CN102475765B - 一种改善肾功能并抑制肾组织纤维化的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于改善肾功能并抑制肾组织纤维化的中药组合物,该中药组合物主要由以下重量份的原料药制成:丹参10-50份、黄芪10-60份、仙灵脾10-30份、虫草菌丝5-30份、制大黄3-30份。临床研究显示应用本发明中药组合物治疗慢性肾功能不全患者168例,取得显著临床效果,临床症状得到改善,有的基本消失,能显著改善肾功能,明显降低血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),总有效率达88.66%。动物实验研究显示本发明中药组合物能够延缓慢性肾功能衰竭进展,其机制与有效抑制肾组织胶原的沉积和TGF-β的分泌,从而抑制肾脏纤维化等作用有关。本发明中药组合物临床应用成本低、安全可靠、疗效优良。
Description
技术领域
本发明属中药领域,具体涉及一种中药组合物,尤其涉及一种用于改善肾功能并抑制肾组织纤维化的中药组合物。
技术背景
慢性肾脏病(CKD)是严重危害人类健康的重大疾病,目前在全球范围内正以惊人的速度持续增长。2007年2月20日国际肾脏病学会新闻公告:目前世界上超过5亿人口患有不同的肾脏疾病,每年超过百万人口死于CKD相关联的心脑血管疾病。CKD已成为继心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病之后又一个威胁人类健康的重要疾病,成为全球性公共卫生问题,成为新的流行病。就全球情况来看,CKD发病率有上升趋势。
CKD已是人类面临的主要健康问题,其最终会发展为终末期肾脏病(ESRD)。美国肾脏数据登记系统(USRDS)的数据显示,从1988年至2002年美国ESRD的年发病率由39.4/百万人口上升至98.3/百万人口。据估计,未来10年该数据仍将以每年4.1%的百分比上升。北京、上海2个大城市2002~2003年的不完全统计资料显示,每年进入血液透析的新患者人数均在4000例左右,表明在我国慢性肾衰竭也存在着不容忽视的增长趋势!在首次就诊的CKD患者中有2/3血肌酐超过176.8μmol/L,1/4血肌酐已超过530.4μmol/L。因此对CKD的防治更有特殊重要意义。无论是全国还是北京、上海地区实际CRF(慢性肾功能衰竭)的发病率远远高于统计的数据。可见,如何对CKD进行早期防治,延缓肾功能进展,降低尿毒症的发病率,延迟CKD进入ESRD的时间,是各国肾脏病研究者面临的重要课题。
CKD的病理过程以肾功能的进行性丧失,细胞外基质(Extracellur Martrix,ECM)在细胞外的大量聚积导致的广泛肾纤维化为特征。而肾纤维化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同通路,其特征包括肾小球纤维化、肾间质纤维化、肾血管纤维化,是各种肾脏疾病慢性化主要的病理学表现之一,是各种肾小球、血管和小管间质本身疾病的最后结局。无论基础疾病如何,CKD一旦进展,终将导致肾组织广泛疤痕形成,表现为肾实质毁损和终末期肾功能衰竭。在肾脏纤维化过程中,多种细胞共同参与,对CKD发生、发展起重要作用。
当肾脏受到内在或外界损伤,受损组织开始一系列自我修复过程:首先,肾脏固有细胞激活,促炎性细胞因子产生和释放,单核/巨噬细胞、T细胞被招募并向受损部位浸润,随后,系膜细胞、成纤维细胞、小管上皮细胞在相关细胞因子作用下被激活或进行转分化并产生大量ECM;大量ECM沉积可致纤维瘢痕形成和肾组织重构,导致肾实质毁损和肾功能丧失。总之,RIF(肾间质纤维化,renal interstitial fibrosis,RIF)是多种因素损伤肾小管上皮细胞后所致的肾脏常见病理变化,其进一步发展导致肾小球毛细血管狭窄、肾小管萎缩、肾功能损害。目前认为,RIF形成的分子机制主要包括四个阶段:(1)细胞活化和损伤阶段;(2)纤维化信号传递阶段;(3)纤维化形成阶段;(4)肾脏结构和功能毁损阶段。
