnosti plazmy za použití stejných metod. Podobně mohou být části LT-beta genu, které kódují polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou

LT-beta, vyhodnoceny za použití rutinních screeningových testů, jak uvedeno pro LT-alfa. Produkce rozpustných komplexů

Rozpustné (nevázané na membránu) LT-alfa/beta heteromemí komplexy obsahují LT-beta podjednotky, které byly změněny z formy vázané na membránu na rozpustnou formu. Tyto

-11 CZ 298711 B6 komplexy jsou popsány detailně v souběžné mezinárodní přihlášce přihlašovatelů (PCT/US93/11669, zveřejněné 9. ledna 1992 jako WO 94/13808). Rozpustné LT-beta peptidy jsou definovány sekvencí aminokyselin lymfotoxinu-beta, přičemž sekvence je rozštěpena v libovolném bodě mezi koncem transmembrální oblasti (tj. asi u aminokyseliny č. 44) a první homologní oblastí TNF (ti. u aminokyseliny č. 88) podle číslovacího systému Browninga a spol., Cell, 72, str. 847 až 856 (1993)).

Rozpustné LT-beta polypeptidy mohou být produkovány oddělením N-konce LT-beta k odstranění cytoplazmatického konce a transmembrální oblasti (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Alternativně může být transmembrální doména inaktivována vypuštěním nebo ío nahražením normálně hydrofobních zbytků aminokyselin, které obsahují transmembrální doménu, hydrofilními zbytky aminokyselin. V každém případě se vytvoří značně hydrofilní hydropatický profil, který snižuje afinitu lipidů a zlepšuje rozpustnost ve vodě. Přednost se dává odstranění transmembrální domény před náhradou hydrofilními zbytky aminokyselin, protože se tím zamezuje zavedení potenciálně imunogenních epitopů.

Odstraněná nebo inaktivovaná transmembrální doména může být nahrazena nebo připojena k vedoucí sekvenci typu I (tj. k vedoucí sekvenci VCAM-1) tak, že protein je sekretován počínaje kdekoliv od mezi val 140 do pro88. Rozpustné LT-beta polypeptidy mohou obsahovat libovolný počet dobře známých vedoucích sekvencí na N-konci. Taková sekvence by dovolila, aby peptidy byly exprimovány a zacíleny k sekreční cestě v eukaryotickém systému. Viz např. Ernst a spol., patent US 5 082 783 (1992).

Rozpustné LT-alfa/beta heteromemí komplexy mohou být produkovány kotransfekcí vhodné hostitelské buňky s DNA kódující LT-alfa a rozpustný LT-beta (Crowe a spol., J. Immunol.

Methods, 168, str. 79 až 89 (1994)). Rozpustný LT-beta sekretovaný v nepřítomnosti LT-alfa je vysoce oligomerizován. Avšak když je exprimován společně s LT-alfa, vytvoří se 70 kD jakoby trimemí struktura, která obsahuje oba proteiny. Je též možno produkovat rozpustné LT alfal/beta2 heteromemí komplexy transfekcí buněčné linie, která normálně exprimuje pouze LTalfa (tak jako shora zmíněné buňky RPMI 1788) genetickým kódováním rozpustného LT-beta polypeptidu.

LT-alfa a LT-beta polypeptidy mohou být syntetizovány odděleně denaturovány použitím mírných detergentů, vzájemně smíšeny a renaturovány odstraněním detergentu, čímž se vytvoří smíšené LT heteromemí komplexy, které mohou být rozděleny (viz níže).

Purifikace LT-alfal/beta2 komplexů

Rozpustné LT-alfa l/beta2 heteromemí komplexy se oddělí od koexpresních komplexů, obsahujících různou podjednotkovou stechiometrii, chromatografií za použití TNF a LT-beta receptorů jako afinitních purifikačních činidel. TNF receptory se váží pouze v alfa/alfa rozštěpech LT komplexů. LT-beta receptor se váže s vysokou afinitou na beta/beta rozštěpy a s nižší afinitou na alfa/beta rozštěpy heteromemích LT-alfa/beta komplexů. LT-alfa3 a LT-alfa2/betal se tedy budou vázat na TNF-R. LT-beta-R může též vázat trimery LT-alfa2/betal (v rozštěpech alfa/beta), ale nemůže vázat LT-alfa3. Kromě toho LT-beta-R (ale ne TNF-R) váže LTalfa l/beta2 a LT-beta(n) (přesné složení takovéhoto přípravku není známo, jsou to však velké agregáty).

Reagencie s afinitou k receptoru mohou být připraveny bud’ jako rozpustná extracelulámí doména (viz například Loetscher a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329 (1991)) nebo jako chimérické proteiny s extracelulámí doménou pro vazbu ligandů připojenou k doméně imunoglobulinu Fc (Loetscher a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329 (1991), Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Receptory se připojují kafinitním matricím chemickým zesítěním za použití rutinních postupů.

Existují dvě schémata, kterými LT-alfal/beta2 ligand může být purifikován za použití receptorů a imunoafinitní chromatografie. V prvním schématu se vede supematant z vhodného expresního

- 12CZ 298711 B6 systému, který exprimuje společně jak LT-alfa formu, tak seříznutou LT-beta formu, přes TNFR kolonu. TNF-R bude vázat LT-alfa3 a LT-alfa2/betal trimery. Průtok TNF-R kolonou bude obsahovat LT-beta(n) a LT-alfa l/beta2.

Ve druhém schématu všechny formy obsahující LT-beta (LT-beta(n), LT-alfal/beta2 a LTalfa2/betal) jsou vázány na a eluovány z LT-beta-R kolony za použití klasických metod, jako chaotropu nebo změny pH. (LT-alfa3 protéká touto kolonou). Eluát je neutralizován nebo chaotrop odstraněn a eluát se pak vede přes TNF-R kolonu, která váže pouze LT-alfa2/betal trimery. Průtok touto kolonou bude obsahovat LT-beta(n) a LT-alfal/beta2 trimery.

V obou případech mohou být čisté trimery odděleny od LT-beta následující gelovou filtrací nebo/a o sobě známými postupy iontoměničové chromatografie.

Alternativně mohou být různé formy LT-alfa/beta heteromemích komplexů odděleny a purifiko15 vány řadou obvyklých chromatografických prostředků. Může být též výhodné kombinovat sérii obvyklých purifikaěních schémat s některým z imunoafinitních purifikačních operací popsaných shora.

Zdroj anti-LT-beta-R protilátek

Polyklonální protilátková séra zaměřená proti lidskému LT-beta receptoru se připravují použitím konvenčních metod tím, že se zvířatům, jako kozám, králíkům nebo myším, aplikuje subkutánní injekcí humánní fúzní protein mezi LT-beta receptorem a Fc (příklad 2) v kompletním Freundově adjuvantu, následované druhou intraperitoneální nebo subkutánní injekcí v kompletním Freundu. Polyklonální antiséra obsahující požadované protilátky, které jsou zaměřeny proti LT25 beta receptoru, se podrobí screeningu konvenčními postupy.

Myší monoklonální protilátky (mAbs) zaměřené proti humánnímu fůznímu proteinu mezi LTbeta receptorem a Fc se připravují intraperitoneální imunizací myší RBF opakovaně pomocí od CHO buňky odvozeného rekombinantního fúzního proteinu mezi LT-beta receptorem a Fc (LT-beta-R-Fc) vázaného na protein A sefarózu v nepřítomnosti adjuvantu. Nakonec se zvířatům aplikuje druhá injekce rozpustného LT-beta-R-Fc (jak i.p., tak i.v.), slezinné buňky se fuzují za použití klasických protokolů a hybridomy se podrobí screeningu za použití testu ELISA (Ling a spol., J. Interferon and Cytokine Res., 15, str. 53 až 59 (1995)). Hybridomy se dále podrobí screeningu ke zjištění jejich schopnosti blokovat vázání aktivovaných hybridomových buněk 11-23 — které exprimují povrchový LT-alfal/beta2 — na destičky potažené LT-beta-RFc. Čisté monoklonální protilátky se připravují purifikací IgG ze supematantů kultury hybridomu proteinem A sefarózou.

Je též možno připravit různé formy anti-LT-beta-R protilátek použitím standardních metod rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře, 349, str. 293 až 299 (1991)). Mohou být například sestrojeny „chimérické“ protilátky, ve kterých je doména vázající antigen ze zvířecí protilátky napojena na humánní konstantní doménu (např. Cabilly a spol., US 4,816.567, Morrison a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81, str. 6851 až 6855 (1984)). Chimérické protilátky redukují pozorované imunogenní odpovědi vyvolané zvířecími protilátkami, když jsou použity při klinické léčbě lidí.

Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní „humanizované protilátky“, které rozpoznávají LT-beta-R. Humánní protilátky jsou chiméry obsahující většinou humánní IgG sekvence, do kterých byly vloženy oblasti odpovídající za specifické vázání antigenu (např. WO 94/04679).

Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, příslušné protilátky se izolují a část sekvencí variabilní oblasti odpovídající za specifické vázání antigenu se odstraní. Oblasti vázající antigen odvozené od zvířat se pak klonují do odpovídající pozice genů humánní protilátky, ve které byly odstraněny oblasti pro vazbu antigenu. Humanizované protilátky minimalizují použití heterolog- 13CZ 298711 B6 nich (mezidruhových) sekvencí v humánních protilátkách a méně pravděpodobně vyvolají imunitní odpovědi v léčeném jedinci.

Konstrukce různých tříd rekombinantních anti-LT-beta-R protilátek může být též provedena vytvořením chimérických nebo humanizovaných protilátek obsahujících anti-LT-beta-R variabilní domény a humánní konstantní domény (CH1, CH2, CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Například anti-LT-beta-R IgM protilátky se zvýšenými valencemi místa pro vazbu antigenu mohou být rekombinantně produkovány klonováním místa pro vazbu antigenu do vektorů nesoucích konstantní oblasti humánního μ řetězce (Arulanandam a spol., J. Exp. Med.,

177, str. 1439 až 1450 (1993), Lané a spol., Eur. J. Immunol., 22, str. 2573 až 2578 (1993),

Traunecker a spol., Nátuře, 339, str. 68 až 70 (1989).

Mimo to mohou být standardní techniky rekombinantní DNA použity ke změně vazebných afinit rekombinantních protilátek k jejich antigenům změnou zbytků aminokyselin v blízkosti vazeb15 ných míst pro antigen. Vazebná afinita humanizované protilátky k antigenu může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulárním modelování (Queen a spol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, str. 10029 až 10033 (1989), WO 94/04679).

