CN102370738A - 一种防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂及制备方法 - Google Patents
一种防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属中药领域,涉及一种治疗和预防慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂及制备方法。本发明以中医“正虚邪实,气血不足,瘀血阻络”理论为依据,采用中药材紫丹参、全当归、桃仁、淮牛膝和制大黄制成中药复方制剂。经动物实验和临床试用,结果显示,本发明的中药复方制剂通过改善肾血液动力学,调节脂质代谢紊乱,增加抗氧化能力,抑制细胞因子的过度表达,从而改善肾小球硬化和间质纤维化程度,保护残余肾的结构和功能,延缓早、中期慢性肾衰恶化的进程。尤其适用于治疗CKD2-4期慢性肾脏病并发肾纤维化病变包括肾功能减退、蛋白尿、肾脏缩小等的患者。
Description
技术领域
本发明属中药领域,涉及一种防、治慢性肾脏病肾纤维化中药复方制剂,具体涉及一种防、治慢性肾脏病(CKD2-4期)肾纤维化的中药复方制剂及制备方法。
背景技术
慢性肾脏病(CKD)是严重危害人类健康的重大疾病,目前在全球范围内正以惊人的速度持续增长。据2007年2月20日国际肾脏病学会新闻公告:目前世界上超过5亿人口患有不同的肾脏疾病,每年超过百万人口死于CKD相关联的心脑血管疾病。CKD其最终会发展为终末期肾脏病(ESRD),已成为继心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病之后又一个威胁人类健康的重要疾病。就全球情况来看,CKD发病率呈上升趋势,已发展为全球性公共卫生问题。
美国肾脏数据登记系统(USRDS)的数据显示,从1988年至2002年美国ESRD的年发病率由39.4/百万人口上升至98.3/百万人口。据估计,未来10年该数据仍将以每年4.1%的百分比上升。北京、上海2个大城市2002~2003年的不完全统计资料显示,实际CRF的发病率远远高于统计的数据。资料还显示每年进入血液透析的新患者人数均在4000例左右,表明在我国慢性肾衰竭存在着不容忽视的增长趋势。研究显示,在首次就诊的CKD患者中有2/3血肌酐超过176.8μmol/L,1/4血肌酐已超过530.4μmol/L。因此,如何对CKD进行早期防治,延缓肾功能进展,降低尿毒症的发病率,延迟CKD进入ESRD的时间,是各国肾脏病研究者面临的重要课题。
研究显示,CKD的病理过程以肾功能的进行性丧失,细胞外基质(Extracellur Martrix, ECM)在细胞外的大量聚积导致的广泛肾纤维化为特征。而肾纤维化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同通路,其特征包括肾小球纤维化、肾间质纤维化、肾血管纤维化,是各种肾脏疾病慢性化主要的病理学表现之一,是各种肾小球、血管和小管间质本身疾病的最后结局。无论基础疾病如何,CKD一旦进展,终将导致肾组织广泛疤痕形成,表现为肾实质毁损和终末期肾功能衰竭。
研究还揭示,当肾脏受到内在或外界损伤,受损组织开始一系列自我修复过程:首先,肾脏固有细胞激活,促炎性细胞因子产生和释放,单核/巨噬细胞、T细胞被招募并向受损部位浸润,随后,系膜细胞、成纤维细胞、小管上皮细胞在相关细胞因子作用下被激活或进行转分化并产生大量ECM;大量ECM沉积可致纤维瘢痕形成和肾组织重构,导致肾实质毁损和肾功能丧失。总之,纤维化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF)是多种因素损伤肾小管上皮细胞后所致的肾脏常见病理变化,其进一步发展导致肾小球毛细血管狭窄、肾小管萎缩、肾功能损害。目前认为,RIF形成的分子机制主要包括四个阶段:(1)细胞活化和损伤阶段;(2)纤维化信号传递阶段;(3)纤维化形成阶段;(4)肾脏结构和功能毁损阶段。