CKD病程进展的原因,既与肾脏病本身的基础病变有关,又与某些共同的途径有关。与CKD进展可能有关的某些共同途径主要有以下几方面:肾脏病变时出现大量蛋白尿、高血压、高血脂、感染、酸中毒、电解质紊乱等基本因素导致肾脏血液动力学改变、肾脏细胞因子分泌、脂代谢紊乱、从而最终导致肾小球硬化、肾脏固有细胞活化及肾小管间质纤维化。因此在防治CKD的加重过程中,诱发因素的治疗尤为重要,因为对已经毁损的肾单位已是不可逆的,而如何保护残肾的肾功能关键是要对加重肾病进展的诱发因素的治疗,如饮食以及对高血压、高血脂、感染、酸中毒、电解质紊乱、高尿酸血症和大量蛋白尿的治疗。目前现代医学对肾间质纤维化的研究着重于阻止肾间质纤维化形成的三个阶段即炎症导致细胞因子的释放,纤维母细胞活化和基质的沉淀,以及纠正相关因素(如感染、尿蛋白、高血压、高血糖、血液动力学紊乱等)。随着对肾纤维化发病机制的深入研究,尤其是细胞生物学、分子生物学的研究,针对胶原及其ECM代谢的不同环节,确立了多种抗肾间质纤维化的途径。如抗TGF-β1抗体、Prifenidon(PFD)、ACEI、血管紧张素II及其受体拮抗剂等抗肾纤维化西药的研究和应用,使抗肾纤维化研究得到了很大发展。但其效果并不理想,且目前多限于动物实验阶段。
从目前的研究来看,对其发病机制仍有发展的空间,而当前抗肾纤维化的治疗大部分仍局限于动物实验阶段,进入临床还需要走很长的路,而且疗效还待进一步的提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种改善肾功能并抑制肾组织纤维化,使用方便、成本低廉、疗效好的中药组合物。
祖国医学文献中没有对CKD论述,但究其病因及症状不离“虚劳”、“水肿”、“癃闭”、“溺毒”等范畴。传统中医认为通过四诊的宏观检测见到或触及坚硬不移的有形肿块称为癥积,而现代中医部分学者借助科技手段(如光镜、电镜等)检测到肾脏形态学改变,如细胞外基质积聚、球囊黏连、血管襻闭塞、局灶或节段性硬化、间质纤维化及肾疤痕形成等,所以认为肾脏纤维化是发生在肾脏的微型癥积,瘀血阻络则是肾脏微型癥积的主要病理基础。各种慢性肾脏疾病最终可因久病伤正而导致正虚邪实,浊邪上逆,出现水肿、癃闭、关格的结局与现代医学中慢性肾脏疾病(肾脏纤维化的病理改变)出现,最终导致CRF的认识基本一致。虽然正虚和邪实各有其说,但从纤维化形成的病理基础来看,其与湿浊、瘀血密切相关。
“湿浊”即“湿毒”,因其常具有秽浊性,故称之为“湿浊”,多由于机体脏腑功能紊乱,脾肾严重受损,阴阳气血、脉道失调,不能维持正常的水液代谢;脾失健运,肾失蒸腾气化,二便失司,清阳不升,浊阴不降,清浊相混,不能及时排出体外,蓄积于体内而产生。与现代医学所述慢性肾功能衰竭(CRF),由于机体不能排泄代谢废物即尿毒症毒素(包括尿素、肌酐、胍类、多肽类等),水电解质、酸碱平衡出现紊乱,尿毒症毒素蓄积体内这一观点是相吻合的。湿浊既成,则可导致以下几方面情况发生。(1)常壅塞三焦,致正气不得升降,而发上关下格之病理转归。如李中梓在《证治汇补》中所说:“既关且格,必小便不通,旦夕之间,陡增呕恶。此因浊邪壅塞三焦,正气不得升降,所以关应下而小便闭,格应上而呕吐,阴阳闭绝,一日即死,最为危候。”(2)使三焦气机壅滞,气病及血,血行不畅;或湿浊日久不祛,使脾气益虚,气虚不能摄血,血不循经为瘀,则湿浊与瘀血互夹,痹阻于脏腑经络,使本病迁延日久,顽固难愈。(3)阻碍脾胃,致脾胃气机升降失常,气血生化更趋匮乏。(4)湿浊蕴久化热,热毒之邪煎熬熏蒸,伤津耗液,而津液干枯,猝然阻格,致上下不通,发为关格。(5)与瘀血互结,相互济恶,化热生毒,血分热毒,上扰心肺,或下犯肝肾,出现各种严重变证。可见,湿浊内留是肾组织纤维化进行性加重的重要因素。