Může být žádoucí zvýšit nebo snížit afinitu anti-LT-beta-R protilátek k LT-beta-R v závislosti na cílovém typu tkáně nebo příslušném uvažovaném plánu léčby. Například může být výhodné pro semiprofylaktické léčby léčit pacienta konstantními hladinami anti-LT-beta-R protilátek se sníženou schopností signalizovat LT-beta cestou. Podobně mohou být anti-LT-beta-R protilátky se zvýšenou afinitou k LT-beta-R výhodné pro krátkodobé léčby cílené proti nádoru.

Screening anti-LT-beta-R protilátek na LT-beta-R aktivující činidla

Anti-LT-beta-R protilátky podle vynálezu mohou potencovat protinádorovou aktivitu LTalfa/beta heteromemích komplexů (s výhodou LT-alfal/beta2) za přítomnosti LT-beta-R aktivujícího činidla jako je IFN-gama. Tyto anti-LT-beta-R protilátky jsou zde také uváděny jako LT-beta-R aktivující činidla. Protilátky, které působí jako aktivující činidla, jsou selektovány následovně:

1) Série jamek pro tkáňové kultury obsahující nádorové buňky jako buňky HT29 se kultivují tři až čtyři dny v médiu obsahujícím LT-beta-R aktivující činidlo, jako je IFN-gama a purifikovaný LT-alfa/beta heteromemí komplex — s výhodou LT-alfal/beta2 — v přítomnosti nebo nepřítomnosti postupných ředění testované anti-LT-beta-R protilátky.

2) Ke směsi buněk se přidá vitální barvivo, které měří mitochondriální funkci jako MTT, a nechá se reagovat několik hodin.

3) Kvantifikuje se optická hustota (OD) směsi v každé jamce při vlnové délce světla 550 nm (OD 550). OD 550 je nepřímo úměrná počtu nádorových buněk usmrcených v přítomnosti LTalfa/beta heteromemího komplexu, LT-beta-R aktivujícího činidla a testované anti-LT-beta-R protilátky v každé jamce.

Výhodné protilátky podle vynálezu, které působí individuálně jako LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti LT-alfal/beta2 a IFN-gama, zahrnují BKA11, CDH10, BHA10 a BCG6 anti-LTbeta-R monoklonální protilátky (Tabulka 2, viz níže).

Zesítění anti-LT-beta-R protilátek

Zesítěné anti-LT-beta-R protilátky podle vynálezu působí individuálně jako LT-beta-R aktivující činidla bez exogenních LT-alfa/beta heteromemích komplexů v přítomnosti druhého LTbeta-R aktivujícího činidla, jako je IFN-gama. Zesítěné anti-LT-beta-R protilátky se zřejmě váží na a indukují kumulaci LT-beta receptorů buněčného povrchu, čímž aktivují LT-beta receptorem zprostředkovanou cílenou smrt buněk.

-14CZ 298711 B6

Podle jednoho provedení je jeden nebo více typů anti-beta-R protilátek zesítěno imobilizací na ve vodě nerozpustné matrici nebo povrchu. Derivatizace s bifunkčním činidlem je užitečná pro zesítění protilátek na ve vodě nerozpustnou nosnou matrici nebo povrch. Činidla běžně používaná k provedení zesítění protilátek na vodou nerozpustnou nosnou matrici nebo povrch zahrnují l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenylethan, glutaraldehyd, estery N-hydroxysukcinamidu včetně esterů s 4-azidosalicylovou kyselinou, homobifunkční imidoestery včetně disukcinimidylesterů a bifunkční maleinimidy jako například bis-N-maleinimido-l,8-oktan. Derivatizační činidla jako methyl-3-((p-azidofenyl)dithio)propioimidát tvoří fotoaktivovatelné meziprodukty, které mohou být selektivně zesítěny, když jsou stimulovány světlem. Reaktivní ve vodě nerozpustné matrice to jako kyanogenbromidem aktivované sacharidy a substráty popsané v US patentech č. 3 959 080, 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 a 4 330 440 mohou být též použity pro imobilizací a zesítění proteinů.

Povrchy, ke kterým jsou protilátky připojeny, mohou být neproteinový polymer, obvykle hydrofilní polymer buď přírodního nebo syntetického původu. Mohou být použity hydrofílní polyviny15 lové polymery jako polyvinylalkohol (PVA) a polyvinylpyrrolidon (PVP). Užitečné jsou též polyethylenethery, jako polyethylenglykol, polypropylenglykol, polyoxyethylenestery nebo methoxypolyethylenglykol, polyoxyalkyleny, jako polyoxyethylen a polyoxypropylen, a blokové kopolymery polyoxyethylenu a polyoxypropylenu (Pluronics), polymethakryláty, karbomery, rozvětvené nebo nerozvětvené polysacharidy, které zahrnují sacharidové monomery, D-man20 nózu, D- a L-galaktózu, fukózu, fruktózu, D-xylózu, L-arabinózu, D-glukuronovou kyselinu, sialovou kyselinu, D-galakturonovou kyselinu, D-mannuronovou kyselinu (např. polymannuronovou kyselinu nebo alginovou kyselinu), D-glukosamin, D-galaktosamin, D-glukózu a neuraminovou kyselinu včetně homopolysacharidů a heteropolysacharidů, jako laktózy, amylopektinu, škrobu, hydroxyethylškrobu, amylózy, dextransulfátu, dextranu, dextrinů, glykogenu nebo polysacharidové podjednotky kyselých mukopolysacharidů, např. hyaluronové kyseliny, polymerů alkoholů cukrů, jako je polysorbitol a polymannitol, a heparin nebo heparon.

Před zesítěním je polymer s výhodou rozpustný ve vodě a s výhodou obsahuje pouze jedinou reaktivní chemickou skupinu, aby se zabránilo vícenásobnému zesítění s protilátkou. V každém případě by měly být reakční podmínky optimalizovány, aby se omezilo zesítění a aby se izolo30 vály produkty — buď přímo nebo následující gelovou filtrací nebo chromatografíckou operací — s v podstatě homogenním rozsahem molekulové hmotnosti. Optimální molekulová hmotnost zesítěné protilátkové matrice bude stanovena rutinním experimentováním za použití zde popsaných testů na cytotoxicitu a na vázání receptoru.

Finální konjugát po zesítění je s výhodou rozpustný ve fyziologických kapalinách jako je krev. Polymer by neměl být vysoce imunogenní ve formě konjugátu a měl by mít viskozitu kompatibilní s intravenózní infuzí nebo injekcí, pokud některá z nich je uvažovanou cestou pro aplikaci.

Polymer může být též ve vodě nerozpustný. K materiálům, které mohou být použity, patří hydrofílní gely nebo tvarované předměty s povrchy, ke kterým mohou být protilátky imobilizovány, jako chirurgické hadice, katétry nebo drény. S výhodou se používají pevné nosné materiály, které jsou biologicky kompatibilní a v podstatě inertní ve fyziologickém okolí. Materiál je biologicky kompatibilní, jestliže nestimuluje podstatně imunitní odpovědi včetně zánětu nebo nepřitahuje fibrotické buňky, když je umístěn uvnitř těla pacienta.

Anti-LT-beta-R protilátky mohou být též imobilizovány na povrchy, které byly kovalentně nebo nekovalentně potaženy sekundárními protilátkami, které se budou vázat na primární anti-LTbeta-R protilátky (např. kozí protimyší IgG protilátky, viz příklad 7). Každá individuálně testovaná anti-LT-beta-R monoklonální protilátka, když byla imobilizovaná na povrch se sekundár50 nimi protilátkami, působí jako LT-beta-R aktivující činidlo v přítomnosti IFN-gama (obrázky 4 a 7).

V alternativním provedení mohou zesítěné protilátky anti-LT-beta-R v roztoku působit jako LT-beta-R aktivující činidla. Anti-LT-beta-R protilátky mohou být zesítěny pomocí anti-LT- 15 CZ 298711 B6 beta-R Ab (nebo mAb) zesíťujícího činidla. Anti-LT-beta-R Ab (nebo mAb) zesíťující činidlo podle vynálezu je jakékoliv činidlo schopné buď kovalentní vazby nebo nekovalentní agregace anti-LT-beta-R protilátek (nebo monoklonálních protilátek) v roztoku, takže zesítěné anti-LTbeta-R protilátky (nebo monoklonální protilátky) se mohou vázat na a potencovat povrchovou kumulaci cílových buněk LT-beta-R. Taková činidla zesíťující anti-LT-beta-R Ab (nebo mAb) zahrnují, avšak nejsou omezeny na chemická zesíťovací činidla, která mohou reagovat s protilátkami kontrolovaným způsobem, jak shora popsáno. Alternativně mohou být použity k vytvoření aglomerátů anti-LT-beta-R protilátek v roztoku sekundární protilátky, Sefarosa A, Fc receptory nebo jiná činidla, která se váží na a spojují ve shluky řadu primárních anti-LT-beta-R protilátek, aniž blokují jejich aktivitu.

Četné anti-LT-beta-R protilátky působí v roztoku jako LT-beta-R aktivující činidla

Předmětem vynálezu jsou prostředky obsahující četné anti-LT-beta-R protilátky v roztoku, které působí jako LT-beta-R aktivující činidla tím, že potencují povrchovou kumulaci LT-beta-R.

Mohou být použity polyklonální anti-LT-beta-R protilátky zaměřené proti různým epitopům LT-beta-R. S výhodou jsou anti-LT-beta-R protilátky monoklonální protilátky zaměřené proti různým a nepřekrývajícím se epitopům LT-beta-R.

Kombinovaný přístup anti-LT-beta-R monoklonální protilátky k aktivaci LT-beta receptoru vyžaduje spojení dvou nepřekrývajících se epitopů. Mimo to je pravděpodobné, že produktivní agregace receptorů se dosáhne pouze s určitými epitopy. Byla identifikována přítomnost nejméně čtyř specifických LT-beta-R imunoreaktivních epitopů. Další epitopy (jak definováno novými monoklonálními protilátkami) mohou být identifikovány pokračováním ve fúzi imunizovaných buněk myší sleziny, imunizací různých druhů zvířat a použitím různých cest imunizace.

Epitopy mohou být také přímo zmapovány ohodnocením schopnosti různých monoklonálních protilátek konkurovat si vzájemně ve vazbě na LT-beta-R za použití chromatografických technik BIAcore (Pharmacia BIAtechnology Handbook, „Epitope Mapping“, oddíl 6.3.2, (květen 1994), viz též Johne a spol., J. Immunol. Methods, 160, str. 191 až 198 (1993)).

Jednotlivé LT-beta-R monoklonální protilátky mohou být seskupeny nejméně do čtyř tříd podle jejich schopnosti spolupracovat v kombinaci s jinými LT-beta-R monoklonálními protilátkami při usmrcování nádorových buněk v cytolytických testech (příklad 8, tabulka 1). Například BDA8 monoklonální protilátka ve skupině I nepůsobí v kombinaci s AGH1 monoklonální proti35 látkou ve skupině I k podpoře cytotoxicity nádorových buněk. Podobně monoklonální protilátky BKA11 a CDH10 ze skupiny III nespolupracují v testu na cytotoxicitu nádorových buněk.

