CN109935281B - 一种解析大黄酸对肾间质纤维化疗效的定量网络药理学模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
目前网络药理学主要聚焦在药物与靶点及通路分子网络间静态的、定性的表征，未体现药物浓度差异与机体细胞分子网络、细胞‑细胞间通讯网络及细胞形成组织多层次、高维度的交互生命过程。发明人提出定量网络药理学模型来表征药物浓度差异与多尺度生物网络动态的、定量的调节过程。首先基于质量守恒、希尔定律和米氏方程，应用微分、偏微分方程等首次构建了疾病的细胞内分子通路及分子‑细胞‑组织多尺度的网络动力学模型，模拟病理进程。再根据酶促动力学原理，构建了药物干预的多尺度网络动力学模型，模拟药物在不同浓度、作用于单靶点/多靶点及不同病理阶段下对多尺度网络的干预。由此，解析大黄酸对肾间质纤维化疾病网络的动态、定量的调节。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种解析大黄酸对肾间质纤维化疗效的定量网络药理学模型构建方法。
背景技术
网络药理学是一门将生物网络与药物作用网络整合，并分析药物与网络节点或网络模块的关系的学科。其由传统意义上，寻找药物单一靶点转向综合网络分析，强调药物对整体疾病网络的协同调节，从而超越了单靶点思想的束缚。
目前网络药理学的研究思路通常分为两类：一是根据公共数据库和公开发表的已有数据，建立特定药物作用机制网络预测模型，预测药物作用靶点，从生物网络平衡的角度解析药物作用机制；二是利用各种组学以及高通量技术，采用生物信息学手段分析和构建药物-靶点-疾病网络，建立预测模型，进而解析所研究药物的网络药理学机制。
但现有的技术中仍存在许多不足，例如：现阶段药物扰动的生物网络仍停留在细胞分子通路网络的定性表征，未反映多层次、高维度的交互生命过程；此外，目前研究主要聚焦在药物对静态生物网络的定性扰动，鲜见药物对动态生物网络的扰动；还有，目前网络药理学研究未反映药物浓度差异对疾病生物网络的影响，难以体现药物在临床上发挥疗效的强度及可能的不良反应。总之，目前的网络药理学主要聚焦在药物对分子通路网络的静态、定性的调节，未体现药物浓度差异对生物网络(受体或通道→细胞→器官(组织)→整体)在空间和时间维度动态的、定量的调节。
大黄酸是一类常用于治疗慢性肾病的药物。大黄酸对肾小管间质纤维化的治疗首先是针对分子通路的调控，再传递到细胞水平，通过抑制细胞异常表型的激活，最终表现为组织和器官水平的修复。作为一个多靶点的成分，大黄酸作用靶点的生物网络是复杂的，而复杂生物网络的调控与细胞表型改变、组织和器官的变化密切相关的。因此，系统地研究大黄酸干预疾病网络的响应对于肾间质纤维化的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种解析大黄酸对肾间质纤维化疗效的定量网络药理学模型构建方法，不仅阐述了定量药理学的原理和方法，还建立了药物干预疾病的定量和动态网络药理学模型。
一种解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，包括以下步骤：
S1、构建小管上皮细胞和成纤维细胞的细胞内分子信号通路网络，构建包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度网络。
S2、根据步骤S1中得到的所述多尺度分子网络，通过质量守恒定律、米氏方程和希尔方程构建ODE 方程，进行分子尺度的网络模型模拟。
S3、细胞和组织尺度模型的模拟：该模拟基于ABM规则实现，通过设置主体的细胞特异性规则来模拟细胞与细胞之间的交互。
细胞行为的动力学模拟过程为：首先一个细胞感知到周围环境中的刺激，继而将刺激信号传递到细胞内分子网络并调整细胞行为；
其次由系统计算出相应细胞行为对应的概率P再生成一个随机数r∈(0,1)，若r≤P，则发生相应的细胞行为；
在组织水平上，当细胞外基质的浓度达到阈值，则产生瘢痕。
S4、细胞外尺度模型的模拟：基于PDE方程模拟细胞外环境中的分子随时间的浓度变化，优选的，细胞外环境中的分子包括TGF-β1、MCP-1、ECM以及MMP。
S5、利用步骤S2中得到的多尺度分子网络模型模拟肾间质的病理进程，该模型通过迭代算法运行，细胞行为和组织形态由ABM规则控制，最终得到与疾病进程相关的输出值。
S6、大黄酸干预模型：修改ODE方程以模拟大黄酸的抑制作用，并描述大黄酸干预后的蛋白磷酸化速率，再分别模拟大黄酸不同浓度、作用于单靶点/双靶点及不同病理阶段的干预差。
S7、模型的实现：模型模拟的环境为1mm×1mm的二维肾皮质部分，并且该部分被分成了50×50的四方格点，即每一个格点的大小为20μm×20μm，约为1个细胞的大小，所述模拟过程基于Matlab编程语言实现，并在400核服务器上进行运算。
更进一步，步骤S1具体包括以下步骤：
S1-1:根据肾间质纤维化分子机制和信号通路总结肾间质纤维化分子通路，再结合KEGG数据库构建分子信号通路网络。
S1-2：简化分子信号通路网络：保留并根据质量守恒原则简化TGF-β/Smad信号通路、MAPK信号通路以及NF-κB信号通路，保留并精简大黄酸作用靶点蛋白p38MAPK蛋白和JNK蛋白再收敛作用于一个中心蛋白的信号级联通路，保留通路中的肾纤维化指标性蛋白。优选的肾纤维化指标性蛋白包括有ɑ-SMA、 Fn和细胞周期关键蛋白Cyclin。
S1-3：构建包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度分子网络。
更进一步，步骤S2具体包括以下步骤：
S2-1:受体与配体之间的结合和解离过程为：
受体浓度随时间的变化为：
其中，[L]表示配体、[R]表示受体[L·R]表示配体-受体复合物的浓度。参数kon是结合速率常数，kdiss是解离速率常数。
S2-2：磷酸化过程为：
该过程由米氏方程描述，
细胞质激酶蛋白的磷酸化速率为：
其中，[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中的激酶蛋白浓度和磷酸化后的激酶蛋白浓度。[P]是该激酶蛋白的上游蛋白的浓度，参数k是米氏方程的速率常数，J是米氏常数。参数Vdep和Jdep分别表示去磷酸化的最大速率和米氏常数。
S2-3：细胞质中的蛋白入核过程为：
这一过程由质量作用定律进行模拟，细胞核内蛋白的动态变化为：
其中，[Kn]表示细胞核内激酶蛋白的浓度，[Kc]表示细胞质中激酶蛋白的浓度，kim是激酶蛋白转移入核的速率常数。
S2-4：由希尔方程模拟调节蛋白调控下的基因表达过程：[T]→[L]，
表达产物的生成速率为：
其中[T]表示调节蛋白的浓度，[L]是表达产物的浓度，kexp表示速率常数，Jexp表示米氏方程，h表示希尔系数。
更进一步，步骤S3中，细胞水平的交互规则包括MCs的招募、MCs和FBCs的移动、FBCs和TECs 的增殖、FBCs分化为MFBCs、TECs发生EMT、TGF-β1诱导的TECs凋亡、细胞死亡以及介质的分泌。
更进一步，步骤S3中，细胞外环境中的分子随时间的浓度变化的数学表达式以反应-扩散方程表示：
其中Dc表示扩散系数，δc是降解速率常数，A(x,y,V)表示用某个时间的状态变量(V)和位置信息(x,y) 描述的主体A，β是速率参数的向量，Y1,Y2,...,YR表示所有与主体相关的物质，g(C,Y1,Y2,...,YR,β)是主体关于细胞外分子的反应函数。
更进一步，步骤S6中大黄酸干预后的蛋白磷酸化速率为：
[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中激酶蛋白和磷酸化蛋白的浓度，D是大黄酸的浓度，参数Ki表示大黄酸对蛋白Kc磷酸化过程的抑制常数。
发明人所提出的定量网络药理学模型，构建了分子-细胞-组织多尺度生物网络和药物干预模型，通过此，可以研究大黄酸的药物浓度差异对多尺度生物网络的动态、定量的调节，提高药物研发的成功率、临床有效性及安全性。
通过大黄酸作用肾间质纤维化网络模型构建，阐述了定量药理学的原理和方法。构建了多尺度网络动力学模型来模拟肾脏纤维化在时间和空间尺度的病理进程，建立了药物干预疾病多尺度网络的定量和动态网络药理学模型。从而探讨了大黄酸在不同浓度、单靶点和多靶点以及不同病理阶段对多尺度网络的调节机制。
本方案具有以下优点：首先，在目前网络药理学和系统生物学基础上，提出了定量网络药理学概念和理论方法来表征药物与机体多尺度网络的相互作用过程。首次构建了肾间质纤维化的分子-细胞-组织多尺度网络动力学模型，模拟了肾间质纤维化的病理过程，揭示了肾间质纤维化病程的关键分子通路。同时构建了大黄酸扰动的网络动力学多尺度模型，模拟了不同浓度，单靶点/双靶点及大黄酸对疾病不同病程的调节。
其次，与以往的疾病多尺度模型相比，发明人根据系统生物学的网络简化规则，应用微分方程和偏微分方程构建小分子扩散、蛋白等大分子间作用、细胞行为和组织水平等多尺度的网络动力学模型及大黄酸的扰动模型，为疾病多尺度网络及药物干预的网络动力学模型构建提供了新思路。此外，通过本方案，还揭示了大黄酸干预肾间质纤维化网络的特点。
附图说明
图1为跨越时间和空间尺度的混合多尺度模型示意图。
图2为分子尺度网络模型的构建及模拟过程示意图。
图3为细胞行为的随机模拟过程。
图4为多尺度RIF疾病模型的示意图。
图5为实验例1～实验例3中模拟结果与实验数据之间的拟合。(A)TEC MTT实验结果(左)以及TEC 凋亡概率拟合曲线(右)。*P<0.05,**P<0.01。(B)FBC MTT实验结果(左)以及FBC增殖概率拟合曲线(右)。 *P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001。(C)TEC免疫荧光实验的代表性图片(左)以及TEC分化概率拟合曲线 (右)。(D)FBC免疫荧光实验的代表性图片(左)以及FBC分化概率拟合曲线(右)。
