JP2012504245A - リンホトキシンアンタゴニストに対する関節リウマチの応答性を予測する生物学的マーカー - Google Patents

リンホトキシンアンタゴニストに対する関節リウマチの応答性を予測する生物学的マーカー Download PDF

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Abstract

本発明は、可溶性リンホトキシン（ｓｏｌＬＴ）、及び自己免疫疾患の治療におけるバイオマーカーとしてｓｏｌＬＴを使用する方法に関するものである。より詳細には、本発明は、可溶性リンホトキシンアルファ−ベータ（ｓｏｌＬＴαβ）、及び関節リウマチ（ＲＡ）の治療においてバイオマーカーとしてこのｓｏｌＬＴαβを使用する方法に関するものである。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本出願は、全開示が出典明示によりここに援用される２００８年９月３０日出願の米国仮出願第６１／１９４８５０号（弁護士ドケット番号ＰＲ４２５４）、及び２００９年５月７日出願の米国仮出願第６１／１７６４０６号（弁護士ドケット番号ＰＲ４２５４−１）の利益及び優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、可溶性リンホトキシン（ｓｏｌＬＴ）、及び自己免疫疾患の治療におけるバイオマーカーとしてｓｏｌＬＴを使用する方法に関するものである。より詳細には、本発明は、可溶性リンホトキシンアルファ−ベータ（ｓｏｌＬＴαβ）、及び関節リウマチ（ＲＡ）の治療においてバイオマーカーとしてこのｓｏｌＬＴαβを使用する方法に関するものである。
自己免疫疾患は、ヒトにおける臨床的に重要な疾患のままである。名称が暗示するように、自己免疫疾患は体の自身の免疫系を介して作用する。病理メカニズムは個々のタイプの自己免疫疾患で異なっているが、ある一般的なメカニズムは、特定の内因性タンパク質に対する抗体(ここでは、自己応答性抗体又は自己抗体とも称される)の産生を含んでいる。医者及び科学者は、ＲＡ、多発性硬化症、血管炎、免疫媒介性糖尿病、及びループス、例えばＳＬＥを含む、７０以上の臨床的に異なる自己免疫疾患を同定している。多くの自己免疫疾患は、２０００００人より少ないヒトが希に罹患しているものであるが、集合的には、これらの疾患は何百万人もの人口の推定５％のアメリカ人を罹患させており、ほとんどの疾患では、女性が偏って影響を受けている。これらの疾患の慢性的な性質は、莫大な社会的及び財政的負担である。
炎症性関節炎は、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬性関節炎(ＰｓＡ)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群、及び多発性筋炎を含む多様な自己免疫疾患における顕著な臨床的徴候である。これらの患者のほとんどが関節変形を発症しているが、典型的には、ＲＡとＰｓＡ患者のみが画像診断で骨びらんを示す。
ＲＡは、北ヨーロッパ及び北アメリカの成人人口の約０．５〜１％、世界の他の地域ではわずかに少ない割合で罹患している慢性の炎症性疾患である(Alamanosa及びDrosos, Autoimmun. Rev., 4:130-136(2005))。ＲＡは、罹患している関節の滑膜における慢性の炎症により特徴付けられ、慢性的な痛みと疲労のため、最終的には日常機能の喪失に至る、全身性炎症性疾患である。患者の大部分は、罹患している関節において軟骨及び骨の進行性劣化を被っており、最終的には永続的な身体障害に至るおそれがある。ＲＡの長期間にわたる予後は不良であり、約５０％の患者が、診断時から１０年以内に、顕著な機能的身体障害を被っている(Keystone, Rheumatology, 44(Suppl.2):ii8-ii12(2005))。平均余命は、平均して３−１０年少ない(Alamanosa及びDrosos, 上掲)。高力価のリウマチ因子(ＲＦ)を有する患者(患者の約８０％)は、より攻撃的な疾患を患っており(Bukhariら, Arthritis Rheum. 46:906-912(2002))、ＲＦネガティブなヒトに対して長期間にわたって悪化し、死亡率も増加する(Heliovaaraら, Ann. Rheum. Dis., 54:811-814(1995))。
慢性的な炎症性骨疾患、例えばＲＡの病変形成は、完全には解明されていない。このような疾患には、破骨細胞吸収が増加するために、罹患している関節周囲の骨量減少が伴う。このプロセスは炎症促進性サイトカインの局所的生成が増大することで、主として媒介される(Teitelbaum, Science, 289:1504-1508(2000)；Goldring, Arthritis Res. 2(1):33-37(2000))。これらのサイトカイン類は、破骨細胞系において細胞に直接的に又は必須の破骨細胞分化因子、ＮＦκＢリガンドのレセプター活性化因子(ＲＡＮＫＬ)、及び／又はその可溶性デコイレセプター、オステオプロテゲリン(ＯＰＧ)、骨芽細胞／間質細胞の生成に影響を及ぼすことにより間接的に作用させることができる(Hossbauerら, J. Bone Miner. Res., 15(1):2-12(2000))。腫瘍壊死因子-アルファ(ＴＮＦ-α)は炎症の主要なメディエーターであり、種々の形態の骨量損失の病変形成における重要性は、いくつかの実験及び証拠により支持されている(Feldmannら, Cell, 85(3):307-310(1996))。しかしながら、破骨細胞形成(Douniら, J. Inflamm., 47:27-38(1996))、びらん性関節炎(Campbellら, J. Clin. Invest., 107(12):1519-1527(2001))、又は骨溶解症(Childsら, J. Bon. Min. Res., 16:338-347(2001))にとって、これらがＴＮＦ-αの不在下で生じる可能性があることから、ＴＮＦ-αは必須ではない。
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)関連タンパク質は、宿主防御からアポトーシスに対する免疫調節の範囲まで、多様な活性を有する大きなファミリーのタンパク質として、当該分野で認識されている。それらが上昇している中で、多くの腫瘍壊死因子スーパーファミリー(ＴＮＦ-ＳＦ)のメンバーが存在する。ＴＮＦ-ＳＦは、宿主防御からアポトーシスに対する免疫調節の範囲まで、多様な活性を示す、１８の同定されたメンバーの大きなファミリーである(Locksleyら, Cell 2001; 104(4):487-501)。ＴＮＦ-ＳＦのメンバーは、細胞-細胞接触を介して局所的に作用する膜結合形態に、又は分泌タンパク質として存在する。ＴＮＦ-ＳＦレセプター(ＴＮＦＲ-ＳＦ)のファミリーは、これらのタンパク質に結合し、アポトーシス、細胞増殖、組織分化、及び炎症促進反応を含む多様なシグナル伝達経路を誘発する。ＴＮＦ-αはそれ自体により、炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス、細菌、及び寄生虫感染、悪性腫瘍、及び神経変性疾患に関連しており、ＲＡ及びクローン病等の自己免疫疾患における特定の治療標的である(Feldmannら, 2001, 上掲)。
特にＲＡにおいて、免疫反応は、滑膜コンパートメントに存在し、関節への急性炎症細胞及びリンパ球の流入を生じせしめる一又は複数の抗原により開始／持続すると考えられている。炎症の連続波により、パンヌスと呼称される浸潤性及びびらん性組織の形成に至る。これには、ＴＮＦ-α及びインターロイキン-１(ＩＬ-１)等の、炎症促進性サイトカインを生成する、増殖性の線維芽細胞様滑膜細胞及びマクロファージが含まれる。タンパク質分解性酵素、種々の炎症媒介物質の局所放出、及び破骨細胞の活性化は、多くの組織損傷に寄与している。関節軟骨の喪失及び骨の浸食の形成がある。周囲の腱及び嚢は、炎症プロセスに影響を受けるおそれがある。最終的に、関節構造の完全性は損なわれ、身体障害が生じる。
ＲＡの免疫病原性に対するＢ細胞の正確な寄与は、完全には特徴付けられていない。しかしながら、Ｂ細胞は病気のプロセスに関与している可能性があることから、いくつかの可能なメカニズムが存在する(Silverman and Carson, Arthritis Res. Ther., 5 Suppl. 4:S1-6(2003))。
歴史的に、Ｂ細胞は、自己抗体-生成細胞の前駆体として供給されることにより、主としてＲＡにおける疾患プロセスに寄与していると考えられる。タイプＩＩコラーゲン、及びプロテオグリカン類、並びにリウマチ因子に対する抗体を含む、多くの自己抗体特異性が同定されている。多量の抗体の生成により、免疫複合体の形成、及び補体カスケードの活性化に至る。順に、免疫反応が増幅され、局所的な細胞溶解になるおそれがある。増加したＲＦ合成及び補体消費は、疾患活性に相関がある。ＲＦそれ自体の存在は、より重度の形態のＲＡ、及び関節外の特徴の存在に関連している。
近年の証拠(Janeway and Katz, J. Immunol., 138:1051(1998); Riveraら, Int. Immunol., 13:1583-1593(2001))には、Ｂ細胞が高度に効率的な抗原提示細胞(ＡＰＣ)であることが示されている。ＲＦ-ポジティブＢ細胞は、それらの表面免疫グロブリンが、それらの内部に存在する抗原にかかわらず、任意の免疫複合体を容易に捕捉可能であるために、特に強力なＡＰＣである。よって、多くの抗原はＴ細胞への提示のためにプロセシングすることができる。さらに近年、このことにより、ＲＦ-ポジティブＢ細胞が自己増殖可能であることも示唆されている(Edwardsら, Immunology, 97:188-196(1999))。
Ｔ細胞の活性化のために、２つのシグナルが細胞に送達される必要があり；一方は、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)を介しており、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)抗原の存在下で、プロセシングされたペプチドを認識し、第２は同時刺激分子を介している。活性化された場合、Ｂ細胞はそれらの表面で同時刺激分子を発現し、よってＴ細胞の活性化及びエフェクター細胞の生成のための第２のシグナルを提供することができる。
Ｂ細胞は、それら自身の機能、並びにサイトカイン類を生成することにより他の細胞の機能を促進させることができる(Harrisら, Nat. Immunol., 1:475-482(2000))。ＴＮＦ-α及びＩＬ-１、リンホトキシン-アルファ(ＬＴα)、インターロイキン-６(ＩＬ-６)、及びインターロイキン-１０(ＩＬ-１０)は、Ｂ細胞がＲＡ滑膜において生成可能なサイトカイン類の一部である。
Ｔ細胞の活性化は、ＲＡの病変形成における鍵となる成分であると考えられているが、重度の複合免疫不全疾患(ＳＣＩＤ)マウスにヒトの滑膜移植片を使用した最近の研究では、関節内部におけるＴ細胞の活性化及び保持は、Ｂ細胞の存在にかなり依存していることが示されている(Takemuraら, J. Immunol., 167:4710-4718(2001))。
ＡＰＣはＴ細胞において同様の効果を有しているとは思われないため、ここでＢ細胞の正確な役割は明らかになっていない。
関節に対する構造的損傷は、慢性的な滑膜炎症の重要な結果である。ＲＡに罹患している患者の６０％〜９５％が、発病の３-８年以内に、少なくとも一のＸ線写真びらんを発症している(Paulusら, J. Rheumatol., 23:801-805(1996); Hulsmansら, Arthritis Rheum., 43:1927-1940(2000))。初期のＲＡにおいて、Ｘ線写真損傷スコアと機能的能力との間の相関は弱いが、疾患の８年後、相関係数は０．６８程の高値に達することができる(Scottら, Rheumatology, 39:122-132(2000))。少なくとも４年間ＲＡを患っている、６０歳より若い１００７人の患者において、Wolfeら(Arthritis Rheum, 43 Suppl. 9:S403(2000))は、ラーセンのＸ線写真損傷スコア(Larsenら, Acta Radiol. Diagn. 18:481-491(1977))の進行速度、増加する社会保障身体障害の立場、及び減少する家族収入には、かなりの相関があることを見出した。
Ｘ線写真損傷からの予防及び遅延化は、ＲＡ治療の目的の一つである(Edmondsら, Arthritis Rheum., 36:336-340(1993))。６又は１２ヶ月の期間の、コントロールされた臨床治験により、Ｘ線写真損傷スコアの経過は、メトトレキセート(ＭＴＸ)(Sharpら, Arthritis Rheum., 43:495-505(2000))、レフルノミド(Sharpら, 上掲)、スルファサラジン(ＳＳＺ)(Sharpら, 上掲)、プレドニゾロン(Kirwanら, N. Engl. J. Med., 333:142-146(1995); Wassenburgら, Arthritis Rheum, 42:Suppl 9:S243(1999))、インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト(Bresnihanら, Arthritis Rheum, 41:2196-2204(1998))、又はインフリキシマブ／ＭＴＸの組合せ(Lipskyら, N. Eng. J. Med., 343:1594-1604(2000))を受容した群よりも、プラシーボ群の方が早いこと、エタネルセプトを用いた治療後のＸ線写真経過が、ＭＴＸを用いた処理後よりも早いこと(Bathonら, N. Engl. J. Med., 343:1586-1593(2000))が実証された。他の研究では、コルチコステロイド(Joint Committee of the Medical Research Council and Nuffield Foundation, Ann Rheum. Dis., 19:331-337(1960); Van Everdingenら, Ann. Intern. Med., 136:1-12(2002))、シクロスポリンＡ(Paseroら, J. Rheumatol., 24:2113-2118(1997); Forre, Arthritis Rheum., 37:1506-1512(1994))、ＭＴＸ対アザチオプリン(Jeurissenら, Ann. Intern. Med., 114:999-1004(1991))、ＭＴＸ対オーラノフィン(Weinblattら, Arthritis Rheum., 36:613-619(1993))、ＭＴＸ(メタ分析)(Alarconら, J. Rheumatol., 19:1868-1873(1992))、ヒドロキシクロロキノン(ＨＣＱ)対ＳＳＺ(Van der Heijdeら, Lancet, 1:1036-1038)、ＳＳＺ(Hannonenら, Arthritis Rheum., 36:1501-1509(1993))、ＣＯＢＲＡ(Combinatietherapei Bij Reumatoide Artritis)プレドニゾン、ＭＴＸ及びＳＳＺの組合せ(Boersら, Lancet, 350:309-318(1997); Landeweら, Arthritis Rheum., 46:347-356(2002))、 ＭＴＸ、ＳＳＺ、及びＨＣＱの組合せ(O'Dellら, N. Engl. J. Med., 334:1287-1291(1996); Mottonenら, Lancet, 353:1568-1573(1999))、シクロホスファミド、アザチオプリン、及びＨＣＱの組合せ(Csukaら, JAMA, 255:2115-2119(1986))、及びアダリムマブとＭＴＸとの組合せ(Keystoneら, Arthritis Rheum., 46 Suppl. 9:S205(2002))を用いて治療された患者において、Ｘ線写真進行していると評価されている。
ＦＤＡは、ある種の薬物、例えばレフルノミド、エタネルセプト、及びインフリキシマブが、Ｘ線写真関節損傷の進行を遅延化させるというラベリングクレームを承認している。これらのクレームは、ランダムに割り当てられた治療群とコントロール群との間で観察される進行速度における、統計的に有意な差異に基づく。しかしながら、治療及びコントロール群における個々の進行速度は、かなりの程度で重複しており；よって、治療群間の有意な差異にかかわらず、これらのデータは、治療を開始する患者が、Ｘ線写真損傷の進行に対して有益な結果を有するであろう可能性を推定するのに使用することはできない。進行していない、例えば双方の時点で損傷スコアが０である、損傷スコアが増加していない、びらんを有する新たな関節がない、スコアの変化が最も小さな検出可能な差異(すなわち、同じＸ線写真の繰り返しリーダー間の差異について、９５％信頼区間)を超えない個々の患者からの対のＸ線写真を分類するための種々の方法が提案されている(Lassereら, J.Rheumatol., 26:731-739(1999))。
６又は１２ヶ月の臨床治験の開始及び終了時に得られる対のＸ線写真間の間隔中、個々の患者における構造的損傷が増加しているかどうかを決定することは、いくつかの理由で困難である。Ｘ線写真損傷の速度は、ＲＡ患者の集団では均一ではなく；数人の患者は損傷が素早く進行するが、多くは、特に時間間隔が比較的短いならばほとんど又は全く進行しない。Ｘ線写真損傷をスコア化するための方法、例えばSharp(Sharpら, Arthritis Rheum., 14:706-720(1971); Sharpら, Arthritis Rheum., 28:1326-1335(1985)), Larsen(Larsenら, Acta Radiol. Diagn., 18:481-491(1977))、及びこれらの方法の修正法(Van der Heijde, J. Rheumatol., 27:261-263(2000))は、肋軟骨下皮膚板の見かけ妨害が実在しているかどうか、又は関節の反対側の皮質間の距離が実在しているか、もしくはフィルムとＸ線写真ビームに対する、関節位置のわずかな変化、Ｘ線暴露における変化、又はいくつかの他の技術的要因によるものであるかどうかの、リーダーの解釈及び判断に依存する。
よって、記録されたスコアは実際の損傷の概算であり、多くの被験者にとって、同じＸ線写真での繰り返しスコア間の最も小さな検出可能な差異は、基線と最終Ｘ線写真との間の間隔で生じる実際の変化よりも大きい。もし、リーダーがフィルムの時間列に対して盲目であったならば、これらの不可避のスコアリングエラーは、スコアが低下する場合は明らかに「治癒」に至り、又はリーディングエラーがフィルム間の差異を増加させる場合は明らかに急速な進行があるといった、いずれかの方向にある可能性がある。研究が、プラシーボと比較して、効果的な治療を受けるようにランダムに割り当てられた患者の、かなり大きな個体群に関与している場合、正及び負のリーディングエラーは互いに相殺され、治療群間には、小さいが実際の差異を検出することができる。
同様の問題に起因するＲＡ疾患活動性を定量化するために使用され臨床測定の不正確さ；臨床治験からのある種の結果判定間の統計的に有意な差異は、治療を開始した個人にとって、改善の可能性を推定するのに有用ではなかった(Paulusら, Arthritis Rheum., 33:477-484(1990))。個々の改善性の帰属は、圧痛及び膨張した関節数に２０％の改善がある、５のさらなる測定(痛み、物理的機能、患者の大規模な健康評価、医者の大規模な健康評価、及び急性相反応物質レベル)のうち少なくとも３に２０％の改善がある場合に、改善された患者を指定する、米国リウマチ学会(ＡＣＲ)の改善のための２０％複合基準(ＡＣＲ２０)を作製して実施される(Felsonら, Arthritis Rheum., 38:727-735(1995))。これらの測定の全ては、最も小さな検出可能な差異に対して、大きな値を有するが、同様のプロセス(疾患活動性)の７つの態様のうち５つが同時に改善されることが必要であり、７つの測定エラーのランダムさが制約され、個々に対する実際の改善の結果であると考えるのは容易である。
ＲＡにおいて、関節損傷は顕著な特徴である。関節破壊の放射線的パラメーターは、疾患転帰の記述において、鍵となる結果判定として見られる。近年のＯＭＥＲＡＣＴ(Outcome Measures in Rheumatology Clinical Trials)コンセンサスミーティングにおいて、放射線学は、長期にわたる観察研究についての結果判定の中核の一部として選択された(Wolfeら, Arthritis Rheum., 41 Supp 9:S204(1998)abstract)。また放射線学は、長期間にわたる臨床治験についての測定の中核が必要な、ＷＨＯ／ＩＬＡＲ(World Health Organization/International League of Associations for Rheumatology)の一部でもある(Tugwell and Boers, J. Rheumatol., 20:528-530(1993))。
ＲＡでの放射線学的損傷の結果において利用可能なデータは、短期間及び長期間の研究の双方において得られる。最近疾患を発症したＲＡ患者の短期間での研究では、６ヶ月毎に得られるＸ線写真に、初期に急速に進行した後、２〜３年経って、手及び足における放射線学的損傷の進行速度が低減することが示された(Van der Heijdeら, Arthritis Rheum., 35:26-34(1992); Fexら, Br. J. Rheumatol., 35:1106-1055(1996))。あまり頻繁にＸ線写真をとっていない長期間の研究では、２５年までの疾患の持続時間において、絶え間ない損傷の低下を伴う、一定速度の進行が見出された(Wolfe and Sharp, Arthritis Rheum., 41:1571-1582(1998); Graudalら, Arthritis Rheum., 41:1470-1480(1998); Plantら, J. Rheumatol., 25:417-426(1998); Kaarela and Kautiainen, J. Rheumatol., 24:1285-1287(1997))。Ｘ線写真進行パターンにおけるこれらの差異が、スコアリング技術における差異であるかどうかは、明らかになっていない。
使用されるスコアリングシステムは、スコアリングされる関節の数、びらんについての独立スコアの存在(ＥＲＯ)、及び関節腔狭小化(ＪＳＮ)、関節毎の最大スコア、及び放射線学的異常部分の計量で異なる。今のところ、好ましいスコアリング方法についての合意はない。早期関節炎を患っている患者のコホート研究において、最初の３年間の経過観察中、ＪＳＮ及びＥＲＯは、手及び足の放射線学的損傷にて測定された進行に対し、それらの寄与に差異があることが見出された(Van der Heijdeら, Arthritis Rheum., 35:26-34(1992))。さらに、ＥＲＯ及びＪＳＮのスコアリングとは独立した方法、例えばシャープ(Sharp)及びケルグレン(Kellgren)スコアは、全体的な測定を使用する方法、例えばラーセンスコアよりも、初期のＲＡにおいて、変化に対してより敏感であることが見出された(Plantら, J. Rheumatol., 21:1808-1813(1994); Cuchacovichら, Arthritis Rheum., 35:736-739(1992))。シャープスコアは労働集約的方法である(Van der Heijde, Baillieres Clin. Rheumatol., 10:435-533(1996))。遅発性又は破壊性のＲＡにおいて、シャープ及びラーセン法では、類似の情報が提供されることが見出された。しかしながら、病気の終盤で、種々のスコアリングの変化に対する感度は未だ研究されておらず、ＥＲＯ及びＪＳＮを独立して測定するスコアリング方法が有益な情報を提供するということを主張できる(Pincusら, J. Rheumatol., 24:2106-2122(1997))。また、ＲＡの長期間にわたる評価についての、３つの放射線学的スコアリングシステムを比較した、Drossaers-Bakkerら, Arthritis Rheum., 43:1465-1472(2000)を参照のこと。
Paulusら, Arthritis Rheum., 50:1083-1096(2004)は、臨床治験に関与した、ＲＡに罹患している個人における、進行性又は非進行性としての関節のＸ線写真損傷を分類し、観察コホートにおけるＲＡ関節損傷が、多くの不正確で関連してるが明確に異なっている構造的関節損傷の測定を含む複合定義の使用を伴う、進行性又は非進行性として分類可能であると結論付けている。ＲＡ患者の日々の臨床管理において、少なくとも５つのシャープＸ線写真損傷スコア単位の一対のＸ線写真間の間隔変化は、実在の構造的変化と見なされる前に存在し、治療法決定の基礎として使用されると思われる。
過去１０年間、ＲＡの治療における主な利点が存在する。新規の生物剤と共に、現存する疾患修飾性抗リウマチ剤の併用使用により、多くの患者に、より高レベルの効果が提供され、同時に、初期診断及び疾患治療の結果も改善される。
エタネルセプトは、ＴＮＦ、続いて炎症性サイトカインカスケードを阻害する完全な融合タンパク質である。エタネルセプトは、ＲＡを患っている成人における疾患活動性を急速に低下させ、その改善を維持する、安全で効果的なものであることが示されている(Bathonら, N. Eng. J. Med., 343:1586-1593(2000); Morelandら, N. Engl. J. Med., 337:141-147(1997); Morelandら, Ann. Intern. Med., 130:478-486(1999); Weinblattら, N. Engl. J. Med., 340:253-259(1999); Morelandら, J. Rheumatol., 28:1238-1244(2001))。多関節型若年性ＲＡを患っている子供においても、等しく効果的である(Lovellら, N. Engl. J. Med., 342:763-769(2000))。エタネルセプトは、ＲＡを治療するために、単独療法、並びにＭＴＸとの併用療法としての使用が承認されている。US 2007/0071747には、びらん性多発性関節炎を治療するためのＴＮＦ-アルファインヒビターの使用が開示されている。
機能損失及びＸ線写真変化は、疾患過程の初期で生じる。これらの変化はある種のＤＭＡＲＤの使用により、遅延化又は予防することができる。いくつかのＤＭＡＲＤは、病初では臨床的に効果的であり、良好な耐性を有するが、これらの薬剤の多くは、経時的にあまり効果がなくなるか、又は毒性が増加してくる。その効能及び耐用性に基づき、ＭＴＸは、他の治療が測定されることにより、標準的な治療となる(Bathonら, N. Eng. J. Med., 343:1586-1593(2000); Albertら, J. Rheumatol., 27:644-652(2000))。
近年の研究では、レフルノミド、ＭＴＸ、又はプラジーボを摂取した後期ＲＡを患っている患者(Strandら, Arch. Intern. Med., 159:2542-2550(1999))、並びにＭＴＸに部分的に反応した後、インフリキシマブとＭＴＸ、又はプラシーボとＭＴＸを摂取した患者における、Ｘ線写真の進行を研究した(Lipskyら, N. Engl. J. Med., 343:1594-1602(2000); Mainiら, Lancet, 354:1932-1939(1999))。ＥＮＢＲＥＬＴＭ ＥＲＡ(初期ＲＡ)治験の最初の１年において、エタネルセプトは、疾患の徴候及び症状の改善性、及びＸ線写真進行の阻害性において、ＭＴＸよりもかなり効果的であることが示された(Bathonら, N. Eng. J. Med., 343:1586-1593(2000))。Genoveseら, Arthritis Rheum. 46:1443-1450(2002)には、研究の２年目の結果が報告されており、単独療法としてのエタネルセプトは、疾患活動度の低減、構造的損傷の阻害、及び初期の攻撃的ＲＡを患っている患者における２年以上にわたっての身体障害の低減において、ＭＴＸよりも安全で優れていると結論付けている。
さらに、手及び足におけるＸ線写真進行の低下は、ＭＴＸと併用してインフリキシマブを受容した後の、初期のＲＡを患っている患者において観察された(Van der Heijdeら, Annals Rheumatic Diseases 64:418-419(2005))。初期のＲＡを患っている患者は、インフリキシマブで治療した後の身体機能に、臨床的に有意義で持続性の改善が達成された(Smolenら, Annals Rheumatic Diseases, 64:418(2005))。初期のＲＡを患っている患者のＸ線写真進行における、インフリキシマブ及びＭＴＸの効果は、Van der Heijdeら, Annals Rheumatic Diseases, 64:417(2005)に報告されている。強直性脊椎炎を患っている患者のインフリキシマブ治療により、臨床効果に関連した炎症及び骨代謝のマーカーにおける変化に至る(Visvanathanら, Effects of infliximab on markers of inflammation and bone turnover and associations with bone mineral density in patients with ankylosing spondylitis, Ann Rheum Dis, Feb 2009; 68: 175-182)。
ＡＳＳＥＲＴと命名された、ランダム化されたプラシーボコントロール治験から得られた、強直性脊椎炎(ＡＳ)を患っている患者の骨密度におけるインフリキシマブ治療の効果は、Van der Heijdeら, Efficacy and safety of infliximab in patients with ankylosing spondylitis: results of a randomized, placebo-controlled trial(ASSERT). Arthritis Rheum 2005;52:582-91に報告されている。インフリキシマブは、ＡＳＳＥＲＴからの結果において、ＡＳを患っている患者の疲労や痛みを改善することが見出された。さらに、ＡＳＳＥＲＴの結果として、ＡＳを患っている患者におけるインフリキシマブの効能及び安全性は、van der Heijdeら, Arthritis Rheum., 52:582-591(2005)に記載されている。筆者達は、インフリキシマブが、２４週の研究期間中、ＡＳを患っている患者の大規模コホートにおいて、良好な耐性があり、効果的であると結論付けている。さらに、脊椎炎症におけるインフリキシマブ治療の効果を、ＡＳを患っている２７９人の患者のランダム化されたプラシーボコントロール治験における磁気共鳴映像により評価した(Van der Heijdeら, Arthritis Rheum., 52:582-591(2005)。ＡＳを患っている患者における脊椎のＸ線写真進行の治療効果が測定されるべき方法は、van der Heijdeら, Arthritis Rheum. 52(7):1979-1985(2005)が取り組んでいる。
１年後の、インフリキシマブ多国籍乾癬性関節炎コントロール治験(ＩＭＰＡＣＴ)のＸ線写真分析の結果が、Antoniら, The Infliximab Multinational Psoriatic Arthritis Controlled Trial(IMPACT): results of radiographic analyses after 1 year, Ann Rheum Dis, Aug 2006; 65: 1038-1043により報告されている。併用研究を用いた、ＲＡにおける抗ＴＮＦ因子治験からのデータを詳細にサブ解析することによる、臨床的改善の見られないＲＡ患者でのインフリキシマブとＭＴＸを用いた治療によるＸ線写真利点の証拠は、Smolenら, Arthritis Rheum. 52:1020-1030(2005)により報告されている。修正されたシャープ/van der Heijdeスコアにおける平均変化により測定された場合のＸ線写真進行は、インフリキシマブとＭＴＸを受容した患者よりも、ＭＴＸとプラシーボを受容した患者のほうが、より大きかった。著者は、臨床的改善のない患者でさえ、インフリキシマブとＭＴＸを用いた処理により、破壊過程に対してかなりの利点が提供され、このような患者における、疾患のこれらの２測定が解離していることが示唆される。ベースラインとなるＸ線写真損傷と、ＲＡに罹患した患者をインフリキシマブを用いて治療した後の身体機能における改善との間の関連性は、Breedveldら, Annals Rheumatic Diseases, 64:52-55(2005)に記載されている。構造的損傷は、シャープスコアのvan der Heijde修正を使用して評価した。著者は、ベースラインにおいて関節損傷が大きければ大きいほど、ベースラインにおける身体機能は乏しく、治療後の身体機能の改善性は少なく、関節破壊の進行を遅延化させるためにも、初期の治療介入の重要性が強調されると結論付けた。
ＴＮＦは、インビトロにおいていくつかの形質移入された株化細胞に対して毒性があり、インビボにおいてある種の腫瘍壊死の原因でもある、血清由来因子として同定されている。スーパーファミリーでの類似した因子が同定されており、リンホトキシン(「ＬＴ」)と称されている。１９８０年代の初期、ＴＮＦとＬＴとの間に類似性が観察されたため、ＴＮＦとＬＴは、それぞれＴＮＦ-α及びＴＮＦ-βと称することが提案されていた。よって、科学文献では双方の命名法が言及されている。本出願で使用される場合、用語「ＴＮＦ」はＴＮＦ-αと称される。後の研究により、ＬＴα及びＬＴβ称される、２形態のＬＴが明らかとなった。US 2005-0129614には、ＴＬ-５と命名される、構造的及び生物学的な類似性に基づく、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの他のポリペプチドメンバーが記載されている。
タンパク質のＴＮＦファミリーのメンバーは、局所的に細胞-細胞接触を介して作用する膜結合形態において、又は分泌タンパク質として存在する。ＴＮＦ-関連レセプターのファミリーは、これらのタンパク質と反応し、アポトーシス、細胞増殖、組織分化、及び炎症促進反応を含む、種々のシグナル伝達経路を誘発する。ＴＮＦ-αはそれ自身により、炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス、細菌及び寄生虫感染、悪性腫瘍、及び神経変性疾患に関連しており、ＲＡ及びクローン病等の疾患における、特定の生物学的治療に対する有用な標的である。
ＴＮＦ及びＬＴαタンパク質のクローニング及びそれらそれぞれの生物活性のさらなる特徴付けにより、タンパク質は多くの側面で異なっていることが明らかとなった。Aggarwalら, Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley-Liss, Inc. 1990, pp. 375-384。例えば、ＬＴαは、約２０ｋＤａで、分泌性の可溶性タンパク質である(２５ｋＤａ、Ｎ-及びＯ-グリコシル化されている場合)。対照的に、ＴＮＦは、グリコシリル化に対してはサイトを有しておらず、元来のタンパク質が細胞結合型であることに帰する、見かけの膜貫通ドメインを用いて合成される。細胞結合型ＴＮＦタンパク質のタンパク質分解により、約１９ｋＤａの分子量を有する、可溶性形態のタンパク質が放出される。ＴＮＦは、主としてマクロファージを活性化させることにより生成されるが、ＬＴはリンパ球を活性化させることにより生成される。Wongら, Tumor Necrosis Factors: The Molecules and their Emerging Role in Medicine, Beutler, B., ed., Raven Press(1991), pp. 473-484。また、ＴＮＦとＬＴαをコードする配列も異なっている。ＴＮＦとＬＴαは、約３２％のみのアミノ酸配列同一性を共有している。ＴＮＦ及びＬＴαの異なる生物活性にかかわらず、ＴＮＦは内皮細胞インターロイキン-１(「ＩＬ-１」)の生成を増加させるが、ＬＴαは、その点についてあまり効果を有さない。さらに、ＴＮＦは、マクロファージからマクロファージコロニー刺激因子の生成を誘発させるが、ＬＴαはその点についてもあまり効果を有さない。これら及び他の生物活性は、Aggarwal, Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action, Aggarwal及びVicek編(1992), pp. 61-78において論議されている。
ＴＮＦ及びＬＴαは、Spriggs, 「Tumor Necrosis Factor: Basic Principles and Preclinical Studies」, Biologic Therapy of Cancer, DeVitaら編, J.B. Lippincott Company(1991)Ch. 16, pp. 354-377; Ruddle, Current Opinion in Immunology, 4:327-332(1992); Wongら, 「Tumor Necrosis Factor」, Human Monocytes, Academic Press(1989), pp. 195-215; and Paulら, Ann. Rev. Immunol., 6:407-438(1988)による総説に、さらに記載されている。
非腫瘍細胞において、ＴＮＦ及びＴＮＦ-関連サイトカイン類は、多様な免疫反応に活性がある。ＴＮＦ及びＬＴαの双方のリガンドはＴＮＦ反応に結合して活性化させる(ｐ５５又はｐ６０、及びｐ７５又はｐ８０；ここでは「ＴＮＦ-Ｒ」と呼称する)。
細胞表面ＬＴ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞(ＩＩ-２３．Ｄ７)を特徴とするものであり、高レベルのＬＴを発現する(Browningら, J. Immunol., 147: 1230-1237(1991); Androlewiczら, J. Biol. Chem., 267: 2542-2547(1992))。ＬＴｂ-Ｒ、ＬＴサブユニット、及び表面ＬＴ複合体の発現及び生物学的役割は、Wareら, 「The ligands and receptors of the lymphotoxin system」, Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, pp. 175-218(1995)に概説されている。
腫瘍壊死因子-β(ＴＮＦ-β)としても公知のリンホトキシン-α(ＬＴα)は、Ｂ細胞を含む種々の細胞による細胞分裂刺激の後に生成される。それは、膜貫通ドメインを欠き、ＴＮＦファミリーのメンバーである、膜貫通タンパク質ＬＴ-βと共に、ヘテロ三量体複合体として、細胞表面で発現する。ＬＴ-αβ膜複合体は、活性化したＴ、Ｂ及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞において見出され、ＬＴ-α１β２からなる主要形態と、サブユニット組成で異なる。破壊されたＬＴ-α(ＴＮＦ-β)遺伝子を有するマウスでは、末梢リンパ節及びパイエル板の発生が失敗しているため、ＬＴ-α(ＴＮＦ-β)は、Ｂ細胞に対して細胞分裂し、リンパ球ホーミング、及び脾臓及びリンパ節の形成において、重要な役割を担っていると思われる。
ＬＴαとＬＴβは、ＴＮＦ-ＳＦのメンバーである。ＬＴα発現が誘発され、主として、Ｔ及びＢリンパ球、及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の活性化により、ＬＴαが分泌される。Ｔヘルパー細胞サブクラスにおいて、ＬＴαは、Ｔｈ１により生成されるが、Ｔｈ２細胞では生成されないと思われる。また、ＬＴαはメラノサイトにおいて検出されている。ＬＴｂ(ｐ３３とも称される)は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、及びリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞の表面で同定されている。研究には、ＬＴβがＬＴαの不在下で機能しないことが示されている。
ＬＴαは、ホモ三量体(ＬＴα３)、又はＬＴβとのヘテロ三量体として存在している。これらのヘテロ三量体は、ＬＴαの２つのサブユニットとＬＴβ(ＬＴα２ｂ１)の一つのサブユニット、又はＬＴαの一つのサブユニットとＬＴｂ(ＬＴα１ｂ２)の２つのサブユニットのいずれかを含む。ＬＴαはホモ三量体として細胞から分泌されるか、又はＬＴα１β２ヘテロ三量体として、主として膜貫通ＬＴβと、細胞表面で複合する(Gramaglia I,ら, J Immunol 1999;162(3):1333-8)。
２つの三量体ＬＴ形態は異なるレセプターに結合し：ＬＴα３はＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩＩに結合するが；ＬＴα１β２はＬＴββＲに結合する。ヘテロ三量体形態ＬＴα２β１はＴＮＦレセプターに結合すると思われる。ＬＴβＲ経路を介したシグナル伝達は、胚中心(ＧＣ)構造の発育、及び第２のリンパ節(ＬＮ)の正常な発育の調節にとって重要である(Ware CF., Annu Rev Immunol 2005;23:787-819)。それは、自己免疫疾患に関連している、慢性的に炎症を起こしている組織における三次リンパ系構造の発育に関連している(Weylandら J Rheumatol Suppl 2007;79:9-14)。増加したＬＴα、ＬＴβ及びＬＴβＲ転写物がＲＡ患者の滑膜組織で観察され、疾患の病変形成におけるＬＴ経路についての役割を指示する(Takemuraら, 2001, 上掲)。さらに、ＬＴβ-Ｒ発現は、ＲＡ患者における線維芽細胞様滑膜細胞で増加している(Braunら, Arthritis Rheum 2004;50(7):2140-50)。
ＬＴβ-Ｒは、免疫系の発育、及び濾胞樹状細胞及び多くの間質細胞型を含む、免疫系の多くの細胞の機能維持の双方において、明確に表された役割を有する(Matsumotoら, Immunol. Rev. 156:137(1997))。ＬＴβ-Ｒに対する公知のリガンドはＬＴα１β２ばかりでなく、ＬＩＧＨＴと呼ばれる第２のリガンドも含む(Mauriら, Immunity 8:21(1998))。ＬＴβ-Ｒの活性化により、インビボにおけるある種の癌細胞系のアポトーシス死が誘発されることが示されている(US 6,312,691)。ＬＴβ-Ｒに対するヒト化抗体、及びその使用方法は、US 2004-0058394に提供されており、ヒトにおける腫瘍の進行、重症化又は影響を治療又は低減するのに有用であると記載されている。さらに、EP 1585547(WO 2004/058183)(LePage and Gill)には、一又は複数の他の化学療法剤と併用して、ＬＴβ-Ｒシグナル伝達を活性化させる組成物を含む併用治療、並びに腫瘍阻害において付加的な効果を有するＬＴβ-Ｒアゴニスト剤と併用される薬剤を同定する方法が開示されている。
ＬＴは、ノックアウトマウスで明白なように、リンパ新生にとって重要である。ＬＴβ-Ｒが不十分なマウスではリンパ節とパイエル板が欠失していることが示され、さらに損なわれた抗体親和成熟を示す、Futtererら Immunity, 9(1): 59-70(1998)が参照される。Rennertら, Immunity, 9(1): 71-9(1998)は、ＬＴβ-Ｒに対するアゴニストモノクローナル抗体が、ＬＴαノックアウトマウスにおいて、リンパ節を作製する能力を復元することを報告している。さらに、Wuら, J. Immunology, 166(3): 1684-9(2001)、及びEndresら,J. Exp. Med., 189(1): 159-68(1999); Dohiら, J. Immunology, 167(5): 2781-90(2001); 及びMatsumotoら, J. Immunology, 163(3): 1584-91(1999)を参照。Kornerら Eur. J.Immun., 27(10): 2600-9(1997)は、ＴＮＦとＬＴの双方を欠くマウスでは、Ｂ細胞成熟の遅延化及び血清免疫グロブリン欠失が見られるが、ＴＮＦのみを欠くマウスでは、このような欠損症は見られないことを報告している。
さらに、ＬＴは炎症にとって重要である。ＬＴαは、炎症、増加したケモカイン発現、及びリンパ様構造を示す、ＲＩＰ.ＬＴαトランスジェニックマウスの膵臓で過剰発現しており、ＬＴβ単独の過剰発現では、さらなる炎症がないことが示されている。さらに、ＬＴα-欠失マウスではＴＮＦ-α生成が損なわれ、このようなマウスをＴＮＦ-トランス遺伝子と交配させた場合、欠損した脾臓構造及び機能は回復し(Kollias, J. Exp. Med., 188:745(1998); Chaplin, Ann Rev Imm 17:399(1999))、低減したＴＮＦレベルは病原体投与後に回復する(Eugster, Eur. J.Immun. 31:1935(2001))。
ＴＮＦ-α又はＬＴα３がＴＮＦレセプターＴＮＦＲＩ及び／又はＴＮＦＲＩＩと相互作用する場合、炎症促進反応及び／又はアポトーシスといった結果に至る。ＬＴα１β２がレセプターＬＴβ-Ｒと相互作用する場合、リンパ新生、及びケモカイン類及び接着分子の誘導といった結果に至る。自己免疫疾患はリンパ新生及び炎症反応に関連しており、ＭＳ、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、及びＲＡを含む、自己免疫疾患を患っている患者において、ＬＴ発現が増加する(Weyandら, Curr. Opin. Rheumatol., 15: 259-266(2003); Selmajら, J. Clin.Invest., 87: 949-954(1991); Matuseviciusら, J. Neuroimm., 66: 115-123(1996); Powellら, International Immunology, 2(6): 539-44(1990); Zippら, Annals of Neurology, 38/5: 723-730(1995); Voskuhlら, Autoimmunity 15(2): 137-43(1993);Selmajら, J. Immunology, 147: 1522-29(1991); Agyekumら, Journal Pathology, 199(1): 115-21(2003); 及びTakemuraら, J. Immunol., 167: 1072(2001))。