Obrázek 5A-C znázorňuje účinky aplikací typických anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek samotných a v párové kombinaci na nádorové buňky v testech na cytotoxicitu za přítomnosti

IFN-gama jako LT-beta-R aktivujícího činidla. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátka CBE11 ze skupiny IV použitá samotná má malý cytotoxický účinek, který je zvýšen v kombinaci s monoklonální protilátkou BHA10 ze skupiny II (obrázek 5A). CBE11 vyvolává podobný účinek s monoklonální protilátkou CDH10 ze skupiny III (obrázek 5B).

Cytotoxicita způsobená aplikací kombinace monoklonálních protilátek anti-LT-beta-R v roztoku není vůči nádorové buněčné linii HT29 mimořádná. Obrázek 5C ukazuje, že monoklonální protilátka AGH1 ze skupiny I a monoklonální protilátka CDH10 ze skupiny III působí synergicky při usmrcování dvou různých nádorových buněčných linií (buněk HT29 a buněk WiDr) odvozených od humánních adenokarcinomů.

Souhrn vlastností monoklonálních protilátek anti-LT-beta-R

Všechny monoklonální protilátky anti-LT-beta-R podle vynálezu, když jsou zesítěny mobilizací, působí jako LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti druhého LT-beta-R aktivujícího činidla, jako je IFN-gama. Schopnost anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek působit jako

- 16CZ 298711 B6

LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti nebo nepřítomnosti LT-alfal/beta2 v roztoku se často mění podle stavu buněk v době testu. Tabulka 2 (viz níže) shrnuje vlastnosti anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek podle vynálezu.

Monoklonální protilátky BDA8 a AGH1 ze skupiny I nepůsobí jako LT-beta-R aktivující činidla v roztoku s LT-alfal/beta2. Monoklonální protilátka BDA8 dokonce blokuje protinádorový účinek LT-alfal/beta2 (obrázek 3B a tabulka 2). Naproti tomu anti-LT-beta-R monoklonální protilátky BCH6 a BHA10 mají smíšené agonistické a antagonistické účinky, když jsou aplikovány s LT-alfa l/beta2. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky BKA11 a CDH10 ze ío skupiny III jsou jedinečné ve své schopnosti působit jako LT-beta-R aktivující činidla, která potencují protinádorové účinky v přítomnosti LT-alfal/beta2 a druhého LT-beta-R aktivujícího činidla jako je IFN-gama, aniž mají antagonistické účinky, jaké je možno často pozorovat u monoklonálních protilátek BCG6 a BHA 10 ze skupiny II.

Je důležité mít na paměti, že klasifikace anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek založená na jejich schopnosti kooperovat v cytolytických testech na nádorových buňkách odráží skutečnost, že spolupůsobí s určitými epitopy LT-beta-R. Monoklonální protilátky obsahující jedinou skupinu však nemají nutně stejné vazebné afinity ke svým příslušným epitopům. Variabilní výsledky, pozorované při srovnávání účinků různých monoklonálních protilátek náležejících ke stejné skupině nebo k různým skupinám, mohou tedy představovat rozdíly ve vazebných afinitách. Je tedy možné, že by mohla být izolována monoklonální protilátka ze skupiny 1 nebo ze skupiny IV s vyšší vazebnou afinitou pro LT-beta-R, která by fungovala podobně jako monoklonální protilátky ze skupiny III jako LT-beta-R aktivující činidlo za přítomnosti LT-afal/beta2.

Hybridomové buněčné linie nebo jejich subklony, které produkují anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, popsané shora, byly uloženy 12. ledna 1995 v American Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) ve smyslu ustanovení Budapešťské úmluvy a byla jim přidělena následující čísla přírůstku ATCC:

	buněčná linie	název mAb	číslo přírůstku ATCC
a)	AG.H1.5.1	AGH1	HB	11796
b)	BD.A8.AB.9	BDA8	HB	11798
c)	BC.G6.AF5	BCG6	HB	11794
d)	BH.A10	BHA10	HB	11795
e)	BK.A11.AC10	BKA11	HB	11799
f)	CB.E11.1	CBE11	HB	11793
9)	CD.H1O.1	CDH10	HB	11797

Všechna omezení týkající se dostupnosti shora uvedených depozit ATCC budou neodvolatelně odstraněna po udělení patentu na tuto přihlášku.

Funkce anti-LT-beta-R IgM monoklonálních protilátek jako LT-beta-R aktivujících činidel

Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, které obsahují více než dvě vazebná místa pro antigen s IgG, budou také působit v roztoku jako LT-beta-R zesíťující činidla na buněčném povrchu a budou proto spadat pod definici LT-beta-R aktivujícího činidla podle vynálezu. Vazebná místa monoklonální protilátky anti-LT-beta-R pro antigen mohou být vybudována do IgM molekul — které mají deset vazebných míst pro antigen — za použití standardních technik rekombinantní DNA a hybridomu (příklad 12).

Alternativně je možno sebrat a obohatit kompletní IgM molekuly myši (nebo jiného zvířete) izolované metodou fúze hybridomu po jediné imunizaci antigenem. Jednou cestou obohacení

- 17CZ 298711 B6

IgM molekul by byla imunizace myší CD40 s chybějící signalizací (Kawabe a spol., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spol., Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)). Tyto myši nemohou efektivně produkovat imunoglobuliny IgG a proto jejich reakce na stimulaci antigenem je zvýšena pro IgM izotypy.

Anti-LT-beta-R IgM protilátky mohou v důsledku své zvýšené valence účinně agregovat LTbeta-R molekuly v rovině membrány, čímž zvyšují LT-beta-R signalizaci ve srovnání s jejich IgG protějšky, které mají dvě vazebná místa pro antigen. Dramatický příklad zvýšené účinnosti multivalentních protilátek při kumulaci receptorů je patrný u protilátek vůči Fas receptoru, kde je ío IgM forma velmi účinná a normální bivalentní imunoglobuliny IgG nejsou účinné v roztoku (Yonihara a Yonihara, J. Exp. Med., 169, str. 1747 až 1756 (1989), Alderson a spol., Int.

Immunol., 6, str. 1799 až 1806 (1994)).

Podobně apo-1 monoklonální protilátka proti Fas receptoru je typu IgG3. Tato monoklonální 15 protilátka je silné cytotoxické činidlo, které závisí na Fc interakcích výhradně k IgG3 subtypům za účelem agregace na větší polyvalentní formy. Odstranění Fc oblasti vytváří F(ab)₂ formu, která se nemůže spojit do větších agregátů a která je inaktivní (Dhein a spol., J. Immunol., 149, str. 3166 až 3173 (1992)). Analogicky se tedy předpokládá, že IgM verze anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek budou účinné protinádorové prostředky.

Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhibují růst nádorů u myší

Schopnost LT-beta-R aktivujícího činidla, jako je anti-LT-beta-R monoklonální protilátka, inhibovat růst humánních nádorových buněk in vitro (příklady 6 až 8 a 13) může svědčit o protinádorové účinnosti in vivo. Pokusy provedené na imunodeficitních myších (SCID) ukazují, že anti-beta-R monoklonální protilátka (CBE11) může účinně blokovat tvorbu nádoru humánními adenokarcinomatózními buňkami WiDr (příklad 14, obrázek 6). U myší inokulovaných subkutánně (s.c.) WiDr buňkami se vytvoří během dvou týdnů měřitelné nádory. Když se myším aplikovala i.p. CBE11 monoklonální protilátka ve stejnou dobu, kdy byly inokulovány buňky WiDr s.c., nádorový růst byl dramaticky blokován (obrázek 6A). Protinádorový účinek CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky se zvýšil přidáním IFN-gama. CBE11 byl však účinný i bez exogenního IFN-gama. Ve skupině CBE11 + IFN-gama bylo 7 ze 16 zvířat zcela bez nádorů, zatímco zbývající zvířata měla malé uzlíky, které se během 2 měsíců nezvětšily. Myši, kterým byl aplikován samotný CBE11, byly 30. den podobné jako skupina, které bylo aplikováno CBE11 + IFN-gama. U myší, kterým byl aplikován samotný CBE11, se však nakonec vyvinuly pomalu rostoucí nádory. Mezi skupinami CBE11 (+/- IFN-gama) a kontrolními skupinami (fyziologický roztok, IFN-gama samotný a kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) + IFN-gama) byly statisticky významné rozdíly, ale mezi kontrolními skupinami žádné významné rozdíly nebyly. Jak 1E6, tak CBE11 monoklonální protilátky jsou protilátky typu IgGl. 1E6 monoklonální protilátka účinně pokrývá nádorové buňky, ale neblokuje růst nádorů. Komplementární nebo NK (natural killer) buňkami ovlivněné události tedy nejsou jediným podkladem pro protinádorovou aktivitu CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky.

Účinnost CB11 monoklonální protilátky v inhibici růstu nádorů in vivo v nepřítomnosti exogenního IFN-gama je neočekávána, protože existovala závislost na IFN-gama pro měřitelné cytotoxické účinky na bázi LT-beta-R in vivo. Buď dochází k určitému crossing-over myšího IFN-gama na lidské IFN-gama receptory nebo mohou probíhat in vivo jiné mechanizmy.

CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka může také inhibovat růst rozvinutého nádoru u myší (obrázek 6B). Myši byly inokulovány s.c. 1. den humánními WiDr buňkami adenokarci50 nomu a nádory se ponechaly vyvíjet 15 dní (příklad 14). Nádory u zvířat, kterým byl aplikován IFN-gama samotný nebo s kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátkou (1E6) + IFN-gama, pokračovaly ve zvětšování velikosti v průběhu 7-týdenního pokusu. Naproti tomu se růst nádorů, na které se působilo CBE11 anti-LT-beta-R protilátkou (+ IFN-gama nebo

-18CZ 298711 B6 samotnou) zastavil a po následujících třech injekcích CBE11 protilátky během tří týdnů se růst nádorů zastavil do 49 dnů po inokulaci, kdy byl pokus ukončen (obrázek 6B).

Tyto pokusy prokazují, že anti-LT-beta-R monoklonální protilátka, která aktivuje LT-beta-R signalizaci, je schopna účinně inhibovat tvorbu nádoru v ranných stadiích a může též blokovat pokračující růst nádorových buněk v pozdějších stadiích tumorigeneze in vivo. Tyto pokusy též prokazují, že aplikace jediného LT-beta-R aktivujícího činidla může být účinná pro léčbu nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie u postiženého živočicha.