图6为FBC细胞的分子水平模拟结果：TGF-β1(A)、ECM(B)、MCP-1(C)、Cyclin(D)、ɑ-SMA(E)及 MMP(F)浓度随时间的变化。
图7为TEC细胞的分子水平模拟结果：TGF-β1(A)、ECM(B)、MCP-1(C)、Cyclin(D)、ɑ-SMA(E)及 MMP(F)浓度随时间的变化。
图8为低浓度TGF-β1(1ng/mL)和高浓度TGF-β1(10ng/mL)刺激下多尺度模型模拟结果。(A)低浓度和高浓度TGF-β1刺激下的细胞数量变化。(B)低浓度和高浓度TGF-β1刺激下21天后的细胞分布。(C)低浓度和高浓度TGF-β1刺激下21天后的组织水平的结果。
图9为不同浓度的大黄酸干预模拟结果。(A)5nM大黄酸干预后模拟结果。(B)10nM大黄酸干预后的模拟结果。(C)20nM大黄酸干预后模拟结果。(D)7μM大黄酸干预后模拟结果。
图10为浓度为20nM的大黄酸对不同病理阶段RIF进行干预的模拟结果：(A)从0时刻开始干预的模拟结果。(B)从第7天开始干预的模拟结果。(C)从第14天开始干预的模拟结果。
图11为浓度为20nM的大黄酸对疾病网络进行单靶点和双靶点干预的模拟结果：(A)干预双靶点的模拟结果。(B)仅靶向JNK蛋白的模拟结果。(C)仅靶向p38蛋白的模拟结果。
图12为大黄酸干预后的细胞实验结果。A：KFB MTT实验结果。A组表示在10ng/mLTGF-β1作用下成纤维细胞细胞活性并将其细胞存活率设定为1；B组表示DMSO对照组，P>0.05可排除DMSO对本实验的影响；C组表示0ng/mL TGF-β1作用下成纤维细胞活性，与A组相比表明10ng/mL TGF-β1对成纤维细胞有增殖作用；D、E、F和G组分别为1、5、10和20ng/mL大黄酸与10ng/mL TGF-β1共同作用组，相较于A组表明在这些浓度下大黄酸均有抑制成纤维细胞增殖的作用，且各浓度间无统计学差异。****p <0.0001。B：KFB细胞免疫荧光实验结果。C：HK-2细胞免疫荧光实验结果。
图13为8ng/mL TGF-β1处理24和48小时后KFB细胞分泌的Fn浓度。作用48小时后，分泌的Fn 的量与作用24小时后的结果相比显著增加，p<0.05。
图14为各组大鼠HE染色结果：A：假手术组；B：模型组7天；C：模型组14天；D：模型组21天； E：大黄酸给药组7天；F：大黄酸给药组14天；G：大黄酸给药组21天。
图15为各组大鼠Masson染色结果：A：假手术组；B：模型组7天；C：模型组14天；D：模型组 21天；E：大黄酸给药组7天；F：大黄酸给药组14天；G：大黄酸给药组21天。
具体实施方式
下面，通过示例性的实施方式对本发明具体描述。
实施例1：
S1、多尺度网络模型的构建：选择小管上皮细胞(Tubular epithelial cell，TEC)和成纤维细胞(Fibroblast, FBC)构建细胞内分子信号通路网络，具体构建过程如图2所示：
第一步，根据文献中报道的肾间质纤维化分子机制和相关信号通路，归纳总结肾间质纤维化分子通路；同时结合KEGG数据库，构建分子信号通路网络。
第二步，分子信号通路网络的简化。简化规则如下：
(1)保留在肾间质纤维化病理过程中起了主要作用的TGF-β/Smad信号通路，MAPK信号通路以及 NF-κB信号通路。
(2)通路简化。完整的上述信号通路模拟涉及较多的动力学参数，且这些参数大部分未知，难以精确地模拟。同时，ODE方程模拟分子网络动态变化时，需要在每个更新步长内考虑每个细胞，完整的过程模拟较为耗时。据此，根据质量守恒原则，进一步简化上述分子网络。
(3)由于我们研究大黄酸对肾纤维化过程的干预，因而保留上述信号通路中大黄酸作用靶点蛋白p38 MAPK蛋白和JNK蛋白。
(4)根据文献中提出的规则，精简上游蛋白收敛作用于一个中心蛋白的信号级联通路。
(5)保留通路中的肾纤维化指标性蛋白，如ɑ-SMA，Fn和细胞周期关键蛋白Cyclin。
同时，还需构建包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度网络。
根据简化规则得到的TGF-β/Smad信号通路、MAPK信号通路和NF-κB信号通路如图4B所示，细胞膜外的TGF-β1与其受体TGFBR结合，使受体活化，活化的受体进入细胞内，激活Smad3蛋白和TRAF 蛋白。激活的Smad3蛋白与Smad4蛋白形成Smad3-Smad4复合物，以二聚体的形式进入细胞核内调控靶基因MCP-1、ECM和ɑ-SMA的表达，引起炎症过程、瘢痕形成以及EMT的转换。激活的TRAF蛋白通过逐级磷酸化，分别使p38、JNK和IKK激活，活化的p38、JNK进入细胞核调控转录因子AP-1和NF-κB。细胞膜外的ECM与膜上的整合素Intergrin结合，形成复合物，进入核内激活FAK蛋白。活化的FAK蛋白通过磷酸化使ERK和IKK激活。活化的ERK蛋白进入细胞核，与核内的p38、JNK蛋白一同调控转录因子AP-1和NF-κB。活化的IKK诱导NF-κB信号通路，使IκBɑ磷酸化，并促使其降解，导致NF-κB从 IκBɑ-NFκB复合物中游离出来，累积的NF-κB进入细胞核内与靶基因DNA结合，发挥对靶基因的调控作用。在TGF-β1和ECM的诱导下，细胞核中AP-1和NF-κB调控一系列的TGF-β1、MCP-1、Cyclin等肾毒性细胞因子、炎症因子、细胞周期蛋白的表达。其中TGF-β1分泌到细胞外，在细胞外积聚，激活 TGF-β/SMAD信号通路，大量表达MCP-1、ɑ-SMA和ECM，进一步加重炎症反应和纤维化进程。上述简化的信号分子网络，总体上反映了分子水平上肾间质纤维化信号分子网络转导和应答过程。
S2分子尺度网络模型的模拟：根据S1中的简化的分子网络，通过质量守恒定律，米氏方程和希尔方程构建ODE方程。ODE方程所描述的生物学过程如附表1所示，对应的方程如表2所示。
表1.分子尺度的生物学过程
续.表1
表2.分子尺度的ODE方程
| Reactant number | Reactant | Unit | Kinetic equations |
| x(1) | TGF-β | nM | dx(1)＝10^9/(NA*Vextra)*(Vexp1-V1)； |
| x(2) | TGFBR | # | dx(2)＝-V1-V2+V4+V5； |
| x(3) | TRC | # | dx(3)＝V1-V3； |
| x(4) | TGFBR_int | # | dx(4)＝V2-V4； |
| x(5) | TRC_int | # | dx(5)＝V3-V5； |
| x(6) | ECM | nM | dx(6)＝10^9/(NA*Vextra)*(-V6+Vexp2)； |
| x(7) | Integrin | # | dx(7)＝-V6-V7+V9+V10； |
| x(8) | ERC | # | dx(8)＝V6-V8； |
| x(9) | Integrin_int | # | dx(9)＝V7-V9； |
| x(10) | ERC_int | # | dx(10)＝V8-V10； |
| x(11) | TRAF | nM | dx(11)＝-V11； |
| x(12) | pTRAF | nM | dx(12)＝V11； |
| x(13) | FAK | nM | dx(13)＝-V12； |
| x(14) | pFAK | nM | dx(14)＝V12； |
| x(15) | p38 | nM | dx(15)＝-V13； |
| x(16) | pp38 | nM | dx(16)＝V13-V22+V29/kratio； |
| x(17) | JNK | nM | dx(17)＝-V14； |
| x(18) | pJNK | nM | dx(18)＝V14-V23+V30/kratio； |
| x(19) | ERK | nM | dx(19)＝-V15； |
| x(20) | pERK | nM | dx(20)＝V15-V24+V31/kratio； |
| x(21) | IKK | nM | dx(21)＝-V16； |
| x(22) | pIKK | nM | dx(22)＝V16； |
| x(23) | IκBα | nM | dx(23)＝-V17-V19； |
| x(24) | NFκB | nM | dx(24)＝-V17+V18-V25+V32/kratio； |
| x(25) | IκBα-NFκB | nM | dx(25)＝V17-V18； |
| x(26) | Smad3 | nM | dx(26)＝-V20； |
| x(27) | pSmad3 | nM | dx(27)＝V20-V21； |
| x(28) | Smad4 | nM | dx(28)＝-V21； |
| x(29) | pSmad3/4 | nM | dx(29)＝V21-V28+V33/kratio； |
| x(30) | pp38n | nM | dx(30)＝V22*kratio-V29； |
| x(31) | pJNKn | nM | dx(31)＝V23*kratio-V30； |
| x(32) | pERKn | nM | dx(32)＝V24*kratio-V31； |
| x(33) | NFκBn | nM | dx(33)＝V25*kratio-V26-V32； |