特にＲＡに関しては、ＲＡ患者におけるヒトＬＴα３及びＴＮＦ-αのレベルは、正常なドナーよりも上昇している(Stepien, Eur Cytokine Net 9: 145(1998))。ＲＡにおけるＬＴαの役割には：血清ＬＴαが数人のＲＡ患者に存在し、増加したＬＴαタンパク質が滑膜に存在し、ＬＴ経路が滑膜における異所性リンパ新生に関連しており、ＲＡ患者の線維芽細胞様滑膜細胞に、増加したＬＴβ-Ｒ発現が存在する、ことを含む。さらに、事例レポートには、中和したＬＴα３が、インフリキシマブ-耐性ＲＡ患者にとって有益であることが開示されている(Buchら, Ann. Rheum.Dis., 63: 1344-46(2004))。また、Hanら, Arthrit. Rheumat., 52: 3202-3209(2005)には、ＬＴ経路を遮断すると、Ｔｈ１反応が高められることにより、自己免疫関節炎が悪化することが記載されている。
コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)において、ＬＴβＲ-Ｆｃで予防及び治療された前臨床効果は、Favaら, J. Immunology, 171(1): 115-26(2003)に示されている。さらに、ＬＴα-欠損マウスは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)に対して耐性がある(Suenら, J. Exp. Med, 186: 1233-40(1997); Sean Rimintonら, J. Exp. Med, 187(9): 1517-28(1998))。ＥＡＥにおけるＬＴβＲ-Ｆｃの効果も公開されている(Gommermanら, J. Clin.Invest ,112(5): 755-67(2003))。また、ＬＴβＲ-Ｆｃは、マウスにおけるリンパ新生を破壊する。Mackayら, Europ. J. Immunol. 27(8): 2033-42(1997))。さらに、ＬＴβＲ-Ｆｃを投与すると、肥満ではない糖尿病マウスにおける、インスリン依存性真性糖尿病(ＩＤＤＭ)が低下する(Wuら, J. Exp. Med , 193(11): 1327-32(2001))。非ヒト霊長類のリンパ新生におけるＬＴの役割は、ＬＴβＲ-Ｆｃを使用し、Gommermanら, J. Clin. Invest.110(9): 1359-69(2002)により研究された。さらに、ＬＴα-欠損マウスは、ＴＮＦ-α-欠損マウスよりも、マイコバクテリウム・ボビスに対して、あまり影響されない。Eugsterら, Europ. J. Immunol., 31: 1935(2001)。
ＬＴ経路に干渉するアンタゴニストは、自己免疫疾患を治療する潜在的治療剤として同定されている。本経路におけるこのような分子はリンホトキシンアルファ(ＬＴα)であり、ＴＮＦ-アルファ又はリンホトキシンベータ(ＬＴβ)等の、本経路に関与する他のサイトカイン類よりも、本経路において種々のレセプターとの相互作用が可能であることが示されているため、魅力的な標的である。ＬＴαアンタゴニスト抗体は自己免疫疾患、例えば関節リウマチ(ＲＡ)の治療のための治療剤としての可能性が示されている(その全体が出典明示によりここに援用Adamsら WO/2008/06377を参照)。しかしながら、任意の付与されたＲＡ関節炎患者にとって、患者が特定の治療、より新規のＬＴアンタゴニスト治療に対してでさえ、反応しそうであることを、頻繁に予測又は予知することはできず、よって、最も効果的な治療を見出すために、多くの場合、患者にとってかなり危険で不快な、多数の治験及びエラーが必要となる。
しかして、ＲＡを治療するために、単一薬剤として、又は他の薬剤と併用して使用するかどうか、患者が治療に対して反応しているかを測定するための、またＬＴアンタゴニスト治療を用いたＲＡ患者のより効果的な治療レジメに、このような測定法を導入するための、より効果的な手段が必要とされている。
ここに引用された全ての引用文献の全内容は、出典明示によりここに援用される。
本発明は、可溶性のＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)組成物、自己免疫疾患、例えば関節リウマチの治療におけるバイオマーカーとしての使用方法を提供する。
一態様において、本発明は、関節リウマチ(ＲＡ)を患っている患者が、リンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストでの治療に対して応答性であるかどうかを評価する方法を提供し、該方法は、ＬＴアンタゴニストで治療された患者における、ｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含み、未治療の患者におけるｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療された患者におけるｓｏｌＬＴαβの量が増加度合いが、患者はＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性を示す。
他の態様において、本発明は、患者における関節リウマチ(ＲＡ)の治療効果をモニターする方法を提供し、ここで患者はＬＴアンタゴニストで治療され、該方法は、ＬＴアンタゴニストで治療された患者におけるｓｏｌＬＴαβの量をモニターすることを含み、未治療の患者におけるｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療された患者におけるｓｏｌＬＴαβの量の増加度合いが、ＬＴアンタゴニストでの治療の指標となる。
他の態様において、本発明は、患者亜集団における、関節リウマチを治療するのに効果的な治療剤を同定する方法を提供し、該方法は、薬剤で治療された患者亜集団における、所定量のｓｏｌＬＴαβの存在下、薬剤の効果との相関関係を示すことを含み、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者亜集団が薬剤を用いた治療に対する応答性を示し、よって患者亜集団における関節リウマチの治療に対して、効果的な薬剤であると同定される。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストで治療した後、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を、治療前の患者から得られた試料と比較することを含み、治療後のｓｏｌＬＴαβの増加量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応の指標となる、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する関節リウマチを患っている患者の応答性を予測する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストで治療した後、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を、治療前の患者から得られた試料と比較することを含み、治療後のｓｏｌＬＴαβの増加量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応を指標となる、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する関節リウマチを患っている患者の応答性をモニターする方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストでの治療の前後の、患者の血清又は滑液におけるｓｏｌＬＴαβの量を比較することに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を調節することを含み、ｓｏｌＬＴαβの増加量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応の指標となる、ＬＴアンタゴニストを用いた、関節リウマチを患っている患者の治療法を修正する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストでの治療の前後の、患者の血清又は滑液におけるｓｏｌＬＴαβの量を比較することに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの有効量を決定することを含み、ｓｏｌＬＴαβの量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応の指標となる、関節リウマチを患っている患者の、ＬＴアンタゴニストでの治療を設定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストでの治療の前後の、患者の血清又は滑液におけるｓｏｌＬＴαβの量を比較することに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を修正することを含み、ｓｏｌＬＴαβの量が疾患の予後の指標となる、患者における自己免疫疾患の予後を予測する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストで治療した後、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を、治療前の患者から得られた試料と比較することを含み、治療後のｓｏｌＬＴαβの持続増加量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応の指標となる、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する関節リウマチを患っている患者の応答性をモニターする方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＴアンタゴニストで治療した後、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を、治療前の患者から得られた試料と比較することに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を調整することを含み、治療後のｓｏｌＬＴαβの増加、及び／又は持続増加量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する反応の指標となり、ＬＴアンタゴニストの量が、患者におけるｓｏｌＬＴαβの増加量を得る及び／又は持続させるように調整される、ＬＴアンタゴニストを用いた、関節リウマチを患っている患者の治療法を修正する方法を提供する。
上述した方法のいくつかの態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者の血清中、１-１００００ｐｇ／ｍＬの範囲とすることができる。一実施態様において、ｓｏｌＬＴαβは、患者の血清中、２５-８００ｐｇ／ｍＬの範囲とすることができる。他の実施態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者の滑液又は組織中、２０-４００ｐｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
他の態様において、本発明は、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含み、ｓｏｌＬＴαβの量が疾患を示すものである、患者における自己免疫疾患を診断又は予測する方法を提供する。一態様において、患者はＬＴアンタゴニストで治療される。他の態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は１０−５００ｐｇ／ｍＬの範囲である。一態様において、試料は血清試料である。
他の態様において、本発明は、患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含み、ｓｏｌＬＴαβの量が疾患を示すものである、自己免疫疾患に対する危険性について、患者を診断又は予測する方法を提供する。一態様において、患者はＬＴアンタゴニストで治療される。他の態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は１０−５００ｐｇ／ｍＬの範囲である。一態様において、試料は血清試料である。
上述した方法のいくつかの態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は、ＬＴアンタゴニストの第一の用量を投与した後、２４時間、５０日又は１００日内に測定可能である。一実施態様において、アンタゴニストはイムノアドヘシンとすることができる(例えば、抗体はキメラ、ヒト化又はヒト抗体とすることができる)。他の実施態様において、抗体は抗リンホトキシンアルファ(抗ＬＴα)抗体である。他の実施態様において、アンタゴニストは細胞毒性剤とコンジュゲートしておらず、又はアンタゴニストは細胞毒性剤とコンジュゲート可能である。
いくつかの実施態様において、ＬＴアンタゴニストは静脈内に投与可能であり、又はＬＴアンタゴニストは皮下投与可能である。他にも、ＬＴアンタゴニストは罹患した関節に投与することもできる。
いくつかの実施態様において、患者は、関節リウマチ用の薬物を以前に一度も投与されたことはなく、患者は関節リウマチ用の少なくとも一の薬物を過去に投与されたことはなく、又は患者は、過去に投与された少なくとも一の薬物に対して反応していない。他の実施態様において、過去に投与された薬物又は薬物類は、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、又は非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)であってよい。
一実施態様において、ＬＴアンタゴニスト治療は、ＬＴアンタゴニストと共に一又は複数の第二の医薬を有効量投与することをさらに含み、ここでＬＴアンタゴニストは第一の医薬である。他の実施態様において、第二の医薬は一又は複数の薬物であってよい。他の実施態様において、第二の医薬は、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、疼痛コントロール剤、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はそれらの組合せとすることができる。
一実施態様において、免疫抑制剤は、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリン、及びシクロホスファミドからなる群から選択することができる；
一実施態様において、第二の医薬は、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ-ペニシラミン、注射用金、経口用金、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシン、及びメトトレキセートからなる群から選択されるＤＭＡＲＤである。一実施態様において、第二の医薬は、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、アスピリン、及びイブプロフェンからなる群から選択されるＮＳＡＩＤである。
一実施態様において、第二の医薬は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンからなる群から選択されるコルチコステロイドである。
一実施態様において、第二の医薬 抗アルファ４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット(kinaret)、エファリズマブ、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＮＦκＢリガンドの抗レセプター活性化因子(抗ＲＡＮＫＬ)、ＮＦκＢ-Ｆｃの抗レセプター活性化因子(ＲＡＮＫ-Ｆｃ)、パミドロナート、アレンドロナート、アクトネル、ゾレンドロナート、クロドロナート、メトトレキセート、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、スルファサラジン(ＳＳＺ)、プレドニゾロン、インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾン、及びメチルプレドニゾロンからなる群から選択することができる。
他の実施態様において、第二の医薬は、インフリキシマブ、インフリキシマブ／メトトレキセート(ＭＴＸ)の組合せ、ＭＴＸ、エタネルセプト、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、プレドニゾロン、ＭＴＸ及びＳＳＺの組合せ、ＭＴＸ、ＳＳＺ及びＨＣＱの組合せ、シクロホスファミド、アザチオプリン及びＨＣＱの組合せ、及びアダリムマブとＭＴＸの組合せからなる群から選択することができる。
他の一実施態様において、第二の医薬はＭＴＸとすることができる。他の実施態様において、ＭＴＸは経口的又は非経口的に投与することができる。
一実施態様において、本方法は、関節リウマチ(ＲＡ)に罹患している患者に関連している。他の実施態様において、ＲＡは早期関節リウマチ又は初発関節リウマチであってよい。他の実施態様において、患者は一又は複数の抗腫瘍壊死因子(抗ＴＮＦ)インヒビターに対して、不十分な応答を示す可能性がある。
一実施態様において、ｓｏｌＬＴαβの量は、ＬＴアンタゴニストの第一の用量を投与した後、２４時間、５０日又は１００日内に測定される。
他の実施態様において、過去に投与された薬物(類)は、ＬＴアンタゴニスト治療の前に、少なくとも約３つの方法で投与可能である。他の実施態様において、ＬＴアンタゴニストは、ＲＡを治療するための任意の他の医薬を用いることなく、投与することができる。
一実施態様において、ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性をモニターする方法は検査を使用することを含む。一実施態様において、検査は、治療前のベースラインと比較して、骨又は組織の関節損傷の低減度を測定する画像検査である。他の実施態様において、検査は総修正Ｓｈａｒｐスコアを測定することができる。
他の一実施態様において、投与されるＬＴアンタゴニストの量は、関節損傷の低減を達成するのに有効なものである。
他の実施態様において、本方法は、有効量のＬＴアンタゴニストを患者に投与することによる、患者を再治療することをさらに含むことができる。他の実施態様において、再治療は、アンタゴニストの最初の投与の少なくとも２４週後に開始される。さらなる他の実施態様において、各投与時に投与されるＬＴアンタゴニストの量は、関節損傷の持続又は保持された低減を達成するのに有効なものである。他の実施態様において、本方法は、有効量のＬＴアンタゴニストを用いて開始される、さらなる再治療を含むことができる。他の実施態様において、さらなる再治療は、アンタゴニストの第二回目の投与の少なくとも２４週後に開始可能である。一実施態様において、関節損傷は再治療後に低減する可能性がある。他の実施態様において、再治療後の検査時に、患者に臨床的改善が観察できない可能性がある。
他の態様において、本発明は、関節リウマチを治療するために、患者に有効量のＬＴアンタゴニストをまず投与することを含む、患者における関節リウマチを治療する方法を提供し、但し、患者からの試料には、コントロール中のＬＴの量よりも多くの量のＬＴ(例えば、ｓｏｌＬＴαβ及びＬＴα３)が含まれており、より多くの量で、患者に有効量のＬＴアンタゴニストを投与することによる、ＬＴアンタゴニスト治療、及び患者のＬＴアンタゴニスト再治療の最初の投与後少なくとも２４週での患者の応答性を示し、ＬＴアンタゴニストの最初の投与後の検査時に、患者に臨床的改善が観察されない。
一態様において、検査用試料は、血清、滑膜組織、又は滑液である。一態様において、対照用試料は、治療前の、変形性関節炎患者の罹患した関節、又はＲＡに罹患した関節からの滑液試料である。他の態様において、対照用試料は、正常なドナー血清試料、又はＲＡ患者からの治療前試料である。
一実施態様において、検査は、ｓｏｌＬＴαβのレベルを測定するのに適した装置を使用して実施される。他の実施態様において、検査は、適切なプロセッサにより実行されるソフトウェアプログラムを使用して実施される。ある種の実施態様において、プログラムは、有形情報記録媒体に保存されるソフトウェアに統合される。ある種の他の実施態様において、有形情報記録媒体は、ＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、及びプロセッサに関連したメモリーからなる群から選択される。
ある実施態様において、本発明の方法は、検査又は診断の結果を記録したレポートを作成する工程をさらに含む。一実施態様において、レポートは有形情報記録媒体に記録又は保存される。特定の実施例において、有形情報記録媒体は紙である。他の実施態様において、有形情報記録媒体は、ＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、及びプロセッサに関連したメモリーからなる群から選択される。
ある種の他の実施態様において、本発明の方法は、利害関係者に診断の結果を連絡する工程をさらに含む。一実施態様において、利害関係者は、患者又は主治医である。他の実施態様において、連絡は、書面、電子メール又は電話によりなされる。
図１Ａは、ヒトＬＴαβヘテロ三量体についての特定の電気化学発光アッセイ(ＥＣＬＡ)についての概略図を示す。 図１Ｂは、ヒトＬＴαβのみを検出し、他のＴＮＦファミリーリガンドを検出しないこのアッセイの特異性を示す。ｈｕＬ ＴβＲ-Ｆｃ捕獲及び抗ＬＴα検出を使用するアッセイは、特にＬＴα１β２及びＬＴα２β１を認識するが；ＬＴα３、ＴＮＦα、又はＬＩＧＨＴは認識しない。 図１Ｃにおいて、ＬＴα及びＬＴβコンストラクトで安定して形質移入された２９３細胞は、ｈｕＬＴβＲ-Ｆｃ-Ａｌｅｘａ-６４７で染色され、ＦＡＣＳにより表面ＬＴαβ発現が分析され(オープンヒストグラム)；形質移入されていない細胞又は対照抗体で染色された細胞も示される。 図１Ｄにおいて、形質移入されていない２９３細胞、及びＬＴα及びＬＴβコンストラクトで形質移入された細胞からの培養上清は、特定のＬＴα３、ＬＴαβ、及びＴＮＦαアッセイを使用して分析され、可溶性サイトカイン類のレベルが測定される(棒は、４つの培養体の平均及びＳＤを示す)。各アッセイについても、最も低い検出限界を点線で示す。 図２は、活性化したヒトＴ細胞が、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ切断によりＬＴαβを脱落させることを例証する。(Ａ)再活性化後２日の極性化ヒトＴ細胞からの培養上清は、特定のＬＴα３、ＬＴαβ、及びＴＮＦαアッセイを使用して分析され、可溶性サイトカイン類のレベルが測定された(棒グラフは、３つの血液ドナーの平均及びＳＤを示す)。 図２は、活性化したヒトＴ細胞が、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ切断によりＬＴαβを脱落させることを例証する。(Ｂ)再活性化後１日間、−／＋１０又は５０μＭのＴＮＦαプロテアーゼインヒビター-１(ＴＡＰＩ-１)処理されたＴｈ１ヒトＴ細胞からの培養上清は、可溶性サイトカイン類のレベルについて、パネルＡにあるように分析された(棒は、３つの血液ドナーの平均及びＳＤを示す)。 図２は、活性化したヒトＴ細胞が、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ切断によりＬＴαβを脱落させることを例証する。(Ｃ)ＲＮＡはパネルＢにおいて、細胞集団から単離され、ＤＮＡプローブに特異的なＬＴα、ＬＴβ及びＴＮＦαを使用し、ＰＣＲにより定量した。 図２は、活性化したヒトＴ細胞が、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ切断によりＬＴαβを脱落させることを例証する。(Ｄ)プールした極性化Ｔｈ１細胞からの上清は、抗ＬＴα-コンジュゲート又はＬＴβＲ-Ｆｃ-コンジュゲートしたアガロースビーズを用いて免疫沈降され、ゲル電気泳動により分離したタンパク質を変性させ、ＬＴα(赤)及びＬＴβ(緑)に対して特異的な、蛍光染料で標識されたプローブを使用し、ウエスタンブロットした。参照として、組換えヒトＬＴα１β２が使用された。２つのグリコシル化形態は、それぞれＬＴα及びＬＴβについて見られる。 図３は、ｍｕＬＴβＲ-Ｆｃが投与された実験用の自己免疫疾患脳脊髄炎(ＥＡＥ)マウスの血清におけるｓｏｌＬＴαβレベルの上昇を示す。 図４Ａは、(Ａ)ｍｕＬＴβＲ-Ｆｃが投与されたコラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)マウスの血清におけるｓｏｌＬＴαβレベルの上昇を示す。 図４Ｂは、(Ｂ)ＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃが投与されたＣＩＡマウスの血清における可溶性ＴＮＦ-αレベルの上昇を示す。 図５は、重度の移植片対宿主病を発病したヒトＳＣＩＤマウス(ヒト末梢血液単核細胞を移植)の血清における、可溶性のヒトＬＴαβのレベルを示す。可溶性のヒトＬＴαβのレベルは、対照抗体(ハーセプチン)で治療されたマウスでは上昇したが、ＣＴＬＡ-４-Ｆｃ(抗炎症治療剤)で治療されたマウスではかなり低下した。 図６は、ＲＡ患者の血清及び滑液中の末梢ｓｏｌＬＴαβを示す。(Ａ)正常なヒトドナー及びＲＡ患者から収集した血清は、特定のＬＴα３、ＬＴαβ、及びＴＮＦαアッセイを使用して、可溶性サイトカイン類のレベルについて分析された(水平線は平均を表す)。 図６は、ＲＡ患者の血清及び滑液中の末梢ｓｏｌＬＴαβを示す。(Ｂ)ＲＡ及びＯＡ患者の膨張した関節から収集された滑液は、特定のＬＴα３、ＬＴαβ、及びＴＮＦαアッセイを使用して、可溶性サイトカイン類のレベルについて分析された(水平線は平均を表す)。 図７は、可溶性ＬＴαβ及びＬＴα３が、原発性ＲＡ線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)における炎症促進性サイトカイン類、ケモカイン類及び付着分子の発現を誘発することを示す。(Ａ)原発性ＲＡ ＦＬＳ系は、６時間、３００ｎｇ／ｍＬのＬＴαβ又は培地単独で模倣された。全ＲＮＡが細胞から精製され、示した遺伝子について、定量ＰＣＲを実施した。 図７は、可溶性ＬＴαβ及びＬＴα３が、原発性ＲＡ線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)における炎症促進性サイトカイン類、ケモカイン類及び付着分子の発現を誘発することを示す。(Ｂ)ＦＬＳは、６時間、１００ｎｇ／ｍＬのＬＴα３又は培地単独で模倣された。全ＲＮＡが細胞から精製され、示した遺伝子について、定量ＰＣＲを実施した。データは平均±ＳＥＭとして示され、コントロールとサイトカイン類との全ての差異は、対応ｔ検定によれば高度に有意であった(ｐ値＜０．０４)。 図７は、可溶性ＬＴαβ及びＬＴα３が、原発性ＲＡ線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)における炎症促進性サイトカイン類、ケモカイン類及び付着分子の発現を誘発することを示す。(Ｃ)ＦＬＳは、ＬＴαβ又はＬＴα３単独で、又は２５μｇ／ｍＬのＬＴβＲ-Ｆｃ又はＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃの存在下で刺激された。全ＲＮＡが細胞から精製され、示した遺伝子について、定量ＰＣＲを実施した。
(詳細な記述)
Ｉ．略語
特に示さない限り、次の略語が適用される。
Figure 2012504245
ＩＩ．定義
特に示さない限り、本発明の実施は、当該技術の範囲内で、分子生物学(組換え技術を含む)、細菌学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いてなされる。このような技術は文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(Sambrookら, 1989); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubelら編, 1987, 及び定期最新情報); PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullisら, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual(Barbasら, 2001)において詳細に説明されている。
他に定められないならば、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術の当業者により、通常に理解されるような同様の意味を有する。Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 1994), 及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons(New York, NY 1992)、但し、当業者には、本出願において使用される多くの用語に対する一般的指針が提供される。
当業者であれば、本発明の実施に使用可能で、ここに記載のものに類似又は等価な多くの方法及び物質を認識しているであろう。実際、本発明は、何らの方法でも、記載の方法及び物質に限定されない。本発明の目的にとって、次の用語を以下に定める。
「リンホトキシン-アルファ」又は「ＬＴα」又は「ＬＴａ」は、２５０００の相対分子量を有する単量体タンパク質としてここで定められる。本タンパク質は米国特許第5,824,509号の図２Ａに示す配列(ここでは配列番号：１と同定)、又はｌｅｕ＋１(ロイシルアミノ末端リンホトキシン種とも称される)、又はｈｉｓ＋２４(ヒスチジルアミノ末端リンホトキシン種とも称される)で、米国特許第5,824,509に開示されているものを有する。
Figure 2012504245
特に、ＬＴαはＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ホモ三量体ＬＴα３(以下に定める)として細胞から分泌されるか、又はＬＴαβ(以下に定める)として、主としてＬＴα１β２ヘテロ三量体として、ＬＴβ(以下に定める)と、細胞表面で複合体化する。ＬＴαは、ヒトＴＮＦ-α又はその天然の動物性類似体を特異的に除外すると定められる(Pennicaら, Nature 312:20/27: 724-729(1984)及びAggarwalら, J. Biol. Chem. 260: 2345-2354(1985))。ＬＴαは、例えば米国特許第５６６１００４号において定められているように、ヒトＬＴβを特異的に排除すると定められる。
「リンホトキシン-ベータ」又は「ＬＴβ」又は「ＬＴｂ」は、米国特許第５６６１００４号に配列番号：２として示されるアミノ酸配列を有する、生物学的に活性なポリペプチドとしてここでは定められている。ＬＴβは、例えば米国特許第5,824,509号に定められているように、ヒトＬＴαを特異的に排除すると定められる。
「リンホトキシン-アルファ３」又は「リンホトキシン-α３三量体」又は「ＬＴα３」又は「ＬＴａ３」は、ＬＴαモノマーのホモ三量体を意味する。それは、５５０００-７００００の相対分子量(Ｍｒ)を有する糖タンパク質であり、３つのＬＴαモノマーの会合により形成される。
「リンホトキシン-アルファ-ベータ」又は「リンホトキシン-αβ」又は「ＬＴαβ」又は「ＬＴαβ複合体」又は「ＬＴａｂ」は、ＬＴαとＬＴβの膜結合ヘテロ三量体を意味する。これらのヘテロ三量体は、ＬＴαの２つのサブユニットとＬＴβ(ＬＴα２β１)の１つのサブユニット、又はＬＴαの１つのサブユニットと２つのＬＴβ(ＬＴα１β２)のいずれかを含有する。本用語は、ＬＴα２β１又はＬＴα１β２を、個々に又は混合物として含む。
用語「可溶性リンホトキシン-アルファ−ベータ」又は「ｓｏｌＬＴαβ」は、細胞に結合又は会合しない、溶液中のＬＴαβを意味する。ｓｏｌＬＴαβは、膜貫通領域の末端(すなわち、米国特許第５６６１００４号において配列番号：２の約アミノ酸４４)と約アミノ酸９５の間の任意の点で切断されたＬＴβにより定められる。
「腫瘍壊死因子レセプター-１」又は「ＴＮＦＲＩ」及び「腫瘍壊死因子レセプター-ＩＩ」又は「ＴＮＦＲＩＩ」は、ＬＴα３ホモ三量体に対する細胞表面ＴＮＦレセプターを称し、それぞれｐ５５及びｐ７５として公知である。
「リンホトキシン-ベータレセプター」又は「リンホトキシン-βレセプター」又は「ＬＴβ-Ｒ」又は「ＬＴｂ」は、ＬＴαβヘテロ三量体が結合するレセプターを意味する。ここで使用される場合、用語「リンホトキシンレセプター」はリンホトキシン-βレセプターを意味する。
「調節サイトカイン類」は、患者における自己免疫疾患の存在を示す異常なレベルのサイトカイン類である。このようなサイトカイン類には、例えばインターロイキン-１(ＩＬ-１)、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２３、ＩＬ-２４、ＩＬ-２５、ＩＬ-２６、ＢＬｙＳ／Ａｐｒｉｌ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ-１、ＭＩＦ、ＭＣＰ-１、Ｍ-ＣＳＦ、又はＧ-ＣＳＦ、リンホトキシン、ＬＩＧＨＴ、４-１ＢＢリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＨＡＮＫ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、及びＶＥＧ１が含まれる。この群には、ＴＮＦファミリーのメンバーが含まれ、限定されるものではないが、ＴＮＦ-α、リンホトキシン(ＬＴｓ)、例えばＬＴα、ＬＴβ、及びＬＩＧＨＴが含まれる。ＴＮＦスーパーファミリーについての概説は、MacEwan, Br. J. Pharmacology 135: 855-875(2002)を参照のこと。好ましくは、調節サイトカインはリンホトキシン、例えばＴＮＦファミリーのメンバーである。
「関節リウマチに関連した炎症性サイトカイン類は、ＲＡ病理に関連したリンホトキシン類、例えばＬＴαを称し、全身的に、及び／又は関節において、又はインビトロコラーゲン誘発関節炎アッセイにおいて阻害可能である。
「ＬＴαβ-発現細胞」は、ＬＴαβヘテロ三量体を発現及び／又は脱落させる細胞である。
語句「ＬＴαβ-発現細胞を調節」とは、例えば単球、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞を含む細胞を用い、サイトカイン類、ケモカイン類、又は成長因子により作製されるタンパク質を枯渇又は変化させることを意味する。
「リンホトキシンアンタゴニスト」又は「ＬＴアンタゴニスト」は、例えばＬＴＲ-発現細胞により誘発される炎症誘発反応を低減又は防止することにより、一又は複数のＬＴＲ発現細胞の機能と干渉する、及び／又は哺乳動物におけるその対応リンホトキシンレセプター(ＬＴＲ)へのＬＴの結合を低減又は防止する分子である。ＬＴアンタゴニストは、インビトロ、インサイツ、及び／又はインビボで、ＬＴを低減、ブロック、阻害、無効、調節、及び／又はそうでなければ干渉可能である。このような薬剤は、例えばＬＴに結合し、その活性を中和することを介して、ＬＴの生物学的機能又は活性を阻害可能である。例えば、ＬＴアンタゴニストは、リンホトキシンＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質合成、リンホトキシン放出、リンホトキシンレセプターシグナル伝達、膜リンホトキシン切断、リンホトキシン活性、及びリンホトキシン生成及び／又は合成を低減、ブロック、無効、調節、干渉、防止及び／又は阻害可能である。ＬＴアンタゴニストの例には、限定されるものではないが、抗ＬＴ抗体、その抗原-結合断片、ＬＴへの結合時、ＬＴに対するレセプターを発現する細胞の一又は複数の機能と干渉し、ＬＴと特異的に結合する、その特定の変異体又はドメイン、可溶性リンホトキシンレセプター又は断片、その融合ポリペプチド、小分子ＬＴアンタゴニスト、例えばＴＮＦ結合タンパク質Ｉ又はＩＩ(ＴＢＰ-Ｉ又はＴＢＰ-ＩＩ)、ネレリモンマブ(nerelimonmab)、ＣＤＰ-５７１、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムラブ(HUMIRAＴＭ)、ＣＤＰ-５７１、ＣＤＰ-８７０、アフェリモマブ、レネルセプト等)、その抗原-結合断片、ＬＴに特異的に結合するレセプター分子、リンホトキシン合成、ＬＴ放出、又は標的細胞におけるその作用を防止及び／又は阻害する化合物、例えばサリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼインヒビター(例えば、ペントキシフェリン及びロリプラム)、Ａ２ｂアデノシンレセプターアゴニスト、及びＡ２ｂアデノシンレセプターエンハンサー、リンホトキシンレセプターシグナル伝達を防止及び／又は阻害する化合物、例えば分裂促進因子活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼインヒビター、膜リンホトキシン切断をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばメタロプロテイナーゼインヒビター、リンホトキシン活性をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばアンジオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒビター(例えば、カプトプリル)、及びリンホトキシンの生成及び／又は合成をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばＭＡＰキナーゼインヒビターが含まれる。好ましいアンタゴニストには、抗体又はイムノアドヘシンが含まれる。ここで考慮されるＬＴアンタゴニストの例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、及びアダリムマブ(HUMIRAＴＭ)である。一実施態様において、ＬＴアンタゴニストはＬＴαのアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体、特にヒト化したモノクローナル抗ＬＴα抗体である。
ここで使用される場合、「アンタゴニスト」は、ここに開示の天然ポリペプチドの生物活性を部分的又は全体的にブロック、阻害、又は中和する任意の分子を含む。適切なアンタゴニスト分子には、特にアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び小有機分子等が、非限定的例として含まれる。アンタゴニストを同定する方法は、それを発現する細胞を含むこのようなポリペプチドと、候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子とを接触させ、通常このようなポリペプチドに関連する一又は複数の生物活性における検出可能な変化を測定することを含む。
「ブロック」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を抑制又は低減するものである。好ましいブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に阻害する。
ここで使用される場合、「抗リンホトキシン抗体アンタゴニスト」又は「抗ＬＴ抗体アンタゴニスト」は、ＬＴアンタゴニストである抗体である。例えばいくつかの実施態様において、抗リンホトキシン抗体アンタゴニストは、例えばＬＴＲ-発現細胞により誘発される炎症誘発反応を低減又は防止することにより、一又は複数のリンホトキシンレセプター(ＬＴＲ)発現細胞の機能と干渉する、及び／又は哺乳動物におけるその対応リンホトキシンレセプターへのＬＴの結合を低減又は防止する。ＬＴに結合する抗体は、以下の通りに命名される：リンホトキシンアルファ(ＬＴα)に結合する抗体、「抗リンホトキシンアルファ抗体」又は「抗ＬＴα抗体」。アンタゴニストは、抗炎症効果について、当該技術で公知の種々の方法によりスクリーニング可能である。例えば、スクリーニング方法は以下の参照に記載されているようにして使用可能である：Lu, Yら, Current Opinionin Pharmacology 7, 571-546(2007); Han, Sら Arthritis Rheum 52, 3202-3209(2005);Fava, R.Aら, J Immunol 171, 115-126(2003); Mackay, Fら, Gastroenterology 115, 1464-1475(1998); Gommerman, J.Lら, Nat Rev Immunol 2003 上掲); Wu, Qら, J Exp Med 193, 1327-1332(2001); 及びEttinger, Rら, J Exp Med 193, 1333-1340(2001)。
ここで使用される場合、用語「調節」は、例えば生体分子の活性又は機能を、アップ又はダウンレギュレーション又は変化させることを意味する。例えば、調節とは、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子もしくは一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベルを、発現、レベル又は活性が、モジュレーターの不在下で観察されるよりも多く又は少なくなるように、変化、又はアップ又はダウンレギュレーションすることを意味する。例えば、ＬＴアンタゴニストは、ＬＴポリペプチド及び／又はリンホトキシンレセプターポリペプチドの活性時に、モジュレーターとして作用する。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、広義において相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「単離された」アンタゴニストとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の探求、診断又は治療への使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。いくつかの実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定して抗体の９５重量％を越え、いくつかの実施態様においては９９重量％を越えるまで；（２）例えばスピニングカップシークエネーターを使ったＮ末端又は内在するアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）例えばクーマシーブルー又は銀染色を用いた還元又は非還元状態の下でのSDS-PAGEにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然な環境の少なくとも一成分が存在しないことから、組換え細胞のインサイツ抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製段階によって調製されるであろう。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」とも称される。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」とも称される。これらのドメインは一般的に抗体のほとんどの可変部分であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して保持され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害への抗体の関与を示す。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、さらにこれらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般的に、例えばAbbasら Cellular and Mol. Immunology, 第4版.(W. B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と、一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される、大きな融合分子の一部とすることができる。
用語「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」は、ここでは交換可能に使用され、以下に示すような抗体断片ではなく、実質的に無傷形態の抗体を意味する。本用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。
ここでの目的にとって、「ネイキッド抗体」とは、細胞障害性部分又は放射標識にコンジュゲートしない抗体である。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖と重鎖が、二本鎖Ｆｖ種に類似した「二量体」構造に結合可能なように、可動性ペプチドリンカーにより共有結合可能である。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互作用して、ＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を画成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、さらに軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore編, (Springer-Verlag, New York：1994), pp. 269-315を参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を称し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、二価又は二重特異性であってよい。ダイアボディーは、欧州特許第404,097号；国際公開第1993/01161号；Hudsonら, Nat.Med., 9:129-134(2003); 及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)に、さらに詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディは、Hudsonら, Nat. Med., 9:129-134(2003)に記載されている。