血瘀是指血液的循行迟缓,流行不畅,甚至血液瘀结停滞成积的病理变化,其病机主要是血行不畅,产生原因或因于气滞而致血行受阻,或气虚而血行迟缓,或痰浊阻于脉络,或寒邪入血,血寒而凝,或邪热入血,煎灼血液,或外力扭挫伤脉络等均可形成血瘀,甚至血液瘀结成块而成瘀血。因此,瘀血是血瘀病变的病理产物,而在瘀血形成之后,又可阻于络脉,而成为形成血瘀的一种原因。因“络主血”,血液运行于络脉中,故血瘀与络脉关系密切。有学者总结归纳认为因络脉病变所致的血瘀证三个方面:一为络脉郁滞,即叶天士“邪与气血两凝,结聚络脉”之意;二为络脉空虚,即络中气血不足,络脉失养,其正常功能,气血津液运行失常,痰瘀互结,血行不畅;三为络脉损伤,此即叶天士所云“离络留而为瘀也”之意。而“瘀”是它们共同的病理变化,并由此进一步加重病情,增加病邪锢结难解之势。从某种意义上说,“久病入络”也可理解为“久病入血”,或是对某些脏腑血分病证的病理阐发。
根据对CKD病因病机认识,本发明提出以中医“正虚邪实,湿浊内留,瘀血阻络”理论为依据,制定扶正泄浊治疗原则,应用从“本”补益气血,从“标”泄浊化瘀的治疗方法,采用中药丹参、黄芪、仙灵脾、虫草菌丝、制大黄进行配伍,功效为扶正祛邪,化湿泄浊,活血化瘀。
本发明提供一种改善肾功能、抑制肾组织纤维化的中药组合物,该中药组合物主要由以下重量份的原料药制成:丹参10-50份、黄芪10-60份、仙灵脾10-30份、虫草菌丝5-30份、制大黄3-30份。优选地,本发明的中药组合物由以下重量份的原料药制成:丹参15-30份、黄芪15-30份、仙灵脾15-20份、虫草菌丝9-15份、制大黄9-15份。
本发明的中药组合物主要适应症是慢性肾功能不全可伴有肾纤维化病变(肾功能减退、蛋白尿、肾脏缩小等)的患者。根据临床病人多以正虚邪恋为主要表现,认为湿浊、血瘀在慢性肾衰进展上占有重要作用,以CKD正虚邪实的病因病机,研制扶正泄浊、活血化瘀并用的中药复方,以丹参,益气补血活血,微寒;黄芪,健脾益气,微温;仙灵脾,温益元阳,性温;虫草菌丝,壮命火、益精髓,性平;制大黄,清热泄浊、活血解毒,性寒,纵观全方,以扶正泄浊、攻补兼施、温凉并用为主,兼以活血化瘀,使驱邪而不伤正,补而不滞邪,针对慢性肾衰的诱发和加剧因素湿浊、瘀血进行治疗,体现了中医“治未病”及“治病必求其本”的精神。通过增加有效肾单位,提高内生肌酐清除率,从而提高机体清除毒性物质的能力而达到“降浊”的目的;同时通过完善肾小管功能,增强其对营养物质的重吸收能力,并影响体内蛋白代谢,改善贫血,调节免疫机制而达到“扶正”的作用。从而改善肾小球硬化和间质纤维化程度,保护残余肾的结构和功能,延缓了早、中期慢性肾衰恶化的进程,同时应用肾脏系膜细胞、成纤维细胞体外培养证实其体内疗效的结果。
现代药理研究表明:
丹参:具有抗氧化、清除氧自由基,抑制FN(血纤维连接蛋白)在肾组织中过度沉积的作用。近年来对丹参单体及其提取物的研究取得了很大的进展,人们认识到丹参及其提取物不仅可以抑制胶原的合成,同时可促进胶原的降解,对胶原代谢有直接的作用。而林琼真等研究发现,丹参能明显减少UUO大鼠模型α-SMA的表达,可能通过抑制肾小管间质细胞向肌成纤维细胞转化,起到延缓肾间质纤维化的作用。
黄芪:有补虚作用,誉为“补药之长”、“补气之最”、“疮家圣药”。黄芪中含有糖类、粘液质、胆硷、甜菜硷、叶酸、多种氨基酸等物质。据药理分析,可消除肾炎的尿蛋白,有显着利尿作用,并能增强血浆蛋白、血红蛋白及红血球。钟小明等研究发现,嘌呤霉素致肾病综合征的大鼠模型,使用当归黄芪合剂后,明显减弱了病鼠肾组织单核巨噬细胞的浸润,有效降低肾小管上皮细胞TGF-β1表达量,进而减少细胞外基质聚集,使肾损伤减少,肾功能得到保护。张立艳等发现黄芪可显著性抑制激活的肾间质纤维细胞分泌FN,下调激活的成纤维细胞表面表达CD44mRNA,证实黄芪可通过抑制成纤维细胞过度生成FN等ECM的产生,而起到抗肾纤维化。