| x(34) | pNFκBn | nM | dx(34)＝V26； |
| x(35) | AP-1 | nM | dx(35)＝-V27； |
| x(36) | pAP-1 | nM | dx(36)＝V27； |
| x(37) | pSmad3/4n | nM | dx(37)＝V28*kratio-V33； |
| x(38) | MCP-1 | nM | dx(38)＝10^9/(NA*Vextra)*Vexp3； |
| x(39) | MMP | nM | dx(39)＝10^9/(NA*Vextra)*Vexp4； |
| x(40) | Bcl | # | dx(40)＝Vexp5； |
| x(41) | α-SMA | # | dx(41)＝Vexp6； |
| x(42) | CycD | # | dx(42)＝Vexp7； |
分子水平模型总共有42个ODE方程，用来表征42种物质的浓度变化。物质的初始浓度如附表3所示。
表3.分子尺度ODE方程中的物质初始浓度
| 编号 | 反应物 | xmean | 单位 |
| x(1) | TGF-β | 0.1 | nM |
| x(2) | TGFBR | 830 | # |
| x(3) | TRC | 0 | # |
| x(4) | TGFBR_int | 8300 | # |
| x(5) | TRC_int | 0 | # |
| x(6) | ECM | 0.141097561 | nM |
| x(7) | Integrin | 1000 | # |
| x(8) | ERC | 0 | # |
| x(9) | Integrin_int | 10000 | # |
| x(10) | ERC_int | 0 | # |
| x(11) | TRAF | 27.5 | nM |
| x(12) | pTRAF | 0 | nM |
| x(13) | FAK | 39.5 | nM |
| x(14) | pFAK | 0 | nM |
| x(15) | p38 | 200 | nM |
| x(16) | pp38 | 0 | nM |
| x(17) | JNK | 500 | nM |
| x(18) | pJNK | 0 | nM |
| x(19) | ERK | 415 | nM |
| x(20) | pERK | 0 | nM |
| x(21) | IKK | 80 | nM |
| x(22) | pIKK | 0 | nM |
| x(23) | IκBα | 0 | nM |
| x(24) | NFκB | 0 | nM |
| x(25) | IκBα-NFκB | 80 | nM |
| x(26) | Smad3 | 729.06 | nM |
| x(27) | pSmad3 | 0 | nM |
| x(28) | Smad4 | 1701.12 | nM |
| x(29) | pSmad3/4 | 0 | nM |
| x(30) | pp38n | 0 | nM |
| x(31) | pJNKn | 0 | nM |
| x(32) | pERKn | 0 | nM |
| x(33) | NFκBn | 0 | nM |
| x(34) | pNFκBn | 0 | nM |
| x(35) | AP-1 | 800 | nM |
| x(36) | pAP-1 | 0 | nM |
| x(37) | pSmad3/4n | 0 | nM |
| x(38) | MCP-1 | 0.02 | nM |
| x(39) | MMP | 0.9 | nM |
续表.3
| 编号 | 反应物 | xmean | 单位 |
| x(40) | Bcl | 0 | # |
| x(41) | α-SMA | 0 | # |
| x(42) | CycD | 0 | # |
方程中相关的动力学参数及其定义如附表4～8所示。
表4.ODE模型中与受体-配体动态相关的参数
| 参数 | 数值 | 单位 | 生物学释义 |
| kon1 | 0.023 | (nM·s)<sup>-1</sup> | Formation rate constant of TRC |
| kdiss1 | 0.00015 | s<sup>-1</sup> | Dissociation rate constant of TRC |
| kint2 | 0.00555 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TGFBR internalization |
| kint3 | 0.00555 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TRC internalization |
| krec4 | 0.000555 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TGFBR recycling |
| krec5 | 0.000555 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TRC recycling |
| kon6 | 0.002 | (nM·s)<sup>-1</sup> | Formation rate constant of ERC |
| kdiss6 | 0.007 | s<sup>-1</sup> | Dissociation rate constant of ERC |
| kint7 | 0.016666667 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of Integrin internalization |
| kint8 | 0.002 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of ERC internalization |
| krec9 | 0.0016 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of Integrin recycling |
| krec10 | 0.08 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of ERC recycling |
根据成纤维细胞和上皮细胞TGF-β1分泌量不同，设置两种细胞合成TGF-β1的速率不同，其它参数设定相同。文中涉及的不同的生物学过程用以下几种情形概括描述：
配体与受体的结合：
该模型用质量守恒定律来描述受体与配体之间的结合和解离过程。公式(1)描述了受体浓度随时间的变化：
其中[L]、 [R]和[L·R]分别表示配体、受体、配体-受体复合物的浓度。参数kon是结合速率常数，kdiss是解离速率常数。等号右侧相加的两项中，第一项-kon×[L]×[R]表示结合过程，第二项kdiss×[L·R]表示解离过程。
磷酸化过程：
该过程由米氏方程描述。细胞质中激酶蛋白的磷酸化受到上游蛋白的调控。公式(2)描述了细胞质激酶蛋白的磷酸化速率：
方程右侧的第一项
表示磷酸化反应，第二项
表示去磷酸化。[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中的激酶蛋白浓度和磷酸化后的激酶蛋白浓度。[P]是该激酶蛋白的上游蛋白的浓度。参数k 是米氏方程的速率常数，J是米氏常数。参数Vdep和Jdep分别表示去磷酸化的最大速率和米氏常数。
细胞质中的蛋白入核过程：
这一过程由质量作用定律进行模拟。公式(3)表示细胞核内蛋白的动态变化：
其中[Kn]表示细胞核内激酶蛋白的浓度，[Kc]表示细胞质中激酶蛋白的浓度。kim是激酶蛋白转移入核的速率常数。
基因表达的过程：[T]→[L]，希尔方程用来模拟调节蛋白(转录因子)调控下的基因表达过程。公式(4) 模拟表达产物的生成速率：
其中[T]表示调节蛋白的浓度，[L]是表达产物的浓度。方程中的kexp、Jexp和h分别表示速率常数、米氏方程和希尔系数。
表5.ODE模型中与磷酸化过程相关的参数
| 参数 | 数值 | 单位 | 生物学释义 |
| k11 | 0.5 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TRC_int-dependent TRAF phosphorylation |
| k12 | 5 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of ERC_int-dependent FAK phosphorylation |
| k13 | 0.12 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pTRAF-dependent p38 phosphorylation |
| k14 | 0.12 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pTRAF-dependent JNK phosphorylation |
| k15 | 0.12 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pFAK-dependent ERK phosphorylation |
| k16a | 0.12 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pTRAF-dependent IKK phosphorylation |