ここで使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体を意味する。よって、「モノクローナル」との修飾語句は、別々の抗体の混合物としてではなく、抗体の特徴を示す。ある種の実施態様において、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を有する抗体を含み、ここで、標的-結合ポリペプチド配列は、多くのポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られる。例えば選択プロセスは、多数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールから、唯一のクローンを選択することとすることができる。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養における生産性を改善するため、インビボにおける免疫原性を低下させるため、多重特異的抗体を産生させる等のために、さらに変化させることができ、また変化した標的結合配列を有する抗体も、この発明のモノクローナル抗体であると理解すべきである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンによって典型的には汚染されていない点で有利である。
「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を任意の特定の方法で生産する必要があると解釈されるものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97(1975); Hongoら, Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988); Hammerlingら: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681(Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628(1991); Marksら, J. Mol. Biol., 222:581-597(1992); Sidhuら, J. Mol. Biol., 338(2):299-310(2004); Leeら, J. Mol. Biol., 340(5):1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(34):12467-12472(2004);及びLeeら, J. Immunol. Methods, 284(1-2):119-132(2004)、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する、ヒト又はヒト様抗体を動物において生成させるための技術(例えば、国際公開第1998/24893号; 国際公開第1996/34096号; 国際公開第1996/33735号; 国際公開第1991/10741号; Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551(1993); Jakobovitsら, Nature, 362: 255-258(1993); Bruggemannら, Year in Immunol., 7:33(1993); 米国特許第5,545,807号; 同5,545,806号; 同5,569,825号; 同5,625,126号; 同5,633,425号; 及び同5,661,016号; Marksら, Bio/Technology, 10: 779-783(1992); Lonbergら, Nature, 368:856-859(1994); Morrison, Nature, 368:812-813(1994); Fishwildら, Nature Biotechnol., 14:845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnol., 14:826(1996);及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93(1995)を参照)を含む、種々の技術により作製されてよい。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来、あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号、及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば関心ある抗体を用いて、免疫化されたマカクザルにより生成された抗体から誘導されたものである、PRIMATIZED(登録商標)抗体を含む。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものキメラ抗体ある。一実施態様において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＨＶＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmannら, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照。またさらに、例えばVaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 1:105-115(1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038(1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433(1994); 及び米国特許第6,982,321号及び米国特許第7,087,409号を参照。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体この定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該技術で公知の種々の技術を使用して生成可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marksら, J. Mol. Biol., 222:581(1991)。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に有用なのは、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77(1985); Boernerら, J. Immunol., 147(1):86-95(1991)に記載の方法である。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74(2001)を参照。ヒト抗体は、抗原誘発に反応するこのような抗体が生成されるように修飾された、トランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製可能であるが、その内在性座位は、例えば免疫化キセノマウスで無効である(例えば、XENOMOUSETM技術に関し、米国特許第6,075,181号及び同6,150,584号を参照)。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関し、例えば、Liら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)を参照。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、特にＨ３は抗体に微細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXuら, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Castermanら, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriffら, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
多数のＨＶＲの描写がここで使用され、また含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲｓ)であるＨＶＲは配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、構造的ループ位置の代わりを言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、オックスフォード・分子ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらそれぞれのＨＶＲの残基を以下に記す。
カバットループ AbM Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(カバット番号付)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Chothia番号付)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＨＶＲは次の通り「伸展ＨＶＲ」を含みうる：ＶＬ中の２４-３６又は２４-３４（Ｌ１）、４６-５６又は５０-５６（Ｌ２）及び８９-９７又は８９-９６（Ｌ３）と、ＶＨ中の２６-３５（Ｈ１）、５０-６５又は４９-６５（Ｈ２）及び９３-１０２、９４-１０２又は９５-１０２（Ｈ３）。これらの伸展ＨＶＲの定義の各々に対して上掲のKabat等に従って、可変ドメイン残基を番号付けした。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義するようにＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバットにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変形は、Kabatら 上掲における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、ＦＲ又はＨＶＲの可変ドメインを短くする、又はそこに挿入される、対応のより少ない又は付加的なアミノ酸を含有可能である。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物(カバットに従い残基５２ａ)、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基(例えば、カバットに従い残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等)を含む。残基のカバット番号付けは、「標準的な」カバットナンバー配列を有する抗体配列の相同な領域で配列させることにより、付与された抗体について決定できる。
「親和成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＨＶＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。一実施態様において、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。例えば、Marksら Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ-及びＶＬドメイン混合による親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えばBarbasら, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier ら, Gene, 169：147-155(1995)；Yeltonら, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jacksonら, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkinsら, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「成長阻害」抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を防止又は低減するものである。例えば、抗体はインビトロ及び／又はインビボでＢ細胞の増殖を防止又は低減可能である。
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等の標準的なアポトーシスアッセイにより決定されるような、例えばＢ細胞のプログラム細胞死を誘発するものである。抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域)に起因するそれらの生物活性を称し、抗体のアイソタイプにより変化する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞の活性化等が含まれる。
ここで用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端までの位置のアミノ酸残基から伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば抗体の生成又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって、取り除くことができる。従って、無傷抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
特に示されていないならば、ここでは、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabatら, 上掲 におけるようなＥＵインデックスのものである。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃレセプター結合；ＡＤＣＣ；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)のダウンレギュレーション等が含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン(例えば、抗体-可変ドメイン)と組合せたＦｃ領域が必要であり、例えばここでの定義では、開示されているように、種々のアッセイを使用して評価することができる。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡアロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域；並びにその自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一のアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも一のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の相同性を有し、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。
用語「Ｆｃ領域含有抗体」は、Ｆｃ領域を含む抗体を意味する。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば抗体の精製中に、又は抗体をコードする核酸を組換え的に操作することによって、取り除くことができる。従って、この発明のＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、全てのＫ４４７残基が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体を含みうる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載する。いくつかの実施態様において、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける用語「ＦｃＲ」によって包含される。
用語「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、胎児への母のＩｇＧの移動(Guyerら, J. Immunol. 117:587(1976)、及びKimら, J. Immunol. 24:249(1994))、及び免疫グロブリンのホメオスタシスの調節の原因となる、新生児レセプター、ＦｃＲｎを含む。ＦｃＲｎへの結合性を測定する方法は公知である(例えば、Ghetie and Ward, Immunology Today,18(12):592-8(1997); Ghetieら, Nature Biotechnology, 15(7):637-40(1997); Hintonら, J. Biol. Chem.,279(8):6213-6(2004); 国際公開第2004/92219号(Hintonら)を参照)。
インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合性、及びヒトＦｃＲｎ高-親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質移入したヒト株化細胞、変異Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類においてアッセイ可能である。国際公開第2000/42072号(Presta)には、ＦｃＲｎへの改善された又は低下した結合性を有する抗体が記載されている。また、例えばShieldsら, J. Biol. Chem., 9(2): 6591-6604(2001)を参照。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様において、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能(類)を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離することができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原担持標的細胞に特異的に結合可能なように、ある種の細胞傷害性細胞(例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ)に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)に結合したＩｇを分泌し、続いて細胞毒で標的細胞を殺す、細胞傷害の形態を意味する。ＡＤＣＣ媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第5,500,362号又は同5,821,337号、又は米国特許第6,737,056号(Presta)に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞を含む。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynesら, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価可能である。
「補体依存性細胞傷害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的細胞を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、同族抗原と結合した抗体(適切なサブクラスのもの)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列(変異Ｆｃ領域を有するポリペプチド)が変化し、Ｃ１ｑ結合能力が増加又は低下したポリペプチド変異体は、例えば米国特許第6,194,551号及び国際公開第1999/51642号に記載されている。また、例えばIdusogieら, J. Immunol. 164:4178-4184(2000)を参照。
「結合親和性」は、一般的に、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の強度総計を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の１：１相互作用を表す、固有の結合親和性を表す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該技術で公知の一般的方法により測定することができる。低-親和性抗体は、一般的に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向にあるが、高-親和性抗体は、一般的により素早く抗原に結合し、長時間、結合を持続している傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術で公知であり、そのいずれかを本発明の目的に使用することができる。結合親和性を測定するための、特定の例証及び例示的実施態様を以下に記載する。
一実施態様において、この発明において、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイに記載するように、関心ある抗体のＦａｂバージョンと、その抗原とを用いて実施される、放射標識抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)により測定される。抗原に対する、Ｆａｂの溶液-結合親和性は、標識されていない抗原の滴定シリーズの存在下、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識された抗原を用いてＦａｂを平衡化させ、ついで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレート、結合抗体を捕捉することにより測定される(例えば、Chenら, J. Mol. Biol., 293:865-881(1999)を参照)。アッセイについての条件を確立するために、マイクロタイタープレート(DYNEX Technologies, Inc.)を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)に５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)が入ったもので、一晩コーティングし、続いて、室温(約２３℃)で２〜５時間、ＰＢＳに２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンが入ったものでブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］-抗原を、関心あるＦａｂの連続希釈液と混合する(例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致、Prestaら, Cancer Res., 57:4593-4599(1997))。ついで、関心あるＦａｂを一晩インキュベートするが；インキュベートは、確実に平行に達するように、長時間(例えば、約６５時間)続けることができる。その後、混合物を、室温でインキュベート(例えば１時間)するために捕捉プレートに移す。ついで、溶液を除去し、ＰＢＳに０．１％のトゥイーン-２０ＴＭ界面活性剤が入ったもので、８回洗浄する。プレートを乾燥させた時に、１５０μｌ／ウェルの発光体(scintillant)(MICROSCINT-20ＴＭ; Packard)を添加し、プレートをTOPCOUNTＴＭガンマカウンター(Packard)で１０分計測する。最大架橋２０％未満が付与される各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイを使用して選択する。
他の実施態様に従い、Ｋｄ又はＫｄ値は、〜１０反応単位(ＲＵ)で、固定化抗原ＣＭ５チップを用い、２５℃にて、BIACORE(登録商標)-2000又はBIACORE(登録商標)-3000機器(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用する、表面プラズモン共鳴法により測定される。簡単には、カルボキシメチル化されたデキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)は、供給者の使用説明書に従い、Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化される。抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、カップリングタンパク質の反応単位(ＲＵ)が約１０になるように、５μｌ／分の流速で注射する前に、５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈される。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射し、未反応基をブロックする。動力学測定のために、２倍に連続希釈されたＦａｂ(０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ)を、約２５μｌ／分の流速で、２５℃にて、ＰＢＳに０．０５％のトゥイーン２０ＴＭ界面活性剤が入ったもの(ＰＢＳＴ)に注射する。会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を、会合と解離のセンサーグラムを同時に適合することにより、単一の１対１Langmuir結合モデル(BIAcore(登録商標)Evaluation Software version 3.2)を使用して算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出する。例えば、Chenら,J. Mol. Biol., 293:865-881(1999)を参照。オン速度(on-rate)が、上述した表面プラズモン共鳴アッセイにより、１０６Ｍ−１ｓ−１を超過しているならば、オン速度は、分光計、例えばストップフローが具備された分光光度計(Aviv Instruments)、又は8000シリーズのSLM-AMINCOＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で攪拌キュベットを具備するもので測定される場合、増加濃度の抗原下、ＰＢＳに２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ形)が入ったものを２５℃で、蛍光発光強度(励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍの帯域通過)における増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を使用して測定可能である。
この発明の「オン速度」、「解離の速度」、「解離速度」又は「ｋｏｎ」は、BIACORE(登録商標)-2000又はBIACORE(登録商標)-3000システム(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用し、上述にて記載したように測定することができる。
ここで使用される場合、用語「実質的に類似」又は「実質的に同様」は、２つの数値(例えば、一方は本発明の抗体に関連しており、他方は参照／比較抗体に関連している)の間の十分高度な類似性を示し、当業者であれば、該値(例えばＫｄ値)により測定される生物学的特徴の範囲内で、２つの値の間に、ほとんど又は全く生物学的及び／又は統計的に有意な差異がないとみなすであろう。前記２つの値の間の差異は、例えば、参照／比較分子に対する値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
ここで使用される場合、語句「実質的に低減」又は「実質的に異なる」は、２つの数値(一般的に、一方は分子に関連しており、他方は参照／比較分子に関連している)の間の十分高度な差異を示し、当業者であれば、該値(例えばＫｄ値)により測定される生物学的特徴の範囲内で、２つの値の間に、統計的に有意な差異があるとみなすであろう。前記２つの値の間の差異は、例えば、参照／比較分子に対する値の関数として、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、及び／又は約５０％以上である。
ある実施態様において、ここで有用なヒト化抗体は、ＩｇＧ Ｆｃにアミノ酸変化をさらに含み、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体以上に、ヒトＦｃＲｎに対し、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらに好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍までに増加した結合親和性を示す。
ＩｇＧにおけるＮ-グリコシル化部位は、ＣＨ２ドメインにおけるＡｓｎ２９７にある。ここでの使用に含まれるものは、Ｆｃ領域を有する任意のヒト化抗体の組成物であり、ここで、組成物中の抗体の約８０-１００％(好ましくは、約９０-９９％)が、糖タンパク質のＦｃ領域に結合するフコースを欠くか、又はフコース含有量が低下している成熟したコア炭水化物構造を含む。
ここで使用される場合、「関節リウマチ」又は「ＲＡ」は、ＲＡの分類について、２０００の改訂されたAmerican Rheumatoid Associationの基準、又は任意の類似した基準に従い診断された、認定病態を意味する。本用語には活性又は初期のＲＡだけではなく、以下に記載するような初発ＲＡも含まれる。ＲＡの生理学的指標には、ＲＡにおいて不変ではない特徴である、急性及び慢性の対称な関節膨張が含まれる。手の近位指節間(ＰＩＰ)関節、並びに中手指節関節(ＭＣＰ)、手首、肘、膝、足首、及び中足指節(ＭＴＰ)関節の紡錘状膨張は、一般的に影響を受けており、膨張は容易に検出される。受動運動における痛みは、関節炎症についての最も高感度なテストであり、多くの場合、炎症及び構造的変形により、影響を受けている関節の運動範囲が制限される。典型的な可視的変化には、ＭＣＰ関節での指の尺骨偏位、過伸展、又はＭＣＰ及びＰＩＰ関節の過屈曲、肘の屈曲拘縮、及び手根骨及びつま先の亜脱臼が含まれる。ＤＭＡＲＤは症状の治療において効果的でないか、又は全く効果的ではないという点から、ＲＡを患っている被験者はＤＭＡＲＤに対する耐性がある。さらに、この発明の治療に対する候補者は、毒性又は不十分な効果の故に、ＴＮＦインヒビター、例えばエタネルセプト、インフリキシマブ及び／又はアダリムマブを用いた、以前又は現在の治療に対して不十分な反応を示す人である(例えば、エタネルセプトを、３ヶ月、２５ｍｇで週に２回、又は３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブを少なくとも４回注入)。
「活動性関節リウマチ」を患っている患者とは、活動的で潜在的ではないＲＡの症状がある患者を意味する。「早期活動性関節リウマチ」を患っている被験者は、ＲＡ分類について、改訂された1987年のＡＣＲ基準に従い、少なくとも８週間であるが４年以上ではない期間、活動性ＲＡであると診断された被験者である。
「早期関節リウマチ」を患っている被験者は、ＲＡ分類について、改訂された1987年のＡＣＲ基準に従い、少なくとも８週間であるが４年以上ではない期間、ＲＡであると診断された被験者である。ＲＡには、例えば若年発症性ＲＡ、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)、又は若年性ＲＡ(ＪＲＡ)が含まれる。
「初発ＲＡ」を患っている患者は、ＲＡ-特異的予後バイオマーカー、例えば抗ＣＣＰ及び共有エピトープの存在に関連して、ＲＡ診断についてのＡＣＲ基準を十分には満たさない早期多発性関節炎を患っている。それらには、多発性関節炎ではあるが、まだＲＡとは診断されてはおらず、真性にＡＣＲ基準でＲＡを発症する危険性が高い(９５％の可能性)ポジティブ抗ＣＣＰ抗体を有する患者が含まれる。
「関節損傷」は広義の意味で使用され、結合組織又は軟骨を含む、一又は複数の関節の任意の部分に対する損傷、もしくは部分的又は完全な破壊を称し、ここで、損傷には、関節の痛み／関節痛の原因かもしれない、又はそうではないかもしれない任意の原因による構造的及び／又は機能的損傷が含まれる。限定されるものではないが、炎症性関節疾患並びに非炎症性関節疾患に関連する又は起因する関節損傷が含まれる。この損傷は、任意の病状、例えば自己免疫疾患、特に関節炎、さらにはＲＡにより引き起こされる。このような病状の例には、急性及び慢性の関節炎、若年発症性ＲＡ、ＪＩＡ、又はＪＲＡを含むＲＡ、及びリウマチ性滑膜炎、痛風又は痛風性関節炎、急性の免疫学的関節炎、慢性の免疫学的関節炎、変性性関節炎、タイプＩＩコラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、敗血症性関節炎、ライム病関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、arthritis chronica progrediente、変形性関節炎、慢性多発性関節炎primaria、応答性関節炎、閉経性関節炎、エストロゲン枯渇性関節炎、及び強直性脊椎炎／リウマチ性脊椎炎)、ＲＡ以外のリウマチ様自己免疫疾患、及びＲＡに対して２次的なかなりの全身性病変(限定されるものではないが、脈管炎、肺線維症又はフェルティ症候群)の段階が含まれる。ここでの目的について、関節は、それを囲み、支持している部分と共に、(動物等の脊椎動物の)骨格のエレメント間の接触点であり、限定するものではないが、例えば臀部、脊椎の椎骨の間の関節、脊椎と骨盤(仙腸関節)の間の関節、骨に結合している靱帯と腱の関節、肋骨と脊椎の間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足首及びつま先、特に手と足の関節が含まれる。
ここで、被験者の「治療」とは、治療的治療及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必要があるものには、既にＲＡ又は関節損傷を患っているもの、並びにＲＡ又は関節損傷、もしくはＲＡ又は関節損傷の進行が予防されるべきものが含まれる。従って、被験者は、ＲＡ又は関節損傷に罹患していると診断されてもよく、又はＲＡ又は関節損傷に罹りやすい又は敏感であってもよく、又はＲＡ又は関節損傷が、治療の存在下で進行するおそれがあると思われてもよい。ＲＡ又は関節損傷が軽減又は治癒し、もしくはその徴候及び症状及び構造的損傷を含み、ＲＡ又は関節損傷の進行が、投与前の被験者の状態と比較して、停止又は遅延化しているならば、ここで治療は成功である。成功裏の治療には、ＲＡ、もしくは関節又は構造的損傷の進行が、完全に又は部分的に防止されることも、さらに含む。ここでの目的にとって、ＲＡ、又は関節損傷、又は関節損傷の進行の遅延化又は低減は、ＲＡ又は関節損傷の停止、低減、又は逆転と同様である。
ここで使用される場合、用語「患者」は、治療を所望する任意の単一の動物、好ましくは哺乳動物(非ヒト動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類を含む)を意味する。最も好ましくは、ここでの患者はヒトである。
ここで「被験者」とは、例えば、最近診断された、又は以前に診断された、及び現在、再発又はぶり返しを被っている、又はＲＡもしくは関節損傷の危険性がある、原因となる問題がないにかかわらず、ＲＡ又は関節損傷の一又は複数の徴候、症状又は他の指標を被っている、又は被った経験のある、治療に適切な、患者を含む任意の単一のヒト被験者である。被験者として意図するものには、疾患の臨床的徴候を何ら示さない臨床研究試験に関与する被験者、又は疫学研究に関与する被験者、又は対称として使用される被験者が含まれる。被験者は、リンホトキシンレセプターアンタゴニストを含む、ＲＡ又は関節損傷用の薬物で予め治療されていてもよいし、そのような治療がされていなくてもよい。被験者は、ここでの治療が開始される際に使用される第二の医薬の投薬を受けていなくてもよく、すなわち、被験者は、「ベースライン」(すなわち、ここでの治療方法にて、アンタゴニストの初回容量の投与前の時点での設定点、例えば治療が開始される前の被験者をスクリーニングする日)にて、ＭＴＸ等の免疫抑制剤で予め治療されていない。このような「投薬を受けていない」被験者は、一般的に、このような第二の医薬で治療するための候補者とみなされる。
「臨床的改善」は、Ｘ線検査を含む、種々の検査により測定された場合に、治療の結果として、ＲＡ又は関節損傷のさらなる進行が防止された、又はＲＡ又は関節損傷に何らかの改善がみられることを意味する。よって、臨床的改善は、例えば脆弱又は膨張した関節の数、Psoriasis Assessment Severity Index、被験者の包括的臨床的評価を評価することにより、赤沈速度を評価することにより、又はＣ-応答性タンパク質レベルの量を評価することにより測定することができる。
ここでの目的にとって、被験者は、ＲＡ又は活動性関節損傷の症状、例えばここに開示の方法により検出可能なものがない、またベースライン又は治療中の所定の時点で評価された場合、ＲＡ又は関節損傷の進行がないならば、「寛解」している。寛解していないヒトには、ＲＡ又は関節損傷が悪化又は進行しているヒトが含まれる。活動性ＲＡ又は関節損傷を含む、症状の戻りがあるこのような被験者は、「ぶり返し」又は「再発」した被験者である。
ＲＡ又は関節損傷の「症状」は、被験者が被っている、任意の病的な現象、又は構造、機能又は間隔における正常性からの逸脱、及びＲＡ又は関節損傷の指標、例えば脆弱又は膨張した関節を含む上述したものである。
語句「有効量」は、ＲＡ又は関節損傷の治療に有効な薬物の量を意味する。これには、例えばＸ線又は他の検査により決定された量を投与する前のベースラインと比較して、ＲＡ又は関節損傷に低減をもたらすのに効果的な量が含まれる。有効量の第二の医薬は、ここでのアンタゴニストと併用して、ＲＡ又は関節損傷を治療するばかりでなく、併用剤又は規定にある疾患又は疾病を含む、ＲＡ又は関節損傷に付随する副作用又は症状又は他の状態を含む、所望しない影響を治療するために提供される。
「総修正Ｓｈａｒｐスコア」は、Genant, Am. J. Med., 30:35-47(1983)により修正されたように、シャープの方法を使用したＸ線写真を評価するために得られるスコアを意味する。主たる評価は、スクリーニングからの全シャープ-ゲナント(Genant)スコアにおける変化であろう。シャープ-ゲナントスコアは、びらんスコア、及び手と足の双方の関節腔狭小化スコアと組合せられる。関節損傷は、ベースライン(患者が、ここでのアンタゴニストの最初の投与前にスクリーニング又は検査される時)でのスコア以下の平均変化により、この検査のスコアリングにおいて測定される。
補助治療としてここで使用される場合、用語「免疫抑制剤」は、ここで治療される哺乳動物の免疫系を抑制又はマスクするように作用する物質を意味する。サイトカイン生成を抑制する、自己抗原発現をダウンレギュレート又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例は、２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン類（米国特許第4,665,077号参照、）；ＮＳＡＩＤ；ガンシクロビル、タクロリムス、グルココルチコイド類、例えばコルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター、又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例えばＣＴＸ；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソーン；グルタルアルデヒド(米国特許第4,120,649号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド類、例えばコルチコステロイド類又はグルココルチコステロイド又はグルココルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、SOLU-MEDROL(登録商標)メチルプレドニソロンコハク酸ナトリウムを含むメチルプレドニソロン、及びデキサメタゾン；デヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばＭＴＸ(経口又は皮下用)；抗マラリア剤、例えばクロロキン及びヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインアンタゴニスト、例えばサイトカイン抗体又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、特に抗インターフェロン-α、-β又は-γ、抗ＴＮＦα抗体(インフリキシマブ(REMICADE(登録商標)又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗ＴＮＦβ抗体、抗ＩＬ-２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体、及び抗ＩＬ-６レセプター抗体及びアンタゴニスト(ACTEMRAＴＭ(トシリズマブ(tocilizumab))；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；汎Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶性ペプチド（国際公開第90/08187号）；ストレプトキナーゼ；トランスフォーミング成長因子-ベータ(ＴＧＦβ)；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＤＮＡ又はＲＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；クロラムブシル；デオキシスパガリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター（Cohenら, 米国特許第5,114,721号）；Ｔ細胞レセプター断片（Offnerら, Science, 251: 430-432 (1991); 国際公開第90/11294号; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 及び国際公開第91/01133号）；ＢＡＦＦアンタゴニスト、例えば抗ＢＡＦＦ抗体及び抗ＢＲ３抗体及びｚＴＮＦ４アンタゴニスト(Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-115(2002)を参照)；Ｔ細胞ヘルパーシグナルに干渉する生物学、例えばＣＤ４０-ＣＤ４０リガンドに対する遮断抗体を含む、抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)(例えば、Durieら, Science, 261:1328-1330(1993); Mohanら, J. Immunol., 154:1470-1480(1995))、及びＣＴＬＡ４-Ｆｃ(Finckら, Science, 265:1225-1227(1994))；Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第340,109号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。ここで、いくつかの免疫抑制剤はＤＭＡＲＤ、例えばＭＴＸである。ここで、好ましい免疫抑制剤の例には、ＣＴＸ、クロラムブシル、アザチオプリン、レフルノミド、ＭＭＦ、又はＭＴＸが含まれる。
用語「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの一般的用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン；マクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１ｂ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５等のインターロイキン(ＩＬ)、特にPROLEUKIN(登録商標) rIL-2；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β(リンホトキシン)；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子である。ここで使用される場合、用語サイトカインには、天然源又は組換え細胞培養から得られるタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物、特に合成的に生成された小分子実体、及びその製薬的に許容可能な誘導体又は塩が含まれる。「サイトカインアンタゴニスト」は、例えば、サイトカインに対する抗体、サイトカインレセプターに対する抗体、及びイムノアドヘシンを含む、任意のメカニズムによるサイトカインを阻害又は拮抗する分子である。
「疾患修飾性抗リウマチ剤」又は「ＤＭＡＲＤｓ」の例には、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ＭＴＸ、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ(及び、経口及び皮下用ＭＴＸ)、アザチオプリン、Ｄ-ペニシラミン、金塩(経口用)、金塩(筋内用)、ミノサイクリン、シクロスポリンＡ及び局所用シクロスポリンを含むシクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ(Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197(9):1125-1139(2003))、その塩及び誘導体が含まれる。ここで好ましいＤＭＡＲＤはＭＴＸである。
「非ステロイド性抗炎症剤」又は「ＮＳＡＩＤ」の例には、アスピリン、アセチルサルチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ＣＯＸ-２インヒビター、例えばセレコキシブ(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾール-１-イル)ベンゼンスルホンアミド、バルデコキシブ(BEXTRA(登録商標))、及びメロキシカム(MOBIC(登録商標))、その塩及び誘導体等が含まれる。好ましくは、それらは、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン、又はトルメチンである。