研究者认为,CKD病程进展的原因,既与肾脏病本身的基础病变有关,又与某些共同的途径有关,如:肾脏病变时出现大量蛋白尿、高血压、高血脂、感染、酸中毒、电解质紊乱等基本因素导致肾脏血液动力学改变、肾脏细胞因子分泌、脂代谢紊乱、从而最终导致肾小球硬化、肾脏固有细胞活化及肾小管间质纤维化。因此,在防治CKD的加重过程中,诱发因素的治疗尤为重要,因为对已经毁损的肾单位已是不可逆的,而如何保护残肾的肾功能关键是要对加重肾病进展的诱发因素的治疗,如饮食以及对高血压、高血脂、感染、酸中毒、电解质紊乱、高尿酸血症和大量蛋白尿的治疗。目前,现代医学对肾间质纤维化的研究着重于阻止肾间质纤维化形成的三个阶段即炎症导致细胞因子的释放,纤维母细胞活化和基质的沉淀,以及纠正相关因素(如感染、尿蛋白、高血压、高血糖、血液动力学紊乱等)。随着对肾纤维化发病机制的深入研究,尤其是细胞生物学、分子生物学的研究,有关技术人员针对胶原及其ECM代谢的不同环节,已确立了多种抗肾间质纤维化的途径,如抗TGF-β1抗体、Prifenidon(PFD)、ACEI、血管紧张素II及其受体拮抗剂等抗肾纤维化西药的研究和应用,使抗肾纤维化研究得到了很大发展,但其效果不理想,且目前多限于动物实验阶段,进入实际临床治疗尚有距离,且疗效还待进一步的提高。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的缺陷,提供一种使用方便、成本低廉、疗效好的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂。尤其是一种抗慢性肾脏病(CKD2-4期)肾纤维化的中药复方制剂。
中医文献中没有对CKD论述,但究其病因及症状不离“虚劳”、“水肿”、“癃闭”、“溺毒”等范畴。传统中医认为通过四诊的宏观检测见到或触及坚硬不移的有形肿块称为癥积,而现代中医部分学者借助科技手段(如光镜、电镜等)检测到肾脏形态学改变,如细胞外基质积聚、球囊黏连、血管襻闭塞、局灶或节段性硬化、间质纤维化及肾疤痕形成等,认为肾脏纤维化是发生在肾脏的微型癥积,瘀血阻络则是肾脏微型癥积的主要病理基础。各种慢性肾脏疾病最终可因久病伤正而导致正虚邪实,浊邪上逆,出现水肿、癃闭、关格的结局,而现代医学中通过肾脏纤维化的病理改变确定慢性肾脏疾病的发展进程,两者对 CRF的认识基本一致。中医虽然正虚和邪实各有其说,但从纤维化形成的病理基础来看,其与瘀血证密切相关,属于肾络瘀阻。
中医认为,血瘀其病机主要是血行不畅,产生原因或因于气滞而致血行受阻,或气虚而血行迟缓,或痰浊阻于脉络,或寒邪入血,血寒而凝,或邪热入血,煎灼血液,或外力扭挫伤脉络等均可形成血瘀,甚至血液瘀结成块而成瘀血。因此,瘀血是血瘀病变的病理产物,而在瘀血形成之后,又可阻于络脉。因“络主血”,血液运行于络脉中,故血瘀与络脉关系密切。有学者认为因络脉病变所致的血瘀证三个方面:一为络脉郁滞,即叶天士“邪与气血两凝,结聚络脉”之意;二为络脉空虚,即络中气血不足,络脉失养,其正常功能,气血津液运行失常,痰瘀互结,血行不畅;三为络脉损伤,此即叶天士所云“离络留而为瘀也”之意。而“瘀”是它们共同的病理变化,并由此进一步加重病情,增加病邪锢结难解之势。从某种意义上说,“久病入络”也可理解为“久病入血”,或是对某些脏腑血分病证的病理阐发。
本发明以中医“正虚邪实,气血不足,瘀血阻络”理论为依据,制定扶正祛邪治疗原则,应用从“本”补益气血,从“标”活血化瘀的治疗方法,采用中药原料药紫丹参、全当归、桃仁、淮牛膝、制大黄制成防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂。
本发明的中药复方制剂,以紫丹参益气补血活血,微寒;桃仁祛瘀活血,性平;淮牛膝,补肾活血,性平;制大黄,清热泄浊活血,性寒;当归补血活血,性温,纵观全方,以活血为特征,兼以扶正泻浊,攻补兼施,温凉并用,使驱邪而不伤正,补而不滞邪,针对慢性肾衰的诱发和加剧因素瘀血进行治疗,体现了中医“治未病”及“治病必求其本”的精神。
本发明的中药复方制剂,其中:
紫丹参:具有抗氧化、清除氧自由基,抑制FN在肾组织中过度沉积的作用。研究证实丹参单体及其提取物不仅可以抑制胶原的合成,同时可促进胶原的降解,对胶原代谢有直接的作用。研究还发现,丹参能明显减少UUO大鼠模型α-SMA的表达,可能通过抑制肾小管间质细胞向肌成纤维细胞转化,起到延缓肾间质纤维化的作用。
制大黄:实验证实其中的主要成分大黄素和大黄酸对肾间质纤维化具有防治作用。现代医学在人肾纤维细胞体外培养的基础上发现,大黄素能明显抑制人肾成纤维细胞增殖,且大黄酸具有抑制TGF-β1激活肾间质成纤维细胞的作用,并拮抗TGFβ1导致的FN表达和合成;大黄蒽醌和大黄酸蒽酮葡萄糖糖甙在体外培养液中,能直接抑制大鼠肾小球系膜细胞生长及系膜细胞DNA、蛋白质的合成,以及抑制肾小管上皮细胞的增生,减轻肾脏受损后的代偿性肥大。