| k16b | 12 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pFAK-dependent IKK phosphorylation |
| k20 | 2.22 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of TRC_int-dependent Smad3 phosphorylation |
| k26a | 1 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pp38-dependent NFκBn phosphorylation |
| k26b | 0.1 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pJNK-dependent NFκBn phosphorylation |
| k26c | 0.6 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pERK-dependent NFκBn phosphorylation |
| k27a | 0.07 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pp38-dependent AP-1 phosphorylation |
| k27b | 0.07 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pJNK-dependent AP-1 phosphorylation |
| k27c | 0.07 | s<sup>-1</sup> | Rate constant of pERK-dependent AP-1 phosphorylation |
| J11 | 1 | nM | Michaelis constant of TRC_int-dependent TRAF phosphorylation |
| J12 | 0.05 | nM | Michaelis constant of ERC_int-dependent FAK phosphorylation |
| J13 | 40 | nM | Michaelis constant of pTRAF-dependent p38 phosphorylation |
| J14 | 40 | nM | Michaelis constant of pFAK-dependent ERK phosphorylation |
| J15 | 20 | nM | Michaelis constant of pTRAF-dependent IKK phosphorylation |
| J16a | 40 | nM | Michaelis constant of pFAK-dependent IKK phosphorylation |
| J16b | 40 | nM | Michaelis constant of pFAK-dependent IKK phosphorylation |
| J20 | 0.8 | nM | Michaelis constant of TRC_int-dependent Smad3 phosphorylation |
| J26a | 7.6 | nM | Michaelis constant of pp38-dependent NFκBn phosphorylation |
| J26b | 46.8 | nM | Michaelis constant of pJNK-dependent NFκBn phosphorylation |
| J26c | 10 | nM | Michaelis constant of pERK-dependent NFκBn phosphorylation |
| J27a | 200 | nM | Michaelis constant of pp38-dependent AP-1 phosphorylation |
| J27b | 200 | nM | Michaelis constant of pJNK-dependent AP-1 phosphorylation |
| J27c | 200 | nM | Michaelis constant of pERK-dependent AP-1 phosphorylation |
表6.ODE模型中与去磷酸化过程相关的参数
| 参数 | 数值 | 单位 | 生物学释义 |
| Vdep11 | 1 | nM·s-1 | Rate constant of pTRAF spontaneous dephosphorylation |
| Vdep12 | 0.23 | nM·s-1 | Rate constant of pFAK spontaneous dephosphorylation |
| Vdep13 | 6 | nM·s-1 | Rate constant of pp38 spontaneous dephosphorylation |
| Vdep14 | 6 | nM·s-1 | Rate constant of pJNK spontaneous dephosphorylation |
| Vdep15 | 6 | nM·s-1 | Rate constant of pERK spontaneous dephosphorylation |
| Vdep16 | 10 | nM·s-1 | Rate constant of pIKK spontaneous dephosphorylation |
| Vdep20 | 10 | nM·s-1 | Rate constant of pSmad3 spontaneous dephosphorylation |
| Vdep26 | 1 | nM·s-1 | Rate constant of pNFκB spontaneous dephosphorylation |
| Vdep27 | 16 | nM·s-1 | Rate constant of pAP-1 spontaneous dephosphorylation |
| Jdep11 | 20 | nM | Michaelis constant of pTRAF spontaneous dephosphorylation |
| Jdep12 | 32 | nM | Michaelis constant of pFAK spontaneous dephosphorylation |
| Jdep13 | 100 | nM | Michaelis constant of pp38 spontaneous dephosphorylation |
| Jdep14 | 100 | nM | Michaelis constant of pJNK spontaneous dephosphorylation |
| Jdep15 | 100 | nM | Michaelis constant of pERK spontaneous dephosphorylation |
| Jdep16 | 10 | nM | Michaelis constant of pIKK spontaneous dephosphorylation |
| Jdep20 | 10 | nM | Michaelis constant of pSmad3 spontaneous dephosphorylation |
| Jdep26 | 100 | nM | Michaelis constant of pNFκB spontaneous dephosphorylation |
| Jdep27 | 10 | nM | Michaelis constant of pAP-1 spontaneous dephosphorylation |
表7.ODE模型中与蛋白出核和入核过程相关的参数
| 参数 | 数值 | 单位 | 生物学释义 |
| k22im | 0.0008 | s-1 | Nuclear import rate constant for pp38 |
| k23im | 0.0008 | s-1 | Nuclear import rate constant for pJNK |
| k24im | 0.0008 | s-1 | Nuclear import rate constant for pERK |
| k25im | 0.00005 | s-1 | Nuclear import rate constant for NFκB |
| k28im | 0.00267 | s-1 | Nuclear import rate constant for pSmad3/4 |
| k29ex | 0.000316 | s-1 | Nuclear export rate constant for pp38n |
| k30ex | 0.000316 | s-1 | Nuclear export rate constant for pJNKn |
| k31ex | 0.000316 | s-1 | Nuclear export rate constant for pERKn |
| k32ex | 0.0000316 | s-1 | Nuclear export rate constant for NFκBn |