「コルチコステロイド」は、自然に生じるコルチコステロイドの影響を模倣又は増加させたステロイド類の一般的化学構造を有する、任意の合成的又は自然に生じる物質の一つを意味する。合成コルチコステロイドの例には、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロン、例えばSOLU-MEDROL(登録商標)メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムを含む)、デキサメタゾン又はデキサメタゾントリアムシロノン、ヒドロコルチゾン、及びベータメタゾンが含まれる。ここで好ましいコルチコステロイドは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンである。
「薬物」は、ＲＡ又は関節損傷、もしくはＲＡ又は関節損傷の徴候又は症状又は副作用を治療する活性剤である。
用語「製薬用処方物」は、薬物の生物活性が効果的であるように、このような形態にされ、処方物が投与される被験者に、許容できない毒性のある付加的な成分を含有しない滅菌調製物を意味する。
「滅菌」処方物は、無菌であるか、又は全ての生存している微生物及びそれらの芽胞がない。
「パッケージ挿入物」は、指示、使用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合せられる他の治療用製品、及び／又はこのような治療用製品の使用に関する注意についての情報を含む、治療用製品又は薬物の市販パッケージに常套的に含まれる指示を意味するために使用される。
「キット」は、少なくとも一の試薬、例えばＲＡ又は関節損傷を治療する薬物、又は本発明のバイオマーカー遺伝子又はタンパク質を特異的に検出するプローブを含有する任意の製造品(例えば、パッケージ又は容器)である。製造品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして、好ましくは奨励、流通、又は販売されている。
「広告ターゲット」は、特定の薬物が、特に使用法、治療又は指示に対して、市場又は広告により奨励されている又は奨励されることを意図している人々のグループ又は団体、例えば個人の患者、患者群、新聞の読者、医学文献、及び雑誌、テレビ、又はインターネットの視聴者、ラジオ又はインターネットの聴取者、医師、製剤会社等である。
ここで使用される場合、用語「試料」又は「検査用試料」は、一般的に生体試料を意味する。例えば、生体試料は個人から得られる。生体試料の例は、生体液、体組織、細胞、組織、細胞培養物、又は他の生体物質である。生体液は、例えばリンパ、血清、新鮮な全血、末梢血液単核細胞、凍結した全血、血漿(新鮮なもの又は凍結したものを含む)、尿、唾液、精液、滑液、及び髄液である。また、試料には、滑膜組織、皮膚、毛包、及び骨髄も含まれる。哺乳動物から組織バイオプシー及び生体液を得るための方法は、当該技術でよく知られている。「試料」及び「生体試料」は、ここでは交換可能に使用される。
例えばここで使用される場合、「血清試料」は、例えば個人から得られる血清試料である。哺乳動物から血清を得るための方法は、当該技術でよく知られている。
ここで使用される場合、用語「滑膜試料」は、例えば個人から得られた滑膜試料(例えば、液体及び／又は組織)である。哺乳動物から滑膜試料を得るための方法は、当該技術でよく知られている。
ここで使用される場合、用語「バイオマーカー」は、例えば、治療介入に反応可能な患者の正常及び／又は病的状態の指示体を意味する。バイオマーカーの例には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、又は糖脂質-ベースの分子マーカーが含まれ、生体試料中の発現又は存在性は、標準的な方法(又はここに開示の方法)により検出可能であり、例えば、ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性を予測及び／又は予知することができる。本発明により考慮されるこのようなバイオマーカーには、限定されるものではないが、ｓｏｌＬＴαβが含まれる。いくつかの実施態様において、バイオマーカー(例えば、特定の変異及び／又はＳＮＰ)は、検査用試料に存在しており、対照又は参照試料には存在せず、又は検査用試料には、対照又は参照試料とは異なる特定の量又はレベルで存在する。他の実施態様において、このようなバイオマーカーの発現性は、対照試料で観察されるよりも、より高く測定される可能性がある。用語「マーカー」又は「バイオマーカー」は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、用語「予測」及び「予知」は、予測又は予知する方法を意味する趣意において、ＬＴレセプターアンタゴニスト及び／又はＬＴアンタゴニストでの治療に対して、反応していると思われる患者を選択する方法を実施可能にするためにある。
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」は、その遺伝がモニターできる制限酵素認識部位又は遺伝子のような染色体上の同定可能な物理的位置を意味することもできる。マーカーは「遺伝子発現マーカー」と称される遺伝子の発現領域、又は既知のコード化機能のないＤＮＡのあるセグメントでありうる。
ここで使用される場合、「薬力学的バイオマーカー」又は「ＰＤＢ」は、必要とする患者に治療剤を投与する前、投与中、及び／又は投与後に検出可能なバイオマーカーを意味する。薬力学的マーカーは、投与及びレジメンを決定し、患者のサブグループ、又は治療剤に対する応答性である表現型を同定し、又は主要な治療剤を選択及び開発する助けとなる、臨床治験又は非臨床治験アッセイの基本を提供することができる。例えば、リンホトキシンアルファ-ベータ(ＬＴαβ)は、ＬＴアンタゴニスト、例えば抗リンホトキシンアルファ(ＬＴα)抗体に対して反応する、ＲＡ患者のサブ表現型を同定するための薬力学的バイオマーカーとして使用することができる。さらに、ＰＤＢは、薬剤を用いた治療をモニターするのに使用することができる。
動詞「決定する」及び「評価する」は、同様の意味を有し、本出願を通して交換可能に使用される。
リンホトキシンレセプターアンタゴニスト及び／又はＬＴアンタゴニストでの治療に対する患者の「効果的反応」又は患者の「応答性」、及び類似の語法は、ＲＡを患っていることへの危険性、又はアンタゴニストでの治療の結果として患者に付与される、臨床的又は治療的利点を意味する。このような利点には、細胞又は生物学的反応、完全寛解、部分的反応、疾患の安定(進行又は再発がない)、又はアンタゴニストでの治療から又は結果としての患者の再発の遅延化が含まれる。例えば、効果的反応は、ここで少量の少なくとも一のバイオマーカーを用いて診断された患者対少量の一又は複数のバイオマーカーを用いても診断されなかった患者において観察することができる。ここで、バイオマーカー(類)の発生率は、このような効果的反応を、効果的に予測、又は高感度で予測する。
事前に投与された一又は複数の薬物に対する、被験者又は患者の反応に関する場合、語句「〜に対して反応しない」は、このような薬物(類)の投与時、被験者又は患者が、彼らが治療されている疾患の治療に対して、何も又は適切な徴候を示さない、又は薬物(類)に対して臨床的に許容できない高度の毒性を示す、又はこのような薬物(類)の最初の投与後、治療の徴候が維持されないことを記載し、言下に、治療は本文中、ここに定められたように使用される。表現「反応しない」には、被験者が過去に投与された薬物(類)に対して耐性がある及び／又は不応であることが含まれ、被験者又は患者が、付与されている薬物(類)を受容している間も進行しており、もはや反応しない薬物(類)に関与するレジメンが終了した後に、１２ヶ月(例えば６ヶ月以内)以内で進行している状況を含む。よって、一又は複数の薬物に反応しないには、以前又は現在の治療をもって、その後も活動性疾患が続いている被験者が含まれる。例えば、患者は、かれらが反応しない薬物(類)を用いた治療の１〜３ヶ月後も、活動性疾患の活性を有している場合もある。
「負の副作用の危険性を低減」とは、以前投与された薬物を用いて、同じ患者又は別の患者の治療に起因して観察される危険性よりも、ここでのアンタゴニストでの治療に起因する副作用の危険性が、低い程度まで低減していることを意味する。このような副作用には、毒性に関して上述にて説明されたもの、好ましくは感染症、癌、心不全、又は脱髄が含まれる。
「相関」又は「相関する」とは、任意の方法で、第１の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と、第２の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果とを比較することを意味する。例えば、第１の分析又はプロトコルの結果を、第２のプロトコルの実施に使用してもよいし、及び／又は第２の分析又はプロトコルを実施すべきかどうかを決定するために、第１の分析又はプロトコルの結果を使用してもよい。ここでの種々の実施態様に関して、リンホトキシンレセプターアンタゴニスト及び／又はＬＴアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体を使用する特定の治療レジメンを実施すべきかどうかを決定するために、分析アッセイの結果を使用してもよい。
ＲＡ患者又は関節損傷を患っている患者に対する、臨床的利点の増加に関連したバイオマーカーの「量」又は「レベル」は、生体試料において検出可能なレベルである。これらは、専門家には公知の方法で測定することができ、この発明において開示されている。評価されるバイオマーカーの発現レベル又は量は、治療に対する応答性を測定するために使用可能である。
一般的に、用語「発現のレベル」又は「発現レベル」は交換可能に使用され、生体試料中のポリヌクレオチド又はアミノ酸生成物又はタンパク質の量を意味する。「発現」は、遺伝子コード情報が、細胞に存在し操作される構造に変換されるプロセスを意味する。よって、本発明において、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を意味する。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片は、別にスプライシング又は分解された転写物により、又はタンパク質の翻訳後プロセシング、例えばタンパク質分解から生成された転写物由来であろうがなかろうが、発現したとして考えられる。「発現した遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、ついてタンパク質に翻訳されたもの、及びＲＮＡに転写はされたが、タンパク質には翻訳されなかったもの(例えば、リボソームＲＮＡに移行)が含まれる。
ここでの方法及びシステムに使用される場合、「アルゴリズム」は、手順を実施するための、典型的には、連続状態の明確に定義されたシリーズを介してプロセシングし、最終的には最終状態、簡単なケースでは、サイトカイン(類)の量に対して「はい」又は「いいえ」の２つの回答で終結させるための、明確に定義された説明書の的確なリスト、又は特定の組の説明書である。
ここで使用される場合、用語「共変数」は、患者に関するある種の可変性又は情報を意味する。臨床的エンドポイントは回帰モデルにおいて頻繁に考慮されるものであり、ここで、エンドポイントは依存する可変性を表し、バイオマーカーは主たる又は標的となる独立の可変性(リグレッサー)を表す。臨床的データプールからの付加的な可変性が考慮される場合、それらは(臨床的)共変数として示される。
用語「臨床的共変数」は、ベースラインで一般的に利用される、患者についての全ての臨床的情報を記載するために、ここでは使用される。これらの臨床的共変数は、性別、年齢等の人口統計学的情報、他の既往の情報、合併症、併用治療、身体検診の結果、得られた一般的に実験用パラメータ、ＲＡ又は関節損傷の公知の特性、ＲＡ疾患の程度を定量化した情報、ＥＣＯＧ又はＫａｒｎｏｆｓｋｙ指標等の臨床的能力スコア、臨床疾患の段階分け、前処理のタイミング及び結果、病歴、並びに治療の臨床反応に関連した類似の情報を含む。
ここで使用される場合、用語「生分析」又は「未調整分析」は、考慮されるバイオマーカーの他に、何の付加的な臨床的共変数も、独立因子又は階層化共変数として回帰モデルで使用されない、回帰分析を意味する。
ここで使用される場合、用語「共変数により未調整」は、考慮されるバイオマーカーの他に、付加的な臨床的共変数が、独立因子又は階層化共変数として回帰モデルで使用される、回帰分析を意味する。
ここで使用される場合、用語「単変数」は、独立因子として、標的バイオマーカーのみがモデルの一部である、回帰モデル又は図表を意味する。これらの単変数モデルは、付加的な臨床的共変数と共に、又はともなわずに考慮可能である。
ここで使用される場合、用語「多変数」は、独立変数として、一以上の標的バイオマーカーがモデルの一部である、回帰モデル又は図表を意味する。これらの多変数モデルは、付加的な臨床的共変数と共に、又はともなわずに考慮可能である。
単数又は複数で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを称し、これは未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい。よって、例えば、ここで定義されるポリヌクレオチドには、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であってもよく、又はより典型的には二本鎖であっても又は一本鎖又は二本鎖領域を含んでもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含む混成分子が含まれる。またここで使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域のストランドは同じ分子由来でも又は異なった分子由来でもよい。その領域は一又は複数の分子の全てを含みうるが、より典型的には幾らかの分子の領域のみを含む。三本ヘリックス領域の分子の一つがしばしばオリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は特にｃＤＮＡｓを含む。その用語には、一又は複数の修飾塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡが含まれる。よって、安定性又は他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語がここで意図するところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような希な塩基又はトリチウム化塩基のような修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡはここで定義される「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は未修飾のポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的及び／又は代謝的に修飾された形態、並びに単純細胞及び複雑細胞を含む細胞及びウイルスに特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」は、限定するものではないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド及び二本鎖ＤＮＡを含む比較的短いポリヌクレオチドを意味する。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、例えば市販されている自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学的方法によってしばしば合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法を含む様々な他の方法によって、及び細胞及び生物中でのＤＮＡの発現によって、作製することができる。
語句「遺伝子増幅」は、遺伝子又は遺伝子断片の複数コピーが特定の細胞又は細胞株中で形成されるプロセスを意味する。複製領域（増幅ＤＮＡの伸展）はしばしば「増幅産物」と称される。通常、生産されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、つまり遺伝子発現のレベルは、発現した特定の遺伝子から作製されたコピー数の割合でまた増加する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に相補鎖がその融点より低い環境で存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望のホモロジーの度合いが高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここに定義される場合、「ストリンジェントな条件」又は「高いストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃で７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーによる５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる；又は（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０％ホルムアミド中での４２℃での洗浄とその後の５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を伴う、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いる。
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして同定され、上述のものよりストリンジェンシーが低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一例は、３７℃で、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液での終夜にわたるインキュベーションと、それに続く３７-５０℃で１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかが分かるであろう。
用語「スプライシング」及び「ＲＮＡスプライシング」は交換可能に使用され、イントロンを除去し、エキソンを結合させて、真核生物細胞の細胞質中に移動する連続したコード化配列を有する成熟ｍＲＮＡを生産するＲＮＡプロセシングを意味する。
理論的には、用語「エキソン」は、成熟ＲＮＡ産物に提示される介在遺伝子の任意のセグメントを意味する(B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990)。理論的には、用語「イントロン」は、転写されているがその何れかの側のエキソンを共にスプライシングすることによって転写物内から除去されるＤＮＡの任意のセグメントを意味する。作用的には、エキソン配列は参照配列番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列で生じる。作用的には、イントロン配列は、エキソン配列によって一括されその５'及び３'境界にＧＴ及びＡＧスプライスコンセンサス配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
ここで使用される場合、用語「標識」は、試薬、例えば核酸プローブ又は抗体に直接又は間接的にコンジュゲート又は融合し、それがコンジュゲート又は融合した試薬の検出が容易な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能なもの(例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識)、又は酵素標識のケースでは、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。本用語は、プローブ又は抗体へ検出可能な物質をカップリング(すなわち、物理的に結合)させることによる、プローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識された他の試薬との反応による、プローブ又は抗体の関節標識を含むことを意図している。関節標識の例には、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出可能なように、蛍光標識された二次抗体を使用し、ビオチンでＤＮＡプローブの末端を標識する、一次抗体の検出を含む。
用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持ち、その断片が同一のポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む小さな抗体断片を意味する。非常に短いために同一鎖上で二つのドメイン間での対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば欧州特許出願公開第404,097号；国際公開第93/11161号；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)にさらに十分に記載されている。
「ネイキッド抗体」は、小分子又は放射標識等の異種分子にコンジュゲートされていない抗体である。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して９５重量％抗体を越えるまで、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。塩基性の４-鎖抗体単位は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である(ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と称される付加的なポリペプチドと共に、５つの塩基性ヘテロ四量体からなり、よって１０の抗原結合部位を有し、分泌ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２-５の塩基性４-鎖単位を含む多価集合体を形成可能である)。ＩｇＧのケースにおいて、４-鎖単位は一般的に約１５００００ダルトンである。各Ｌ鎖は一つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結しており、一方２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて、一又は複数のジスルフィド結合により互いに連結している。また各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各Ｈ鎖は、Ｎ-末端に可変ドメイン(ＶＨ)、これに続いてα及びγ鎖それぞれに対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)、及びμ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ-末端に可変ドメイン(ＶＬ)、これに続いて他端に定常ドメイン(ＣＬ)を有する。ＶＬはＶＨに整列しており、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)に整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬは対になって、互いに単一の抗原-結合部位を形成している。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71頁, 6章が参照される。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと称される、明確に区別される２つのタイプの一方を割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に基づき、免疫グロブリンは、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと指定される重鎖を有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つのクラスがある。γ及びαクラスは、さらにＣＨ配列及び機能の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えばヒトでは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２と表される。
「親和成熟」抗体とは、その変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じせしめる抗体の一又は複数の高頻度可変領域における一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルさえの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順を使用して生産される。Marksら Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbasら, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994)；Schier ら, Gene, 169:147-155(1995)；Yeltonら, J. Immunol., 155:1994-2004(1995)；Jacksonら, J.Immunol., 154(7):3310-9(1995)；及びHawkinsら, J. Mol. Biol., 226:889-896(1992)に記載されている。
ここでの「アミノ酸配列変異体」抗体は、主な種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主な種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは主な種抗体と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主な種抗体のアミノ酸配列内又は隣接して、所定の位置で置換、欠失及び／又は付加を有する。ここでのアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体(例えば脱アミド化された抗体変異体)、塩基性変異体、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展(例えばＶＨＳ-)を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せが含まれる。ここで特に関心のある抗体変異体は、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展を含み、場合によっては主な種抗体に対して他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の相違をさらに含んでなる抗体である。
ここでの「グリコシル化変異体」抗体は、主な種抗体に結合した一又は複数の炭水化物部分と異なる一又は複数のそれに結合した炭水化物部分を有する抗体である。ここでのグリコシル化変異体の例には、そのＦｃ領域に接着した、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１又はＧ２オリゴ糖構造を有する抗体、その一又は二の軽鎖に結合した一又は二の炭水化物部分を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖に結合した炭水化物がない抗体等、及びグリコシル化変異の組合せを有する抗体が含まれる。
抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造は、例えば残基２９９（残基のＥｕ番号付けでは２９８）で、抗体の一又は二の重鎖に結合していてもよい。パーツズマブでは、Ｇ０が主要なオリゴ糖構造で、例えばＧ０-Ｆ、Ｇ-１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１-１、Ｇ１（１-６）、Ｇ１（１-３）及びＧ２のような他のオリゴ糖構造はパーツズマブ組成物中により少量で見出される。
特に明記しない限り、ここでの「Ｇ１オリゴ糖構造」にはＧ-１、Ｇ１-１、Ｇ１（１-６）及びＧ１（１-３）構造が含まれる。
ここでの「アミノ末端リーダー伸展」は、抗体の何れか一又は複数の重鎖又は軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一又は複数のアミノ酸残基を意味する。例示的なアミノ末端リーダー伸展は、抗体変異体の一方又は両方の軽鎖に存在する３つのアミノ酸残基、ＶＨＳを含むか又はこれらからなる。
「脱アミド化」抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド又はイソ-アスパラギン酸に誘導体化されているものである。
一又は複数のさらなる治療剤との「併用」投与は、同時(一致)及び任意の順序での連続投与が含まれる。
ここで用いられる場合、「担体」とは、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン7、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS7を含む。
「固相」又は「固体状支持体」とは、本発明のポリペプチド、核酸、抗体、又はＩｈｈ、ＤｅｆＡ５及び／又はＤｅｆＡ６が付着又は結合することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」又は「小有機分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
語句「有効量」は、ＲＡ又は関節損傷の治療に有効な薬物の量を意味する。これには、例えばＸ線又は他の検査により決定された量を投与する前のベースラインと比較して、ＲＡ又は関節損傷に低減をもたらすのに効果的な量が含まれる。有効量の第二の医薬は、ここでのアンタゴニストと併用して、ＲＡ又は関節損傷を治療するばかりでなく、併用剤又は規定にある疾患又は疾病を含む、ＲＡ又は関節損傷に付随する副作用又は症状又は他の状態を含む、所望しない影響を治療するために提供される。「有効量」は、この目的に関連した常套的な方法で、経験的に決定してもよい。
用語「発現のレベル」又は「発現レベル」は交換可能に使用され、一般的に、生体試料中のポリヌクレオチド又はアミノ酸生成物又はタンパク質の量を意味する。「発現」は、遺伝子コード情報が、細胞に存在し操作される構造に変換されるプロセスを意味する。よって、本発明において、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を意味する。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片は、別にスプライシング又は分解された転写物により、又はタンパク質の翻訳後プロセシング、例えばタンパク質分解から生成された転写物由来であろうがなかろうが、発現したとして考えられる。「発現した遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、ついてタンパク質に翻訳されたもの、及びＲＮＡに転写はされたが、タンパク質には翻訳されなかったもの(例えば、リボソームＲＮＡに移行)が含まれる。
ここで使用される場合、用語「過剰発現」は、その組織についての正常な発現レベルよりも高い、組織の細胞遺伝子発現を意味する。ここで使用される場合、用語「過小発現」は、その組織についての正常な発現レベルよりも低い、組織の細胞遺伝子発現を意味する。いずれかのケースにおいて、高い又は低い発現は、研究のコントロール条件下、正常な発現からはかなり異なる。
「コントロール」は、患者である哺乳動物における、遺伝子のベースライン又は正常な発現、タンパク質の活性を測定するために使用される，個人から得られる試料を含む。従って、対照試料は、関節リウマチを患っていない(標準的な技術により測定)個人からを含む、多くの手段で得ることができ；例えば、ＲＡに罹患したことのない被験者の対照試料；ＲＡを患っていない被験者の対照試料；又はＲＡの危険性が疑われていない被験者からの対照試料。また、コントロールは予め確立されている標準体も含む。従って、本発明で実施される任意の検定又はアッセイは確立された標準体と比較されて、比較する度に、対照試料を得る必要がない場合もある。
ＩＩＩ．発明の一般的記載
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学の従来からの技術を使用する。かかる技術は、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 2版 (Sambrookら, 1989)」；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」, 4版(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. Miller及びM.P. Calos編, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編, 1987)；及び「PCR:The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら編, 1994)のような文献に十分に説明されている。
本発明は、可溶性リンホトキシン(ｓｏｌＬＴ)、及び自己免疫疾患の治療にバイオマーカーとしてｓｏｌＬＴを使用する方法に関する。特に、本発明は、可溶性リンホトキシンアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)、及び関節リウマチ(ＲＡ)の治療にバイオマーカーとして、このｓｏｌＬＴαβを使用する方法に関する。
本発明の組成物及び方法は、ＲＡ等の自己免疫疾患について、患者の治療方法の決定を補助するための、簡便で、効果的であり、潜在的に費用効率の高い手段を提供する。例えば、本発明は、患者の治療に適切又は効果的な治療法を評価又は同定するために、ＲＡを患っている患者に、所定量のｓｏｌＬＴαβを使用する方法を提供する。
Ａ．可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の組成物及び方法
本発明は、可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)組成物、及び自己免疫疾患、例えば関節リウマチ(ＲＡ)の治療に関する情報を得るための使用方法を提供する。例えば、本発明は、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する、自己免疫疾患を患っている患者の応答性を評価する方法を提供し、該方法は、患者における、可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)のレベルを評価又は測定することを含み、ここで、未治療の患者における量と比較して、治療された患者におけるｓｏｌＬＴαβの量の増加度合いが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となる。
ｓｏｌＬＴαβの量又はレベルは、タンパク質又は核酸を検出するためのアッセイを含む、多様な標準的アッセイフォーマットを使用して測定することができる。いくつかの実施態様において、アッセイフォーマットは、ｓｏｌＬＴαβタンパク質又はのＲＮＡの量、及びその活性を検出する。
一実施態様において、本発明は、ＲＡを患っている患者が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対して応答性であるかどうかを評価する方法を提供し、該方法は、患者におけるｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含み、ｓｏｌＬＴαβの量が、患者がＬＴアンタゴニストでの治療に対して応答性であるかどうかの予測となる。一実施態様において、血清及び／又は滑液は患者から得られ、患者に存在するバイオマーカーの量を評価するためのアッセイにかけられる。いくつかの実施態様において、閾値又はベースライン量は、対照試料に基づき決定することができる。一態様において、対照試料は、治療前の、骨関節炎患者の罹患関節又はＲＡ患者の罹患関節からの滑液試料である。他の態様において、対照試料は、正常なドナーの血清試料、又はＲＡ患者の治療前試料である。
他の実施態様において、本発明は、ＲＡ患者亜集団に使用されるＬＴアンタゴニストを特定する方法を提供し、該方法は、ＲＡと相関している又はＲＡの指標となるｓｏｌＬＴαβの量で、ＬＴアンタゴニストを患者亜集団に投与するための説明書が提供される。
さらなる態様において、本発明は、患者からの試料中の、ｓｏｌＬＴαβの量を検出するための試薬；バイオマーカーの検出を実施するハードウェア；及び患者が治療に敏感である又は反応してるかを決定するためのアルゴリズムを実施するコンピューター的手段を含む、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する、ＲＡを患っている患者の応答性を分析するためのシステムを提供する。
ｓｏｌＬＴαβを検出する試薬は、例えばｓｏｌＬＴαβに結合する抗体、ポリヌクレオチド、及び他の分子であってよい。ハードウェアは、好ましくは検出工程を実施するための機器又はコンピュータであり、コンピュータ的手段は、例えばコンピュータ又は機器であってよい。
本発明は、患者又は患者集団におけるｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含む、ＲＡを患っている患者又は患者集団の治療法を選択する方法を提供し、ここで、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者が治療に対して反応しているであろうことを示す。一実施態様において、患者の血清又は滑液又は組織におけるｓｏｌＬＴαβの量が評価される。一実施態様において、本方法は、患者にＬＴアンタゴニストを投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、アンタゴニストは抗ＬＴα抗体である。
他の実施態様において、本発明は、患者におけるｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含む、ＬＴアンタゴニストで治療するために、ＲＡを患っている患者を選択する方法を提供し、ここで、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者がＬＴアンタゴニストでの治療に対して反応しているであろうことを示す。一実施態様において、患者の血清又は滑液又は組織におけるｓｏｌＬＴαβの量が評価される。一実施態様において、本方法は、患者にＬＴアンタゴニストを投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、アンタゴニストは抗ＬＴα抗体である。
他の実施態様において、本発明は、患者におけるｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含む、ＬＴアンタゴニストで治療するために、ＲＡを患っている患者を同定する方法を提供し、ここで、ｓｏｌＬＴαβの量は、患者がＬＴアンタゴニストでの治療に対して反応しているであろうことを示す。一実施態様において、患者の血清又は滑液又は組織におけるｓｏｌＬＴαβの量が評価される。一実施態様において、本方法は、患者にＬＴアンタゴニストを投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、アンタゴニストは抗ＬＴα抗体である。
他の実施態様において、本発明は、患者におけるｓｏｌＬＴαβの量を評価することを含む、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する、ＲＡ患者の応答性をモニターする方法を提供し、ここで、ｓｏｌＬＴαβの量は、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する、患者の応答性の指標となる。一実施態様において、患者の血清又は滑液又は組織におけるｓｏｌＬＴαβの量が評価される。一実施態様において、アンタゴニストは抗ＬＴα抗体である。
医術における技術の一つ、特に治療学を用いた診断検査及び治療の適用に関し、生物システムは、幾分変化しやすく、常に完全に予測可能ではなく、よって多くの良好な診断検査又は治療学が、時折効果的でないことは認識されているであろう。しかして、検査結果、患者の状態及び病歴、及び自身の経験に基づき、個々の患者に対して、最も適切な治療コースを決定することは、最終的には主治医の判断になる。診断検査又は他の基準からのデータに基づき、医者がＬＴアンタゴニストを用いて患者を治療することを選択する場合、患者がＬＴアンタゴニストに対して、特に敏感であると予測されない場合でさえ、特に他の明らかな治療見解の全て又はほとんどが失敗したならば、又は別の治療を付与した場合に、ある程度の相乗性が予期されるならば、好機となる可能性がある。
本発明は、(ａ)ＬＴアンタゴニストの感度の範囲を示す細胞のパネルにおいて、候補バイオマーカーの発現レベルを測定し、(ｂ)ＬＴアンタゴニストへの効果的な応答性に対する、ＲＡを患っている患者の感度と、細胞における候補バイオマーカーの発現レベル又は存在性との間の相関関係を同定することを含む、その発現レベルが、ＬＴアンタゴニストに対する、ＲＡを患っている特定の患者の効果的な応答性を予測するバイオマーカーを同定する方法をさらに提供するもので、ここで相関関係は、バイオマーカーの発現レベル又は存在性が、ＬＴアンタゴニストによる治療に対する、患者の応答性の予測となることを示す。この方法の一実施態様において、細胞のパネルは、患者又は実験用動物モデルから得られた試料から調製されたＲＡ試料のパネルである。さらなる実施態様において、細胞のパネルは、マウス異種移植における株化細胞のパネルであり、ここで応答性は、例えば、応答性の分子マーカーをモニターすることにより測定することができる。
また、本発明は、(ａ)ＲＡを患っている患者からの試料中の、候補バイオマーカーのレベルを測定し、(ｂ)ＬＴアンタゴニストを用いたＲＡの治療の有効性と、患者からの試料中の候補バイオマーカーの発現レベル又は存在性との相関関係を同定することを含む、ＬＴアンタゴニストを用いて、ＲＡをより効果的に治療するための診断体であるバイオマーカーを同定する方法を提供するもので、ここで相関関係は、該バイオマーカーが、ＬＴアンタゴニストを用いて、ＲＡをより効果的に治療するための診断体であることを示す。
他の態様において、本発明は、(ａ)ＲＡを患っている患者からの試料中の、候補バイオマーカーのレベルを測定し、(ｂ)ＬＴアンタゴニストを用いて治療した場合の、患者の長期にわたる症状がない状態と、患者からの試料中の候補バイオマーカーの発現レベル、血清陽性又は存在性との相関関係を同定することを含む、ＬＴアンタゴニストを用いて治療した場合の、ＲＡを患っている患者の長期にわたる症状がない状態用の診断体であるバイオマーカーを同定する方法を提供するもので、ここで患者の長期にわたる症状がない状態とバイオマーカーとの相関関係は、該バイオマーカーが、ＬＴアンタゴニストを用いて治療した場合の、ＲＡを患っている患者の長期にわたる症状がない状態用の診断体であることを示す。
前述した方法における治療の効果は、例えばACR及び／又はEuropean League Against Rheumatism(EULAR)の、ＲＡを患っている患者における臨床反応パラメータを使用することにより、又は患者におけるＲＡの程度の分子定量をアッセイすることにより、測定することができる。
ここに記載した全ての方法において、試料は、ＲＡに罹患している疑いがある、又はＲＡに罹患していると診断された患者、よって治療の必要があると思われるものから取り出される。マーカー発現の評価のために、患者試料、例えば細胞、又はこれらの細胞により生成されるタンパク質又は核酸を含有するものが、本発明の方法に使用することができる。この発明の方法において、バイオマーカーのレベルは、試料中におけるマーカーの量(例えば、絶対量又は濃度)を評価することにより、好ましくは検出可能レベルのバイオマーカーを含有する生体液又は排出物を評価することにより測定することができる。いくつかの実施態様において、滑液、滑膜組織、及び／又は血清は、ｓｏｌＬＴαβの量の評価に使用される。ここで使用される場合、「血液」は、全血、血漿、血清、又は任意の血液からの誘導体が含まれる。尿、唾液、便、胸水、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液(ＣＳＦ)、又は任意の他の体分泌物又はその誘導体を含む、他の生体液又は分泌物が、本発明における試料として有用である。このような生体液又は排出物におけるバイオマーカーの評価は、侵襲性サンプリング方法が、時折、不適切又は不都合な環境にあることが好ましい可能性もある。しかしながら、ここで検査される試料は、好ましくは滑膜組織、滑液、血液／血清、又はそれらの任意の組合せである。
試料は、凍結、新鮮、固定化(例えば、ホルマリン固定)、遠心分離された、及び／又は包埋された(例えば、パラフィン包埋)ものなどであってよい。もちろん、細胞試料は、試料中のマーカーの量を評価する前に、多様なよく知られている収集後調製及び保管技術(例えば、核酸及び／又はタンパク質抽出、固定化、保管、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等)にかけることができる。同様に、バイオプシーも、収集後調製及び保管技術、例えば固定化にかけることができる。
一実施態様において、ここに記載された一又は複数のバイオマーカーが、各バイオマーカーについて、所定閾値レベルよりも高くないレベルで患者からの試料に存在していることが見出された場合、試料が得られた患者は、ここに開示のＬＴアンタゴニストを用いた治療についての候補者であると結論付けられる。バイオマーカータンパク質のレベルは、当業者によく知られている方法を使用して測定することができる。
タンパク質バイオマーカー、例えばＬＴαβ及び／又はＬＴαＡｓを検出するための物理的及び定量テストに関し、種々のタンパク質アッセイを利用することができる。例えば、試料は、抗体−バイオマーカー複合体が形成されるのに十分な条件下で、バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、ついで該複合体を検出することができる。タンパク質バイオマーカーの存在性は、血漿及び血清を含む、多様な組織及び試料をアッセイするための多くの方法、例えばウエスタンブロット(免疫沈降を伴う又は伴わない)、２次元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、免疫沈降、蛍光標示式細胞分収(ＦＡＣＳ)、フローサイトメトリー、及びＥＬＩＳＡ手順により達成可能である。このようなアッセイフォーマットに使用される広範囲の免疫アッセイ技術が利用可能であり、例えば、米国特許第4,016,043号、同4,424,279号、及び同4,018,653号が参照される。これらには、非競合型のシングルサイト又はツーサイト「サンドイッチアッセイ」、並びに伝統的な競合結合アッセイの双方が含まれる。またこれらのアッセイは、標的バイオマーカーに対する、標識された抗体の直接結合も含まれる。