当归:素有“十方九归”之称,“药王”之美誉。《景乐全书.本草正》记载:当归,其味甘而重,故专能补血;其气轻而辛,故又能行血。补中有动,行中有补,诚血中之气药,亦血中之圣药也。研究表明,当归的主要成分为藁本内酯类及其异构物、香豆素类、黄酮类以及有机酸类物质。将当归黄芪合剂作用于嘌呤霉素致肾病综合征的大鼠模型,能明显减弱病鼠肾组织单核巨噬细胞的浸润,降低肾小管上皮细胞TGF-β1表达量,进而减少细胞外基质聚集,使肾损伤减少,肾功能得到保护。
淮牛膝:功效为破癥结,活血祛瘀通经,补肝肾,强筋骨,利尿通淋,引血下行。牛膝中含有多糖、皂苷、甾酮等多种有效成分,现代药理学研究证实其有显著的抗氧化、抗衰老和提高机体免疫功能的作用,并且可扩张血管,改善血液流变学指标。
桃仁:具有活血祛癖、润肠通便之功效。常用于经闭、痛经、癥瘕痞块、跌打损伤、肠燥便秘等症。桃仁的主要抗纤维化成分为苦杏仁苷。现代药理学通过单侧输尿管梗阻RIF模型,研究结缔组织生长因子(CTGF)在肾间质纤维化中的表达情况及中药桃仁的干预作用,结果表明桃仁能通过下调CTGF的表达,保护肾小管细胞,减轻肾间质纤维化。
本发明的中药复方制剂由下述重量配比的原料药制成:紫丹参10-50g、全当归10-50g、桃仁5-30g、淮牛膝10-50 g、制大黄3-30g。
本发明中,所述的原料药优选重量配比是:紫丹参15-30g、全当归15-30g、桃仁12-15g、淮牛膝15-30 g、制大黄9-15g。
本发明中,所述的原料药更优选重量配比是: 紫丹参30g、全当归15g、桃仁15g、淮牛膝15g、制大黄15g。
本发明的另一目的是提供所述的中药复方制剂的制备方法。
本发明的中药复方制剂通过下述方法制备:按配方量称取原料药,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g。
本发明的中药复方制剂按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
本发明的中药复方制剂经动物实验以及临床试用,结果表明,所述的复方制剂具有阻止肾组织胶原和蛋白增生、抑制肾脏纤维化、延缓慢性肾功能衰竭进展等作用,能有效改善肾功能。
动物实验结果表明:
1、本发明的中药复方制剂能改善肾脏纤维化,使5/6大鼠肾 切除大鼠肾衰模型的肾组织病变减轻,与降低血清LN、 PC-Ⅲ、 C-Ⅳ和升高FN水平有关;免疫组化结果显示,抑制大鼠残余肾细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,减少FN、 C-Ⅳ的沉积,减轻肾小球硬化程度;光镜电镜提示能改善肾组织病理。
2、细胞分子生物学结果显示:
体内实验:可抑制5/6大鼠肾切除残余肾组织细胞过度凋亡,降低血清TNF-α;用RT-PCR技术测验发现可抑制残余肾组织血小板源性生长因子(PDGF)、TNF-αmRNA的过度表达;
体外实验:体外抑制大鼠肾脏间质成纤维细胞的增殖及分泌细胞外基质C-Ⅳ、FN,减少TNF-α的含量;体外抑制大鼠肾脏系膜细胞的增殖及分泌细胞外基质C-Ⅳ、FN 及抑制PDGF-mRNA的表达。
3、对氧化抗氧化系统的调节实验结果显示:
体内实验:用肾缺血再灌注模型再灌注15分钟、24、96小时三个时点,结果显示肾功能显著改善(P<0.05),血清及肾组织MDA明显下降(P均<0.05);血清及肾组织NO、NOS、SOD、GSH-Px显著升高(P均<0.05);肾组织形态学显示能明显抑制肾小管上皮变性、坏死、脱落,减轻急性肾缺血再灌注所致的肾组织损伤,增加5/6大鼠肾切除肾衰模型大鼠血液和肾组织中SOD和GSH、降低MDA水平;
体外实验:采用化学发光法检测本发明制剂对超氧阴离子、羟自由基的抑制作用,结果显示本发明制剂具有良好的抗氧化能力。
4、改善肾脏血液动力学,调节肾脏血管活性物质的代谢:可使5/6大鼠切除大鼠模型血液AT-Ⅰ、AT-Ⅱ、ET、TXB2降低,使血清CGRP、NO和NOS、6-Keto-PGF1α的升高;可使C-BSA致新西兰大耳白兔肾衰模型血液AT-Ⅰ、AT-Ⅱ、ET降低;用肾缺血再灌注模型研究发现血清ET、TXB2明显下降;血清CGRP、6-Keto-PGF1α,血清及肾组织NO、NOS显著升高。