| k33ex | 0.0003 | s-1 | Nuclear export rate constant for pSmad3/4n |
表8.ODE模型中与基因表达过程相关的参数
| 参数 | 数值 | 单位 | 生物学释义 |
| kexp1 | 1 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent TGF-βexpression |
| kexp2 | 1.5 | #·s-1 | Rate constant of pSmad3/4n-dependent ECM expression |
| kexp3a | 0.7533729 | #·s-1 | Rate constant of pNFκBn-dependent MCP-1 expression |
| kexp3b | 0.7533729 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent MCP-1 expression |
| kexp3c | 0.7533729 | #·s-1 | Rate constant of pSmad3/4n-dependent MCP-1 expression |
| kexp4a | 0.7533729 | #·s-1 | Rate constant of pSmad3/4n-dependent MCP-1 expression |
| kexp4b | 0.7533729 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent MMP expression |
| kexp5a | 0.0001 | #·s-1 | Rate constant of pNFκBn-dependent Bcl expression |
| kexp5b | 0.0001 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent Bcl expression |
| kexp6 | 0.002 | #·s-1 | Rate constant of pSmad3/4n-dependentα-SMA expression |
| kexp7a | 0.0005 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent CycD expression |
| kexp7b | 0.0005 | #·s-1 | Rate constant of pAP-1-dependent CycD expression |
| Jexp1 | 6.5 | nM | Michaelis constant of pAP-1-dependent TGF-βexpression |
| Jexp2 | 7.5 | nM | Michaelis constant of pSmad3/4n-dependent ECM expression |
| Jexp3a | 35 | nM | Michaelis constant of pSmad3/4n-dependent ECM expression |
| Jexp3b | 35 | nM | Michaelis constant of pAP-1-dependent MCP-1 expression |
| Jexp3c | 35 | nM | Michaelis constant of pSmad3/4n-dependent MCP-1 expression |
| Jexp4a | 65 | nM | Michaelis constant of pNFκBn-dependent MMP expression |
| Jexp4b | 65 | nM | Michaelis constant of pAP-1-dependent MMP expression |
| Jexp5a | 650 | nM | Michaelis constant of pNFκBn-dependent Bcl expression |
| Jexp5b | 650 | nM | Michaelis constant of pAP-1-dependent Bcl expression |
| Jexp6 | 650 | nM | Michaelis constant of pSmad3/4n-dependentα-SMA expression |
| Jexp7a | 650 | nM | Michaelis constant of pSmad3/4n-dependent CycD expression |
| Jexp7b | 650 | nM | Michaelis constant of pAP-1-dependent CycD expression |
| n1 | 2 | N/A | Hill coefficient for TGF-βsynthesis by pAP-1 |
| n2 | 2 | N/A | Hill coefficient for ECM synthesis by pSmad3/4n |
| n3a | 2 | N/A | Hill coefficient for MCP-1 synthesis by pNFκBn |
| n3b | 2 | N/A | Hill coefficient for MCP-1 synthesis by pAP-1 |
| n3c | 2 | N/A | Hill coefficient for MCP-1 synthesis by pSmad3/4n |
| n4a | 2 | N/A | Hill coefficient for MMP synthesis by pNFκBn |
| n4b | 2 | N/A | Hill coefficient for MMP synthesis by pAP-1 |
| n5a | 2 | N/A | Hill coefficient for Bcl synthesis by pNFκBn |
| n5b | 2 | N/A | Hill coefficient for Bcl synthesis by pAP-1 |
| n6 | 2 | N/A | Hill coefficient forα-SMA synthesis by pSmad3/4n |
| n7a | 2 | N/A | Hill coefficient for CycD synthesis by pSmad3/4n |
| n7b | 2 | N/A | Hill coefficient for CycD synthesis by pAP-1 |
S3、细胞和组织尺度模型的模拟：细胞和组织尺度模型的模拟基于ABM规则实现，ABM规则参数如表9所示。
表9.细胞和组织尺度ABM模型的参数
在该模型中，通过设置主体的细胞特异性规则，来模拟细胞与细胞之间的交互。细胞水平的交互规则包括MCs的招募、MCs和FBCs的移动、FBCs和TECs的增殖、FBCs分化为MFBCs、TECs发生EMT、 TGF-β1诱导的TECs凋亡、细胞死亡以及介质的分泌。细胞的各种行为通过基于概率的规则实现，且在每个ABM步长内进行细胞行为的更新。
细胞行为的动力学模拟过程如图3所示，首先一个细胞感知到周围环境中的刺激，继而将刺激信号传递到细胞内分子网络，进而调整细胞行为。系统计算出相应细胞行为对应的概率P，并且生成一个随机数 r∈(0,1)。最后，如果r≤P，发生相应的细胞行为。在组织水平上，模型考虑组织瘢痕的形成与ECM(细胞外基质)浓度相关，ECM的浓度达到一个阈值，则产生瘢痕。
参数的获得及校准：通过已发表的文献获取模型参数的实际数值或者合理的参数范围，进而用不确定性和敏感性分析得到对模型输出有显著性影响的参数，然后对部分参数通过实验数据进行非线性拟合或直接测定。
分子水平的ODE模型，细胞水平的ABM模型以及细胞外水平的PDE模型参数如附表4～10所示中。
表10.细胞外尺度PDE模型的参数
| Parameter | Value | Units | Biological interpretation |
| D<sub>MCP1</sub> | 0.000000052 | cm<sup>2</sup>/s | The diffusion coefficient of MCP1 |
| D<sub>TGFB</sub> | 0.00000027 | cm<sup>2</sup>/s | The diffusion coefficient of TGF-β |
| D<sub>MMP</sub> | 0.000000001 | cm<sup>2</sup>/s | The diffusion coefficient of MMP |
| k<sub>degMCP1</sub> | 0.00002 | s<sup>-1</sup> | The degradation rate constant of MCP1 |
| k<sub>degTGFB</sub> | 0.00385 | s<sup>-1</sup> | The degradation rate constant of TGF-β |
| k<sub>degECM</sub> | 0.00000428 | s<sup>-1</sup> | The degradation rate constant of ECM |
| k<sub>degMMP</sub> | 0.0000000868 | s<sup>-1</sup> | The degradation rate constant of MMP |