サンドイッチアッセイは、最も有用で一般的に使用されているアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くの変形が存在し、全てが本発明に含まれることを意図している。簡単には、典型的なフォワードアッセイ(forward assay)において、標識されていない抗体は固体状基質に固定され、検査される試料は結合分子と接触させられる。適切なインキュベート時間の後、抗体-抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間、検出可能なシグナルを生成可能なレポーター分子で標識された、抗原に特異的な第２の抗体を添加し、抗体-抗原-標識された抗体の他の複合体を形成させるのに十分な時間インキュベートする。任意の未反応の物質を洗い流し、抗原の存在を、レポーター分子により生成されるシグナルを観察することにより測定する。結果は、単に、可視シグナルを観察することによる定性、又は既知量のバイオマーカーを含有する対照試料と比較することによる定量のいずれかであってよい。
フォワードアッセイにおける変形には、試料と標識された抗体の双方を、結合した抗体に同時に添加する、同時アッセイが含まれる。容易に明らかになるであろう任意の少しの変形を含む、これらの技術は当業者によく知られている。典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいて、バイオマーカーに対する特異性を有する第１の抗体は、固体表面に共有的又は受動的に結合している。固体表面は、典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されているポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体状支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又は免疫アッセイの実施に適した任意の他の表面の形態をしていてよい。結合方法は当該分野でよく知られており、一般的に架橋、共有結合、又は物理的吸着からなり、ポリマー-抗体複合体は、検査用試料の調製において洗浄される。ついで、検査される試料のアリコートが、固相複合体に添加され、十分な時間(例えば、２-４０分、都合がよければ一晩)、適切な条件下(例えば室温〜４０度、特に２５℃〜３２℃を含む)でインキュベートされ、抗体に存在する任意のサブユニットとの結合が可能になる。インキュベート時間後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、バイオマーカーの一部に対して特異的な第２の抗体と共にインキュベートする。分子マーカーへの第２の抗体の結合を表示するのに使用されるレポーター分子に、第２の抗体を結合させる。
代替法は、試料中の標的バイオマーカーの固定化、ついでレポーター分子で標識された又はされていない特定の抗体への、固定化された標的の暴露を含む。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体を用いた直接標識により検出することができる。また、第１の抗体に特異的な標識された第２の抗体は、標的-第１の抗体複合体に暴露され、標的-第１の抗体-第２の抗体の三重複合体が形成される。複合体はレポーター分子により発光するシグナルで検出される。本明細書で使用される場合、「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原-結合抗体の検出を可能にする、分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイで最も一般的に使用されているレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、放射性核種含有分子(すなわち放射性同位元素)、又は化学発光分子のいずれかである。
酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)のケースにおいて、酵素は、一般的にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩により、第２の抗体にコンジュゲートしている。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に容易に利用される、かなり多様な様々なコンジュゲート技術が存在する。一般的に使用されている酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼ等が含まれる。特定の酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色調変化を生じるように選択される。適切な酵素の例には、アリカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。また、上述したような発色性基質よりも、蛍光生成物を生じる、蛍光発生基質を使用することもできる。全てのケースにおいて、酵素標識された抗体は、結合が可能な、第１の抗体-分子マーカー複合体に添加され、ついで、過度の試薬が洗い流される。次に、適切な基質を含有する溶液が抗体-抗原-抗体の複合体に添加される。基質を第２の抗体に結合した酵素と反応させ、定性的可視シグナルが付与され、通常、分光光学的に定量され、試料中に存在するバイオマーカーの量が表示される。また、蛍光化合物、例えばフルオレセイン及びローダミンは、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的にカップリング可能である。特定の波長の光を有する照明により活性化した場合、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸着し、分子内に励起状態を誘発し、光学顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色調の光を発光する。ＥＩＡの場合、蛍光標識された抗体は、第１の抗体−分子マーカー複合体に結合可能である。未結合の試薬を洗い流した後、残存している三重複合体を適切な光の波長に暴露させ、観察された蛍光が、関心ある分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は、双方とも、当該分野で十分に確立されている。しかしながら、他のレポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光、又は生物発光分子を使用してもよい。
第二世代ＥＬＩＳＡ(IMMUNOSCAN RAＴＭ)、並びに凝集アッセイ(Latex及びWaaler-Rose)、及び特定のＥＬＩＳＡ(ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ)を含む、酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)及び血清学的アッセイを使用することもできる。IMMUNOSCAN RAＴＭ(Eurodiagnostica, The Netherlands)、Inova Diagnostics、及びAxis-Shield Diagnosticsを含む商業的に入手可能なＥＬＩＳＡを使用することができる。検出は、合成シトルリン化ペプチド変異体を使用することができる。
Abreuら, 「Multiplexed immunoassay for detection of rheumatoid factors by FIDIS technology」, Annals of the New York Academy of Sciences, 1050(Autoimmunity):357-363 (2005)は、FIDIS RHEUMAＴＭを対比させており、凝集及びＥＬＩＳＡと共に、ヒト及び動物からのＩｇＧのＦｃ決定基に指向するＩｇＭクラスＲＦの同時検出用に設計された多重免疫アッセイは、ＲＡに対する、生物学的マーカーの特異性及び臨床的敏感性を評価する。ＦＩＤＩＳ技術はLUMINEXＴＭシステムを使用しており、明確に色分けされたマイクロスフェアセット、フローサイトメトリー、及びデジタル信号処理ハードウェア及びソフトウェアからなる。凝集及びＥＬＩＳＡ検査は、市販のキットで実施することができる。ヒト特異性について、ＦＩＤＩＳはラテックス凝集又はＥＬＩＳＡと比較された。動物特異性について、ＦＩＤＩＳは、Waaler-RoseＴＭ技術及びＥＬＩＳＡと比較された。免疫蛍光法を使用する、ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗ＣＣＰの検出も測定された。Dubois-Galopinら, 「Evaluation of a new fluorometric immunoassay for the detection of anti-cyclic citrullinated peptide autoantibodies in rheumatoid arthritis」,Annales de Biologie Clinique, 64(2):162-165 (2006)は、UniCAP 100εにおいて完全に自動化された、EliA CCPＴＭと称される新規の蛍光-酵素免疫アッセイによる抗ＣＣＰ抗体の測定を評価するものでる。これはＥＬＩＳＡ法(Euroimmun)を用いて十分に比較される。
タンパク質バイオマーカー(類)(例えば多型)に加えて、評価されることが所望されている遺伝子バイオマーカーを検出するための方法は、例えば試料中のＳＮＰの存在性及び／又は発現を調査するプロトコルを含む。哺乳動物からの組織又は細胞試料は、ＤＮＡマイクロアレイスナップショットを含む、商業的に入手可能な、ＤＮＡ ＳＮＰクリップマイクロアレイ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、アレイハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析、ノーザン、ドット-ブロットを使用し、遺伝子マーカーｍＲＮＡ又はＤＮＡについて簡便にアッセイすることができる。例えばリアルタイムＰＣＴ(ＲＴ-ＰＣＲ)アッセイ、例えば定量ＰＣＴアッセイが、当該技術でよく知られている。本発明の例示的な実施態様において、生体試料中のＳＮＰ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも一のプライマーを使用する逆転写により、試料からｃＤＮＡを生成させ；センス及びアンチセンスプライマーとしてＳＮＰポリヌクレオチドを使用して生成するようにｃＤＮＡを増幅させ、そこでＳＮＰ ｃＤＮＡを増幅させ；増幅したＳＮＰ ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。さらに、このような方法は、生体試料中のＳＮＰ ｍＤＮＡのレベルの測定を可能にする(例えば、アクチンファミリーメンバー等、「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調査することによる)、一又は複数の工程を含むことができる。場合によっては、増幅されたＳＮＰ ｃＤＮＡの配列を測定することもできる。
特定の一実施態様において、多型の遺伝子型決定は、TAQMANＴＭ ５'-対立遺伝子判別アッセイ、制限断片長多型ＰＣＲ-ベースアッセイ、又はPYROSEQUENCERＴＭ機器を使用する、ＲＴ-ＰＣＲ技術により実施することができる。さらに、米国特許第7,175,985号に説明されているような、遺伝的変異又は多型を検出するための方法が使用されてもよい。この方法において、核酸はハイブリッド形成された３'-末端を利用して合成され、ここで、相補鎖合成の次の段階についての起点として、同じ鎖のヌクレオチド配列として存在する標的ヌクレオチド配列の特定の領域における、相補鎖合成により合成される。
ＰＣＲに使用されるプローブは、検出可能マーカー、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、又は酵素で標識されてもよい。このようなプローブ及びプライマーは、試料中のＳＮＰの存在を検出するため、及びＳＮＰコード化タンパク質を発現する細胞を検出する手段として使用することができる。当業者により理解されるように、非常に多くの異なるプライマー及びプローブが、公知の配列に基づいて調製され、増幅、クローン、及び／又はＳＮＰ ｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを測定するのに効果的に使用される。
他の方法は、マイクロアレイ技術により、組織又は細胞試料中のｍＲＮＡを調査又は検出するプロトコルを含む。核酸マイクロアレイを使用すると、検査及び検査からの対照ｍＲＮＡ試料及び対照組織試料が逆転写され、標識され、ｃＤＮＡプローブが生じる。ついで、プローブは、固体状支持体に固定された核酸のアレイとハイブリッド形成する。アレイの各メンバーの配列と位置が公知となるように、アレイを設定する。例えば、ある病状を発症している可能性のある遺伝子の選択は、固体状支持体に配列されてもよい。特定のアレイメンバーで標識されたプローブのハイブリッド形成により、プローブが誘導された試料で、その遺伝子が発現していることを示す。病変組織の種々の遺伝子発現分析により、有益な情報が提供される。マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリッド形成技術及びコンピュータ技術を利用し、一回の実験で数千の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロフィールが評価される(例えば、国際公開第2001/75166号を参照)。アレイ製作の論議用に、例えば、米国特許第5,700,637号、同5,445,934号、及び同5,807,522号； Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); 及びCheungら, Nature Genetics, 21(Suppl):15-19 (1999)が参照される。
さらに、欧州特許第1,753,878号に記載されているマイクロアレイを利用するＤＮＡプロファイリング及びＳＮＰ検出方法が使用されてもよい。この方法は、短いテンデム反復(ＳＴＲ)分析とＤＮＡマイクロアレイを利用する、種々のＤＮＡ配列間を素早く同定及び識別する。一実施態様において、標識されたＳＴＲ標的配列は、相補プローブを担持するＤＮＡマイクロアレイとハイブリッド形成する。これらのプローブは長さが変わり、可能なＳＴＲの範囲をカバーする。ＤＮＡハイブリッドの標識された単鎖領域は、ポストハイブリッド形成酵素的消化を利用し、マイクロアレイ表面から選択的に除去される。未知の標的における繰り返しの数は、マイクロアレイとハイブリッド形成したままの、標的ＤＮＡのパターンに基づき推定される。
マイクロアレイプロセッサの一例は、Affymetrix GENECHIP(登録商標)システムであり、これは商業的に入手可能で、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製作されるアレイを含む。当業者に公知の他のシステムが使用されてもよい。
ＲＴ-ＰＣＲ又は他のＰＣＲをベースにした方法の他に、バイオマーカーのレベルを測定するための他の方法には、プロテオミクス技術、並びに分子レベルでの患者の反応に基づく、ＲＡの治療に必要な個々の遺伝的プロフィールが含まれる。ここでの特定のマイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイは、一又は複数の抗ＣＤ２０抗体に対する敏感性又は耐性と相互に関連している発現プロフィールを有する、一又は複数のバイオマーカーを含んでいてよい。さらに、ＳＮＰは、例えば国際公開第2000/058522号に開示されているように、シリコンマイクロチップ上の電子回路を使用して検出することができる。
有効性、薬剤暴露、又は臨床反応の素早いアクセスしやすい読み出しを提供するバイオマーカーの同定は、候補薬剤の臨床開発においてますます重要になる。本発明の実施態様には、分泌されたタンパク質、又はバイオマーカーの一カテゴリーを表す血漿バイオマーカーのレベルにおける変化を測定することが含まれる。一態様において、物質の容易に利用しやすい供給源を表す血漿試料は、バイオマーカー分析用の代用組織として供給される。
上述した技術の応用における指針を提供するために、多くの参照が利用される(Kohlerら, Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Inimunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 及びZola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987))。ノーザンブロット分析は当該技術でよく知られている従来からの技術であり、例えばMolecular Cloning, a Laboratory Manual, 第2版, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY, 11803-2500)に記載されてる。遺伝子及び遺伝子生成物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えばAusubelら編, Current Protocols In Molecular Biology , Units 2 (ノーザンブロット法), 4 (サウザンブロット法), 15 (免疫ブロット法) 及び18 (ＰＣＲ分析)に見出される。
バイオマーカーの検出に使用するための、キット又はが製造品は、本発明により提供される。このようなキットは、ＲＡを患っている被験者がＬＴアンタゴニストに対して効果的に反応するかどうか決定するために使用することができる。これらのキットは、バイアル、チューブ等の一又は複数の容器手段を閉じ込めて受け入れるために区分されたキャリア手段を含み、各容器手段は本方法に使用される分離エレメントの一つを含む。例えば、容器手段の一つは、検出可能に標識された又は標識可能なプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれタンパク質又は自己抗体マーカー又は遺伝子又はメッセージに特異的な抗体又はポリヌクレオチドであってよい。キットが核酸ハイブリダイゼーションに利用されて、標的核酸を検出する場合、キットは、標的核酸配列を増幅するためのヌクレオチド(類)を収容する容器、及び／又はレポーター手段、例えばビオチン-結合タンパク質、特にアビジン又はストレプトアビジンを、レセプター分子、例えば酵素、蛍光、又は放射性同位元素標識に結合して含有する容器を有し得る。
このようなキットは、典型的には上述した容器、及びバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書と共にパッケージ挿入物を含む、商業用及び使用者の観点から望ましい物質を含む、一又は複数の他の溶液を有するであろう。ラベルは、組成物が特定の用途に使用されることを示すように容器に存在し、またインビボ又はインビトロ使用のための指示、例えば上述したものを示すこともある。
本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器、該容器上のラベル、及び該容器に収容された組成物を含むキットであり、ここで組成物は、タンパク質又は自己抗体バイオマーカーに結合する一次抗体を含有し、該容器上のラベルは、組成物が試料中のこのようなタンパク質又は抗体の存在性を評価するために使用可能であることを示し、キットが、特定の試料型におけるバイオマーカータンパク質の存在性を評価するために抗体を使用することについての使用説明書を含む。本キットは、試料を調製し、試料に抗体を適用するための使用説明書と物質のセットをさらに含有可能である。本キットは一次及び二次抗体の双方を含み、二次抗体は標識、例えば酵素標識にコンジュゲートしている。
他の実施態様は、第１の容器、該容器上のラベル、及び該容器に収容され、上述したバイオマーカー(類)を検出するための試薬を含有する組成物、第２の容器、該容器上のラベル、及び該第２の容器に収容され、緊縮条件下で検出されるポリヌクレオチド多型の補体にハイブリダイズする一又は複数のポリヌクレオチドを含有する組成物を含む、遺伝子多型バイオマーカー共にバイオマーカー(類)を検出するためのキットであり、該第１の容器上のラベルは、組成物が、試料中のここに記載の一又は複数のバイオマーカーの存在性を評価するために使用可能であることを示し、該第２の容器上のラベルは、組成物が、試料中のＳＮＰの存在性を評価するために使用可能であることを示し(試料はサイトカイン(類)を含有するものと同一又は異なる)、キットが、特定の試料中のバイオマーカー(類)の量を検出するための試薬を使用することについての使用説明書、及び特定の試料型におけるＳＮＰ ＲＮＡ又はＤＮＡの存在性を評価するためにポリヌクレオチド(類)を使用することについての使用説明書を含む。
キットの他の任意の成分には、一又は複数のバッファー(例えば、ブロックバッファー、洗浄バッファー、基質バッファー等)、他の試薬、例えば酵素標識により化学的に変化された基質(例えば色素原)、エピトープ回収溶液、対照試料(正及び／又は負のコントロール)、コントロールスライド(類)等が含まれる。またキットには、キットを使用して得られた結果を説明するための使用説明書を含めることもできる。
抗体ベースキットについてのさらなる特定の実施態様において、該キットは、例えば(１)バイオマーカータンパク質に結合する第１の抗体(例えば、固体状支持体に結合)；場合によっては(２)タンパク質又は第１の抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識に結合する第２の異なる抗体を含有可能である。
遺伝子を検出するキット(オリゴヌクレオチドべースキット)について、該キットは、例えば(１)バイオマーカータンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、又は(２)バイオマーカー核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対を含有可能である。また本キットは、例えば緩衝剤、防腐剤、又はタンパク質安定剤をさらに含有可能である。本キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な成分(例えば、酵素又は基質)をさらに含有可能である。さらに本キットは、アッセイされ、検査用試料と比較可能な対照試料又は一連の対照試料を含有可能である。キットの各成分は、個々の容器に包含可能であり、種々の容器の全てが、キットを使用して実施されるアッセイの結果を説明するための使用説明書と共に、単一パッケージ内にある。
Ｂ．統計
ここで使用される場合、予測尺度の一般的形態は、明細書においては、臨床的共変数を潜在的に含む一又は複数のバイオマーカーの機能からなり、応答性又は非応答性が予測、さらに一般的には、適切に定められた臨床的エンドポイントに関する有益性又は有益性の欠如が予測される。
予測尺度も最も単純な形態は、共変数のない一変数モデルからなり、ここで予測はカットオフ又は閾値を用いて決定される。これは、特定のカットオフｃ、バイオマーカー測定ｘについてのヘビサイド関数に関した表現であり、二元予測(binary prediction)Ａ又はＢは次のように作成される：
Ｈ(ｘ-ｃ)＝０ならば、Ａを予測。
Ｈ(ｘ-ｃ)＝１ならば、Ｂを予測。
これは、予測尺度において、一変数バイオマーカー測定を使用する、最も簡単な方法である。このような単純な規則が十分である場合、効果の方向性、すなわち高い又は低い発現レベルが患者にとって有益であるかどうかを、簡単に同定することができる。
臨床的共変数を考慮することが必要である場合、及び／又は多変数の予測尺度においてへ、複数のバイオマーカーが使用される場合、この状況はさらに複雑になるおそれがある。以下、２つの仮説例において、関与する問題点を例証する：
共変数調節(仮説例)：バイオマーカーＸについて、高発現レベルが悪い臨床反応に関与していることが、臨床治験集団において見出される(一変数分析)。近接分析(closer analysis)には、集団には２種類のＲＡ臨床反応が存在しており、その一方は他方よりも悪い反応を有し、同時に、このＲＡ群全体についてのバイオマーカー発現は、一般的により高いことが示されている。調節共変数分析により、それぞれのＲＡタイプについて、臨床的有益性と臨床反応との間の関係は逆である、すなわちＲＡタイプにおいて、発現レベルが低ければ低い程、関連する臨床反応は良好であることが明らかとなった。全体的な逆効果は、共変数ＲＡタイプよりマスクされ、予測尺度の一部として共変数が調節された分析は、方向が逆であった。
多変数予測(仮説例)：バイオマーカーＸについて、高発現レベルが悪い臨床反応にわずかに関与していることが、臨床治験集団において見出された(一変数分析)。第２のバイオマーカーＹについては、同様の観察が一変数分析においてなされた。ＸとＹの組合せはでは、双方のバイオマーカーが低い場合に、良好な臨床反応が現れた。これにより、双方のバイオマーカーがいくつかのカットオフよりも低いならば、有益であると予測されるという規則が作成される(及び--ヘビサイド予測関数の関連)。組合せ規則について、一変数の趣旨において、単純な規則はもはや通用しないが、例えば、Ｘにおいて低い発現反応ベルを有していても、より良好な臨床反応は、自動的に予測されないであろう。
これらの単純な実施例には、共変数を有する又は有さない予測尺度が、各バイオマーカーの一変数レベルでは判断できないことが示されてる。複数のバイオマーカーと、共変数による潜在的調節とを組合せると、単一のバイオマーカーに対する単純な関係をあてがうことができなくなる。特に血清中のマーカー遺伝子は、他の臨床的共変数を潜在的に含有する、複数のマーカー予測モデルに使用され得るので、このようなモデル内における単一マーカー遺伝子の有益な効果の方向性は、単純な方法では測定できず、一変数分析、すなわち単一マーカー遺伝子について記載されているような状況で見出される方向性と矛盾するおそれがある。
Ｃ．バイオマーカーとして可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)を使用する診断方法
本発明の方法は、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ(ＲＡ)を治療する方法に関する情報を提供するための有益な手段である。
一実施態様において、ここで提供される方法は、ＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量を測定する工程を含む。本発明の方法は、ＲＡ患者からの試料を操作又は検査する工程をさらに含むことができる。一実施態様において、操作工程は、ｓｏｌＬＴαβの量を検出するための試料とを接触させることを含む。他の実施態様において、試薬は、核酸、ポリペプチド、抗体、又はそのｓｏｌＬＴαβ-応答性断片、組換え体である。
例えば、生体試料中のＮＩＢＤマーカーの発現差異を検出する方法は、まず、抗ＩＢＤマーカー抗体、そのＩＢＤマーカー-応答性断片、又は抗ＩＢＤマーカー抗体の抗原-結合領域を含む組換えタンパク質と試料とを接触させ；ついで、試料中におけるＩＢＤマーカータンパク質の結合を検出することを含む。
バイオマーカーの発現又はタンパク質のレベルの測定は、適切なプロセッサにより施行されるソフトウェアプログラムを使用して実施できる。適切なソフトウェア及びプロセッサは、当業者によく知られており、商業的に入手可能である。プログラムは、有形情報記録媒体、例えばＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、又はプロセッサに連結したしたメモリに保管されたソフトウェアにおいて具現化されてよいが、当業者であれば、全てのプログラム又はその一部が、プロセッサ以外の装置により施行され、及び／又はよく知られている方式でファームウェア及び／又は専用ハードウェアにおいて具現化されてもよいことは、容易に理解しているであろう。
ｓｏｌＬＴαβのレベルを測定又は得た後、アッセイ結果、所見、診断、予想及び／又は推奨治療が典型的には記録され、例えば技師、医師及び／又は患者に伝えられる。ある実施態様では、コンピュータを使用して、患者及び／又は主治医のような関係者にそのような情報を伝える。いくつかの実施態様では、結果又は診断が伝えられる国又は管轄区域とは異なる国又は管轄区域で、アッセイが実施され又はアッセイ結果が分析される。
好ましい実施態様では、患者においてｓｏｌＬＴαβレベルに基づく診断、予測及び／又は推奨治療は、アッセイが完了し、診断及び／又は予測が作成された後に出来るだけ早く患者に伝えられうる。結果及び／又は関連情報は、患者を治療する医師によって患者に伝えられうる。あるいは、結果は、書面、伝達の電子形態、例えば電子メール、又は電話を含む任意の伝達手段によって患者に直接伝えることができる。伝達は、電子メール通信の場合におけるように、コンピュータの使用により容易にすることができる。ある実施態様では、診断試験の結果及び／又は導かれた結論及び／又は検査に基づく治療の推奨を含む伝達が作成され、テレコミュニケーションの熟練した技術者にはよく知られているコンピュータハードウェア及びソフトウェアの組合せを使用して被検者に自動的に配信されうる。ヘルスケア向けのコミュニケーションシステムの一例は、その全内容がここに参照により取り込まれる米国特許第6,283,761号に記載されている；しかしながら、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを利用する方法に限られるものではない。本発明の方法のある実施態様では、試料のアッセイ、疾患の診断、及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法工程の全て又は一部が異なった（例えば外国の）管轄区域で実施されうる。
診断を容易にするために、ｓｏｌＬＴαβのレベルは、電気的又は機械可読媒体、例えば限定されるものではないが、ＶＣＲにより可読されるアナログテープ、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュ媒体、その他のものを含む、ディスプレイ装置に表示可能である。このような機械可読媒体は、付加的な検査結果、例えば限定されるものではないが、臨床パラメータの測定及び伝統的な研究室危険因子をさらに含有可能である。別に又は付加的に、機械可読媒体は、病歴及び関係する家族歴等の被験者情報も含有可能である。
商業的な診断目的で実施する場合、この発明の方法により、ここに記載の一又は複数のバイオマーカーの標準的レベルのレポート又は要約が一般的には作製される。この発明の方法により、限定されるものではないが、治療に対する適合性、治療に対する応答性、治療の治療効果、治療の安全性、又はその任意の組合せを含む、ＬＴアンタゴニストアンタゴニスト治療と患者に関する一又は複数の予測を含むレポートが作製されるであろう。他の実施態様において、レポートは、ＬＴアンタゴニスト治療が投与されない患者に関する予測、又はＬＴアンタゴニスト治療が投与された患者に関する予測に関連している。
この発明の方法及びレポートは、データベース中にレポートを保存することを更に含みうる。あるいは、該方法は、被検者のためにデータベース中に記録をさらに作成し、記録にデータを追加することができる。 一実施態様では、レポートは紙のレポートであり、他の実施態様では、レポートは聴覚性レポートであり、他の実施態様では、レポートは電子的レポートである。レポートは医師及び／又は患者に提供されることが考えられる。レポートの受領は、データ及びレポートを含むサーバーコンピュータにネットワーク接続を樹立し、サーバーコンピュータからデータ及びレポートを要求することをさらに含みうる。本発明によって提供される方法はまた全体を又は部分的に自動化することもできる。
Ｄ．ＲＡ患者−バイオマーカーとしての可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の使用
本発明は、患者試料中のｓｏｌＬＴαβの量を測定又は検出することによる、治療的有効量のＬＴアンタゴニストを用いて治療された、又は治療を受けているＲＡ患者についての情報を提供する方法を提供し、ここでｓｏｌＬＴαβの量は、患者がＬＴアンタゴニストでの治療に対して反応するか、又は反応しそうであることを示す。例えば、ｓｏｌＬＴαβのこのような量は、患者の血清中に２０-８００ｐｇ／ｍｌ、又は患者の滑液中に２０-４００ｐｇ／ｍｌである。
他の実施態様において、本発明は、患者の試料Ｒ中のｓｏｌＬＴαβの検出量で、ＲＡ又はＲＡの進行度又はＲＡの危険性を診断、予測又は予後診断する方法を提供する。例えば、ｓｏｌＬＴαβのこのような量は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｐｇ／ｍｌ、又は少なくとも５００ｐｇ／ｍｌである。
上述した方法におけるＬＴアンタゴニスト治療の有効性は、例えば、ＲＡを患っている患者における、ＡＣＲ及び／又はＥＵＬＡＲ臨床反応パラメーターを使用することにより、又は患者におけるＲＡの程度を分子決定基をアッセイすることにより測定することができる。例えば、臨床医は、当該分野で公知の任意のいくつかの方法を使用し、ＬＴアンタゴニストの特定の投与計画の有効性を測定することができる。例えば、Ｘ線技術を使用し、患者における関節破壊及び損傷を測定することができ、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、及びＡＣＲ７０のスケールを使用し、治療に対する相対的有効応答性を測定することができる。最適な所望する反応(例えば治療反応)が提供されるように、投与計画を調節してもよい。例えば、一回で投与されてもよく、時間をかけて、数回に分けて投与されてもよく、又は治療状況の危急に応じて、比例的に投与量を増加又は低減してもよい。
アンタゴニストでの治療に対して最も反応した患者集団が同定されると、ここでアンタゴニスト単独又は他の薬剤との組合せを用いた治療が、その徴候又は症状を含む、ＲＡ又は関節損傷を改善するという結果をもたらす。例えば、このような治療により、第二の医薬(例えば免疫抑制剤、特にＭＴＸ)のみを用いて治療された患者に対して、ＡＣＲ測定においては改善性がもたらされ、及び／又はＡＣＲにより測定された場合、目的とする反応が(部分的又は完全に、好ましくは完全に)もたらされる。さらに、ここでのアンタゴニストと少なくとも一の第二の医薬とを組合せた治療により、好ましくは付加的な、より好ましくは相乗的な(すなわち、付加的なもの以上の)治療的有益性が患者にもたらされる。好ましくは、この方法において、第二の医薬の少なくとも一の投与と、ここでのアンタゴニストの少なくとも一の投与との間のタイミングは、約１ヶ月又はそれ以下、好ましくは約２週間又はそれ以下である。
治療的有効量のＬＴアンタゴニストを患者に投与する調節又は修正された正確な方式、続く、アンタゴニストに対して患者に起こり得る応答性の診断は、主治医の裁量によることは、医薬分野の当業者には理解されているであろう。用量、他の抗ＲＡ剤との組合せ、投与のタイミング及び頻度等は、このようなアンタゴニストに対して患者に起こり得る応答性の診断の程度、並びに患者の病状及び病歴の影響を受ける可能性がある。
アンタゴニストを含有する組成物は、良好な医療行為と一致した様式にて、処方、服用及び投与されるであろう。ここで考慮される要因には、治療されるＲＡの特定の種類、治療される特定の哺乳動物、患者個人の臨床症状、ＲＡの原因、アンタゴニストの送達部位、起こり得る副作用、アンタゴニストの種類、投与方法、投与スケジュール、及び医者に公知の他の要因が含まれる。投与されるアンタゴニストの有効量は、このような考慮による影響を受けるであろう。
当該分野の通常の技量を有する医師であるならば、特定のアンタゴニストの種類及び安全性プロフィール等の要因に応じて、必要とする製薬用組成物の有効量を、容易に決定及び処方することができる。例えば、このようなアンタゴニスト、例えば抗ＬＴアルファ抗体の投与から出発し、安全性を評価するために、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで、製薬用組成物に使用し、所望の効果(安全性を妥協することなく)が達成されるまで、徐々に用量を増加させていくであろう。アンタゴニストの付与された用量又は治療レジメの有効性は、例えば有効性の標準的なＲＡ測定を使用し、患者の徴候及び症状を評価することにより測定することができる。
ａ．用量
疾患の治療又は予防のために、(単独で、又は以下に示す第二の医薬との併用で使用される場合)本発明の抗体の適切な用量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床病歴及び抗体に対する応答性、及び主治医の裁量に依存するであろう。用量は、毒性及び副作用が最小となる一方、その徴候を治療するのに効果的であることが好ましい。
抗体は、１回で、又は連続治療上で適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ(好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与について、治療は疾患症状の所望の抑制が得られるまで持続される。抗体の例示的な一用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ又は４００ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）を患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量の抗体が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。例示的用量療法は、約４〜５００ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の後、約２〜４００ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメも有用であり得る。この治療法の進行は、常套的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
自己免疫疾患の治療について、治療的有効量は、典型的には約５０ｍｇ／ｍ２〜約３０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５０〜１５００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約５０-１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様において、用量範囲は約１２５-７００ｍｇ／ｍ２である。ＲＡの治療のために、一実施態様において、ヒト化抗体の用量範囲は、２回の投与で付与されて、約５０ｍｇ／ｍ２又は１２５ｍｇ／ｍ２(約２００ｍｇ／用量と同等)〜約１０００ｍｇ／ｍ２であり、例えば第１用量は、１日目の約２００ｍｇであり、続いて第２用量は、１５日目の約２００ｍｇである。種々の実施態様において、用量は、５０ｍｇ／用量、８０ｍｇ／用量、１００ｍｇ／用量、１２５ｍｇ／用量、１５０ｍｇ／用量、２００ｍｇ／用量、２５０ｍｇ／用量、２７５ｍｇ／用量、３００ｍｇ／用量、３２５ｍｇ／用量、３５０ｍｇ／用量、３７５ｍｇ／用量、４００ｍｇ／用量、４２５ｍｇ／用量、４５０ｍｇ／用量、４７５ｍｇ／用量、５００ｍｇ／用量、５２５ｍｇ／用量、５５０ｍｇ／用量、５７５ｍｇ／用量、又は６００ｍｇ／用量、又は７００ｍｇ／用量、又は８００ｍｇ／用量、又は９００ｍｇ／用量、又は１０００ｍｇ／用量、又は１５００ｍｇ／用量の任意の一つである。
疾患の治療において、本発明のＬＴアルファ-結合抗体は、疾患に熟練している医師により投与される場合、患者に慢性的に又は間欠的に投与することができる。
静脈注射又は皮下的に薬剤が投与された患者は、有害事象、例えば熱、悪寒、灼熱感、無力症、及び頭痛を被っている可能性がある。このような有害事象を軽減又は最小にするために、患者は、最初に調整用量(類)、続いて治療用量を受容することができる。調整用量(類)は、患者に高用量での耐性を付けさせるために、治療用量よりも少ない。
ここで抗体は、上述した種々の因子、例えば投与される量に応じて、医者の技量と判断の範囲内の頻度で投与することができる。この頻度は、週に２回、週に３回、週に１回、又は月に１回を含む。この方法の好ましい態様において、抗体は、隔週でわずか１回、より好ましくは月に約１回投与される。
ｂ．投与経路
本発明の方法で使用される抗体(並びに任意の第二の医薬)は、投与が急性又は慢性であるかどうかを含む、多くの因子に応じて、医療行為者に公知の適切な方法に従い、ヒト患者を含む被験者又は患者に投与される。これらの経路には、非経口、静脈内、例えばボーラスとして、所定期間を超えた連続注入により、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、肺内、脳脊髄内、関節内、滑液?内、くも膜下腔内、病巣内、又は吸入経路(例えば、鼻腔内)が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。さらに抗体は、特に減少させた量の抗体で、パルス注入によって適切に投与され得る。ここで好ましい経路は、静脈内又は皮下投与であり、最も好ましくは皮下である。
一実施態様において、ここでの抗体は、静脈注入により、好ましくは注入用ビヒクルとして、０．９〜２０％の塩化ナトリウム溶液と共に投与される。
しかしながら、上記したようなアンタゴニストの提案した量及び投与頻度は、多くの治療的裁量による。上記のように、適切な用量及びスケジュールを選択する際の鍵となる要素は、得られた結果である。例えば、相対的により高い用量は、まず最初に進行中及び急性ＲＡの治療に必要とされるかもしれない。最も効果的な結果を得るために、アンタゴニスト治療では、バイオマーカーで予測されたらすぐに、ＲＡの可能性又は寛解として、ＲＡの最初の徴候、診断、出現または発症に近づくように、アンタゴニストが投与される。
ここで説明されている、本発明の全ての方法において、アンタゴニスト(例えば、ＬＴ又はリンホトキシンレセプターに結合する抗体)は、コンジュゲートしていない、例えばネイキッド抗体であってよく、又は例えば半減期を改善するために、さらに効果的な他の分子とコンジュゲートしていてもよい。一実施態様において、アンタゴニストはＬＴαアンタゴニストである。他の実施態様において、ＬＴアンタゴニストは抗ＬＴα抗体、特にヒト化抗ＬＴα抗体である。
ここでの方法のさらなる実施態様において、被験者は、一又は複数の薬剤、例えばＲＡを治療するためのＴＮＦ-αインヒビター、特にＴＮＦＲ-Ｆｃ又は抗ＴＮＦ-α又は抗ＴＮＦ-αレセプター抗体、又は関節損傷又は根底にある原因、例えば自己免疫疾患を治療するための免疫抑制剤(類)で以前に治療されたことがなく、ＬＴアンタゴニスト(例えば、ＬＴに対する抗体)で以前に治療されたことがない。他の実施態様において、被験者は、インテグリンアンタゴニスト、例えば抗α４インテグリン抗体又は同時刺激モジュレーター、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、抗炎症剤、例えばＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤでＭＴＸ以外のもの、さらにアザチオプリン及び／又はレフルノミドを除き、治験薬を含む細胞枯渇治療(例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ２２、又はＢＬｙｓ／ＢＡＦＦ)、ベースラインの前２８日以内の生／弱毒化ワクチン、又はコルチコステロイド類、例えばベースライン前の４週間以内の関節内又は非経口グルココルチコイドで、以前に治療されたことはない。さらに好ましくは、被験者は、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、ＤＭＡＲＤ、又はＮＳＡＩＤで治療されたことはない。より好ましくは、被験者は、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、又はＮＳＡＩＤで治療されたことはない。
さらなる態様において、被験者は、最初又は遅れてアンタゴニスト又は抗体に暴露させた後を含む、上述した任意の方法で治療する前に、ＲＡ又は関節損傷を再発、又は器官損傷、例えば腎臓損傷を被っているおそれがある。しかしながら、好ましくは被験者は、ＲＡ又は関節損傷を再発しておらず、より好ましくは少なくとも最初の治療の前にこのような再発はない。
さらなる実施態様において、被験者は、Ｂ細胞悪性腫瘍、固形腫瘍、血液系腫瘍、又は上皮内癌(切除又は治療された皮膚の基底細胞及び扁平細胞の細胞腫を除く)を含む悪性腫瘍を患っていない。さらなる実施態様において、被験者は、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫疾患、又はＲＡに対して二次的な重症の全身性病変(血管炎、肺線維症、又はフェルティ症候群を含むが、限定されるものではない)を患っていない。他の実施態様において、被験者は、二次性シェーグレン症候群又は二次性限局性皮膚血管炎を患っていない。他の実施態様において、被験者は、ＲＡのＡＣＲ Classification of Functional Statusにより定められる機能的クラスＩＶを患っていない。さらなる実施態様において、被験者は、ＲＡ以外の炎症性関節疾患(痛風、応答性関節炎、乾癬性関節炎、血清反応陰性脊椎関節症、又はライム病を含むが、限定されるものではない)、又は他の全身性自己免疫疾患(ＳＬＥ、炎症性腸疾患、強皮症、炎症性筋疾患、混合性結合組織病、又は任意のオーバーラップ症候群を含むが、限定されるものではない)を患っていない。他の実施態様において、被験者は、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)、若年性ＲＡ(ＪＲＡ)、及び／又は１６才前のＲＡを患っていない。他の実施態様において、被験者は、重症の及び／又は制御できない心疾患又は肺疾患(閉塞性肺疾患を含む)、又は重症の合併症で、神経系、腎臓、肝臓、内分泌、又は胃腸の疾患を含むが、限定されないもの、ＨＩＶ感染の公知の病歴を含む、原発性又は続発性免疫不全(その病歴又は現在の活性)を患っていない。他の態様において、被験者は、任意の有効性評価に影響を与えるおそれのある、任意の神経(先天性又は後天性)、血管又は全身性の疾患、特に関節痛及び膨張(例えば、パーキンソン病、脳性麻痺、又は糖尿病性神経障害)を患っていない。さらなる実施態様において、被験者はＭＳを患っていない。さらなる態様において、被験者は、ループス又はシェーグレン症候群を患っていない。さらなる他の態様において、被験者は、ＲＡ以外の自己免疫疾患を患っていない。本発明の他の態様において、被験者における任意の関節損傷は、自己免疫疾患又はＲＡ以外の自己免疫疾患、又は自己免疫疾患又はＲＡ以外の自己免疫疾患の発症の危険性を伴わない。