ío Postupy popsané v příkladu 14 mohou být použity k identifikaci LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu, které působí inhibičně samostatně nebo v kombinaci na růst nádorových buněk in vivo. Je předpokládáno, že jiná LT-beta-R aktivující činidla — zahrnující, ale neomezující se na ta, která byla identifikována v in vitro testech na cytotoxicitu nádorových buněk — mohou mít podobné protinádorové účinky in vivo, kdyby byly aplikovány buď samotné nebo v kombi15 naci zvířatům nebo lidem.

Použití IFN-gama a jiných LT-beta-R aktivujících činidel

Cytotoxické účinky LT-alfa/beta heteromemích komplexů a zesítěných nebo vícenásobných anti-LT-beta-protilátek na nádorové buňky se zvyšuje přítomností LT-beta-R aktivujícího činidla, zejména IFN-gama. O humánních adenokarcinomatózních buňkách střevního původu (HT29 buňkách) bylo v minulosti prokázáno, že jsou senzitivní vůči FasR signalizaci (Yonehara a Yonehara, J. Exp. Med., 169, str. 1747 až 1756 (1989)), a vůči TNF a LT-alfa za přítomnosti IFN-gama (Browning a spol., J. Immunol., 143, str. 1856 až 1867 (1989)).

Množství LT-beta-R aktivujícího činidla, potřebného ke zvýšení protinádorové účinnosti LTalfa/beta heteromemích komplexů, anti-LT-beta-R protilátek nebo jiných LT-beta-R aktivačních činidel, podle vynálezu bude záviset na typu buňky nebo tkáně, na které se působí, a také na způsobu léčby a může být stanoveno empiricky použitím rutinních metod. LT-beta-R aktivující činidlo může být dodáno v koncentraci nebo aplikováno rychlostí zjištěnou, že je účinná ve spo30 jení s jinými LT-beta-R aktivujícími činidly, přičemž se berou v úvahu shora uvedené faktory.

Alternativně je možno se zaměřit na endogenní LT-beta-R aktivující činidla, například na interferony jako je IFN-gama, které mohou být vytvořeny buňkami nebo tkáněmi obklopujícími cílové nádorové buňky. Endogenní IFN-gama je normálně produkován po virové infekci a je též nalézán v blízkosti nádorů (Dinge a spol., Immunity, 1, str. 447 až 456 (1994)).

Do rozsahu skupiny LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu spadá kterékoliv činidlo, které je schopné indukovat interferony, s výhodou IFN-gama, a které potencuje cytotoxické účinky LT-alfa/beta heteromemích komplexů a anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek na nádorové buňky. Zatímco virová infekce normálně indukuje tvorbu IFN-gama, hladiny endogenního IFNgama mohou být zvýšeny jinými činidly (příklad 10). Například klinické pokusy prokázaly indukci interferonu účinkem dvouřetězcové RNA (dsRNA). Účinné jako induktory interferonu jsou tedy v tomto ohledu polyriboguanylová kyselina/polyribocytidylová kyselina (poly-rG/rC) a jiné formy dsRNA (Juraskova a spol., Eur. J. Pharmacol., 221, str. 107 až 111 (1992)).

Stimulátor interferonů z Glycyrrhiza glabra (Acharya a spol., Indián J. Med. Res., 98, str. 69 až 74 (1993)) a farmaceutické prostředky, z nichž mnohé je možno aplikovat orálně, mohou být též použity ke zvýšení hladin interferonu. K takovým induktorům interferonů patří: imikvimod (Bemstein a spol., Antiviral Res., 20, str. 45 až 55 (1994), saparal (Paramononova a spol., Vopr.

Virusol., 39, str. 131 až 134 (1994)), arylpyrimidony jako například bropirimin (Onishi a Machida, Hinyokika Kivo, 40, str. 195 až 200 (1994)), Ridostin (Cheknev a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 125 až 128 (1994)).

-19CZ 298711 B6

Řada těchto činidel indukujících interferony byla charakterizována jako induktory interferonů typu I jako IFN-alfa. Typ I interferonů může též působit jako LT-beta-R aktivující činidla, ale méně účinná než IFN-gama.

Léčení za použití LT-alfa/beta komplexů a LT-beta-R aktivuj ících činidel

Prostředky podle vynálezu budou aplikovány v účinné dávce pro léčbu příslušného klinického stavu. Určení výhodného farmaceutického přípravku a terapeuticky účinného dávkování pro danou aplikaci spadá do působnosti odborníků, přičemž se bere v úvahu například stav a hmotnost pacienta, rozsah požadované léčby a tolerance pacienta na léčbu.

Obvykle lidé mohou snášet až do 100 až 200 pg/m² TNF, dříve než se projeví závažná toxicita (Schiller a spol., Cancer Res., 51, str. 1651 až 1658 (1991)). U myší způsobily dávky v rozsahu 1 až 5 pg/myš/den podávané v 5x10⁴ jednotkách rekombinantního lidského IFN-gama regresi primárního nádoru (Balkwill a spol., CIBA Foundation Symposium (1987), Havell a spol., J. Exp.

Med., 167, str. 1067 až 1085 (1988)). Na základě relativní účinnosti TNF a LT-alfal/beta2 v HT29 cytolytických testech poskytne přibližně 5 až 25 pg/myš/den LT-alfal/beta2 terapeutické rozmezí dávky. Extrapolací na člověka se očekává, že bude zapotřebí dávkování nejméně 1 mg/m² LT-alfal/beta2 v kombinaci s LT-beta-R aktivujícím činidlem, například IFN-gama.

Historicky byla léčba pomocí IFN-gama prováděna buď s maximálními tolerovanými dávkami v rozmezí 100 až 250 pg/m² nebo v „imunomodulačních“ hladinách v rozmezí 10 až 25 pg/m²(viz například Kopp a spol., J. Immunother., 13, str. 181 až 190 (1993)). Kombinační terapie se dvěma interferony použily 4 x 10⁶ jednotek/m² IFN-alfa a přibližně 250 pg/m² IFN-gama (Niederle a spol., Leuk. Lymphoma, 9, str. 111 až 119 (1993)). Očekává se, že střední dávky asi

25 až 100 pg/m² IFN-gama v kombinaci s LT-alfa/beta heteromemími komplexy nebo purifikovanými anti-LT-beta-R protilátkami zde popsanými budou vhodnými startovacími body pro optimalizaci léčebných dávek.

Aplikace LT-alfa/beta heteromemích komplexů a zesítěných anti-LT-beta-R protilátek podle vynálezu včetně izolovaných a purifikovaných forem protilátek nebo komplexů, jejich solí nebo jejich farmaceuticky přijatelných derivátů může být provedena za použití libovolných obvykle používaných metod aplikace prostředků, které se vyznačují protinádorovou účinností.

Farmaceutické prostředky používané při těchto terapiích mohou mít též nejrůznější formy. K těm patří například pevné, polopevné a kapalné dávkovači formy, jako tablety, pilulky, prášky, kapalné roztoky nebo suspenze, čípky a roztoky, které je možno aplikovat injekčně nebo infuzí. Výhodná forma závisí na předpokládaném způsobu podání a terapeutické aplikace. Způsoby podání mohou zahrnovat orální, parenterální, subkutánní, intravenózní nebo topické aplikace nebo aplikaci přímo do léze.

LT-alfa/beta heteromemí komplexy, IFN-gama a anti-LT-beta-R protilátky mohou být například uloženy do sterilních, izotonických přípravků s nebo bez kofaktorů, které stimulují absorpci nebo stabilitu. Přípravek je s výhodou kapalný nebo to může být lyofilizovaný prášek. Například LT komplexy nebo/a anti-LT-beta-R protilátky a IFN-gama mohou být zředěny pufrem přípravku sestávajícím z 5,0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónové, 2,7 mg/ml citrátu trojsodného, 41 mg/ml mannitolu, 1 mg/ml glycinu a 1 mg/ml polysorbátu 20. Tento roztok může být lyofilizován, uskladněn za chlazení a rekonstituován před aplikací sterilní vodou pro injekce.

Prostředky budou s výhodou též obsahovat obvyklé farmaceuticky přijatelné nosiče dobře známé v oboru (viz například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, 1980, Mac Publishing Company). Takové farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat jiné medicinální prostředky, nosiče, genetické nosiče, adjuvanty, pomocné látky atd., jako humánní sérový albumin nebo plazmatické přípravky. Prostředky jsou s výhodou ve formě dávkovači jednotky a obvykle se budou aplikovat jednou nebo několikrát za den.

-20CZ 298711 B6

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat též za použití mikrokuliček, liposomů, jiných aplikačních systémů za použití mikročástic nebo prostředků s retardovaným uvolňováním, umístěných v, blízko nebo jinak v kontaktu s postiženými tkáněmi nebo krevním řečištěm. Vhodné příklady nosičů s retardovaným uvolňováním zahrnují semipermeabilní polymemí matrice ve formě tvarovaných předmětů jako jsou čípky nebo mikrotobolky. Implantovatelné nebo mikrotobolkové matrice s retardovaným uvolňováním zahrnují polylaktidy (US patent ě. 3 773 319, EP 58 481), kopolymery L-glutamové kyseliny a gama-ethyl-L-glutamátu (Sidman a spol., Biopolymers, 22, str. 547 až 556 (1985)), poly(2-hydroxyethylmethakrylát) ío nebo ethylenvinylacetát (Langer a spol., J. Biomed. Mater. Res., 15, str. 167 až 277 (1981),

Langer, Chem. Tech., 12, str. 98 až 105 (1982)).

Liposomy obsahující LT-beta-R heteromemí komplexy nebo/a anti-LT-beta-R protilátky a IFN-gama mohou být připraveny dobře známými metodami (viz např. DE 3 218 121, Epstein a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82, str. 3688 až 3692 (1985), Hwang a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 77, str. 4030 až 4034 (1980), US patenty č. 4 485 045 a č. 4 544 545). Obvykle se jedná o liposomy malého (kolem 20 až 80 nm) unilamelámího typu, ve kterém je obsah lipidů větší než asi 30 mol. % cholesterolu. Podíl cholesterolu je zvolen tak, aby reguloval optimální rychlost uvolňování LT komplexu nebo/a anti-LT-beta-R protilátek a IFN-gama.