| k<sub>degM2E</sub> | 0.0000787 | (nM·s)<sup>-1</sup> | The degradation rate constant of ECM induced by MMP |
| k<sub>secMCP1</sub> | 0.00086 | nM/s | The secretion rate of MCP-1 by Macrophages |
| k<sub>secTGFB</sub> | 0.0043 | nM/s | The secretion rate of TGF-β by Macrophages |
| k<sub>secECM</sub> | 0.0068 | nM/s | The secretion rate of ECM by Myofibroblasts |
| k<sub>secMMP</sub> | 0.000086 | nM/s | The secretion rate of MMP by Macrophages |
如图4A所示，细胞外的损伤刺激因子TGF-β刺激肾间质中的TECs，激活了细胞内的NF-κB等炎症通路，从而表达并分泌MCP-1等趋化因子。MCP-1促使炎性细胞向肾间质浸润并活化。活化的巨噬细胞分泌更多的TGF-β1、MCP-1和MMP等物质参与RIF的调节。分泌的TGF-β1诱导TECs和FBCs内 TGF-β/Smad信号通路的激活，促进TECs和FBCs的表型转变为肌成纤维细胞，分泌大量的ECM。同时， FBCs的增殖和TECs的凋亡由TGF-β1诱导。此外，更多的TGF-β进一步促进NF-κB等炎症信号通路的激活。随后，肾脏固有细胞数量不断减少，肌成纤维细胞不断增多，ECM的合成与降解失衡，肾间质中ECM 过度堆积，瘢痕硬化形成。
通过整合分子尺度网络，细胞和组织尺度网络，我们构建了包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度RIF疾病网络。
S4、细胞外尺度模型的模拟：细胞外尺度网络模型基于PDE方程模拟细胞外环境中的分子随时间的浓度变化，包括TGF-β1、MCP-1、ECM以及MMP。其数学表达式以反应-扩散方程表示：
公式等号右侧第一项
表示细胞外分子的扩散过程，由显式欧拉五点差分法求数值解，区域的边界用Dirichlet边界条件进行处理。
第二项
表示细胞外分子的降解，对该过程求取解析解。
第三项
表示所有主体产生或消耗的细胞外分子。
其中Dc表示扩散系数，δc是降解速率常数，A(x,y,V)表示用某个时间的状态变量(V)和位置信息 (x,y)描述的主体A，β是速率参数的向量，Y1,Y2,...,YR表示所有与主体相关的物质，g(C,Y1,Y2,...,YR,β) 是主体关于细胞外分子的反应函数。
S5、各尺度网络模型的整合：
多尺度网络模型模拟肾间质分别在低浓度TGF-β1(1ng/mL)和高浓度TGF-β1(10ng/mL)刺激下21天的病理进程，模型通过迭代算法运行。细胞行为和组织形态由基于主体的模型(agent-based model，ABM)规则控制，其更新时长(dtA)为1h。在基于PDE的模型中，扩散、降解和介质分泌事件的更新步长(dtD)为 30s。在基于ODE的模型中，细胞内分子过程的时间步长(dtM)为6s。因此，在每个dtD的步长里，分子水平事件更新5次。在每个dtA的步长里，扩散，降解和介质分泌事件能更新120次。模拟的总时长(T)为 21天。最终可得到与RIF疾病进程相关的多种输出，包括各种细胞数量的变化，剩余的肾小管数量以及瘢痕组织的面积。
S6、大黄酸干预模拟
大黄酸作用分子网络中p38和JNK蛋白的磷酸化过程来调节分子水平信号通路，从而影响模型在细胞水平以至组织水平的输出。修改ODE方程以模拟大黄酸的抑制作用。公式(6)描述了大黄酸干预后的蛋白磷酸化速率：
公式右侧的第一项
表示蛋白[Kc]在大黄酸干预时的磷酸化过程，第二项
表示去磷酸化过程。[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中激酶蛋白和磷酸化蛋白的浓度。D是大黄酸的浓度。参数Ki表示大黄酸对蛋白Kc磷酸化过程的抑制常数，该参数通过实验获得，参数值为4.03×10-11M。
基于上述模型分别模拟大黄酸不同浓度、作用于单靶点/双靶点及不同病理阶段的干预差异，每种干预模式重复模拟50次。
S7、模型的实现：
模型模拟的环境为1mm×1mm的二维肾皮质部分，并且该部分被分成了50×50的四方格点，即每一个格点的大小为20μm×20μm，约为1个细胞的大小。上述模拟过程基于Matlab编程语言实现，并在 400核服务器上进行运算。
构建如实施例1所示的网络药理学模型。基于以上模型，进行临床细胞实验。
细胞培养和试剂：人肾小管上皮细胞(HK-2)和人肾成纤维细胞(KFB)获自American type culture collection(ATCC，USA)。
将HK-2细胞维持在90％高葡萄糖DMEM细胞培养基(Gibco，USA)中，补充有10％热灭活的胎牛血清(Gibco,Australia)，100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素(Gibco,USA)。将KFB细胞维持在90％高葡萄糖DMEM细胞培养基(Gibco，USA)中，补充有10％热灭活的胎牛血清(Gibco，South America)，100U/mL 青霉素G和100μg/mL链霉素(Gibco，USA)。将这两种细胞培养在37℃下含5％CO2的恒温培养箱中。
转化生长因子-β1(TGF-β1)购自Sigma(USA)，并溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃。在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mL牛血清白蛋白(BSA，meilunbio，DaLian， China)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco，USA)稀释至各种工作浓度。胰蛋白酶购自Gibco(USA)。噻唑基蓝四唑溴化物(MTT)，DMSO，4％组织细胞固定剂，Triton X-100，抗荧光减毒片(含DAPI)来自Solarbio(BeiJing， China)。α-平滑肌肌动蛋白(D4K9N)XP兔购自CST(中国)。FITC Affini Pure抗兔IgG(H+L)IgG购自 Earthox(USA)。α-SMA和Fn的ELISA试剂盒来自酶联(ShangHai,China)。
实验例1：上皮细胞凋亡试验
通过常规MTT测定法测定HK-2细胞增殖。将约5000个HK-2细胞每孔接种到96孔板上。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜，使细胞同步，在37℃和5％CO2下用不同浓度的活化TGF-β1处理(0、1、2、3、4、5、8和10ng/mL)48小时。在培养终止前4小时向每个孔中加入25μL MTT。然后弃去上清液并加入150μL的DMSO。摇动以溶解结晶后，通过酶标仪测量490nm 处的光密度，相同实验条件下重复三次。
实验例2：成纤维细胞增殖和大黄酸干预试验
将约5000个KFB细胞每孔接种到96孔板上。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜，使细胞同步，在37℃和5％CO2下用不同浓度的活化TGF-β1(1、2、3、4、5、8和10ng/mL)处理24小时。大黄酸干预实验中，同时用10ng/mL TGF-β1和不同浓度的大黄酸(1、5、10和 20ng/mL)处理24小时，0ng/mL TGF-β1组和DMSO组为对照组。在培养终止前4小时向每个孔中加入 25μL MTT。4小时后弃去上清液并加入150μL的DMSO。摇动以溶解结晶后，通过酶标仪测量490nm 处的光密度，相同实验条件下重复三次。
实验例3：成纤维细胞和上皮细胞的分化及大黄酸干预试验
通过免疫荧光测量细胞分化。将约10000个细胞接种到24孔板中。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜，以同步细胞并恢复基础水平的α-SMA。12小时后，用1、2、 3、4、5、6、7、8、9和10ng/mL TGF-β1处理24小时(KFB细胞)或48小时(HK-2细胞)。大黄酸干预实验中，同时用10ng/mL TGF-β1和不同浓度的大黄酸(1、5、10和20ng/mL)处理24小时(KFB细胞)或48 小时(HK-2细胞)，0ng/mL TGF-β1组和DMSO组为对照组。室温下用4％多聚甲醛固定、0.2％Triton X-100 通透和5％牛血清白蛋白(BSA)封闭，再将细胞与抗α-SMA抗体在4℃下过夜。将FITC标记的抗兔IgG抗体加入细胞中并在37℃室温下避光1小时。用PBST冲洗细胞并暴露于DAPI染细胞核。在正置荧光显微镜下观察细胞，计数每孔3至5个视野，并测定表达α-SMA的总细胞的比例。
实验例4：细胞外Fn的测定
将约10000个KFB细胞接种到24孔板中。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，并且用不同浓度的活化TGF-细胞饥饿和8ng/mL)在37g和5％CO2下分别作用24小时和48小时。使用Fn ELISA试剂盒在24和48小时测量细胞外Fn含量，通过酶标仪测量 490nm处的光密度，每个浓度设置两个复孔，实验重复三次。