これら一番最後の記述の目的について、ここでの「自己免疫疾患」は、個人自身の組織又は器官から、またこれらを指向して生じる疾患又は疾病、又はその共分離(co-segregate)又は所見、又はそこから得られる状態である。高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織における抗原-抗体複合体沈着物、コルチコステロイド又は免疫抑制治療による恩恵、及び罹患組織におけるリンパ球細胞凝集を含むが限定されない、これら自己免疫性疾患及び炎症性疾患の多くには、多数の臨床的及び実験用マーカーが存在してよい。「自己免疫疾患」は、臓器特異的疾患(すなわち、免疫系が、臓器系、例えば内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸及び肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系等に対して、特異的に指向する)、又は複数の臓器系に影響を及ぼすおそれのある全身性疾患(例えばＳＬＥ、ＲＡ、多発性筋炎等)とすることができる。好ましくは、このような疾患には、自己免疫リウマチ性疾患(例えば、ＲＡ、シェーグレン症候群、強皮症、ループス、例えばＳＬＥ及びループス腎炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎)、自己免疫胃腸及び肝臓疾患(例えば、炎症性腸疾患(特に、潰瘍性大腸炎及びクローン病)、自己免疫胃炎及び悪性貧血、自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病)、血管炎(例えば、ＡＮＣＡ-陰性血管炎(ANCA-negative vasculitis)及びＡＮＣＡ-関連血管炎で、チャーグ-ストラウス血管炎、ウェグナー肉芽腫症、及び顕微鏡的多発血管炎を含む)、自己免疫神経障害(例えば、ＭＳ、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫多発ニューロパチー)、腎疾患(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルジェ病)、自己免疫皮膚病(例えば、乾癬、蕁麻疹(urticaria)、じん麻疹(hives)、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデス)、血液病(例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫溶血性貧血)、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫聴覚障害(例えば、内耳障害及び難聴)、べーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫内分泌疾患(例えば、糖尿病関連自己免疫疾患、例えばインスリン依存性真性糖尿病(ＩＤＤＭ)、アジソン病、及び自己免疫甲状腺疾患(例えば、グレーブス病及び甲状腺炎))が含まれる。さらに好ましくは、このような疾患には、例えばＲＡ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＮ-関連血管炎、ループス、ＭＳ、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が含まれる。
上述した方法の他の好ましい態様において、被験者には、ベースライン又は治療の開始前に、ＭＴＸが投与される。より好ましくは、ＭＴＸは、約１０-２５ｍｇ／週の用量で投与される。また、好ましくは、ＭＴＸは、ベースラインの少なくとも約１２週前に投与され、さらに好ましくは、ＭＴＸはベースラインの少なくとも４週間前に、安定した用量で投与される。他の実施態様において、ＭＴＸは経口的又は非経口的に投与される。
上述した方法の特定の好ましい実施態様において、被験者は、一又は複数のＴＮＦ-αインヒビター又はＭＴＸに対して、不十分な応答を示す。
他の好ましい態様において、ＭＴＸは、ＬＴアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体と共に、被験者に投与される。
ここに含まれる場合、診断工程の後、有効量のＬＴアンタゴニスト(例えば、抗ＬＴα抗体を含む抗体)を被験者に投与し、少なくとも約３ヶ月後、好ましくは約２４週間後、ＭＲＩ又はＸ線写真等の画像治療技術により、骨又は軟部組織関節損傷が、投与前のベースラインより低減しているかどうかを測定することを含む、被験者における骨又は軟部組織関節損傷の治療をモニターする方法で、治療後の被験者におけるベースラインに対する低減度合いが、アンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体が関節損傷における効果を示す方法がなされる。好ましくは、ベースラインに対する低減度合いは、アンタゴニスト、例えば抗体又はイムノアドヘシンの投与後、２回測定される。
他の態様において、投与後少なくとも３ヶ月、画像検査(Ｘ線写真及び／又はＭＲＩ)により、投与前のベースラインと比較した、骨又は軟部組織関節損傷における低減度合いが測定され、投与されるアンタゴニストの量が、関節損傷における低減度合いを達成するために効果的な量とされる。好ましくは、検査では総修正Ｓｈａｒｐスコアが測定される。他の好ましい実施態様において、本方法は、アンタゴニストを投与する前の効果と比較した、関節損傷における持続した又は保持された低減度合いを達成するのに有効な量、ＬＴアンタゴニストを患者に付加的に投与することを含む。好ましい態様において、アンタゴニストは、先の投与後のＸ線写真検査時に、患者に臨床的改善がなくても、患者に付加的に投与される。好ましくは、臨床的改善は、脆弱又は膨張した関節の数を評価し、患者の包括的臨床的評価を実施し、赤沈速度を評価し、Ｃ-応答性タンパク質レベルの量を評価し、又は疾患活動性(疾患応答性)の複合測定、例えばＤＡＳ-２８、ＡＣＲ-２０、-５０、又は-７０スコアを使用することにより測定される。
さらなる他の態様において、本発明は、１回目のアンタゴニストの投与後に、Ｘ線検査及び／又はＭＲＩ等の画像治療技術を使用して、被験者における関節損傷の低減度合いを測定し、２回目のアンタゴニストの投与後に、Ｘ線検査及び／又はＭＲＩ等の画像治療技術を使用して、被験者における関節損傷の低減度合いを測定し、１回目と２回目で、被験者に見出された画像を比較し、１回目よりも２回目の方が、スコアが小さければ、アンタゴニストの投与を続けることを含む、診断工程の後に、ＬＴアンタゴニスト(例えば、抗ＬＴα抗体)の、骨又は軟部組織関節損傷を患っている被験者への投与を続けるかどうかを測定する方法を提供する。
さらなる実施態様においては、反応レベルが骨又は軟部組織関節損傷を治療するのに効果的であることを決定するために、投与工程の後に、治療に対する被験者の反応をテストする工程が治療方法に含まれる。例えば、投与後の画像(Ｘ線検査及び／又はＭＲＩ)スコアを検査し、投与前に得られたベースラインの画像結果と比較し、変化があるならば、どの程度の変化があったかを測定することにより、治療が有効であるかどうかを決定する工程が含まれる。この検査は、任意の部分的又は完全な回復の維持度合いを測定するために、投与後、種々の定期的又は不定期の時間間隔で繰り返されてよい。また、ここでの方法は、一又は複数のバイオマーカー又は症状が、上述にて説明したように、関節損傷が存在しているかどうかを確かめるために、投与前に、被験者を検査する工程を含む。他の方法においては、被験者にアンタゴニストを投与する前に、被験者の病状の原因、例えば主原因として、感染又は悪性腫瘍を除外するために、上述にて詳述したように、被験者の病歴をチェックする工程が含まれる。好ましくは、関節損傷は原発性(すなわち主要疾患)であり、続発性、例えば固形又は液性腫瘍にかかわらず、感染又は悪性腫瘍に対して続発性ではない。
ここで、全ての方法の一実施態様において、アンタゴニスト(例えば、抗ＬＴα抗体)は、ＲＡを治療するために、被験者に投与される唯一の薬物であり、すなわち、アンタゴニスト以外の何の薬物も、ＲＡを治療するためには被験者に投与されない。
ここでの方法のいずれかにおいて、好ましくは、アンタゴニストは、ＲＡを治療するために使用される薬物の一つである。よって、ＬＴアンタゴニストと共に、有効量の第二の医薬が、被験者に投与されてもよい(ここで、Ｂ-ＬＴアンタゴニスト(例えば、抗ＬＴα抗体)が最初の医薬である)。第二の医薬は一又は複数の薬物であってよく、例えば免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、例えばサイトカイン抗体、インテグリンアンタゴニスト(例えば抗体)、コルチコステロイド、又は任意のその組合せが含まれる。このような第二の医薬の種類は、ＲＡ及び／又は関節損傷の種類、ＲＡ及び／又は関節損傷の重症度、被験者の病状及び年齢、使用される第一の医薬の種類及び用量を含む種々の要因に依存する。
このような付加的な薬物の例には、免疫抑制剤(例えば、ミトキサントロン(NOVANTRONEＴＭ)、ＭＴＸ、シクロホスファミド、クロラムブシル、レフルノミド、及びアザチオプリン)、静注免疫グロブリン(ガンマグロブリン)、リンパ球-枯渇治療(例えば、ミトキサントロン、シクロホスファミド、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ抗体、抗ＣＤ４、クラドリビン、自己応答性Ｂ細胞のＩｇレセプターにより特異的に認識される、脱免疫化された自己応答性抗原又はその断片を含む、少なくとも２のドメインを有するポリペプチドコンストラクト(国際公開第2003/68822号)、全身照射、及び骨髄移植)、インテグリンアンタゴニスト又は抗体(例えばＬＦＡ-１抗体、特にGenentechから商業的に入手可能なエファリズマブ/RAPTIVA(登録商標)、又はアルファ４インテグリン抗体、例えばBiogenから入手可能なナタリズマブ／ANTEGREN(登録商標)、又は上述した他のもの)、ＲＡ及び／又は関節損傷に続発して又は関連した症状を治療する薬剤、例えばここに示されたもの、ステロイド類、例えばコルチコステロイド(例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、例えば SOLU-MEDROLＴＭメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウムで注射用のもの、プレドニゾン、例えば低用量プレドニゾン、デキサメタゾン、又はグルココルチコイド、例えば関節注射を介してなされるもので、全身コルチコステロイド治療を含む)、非リンパ球枯渇免疫抑制治療(例えば、ＭＭＦ又はシクロスポリン)、ＴＮＦ-αインヒビター、例えばＴＮＦ-αに対する抗体又はそのレセプター、又はＴＮＦＲ-Ｆｃ(例えば、エタネルセプト)、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、プラズマフェレーシス又は血漿交換、トリメトプリム-スルファメトキサゾール(BACTRIMＴＭ、SEPTRAＴＭ)、ＭＭＦ、Ｈ２-ブロッカー又はプロトンポンプインヒビター(潜在的な潰瘍発生免疫抑制治療の使用中)、レポチロキシン、シクロスポリンＡ(例えば、SANDIMMUNE(登録商標))、ソマトスタチン類似体、ＤＭＡＲＤ又はＮＳＡＩＤ、又はサイトカインアンタゴニスト、例えば抗体、抗代謝産物、免疫抑制剤、リハビリ手術、放射性ヨウ素、甲状腺摘除術、又は抗ＩＬ-６レセプターアンタゴニスト／抗体(例えば、ＡＣＴＥＭＲＡＴＭ(トシリズマブ））が含まれる。
このような好ましい薬物には、ガンマグロブリン、インテグリンアンタゴニスト、抗ＣＤ４、クラドリビン、トリメトプリムスルファメトキサゾール、Ｈ２-ブロッカー、プロトンポンプインヒビター、シクロスポリン、ＴＮＦ-αインヒビター、ＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ(例えば、筋骨格症状を治療するもの)、レボチロキシン、サイトカインアンタゴニスト(サイトカインレセプターアンタゴニストを含む)、抗代謝産物、免疫抑制剤、例えばＭＴＸ又はコルチコステロイド、ビスホスホナートが含まれる。
さらに好ましいこのような薬物は、免疫抑制剤、例えばＭＴＸ又はコルチコステロイド類、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はその組合せである。
特に好ましい一実施態様において、第二の医薬は、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ-ペニシラミン、注射用金、経口用金、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシン(myocrisin)、及びＭＴＸからなる群から好ましく選択される、ＤＭＡＲＤである。
他のこのような実施態様において、第二の医薬は、フェンブフェン、ナプロシン(naprosyn)、ジクロフェナク、エトドラク、及びインドメタシン、アスピリン、及びイブプロフェンからなる群から好ましく選択される、ＮＳＡＩＤである。
さらなるこのような実施態様において、第二の医薬は、エタネルセプト、インフリキマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリン、ＭＴＸ、及びシクロホスファミドからなる群から好ましく選択される、免疫抑制剤である。
他の好ましい態様において、第二の医薬は、抗α４、エタネルセプト、インフリキマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット、エファリズマブ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ-Ｆｃ、抗ＲＡＮＫＬ、パミドロナート、アレンドロナート、アクトネル、ゾレンドロナート、クロドロナート、ＭＴＸ、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルミノド、ＳＳＺ、プレドニゾロン、ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾン、及びメチルプレドニゾロンからなる群から選択される。
さらに好ましい実施態様において、第二の医薬は、インフリキマブ、インフリキマブ／ＭＴＸの組合せ、エタネルセプト、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、プレドニゾロン、ＭＴＸ及びＳＳＺの組合せ、ＭＴＸ、ＳＳＺ及びＨＣＱの組合せ、シクロホスファミド、アザチオプリン及びＨＣＱの組合せ、及びアダリムマブとＭＴＸの組合せからなる群から選択される。第二の医薬がコルチコステロイドである場合、好ましくは、それはプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンである。また好ましくは、コルチコステロイドは、アンタゴニストが、標準的な治療として、コルチコステロイドで治療された被験者に投与されていないならば、使用されるよりも低量で投与される。最も好ましくは、第二の医薬はＭＴＸである。
これら全ての第二の医薬は、互いに又は第一の医薬とそれら自体とを組合せて使用されてよく、ここで使用される場合、「第二の医薬」なる表現は、第一の医薬以外の唯一の薬物を意味するものではない。よって、必要とされる第二の医薬は、一つの薬物ではなく、一以上の薬剤から構成されても、含有していてもよい。
ここで説明されたように、これら第二の医薬は、以前に使用されていたのと同じ用量及び投与経路、又は今までに使用されていた用量の約１〜９９％で、一般的に使用される。このような第二の医薬が使用される場合、それにより引き起こされる副作用が除去される又は低減するように、第一の医薬を用いた最初の投薬以上に、特に後続する投薬に、第一の医薬が存在しないならば、好ましくはさらに低量で使用される。
第二の医薬の組合せ投与には、別々の処方物又は単一の製薬用処方物を使用する同時投与(併用投与)、及びいずれかの順番での連続投与が含まれ、ここで双方(又は全ての)活性剤(薬物)が、それらの生物活性に同時に働きかける期間が、好ましくは存在する。
ここに記載のＬＴアンタゴニストは、非経口、局所、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び／又は病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内(i.v.)、動脈内、腹腔内、又は皮下(s.c.)投与が含まれる。またくも膜下腔内投与も適している。さらにアンタゴニストは、例えばアゴニストの低下投与(declining doses)を用いた、パルス注入により、適切に投与されてもよい。好ましくは、アンタゴニストが抗体である場合、i.v.又はs.c.により、好ましくはi.v.注入又は注射により投与される。
上述したような、伝統的な経路により、患者にアンタゴニストを投与することの他に、本発明は、遺伝子治療による投与を含む。アンタゴニストをコードする核酸のこのような投与は、「有効量のアンタゴニストを投与する」なる表現に含まれる。例えば、細胞内抗体を生じせしめるための遺伝子治療の使用に関する、国際公開第1996/07321号を参照のこと。
インビボ又はエキソビボで、患者の細胞内に核酸(場合によっては、ベクターに包含される)を得るためには、２つの主要なアプローチがある。インビボ送達について、核酸は、通常、アンタゴニストが必要とされる部位にて、患者に直接注射される。エキソビボ治療については、患者の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、例えば患者に移植される多孔質膜内に包含されて、又は直接、修飾細胞が患者に投与される(例えば、米国特許第4,892,538号及び同5,283,187号を参照)。生存細胞に核酸を導入するのに利用可能な、多様な技術が存在する。核酸が、意図する宿主の細胞にインビボで、又は培養された細胞にインビトロで移されたかどうかに応じて、技術を変える。哺乳動物細胞へのインビトロでの核酸の移動に適した技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法等が含まれる。遺伝子のエキソビボ送達に一般的に使用されているベクターはレトロウイルスである。
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)での形質移入を含む。いくつかの状況では、核酸供給源を、標的細胞に特異的な薬剤、例えば標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)；及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコルは、例えばAndersonら, Science, 256:808-813 (1992)及び国際公開第1993/25673号に記載されている。
他の実施態様において、バイオマーカー分析に基づいた治療に適した、被験者の関節損傷を治療する方法で、ＬＴアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体等の抗体を被験者に投与し、投与の少なくとも約５２週間後、関節損傷の低減度合いを測定するための画像処理検査を被験者に行い、投与前のベースラインと比較し、所定量のアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体の投与が、関節損傷の低減達成に有効である場合は、被験者が成功裏に治療されたことを示す方法が提供される。
この方法において、好ましくは、総修正Ｓｈａｒｐスコアが、検査で測定される。この関節治療方法の他の好ましい実施態様において、アンタゴニストは、抗ＬＴα抗体である。
他の好ましい実施態様において、関節損傷は、関節炎、好ましくはＲＡ、さらに好ましくは早期又は初発ＲＡにより引き起こされる。ここでの全ての方法において、ＲＡは好ましくは早期又は初発ＲＡである。ここでの被験者は、ＲＦネガティブ又はポジティブであってよい。
他の態様において、このような方法は、ＲＡを治療する、又はアンタゴニストの投与前の効果と比較して関節損傷の低減の持続又は保持が達成されるのに有効な量のアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体を被験者に付加的に投与することにより、被験者を再治療することをさらに含む。再治療は、アンタゴニストの第１回目投与の少なくとも約２４週間(好ましくは約２４週間)後に開始され、場合によっては、一又は複数のさらなる再治療が開始されてもよい。他の実施態様において、さらなる再治療は、アンタゴニストの第二回目投与の少なくとも約２４週間後に開始される。
一態様において、アンタゴニストは、事前投与の後のＲＡ検査又は他の画像処理検査時に、被験者に臨床的改善がない場合に、被験者に付加的に投与される。
さらなる好ましい態様において、第１の評価、例えば画像処理評価後のＲＡ又は関節損傷の程度を比較すると、ＲＡ又は関節損傷は再治療後には低減していた。
再治療として、アンタゴニストの複数回暴露が提供されるならば、各暴露は、同じ又は異なる投与手段を使用して提供されてよい。一実施態様において、各暴露はi.v.投与よりなされる。他の実施態様において、各暴露はs.c.投与により付与される。さらなる他の実施態様において、暴露はi.v.及びs.c.投与の双方により付与される。
好ましくは、同じアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体が、少なくとも２のアンタゴニスト暴露、好ましくは各アンタゴニスト暴露に使用される。よって、最初及び第二回目のアンタゴニスト暴露は同じアンタゴニストを用いてなされ、より好ましくは、全てのアンタゴニスト暴露は同じアンタゴニストを用いてなされ、すなわち、最初の２回の暴露、及び好ましくは全ての暴露は、一種類のＬＴアンタゴニスト、例えばＬＴに結合するアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体を用いてなされる。
好ましくは、この再治療法において、第二の医薬は有効量で投与され、ここでアンタゴニストは第一の医薬である。一態様において、第二の医薬は一種を越える医薬である。他の態様において、第二の医薬は上述にて説明したものの一つであり、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はそれらの組合せが含まれ、最も好ましくはＭＴＸが含まれる。
ここに記載の再治療法について、第二の医薬が、アンタゴニスト暴露と共に有効量で投与される場合、任意の暴露、例えば１回のみの暴露、又は１回以上の暴露と共に投与されてよい。一実施態様において、第二の医薬は最初の暴露と共に投与される。他の実施態様において、第二の医薬は最初及び２回目の暴露と共に投与される。さらなる実施態様において、第二の医薬は全ての暴露と共に投与される。プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びシクロホスファミド等、副作用を有する薬剤に対する、被験者の暴露が低減するように、最初の暴露後、ステロイド等、所定量のこのような第二の医薬は低減又は除去される。
再治療法の一実施態様において、被験者は、ＲＡ又は関節損傷を治療するための任意の薬剤(類)、例えば免疫抑制剤(類)を予め投与されていない。他の態様において、被験者又は患者は、ＲＡ又は関節損傷のための以前の治療に対して反応している。
再治療の他の態様において、被験者又は患者は、ＲＡ又は関節損傷を治療するための、一又は複数の薬物(類)を予め投与されている。さらなる実施態様において、被験者又は患者は、予め投与された一又は複数の薬物に対して反応していない。被験者が反応しないかもしれないこのような薬剤には、例えば、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド類、鎮痛剤、又はＬＴアンタゴニスト、例えばＬＴ又はリンホトキシンレセプター対するアンタゴニスト、特に抗ＬＴα抗体が含まれる。特に、被験者が反応しないかもしれない薬剤には、免疫抑制剤、又はＬＴアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体が含まれる。好ましくは、このようなアンタゴニストは、抗体又はイムノアドヘシンではなく、例えば小分子インヒビター、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はアンタゴニストペプチド等で、背景の項に記載されたものである。さらなる態様において、再治療は、被験者が以前は無反応であった、この発明の一又は複数の抗体又はイムノアドヘシンを用いると考えられているため、このようなアンタゴニストには、抗体又はイムノアドヘシンが含まれる。最も好ましくは、被験者又は患者は、ＭＴＸ又はＴＮＦ-αインヒビターを用いた以前の治療に対して反応しない。
他の実施態様において、被験者の関節損傷を治療する方法で、ＬＴアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体等の抗体を被験者に投与し、投与の少なくとも約５２週間後、関節損傷の低減度合いを測定するための画像処理検査を被験者に行い、投与前のベースラインと比較し、所定量のＬＴアンタゴニストの投与が、関節損傷の低減達成に有効である場合は、被験者が成功裏に治療されたことを示す方法が提供される。
この方法において、好ましくは、総修正Ｓｈａｒｐスコアが、検査で測定される。この関節治療方法の他の好ましい実施態様において、アンタゴニストは、抗ＬＴα抗体である。
好ましくは、約５２週評価に関するこの方法において、第二の医薬は有効量で投与され、ここでアンタゴニスト、例えば抗ＬＴα抗体は第一の医薬である。一態様において、第二の医薬は一種を越える医薬である。他の態様において、第二の医薬は上述にて説明したものの一つであり、免疫抑制剤、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はそれらの組合せ、最も好ましくはＭＴＸが含まれる。
他の態様において、本発明は、被験者が一又は複数のここでのバイオマーカーを有している場合、有効量のＬＴアンタゴニストを被験者に投与することを含む、被験者におけるネガティブな副作用(例えば、感染症、癌、心不全、及び脱髄)の危険性を低減させる方法に関する。
このようなアゴニストを生成、修飾及び処方する方法の論議を以下に記す。
Ｅ．アンタゴニストの生成
本発明の方法及び製造品は、ＬＴアンタゴニスト、例えば抗体を使用又は包含している。このようなアンタゴニストをスクリーニングする方法は上述している。このようなアンタゴニストを製造する方法は当該分野の範囲内であり、生成されるアンタゴニストの種類に応じて、化学合成、組換え生成、ハイブリドーマ生成、ペプチド合成、オリゴヌクレオチド合成、ファージディスプレイ等が含まれる。
好ましいアンタゴニストは抗体であるが、ここでは他のアンタゴニストが考慮される。例えば、アンタゴニストには細胞傷害剤と融合又はコンジュゲートしてもよい小分子アンタゴニストが含まれ得る。小分子のライブラリーは、抗原に結合する小分子を同定するために、ここで関心あるＬＴ抗原に対してスクリーニングされる。さらに小分子は、その拮抗特性がスクリーニングされ、及び／又は細胞傷害剤とコンジュゲートされ得る。
また、アンタゴニストは、理論的設計又はファージ表示(例えば、国際公開第1998/35036号)により生産されるペプチドであってもよい。一実施態様において、分子は「CDR模倣物」又は抗体のＣＤＲに基づいて設計された抗体類似物が選択されてもよい。このようなペプチドはそれら自体で拮抗作用を示すが、ペプチドの拮抗特性を高める又は添加するために、細胞傷害剤とペプチドを融合させてもよい。
以下に、本発明で使用される抗体アンタゴニストの生産のための例示的技術を示す。
ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連する抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートさせることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、モノクローナル抗体の生成中に生じる可能性のある変異体を除き、同一であるか又は同じエピトープに結合し、このような変異体は一般的に少量で存在する。よって、「モノクローナル」との修飾語句は、別々のもの又はポリクローナル抗体の混合物としてではなく、抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培養培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal antibodies：Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような従来からの免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来からの手段を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源である。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成をなすことができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)が含まれる。
さらなる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol.,222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ｃ．ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には供給源が非ヒトである一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することによりWinterと共同研究者の方法(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536(1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsら, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してよい(Carterら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaら, J. Immunol., 151:2623(1993))。
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ｄ．ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,595,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature, 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面に抗体断片の機能として表示する。繊維状粒子がファージゲノムの単一ストランドのＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージ表示は多様な形式で行うことができる；例えばJohnson及びChiswell, Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
また、ヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同5,229,275号を参照)。
ｅ．抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第93/16185号；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
ｆ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＬＴα抗原の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時ト形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開1994/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された(国際公開1991/00360号、国際公開第1992/00373号、及び欧州特許第03089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science,229:81 (1985) は無傷な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
Ｆ．アンタゴニストの修飾
アンタゴニストの修飾がここで考慮される。例えば、アンタゴニストは、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの１つに結合させてもよい。抗体断片、例えば一又は複数のＰＥＧ分子に結合したＦａｂ'は、本発明の治療用実施態様である。
また、ここで開示するアンタゴニストはリポソームとして処方されてもよい。アンタゴニストを含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwangら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号；及び国際公開第1997/38731号等に記載されているような当分野において公知の方法によって調製される。循環時間が長いリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。所望の直径を有するリポソームを産出するために、リポソームを規定のサイズの孔のフィルターに通す。本発明の抗体のＦａｂ'断片を、ジスルフィド相互反応を介してMartinら J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載のようにリポソームとコンジュゲートさせることができる。場合によっては、化学療法剤をリポソーム内に内包させる。Gabizonら J. National Cancer Inst.81(19)：1484 (1989)を参照。
ここで記載のタンパク質又はペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、アンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をアンタゴニスト核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アンタゴニストの翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にあるアンタゴニストの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアニリン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞傷害ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチドのアンタゴニストのＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基により置換されたアンタゴニスト分子に、少なくとも一のアミノ酸残基で有する。抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物活性の変化をもたらす場合、表１に「代表的な置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
Figure 2012504245
アンタゴニストの生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
(１)疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
(２)中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
(３)酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
(４)塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
(６)芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
アンタゴニストの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、アンタゴニストにシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい(特にここでのアンタゴニストは抗体断片、例としてＦｖ断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数のＨＶＲ残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体(類)は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和成熟である。簡潔に言えば、幾つかのＨＶＲ部位(例えば６-７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、一価種類にディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。可能な修飾に対する抗原結合の大きな一因である、候補ＨＶＲ部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。このような変更には、アンタゴニストに見い出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又はアンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を含む。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である、は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって典型的には達成される。該変化は、元のアンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合する炭水化物は変更されてよい。例えば抗体のＦｃ領域に結合するフコースを欠失した成熟炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第2003/0157108号(Preata)に記載されている。また、米国特許第2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物において、二等分されたＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する抗体は、国際公開第2003/011878号、Jean-Mairetら、及び米国特許第6,602,684号、Umanaらが参照される。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖において、少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第1997/30087号、Patelらに報告されている。さらに、そのＦｃ領域に結合した変性炭水化物を有する抗体に関連する国際公開第1998/58964号(Raju)及び国際公開第1999/22764号(Raju)を参照のこと。また、Ｎ結合オリゴ糖を含有するＦｃ領域を有する抗体を含む、修飾グリコシル化を有する抗原-結合分子においては、米国特許第2005/0123546号(Umanaら); 米国特許第2004/0072290号(Umanaら); 米国特許第2003/0175884号(Umanaら); 及び国際公開第2005/044859号(Umanaら)を参照のこと。
ここで、好ましいグリコシル化変異体はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合している炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異体はＡＤＣＣ機能が改善されている。場合によっては、Ｆｃ領域は、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４(残基のＥｕ番号付け)での置換といった、ＡＤＣＣをさらに改善する一又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。「脱フコシル化」又は「フコース-欠失」抗体に関する文献に例には：米国特許第2003/0157108号; 国際公開第2000/61739号; 国際公開第2001/29246号; 米国特許第2003/0115614号; 米国特許第2002/0164328号; 米国特許第2004/0093621号; 米国特許第2004/0132140号; 米国特許第2004/0110704号; 米国特許第2004/0110282号; 米国特許第2004/0109865号; 国際公開第2003/085119号; 国際公開第2003/084570号; 国際公開第2005/035586号; 国際公開第2005/035778号; 国際公開第2005/053742号; 米国特許第2006/0063254号; 米国特許第2006/0064781号; 米国特許第2006/0078990号; 米国特許第2006/0078991号; Okazakiら, J. Mol. Biol., 336:1239-1249(2004); Yamane-Ohnukiら, Biotech. Bioeng., 87:614(2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生成する株化細胞の例には、タンパク質フコシル化におけるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞欠失(Ripkaら, Arch. Biochem.Biophys., 249:533-545(1986); 米国特許第2003/0157108 A1号(Presta)、及び国際公開第2004/056312 A1号(Adamsら, 特に実施態様１１)、及びノックアウト株化細胞、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(Yamane-Ohnukiら, Biotech. Bioeng., 87:614(2004))が含まれる。また、Kandaら, Biotechnol. Bioeng., 94:680-688 (2006)を参照。米国特許第2007/0048300(Biogen-IDEC)号には、所望のエフェクター機能を有するアグリコシル化Ｆｃ含有ポリペプチド、例えば抗体を作成する方法、並びに本方法により生成されたアグリコシル化抗体、及び治療剤としてのこのような抗体の使用方法が開示されている。
また、組換え糖タンパク質及びグリコシル化変異体においては、米国特許第2006/024304号(Gerngrossら); 米国特許第7,029,872号(Gerngross); 米国特許第2004/018590号(Gerngrossら); 米国特許第2006/034828号(Gerngrossら); 米国特許第2006/034830号(Gerngrossら); 米国特許第2006/029604号(Gerngrossら); 国際公開第2006/014679号(Gerngrossら); 国際公開第2006/014683号(Gerngrossら); 国際公開第2006/014685号(Gerngrossら); 国際公開第2006/014725号(Gerngrossら);及び国際公開第2006/014726号(Gerngrossら)を参照。
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製されたアンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第5,739,277号に記載されているようにアンタゴニスト(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことができる。ここで使用される場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。そのＦｃ領域に置換を有し、血清半減期が延長された抗体は、国際公開第00/42072号(Presta, L)に記載されてる。
３又はそれ以上(好ましくは４)の機能的抗原結合部位を有するように設計された抗体も考慮される(米国出願第2002/0004587A1号、Millerら)。
Ｇ．製薬用処方物
本発明で使用されるアンタゴニストの治療用処方物は、所望される程度の純度を持つアンタゴニストを、凍結乾燥された調製物又は水性溶液の形態で、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより保管用に調製される。処方物に関する一般的な情報については、例えば、Gilmanら,(eds.)(1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 第8版, Pergamon Press; A. Gennaro(ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版,(1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.; Avisら,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Liebermanら,(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York;及びLiebermanら,(eds.)(1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekkerを参照のこと。
許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスファート、シタラート、及び他の有機酸のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーンＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