仙灵脾:功效为补肾阳,强筋骨,祛风湿。主要含淫羊藿苷、藿羊淫次苷、藿羊淫新苷、有机酸、脂肪酸、生物碱、挥发油等成分。现代药理学研究证实其有调节免疫和分泌系统,改善机体代谢和各器官功能的作用。亦有报告认为,具有改善血流动力和血液流变的作用,并能提高白细胞生成。
虫草菌丝(又称为冬虫夏草):冬虫夏草含有10余种氨基酸及多种微量元素,它可明显降低5/6肾切除大鼠的血尿素氮、肌酐水平,减轻肾小管萎缩和间质纤维化程度,提示冬虫夏草可抑制肾小管间质损伤的进展。郑丰等研究表明:冬虫夏草对体外培养的大鼠肾小管上皮细胞增殖具有明显的促进作用,且在一定范围内呈量效关系,并推测其促增殖效应的机制可能与诱导肾小管上皮细胞持续高水平地表达c-myc原癌基因mRNA有关。
制大黄:主要成分大黄素和大黄酸对肾间质纤维化的防治作用在实验中已得到肯定。如王晓玲等在人肾纤维细胞体外培养的基础上发现,大黄素能明显抑制人肾成纤维细胞增殖。何东元等研究发现,大黄酸具有抑制TGF-β1激活肾间质成纤维细胞的作用,并拮抗TGF β1导致的FN表达和合成。大黄蒽醌和大黄酸蒽酮葡萄糖糖甙在体外培养液中,能直接抑制大鼠肾小球系膜细胞生长及系膜细胞DNA、蛋白质的合成,还能抑制肾小管上皮细胞的增生,减轻肾脏受损后的代偿性肥大。
本发明的中药组合物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何一种中药内服制剂,例如水煎剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂等。
此外,本发明还提供上述中药组合物在制备改善肾功能并抑制肾组织纤维化的药物中的应用,所述改善肾功能并抑制肾组织纤维化包括:降低血清尿素氮BUN、肌酐Scr,抑制肾组织α-SMA的表达,减少Col-I、Col-III的沉积和TGF-β的分泌,减轻肾间质纤维化程度,延缓慢性肾功能减退进展,及用于其他原因导致的慢性肾功能不全和肾脏纤维化。
本发明经临床实验和动物实验证实具有以下有益效果:
1、临床研究:
用本发明中药组合物共治疗慢性肾功能不全患者168例,取得显著临床效果,临床症状得到改善,有的基本消失,能显著改善肾功能,明显降低血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),总有效率达88.66%。
2、动物实验研究
2.1改善肾脏纤维化的作用研究
可使5/6肾切除大鼠肾衰模型(Platt法)和单侧输尿管结扎模型(UUO法)的肾组织病变减轻,可以降低血清尿素氮BUN、肌酐Scr和尿α1微球蛋白(a1-MG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平。免疫组化研究发现其可抑制UUO模型大鼠肾间质α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,减少I型胶原(Col-I)、III型胶原(Col-III)的沉积和转化生长因子-β(TGF-β)的分泌,减轻肾间质纤维化程度;光镜(HE和Masson染色)提示能改善肾组织病理。
2.2细胞分子生物学研究
体外抑制大鼠肾脏间质成纤维细胞和系膜细胞的增殖及TGF-β的分泌。
因此说明本发明中药组合物能有效降低血清尿素氮BUN、肌酐Scr,抑制肾组织α-SMA的表达,减少Col-I、Col-III的沉积和TGF-β的分泌,能有效改善肾功能和微量蛋白尿,阻止肾组织胶原的沉积和TGF-β的分泌,减轻肾间质纤维化程度,抑制肾脏纤维化,延缓慢性肾功能衰竭进展等作用,从而亦可以用于其他原因导致的慢性肾功能不全和肾脏纤维化。本发明中药组合物临床应用成本低、安全可靠、疗效优良。