5、调节慢性肾衰时异常的脂质代谢紊乱:对5/6大鼠肾切除肾衰模型大鼠脂质代谢紊乱具有明显的调节作用,可降低血清TG、LDL(低密度脂蛋白)、LP(a)的水平。
临床试用结果表明:治疗慢性肾脏病(CKD2-4期)患者168例,临床症状得到改善,其中部分临床症状基本消失,能显著改善肾功能, 明显降低尿素氮(Bun)、肌酐(Scr),总有效率达88.6%。
本发明的中药复方制剂可用于治疗慢性肾脏病(CKD2-4期)并发肾纤维化病变(肾功能减退、蛋白尿、肾脏缩小等)的患者。通过改善肾血液动力学,调节脂质代谢紊乱,增加抗氧化能力,抑制细胞因子的过度表达,从而改善肾小球硬化和间质纤维化程度,保护残余肾的结构和功能,延缓早、中期慢性肾衰恶化的进程。
具体实施方式:
实施例1
取原料药:紫丹参10g、全当归10g、桃仁5g、淮牛膝10 g、制大黄3g,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
实施例2
取原料药:紫丹参50g、全当归50g、桃仁30g、淮牛膝50 g、制大黄30g,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
实施例3
取原料药:紫丹参15g、全当归15g、桃仁12g、淮牛膝15g、制大黄9g,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
实施例4
取原料药:紫丹参30g、全当归30g、桃仁15g、淮牛膝30g、制大黄15g,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
实施例5
取原料药:紫丹参30g、全当归15g、桃仁15g、淮牛膝15g、制大黄15g,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。按常规方法制成颗粒剂或片剂或冲剂等剂型。
实施例6 本发明的中药复方制剂改善肾纤维化作用的动物实验
观察对Platt法5/6肾切除作CRF大鼠血脂、氧化抗氧化系统、血液动力学TNF-α的影响。
1、实验用药:本发明中药复方制剂制成颗粒剂。
2、 实验动物及造模方法: SD雄性大鼠(180-200克)40只,大鼠分笼饲养于室温,1周后用Platt法5/6肾切除作大鼠慢性肾衰模型,分两期完成,先背部切口切除左肾2/3,一周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜,保留肾上腺。
3、动物分组及治疗方法:分为5组,假手术对照组"A"8只;模型组"B"8只、中药复方组“C”8只、大黄组“D”8只、丹参组“E”8只,按成人常规用量的20倍给药,其中造模组及治疗组大鼠根据手术后二周所测血肌酐值分组,经统计学处理使分组后各组血肌酐尿素氮值无明显差异。
4、观察肾功能、血脂、NO、氧化抗氧化系统、血液动力学(ET、CGRP、TXB2、6-Keto-PGF1α)、纤维化指标(LN、FN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ)TNF-α等,结果显示:
4.1 治疗前模型组与假手术组肌酐、尿素氮比较 P<0.05有显著差异,提示慢性肾衰模型建立。手术各组治疗前比较肌酐,尿素氮P>0.05,无差异。治疗后各治疗组与模型对照组B组比较 血肌酐、尿素氮明显下降P<0.05-0.01有显著差异。各治疗组能显著降低胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL),调节脂蛋白代谢,统计学检测有显著性意义。
4.2 各治疗组治疗后,SOD、GSH、NO、NOS明显增高,MDA明显下降,与模型对照组相比有统计学意义。
4.3 各治疗组治疗后,CGRP、6-Keto-PGF1α明显增高,ET、TXB2明显下降,与模型对照组相比有统计学意义。
4.4 各治疗组治疗后,LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ明显下降,FN显著上升,与模型对照组相比有统计学意义。
**与模型组比较P<0.01 △△与正常组比较P<0.01
实验结果表明:5/6肾切除导致的慢性肾功能衰竭大鼠的血液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量明显高于正常大鼠(P<0.01)。复方组可明显的降低5/6肾切除导致的慢性肾功能衰竭大鼠血TNF-α值,且疗效优于其余各对照组。