皮下投与に適した凍結乾燥処方物は、例えば米国特許第6,267,958号(Andyaら)に記載されている。このような凍結乾燥処方物は適切な希釈剤で高濃度タンパク質に再構成され、再構成された処方物はここで治療される哺乳動物に皮下的に投与され得る。
アンタゴニストの結晶化形態も考慮される。例えば米国特許第2002/0136719A1号(Shenoyら)を参照のこと。
また、ここでの処方物は一以上の活性化合物(上述した第二の医薬)、好ましくはお互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含みうる。そのような薬物の種類及び有効量は、処方物に存在するＬＴアンタゴニストの量及び種類、及び被験者の臨床パラメーターに依存する。好ましくはこのような第二の医薬は上述したものである。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術はRemington's Pharmaceutical Science 第16版, Osol, A. Ed.(1980)に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例は、アンタゴニスト含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。
インビボ投与に用いる調製物は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
Ｈ．製造品
上述したＲＡの治療に有用な物質を含む製造品をここで提供する。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。この態様において、パッケージ挿入物は容器上又はそれに付随している。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、ＲＡ又は関節損傷の治療に有用なアンタゴニストを保持又は収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤はＬＴアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が
アンタゴニスト及び提供される任意の他の薬物の投与量及び間隔に関して、特定の指針を有する治療に適した被験者の、関節損傷又はＲＡの治療のために使用されることを示している。
製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備していてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
本発明のキット及び製造品は、組成物がＲＡ及び関節損傷の治療に使用されることが示されている、例えばパッケージ挿入物又はラベルの形態で情報をも含んでおり、ここで、各サイトカインの所定閾値レベルよりも高くない、３つのサイトカインの一又は複数のレベルが、疾患を患っている患者からの血清試料で検出される。挿入物又はラベルは任意の形態、例えば紙又は電子媒体、特に磁気記録媒体(例えば、フロッピーディスク)又はＣＤ-ＲＯＭを取ることができる。ラベル又は挿入物は、キット又は製造品における製薬用組成物及び投与形態に関する他の情報を含むことも可能である。
一般的に、このような情報は、包含された製薬用組成物及び投与形態の、効果的かつ安全な使用において、患者及び医者を補助するものである。例えば、アンタゴニストに関する次の情報：薬物動態、薬力学、臨床治験、有効性パラメーター、表示及び使用法、禁忌、警告、安全上の注意、副反応、過剰摂取、適切な用量及び投与、供給方法、適切な保管条件、参照、及び特許情報は、挿入物において提供されうる。
好ましい実施態様において、ここで製造品は第二の医薬を含む容器をさらに具備しており、ここでアンタゴニストは第一の医薬であり、製造品は、有効量の第二の医薬で患者を治療するために、パッケージ挿入物に使用説明書をさらに含む。第二の医薬は上述にて説明したものであり、例示的な第二の医薬は、免疫抑制剤、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、インテグリンアンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はそれらの組合せ、より好ましくはＤＭＡＲＤ、ＮＳＡＩＤ、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、又は免疫抑制剤を含む、上述にて説明したものである。最も好ましくは、第二の医薬はＭＴＸである。
他の態様において、本発明は、アンタゴニスト又は製薬用組成物、及びアンタゴニスト又は製薬用組成物が、試料が得られたＲＡを患っている患者を治療することを示し、一又は複数のバイオマーカーのレベルを評価することにより、各バイオマーカーについての所定閾値レベルよりも高くない一又は複数のバイオマーカーレベルを示すことを記載したラベルを、パッケージの中で組合せることを含む、ＬＴアンタゴニスト又はその製薬用組成物を製造する方法を提供する。これは、試料中に他のバイオマーカーの存在又は不在を示すことに伴い、単独又は組合せることができる。同様の方法が関節損傷に適用することもできる。
本発明は、ＬＴアンタゴニスト以外の抗関節炎治療、例えばＤＭＡＲＤ(ＭＴＸを含む)、又はサイトカイン-又はインテグリン-指向性の生物学的治療を有効量、患者に投与することを含む、患者におけるＲＡを治療する方法を提供し、治療の投与前の患者からの試料では、ここに記載の一又は複数のバイオマーカーのレベルが、ここに記載されたそれぞれについての所定閾値レベルよりも高いことを示す。試料は、例えば、一又は複数のこのようなバイオマーカーのレベルを測定するために、ここに記載の任意の方法によりアッセイすることができる。試料の評価は、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する有効な反応をあまり示さない又は示さない患者で確認される。
Ｉ．広告の方法
広告は、スポンサーが確認し、メッセージがコントロールされた非個人的媒体を通したコミュニケーションである。ここで目的となる広告は、広報、ピーアール、プロダクトプレイスメント、財政援助、引受業務、及びセールスプロモーションが含まれる。またこの用語には、この発明の購入、支持又は認可に対する好ましいパターンを促し、情報を流し、販売促進させ、動機喚起し、そうでなければ修正するために、多くの視聴者にアピールされるようにデザインされた、任意の印刷物によるコミュニケーション媒体に表される、スポンサーの情報公示も含まれる。
ここでの診断方法の広告及び販売促進は、任意の手段で実施することができる。これらのメッセージを送達させるために使用される広告媒体の例には、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、及びコマーシャルを含む広告用掲示板が含まれ、メッセージは放送媒体に表れる。広告には、食料品店のカートのシート、空港通路の壁、バスの側面にあるもの、又は電話の保留メッセージに流れるもの、又は店内のＰＡシステムが含まれ、視覚的又は可聴的コミュニケーションを配することが可能な場所はどこでもしかりである。より特定の例の販売促進又は広告手段には、テレビ、ラジオ、映画、インターネット、例えばウェブ放送又はウェビナー、同時に使用者に伝わるように意図された双方向型コンピュータネットワーク、固定された又は電子型の広告用掲示板、及び他の公共の看板、ポスター、伝統的な又は電子文献、例えば雑誌及び新聞、他の報道発信地、プレゼンテーション、又は電子メール、電話、即時メッセージ、郵送、宅配、大衆、又は伝書メール、本人直接の訪問による個人的接触が含まれる。
使用される広告の種類は、多くの要因、例えば、伝えられる対象視聴者の性質、例えば病院、保険会社、診療所医師、看護師、及び患者、並びに経費検討及び関連管轄法律、及び薬物及び診断法の広告を統制している規則に依存するであろう。広告は、サービス相互作用及び／又は他のデータ、例えば使用者の人口動態及び地理的な位置により定められる使用者の特徴に基づき、個々に特徴付け又はカスタマイズされる。
当該技術で公知の多くの他の実験方法が、この発明の実施において、特にここに記載されているもの、例えば、この発明に関連した分野で利用されている、多くの優れたマニュアル及びテキストに記載されているもの(例えば、Using Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, E及びLane, D編, 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(例えばISBN 0-87969-544-7); Roe B. Aら 1996, DNA Isolation and Sequencing(Essential Techniques Series), John Wiley & Sons(例えばISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins, 2000, ed. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thomer. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 第3版, Joseph Sambrook and Peter MacCallum,(the former Maniatis Cloning manual)(例えばISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubelら John Wiley & Sons(例えばISBN 0-471-50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons(例えばISBN 0-471-11184-8); 及びMethods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Academic Press, Inc.(例えばISBN 0-12-213585-7))、又は分子生物学における実験方法を記載することに向けられた多くの大学又は民間のウェブサイトに記載されているものと成功裏に置き換えることができる。
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例により例証される。本明細書における全ての引用文献の開示は出典明示によりここに明示的に援用される。
次の実施例は、細胞膜からのＬＴαβヘテロ三量体の切断、切断されたｓｏｌＬＴαβの循環中への放出、及びＲＡ滑液に見出されるｓｏｌＬＴαβの増加レベルを始めて示す。またここに記載されるものは、ＲＡ患者から単離された線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)を活性化させるｓｏｌＬＴαβの能力である。
リンホトキシン(ＬＴ)はＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、三量体サイトカインＬＴα３(ＬＴα３)として活性化リンパ球から分泌されるか、又は主としてＬＴα１β２として、膜貫通結合ＬＴβと細胞表面で複合体化する。本発明は、ＬＴα１β２とＬＴα２β１ヘテロ三量体の双方を検出するが、ＬＴα３は検出しないヒトＬＴαβに対する特異的なアッセイを提供する。このアッセイを使用し、本発明者は、表面ＬＴαβ複合体が、活性化したヒト極性化Ｔｈ１細胞の表面から脱落することをここに示す。ＴＡＣＥ(ＴＮＦα転換酵素)インヒビターが、細胞表面又はｍＲＮＡ発現に影響を及ぼさない状況で培養液中に脱落する可溶性ＬＴαβのレベルを低減させたので、メカニズムは、部分的にマトリックスメタロプロテイナーゼに依存する。ｓｏｌＬＴαβの循環レベルを、正常なドナーからの血清中で検出した。また、ｓｏｌＬＴαβを、ＲＡ患者からの血清、及び罹患関節から取り出された滑液においても検出した。血清中に見出されたｓｏｌＬＴαβレベルは、健常なドナーとＲＡ患者との間で類似していたが、ＲＡ関節からの滑液では、骨関節炎を患ってる患者からの滑液よりも、ｓｏｌＬＴαβが有意に高いレベルであった。さらに、ｓｏｌＬＴαβは、一次滑膜線維芽細胞を活性化させた。
可溶性ＬＴαβは、炎症促進メディエーターとして作用し得、ＲＡ患者における関連バイオマーカーである。
実施例１．アッセイ
この実施例は、ヒトＬＴα３及びＬＴαβに特異的な電気化学発光アッセイ(ＥＣＬＡ)について記載する。後続の実施例で使用される他のアッセイもまた記載する。
ヒトＬＴβＲ-Ｆｃを、以下のようにして構築した：細胞外ドメイン(１位から２２４位)を包含するヒトＬＴβＲを、ＬＴβＲ配列の下流のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする修飾されたｐＲＫ５発現ベクター中にクローニングした。ＣＨＯ細胞においてタンパク質を過剰発現させ、以前に記載されたようにして(Nature Immunology社のGrogan/Spits原稿)、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
マウスＬＴβＲ-Ｆｃを、以下のようにして構築した：細胞外ドメイン(１位から２２２位)を包含するマウスＬＴβＲを、ＬＴβＲ配列の下流のマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域をコードする修飾されたｐＲＫ５発現ベクター中にクローニングした。ＣＨＯ細胞においてタンパク質を過剰発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
Ａ．マウスＬＴアッセイ
マウスＬＴα３の測定のための電気化学発光アッセイ
可溶性のマウスＬＴα３を、１時間、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン(登録商標)２０に希釈した３５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＬＴαクローンＡＦ７４９(R&D Systems)で、High Bind９６-ウェルマイクロタイタープレート(Meso Scale Discovery)をコーティングすることにより測定した。ついで、ウェルを５％のウシ血清アルブミンを含む１５０ｕＬのＰＢＳで、１−２時間ブロックした。０．０５％のトゥイーン(登録商標)-２０を含むＰＢＳ(PBS/トゥイーン(登録商標))で６回、ウェルを洗浄し、組換えマウスＬＴα３(R&D Systems)、コントロール、及びアッセイ用希釈液(ＡＤ：ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン２０、１０ｐｐｍのプロクリン(Proclin))で希釈した未知の検査用試料の滴定曲線を、２５μｌ／ウェルで添加し、２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／トゥイーン(登録商標)で６回洗浄し、SULFO-TAG(登録商標) NHS(Meso Scale Discovery)で標識された抗ＬＴαモノクローナル抗体(Ｎ３ＥＶ)(Genentech)を、アッセイ用希釈液に３ｕｇ／ｍｌまで希釈し、１時間、２５μｌ／ウェルでウェルに添加した。プレートをバッファーで６回洗浄し、Ｈ２０に１：２で希釈された１５０μｌ／ウェルのリード(Read)バッファーＴ(Meso Scale Discovery)をプレートに添加した。プレートをMA6000 SECTORＴＭ画像装置(Meso Scale Discovery)ですぐに読み取った。計量した４-パラメーター適合曲線を、得られた標準曲線値からXLFit(Guildford, UK)を使用してプロットし、未知の濃度を外挿した。
マウスＬＴαβの測定のための電気化学発光アッセイ
可溶性のマウスＬＴα３を、ストレプトアビジンでコーティングされた９６-ウェルマイクロタイタープレート(Meso Scale Discovery)を使用して測定した。ついで、ウェルを５％のウシ血清アルブミンを含む１５０ｕＬのＰＢＳで、１−２時間ブロックした。ウェル当たり２５ｕＬの、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン(登録商標)で希釈された１μｇ／ｍｌのマウスＬＴβ-Ｆｃ-ビオチン(R&D Systems)を、ブロックされたプレートと共に、３０分インキュベートした。ウェルを０．０５％のトゥイーン(登録商標)-２０(ＰＢＳ／トゥイーン(登録商標))を含むＰＢＳで６回洗浄し、組換えマウスＬＴα１β２(R&D Systems)、コントロール及び高塩分アッセイ用希釈液(ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン(登録商標)２０、１０ｐｐｍのプロクリン、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＢＧＧ、０．２５％のＣＨＡＰＳ＋３．５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４)で希釈された未知の検査用試料の滴定曲線を、２５μｌ／ウェルで添加し、２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／トゥイーン(登録商標)で６回洗浄し、SULFO-TAG(登録商標) NHS(Meso Scale Discovery)で標識された抗ＬＴαモノクローナル抗体(Ｎ３ＥＶ)(Genentech)を、アッセイ用希釈液に３ｕｇ／ｍｌまで希釈し、１時間、２５μｌ／ウェルでウェルに添加した。プレートをバッファーで６回洗浄し、Ｈ２０に１：２で希釈された１５０μｌ／ウェルのReadバッファーＴ(Meso Scale Discovery)をプレートに添加した。プレートをMA6000 SECTORＴＭ画像装置(Meso Scale Discovery)ですぐに読み取った。計量した４-パラメーター適合曲線を、得られた標準曲線値からXLFit(Guildford, UK)を使用し、未知の濃度を外挿した。
Ｂ．ヒトＬＴアッセイ
ヒトＬＴα３の測定のための電気化学発光アッセイ
ヒトＬＴα３標準体を、以下のようにして室内で産生させた：ヒトＬＴαの細胞外ドメインのコード化配列(P.W. Grayら, 1984, Nature 312:721-724)を、プラスミドｐＢＲ３２２(JG Sutcliffe, 1978, Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 43:77)において、ｔｒｐプロモーターとリボソーム結合部位(DG Yansura and DJ Henner, 1990, Methods in Enzymology 185:54-60)の下流に融合させ、大腸菌中に、このタンパク質のための発現コンストラクトを生じせしめた。小規模なタンパク質誘導を、一晩、ＬＢ培養体をＭ９最小培地(J Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A labatory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)においては(２０Ｘ)、又はＣＲＡＰ培地(LC Simmonsら, 2002, J. Immunol. Methods 263:133-147)においては(１００Ｘ)に希釈することにより、振揺フラスコ中で実施した。ついで、一晩３０℃で振揺しつつ、誘導を進行させた。次の日、ＳＤＳ ＰＡＧＥによる発現分析のために、試料を取り出し、細胞ペーストのバルクを遠心分離し、精製前に凍結させた。ＬＴα３を発現する大腸菌ペーストを顕微溶液化により抽出し、ＬＴα３を、アルファに記載されているように、イオン交換及びゲル濾過工程の組合せにより精製した(P.W. Grayら, 1984, Nature 312:721-724)。
High Bind９６-ウェルマイクロタイタープレート(Meso Scale Discovery(MSD), Gaithersburg, MD)に、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０(ＰＢＳ／トゥイーン)で２μｇ／ｍｌまで希釈された５ｕＬのヤギ抗ヒトＬＴαクローンＡＦ２１１(R&D Systems)をスポット化し、室温で１時間、インキュベートした。攪拌しつつ、ウェルを１５０ｕＬのＰＢＳ＋５％のＢＳＡで１−２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで６回洗浄し、組換えヒトＬＴα３(Genentech Inc.)、コントロール、及び高塩分アッセイ用希釈液(ＨＳＡＤ：ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２０％のＢｇＧ、０．３５ＭのＮａＣｌ、１０％のＦＢＳ)で希釈された検査用試料の滴定曲線を、２５μｌ／ウェルで添加し、攪拌しつつ、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで６回洗浄し、ＡＤにおいて２ｕｇ／ｍｌまで希釈された 抗ＬＴαビオチン化ＰＡｂ(BAF-211, R&D Systems)を、２５μｌ／ウェルで添加し、攪拌しつつ、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＡＤに希釈された５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン-Sulgo-TAG(登録商標)(ＭＳＤ)を２５μｌ／ウェルで添加し、攪拌しつつ、プレートを３０分インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで６回洗浄し、Ｈ２０に１：２で希釈された１５０μｌ／ウェルのReadバッファーＴ(ＭＳＤ)をウェルに添加した。製造者に従い、プレートをMA6000 SectorＴＭ画像装置(ＭＳＤ)で読み取った。計量した４-パラメーター適合曲線を、XLFit(Guilはdford, UK)を使用してプロットし、未知の値を外挿した。
別のプロトコルは以下の通りである：High Bind９６-ウェルマイクロタイタープレート(ＭＳＤ)を、ＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０(Sigma)に４ｕｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＬＴα ＡＦ２１１が入ったものでコーティングし、ヒト血清サイトカインアッセイ希釈液(ＳＣＡＤ)(ＭＳＤ)でブロックした。ついで、プレートを上述したようにしてプロセシングした。
ヒトＬＴβの測定のための電気化学発光アッセイ
High Bind９６-ウェルマイクロタイタープレート(ＭＳＤ)に、ＰＢＳ／トゥイーンで希釈された２５μｇ／ｍｌの組換えヒトＬＴβＲ-Ｆｃ融合タンパク質(Genentech Inc.)、５ｕＬをスポット化し、室温で１時間、インキュベートした。ウェルをブロックし、上述したようにして洗浄し、組換えヒトＬＴα１β２(R&D Systems)、コントロール、及びＡＤで希釈された検査用試料の滴定曲線を、２５μｌ／ウェルで添加し、攪拌しつつ、プレートを２時間インキュベートした。プレートを上述したようにして洗浄し、ＡＤにおいて１ｕｇ／ｍｌまで希釈された 抗ＬＴαビオチン化ＰＡｂ(BAF-211, R&D Systems)を、２５μｌ／ウェルでウェルに添加し、攪拌しつつ、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-Sulgo-TAG(登録商標)(Meso Scale Discovery)と共にインキュベートし、ＭＳＤリードバッファーで展開させ、MA6000 SectorＴＭ画像装置(Meso Scale Discovery)で読み取り、上述したようにしてプロットした。
Ｃ．ＴＮＦαアッセイ
ヒトＴＮＦ-αの測定のための電気化学発光アッセイ
可溶性のヒトＴＮＦ-αを、製造者の使用説明書に従い、ヒト９６-ウェルＴＮＦ-αキット(K111BHA-4, Meso Scale Discovery)を使用して検出した。
マウスＴＮＦ-αの測定のための電気化学発光アッセイ
可溶性のマウスＴＮＦ-αを、製造者の使用説明書に従い、９６-ウェルｍｕＴＮＦ-αキット(K112BHA-4, MSD)を使用して定量した。
ｈｕＬＴαβに特異的なアッセイを開発するために、ｈｕＬＴβＲ-Ｆｃ融合タンパク質を捕獲用に使用した。結合したＬＴαβをポリクローナル抗ＬＴα-ビオチン抗体(クローン211, R&D Systems)で検出した(アッセイ概略図を図１Ａに示す)。ＬＴαβについての定量下限(ＬＬＯＱ)は、５０％のヒト血清で２０ｐｇ／ｍＬである。本発明者は、ヒト組換えＬＴαβ三量体、並びに他のＴＳＦリガンドＬＴα３、及びＴＮＦ-α(ＴＮＦアルファ)で、ＬＴβＲに結合しないものを検出するためのアッセイを試験した。ＬＩＧＨＴはＬＴβＲに結合するが、抗ＬＴα検出抗体によっては検出されない。このアッセイにおける種々の組換えタンパク質の検出を、図１Ｂに示す。ＴＮＦ-α及びＬＩＧＨＴは認識されていない。さらに、ＬＴβＲは、結合するにはＬＴβサブユニットを必要とするため、アッセイではＬＴα３は認識されない。しかしながら、アッセイではＬＴα１β２とＬＴα２β１の双方が検出される。
このアッセイが天然の可溶性ＬＴαβを検出できることを証明するため、安定に形質移入された２９３-ｈｕＬＴαβ(ヒトＬＴαβ)発現細胞からの上清を評価した。以下の実施例２を参照。
実施例２−ｓｏｌＬＴαβはインビトロにおいて活性化されたリンパ球から脱落する
この実施例は、ＬＴαβが活性化リンパ球から脱落し、末梢、例えば血清又は滑液において、可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)が生じることを示す。
全ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、ＰＢＭＣから単離した。細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂ及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下、完全ＤＭＥＭ培地(１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、２μＭの２-ＭＥ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマシンが捕捉されたＤＭＥＭ)中で培養した。ヒトＴｈサブセット極性化条件は以下の通りであった：Ｔｈ０：５μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ-１２、５μｇ／ｍｌの抗ｈＩＦＮ-γ １μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ-４；Ｔｈ１：１ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ-１２、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ-γ、１μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ-４；Ｔｈ２：５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ-４、５μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ-１２、６μｇ／ｍｌの抗ｈＩＦＮ-γ；Ｔｈ１７：１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ-２３、１０μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ-１２、１０μｇ／ｍｌの抗ｈＩＦＮ-γ。Ｔ細胞を、示された量のＴＮＦαプロテアーゼインヒビター１(ＴＡＰＩ-１)(Peptides International)又はコントロールとしてのＤＭＳＯと共に、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８で再刺激した。
再刺激の１日及び２日後、細胞をＦＡＣＳ及びＲＮＡ調製のために収集した；培養上清をＬＴ及びＴＮＦ-α定量化のために収集した。
染色に使用される抗体は、以下の通りである：ＦＩＴＣ-又はＰｅｒＣＰ-抗ＣＤ４、ＰＥ-抗ＣＤ２５、及びＡｌｅｘａ-６４７-抗ｍＩｇＧ２は、BD Biosciencesから購入し；抗ＬＴアルファ、及びＬＴβＲ−Ｆｃは、Alexa Fluor 647タンパク質標識化キット(Invitrogen)を使用して、Ａｌｅｘａ-６４７-コンジュゲートさせた。CellQuest Pro v.5.1.1ソフトウェア(BD Biosciences)を使用し、FACSCaliburフローサイトメーターで試料を獲得し、データ分析をFlowJo v6.4.2ソフトウェア(Tree Star, Inc.)を使用して実施した。生存細胞を、順方向及び側方散乱に基づき通門することにより同定した。細胞のＣＦＳＥ標識化のために、細胞を室温で５分間、５ｕＭのＣＦＳＥと共にインキュベートし、続いてＰＢＳで４回洗浄した。絶対細胞数を決定するために、フローサイトメトリーによる分析の前に、CaliBRITE APCビース(BD Biosciences)を添加し、製造者の使用説明書に従い、全細胞数を測定した。
ＳｏｌＬＴαβを、ヒトＬＴα３及びＬＴαβに対して特異的な電気化学発光アッセイ(ＥＣＬＡ)により測定する。(上の実施例１(アッセイ)を参照)。ＬＴαβについて、このレセプターはＬＴβに特異的に結合し、一又は複数のβサブユニットを含むＬＴ三量体を排他的に捕捉するため、ヒトＴβＲ-Ｆｃ融合タンパク質を捕捉用に使用した。アッセイはヒト組換えＬＴαβ複合体(ＬＴα１β２及びＬＴα２β１)を同様に検出するが、ヒト組換えＬＴα３又は他のＴＮＦ-ＳＦメンバー、ＴＮＦα及びＬＩＧＨＴは認識しなかった(図１Ｂ)。アッセイが天然の可溶性ＬＴαβを検出可能であることを確認するため、安定した２９３-ｈｕＴαβ発現細胞系からの上清を評価した。２９３細胞におけるヒトＬＴαβの発現：２９３細胞を、全長ヒトＬＴα及びヒトＬＴβ(ヒトＬＴα配列 GenBank Ref NM_000595；ヒトＬＴβ配列 GenBank Ref NM_002341)で形質移入させ、安定したヒトＬＴαβ-発現細胞系を生成させた。２９３-ｈｕＬＴαβ形質移入体は、表面ＬＴαβ(図１Ｃ)を発現し、上清は高レベルの分泌ＬＴα(２８７±１８ｎｇ／ｍＬ)及び低レベルの可溶性ＬＴαβ(５．５±０．５１ｎｇ／ｍＬ)を含有していたが、予期したようにＴＮＦαは検出されなかった(図１Ｄ)。
活性化されたＴヘルパー細胞は、可溶性ＬＴα３ホモ三量体を分泌し、それらの表面にＬＴα１β２を発現する。ＬＴα１β２は、再活性化の２４時間後、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７の条件下、極性化した細胞の表面で検出されるが、Ｔｈ２細胞におけるレベルは有意に低く、活性化７２時間後には完全になくなり、以前の報告と一致した(Gramagliaら，リンホトキシンアルファベータは、最近活性化した天然のＴｈ１-様ＣＤ４細胞では発現するが、Ｔｈ２分化中、ＩＬ-４によりダウンレギュレーションされる。J Immunol 1999;162(3):1333-8)(Grogan, 提出された原稿)。一次ヒトＣＤ４＋ＬＴαβ−リンパ球も可溶性ＬＴαβを脱落させるかどうかを測定するために、２日目に、活性化した極性 Ｔヘルパー細胞からの上清を検査した(図２Ａ)。ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-１７、ＩＬ-２２及びＩＬ-４についての細胞培養上清を分析し、これらの細胞の極性化を確認した(Grogan, 提出された原稿)。たとえ低レベルであっても、ＬＴα３及びＴＮＦαが検出される時は、培養上清に可溶性ＬＴαβが検出された。ＬＴαβは活性化リンパ球から積極的に切断される。
実施例３−活性化ヒトＴ細胞はＡＤＡＭ１７プロテアーゼ切断によりＬＴαβを脱落させた
この実施例は、活性化Ｔ細胞によるＬＴαβの脱落におけるメタロプロテイナーゼ切断の役割を例証する。
ＬＴαβ複合体がメタロプロテイナーゼ切断により脱落するかどうかを決定するために、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼによるＴＮＦαの切断を阻害することが知られている、ＴＮＦαプロテアーゼインヒビター１(ＴＡＰＩ-１)を、ヒトＣＤ４＋Ｔｈ１細胞で検査した。培養上清を、ＴＡＰＩ-１の存在又は不在下で、再活性化の１日後に、ｓｏｌＬＴαβ、ＬＴα３及びＴＮＦαについて分析した(図２Ａ及びＢ)。上の実施例２におけるようにして、Ｔ細胞を収集し、培養し、極性化させた。
休止Ｔｈ１極性化リンパ球からの培養上清は、低レベルのｓｏｌＬＴαβ(０．１０ｎｇ／ｍＬ＋／−０．０６)を含んでおり、再活性化の１日後、約８倍増加していた(０．７８ｎｇ／ｍＬ＋／−０．４０、ｎ＝３)。上清ＬＴα３及びＴＮＦα中の増加もまた再活性化細胞において観察された。ＴＡＰＩ-１処置により、用量依存的形式で、再活性化細胞の上清中の可溶性ＬＴαβのレベルが低下した(２−７倍)。分泌されたＬＴα３はＴＡＰＩ-１処置により影響を受けないが、脱落したＴＮＦα上清濃度は、予想通りに３−８倍低下した。ＴＡＰＩ-１処置された細胞の培養上清中におけるＬＴαβの低減は、細胞表面ＬＴの増加には付随せず(データは示さず)、又は細胞内ＬＴ ｍＲＮＡのレベル変化も伴わない(図２Ｃ)。
本実施例は、メタロプロテイナーゼ(ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１７)が、ＬＴαβ複合体が、他のＴＮＦ-ＳＦメンバー、例えばＴＮＦに類似した形で、細胞表面から切断される一メカニズムであることの直接的証拠を示す。ＴＡＰＩ-１(ＡＤＡＭ１７のインヒビター)は、活性化リンパ球の上清に検出されたＬＴαβの濃度を低下させた。よって、ＬＴαβは、ＡＤＡＭ１７によってもまた切断されうる。
実施例４．ＬＴα及びＬＴβ双方のサブユニットは、ウエスタンブロットにより、活性化したヒトリンパ球培養物上清において検出される
可溶性ＬＴβの切断断片の適切な大きさを実証し、ＬＴα及びＬＴβサブユニットの相対比を定量するために、抗ＬＴα抗体又はＬＴβＲ-Ｆｃのいずれかを使用し、リンホトキシン三量体を、活性化したヒトリンパ球培養上清から免疫沈降させた。
上の実施例２のようにして、Ｔ細胞を収集し、培養し、極性化させた。
製造者の使用説明書に従い、AminoLink Plus Immobilization Kit 44894(Pierce, Rockford, IL)を使用し、ヤギ抗ヒトＬＴα ＡＦ２１又はＬＴβＲ-Ｆｃとコンジュゲートさせた。それぞれ１ｍＬの極性化Ｔ細胞培養上清を、４℃で、１００μＬのコンジュゲートトリビーズと共に一晩インキュベートした。ビーズをＰＢＳ／０．０５％のトゥイーン２０／０．５％のＢＳＡで３回洗浄し；免疫複合体を変性させ、９０℃で５分、ＳＤＳ試料バッファー(Invitrogen)＋５％のβメルカプトエタノール(Sigma)においてインキュベートすることにより遊離させた。組換えＬＴα１β２(R & D Systems, Minneapolis MN)を標準体として使用した。分子量マーカー(Invitrogen)、標準体、及び試料を、１．５ｍＭの４-２０％トリス-グリセリンゲル(Invitrogen)において電気泳動させた。iBot(Invitrogen)を使用し、タンパク質をニトロセルロース膜に移動した。膜をLI-COR Biosciences(Lincoln, NE)ブロック用バッファーでブロックし、１００ｎｇ／ｍＬの抗ＬＴαＡＦ２１１-ビオチン(R&D Systems)及び５００ｎｇ／ｍＬの抗ＬＴβ１６８４(R&D Systems)を含有するLI-CORブロック用バッファーにおいて、一晩検査した。ブロットをＰＢＳ＋０．１％のトゥイーン-２０において、室温で洗浄し、ついで、第２の試薬；抗ｍｕＩｇ-染料Ｒ８００及びストレプトアビジン-染料ＩＲ６８０(LI-COR)で検査し、攪拌しつつ、室温で１時間、LI-CORブロック用バッファーにおいて１：１００００に希釈し、以前のように洗浄し、LI-COR IRリーダーにより画像を得た。
移動したタンパク質を含むブロットを、抗ＬＴα及び抗ＬＴβ特異的抗体の混合物で検査し、それぞれ赤と緑の蛍光で検出した。ヒトリンパ球から分泌されたＬＴαは、天然タンパク質の第１のＮ末端３４アミノ酸を欠く、R&Dからの組換えタンパク質よりも大きな、ＭＷ２６−３０ＫＤａのいくつかのグリコシル化型として移動した。また、ヒトリンパ球から脱落したＬＴβも、５３のＮ末端アミノ酸を欠く、R&Dから組換え可溶性ＥＣＤよりわずかに大きい、２８−３０ｋＤａの２つのグリコシル化形態として移動した(そのうちの４つはＥＣＤの一部である)。Ｔ細胞上清におけるＬＴβ断片の大きさは、膜表面でのその切断と、１９５アミノ酸のグリコシル化ＥＣＤの放出と一致した。予期したように、抗ＬＴαは上清からホモ-及びヘテロ-三量体複合体を免疫沈降させたため、抗ＬＴα-コンジュゲートビーズは、ＬＴβＲ-Ｆｃコンジュゲートビーズよりも多量のＬＴαを免疫沈降させた。
ＬＴαβは、インビトロで培養上清中に脱落し、ここに記載のアッセイは、ＬＴαβに対して特異的である。
実施例５．マウス炎症性疾患モデルの血清中におけるｓｏｌＬＴαβの増加
この実施例は、ＬＴαβが活性化リンパ球から積極的に切断され、炎症及び自己免疫疾患の前臨床動物モデルにおけるインビボでの循環に見出されることを例証する(ＣＩＡ及びＥＡＥ)。
ＥＡＥモデル
雌ＳＪＬ／Ｊマウスを、１００μｌのＰＢＳ及び１００μｌのＣＦＡに１５０μｇのペプチドＰＬＰ１３９-１５１が入ったものを含有する２００μｌのエマルションを用い、尾部の基部に、皮内的に免疫化した。１２日目、２−４スコアの動物を、異なる治療群に無作為化した。１００μｌのＰＢＳに、６ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体(コントロール抗体)、マウスＬＴβＲ-Ｆｃ、又はマウスＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃが入ったものを用い、研究期間中、週に３回、マウスを皮下的に治療した。トランスジェニックマウスについても、同様の等級付けシステムを使用し、臨床的徴候について、動物を毎日評価した。
臨床スコアにより測定される、実験用マウスモデルにおける、実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)の重症度は、抗ＬＴα抗体Ｓ５Ｈ３の投与により、ＣＴＬＡ-４-Ｆｃ分子で見られるのに匹敵する程、アイソタイプコントロールに対して低下していた。７０日目、血清を収集し、ｍｕＬＴαをＥＬＩＳＡにより分析した。よって、抗体治療により、再発寛解型ＭＳ等の、ＥＡＥモデルから予測される疾患を治療するのに効果的であろうことが、結果により示唆される。
関節炎の誘発及び治療：ＣＩＡモデル
ＲＡにおいて、複数の関節の滑膜は炎症し、骨及び軟骨を含む関節組織の破壊に至るおそれがある。ＲＡの滑膜は、実際は非常に炎症化するおそれがあり、典型的には、リンパ球及び単核細胞の浸潤、Ｔ細胞及び抗原提示細胞(ＡＰＣ)の活性化、Ｂ細胞免疫グロブリン(Ｉｇ)の分泌、及び炎症促進性サイトカインの産生により特徴付けられる(Potocnikら, Scand. J. Immunol., 31:213(1990)；Wernickら, Arthritis Rheum., 28:742(1985)；Ridleyら, Br. J. Rheumatology, 29:84(1990)；Thomasら, J. Immunol., 152:2613(1994)；Thomasら, J. Immunol., 156:3074(1996))。慢性的に炎症している滑膜には、通常、重度のＣＤ４ Ｔ細胞浸潤が付随する(Pitzalisら, Eur. J. Immunol., 18:1397(1988)；Morimotoら, Am. J. Med., 84:817(1988))。
コラーゲン誘発関節炎(ＣＩＡ)は、ヒト疾患に類似した、ヒトＲＡに対する動物モデルであり、異種性ＩＩコラーゲン(ＣＩＩ)で免疫化することにより、マウスの感受性系統において誘発されうる(Courtenayら, Nature, 283:665(1980)；Cathcartら, Lab. Invest., 54:26(1986))。ＣＩＩに対する抗体及びＣＤ４ Ｔ細胞の双方が、ＣＩＡの発症に必要である。ナイーブな動物への抗ＣＩＩの移動によってのみ、ＣＩＡとはかなり異なる部分的な組織病理に至り、ＣＩＡの完全な症状は発症しない(Holmdahlら, Agents Action, 19:295(1986))。対照的に、ナイーブなレシピエントに対してＣＩＩ-免疫化マウスからの抗ＣＩＩ抗体及びＣＤ４ Ｔ細胞の双方の養子移入により、古典的なＣＩＡの症状が、完全に再構築される(Sekiら, J. Immunol., 148:3093(1992))。また、ＣＩＡに抗体及びＴ細胞の双方が関与していることは、ＣＩＡにおいて炎症を起こした関節の組織病理の知見にも一致する。よって、Ｂ細胞又はＴ細胞の機能をブロックし、又はＴ細胞により誘発される炎症促進性サイトカインを阻害する薬剤は、関節炎の予防又は治療に効果的でありうる。実際、ＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇、ＣＤ４０-ＣＤ４０Ｌ相互作用の封鎖、ＴＮＦ−ａの中和、又はＩＬ-１レセプターのブロックにより、マウスにおけるＣＩＡの予防に至らしめることができる(Mainiら, Immunol. Rev., 144:195(1995)；Joostenら, Arthritis Rheum., 39:797(1996)；Durieら, Science, 261:1328(1993))。
ここで使用されるＣＩＡモデルにおいて、ＤＢＡ-１Ｊマウスは、０日目及び２１日目に、１００μｌの完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)に、１００μｇのウシコラーゲンＩＩ型が入ったもので、皮内的に免疫化した。免疫化の２４日後、マウスを無作為に、治療群に分割した。１００μｌのＰＢＳに、６ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサＩｇＧ２ａモノクローナル抗体(コントロール抗体)又はマウスＬＴβＲ-Ｆｃが入ったものを用い、動物を皮下的に治療した。動物を、研究期間中、週に３回、マウスを皮下的に治療した。動物の肢を、各関節について１−４の等級付けシステムを使用し、関節浸潤の徴候について、毎日検査し、最大スコア１６が付与された。サイトカイン(例えば、ＬＴα及びＴＮＦα)分析用に、血清を３５日目に収集した。
上昇したｓｏｌＬＴαβレベルが、ｍｕＬＴβＲ-Ｆｃ(免疫グロブリンのＦｃ領域にコンジュゲートした組換えマウスＬＴβレセプター)を用いて、１１日間治療したマウスの血清で検出されたが、アイソタイプコントロール抗体又はＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃ(ＥＡＥ、図３；ＣＩＡ、図４Ａ)で処理されたものでは検出されなかった。これにより、双方のマウスモデルにおいて、ＬＴβＲ-Ｆｃに結合したリガンド、ＬＴαβの血液循環における安定性が示唆される。循環ＬＴレベルは正常なマウス、又はアイソタイプコントロール抗体で治療された罹患マウスでは検出されなかった(データは示さず)。同様に、ＴＮＦ-αの増加レベルは、ＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃで治療されたマウスにおいて検出された(図４Ｂ)。
実施例６．可溶性ｈｕＬＴαβ複合体はＨｕＳＣＩＤ ＧＶＨＤモデルの血清中で検出される
この実施例は、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)モデルにおけるＬＴαβを検査するものであり、免疫担当マウス中の活性化ヒトリンパ球がヒトＬＴαβを発現していることを示す。免疫担当細胞が免疫抑制された又は耐性のある患者に移植された場合に、ＧＶＨＤが生じる。ドナーＴ細胞は宿主抗原を認識し、活性化され、サイトカインが分泌され、エフェクター細胞に増殖し分化する。この反応は移植片対宿主反応(ＧＶＨＲ)として知られている。ＧＶＨＲ反応は多臓器症候群であり、効果は生命にかかわる重度の炎症から、下痢及び体重減少といった軽度の症例まで多様である。マウスにおけるＧＶＨＤモデルは、骨髄移植及び自己免疫疾患後に生じる急性及び慢性ＧＶＨＲの臨床疾患をモデル化するために使用された。一般的手順は、Current Protocols in Immunology, 上掲,ユニット4.3に記載されている。この場合、ヒトＰＢＭＣはFICOLＴＭ勾配による正常なドナーのLEUKOPACKＴＭから精製された。
ヒト末梢血単核細胞は、重症の複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスに移植された場合、移植片対宿主病を生じる。ＳＣＩＤマウスを、正常なドナーのロイコパックから精製されたヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を用いて再構成した。ヒト白血球が移植されたＳＣＩＤマウスは重度の移植片対宿主病を発症した。全てのマウス(ｎ＝１０／群)に、セシウム１３７源を使用し、致死量以下の３５０ラドを照射した。照射の２時間後、２００ｕｌのＰＢＳに５０００万のヒトＰＢＭＣ細胞／マウスが入ったものを、マウスに静脈注射した。細胞の注入直後に、週に２回、１００ｕｌの生理食塩水に、３００ｕｇのトラスズツマブ(ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールＡｂ)又はＣＴＬＡ-４-Ｆｃが入ったものを用いて、ＩＰ処置した。ＣＴＬＡ-４-ＦｃはＴ細胞活性化を阻害し、移植片対宿主反応を低下させる。ＣＴＬＡ-４-Ｆｃを、ＣＴＬＡ-４配列の下流のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードする修飾されたｐＲＫ５発現ベクター中にクローニングしたマウスＣＴＬＡ-４の細胞外ドメイン(１位から１６０位)を用い、実施例１におけるマウスＬＴβＲ-Ｆｃを生じせしめるために使用されたものと類似の方式で生成した。POLYMYXINＴＭ B１１０ｍｇ／リットルとネオマイシン１．１ｇ／リットルを、照射の５日後に、飲料水に添加した。生存により示される移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)について、マウスをモニターした。
マウスから採血し、血清を収集し、１日目にｈｕＬＴαβ ＥＣＬＡにより分析した。