LT-alfa/beta heteromemí komplexy a anti-LT-beta-R protilátky podle vynálezu mohou být také připojeny k liposomům obsahujícím jiná LT-beta-R aktivující činidla, chemoterapeutické prostředky nebo IFN-gama k doplnění IFN-gama, který se obvykle nalézá v oblasti nádorů. Připojení LT komplexů a anti-LT-beta-R protilátek k liposomům může být dosaženo libovol25 ným známým zesíťujícím činidlem, jako například heterobifunkčními zesíťujícími činidly, která byla v širokém rozsahu používána ke spojení toxinů nebo chemoterapeutických prostředků s protilátkami pro cílenou aplikaci. Konjugace na liposomy může být též provedena použitím lipidem řízeného síťujícího činidla, hydrazidu 4-(4-maleimidofenyl)máselné kyseliny (MPBH) (Duzgunes a spol., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Výhody terapeutických prostředků na bázi aktivace anti-LT-beta-R

Protinádorová terapie na bázi LT-beta-R aktivace by měla řadu výhod. LT-beta-R se váže na LT-alfa/beta heteromemí komplexy s vysokou afinitou v beta/beta rozštěpech a s nižší afinitou v alfa/beta rozštěpech, vytvořených na rozhraních mezi sousedními LT-alfa a LT-beta pod35 jednotkami. Naproti tomu TNF receptory se váží na LT-alfa/beta heteromemí komplexy s vyšší afinitou pouze v alfa/alfa rozštěpech. Purifikované LT-alfa l/beta2 komplexy se tedy váží s vysokou afinitou na LT-beta-R mezi sousedními LT-beta podjednotkami, ale postrádají alfa/alfa rozštěpy a tedy neaktivují křížově signalizaci prostřednictvím TNF receptorů. LT-alfa/beta heteromemí komplexy podle vynálezu tedy nebudou stimulovat zánětlivé odpovědi spojené s TNF.

Aplikace LT-alfal/beta2 neaktivuje změny endotheliálních buněk spojené se zánětlivou reakcí i při poměrně vysokých hladinách. Z tohoto důvodu by vedlejší účinky způsobení aktivací zánětlivých kaskád, pozorované u TNF, nemělo způsobovat problém při použití farmaceutických prostředků a léčebných metod pro aktivaci LT-beta-R.

Lidský LT-alfal/beta2 se váže na myší LT-beta-R v podstatě stejně dobře jako na humánní LTbeta-R. Injekce 100 pg humánního LT-alfal/beta2 na myš není letální (příklad 11), což ukazuje na to, že stimulace LT-beta-R v celém zvířeti nemá zřetelnou toxicitu patrnou, když byly provedeny podobné pokusy s FasR nebo p60 TNF-R aktivací.

Použití specifických monoklonálních protilátek anti-LT-beta-R nebo kombinací protilátek k vyvolání této cesty u lidí může mít řadu výhod oproti léčbě s LT-alfa/beta heteromemími komplexy. Léčba antireceptorovými protilátkami bude selektivnější než léčba ligandem. Kromě

-21 CZ 298711 B6 toho bude jednodušší připravit a vyrobit ve velkém rekombinantní formy anti-LT-LT-beta-R monoklonálních protilátek než rozpustné LT-alfa/beta heteromemí komplexy.

Uvažuje se o tom, že monoklonální protilátky nebo LT-alfa/beta heteromemí komplexy se budou aplikovat lidem s nádorem společně s obvyklou protinádorovou terapií (tj. ozařováním a chemoterapií). Kombinovaná léčba LT-beta-R aktivací s obvyklými chemoterapiemi může poskytnout další faktor protinádorové aktivity, který by pravděpodobněji zbavil pacienta nádorových buněk, než když se použije protinádorová terapie samotná.

Dále je možné, že by tento přístup měl poměrně málo vedlejších účinků a proto by mohl být aplikován v semiproíylaktickém smyslu v případech rakovin, které ještě nemusely metastázovat, nebo u pacientů z rodin, u kterých je genetická predispozice pro určitý typ rakoviny.

Příklady provedení vynálezu

Následují příklady, které ilustrují LT-alfa/beta heteromemí komplexy a anti-LT-beta-R monoklonální protilátky podle vynálezu a metody použité k jejich charakterizaci. Tyto příklady nemají za účel omezovat rozsah vynálezu. Příklady jsou uvedeny za účelem ilustrace a vynález je omezen pouze patentovými nároky.

Příklad 1

Vytvoření supematantů baculovirem infikovaných hmyzích buněk obsahujících LT-alfa/beta formy

Rekombinantní baculoviry, kódující buď LT-alfa o plné délce nebo sekreto vanou formu LTbeta, byly připraveny, jak popsáno (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Hmyzí buňky (Invitrogen, San Diego, CA.) byly inokulovány o hustotě 2x10⁵ buněk/ml do 7,2 litrů média SF 900-11 (Gibco) bez séra. Po 48 hodinách dosáhla kultura 1,8x10⁶ buněk/ml a byla infi30 kována 150 ml (3x10⁸ PFU/ml) LT-beta a 300 ml LT-alfa baculovirových kultur. Po dvou dnech se kultura odebrala a zbytky buněk byly odstraněny odstředěním. Po přidání kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) a fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) (1 mM EDTA a 150 μΜ PMSF konečné koncentrace) se vyčeřený supematant zkoncentroval 10ti násobnou ultrafiltrací za použití spirální vložky S1YM10 (Amicon). Koncentrát se rozdělil na šest 120ml podílů a alikvotní podíly se skladovaly před purifikací při -70 °C.

Příklad 2

Příprava rozpustných LT-beta receptorů jako chiméry Fc a imunoglobulinu

Extracelulámí doména LT-beta-R byla amplifikována až do transmembránní oblasti polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) z cDNA klonu použitím primerů, které inkorporovaly Notl a Sáli restrikční enzymová místa na 5' a 3' koncích (Browning a spol., J. Immunol., 154, str. 33 až 46 (1995)). Amplifikovaný produkt byl natráven enzymy Notl a Sáli, purifikován a ligován do vektoru pMDR901 linearizovaného enzymem Notl společně s fragmentem enzymů Sall-Notl kódujícím Fc oblast humánního IgGl. Výsledný vektor obsahoval gen reduktázy dihydrofolátu a LT-beta-R-Fc chiméru ovládané oddělenými promotory. Vektor byl elektroporatován do CHO dhfr buněk a methotrexátrezistentní klony byly izolovány standardními postupy. LT-beta-R-Fc je sekretován do média a test ELISA byl použit k selekci buněčných linií produkujících nejvyšší hladinu chimérického proteinu. Vysokoprodukční buněčná linie se nechala narůst do vysokých počtů a kondicionované médium se odebralo. Čistý protein se izoloval pomocí rychle protékající afinitní chromatografíe s Protein A sefarózou.

-22CZ 298711 B6

Příklad 3

Afinitní purifikace LT-alfa l/beta2 za použití TNF-R a LT-beta-R

Pro přípravu pryskyřic k afinitní purifikaci receptorů LT forem byly imobilizovány purifikované přípravky LT-beta-R-Fc (jak popsáno zde v příkladu 2) a TNF-R p60-Fc (Crowe a spol.,

Science, 264, str. 707 až 710 (1994)) na CNBr-sefaróze (Pharmacia) při 5 mg/ml pryskyřice v podstatě podle návodu výrobce. Pryskyřice prošly před použitím jedním elučním cyklem. Část (120 ml) S1Y10 koncentrátu prošla přes dvě sekvenční p60 TNF-R-Fc kolony, které váží LT-alfa a LT-alfa2/betal. Průtok, který obsahoval LT-alfa l/beta2 a LT-beta, byl veden přes LT-beta-R-Fc kolonu. Kolona se promyla vždy 5 objemy PBS, PBS s 0,5 M NaCl a PBS a pak ío se LT-alfa a LT-alfa2/betal komplexy promyly 25 mM fosforečnanem sodným, 100 mM NaCl, pH 3,5. Eluční frakce se ihned zneutralizovaly 1/20 objemu 0,5 M fosforečnanu sodného, pH 8,6 a uložily se na led. Frakce obsahující protein se identifikovaly absorbancí při 280 nm, píkové frakce se spojily a spojené eluce z kolon se zanalyzovaly pomocí SDS-PAGE obarvené jasnou modří coomassie. Shora popsaná eluce poskytla více než 95 % čistého LT-alfal/beta2.

Příklad 4

Charakterizace purifikovaných LT-alfa l/beta2 ligandů

Frakce z příkladu 3 byly rozděleny gelovou vylučovací chromatografií ke zjištění, zda se vytvo20 řily trimery a zda jsou přítomny agregáty. Byla použita kolona TSK G3000 sw x2 při průtokové rychlosti 0,5 ml/minuta, aby se oddělil proteinový standard BioRad z gelové filtrace a tři různé LT trimery, LT-alfa3, LT-alfa2/betal a LT-alfa l/beta2.

Obrázek 1A ukazuje, že velmi málo, pokud vůbec některý, z LT-alfal/beta2 trimerů se ukazuje být agregátem o vysoké molekulové hmotnosti. Srovnání s velikostními standardy ukazuje, že všechny tři formy jsou trimemí, tj. asi o 50 až 60 kDa. Stechiometrie LT-alfa k LT-beta obsažených v purifikovaných frakcích LT-alfa l/beta2 a LT-alfa2/betal byla vyhodnocena buď denzitimetrií gelů zbarvených pomocí coomassie nebo píkovou výškovou analýzou dvou píků následujících po rozštěpení C4 vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi.

Obě měření potvrdila identitu frakcí eluovaných z afinitních chromatografických kolon, popsaných shora.

Čistota přípravků byla dále vyhodnocena ionexovou chromatografií za použití přístrojového vybavení BioCAD k vytvoření charakteristických chromatogramů LT-alfal/beta2 a LT35 alfa2/betal na slabé katexové pryskyřici při několika různých pufrových systémech. Metoda, která se vyznačovala největší schopností čistě zadržet a oddělit ty uvedené tři trimery, obsahovala POROS CM (karboxymethylovou) kolonu provozovanou při 5 ml/min s 16,6 mM MES, 16,66 mM HEPES, 16,66 mM octanu sodného pH 6,5 pufru a promývání s 1 M NaCl gradientem přes 20 objemů kolony. BioCAD chromatogramy LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal komplexů jsou znázorněny na obrázku 1B. Každý trimer, LT-alfa3, LT-alfa2/betal a LT-alfal/beta2 byl eluován při různých koncentracích solí a nebyla prokázána u různých přípravků křížová kontaminace větší než 1 až 2 %.

Příklad 5

Usmrcování humánních adenokarcinomatózních buněk HT29 rozpustnými LT-alfa l/beta2 komplexy

Cytolytický test s buňkami HT29 byl dříve popsán (Browning and Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989)). V typickém testu byla připravena série ředění LT-alfal/beta2 (a jiných cytokinů, kde jsou aplikovatelné) v 0,05 ml v destičkách s 96 jamkami a přidalo se 5000 trypsinizovaných buněk HT29-14 v 0,05 ml média obsahujícího 0 nebo 80 U/ml (protivirových jednotek) humánního IFN-gama. Buňky HT29-14 jsou ze subklonu původní, od ATCC odvozené

-23 CZ 298711 B6

HT29 linie, která je homogennější. V testech byly použity buňky HT29-14. Všechny tyto výsledky mohou být též pozorovány při použití původní HT29 linie odvozené od ATCC. Po 3 až 4 dnech byla změřena mitochondriální redukce barviva MTT následovně: přidalo se 10 1 MTT a po 3 hodinách se redukované barvivo rozpustilo pomocí 0,09 ml izopropanolu s 10 mM HC1 a změřila se optická hustota při 550 nm. K buňkám se předem přidaly rozpustné receptorové formy, připravené, jak zde bylo popsáno, nebo čistý humánní IgG, aby se dosáhlo konečné koncentrace 5 pg/ml.