实施例7 本发明的中药复方制剂对大鼠残余肾小球细胞凋亡和ECM增殖抑制作用实验
1.材料与方法
实验动物与造模方法:成年雄性SD大鼠35只,采用Platt法制作大鼠的慢性肾衰模型,分两期完成。分为模型组(A),中药复方治疗组(B),丹参组(C),大黄组(D),丹参加大黄组(E)。A组予蒸馏水3毫升/日,B、C、D、E组予上述各相应药物3毫升/日(成人标准剂量20倍)灌胃,继续实验一个月后,处死大鼠,取出肾脏,固定于10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋,切片,待测。
观察肾小球细胞凋亡:阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕褐色着染,部分细胞浆也可因核DNA碎片的逸出呈阳性着染,组织切片酶消化处理过程或聚合酶浓度过高时,可出现微弱的背景染色,少量坏死细胞可呈阳性反应,但位于坏死灶内可资鉴别。每张切片至少观察500个水平细胞,计算每个细胞中的阳性细胞数,即为凋亡指数(Apoptotic Index AI)。
纤维联结蛋白(FN),IV型胶原(C-IV):测定方法为免疫组化ABC法。石蜡切片脱蜡水,阻断内源性过氧化物酶,正常马血清封闭,依次滴加抗体,DAB显色,苏木素复染,树胶封片,用PBS代替一抗作阴性对照片,应用真彩色医学图象分析系统由计算机自动单盲计数每例肾小球棕褐色阳性颗粒面积与整个肾小球毛细血管面积的百分比。每例切片的肾小球数≥3个。
肾小球硬化指数(RI):每例切片肾小球硬化指数:根据Raij法,分0-4级,硬化达到肾小球总数25%为I级,依次类推,达到75-100%为4级。
2、研究结果显示:模型组肾小球固有细胞凋亡指数最高,正常细胞数目减少,肾小球硬化增加,中药复方组及其丹参,大黄对过度的细胞凋亡均有抑制作用,从而使凋亡指数下降。在完全硬化萎缩的肾小球中,由于肾小球固有细胞数减少,而FN、C-IV等细胞外基质成分含量明显增加,导致肾小球硬化,表现为肾小球硬化指数增加,应用本发明中药复方及其丹参,大黄后显著抑制了细胞外基质的增生,改善了肾小球硬化。
3、光镜下肾组织结构观察:
3.1 A组:肾脏发育正常,肾皮质内肾小球形态、结构正常,每一低倍镜视野内有6-8个肾小球,呈球形、染色弱嗜碱性;肾小管壁较厚,管腔较小;肾小管之间间质含量少。
3.2 B组:同样的视野内,只有1-2个肾小球结构基本正常,Q其余5-6个肾小球变性,肾小囊腔扩大,囊周纤维化,肾小球间距缩小;肾小管壁薄,管腔扩大、缩小相间隔,并可见蛋白管型和红细胞管型;间质结缔组织增生,并有大量炎症细胞浸润;肾血管壁增厚,管壁玻璃样变性;肾包膜增厚。
3.3 C组:同样的视野内,有6-7个肾小球结构基本恢复正常,肾小囊腔扩大减轻,囊周纤维化减轻;肾小管结构也较正常,管壁较厚,间质结缔组织增生明显减少,少量蛋白管型;间质有少量炎症细胞浸润。
3.4 D组:同样的视野内,有4-5个肾小球结构基本正常, 2-3个肾小球囊腔扩大,肾小管壁薄;管腔轻度扩大,少量蛋白管型;间质结缔组织增生,间质有少量炎症细胞浸润。
3.5 E组:同样的视野内,有4-5个肾小球结构基本正常, 2-3个肾小球囊腔扩大,囊周纤维化;肾小管壁薄;管腔轻度扩大,见蛋白管型;间质结缔组织增生,间质有少量炎症细胞浸润。
电镜下治疗组肾组织病理也有明显好转,与模型组相比有显著改善。
实施例8 本发明的中药复方制剂对慢性肾衰大鼠残余肾系膜细胞重塑及ECM增殖作用实验
1.材料与方法
成年雄性SD大鼠24只,采用Platt法慢性肾衰模型,分为假手术组(A),模型组(B),中药复方组(C),A、B组予蒸馏水3毫升/日,C组予中药复方药物3毫升/日(成人标准剂量20倍)灌胃,继续实验一个月后,处死大鼠,取出肾脏,固定于10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋,切片,待测。