可溶性のヒトＬＴαβが、約３５０ｐｇ／ｍｌのレベルでマウスの血清から検出され、ヒトリンパ球の活性化を抑制するＣＴＬＡ-４-Ｆｃを用いて治療されたマウスでは、検出不可能なレベルまで、少なくとも７倍低下した。図５には、脱落したヒトＬＴαβ複合体が、ＣＴＬＡ-４-ＦｃＢで処置されたｈｕＳＣＩＤマウスでは検出されなかったが、コントロール抗体(ハーセプチン)で処置されたｈｕＳＣＩＤマウスでは高レベルで検出されたことが示されている。ヒトＬＴαβアッセイは、マウスＬＴαβと交差反応しない。
ヒトＴ細胞活性化のｈｕＳＣＩＤインビボモデルは循環ＬＴレベルの上昇を示す。
実施例７．ＲＡ患者の血清及び滑液中での循環末梢ＳｏｌＬＴαβ
この実施例は、ＬＴαβが活性化リンパ球から脱落して、可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)が生じ、ｓｏｌＬＴαβがＲＡ患者の血清及び滑液において同定可能であることを示す。
血清試料を、健常なヒトドナー、及びＲＡについての1987 American College of Rheumatology基準を満たす患者から収集した。滑液試料を、ＲＡ又は骨関節炎(ＯＡ)と診断された患者から収集した。全ての健常なコントロール及び患者から同意書を得た。血液試料を同意している健常なドナーから採取した。遠心分離により、血清を凝集した細胞性部分から分離させ、−８０℃でアリコートにて凍結させた。
２３人の正常なドナー及び１００人のＲＡ患者からの血清を、ＬＴα３、ｓｏｌＬＴαβ、及びＴＮＦαについて分析した。実施例１に記載したアッセイを使用して、可溶性ＬＴαβを、可溶性ＬＴα３ホモ三量体よりも約２０倍高いレベルで、正常及びＲＡの血清中で検出された(図６Ａ)。ｓｏｌＬＴαβ、ＬＴα３及びＴＮＦαの平均レベルは、正常なドナーとＲＡ患者との間に有意差はなかったが、ＴＮＦαのレベルは、ＲＡ患者では約５０％上昇していた。
炎症誘発性サイトカインは、損傷を受けた組織の部位で上昇しており、よって３１人のＲＡ患者及び３３人の骨関節炎(ＯＡ)患者の炎症関節からの滑液を、ｓｏｌＬＴαβ、ＬＴα３、及びＴＮＦαレベルについて分析した(図６Ｂ)。ＲＡ滑液は平均２７、５９、及び５２ｐｇ／ｍＬのＬＴα３、ｓｏｌＬＴαβ、及びＴＮＦαをそれぞれ含んでおり、ＯＡ滑液は、かなり少ない量しか含有していなかった(それぞれ、平均２．７、２１、及び５．９ｐｇ／ｍＬのＬＴα３、ｓｏｌＬＴαβ、及びＴＮＦα)。ＲＡ患者の血清において、ＬＴα３とｓｏｌＬＴαβレベルの間には弱い関係性があり(Ｒ２＝０．３７)、基底にあるメカニズムが双方のレベルに影響しうることが示唆される。分析されたＲＡ患者の滑液においてＬＴα３とＬＴαβとの間の相関は明らかではなかった(Ｒ２＝０．２４)。
ＬＴαβはヒト関節炎患者の滑液で検出される。ＲＡにおけるＬＴαβレベルは、健常なコントロールよりもわずかに高いが、滑液におけるレベルはＯＡ患者よりも有意に高い。他の炎症性ケモカイン及びサイトカインの滑液レベルもまた、ＲＡ対ＯＡ患者において、より高くなる傾向がある。
実施例８．可溶性ＬＴαβはＲＡ患者からの滑膜線維芽細胞を活性化する
この実施例は、ＲＡにおいて、機能的炎症誘発性サイトカインとして作用する可溶性ＬＴαβヘテロ三量体の能力を調べる。我々は、ＬＴα３アイソフォームと共に、ＲＡ患者から単離された原発性線維芽細胞様滑膜細胞(ＦＬＳ)における、炎症促進性ケモカイン、サイトカイン、及び接着分子の発現を誘導するその能力を評価した。
この実施例では、可溶性ＬＴαβヘテロ三量体を昆虫細胞において、以下のようにして発現させた：ヒトＬＴβ遺伝子(Ｃ末端がｈｉｓでタグ化されている)の細胞外コード化領域の１８７アミノ酸のカルボキシ末端部分と、ヒトＬＴα遺伝子(Ｎ末端がｆｌａｇでタグ化されている)の細胞外コード化領域の１６２アミノ酸のカルボキシ末端部分を、ｐＡｃＧＰ６７Ｂバキュロウイルス発現ベクター(Pharmingen)中にクローニングし、ウイルスをこれら２つのコンストラクトを用いて生成させた。昆虫Ｔｎｉ細胞を、タンパク質を含まない培養培地中で、２７℃で３日間、双方のウイルスで同時感染させた。感染した培養培地を、Ｎｉ-ＮＴＡ、抗ｆｌａｇ Ｍ２カラム、ついでＱＨＰ、及びＳ２００サイズ排除カラムで精製し、ＬＴα１β２タンパク質を精製した。
全ＲＮＡを、Qiagen RNeasyミニキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。製造者のプロトコル(Applied Biosystems, Foster City, CA)に従い、Taqman一ステップＲＴ-ＰＣＲマスターミックスキットを具備するABI 7500リアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biosystems)でリアルタイムＲＴ-ＰＣＲを実施した。使用したプライマー及びプローブは以下の通りである：
ＬＴα
プローブ：５'-ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＡＣ-３'(ＦＡＭ-ＴＡＭＲＡ)(配列番号：２)；
順方向：５'-ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＣＴ Ｃ-３'(配列番号：３)；
逆方向：５'-ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＧＴ ＡＧＡ-３'(配列番号：４)。
ＬＴβ
プローブ：５'-ＡＣＧ ＴＡＣ ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＣＧ ＣＣＣ ＣＴＣ Ｃ-３'(ＦＡＭ-ＴＡＭＲＡ)(配列番号：５)；
順方向：５'-ＡＣＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＣＡ-３'(配列番号：６)；
逆方向：５'-ＣＡＴ ＡＴＣ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＴ ＧＴＴ-３'(配列番号：７)。
ＴＮＦ-α
プローブ：５'-ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＡＧＧ-３'(ＦＡＭ-ＴＡＭＲＡ)(配列番号：８)；
順方向：５'-ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＡＴ-３'(配列番号：９)；
逆方向：５'-ＡＡＴ ＡＧＴ ＡＧＧ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＡ-３'(配列番号：１０)。
ＲＰＬ１９
プローブ：５'-ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｃ-３'(ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ)(配列番号：１１)；
順方向：５'-ＧＣＧ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＣＡ-３'(配列番号：１２)；
逆方向：５'-ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＧ-３'(配列番号：１３)；
ＩＬ-８
プローブ：５-ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＧＣ-３'(ＦＡＭ−ＢＨＱ１)(配列番号：１４)；
順方向：５'-ＣＴＣ ＴＣＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＧ-３'(配列番号：１５)；
逆方向：５'-ＣＴＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＧＣ-３'(配列番号：１６)。
次のヒトプライマー／プローブセットをＡＢＩ(Applied Biosystems, Foster City, CA)から購入した：ＩＬ６−Ｈｓ９９９９９０３２＿ｍ１；ＣＸＣＬ１−Ｈｓ００２３６９３７＿ｍ１；ＣＸＣＬ２−Ｈｓ００２３６９６６＿ｍ１；ＩＣＡＭ１−Ｈｓ９９９９９１５２＿ｍ１；ＶＣＡＭ１−Ｈｓ００３６５４８５＿ｍ１。全てのアッセイを３回実施し、データをＲＰＬ１９に対して正規化した。
原発性滑膜線維芽細胞の単離を以下のようにして実施した：1987 ACR基準を満たすＲＡ患者から得られた滑膜組織を、バイオプシーの２４時間後にプロセシングした。組織を、ＲＰＭＩ培地において３７℃で９０分、攪拌しつつ、５０μｇ／ｍＬのコラゲナーゼＶＩＩＩ型にて消化させた。消化させた組織混合物を７０μｍのメッシュ細胞濾過器を通して濾過し、ＤＭＥＭで２回洗浄した。細胞を計数し、ＤＭＥＭに１ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。培養の２４時間後、非接着細胞を吸引し、接着細胞上に新鮮培地を置き換えた。細胞を９０％コンフルエンスで継代し、全ての実験の継代数が５を超えないようにした。滑膜線維芽細胞培養物は＞９９％純度であり、フローサイトメトリーを用いたＣＤ１４染色によりアッセイした場合に、マクロファージ混入がなかった。
培養したＦＬＳを、３００ｎｇ／ｍＬのＬＴαβ又は１００ｎｇ／ｍＬのＬＴα３又は培地単独(コントロール)のいずれかと共に、３７℃で６時間インキュベートした。第２の実験において、ＦＬＳをＬＴａｂ又はＬＴａ３単独で、又は２５μｇ／ｍＬのＬＴβＲ-Ｆｃ又はＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃの存在下で刺激した。双方の実験において、全ＲＮＡを細胞から精製し、上述したヌクレオチド配列を使用し、図４に示す遺伝子について、定量的ＰＣＲを実施した。
ＬＴαβと共にＦＬＳを培養すると、ＣＸＣＬ１(ＧＲＯα)、ＣＸＣＬ２(ＧＲＯβ)、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＶＣＡＭ-１及びＩＣＡＭ-１についての転写が容易に誘発される結果となった(図７Ａ)。またＬＴα３はこれらの遺伝子を誘導可能であったが、増加した生物学的強度を伴った(図７Ｂ)。これらのサイトカイン／サイトカインレセプター相互作用の特異性を確認するために、我々は、ＬＴβＲ-Ｆｃ又はＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃの存在下でのＬＴαβ又はＬＴα３を用いたＲＡ ＦＬＳの刺激を実施した。図７Ｃに示すように、ＬＴβＲ-Ｆｃは、ＬＴαβにより誘発される炎症誘発性遺伝子の発現をブロックしたが、ＴＮＦＲＩＩ-Ｆｃはブロックせず、またＴＮＦＲＩＩ-ＦｃはＬＴα３により誘発される遺伝子発現をブロックしたが、ＬＴβＲ-Ｆｃはブロックしなかった。よって、ＬＴαβ及びｓｏｌＬＴα３三量体アイソフォームの双方がサイトカインとして作用し、原発性ＲＡ ＦＬＳにおける炎症誘発性遺伝子の発現を駆動する。
実施例９−統計学的方法
この実施例は、バイオマーカー予測に有用な方法を示す。
統計的タスクは以下の工程を含むことができる：
１．候補バイオマーカーの事前選択
２．関連性のある臨床効果の応答性予測共変数の事前選択
３．一変数レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
４．一変数レベルでの臨床的共変数を含む、バイオマーカー予測関数の選択
５．多変数レベルでのバイオマーカー予測関数の選択
６．多変数レベルでの臨床的共変数を含む、バイオマーカー予測関数の選択
以下の説明は、異なった工程を詳述するものである：
１：候補バイオマーカーの事前選択：候補バイオマーカーの統計的事前選択は、臨床的有益性の測定に関連してた強度に向けられている。この目的のために、種々の臨床的エンドポイントは、誘導された代理スコア、例えば観測打ち切りを回避するＴＴＰに関する臨床的有益性スコアの程度の順序割当に変換されうる。これらの代理変換測定は、例えば非パラメトリックスピアマン順位相関アプローチにより、簡単な相関関係分析に容易に使用することができる。代替法は、回帰モデルの発症時間(time-to-event regression models)における計量的共変数(metric covariates)として、例えばコックス比例ハザード回帰として、バイオマーカー測定を使用する。バイオマーカー値の統計的分布に応じて、この工程には、いくつかのプレ-プロセシング、例えば分散安定化変換として、また適切な尺度、又は未加工測定の代わりにパーセンタイルを使用する等の標準化工程の使用が必要となるかもしれない。さらなるアプローチは、例えば一人の患者を基準に、(ｘ軸＝バイオマーカー値、ｙ軸＝臨床的有益性の測定値)の散乱を示すことにより、二変数散布図の検査である。例えば、平滑化スプラインにより達成された場合、いくつかの非パラメトリック回帰線は、バイオマーカーと臨床的有益性との関連性を視覚化するのに利用することができる。
これらの異なるアプローチの目的は、使用される有益性測定の少なくとも一において、臨床的有益性とある程度の関連性を示す候補バイオマーカーを事前選択することであり、他の測定についての結果と矛盾しない。利用可能なコントロール群が存在する場合、種々の治療群における、臨床的有益性とバイオマーカーとの間の関連性での差異は、さらなる考察に適したバイオマーカー(類)を作成する、差異予測の兆候とすることができる。
２：関連性のある臨床効果の応答性予測共変数の事前選択：ここに定められた臨床的共変数の統計的事前選択は、事前選択されたバイオマーカーについてのアプローチと類似しており、また臨床的有益性の測定に関連してた強度に指向している。それで、原則的には、上述した１で考慮された、同様の方法が適用される。統計的基準に加え、臨床経験からの基準及び理論的知識が、関連する臨床的共変数を事前選択するのに適用され得る。
臨床的共変数の予測値は、バイオマーカーの予測値と相互作用する可能性がある。それらは、必要であるならば、予測規則を改善するために考慮されるであろう。
３：一変数レベルでのバイオマーカー予測関数の選択：「予測関数」なる用語は一般的な意味に使用され、標的予測を暗示するためにスケーリングされた数をもたらす、バイオマーカー測定の数的関数を意味する。
簡単な例は、特定のカットオフｃとバイオマーカー測定ｘについてのヘビサイド関数の選択であり、二元予測Ａ又はＢは次のように作成される：
Ｈ(ｘ-ｃ)＝０ならば、Ａを予測。
Ｈ(ｘ-ｃ)＝１ならば、Ｂを予測。
これは、予測規則において、一変数バイオマーカー測定を使用する、おそらくは最も一般的な方法である。上述したように、「予測関数」の定義は、予測可能性を調査するのに使用可能な、現存するトレーニングデータセットへの照会を含む。トレーニングセットから、適切なカットオフｃを得るために、別の経路を取ることもできる。まず、１に記載された平滑化スプラインを用いた散布図を使用し、カットオフを定める。また、分布のいくつかのパーセンタイルは、例えばメジアン又は四分位値を選択することができる。またカットオフは、臨床的有益性の測定に関する予測可能性に従い、全ての可能なカットオフを調査することにより、体系的に抽出することができる。次に、マニュアル選択を可能にする、又は最適化のためのいくつかの探索アルゴリズムを使用するために、これらの結果をプロットすることができる。このことは、コックスモデルを使用する、ある種の臨床的エンドポイントをベースにして理解することができ、各テストカットオフにおいて、バイオマーカーは二元共変数として使用されている。次に、臨床的エンドポイントからの結果を、双方のエンドポイントに沿った予測を示すカットオフを選択するために、共に考慮することができる。
予測関数を選択するための、他の一般的ではないアプローチは、共変数として、バイオマーカー値(可能ならば変換されたもの)を有するトレーニングセットから得られた、固定パラメーターコックス回帰モデルに基づく。さらなる可能性は、いくつかの尤度比(又は、その単調変換)における判断に基づいており、標的確率密度は、予測状態の分離用のトレーニングセットにおいて、事前決定される。ついで、バイオマーカーが予測基準のいくつかの関数に当てはめられるであろう。
４：一変数レベルでの臨床的共変数を含む、バイオマーカー予測関数の選択：一変数は、臨床的共変数に関して、唯一のバイオマーカーを使用することを称し、多変数モデルとすることができる。このアプローチは、方法が、関連する共変数情報の導入を可能にすべきことを除けば、臨床的共変数のない探索と類似している。カットオフの選択の散布図法により、共変数の制限使用のみが可能となり、例えば二元共変数は、プロット内でコードされる色調とすることができる。分析が、いくつかの回帰手法に依存しているならば、共変数(その時点で、それらの多く)を使用することは通常は容易である。上述した３に記載されたコックスモデルに基づくカットオフ探査により、共変数を容易に導入することが可能となり、よって、共変数調節された一変数カットオフ探査に至るようになる。共変数による調節は、モデルにおける共変数として、又は層別解析における包含物を介してなされてよい。
また予測関数の他の選択により、共変数の導入が可能になる。
これは、予測関数として、コックスモデルの選択に対して直接的である。これには、例えば異なる年齢群、異なる予測基準の適用を意味する、相互作用レベルにおける共変数の影響を推定するための選択肢が含まれる。
予測関数の尤度比の種類について、予測密度は、共変数を含んで推定されなくてはならない。この目的は、多変数パターン認識の方法を使用するのか、又はバイオマーカー値を、共変数における重回帰により調節することで可能となる(密度測定の前)。
バイオマーカー(未加工測定レベル)と臨床的共変数を使用し、反応として臨床的有益性の測定を使用する、ＣＡＲＴ技術(Classification and Regression Trees, Breimanら (Wadsworth, Inc.: New York, 1984)を、この目的のために使用することができる。カットオフが探査され、決定木型の関数が、予測のための共変数に関与していることが見出されるであろう。ＣＡＲＴにより選択されるカットオフとアルゴリズムは、高頻度で最適に接近しており、組合せられて、考慮される種々の臨床的有益性測定により統一されてもよい。
５：多変数レベルでのバイオマーカー予測関数の選択：異なる一変数予測関数の選択において、それらの予測可能性を維持するいくつかのバイオマーカー候補が存在している場合、バイオマーカーを組合せることにより、すなわち多変数予測関数を考慮することにより、さらなる改善が達成され得る。
単純なヘビサイド関数モデルに基づく、バイオマーカーの組合せは、例えばバイオマーカー値の二元散布図を考慮することにより評価されてよく、ここで最適なカットオフが示される。次にバイオマーカーの組合せは、改善された予測が達成されるように、論理「ＡＮＤ」と「ＯＲ」演算子により、異なるヘビサイド関数を組合せることにより達成可能である。
この目的のために、複数のバイオマーカー(未加工測定レベル)と反応としての臨床的有益性測定を使用し、予測のための決定木型の関数とバイオマーカー用のカットオフが得られる、ＣＡＲＴ技術を使用することができる。ＣＡＲＴにより選択されるアルゴリズムとカットオフは、高頻度で最適に接近しており、組合せられて、考慮される種々の臨床的有益性測定により統一されてもよい。
コックス回帰は、種々のレベルで使用することができる。第１の方法は、二元方式に、複数のバイオマーカーを導入することである(すなわち、いくつかのカットオフを有するヘビサイド関数に基づく)。他の選択肢は、計量方式にバイオマーカーを使用すること(適切な変換後)、又は二元的及び計量的アプローチを混合して使用することである。発展的多変数予測関数は、上述した３に記載されているコックス型のものである。
多変数尤度比アプローチは実施が困難であるが、多変数予測関数用の他の選択肢も存在している。
６：多変数レベルでの臨床的共変数を含む、バイオマーカー予測関数の選択：関連する臨床的共変数が存在する場合、複数の臨床的共変数と複数のバイオマーカーを組合せることにより、改善が達成される。種々の予測関数の選択は、臨床的共変数を含める可能性に関して評価されるであろう。
バイオマーカーについてのヘビサイド関数の簡単な論理的組合せに基づき、トレーニングテストで得られる、ロジスティック回帰モデルをベースにした予測関数に、さらなる共変数を含めてもよい。
ＣＡＲＴ技術及び発展的決定木は、予測アルゴリズムにおけるものを含む、付加的な共変数と共に、容易に使用することができる。
コックス回帰に基づく全ての予測関数は、さらに臨床的共変数を使用することができる。例えば異なる年齢群、異なる予測基準の適用を意味する、相互作用レベルでの共変数の影響を推定するための選択肢が存在する。
多変数尤度比アプローチは、付加的な共変数の使用に、直接拡張可能ではない。

Claims (77)

  1. 関節リウマチ(ＲＡ)患者が、リンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストでの治療に応答性であるかどうかを評価する方法において、
    ａ）未治療のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療されたＲＡ患者から得られた試料中の可溶性ＬＴアルファ-ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の量を決定し、
    ｂ）未治療のＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療されたＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する治療されたＲＡ患者の応答性の指標となる
    ことを含む方法。
  2. ＲＡ患者におけるＬＴアンタゴニストでの治療の効果をモニターする方法において、
    ａ）未治療のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療されたＲＡ患者から得られた試料中の可溶性ＬＴアルファ-ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の量を決定し、
    ｂ）未治療のＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療されたＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＲＡ患者におけるＬＴアンタゴニストでの治療の効果の指標となる
    ことを含む方法。
  3. 患者亜集団における関節リウマチ(ＲＡ)を治療するのに効果的な治療剤としてＬＴアンタゴニストを同定する方法において、
    ａ）未治療のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、患者亜集団からの試料中の、所定量の可溶性ＬＴαβの量の存在性と、ＬＴアンタゴニストの効果との間の相関関係を決定し、
    ｂ）未治療のＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、患者亜集団からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、患者亜集団において、ＬＴアンタゴニストが関節リウマチ(ＲＡ)を治療するのに効果的であることの指標となる
    ことを含む方法。
  4. ＬＴアンタゴニストが関節リウマチ(ＲＡ)を治療するのに効果的である患者亜集団を同定する方法において、
    ａ）未治療のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、患者亜集団からの試料中の、所定量の可溶性ＬＴαβの量の存在性と、ＬＴアンタゴニストの効果との間の相関関係を測定し、
    ｂ）未治療のＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、患者亜集団からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、患者亜集団において、ＬＴアンタゴニストが関節リウマチ(ＲＡ)を治療するのに効果的であることの指標となる
    ことを含む方法。
  5. ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性を予測する方法において、
    ａ）未治療のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後の、ＲＡ患者から得られた試料中の可溶性ＬＴアルファ-ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の量を決定し、
    ｂ）未治療のＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療されたＲＡ患者からの試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する治療されたＲＡ患者の応答性の指標となる
    ことを含む方法。
  6. ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性をモニターする方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前に、ＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後の、ＲＡ患者から得られた試料中の可溶性ｓｏｌＬＴαβの量を決定し、
    ｂ）治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となる
    ことを含む方法。
  7. ＬＴアンタゴニストを用いたＲＡ患者の治療を修正する方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前にＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となり、
    ｂ）ｓｏｌＬＴαβの量の多いか少ないかに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を調整する
    ことを含む方法。
  8. ＲＡ患者に対するＬＴアンタゴニストでの治療を設計する方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前にＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となり、
    ｂ）ｓｏｌＬＴαβの量の多いか少ないかに基づき、ＲＡ患者に対するＬＴアンタゴニストでの治療を設計することを含み、ここで、設計が患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量の調整を含む方法。
  9. 患者における自己免疫疾患の予後を予測する方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前に患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後の患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、疾患の予後の指標となり、
    ｂ）ｓｏｌＬＴαβの量の多いか少ないかに基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を調整する
    ことを含む方法。
  10. リンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストでの治療に対する関節リウマチ(ＲＡ)の患者の応答性をモニターする方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前にＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、
    ｂ）工程(ａ)を繰り返すことを含み、
    ここで、治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量の持続的変化が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となることを含む方法。
  11. ＬＴアンタゴニストを用いたＲＡ患者の治療を修正する方法において、
    ａ）ＬＴアンタゴニスト治療の前にＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後のＲＡ患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、
    ｂ）工程(ａ)を繰り返し、治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量の持続的変化が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する応答性の指標となり、
    ｃ）ｓｏｌＬＴαβの量の持続的変化に基づき、患者に投与されるＬＴアンタゴニストの量を調整する
    ことを含む方法。
  12. 患者における自己免疫疾患を診断又は予測する方法において、
    ＬＴアンタゴニスト治療の前に患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後の患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、
    治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、患者における疾患の指標となる
    ことを含む方法。
  13. 自己免疫疾患に対してリスクのある患者を診断又は予測する方法において、
    ＬＴアンタゴニスト治療の前に患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、ＬＴアンタゴニストで治療された後の患者から得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量を決定し、
    治療前に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量と比較して、治療後に得られた試料中のｓｏｌＬＴαβの量が多いか少ないかが、患者における疾患の指標となる
    ことを含む方法。
  14. 患者がリンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストで治療される請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が１０−５００ｐｇ／ｍＬの範囲にある請求項１２又は１３に記載の方法。
  16. 可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が、患者の血清中において約１−１００００ｐｇ／ｍＬの範囲にある請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  17. 可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が、患者の血清中において約２５−８００ｐｇ／ｍＬの範囲にある請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  18. 可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が、患者の滑液又は組織中において２０−４００ｐｇ／ｍｌの範囲にある請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  19. 可溶性ＬＴαβ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が、リンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストの第一の用量を投与した後、２４時間、５０日又は１００日以内に測定される請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  20. アンタゴニストが抗体又はイムノアドヘシンである請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  21. アンタゴニストが抗体である請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  22. 抗体が、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  23. 抗体が抗リンホトキシンα(ＬＴα)抗体である請求項１８に記載の方法。
  24. アンタゴニストが細胞傷害剤にコンジュゲートされていない請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  25. アンタゴニストが細胞傷害剤にコンジュゲートされている請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  26. 患者には関節リウマチ用の医薬が過去に投与されていない請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  27. 患者には、関節リウマチ用の少なくとも一種の医薬が過去に投与されている請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 患者が、過去に投与された少なくとも一種の医薬には応答性ではない請求項２５に記載の方法。
  29. 過去に投与された医薬が、免疫抑制剤、サイトカインアンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、又は非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)である請求項２６に記載の方法。
  30. リンホトキシンアンタゴニストが静脈的に投与される請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  31. リンホトキシンアンタゴニストが皮下的に投与される請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  32. リンホトキシンアンタゴニスト治療の少なくとも約３ヶ月後に、治療前のベースラインと比較して、骨又は軟部組織関節損傷の低減を測定する画像処理検査を付与し、投与されたリンホトキシンアンタゴニストの量が、関節損傷の低減を達成するのに効果的である請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  33. 検査が総修正Ｓｈａｒｐスコアを測定する請求項３０に記載の方法。
  34. リンホトキシンアンタゴニストが、ＲＡを治療するための如何なる他の医薬もなしに投与される請求項１に記載の方法。
  35. リンホトキシンアンタゴニスト治療が、リンホトキシンアンタゴニストと共に、有効量の一又は複数の第二の医薬を投与することをさらに含み、ここでリンホトキシンアンタゴニストが第一の医薬である請求項１に記載の方法。
  36. 第二の医薬が一種を越える医薬である請求項３５に記載の方法。
  37. 第二の医薬が、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)、疼痛コントロール剤、インテグリンアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)、サイトカインアンタゴニスト、ビスホスホナート、又はそれらの組合せである請求項３５に記載の方法。
  38. 第二の医薬がＤＭＡＲＤである請求項３７に記載の方法。
  39. ＤＭＡＲＤが、オーラノフィン、クロロキン、Ｄ-ペニシラミン、注射用金、経口用金、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ミオクリシン、及びメトトレキセートからなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
  40. 第二の医薬がＮＳＡＩＤである請求項３７に記載の方法。
  41. ＮＳＡＩＤが、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、アスピリン及びイブプロフェンからなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
  42. 免疫抑制剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、レフルノミド、アナキンラ、アザチオプリン、及びシクロホスファミドからなる群から選択される請求項３７に記載の方法。
  43. 第二の医薬が、抗アルファ４、エタネルセプト、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、キナレット、エファリズマブ、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＮＦκＢリガンドの抗レセプター活性化因子(抗ＲＡＮＫＬ)、ＮＦκＢ-Ｆｃの抗レセプター活性化因子(ＲＡＮＫ-Ｆｃ)、パミドロナート、アレンドロナート、アクトネル、ゾレンドロナート、クロドロナート、メトトレキセート、アザルフィジン、ヒドロキシクロロキン、ドキシサイクリン、レフルノミド、スルファサラジン(ＳＳＺ)、プレドニゾロン、インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト、プレドニゾン、及びメチルプレドニゾロンからなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
  44. 第二の医薬が、インフリキシマブ、インフリキシマブ／メトトレキセート(ＭＴＸ)の組合せ、ＭＴＸ、エタネルセプト、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、オーラノフィン、ヒドロキシクロロキン(ＨＣＱ)、プレドニゾロンとＭＴＸとＳＳＺの組合せ、ＭＴＸとＳＳＺとＨＣＱの組合せ、シクロホスファミドとアザチオプリンとＨＣＱの組合せ、及びアダリムマブとＭＴＸの組合せからなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
  45. コルチコステロイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンである請求項４２に記載の方法。
  46. 第二の医薬がＭＴＸである請求項４２に記載の方法。
  47. ＭＴＸが経口的又は非経口的に投与される請求項４４に記載の方法。
  48. 関節炎が、早期関節リウマチ又は初発関節リウマチである請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  49. 患者が一又は複数の抗腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)インヒビターに対して不十分な応答を示す請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  50. 可溶性リンホトキシンアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)の量が、リンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストの第一の用量を投与した後、２４時間、５０日又は１００日内に測定される請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  51. 有効量のリンホトキシンアンタゴニストを患者に投与することにより患者を再治療することをさらに含み、再治療が、アンタゴニストの最初の投与の少なくとも約２４週後に開始される請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  52. 各投与時に投与されるリンホトキシンアンタゴニストの量が、関節損傷の持続的又は維持された低減を達成するのに効果的である請求項４９に記載の方法。
  53. さらなる再治療が、有効量のリンホトキシンアンタゴニストを用いて開始される請求項４９に記載の方法。
  54. さらなる再治療が、アンタゴニストの第二回目の投与の少なくとも２４週後に開始される請求項５１に記載の方法。
  55. 関節損傷が再治療後に低減されている請求項４９に記載の方法。
  56. 再治療後の検査時に、患者に臨床的改善が観察されない請求項４９に記載の方法。
  57. 患者における関節リウマチを治療する方法において、関節リウマチを治療するために患者に有効量のリンホトキシンアンタゴニストを最初に投与することを含み、患者からの試料がコントロール中のリンホトキシン（ＬＴ）の量よりも多い量のＬＴを含むならば、該より多い量はリンホトキシンアンタゴニスト治療に対する患者の応答性を示し、アンタゴニストの最初の投与から少なくとも約２４週後に、患者に有効量のリンホトキシンアンタゴニストを投与することによって患者を再治療し、リンホトキシンアンタゴニストの最初の投与後の検査時には臨床的改善が患者に観察されない方法。
  58. 検査用試料が、血清、滑膜組織、又は滑液である請求項５５に記載の方法。
  59. インビボでのＬＴαβプロセシングをモニターする方法において、ＲＡを患っている患者からの組織検体又は液体試料中のｓｏｌＬＴαβの存在を検出することを含む方法。
  60. 可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)産生インヒビターを同定する方法において、
    ａ）ＲＡを患っており、検査用化合物が投与された検査被験者／患者からの検体におけるｓｏｌをＬＴαβの量を検出し；
    ｂ）該検査用化合物の不在下で産生されたコントロール量のｓｏｌＬＴαβとｓｏｌＬＴαβの検出された量を比較する
    ことを含む方法。
  61. 少なくとも一のＬＴαサブユニットと少なくとも一のＬＴβサブユニットを含む単離された可溶性ＬＴであって、少なくとも一のＬＴβサブユニットが、米国特許第５６６１００４号における配列番号：２のおよそアミノ酸９５と膜貫通領域の末端との間のどこかで切断されている単離された可溶性ＬＴ。
  62. ＬＴβ膜貫通領域の末端が、米国特許第５６６１００４号における配列番号：２のおよそアミノ酸４４にある請求項６１に記載の単離された可溶性ＬＴ。
  63. 関節リウマチ(ＲＡ)患者がリンホトキシン(ＬＴ)アンタゴニストでの治療に対して応答性であるかどうかを評価する方法において、未治療のＲＡ患者におけるｓｏｌＬＴαβ量に対して、ＬＴアンタゴニストで治療された患者から得られた生体液の試料中の、異なった量の可溶性ＬＴアルファ-ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)に基づき、ＲＡ患者の応答性を評価することを含み、異なった量が、ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性の指標である方法。
  64. 評価工程に対して、ＬＴアンタゴニストで治療されたＲＡ患者から得られた生体液の試料中の可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴａｂ)の量を検査する工程が先行する請求項６３に記載の方法。
  65. 前記検査がｓｏｌＬＴａｂの量を決定するのに適した装置を使用して実施される請求項６４に記載の方法。
  66. 前記検査が、適切なプロセッサにより実行されるソフトウェアプログラムを使用して実施される請求項６４に記載の方法。
  67. プログラムが、有形情報記録媒体に保存されたソフトウェアで実施に供される請求項６６に記載の方法。
  68. 有形情報記録媒体が、ＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、及びプロセッサに付随したメモリーからなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
  69. 前記検査又は診断の結果を記録するレポートを作成する工程をさらに含む請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記レポートが有形情報記録媒体に記録又は保存される請求項６９に記載の方法。
  71. 有形情報記録媒体が紙である請求項７０に記載の方法。
  72. 有形情報記録媒体が、ＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、及びプロセッサに関連したメモリーからなる群から選択される請求項７０に記載の方法。
  73. 利害関係者に前記診断の結果を連絡する工程をさらに含む請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。
  74. 利害関係者が患者又は主治医である請求項７３に記載の方法。
  75. 連絡が、書面、電子メール又は電話によりなされる請求項７３に記載の方法。
  76. 検査に基づいた結果及び／又は評価を含むレポートにおいて、
    ａ）ＬＴアンタゴニストで治療されたＲＡ患者から得られた生体液の試料中の、可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)のレベルを検査し；
    ｂ）未治療の患者におけるｓｏｌＬＴａｂのレベルに対する、試料中の異なったレベルの可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)に基づき、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する患者の応答性を評価する
    ことを含み、異なったレベルが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性の指標であるレポート。
  77. 検査に基づいた結果及び／又は評価を保存する有形情報記録媒体において、
    ａ）ＬＴアンタゴニストで治療されたＲＡ患者から得られた生体液の試料中の、可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)のレベルを検査し；
    ｂ）未治療の患者におけるｓｏｌＬＴａｂのレベルに対する、試料中の異なったレベルの可溶性ＬＴアルファ−ベータ(ｓｏｌＬＴαβ)に基づき、ＬＴアンタゴニストでの治療に対する患者の応答性を評価する
    ことを含み、異なったレベルが、ＬＴアンタゴニストでの治療に対するＲＡ患者の応答性の指標である媒体。
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