Obrázek 2A ukazuje usmrcování buněk HT29 působením anti-Fas receptoru mAb CH-11 (který io stimuluje FasR signalizaci), TNF, LT-alfa3, LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal ligandů ve spojení s IFN-gama. Vizuální prohlídka buněk, na které bylo působeno LT-alfal/beta2, ukazuje, že toto činidlo buňky spíše usmrcuje než aby pouze blokovalo jejich proliferaci. V nepřítomnosti IFNgama nejsou pozorovány žádné účinky, což odráží neobvyklou schopnost IFN-gama ovlivnit, jak buňky interpretují signalizaci od TFN rodiny receptorů. Interferony alfa a beta byly 100-krát méně účinné než interferony gama, jak bylo kvantifikováno na bázi jednotek protivirové aktivity.

Obrázek 2B ukazuje inhibici LT-alfal/beta2 usmrcování rozpustným LT-beta-R-Fc ale ne p60TNF-R-Fc, čímž demonstruje, že cytotoxicita je specifická pro LT-alfal/beta2. Nedostatek inhibice u p60-TNF-R-Fc naznačuje, že kontaminace LT-alfa (o níž je známo, že činí méně než

1 %) nemůže být zodpovědná za cytotoxickou aktivitu LT-alfa l/beta2.

Příklad 6

Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky potencují usmrcování buněk HT29 pomocí LT25 alfalbeta2 komplexů

Byly provedeny cytolytické testy, jak popsáno v příkladu 5 s tím rozdílem, že interferony gama a anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (série 0,01 až 1000 ng/ml) byly přidány k buňkám při 2x finální koncentraci a pak se přidalo 50 μΐ roztoku buněk do jamek obsahujících zředěný LT-alfal/beta2. Růst byl vyhodnocen, jak popsáno v příkladu 5. Obrázek 3 ukazuje rozdílné účinky dvou různých anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek v jejich schopnosti potencovat LT-alfal/beta2 cytotoxickou aktivitu. Obrázek 3A ukazuje, že anti-LT-beta-R monoklonální protilátka CDH10 potencuje cytotoxickou aktivitu LT-alfal/beta2 způsobem závislým na dávkování. Obrázek 3B ukazuje účinky jiné anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, BDA8, ve stejném testu. Protilátka BDA8 inhibuje cytotoxickou aktivitu LT-alfal/beta2 spíše než by potencovala usmrcování nádorových buněk.

Příklad 7

Imobilizované anti-LT-beta-R monoklonální protilátky mohou usmrcovat nádorové buňky

HT29

Za účelem imobilizace anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek na plastický povrch byly destičky s 96 jamkami pro tkáňové kultury pokryty 50 μΐ 10 μg/ml kozí protimyší Fc polyklonální protilátky (Jackson ImmunoResearch), promyty a zablokovány 5% fetálním telecím sérem (FCS) v PBS, po čemž následovalo zachycení uvedené monoklonální anti-LT-beta-R protilátky a další promytí. Do monoklonální protilátkou povlečených jamek byly naočkovány buňky HT29 a byly provedeny cytolytické testy jako v příkladu 5. Obrázek 4A ilustruje cytotoxické účinky imobilizovaných anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek BDA8 a CDH10 na buňky HT29. Každá monoklonální protilátka vyvolává individuálně cytotoxicitu na nádorové buňky, když je imobilizována na povrch. Obrázek 4B ukazuje, že tytéž monoklonální protilátky BDA8 a

CDH10, pokud jsou testovány individuálně v roztoku, nejsou cytotoxické, takže cytolytická aktivita jednotlivé anti-LT-beta-R monoklonální protilátky in vitro se jeví být funkcí její imobilizace.

-24CZ 298711 B6

Příklad 8

Kombinace anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek v roztoku, zaměřená proti určitým epitopům, usmrcuje buňky HT29

Růst buněk HT29 byl vyhodnocen, jak popsáno v příkladu 5, s tím rozdílem, že v růstovém médiu byla obsažena jedna nebo dvě anti-LT-beta-R monoklonální protilátky. Tabulka 1 ukazuje účinky na buňky HT29, které byly pozorované, když byly do roztoku přidány různé anti-LTbeta-R monoklonální protilátky (tj. neimobilizované na plastu). Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky mohou být uspořádány do skupin I až IV na bázi jejich relativních schopností působit ío ve vzájemné kombinaci v cytolytickém testu na buňky HT29. Výsledky anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek poskytly v cytolytických testech paralelní údaje o vazbě na receptory, což naznačuje, že monoklonální protilátky v každé z rozdílných skupin rozpoznávají epitopy LTbeta-R.

Tabulka 1

Kombinace rozpustných anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek jsou cytotoxické pro humánní adenokarcinomatózní buňky HT29. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky jsou seřazeny do skupin I, II, III a IV na bázi jejich účinků ve vzájemné kombinaci v cytolytických testech s buň20 kami HT29. Plusy se týkají relativní hladiny cytolytických účinků kombinace monoklonálních protilátek na buňky HT29 v přítomnosti 8 OU/ml interferonu gama. nr = nerelevantní, nd = nedeterminovaná

Druhá snAh

	První	Skupina I	Skupina II	Skupina III	Skupina
Skupina	mAb	BDA8	AGH1	BCG6	BHA10	BKA11	CDH10	CBE11
I	BDA8	nr	-	+	++	+	nd	nd
	AGH1	-	nr	++	+++	++	nd	nd
II	BCG6	++	++	nr	-	+++	nd	nd
	BHA10	++	+++	-	nr	+	+++	++++
III	BKA11	+	++	++·+	nd	nr	-	nd
	CDH10	++	++	++	+++	-	nr	+++
IV	CBE11	nd	+	-i-	+·+·+·+	nd	++++	nr

Obrázek 5A až D kvantifikuje účinky začlenění reprezentativních párových kombinací spoluúčinkujících anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, zaměřených proti různým epitopům LTbeta-R, do HT29 cytolytického testu. Obrázek 5A znázorňuje cytotoxické účinky BHA10 a

CBE11, obrázek 5B znázorňuje cytotoxické účinky CDH10 a CBE11 a obrázek 5C představuje cytotoxické účinky CDH10 a AGH1 samotných a v kombinaci. Obrázek 5D ukazuje cytotoxické účinky kombinace monoklonálních protilátek CDH10 a AGH1 u jiné linie nádorových buněk zvané WiDr.

-25CZ 298711 B6

Tabulka 2 shrnuje vlastnosti reprezentativních anti-LT-beta-R monoklonální protilátky podle vynálezu.

Tabulka 2

Souhrn myších antíhumánních LT-beta-R monoklonálních protilátek

HT29 cytotoxicita mAB mAB Barvení Blokace mAb Rozpustná Rozpustná

skupina	název	buněk*	vazby recep torů^b	zmobili- zovaná na plastu⁶	mAb samotná	mAb s LTalfal- betal
I	BDA8	+++	+++	+	+/.d	inhibuje
I	AGH1	₊₊₊	+++		+/-	inhibuje
II	BCG6	+++	++	+	+/-	smíšená
II	BHA10	+++	+++	+	+/-	smíšená
III	BKA11	+++	+/-	+	-	potencuje
III	CDH10	+++	+/-	+	+/-	potencuje
IV	CBE11	+++	+++	+	+/-	bez účinku

Kontroly

M0PC21 -	-	-	-	bez účinku
HT29/26 -	nd	-	-	bez účinku
TS 2/9* nd	nd	-	-	bez účinku

^aFACS barvení CHO buněk, u nichž došlo k transfekci s LT-beta-R.

^bTest vyhodnocen na to, jestli protilátka blokuje vazbu rozpustného receptoru na aktivovaný hybridom 11-23 T-buňky.

ío nd = neprovedeno.

ΉΤ-29 buňky se nechaly růst s IFN-gama na destičkách pokrytých anti-LT-beta-R, jak definováno v metodách.

^dVariabilní, parciální inhibice v některých testech, žádné účinky v jiných. ^cAntihumánní LFA-3, myší IgGl.

Příklad 9

Spolehnutí na endogenní IFN-gama pro působení na nádorové buňky

IFN-gama, výhodné LT-beta-R aktivující činidlo podle vynálezu, je cytokin, který se vyznačuje 20 protinádorovou účinností a který je tolerován lidmi. Endogenní IFN-gama, přítomný v okolí obklopujícím nádor, může být přítomen v dostatečně vysokých koncentracích, aby fungoval jako

-26CZ 298711 B6

LT-beta-R aktivující činidlo podle vynálezu bez přidání exogenního IFN-gama. Koncentrace IFN-gama v blízkosti nádoru může být stanovena použitím standardních imunotechnických metod na vzorcích tkání z oblasti nádoru. Jestliže je endogenní koncentrace IFN-gama dostatečně vysoká, aby vyvolala protinádorovou aktivitu v kombinaci s LT-alfa/beta heteromemími komplexy nebo anti-LT-beta-R monoklonálními protilátkami podle vynálezu (jak stanoveno cytolytickými testy zde popsanými), pak nemusí být IFN-gama aplikován jako druhé LT-beta-R aktivující činidlo v prostředcích nebo metodách podle vynálezu.

Příklad 10

Indukce endogenního IFN-gama jako LT-beta-R aktivujícího činidla pro působení na nádorové buňky

Sloučeniny, které mohou vyvolat endogenní produkci interferonů, jako je IFN-gama, spadají do skupiny LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu. Například mohou interferony být indukovány působením molekul dvouřetězcové RNA, jako polyriboguanylové/polyribocytidylové kyseliny (poly-G/C).

Samicím C57/bl6 (starým 6 až 8 týdnů) může být aplikováno injekčně 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosaminu, který senzitivuje myši na účinky TNF a jiných protinádorových činidel.

K purifikovanému LT-alfal/beta2 (10 až 100 pg) se přidá série koncentrací poly-G/C (Juraskova a spol., Eur. J. Pharmacol., 221, str. 107 až 111 (1992) v neutrálním fyziologickém roztoku a roztok se aplikuje myším ve formě intraperitoneální (i.p.) injekce. Protinádorová účinnost LTalfal/beta2 bude zvýšena přítomností poly-rG/rC dvouřetězcové RNA.