观察指标与测定方法:肾系膜细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),用半定量法,参照Floege分级标准,分别计数有/无硬化萎缩区的各10只肾小球内积分,取均值。0分系膜弥漫染色很弱或无染色;1分系膜区弥漫性染色很弱或<25%系膜区显示节段性染色;2分25-50%系膜区节段性染色增强;3分50-75%系膜区强染色;4分>75%系膜区强染色。FN、C-IV免疫组化ABC法。应用真彩色医学图象分析系统由计算机自动单盲计数每例肾小球棕褐色阳性颗粒面积与整个肾小球毛细血管面积的百分比。每例切片随机计数10只肾小球内积分,取均值。
研究结果显示:模型组α-SMA的表达在肾小球位于系膜区系膜细胞胞浆内,尚未硬化萎缩的肾小球细胞数比正常肾小球多,并且α-SMA的表达较强。在完全硬化萎缩的多数肾小球中几乎未见α-SMA表达,细胞数减少,但Fn、Co1-IV等细胞外基质成分含量不减少。此外,还观察到血管断面和萎缩的肾小球周围、肾小管上皮细胞内及局灶炎性细胞浸润处均有α-SMA的表达。而中药复方颗粒可使肾小球过度表达的α-SMA下调,抑制了活化的系膜细胞增殖,削弱其对细胞重塑的不良影响,而且减少细胞外基质FN、C-IV过度积聚。
实施例9 本发明的中药复方制剂对慢性肾衰大鼠残余肾组织细胞因子PDGF、TNF-α的基因表达的影响实验
1.材料与方法
1.1实验动物与造模方法:成年雄性SD大鼠35只,采用Platt法制作大鼠的慢性肾衰模型,分两期完成。分为模型组(A),中药复方组(B),丹参组(C),大黄组(D),对照组(E)。A组予蒸馏水3毫升/日B、C、D、E组予上述各相应药物3毫升/日(成人标准剂量20倍)灌胃,继续实验一个月后,处死大鼠,取出肾脏。
1.2用RT-PCR方法检测大鼠残余肾组织中细胞因子PDGF mRNA和TNFα的含量表达
检测结果表明正常组肾脏仅微弱表达PDGF mRNA和TNFα,模型组大鼠残肾组织有高表达,中药复方组显示有较强的抑制作用,丹参组、制大黄组作用次之,对照组未表现出此方面的影响,见表2。
表2、抗纤灵冲剂抑制残余肾PDGF-mRNA和TNFα-mRNA的表达
组别 例数 PDGF-mRNA TNF-αmRNA
各组与正常组比较*P<0.05 **P<0.01
实施例10 本发明的中药复方制剂对离体大鼠系膜细胞及成纤维细胞的影响实验
1、材料与方法
在-20℃冰箱保存备用的无菌各组大鼠血清,大鼠肾小球系膜细胞株。 含药血清制备:SD雄性大鼠48只,每组8只,用Platt法造模,分为6组,假手术组“A”;假手术加中药复方组“B”;模型组“C”、 中药复方组“D”、 丹参组“E”、大黄组“F”,测定大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质,纤连蛋白、四型胶原。
2、实验结果表明,肾衰血清能明显刺激系膜细胞增殖。本发明中药复方颗粒及其组方单味药丹参、制大黄能减轻肾衰血清对系膜细胞的刺激,明显抑制系膜细胞增殖。肾衰大鼠血清能刺激肾系膜细胞分泌四型胶原、纤连蛋白,而且与浓度呈正比,提示肾衰大鼠血清对肾系膜细胞分泌四型胶原的刺激作用有随浓度的增高而增高的趋势。而假手术大鼠含药血清组(B组)与假手术大鼠对照组(A组)无明显差异。10%、20%浓度能抑制肾衰大鼠血清刺激肾系膜细胞分泌四型胶原、纤连蛋白,而以20%浓度的效果更为明显,说明较高浓度本发明制剂更能抑制肾衰大鼠血清刺激肾系膜细胞分泌四型胶原、纤连蛋白。
实施例11 本发明的中药复方制剂对肾间质成纤维细胞增殖及其分泌ECM,TNF-α的影响实验
1、材料和方法
1.1 实验材料:中药复方制剂每袋含生药9克,肾组织来源为上海必凯实验动物中心提供的SD大鼠的肾组织,体重为150±20,Ⅳ型胶原酶,噻唑蓝(MTT)均系Sigma产品;RPMI 1640培养液系美国GIBCO产品;TFN—α标准品系第二军医大学微生物研究室提供;放线菌素D由华美公司提供。
1.2 实验血清制备:采用血清药理学方法制备毒素血清和含药血清,取SD大鼠16只,应用Platt法制作慢性肾衰动物模型,分为肾衰组(8只)和本发明制剂组(8只),实验共进行30天,腹腔静脉无菌采血6ml,分离血清,于-20℃冰箱保存备用。
1.3 本发明中药复方颗粒对体外培养的RFB产生的FN、C-Ⅳ和TNF-α的影响
各孔分别为不加任何血清、加毒素血清、加正常血清、加不同浓度本发明制剂血清(20ml、10ml、5ml、2.5ml),记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组,每组设3个复孔,每孔1ml,37℃,5%CO2培养箱培养24小时,应用ELISA法测定上清液FN、C-Ⅳ,结果用OD值表示;用小鼠L929细胞株生物活性测定法测定上清液TNF-α。