实验例1～实验例4结果：
TGF-β1介导肾小管上皮细胞(HK-2)的凋亡与分化：实验研究了1、2、3、4、5、8和10ng/mL TGF-β1 对上皮细胞48h后的抑制作用。结果如图5A所示，与对照组比较，当TGF-β1浓度≤3ng/mL时，上皮细胞虽凋亡，但无显著性差异，当TGF-β1浓度≥4ng/mL时，TGF-β1上皮细胞的生长明显凋亡TGF-β1对 HK-2EMT过程影响的α-SMA免疫荧光实验如图5C所示。从图5C中可以看出，当不加TGF-β1时，HK-2 细胞不分化；当加入1ng/mL时，细胞出现分化；当浓度为10ng/mL时，细胞几乎全部分化。
TGF-β1促进肾成纤维细胞(KFB)的增殖与分化：实验考察了1、2、3、4、5、8和10ng/mL TGF-β1 对肾成纤维细胞的增殖影响，结果如图5B所示。与对照组相比，当TGF-β1浓度≤3ng/mL作用24h后，虽有增殖，但无显著性差异。当TGF-β1浓度≥4ng/mL时，肾成纤维细胞有显著的增殖(P≤0.05)，随着 TGF-β1浓度的增加，肾成纤维细胞的增殖更为明显。TGF-β1对KFB分化影响的α-SMA免疫荧光实验结果如图5D所示，当不加TGF-β1时，KFB细胞不分化；当加入1ng/mL TGF-β1时，细胞出现分化；当浓度为10ng/mL时，细胞几乎全部分化。
大黄酸抑制TGF-β1介导的肾成纤维细胞(KFB)的增殖与分化：实验考察了1、5、10和20ng/mL大黄酸对10ng/mL TGF-β1作用的肾成纤维细胞增殖的影响，结果如附图12A所示，与对照组相比，当大黄酸浓度≥1ng/mL作用24h后，明显抑制TGF-β1介导的肾成纤维细胞增殖作用，导致肾成纤维细胞的凋亡(P ≤0.05)，大黄酸对肾成纤维细胞的凋亡作用并未随其浓度的增加而增强。
大黄酸对10ng/mL TGF-β1作用的KFB分化影响α-SMA免疫荧光实验结果如附图12B所示，当不加 TGF-β1时，KFB细胞不分化；当TGF-β1浓度为10ng/mL时，细胞几乎全部分化；当加入10ng/mL TGF-β1 和5ng/mL大黄酸时，细胞分化明显得到抑制。
大黄酸抑制TGF-β1介导的肾小管上皮细胞(HK-2)的分化：α-SMA免疫荧光实验用于研究大黄酸对10 ng/mL TGF-β1作用的HK-2分化影响结果如附图12C所示，当不加TGF-β1时，HK-2细胞不分化；当TGF-β1 浓度为10ng/mL时，细胞几乎全部分化；当加入10ng/mLTGF-β1和5ng/mL大黄酸时，细胞分化明显得到抑制。
TGF-β1对成纤维细胞分泌Fn的影响：在相同的实验条件下，通过ELISA试剂盒测定成纤维细胞在8 ng/mL TGF-β1处理24小时和48小时后分泌的Fn的量。由附图13可知，在8ng/mL TGF-β1作用下，48 小时后细胞分泌Fn的量较24小时明显增加。
结合实施例1给出RIF多尺度网络模型的动态模拟结果：
细胞内分子水平的结果
模拟了TECs和FBCs细胞内的分子网络模型后观察细胞内一些细胞因子和蛋白的浓度变化。图6、7 中，黄线和红线分别代表的是1ng/mL和10ng/mL TGF-β1刺激下的结果。由图可知，在1ng/mL TGF-β1 的刺激下，TEC中的TGF-β1、ECM、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和MMP浓度均维持在基线水平；FBC中的TGF-β1、ECM、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和MMP浓度一开始处于基线水平，约10h后呈现快速增长的趋势。然而，在10ng/mL TGF-β1的刺激下，无论是TEC还是FBC，细胞内TGF-β1、ECM、MCP-1、 Cyclin、ɑ-SMA和MMP浓度的增速均高于1ng/mL TGF-β1的刺激。其中，FBC内TGF-β1、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和MMP的浓度随时间呈现线性增长；TEC内MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和MMP的浓度随时间亦呈现线性增长，而TGF-β1随时间的浓度先快速下降，而后上升，稳定在一个较低水平。两种细胞内ECM的浓度均先增加，在约6h后趋于稳定。
实验例5：病理形态学的观察和生化指标检测
右侧肾组织包埋、切片后进行苏木精-伊红HE和Masson染色，正置荧光显微镜下观察造模后肾间质纤维化情况及给药后对大鼠肾间质纤维化的影响。
细胞和组织水平的结果:多尺度网络模型模拟了肾间质在低浓度TGF-β1(1ng/mL)和高浓度TGF-β1(10 ng/mL)刺激下21天的病理进程。
TGF-β1是诱导RIF的重要介质，可以由多种刺激诱导产生，并作为多功能调节剂发挥其促纤维化作用。如图8所示，在初始浓度为1ng/mL TGF-β1的模拟中，细胞数量变化如图8A所示，TEC的数量基本保持不变，仅有轻微波动，表明TEC一直处于增殖和死亡的平衡状态。此外，低浓度的TGF-β1不足以活化肾脏固有细胞并引发炎症反应以产生趋化因子MCP-1，因此没有MC从血管来源浸润到组织中。没有 MC的招募，TGF-β1和其他细胞因子仍然处于正常水平，FBC保持静息状态，没有大量增殖和分化。21 天后的肾组织中，肾小管完好，组织中未形成瘢痕。
如附图14A，15A所示，大鼠组织的HE和Masson结果显示假手术组大鼠不同时间点肾小球、肾小管间质结构正常，小管之间间隙紧密，肾间质中无炎性细胞浸润。Scr和BUN的检测结果如附表11所示，假手术组的Scr和BUN在正常生理范围内。因此，在1ng/mL TGF-β1刺激下的模拟结果与假手术组的动物实验结果基本相符。
表11.各组大鼠血清中的肌酐、尿素氮含量
| 组别 | 肌酐 | 尿素氮 |
| sham | 15.16±2.93 | 5.62±0.32 |
| UUO 7天 | 55.96±7.24<sup>a</sup> | 9.10±0.09<sup>a</sup> |
| UUO 14天 | 62.37±6.35<sup>a</sup> | 11.21±0.76<sup>a</sup> |
| UUO 21天 | 62.50±11.11<sup>a</sup> | 11.67±0.38<sup>a</sup> |
| Rhein 7天 | 42.53±5.01<sup>a</sup> | 6.16±0.12<sup>ab</sup> |
| Rhein 14天 | 55.74±5.26<sup>a</sup> | 8.14±0.46<sup>ab</sup> |
| Rhein 21天 | 57.68±6.41<sup>a</sup> | 7.36±0.29<sup>ab</sup> |
如图8A所示，10ng/mL的TGF-β1刺激后，TEC的数量逐渐减少，这与图5A中，10ng/mLTGF-β1 诱导TECs凋亡的细胞实验结果相一致。在使用10ng/mL TGF-β1刺激后的第7天左右，TEC的数量急剧下降，MFBC的数量开始上升，这一模拟结果与Fan等人与Lan等人文章中报道的10ng/mL TGF-β1可以诱导EMT的实验结果相符，也与图5C中细胞免疫荧光实验结果一致。模拟结果中FBC的数量开始时显著增加，约第9天时后迅速减少，而MFBC的数量约在第7天后开始迅速增加，直至模拟的最后几天趋于平稳。这些过程表明FBCs在模拟过程中先增殖，再分化成为MFBCs，与图5B中10ng/mL TGF-β1诱导成纤维细胞增殖和图5D中的分化实验结果一致。
在模拟进程中，如图8A所示，MC的数量随时间而增加，约7天后趋于稳定。这与文献报道的高浓度TGF-β1可以诱导炎症细胞从血管来源浸润到组织中，并活化成MCs的结果一致。如图8B所示，在模拟的最后几天，所有模拟格点几乎完全被MFBCs占据，MCs在一块区域集中分布。组织水平的模拟结果显示肾小管大部分被破坏，模拟区域中形成了大量的瘢痕，替代了正常组织。如附图14，15所示，UUO 模型大鼠组织的HE和Masson结果显示模型组大鼠7天开始出现肾间质增宽，显微镜下可观察到间质细胞增多，胶原成分增加、沉积，空泡出现，肾小管病变，肾间质纤维化。模型组14天小管萎缩，肾实质被纤维组织取代，空泡进一步增多，胶原沉积，炎细胞浸润。模型组21天时，胶原纤维大量沉积，炎症细胞浸润，为重度病变。如附表11所示，Scr和BUN的检测结果显示模型组随着时间的延长，Scr和BUN 的数值逐渐上升，模型组21天的肌酐、尿素氮水平分别为62.50±11.11，11.67±0.68，明显高于模型组7 天的55.96±7.24，9.10±0.09和假手术组的15.16±2.93，5.62±0.32。提示在10ng/mL TGF-β1刺激下的模拟结果与实验中模型组动物的病程相似。
上述结果表明，在模型模拟中，较低浓度的TGF-β1刺激下，RIF不会被诱导，而高浓度TGF-β1刺激，则会导致肾脏纤维化的产生。
大黄酸对RIF疾病网络模型的干预结果
大黄酸对分子通路网络干预的结果：10ng/mL TGF-β1刺激下的ODE模型中，20nM大黄酸干预后FBC 细胞内各物质的浓度变化如图6中的蓝线所示。其中TGF-β1、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和MMP浓度的增长较未干预时有较明显的滞后。ECM浓度的增加在大黄酸干预前后同时开始，约6h后趋于平缓，最终近似于未干预时的浓度水平。20nM大黄酸干预后TEC细胞内各物质的浓度变化如图7中的蓝线所示。其中 TGF-β1、Cyclin、ɑ-SMA浓度的增长较未干预的模拟明显滞后。大黄酸干预下MCP-1、MMP浓度的增长速率较未干预时缓慢。ECM浓度的增加在大黄酸干预前后同时开始，最后近似于未干预时的浓度水平。