Podobně může být stimulátor interferonů z rostliny Glycyrrhiza glabra (Acharya a spol., Indián J. Med. Res., 98, str. 69 až 74 (1993)) aplikován lidem intravenózně v dávkách od 40 do 100 ml/den. Optimální dávka pro LT-beta-R aktivaci za přítomnosti buď LT-alfa/beta heteromemích komplexů nebo anti-LT-beta-R protilátek může být stanovena empiricky a bude záviset na faktorech jako je typ nádoru, způsob aplikace a program aplikace.

Imiquimod R-837 (Bemstein a spol., Antiviral Res., 20, str. 45 až 55 (1994)), Saparal (Paramanova a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 131 až 134 (1994)), Bropirimine (Onishi a Machida, Hinyokika Kiyo, 40, str. 195 až 200 (1994)) nebo Ridostin (Cheknev a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 125 až 128 (1994)) mohou být též aplikovány jako LT-beta-R aktivující činidla ve spojení s LT-alfa/beta heteromemími komplexy, anti-LT-beta-R protilátkami nebo jejich kombinací. V každém případě mohou být výhodné způsoby aplikace a optimální dávky stanoveny empiricky za použití publikovaných zpráv jako výchozích bodů pro optimalizaci rutinními klinickými postupy.

Příklad 11

Myši tolerují injekce humánního LT-alfal/beta2

Samicím C57/bl6 (starým 6 až 8 týdnů), aklimatizovaným v ústavu po dobu několika dnů, bylo aplikován injekčně i.p. 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosaminu, který senzitivuje myši na TNF a jiné protinádorové prostředky. Byl aplikován i.p. buď humánní TNF, LT-alfa nebo LTalfal/beta2.

Tabulka 3 dokumentuje přežití myší 24 hodin po aplikované injekci.

-27CZ 298711 B6

Tabulka 3

Činidlo	Dávka (pg/zvíře)	Přež
fyziologický roztok	-	4/4
hu-TNF	0,2	0/6
hu-TNF	1,0	0/2
hu-TNF	10	0/4
hu-LT-alfa	0_ř2	2/2
hu-LT-alfa	1,0	2/2
hu-LT-alfal/beta2	10	2/2
hu-LT-alfal/beta2	100	2/2

Příklad 12

Vytvoření rekombinantní anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky

Při použití shora popsaných protinádorových cytotoxicitních testů ve spojení se standardními modely růstu nádorů u imunodeficitních myší může být zvolen anti-LT-beta-R IgG s vhodnými vlastnostmi. Pro přípravu variabilní domény DNA z RNA izolované ze sekretující hybridomové ío buněčné linie za použití standardních metodologií reverzní transkriptázy/PCR může být použito univerzálních primérů, které hybridizují ke každé z variabilních domén IgG těžkých a lehkých řetězců zvolených anti-LT-beta-R. Tyto protokoly byly popsány (Aurulanandam a spol., J. Exp.

Med., 177, str. 1439 až 1450 (1993), Lané a spol., Eur. J. Immunol, 22, str. 2573 až 2578 (1993), Traunecker a spol., Nátuře, 339, str. 68 až 70 (1989)).

Amplifikované produkty se pak shromáždí do vektorů obsahujících humánní CHI, CH2 a CH3 μ řetězcové domény. Koexprese dvou řetězců v jediném hostiteli umožní shromáždit těžké a lehké řetězce do pentamemí IgM molekuly. Tato molekula je chimérou sestávající z myších variabilních oblastí připojených k humánním konstantním oblastem.

Alternativně může být použit proces používající PCR k amplifikaci DNA kódující pouze aktuální vazebné oblasti variabilních oblastí. Amplifikovaná DNA je pak vložena do vektorů obsahujících všechny sekvence humánního IgG kromě aktuálních aminokyselin účastnících se vazby na antigen. Takové konstrukce se nazývají „humanizované“ protilátky a detailní metody pro jejich přípravu jsou dobře známé (např. WO 94/04679).

Příklad 13

Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky fungují jako LT-beta-R aktivující činidla

Anti-LT-beta-R IgM protilátky mohou být připraveny v rekombinantní formě, jak popsáno v příkladu 12.

Alternativně mohou být použity jako zdroj anti-LT-beta-R IgM monoklonálních protilátek kompletní myší imunoglobuliny třídy IgM izolované metodami fúze hybridomu za použití pri35 mámí imunizace normálních myší nebo extenzivní imunizace myší CD40 postrádajících signalizaci (Kawabe a spol., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spol. Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)).

-28CZ 298711 B6

Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky budou podstatně účinnější jako LT-beta-R aktivující činidla než jejich normální bivalentní IgG protějšky, měřeno srovnáními odpovědi na dávku v HT29 cytolytickém testu za přítomnosti IFN-gama. Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky fungují jako LT-beta-R aktivující činidla jak když jsou imobilizovány, tak také, když jsou aplikovány v roztoku. Kromě toho lze očekávat, že zvětší protinádorovou účinnost LTalfa/beta heteromemích komplexů.

Příklad 14

Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhibuj í růst humánních nádorových buněk u myší SCID

Balb/c SCID myším (Jackson Labas, Bar Harbor, ME) bylo aplikováno injekěně subkutánně (s.c.) do zadní partie zvířete 1 χ 10⁶ trypsinizovaných a promytých humánních adenokarcino15 matózních WiDr buněk v objemu 0,2 ml PBS. Injekěně vpravené WiDr buňky vytvoří v myších nádory a schopnost anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhibovat růst nádoru byl monitorován. V jedné sadě pokusů se na myši působilo s nebo bez CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky — buď s nebo bez humánního IFN-gama (10⁶ protivirových jednotek/myš) — současně s inokulací WiDr buněk s.c. (obrázek 6A). Protilátky a IFN-gama byly aplikovány samotné nebo společně i.p. injekcí v 0,2 ml. Kontrolním myším byl aplikován injekěně samotný fyziologický roztok, IFN-gama samotný nebo kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) s IFN-gama. Velikost každého výsledného nádoru byla změřena 30 dní po inokulací. Objem nádoru (v cm³ byl) vypočten z poloměru zjištěného měřením posuvným měřítkem ve dvou směrech. Zvířata, kterým byly aplikovány CBE11 nebo 1E6 monoklonální protilátky, dosta25 ly 10 pg/myš nebo 50 pg/myš protilátky (obrázek 6A, kroužky s tečkami a prázdné kroužky).

V jiné sadě pokusů byly myši inokulovány s.c. WiDr buňkami a nádory se nechaly růst 15 dní, dříve než se myším aplikovala CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka (obrázek 6B). 15. den (před aplikací protilátky) činil objem nádoru CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka (50 pg) — buď s nebo bez humánního IFN-gama (10⁶ protivirových jednotek/myš) — i.p. injekcí v 0,2 ml skupině 12 zvířat. Injekce se opakovaly třikrát nebo vícekrát během období tří týdnů. Kontrolním skupinám (12 myší/skupina) byl injekěně aplikován IFN-gama samotný (10⁶ protivirových jednotek/myš) nebo s 50 pg kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátky (1E6) + IFN-gama (10⁶ protivirových jednotek/myš). Růst nádorů přítomných

15. den byl měřen během doby od 15. do 49. dne po inokulaci nádorových buněk. Výsledky znázorněné na obr. 6B byly zjištěny zaslepeným způsobem. Nádory, na které se působilo monoklonální protilátkou CBE11 buď s nebo bez IFN-gama, přestaly růst. Po třech injekcích monoklonální protilátky CBE11 (+/- IFN-gama) během tří týdnů se růst nádorů zastavil nejméně na 7 týdnů po inokulaci, to jest v době, kdy pokus byl ukončen.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití LT-α/β heteromemího komplexu pro přípravu farmaceutické kompozice určené k aplikaci v přítomnosti nebo společně alespoň s jedním LT-p-R aktivujícím činidlem pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie.
2. Použití podle nároku 1, při němž alespoň jedno LT-P-R aktivující činidlo zahrnuje terapeuticky účinné množství IFN-γ.

-29CZ 298711 B6
3. Použití podle nároku 1, při němž alespoň jedno ΕΤ-β-R aktivující činidlo zahrnuje terapeuticky účinné množství protilátky anti-LT-^-R.
4. Použití podle nároku 3, při němž je protilátkou ani-LT-β-Κ monoklonální protilátka.
5. Použití podle nároku 4, při němž se monoklonální protilátka anti-LT-β-Κ vybere ze skupiny sestávající z anti-LT^-R mAb BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.
6. Použití alespoň jednoho ΕΤ-β-R aktivujícího činidla pro přípravu farmaceutické kompozice ío pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie, při němž jedno ΕΤ-β-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-^R.
7. Použití podle nároku 6, při němž je protilátkou anti-LT^-R monoklonální protilátka.

15
8. Použití podle nároku 6, při němž se protilátka vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky.
9. Použití podle nároku 6, při němž protilátka obsahuje variabilní domény anti-LT^-R.

20 10. Použití podle nároku 6, při němž je protilátkou anti-LT-B-R CBE11.

11. Použití podle nároku 6, při němž je protilátka anti-LT^-R zaměřena na stejný epitop jako

CBE11.

12. Použití podle nároku 6, při němž se protilátka anti-LT-B-R vybere ze skupiny sestávající

25 z BKA11, CDH10, BCG6 aBHAlO.

13. Použití podle nároku 6, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s protinádorovou terapií.

30 14. Použití podle nároku 13, při němž je protinádorovou terapií ozařování nebo chemoterapie.

15. Použití podle nároku 6, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s dalším ΕΤ-β-R aktivujícím činidlem obsahujícím IFN-γ.

35 16. Použití podle nároku 6, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým činidlem, vybraným ze skupiny sestávající z IFN-α, TNF a multivalentních protilátek anti-LT-^-R.

17. Použití alespoň dvou monoklonálních protilátek anti-LT-^-R, které jsou zaměřeny proti

40 nepřekrývajícím se epitopům ΕΤ-β-R, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie.

18. Použití podle nároku 17, při němž se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze

45 skupiny sestávající z BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11.

19. Použití podle nároku 17, při němž se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající z BCG6 a BHA10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1, BDA8, BKA11, CDH10 a CBE11.

20. Použití podle nároku 17, při němž se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11 a CDH10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, BCG6, BHA10 a CBE11.

-30CZ 298711 B6

21. Použití podle nároku 17, při němž je jednou monoklonální protilátkou anti-LT-p-R CBE11, a jiná monoklonální protilátka anti-LT-fi-R se vybere ze skupiny sestávající zAGHl, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11.

22. Použití podle nároku 17, při němž jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-p-R CBE11 a BHA10.

23. Použití podle nároku 17, při němž jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R CBE11 a
10 CDH10.

24. Použití podle nároku 17, při němž jsou monoklonálními protilátkami anti-LT-P-R AGH1 a CDH10.
15 25. Použití podle libovolného z nároků 6 až 24, při němž je jiným LT-p-R aktivujícím činidlem

IFN-γ.