2、研究结果表明,Ⅱ组的OD值及TNF-α明显高于Ⅰ组,毒素血清可明显刺激鼠成纤维细胞(RFB)增殖,正常血清(Ⅲ组)对毒素血清刺激引起的RFB增殖无影响:Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组OD值降低,Ⅶ组与Ⅳ组比较差异显著(P<0.01)。抑制率从低浓度至高浓度逐渐上升趋势,本发明制剂对TNF-α的影响亦可见到相同结果,也能明显抑制毒素血清刺激RFB产生的TNF-α含量,其抑制程度也呈浓度依赖性。
正常血清对毒素血清刺激RFB产生FN,C-Ⅳ的作用无明显影响,含本中药复方颗粒血清可抑制RFB分泌的FN、C-Ⅳ,与正常血清组比较,差异显著,且随浓度增加,抑制率升高,抑制率从低浓度到高浓度呈逐渐上升趋势,低浓度组与高浓度组比较,差异显著,表明本中药复方可拮抗毒素血清刺激作用,抑制RFB产生细胞外基质(ECM)中主要成份FN、C-Ⅳ,该抑制作用呈现一定的量效关系趋势,即浓度越高拮抗作用越强,抑制率越高。
实施例12 本发明的中药复方制剂临床试用研究
1、病例选择
病例选择标准:随机选择临床诊断为慢性肾脏病(CKD2-4期)GFR为15~90。其中男性98例,女性70例,年龄27-84岁,平均年龄54.1岁,原发病为慢性肾小球肾炎,慢性肾盂肾炎,糖尿病肾病,高血压肾动脉硬化等。本发明中药复方治疗组与基础对照组一般资料及观察指标无显著性差异(p>0.05)。
2、治疗方法
基础治疗:病人治疗前先缓解各种诱发和加重肾功能衰竭的因素,如感染、电解质紊乱、高血压等。饮食控制,每日优质低蛋白饮食(30-40克/日)。治疗期间如发现其他并发症,可用西药对症处理,如降压、抗感染、纠正酸中毒、平衡水电解质等。
本发明中药复方制剂中的药物原料重量配比是:丹参30克,制大黄15克,桃仁15克,全当归15克,牛膝15克;制成冲剂,每包10克,每克含生药9克,制成冲剂,1包一日3次,口服,疗程为二月。
3、观察指标
3.1 CRF临床症状及体征:乏力、腰酸、头昏、胸闷、食欲减退、恶心、呕吐、水肿、皮肤瘙痒、出血倾向、骨痛等,每二周记录一次。
3.2 临床化验指标:
3.2.1 肾功能、血脂 :血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr),内生肌酐清除率(Ccr), 血清甘油三脂(TG),总胆固醇(CHL)、脂蛋白;
3.2.2 NO、氧化抗氧化系统指标:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘酞过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(NOS);
3.2.3 血液动力学指标:血管紧张素Ⅰ、Ⅱ(AT-Ⅰ、Ⅱ),内皮素(ET),降钙素相关基因肽(CGEP)、血栓素B2(TXB2),6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1α);
3.2.4 血纤维联结蛋白(FN)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ);
3.2.5 细胞因子:肿瘤坏死因子(TNF-α)。
4、疗效标准:根据卫生部新药临床指导原则和全国肾衰保守疗法专病学术会议疗效标准进行评定,显效:Scr下降值≥30%,自觉症状显著改善,主要体征消失。有效:Scr下降值>20%,临床症状明显改善。无效:Scr及临床症状无改善或加重。
5、统计方法 :本研究数值用 X±Sd表示计量资料采用t检验,组间差异用方差分析。
结果显示,
1、临床症状: 本发明制剂对乏力、腰酸、头昏、胸闷、食欲减退、恶心、呕吐等疗效较好,对出血现象、骨痛等疗效不显。
2、疗效统计:治疗组168例:显效50例,有效81例;无效37例;显效率
38.2%,总有效率88.6%;对照组总有效率68.8%。
3、临床化验指标结果
3.1 肾功能变化:近期疗效观察本发明中药复方可改善慢性肾衰患者的肾功能指标BUN、Scr、Ccr,其中Ccr治疗后较治疗前上升(P<0.05),而Scr、BUN治疗后较治疗前下降(P<0.01),对照组能降低尿素氮、但对血肌酐、内生肌酐清除率无作用,血脂方面:本发明中药复方对血清甘油三脂(TG),总胆固醇(TC)有明显改善,对照组疗效不明显,见表3。