不同浓度大黄酸对多尺度网络干预的结果：为了模拟不同浓度大黄酸的干预效果，在高浓度TGF-β1 刺激的模型中加入大黄酸的干预。将大黄酸的浓度分别设为5nM、10nM、20nM和7μM(组织分布浓度)。
如图9所示：分别用5nM、10nM、20nM和7μM的大黄酸干预后，细胞和组织水平的模拟结果相似。TEC基本保持稳定，在模拟的最后几天略有凋亡。EMT过程和FBC的增殖过程受到抑制，MFBC数量基本未增加。组织水平上，肾小管结构基本都没有受到损伤，瘢痕组织没有形成。与图8所示的对照组相比，TGF-β1诱导的RIF进程被明显缓解。如附图14，15所示，组织的HE和Masson结果显示大黄酸给药组第7天、第14天、第21天与对应时间点模型组的7天、14天、21天相比，空泡减少，胶原沉积，炎细胞浸润等情况有所改善，纤维化程度减轻。
如附表11所示，Scr和BUN的结果显示大黄酸给药组与同时间段的模型组相比较，Scr和BUN明显下降。对于尿素氮，模型组14天时尿素氮含量为11.21±0.76，大黄酸给药组尿素氮为8.14±0.46，显著低于模型组，略高于假手术组的5.62±0.32。对于肌酐，大黄酸组(7天，14天，21天)与模型组(7天，14 天，21天)都比sham组有所增大，含量差异有统计学意义(P<0.05)。将大黄酸组(7天，14天，21天)的肌酐水平与对应天数的模型组比较，其肌酐水平有所下降，但下降不明显。
大黄酸在不同病理阶段对多尺度网络进行扰动的结果：为考察大黄酸在不同病理阶段对疾病网络的扰动影响，分别在模拟的开始，模拟的第7天和第14天加入大黄酸的干预。在模拟开始时，如图10A所示，用20nM大黄酸干预，RIF纤维化程度显著减轻。从第7天开始给予大黄酸干预时，模拟结果如图10B所示，TEC的数量在模拟的0-7天缓慢减少，大黄酸干预后有所增加。FBC数量呈现缓慢持续的增加。MFBC 的数量在第7天之后略有增加，但较快达到平稳状态。21天后，组织水平有些许瘢痕形成，部分肾小管被破坏。当从第14天开始给予大黄酸时，如图10C所示，TEC、FBC、MFBC和MC的细胞数量在14天后都基本保持不变，最终肾组织出现严重的瘢痕化。
多靶点干预与单靶点干预效果的比较：在细胞水平上，当单独靶向JNK蛋白时，模拟结果如图11B 所示，TEC的数量持续缓慢减少，从第7天开始，细胞减少趋势更加明显，直至第21天仍有部分TECs 存活。FBC的数量从约第3天开始缓慢增加，至模拟的第14天，增长趋于平缓，在20天之后数量呈现出下降的趋势。MFBCs的数量在第7天左右开始快速增加。MC的数量持续增长，在第10天左右增速下降。 21天后，格点中的细胞大部分为MFBCs，FBCs的数量约为MFBCs的一半。当单独靶向p38蛋白时，模拟结果如图11C所示，TEC的数量持续缓慢减少，从第7天开始细胞数量减少的速率加快，至第14天模拟格点中仅存个别的TECs。FBC的数量先增加，而后减少。MFBCs的数量在第7天左右开始迅速增加。 MC的数量持续增长，在第10天之后趋于平缓。21天后，模拟的格点几乎被MFBCs占据。在组织尺度上，单独靶向JNK蛋白和p38蛋白虽有延缓病程，但疗效并不明显。而靶向双靶点时，如图11A所示，TECs 基本存活，EMT过程和FBC的增殖过程受到抑制，MFBC数量基本未增加。组织水平上，肾小管结构基本都没有受到损伤，瘢痕组织没有形成，纤维化明显得到缓解。
模拟大黄酸对分子网络和多尺度网络的干预，表明细胞分子网络与分子-细胞-组织多尺度网络差异较大，多尺度网络由于考虑了分子、细胞和形成组织的交互影响，更适合疾病实际模拟；模拟大黄酸对不同病理阶段多尺度网络的扰动，表明慢性肾病的治疗越早干预，疗效越佳。模拟了大黄酸剂量对疾病多尺度网络的影响，表明药物剂量在一定范围内不会造成疾病疗效的显著差异。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于,包括以下步骤：
S1、构建小管上皮细胞和成纤维细胞的细胞内分子信号通路网络，构建包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度分子网络；
S2、根据步骤S1中得到的所述多尺度分子网络，通过质量守恒定律、米氏方程和希尔方程构建ODE方程，进行分子尺度的网络模型模拟；
S3、细胞和组织尺度模型的模拟：该模拟基于ABM规则实现，通过设置主体的细胞特异性规则来模拟细胞与细胞之间的交互，细胞行为的动力学模拟过程为：首先一个细胞感知到周围环境中的刺激，继而将刺激信号传递到细胞内分子网络并调整细胞行为，
其次由系统计算出相应细胞行为对应的概率P再生成一个随机数r∈(0,1)，若r≤P，则发生相应的细胞行为，
在组织水平上，当细胞外基质的浓度达到阈值，则产生瘢痕；
S4、细胞外尺度模型的模拟：基于PDE方程模拟细胞外环境中的分子随时间的浓度变化；
S5、利用步骤S2中得到的多尺度分子网络模型模拟肾间质的病理进程，该模型通过迭代算法运行，细胞行为和组织形态由ABM规则控制，最终得到与疾病进程相关的输出值；
S6、大黄酸干预模型：修改ODE方程以模拟大黄酸的抑制作用，并描述大黄酸干预后的蛋白磷酸化速率，再分别模拟大黄酸不同浓度、作用于单靶点/双靶点及不同病理阶段的干预；
S7、模型的实现：模型模拟的环境为1mm×1mm的二维肾皮质部分，并且该部分被分成了50×50的四方格点，即每一个格点的大小为20μm×20μm，约为1个细胞的大小，所述模拟过程基于Matlab编程语言实现。
2.根据权利要求1所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下步骤：
S1-1:根据肾间质纤维化分子机制和信号通路总结肾间质纤维化分子通路，再结合KEGG数据库构建分子信号通路网络；
S1-2：简化分子信号通路网络：保留并根据质量守恒原则简化TGF-β/Smad信号通路、MAPK信号通路以及NF-κB信号通路，保留并精简大黄酸作用靶点蛋白p38 MAPK蛋白和JNK蛋白再收敛作用于一个中心蛋白的信号级联通路，保留通路中的肾纤维化指标性蛋白；
S1-3：构建包括小管上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞的多尺度分子网络。
3.根据权利要求2所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于，步骤S2具体包括以下步骤：
S2-1:受体与配体之间的结合和解离过程为：
受体浓度随时间的变化为：
其中，[L]表示配体、[R]表示受体[L·R]表示配体-受体复合物的浓度；参数kon是结合速率常数，kdiss是解离速率常数；
S2-2：磷酸化过程为：
该过程由米氏方程描述，细胞质激酶蛋白的磷酸化速率为：
其中，[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中的激酶蛋白浓度和磷酸化后的激酶蛋白浓度；[P]是该激酶蛋白的上游蛋白的浓度，参数k是米氏方程的速率常数，J是米氏常数；参数Vdep和Jdep分别表示去磷酸化的最大速率和米氏常数；
S2-3：细胞质中的蛋白入核过程为：
这一过程由质量作用定律进行模拟，细胞核内蛋白的动态变化为：
其中，[Kn]表示细胞核内激酶蛋白的浓度，[Kc]表示细胞质中激酶蛋白的浓度，kim是激酶蛋白转移入核的速率常数；
S2-4：由希尔方程模拟调节蛋白调控下的基因表达过程：[T]→[L]，表达产物的生成速率为：
其中[T]表示调节蛋白的浓度，[L]是表达产物的浓度，kexp表示速率常数，Jexp表示米氏方程，h表示希尔系数。
4.根据权利要求3所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于：步骤S3中，细胞水平的交互规则包括MCs的招募、MCs和FBCs的移动、FBCs和TECs的增殖、FBCs分化为MFBCs、TECs发生EMT、TGF-β1诱导的TECs凋亡、细胞死亡以及介质的分泌。
5.根据权利要求4所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于：步骤S3中，细胞外环境中的分子随时间的浓度变化的数学表达式以反应-扩散方程表示：
其中Dc表示扩散系数，δc是降解速率常数，A(x,y,V)表示用某个时间的状态变量(V)和位置信息(x,y)描述的主体A，β是速率参数的向量，Y1,Y2,...,YR表示所有与主体相关的物质，g(C,Y1,Y2,...,YR,β)是主体关于细胞外分子的反应函数。
6.根据权利要求5所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于，步骤S6中大黄酸干预后的蛋白磷酸化速率为：
[Kc]和[pKc]分别表示细胞质中激酶蛋白和磷酸化蛋白的浓度，D是大黄酸的浓度，参数Ki表示大黄酸对蛋白Kc磷酸化过程的抑制常数。
7.根据权利要求2或6所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于，步骤S1-2中，所述肾纤维化指标性蛋白包括有ɑ-SMA，Fn和细胞周期关键蛋白Cyclin。
8.根据权利要求7所述的解析大黄酸对肾间质纤维化作用效果的定量网络药理学模型构建方法，其特征在于：步骤S4中，细胞外环境中的分子包括TGF-β1、MCP-1、ECM以及MMP。
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