26. Použití zesítěných protilátek anti-LT-P-R jako prvního LT-p-R aktivujícího činidla pro přípravu farmaceutické kompozice určené k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým LT20 P-R aktivujícím činidlem, jiným než je první, pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie.

27. Použití podle nároku 26, při němž jsou zesítěné protilátky anti-LT-P-R nekovalentně imobilizovány na povrchu.

28. Použití podle nároku 26, při němž jsou zesítěné protilátky anti-LT-P-R kovalentně imobilizovány na povrchu.

29. Použití podle nároku 26, při němž jsou zesítěné protilátky anti-LT-p-R nekovalentně agre30 govány v roztoku pomocí činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-P-R.

30. Použití podle nároku 29, při němž činidlo zesíťující protilátky anti-LT-P-R zahrnuje sekundární protilátku zaměřenou proti protilátce anti-LT-p-R.

35 31. Použití podle nároku 29, při němž činidlo zesíťující protilátky anti-LT-P-R zahrnuje Fc receptor, který se váže na protilátku anti-LT-P-R.

32. Použití podle nároku 26, při němž jsou zesítěné protilátky anti-LT-P-R kovalentně agregovány v roztoku pomocí chemického činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-P-R.

33. Použití podle libovolného z nároků 26 až 32, při němž druhé LT-P-R aktivující činidlo zahrnuje IFN-γ.

34. Způsob selekce LT-P-R aktivujícího činidla, které působí v přítomnosti LT-α/ρ heteromemích komplexů, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

45 a) kultivace nádorových buněk v přítomnosti heteromemích komplexů LT-α/ρ, účinného množství prvního LT-P-R aktivujícího činidla a druhého předpokládaného LT-P-R aktivujícího činidla; a

b) zjištění, zda druhé předpokládané LT-p-R aktivující činidlo zvyšuje protinádorovou aktivitu heteromemího komplexu LT-α/ρ v přítomnosti prvního LT-P-R aktivujícího činidla.

35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že prvním LT-P-R aktivujícím činidlem je IFN-γ.

-31 CZ 298711 B6

36. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že heteromemí komplex LT-α/β vykazuje stechiometrii LT-α 1/β2.

5 37. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň dvou ΕΤ-β-R aktivujících činidel a farmaceuticky přijatelný nosič.

38. Farmaceutická kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, že alespoň jedno ΕΤ-β-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-^-R.

39. Farmaceutická kompozice podle nároku 38, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT^-R je monoklonální protilátka.

40. Farmaceutická kompozice podle nároku 39, vyznačující se tím, že monoklonální

15 protilátkou anti-LT^-R j e CBE11.

41. Farmaceutická kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, že alespoň dvě ΕΤ-β-R aktivující činidla zahrnují monoklonální protilátky anti-LT^-R, které jsou zaměřeny proti nepřekrývajícím se epitopům ΕΤ-β-R.

42. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající zAGHl a BDA8, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající zBCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11.

43. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající zBCG6 a BHA10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1, BDA8, BKA11, CDHlOaCBEll.

44. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že se jedna monoklonální protilátka anti-LT^-R vybere ze skupiny sestávající zBKAll a CDH10, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1 a BDA8, BCG6, BHAlOaCBEll.

45. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že jednou monoklonální protilátkou anti-LIH3-R je CBE11, a jiná monoklonální protilátka anti-LT^-R se vybere ze skupiny sestávající z AGH1, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 a CBE11.

40 46. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že monoklonálními protilátkami anti-LT^-R jsou CBE11 a BHA10.

47. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že monoklonálními protilátkami ant ί-ΕΤ-β-R jsou CBE11 a CDH10.

48. Farmaceutická kompozice podle nároku 41, vyznačující se tím, že monokl onálními protilátkami anti-LT-β-R jsou AGH1 a CDH10.

49. Farmaceutická kompozice podle libovolného z nároků 41 až 48, vyznačující se 50 t í m , že dále obsahuje IFN-γ jako jedno z ΕΤ-β-R aktivujících činidel.

50. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství zesítěných protilátek anti-LT^-R jako LT—β-R aktivující činidlo a farmaceuticky přijatelný nosič.

-32CZ 298711 B6

51. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, vyznačující se tím, že zesítěné protilátky anti-LT-p-R jsou nekovalentně imobilizovány na povrchu.

5 52. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, vyznačující se tím, že zesítěné protilátky anti-LT-p-R jsou kovalentně imobilizovány na povrchu.

53. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, vyznačující se tím, že zesítěnými protilátkami anti-LT-P-R jsou nekovalentně agregované protilátky anti-LT-P-R v roztoku ío pomocí činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-p-R.

54. Farmaceutická kompozice podle nároku 53, vyznačující se tím, že činidlo zesíťující protilátky anti-LT-p-R zahrnuje sekundární protilátku zaměřenou proti protilátce antiLT-p-R.

55. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, vyznačující se tím, že zesítěnými protilátkami anti-LT-p-R jsou kovalentně agregované protilátky anti-LT-p-R v roztoku pomocí chemického činidla zesíťujícího protilátky anti-LT-P-R.
20 56. Farmaceutická kompozice podle libovolného z nároků 50 až 55, vyznačující se tím, že jako druhé LT-P-R aktivující činidlo dále obsahuje IFN-γ.

57. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho LT-P-R aktivujícího činidla a farmaceuticky přijatelný nosič, přičemž
25 jedno LT-p-R aktivující činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-p-R.

58. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT-P-R je monoklonální protilátka.
30 59. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že se protilátka vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky.

60. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že protilátka
35 obsahuje variabilní domény anti-LT-P-R.

61. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT-p-R je CBE11.
40 62. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že se protilátka anti-LT-P-R váže na stejný epitop jako CBE11.

63. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že se protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

64. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku anti-LTp-R.

65. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že protilátkou

50 anti-LT-P-R je agonista LT-p-R.

66. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT-P-R je antagonista LT-P-R.

-33 CZ 29871ί B6

67. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT-P-R je monoklonální protilátka.

68. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že se protilátka 5 vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, humanizované protilátky a multivalentní protilátky.

69. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že protilátkou anti-LT-P-RjeCBEll.

70. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že je protilátka anti-LT-P-R zaměřena na stejný epitop jako CBE11.

71. Farmaceutická kompozice podle nároku 64, vyznačující se tím, že se protilátka 15 anti-LT-p-R vybere ze skupiny sestávající z BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

72. Použití podle nároku 6, při němž je protilátkou anti-LT-P-R agonista LT-p-R.

73. Použití podle nároku 6, při němž je protilátkou anti-LT-p-R antagonista LT-P-R.

74. Použití podle nároku 72, při němž se protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z CBE11, BKA11, CDH10, BCG6 a BHA10.

75. Použití podle nároku 72, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo 25 společně s protinádorovou terapií.

76. Použití podle nároku 75, při němž je protinádorovou terapií ozařování nebo chemoterapie.

77. Použití podle nároku 72, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo 30 společně s IFN-γ.

78. Použití podle nároku 72, při němž je kompozice určena k aplikaci v přítomnosti nebo společně s druhým činidlem, vybraným ze skupiny sestávající zIFN-α, TNF a multivalentních protilátek anti-LT-P-R.

79. Protilátka vytvářená hybridomem vybraným ze skupiny sestávající z CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793), BK.A11.AC10 (přírůstkové č. ATCC HB11799), CD.H10.1 (přírůstkové č. ATCC HB11797), BC.G6.AF5 (přírůstkové č. ATCC HB11794) a BH.A10 (přírůstkové č. ATCC HB11795).

80. Buňka hybridomu vybraného ze skupiny sestávající z CB.El 1.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793), BK.A11.AC10 (přírůstkové č. ATCC HB11799), CD.H10.1 (přírůstkové č. ATCC HB11797), BC.G6.AF5 (přírůstkové č. ATCC HB11794) a BH.A10 (přírůstkové č. ATCC HB11795).

81. Protilátka obsahující variabilní domény anti—LT—β—R odpovídající protilátce vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793).

82. Protilátka anti-LT-p-R obsahující antigen vázající oblast z myší monoklonální protilátky 50 CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793).

83. Protilátka anti-LT-p-R podle nároku 82, kde je protilátka chimérická nebo multivalentní.

84. Protilátka anti-LT-p-R podle nároku 82, kde je protilátka humanizovaná.

-34CZ 298711 B6

85. Protilátka anti-LT-p-R podle nároku 84, kde protilátka obsahuje konstantní oblast lidského IgG.

5 86. Protilátka anti-LT-P-R podle nároku 85, kde konstantní oblastí lidského IgG je konstantní oblast IgGl.

87. Protilátka anti-LT-P-R podle nároku 84, kde je protilátkou fragment F(ab)₂.

ío 88. Humanizovaná protilátka anti-LT-p-R obsahující antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793) a konstantní oblast lidského IgG.

89. Protilátka anti-LT-P-R podle nároku 88, kde konstantní oblastí lidského IgG je konstantní oblast IgGl.

90. Farmaceutická kompozice podle nároku 57, vyznačující se tím, že protilátka anti-LT-P-R obsahuje antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793).

20 91. Farmaceutická kompozice podle nároku 90, vyznačující se tím, že protilátka je chimérická nebo multivalentní.

92. Farmaceutická kompozice podle nároku 90, vyznačující se tím, že protilátka je humanizovaná.

93. Farmaceutická kompozice podle nároku 92, vyznačující se tím, že protilátka obsahuje konstantní oblast lidského IgG.

94. Farmaceutická kompozice podle nároku 93, vyznačující se tím, že konstantní

30 oblastí lidského IgG je konstantní oblast IgGl.

95. Farmaceutická kompozice podle nároku 92, vyznačující se tím, že protilátkou je fragment F(ab)₂.

35 96. Použití podle nároku 6, při němž protilátka anti-LT-p-R obsahuje antigen vázající oblast z protilátky vytvářené hybridomem CB.E11.1 (přírůstkové č. ATCC HB11793).

97. Použití podle nároku 96, při němž se protilátka anti-LT-P-R vybere ze skupiny sestávající z chimérické protilátky, multivalentní protilátky a humanizované protilátky.

98. Použití podle nároku 97, při němž je protilátkou fragment F(ab)₂.

99. Použití podle nároku 96, které dále obsahuje aplikaci protinádorové terapie.
45 100. Použití podle nároku 99, při němž je protinádorovou terapií ozařování nebo chemoterapie.

101. Použití podle nároku 96, které dále zahrnuje podávání LT-P-R aktivujícího činidla.

102. Použití podle nároku 101, při němž se LT-P-R aktivující činidlo vybere ze skupiny 50 sestávající z IFN-α, TNF, interferon indukujícího činidla a protilátky.