表3 CKD治疗前后患者肾功能、血脂的变化
与治疗前相比 * P<0.05 ** P<0.01
3.2、氧化抗氧化系统指标:
如表4所示:治疗组治疗后,SOD、GSH明显增高,MDA明显下降,而对照组的变化无统计学意义。治疗组治疗后能明显增高一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS),而对照组的变化无统计学意义。
表4、治疗组与对照组氧化抗氧化系统指标比较
与治疗前相比 * P<0.05 ** P<0.01;与对照组治疗后相比 # P<0.05
3.3 治疗组与对照组肾血液动力学指标变化结果
3.3.1 患者血浆AT-Ⅰ、AT-Ⅱ经本发明制剂治疗后,皆比治疗前明显下降,具有统计学意义(P<0.05),而对照组的变化无统计学意义。
3.3.2血浆ET、CGRP、TXB2、6-Keto-PGF1α的变化 本发明制剂治疗组血浆ET下降,同时伴有CGRP的升高,与治疗前对比P均<0.05,而对照组治疗后虽有ET、CGRP变化,但与治疗前比较没有统计学意义,P>0.05,血TXB2较治疗前下降, P<0.01,血6-Keto-PGF1α治疗前后,P<0.05,治疗后血6-Keto-PGF1α上升。
3.3.3血浆LN、FN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ:经本发明制剂治疗后血FN较治疗前上升,血LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ治疗后明显下降,P<0.05,对照组的变化无统计学意义,如表5所示。
表5本发明的中药复方制剂对168例早中期CRF患者血纤维化指标的影响(x±S)
与治疗前相比 * P<0.05
4、细胞因子TNF-α:治疗前为53.85±20.14 pg/ml,经本发明制剂治疗后为36.44±12.01 pg/ml,结果显示,血浆TNF-α明显下降,与治疗前对比P<0.01;对照组治疗前为54.32±22.46pg/ml,治疗后48.62±21.24pg/ml,对照组的变化无统计学意义。
Claims (8)
1.一种防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂,其特征在于,由下述重量配比的原料药制成:紫丹参10-50g、全当归10-50g、桃仁5-30g、淮牛膝10-50 g、制大黄3-30g。
2.按权利要求1所述的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂,其特征在于,所述的原料药的重量配比是:紫丹参15-30g、全当归15-30g、桃仁12-15g、淮牛膝15-30 g、制大黄9-15g。
3.按权利要求1所述的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂,其特征在于,所述的原料药的重量配比是:紫丹参30g、全当归15g、桃仁15g、淮牛膝15g、制大黄15g。
4.权利要求1所述的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂的制备方法,其特征在于,其包括下述步骤:
按配方量称取原料药,加入7倍量90%乙醇,热回流1小时,制得提取液;药渣加入7倍量50%乙醇,热回流1小时,再制得提取液,将两次提取液合并、浓缩,至每ml提取液的生药含量为2g,制得中药复方制剂。
5.按权利要求1所述的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂,其特征在于,所述的复方制剂制成颗粒剂或片剂或冲剂。
6. 权利要求1的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂在制备改善肾功能,降低尿素氮和肌酐药物中的用途。
7.权利要求1的防、治慢性肾脏病肾纤维化的中药复方制剂在制备改善肾脏纤维化,延缓慢性肾功能减退药物中的用途。
8.按权利要求7的用途,其中所述的中药复方制剂抑制残余肾组织平滑肌肌动蛋白表达,减少FN、 C-Ⅳ的沉积,减轻肾小球硬化程度。
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