附图说明
图1-图8是实验例2对Platt模型大鼠残余肾小球细胞凋亡的抑制作用研究中光镜下肾组织结构示意图;其中,图1-图4为HE染色(400×),图1代表A组,图2代表B组,图3代表C组,图4代表对照组;图5-图8为Masson染色(400×),图5代表A组,图6代表B组,图7代表C组,图8代表对照组。
图9-图16是实验例4对UUO法单侧输尿管结扎作肾间质纤维化大鼠肾间质胶原和TGF-β增殖的抑制作用研究中光镜下肾组织结构示意图;其中,图9-图12为HE染色(400×),图9代表A组,图10代表B组,图11代表C组,图12代表对照组;图13-图16为Masson染色(400×),图13代表A组,图14代表B组,图15代表C组,图16代表对照组。
具体实施方式
以下通过实验例对本发明的有益效果作进一步的阐述:
实验例一临床研究
1.1病例选择
病例选择标准:应用随机化原则选择临床诊断为肾功能不全患者(CRF)的GFR(肾小球滤过率)为30~90ml/(min·1.73m2)。其中男性86例,女性82例,年龄26-73岁,平均年龄51.5岁,原发病为原发性慢性肾小球肾炎,部分患者肾穿提示肾组织病理IgA肾病,系膜增殖性肾炎,局灶阶段硬化性肾炎等。本发明中药组合物治疗组与基础对照组一般资料及观察指标无显著性差异(p>0.05)。
1.2治疗方法
基础治疗:病人治疗前先缓解各种诱发和加重肾功能衰竭的因素,如感染、电解质紊乱、高血压等。饮食控制,每日优质低蛋白饮食(30-40g/d)。治疗期间如发现其他并发症,可用西药对症处理,如降压、抗感染、纠正酸中毒、平衡水电解质等。
本发明中药组合物组成:丹参15g,黄芪30g,仙灵脾15g,虫草菌丝9g,制大黄15g制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
1.3观察指标
1.3.1CRF临床症状及体征
乏力、腰酸、头昏、胸闷、食欲减退、恶心、呕吐、水肿、皮肤瘙痒、出血倾向、骨痛等,每2周记录1次。
1.3.2临床化验指标
1.3.2.1肾功能、血脂:血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr),内生肌酐清除率(Ccr),血清甘油三脂(TG),总胆固醇(CHL)、脂蛋白;
1.3.2.2氧化抗氧化系统指标如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘酞过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(NOS);
1.3.2.3血液动力学指标:血管紧张素I、II(AT-I、II),内皮素(ET),降钙素相关基因肽(CGRP)、血栓素B2(TXB2),6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1α);
1.3.2.4血纤维连结蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)、IV型胶原(C-IV);
1.3.2.5细胞因子:肿瘤坏死因子(TNF-α)。
1.4近期疗效标准
根据卫生部新药临床指导原则和全国肾衰保守疗法专病学术会议疗效标准进行评定,显效:Scr下降值≥30%,自觉症状显著改善,主要体征消失。有效:Scr下降值>20%,临床症状明显改善。无效:Scr及临床症状无改善或加重。
1.5统计方法
2.结果
2.1临床症状:本发明中药组合物对乏力、腰酸、头昏、胸闷、食欲减退、恶心、呕吐等疗效较好,对出血现象、骨痛等疗效不显。
2.2疗效统计:治疗组168例:显效73例,有效82例,无效13例;显效率36.36%,总有效率88.66%;对照组168例,总有效率66.84%。
2.3临床化验指标结果
2.3.1肾功能变化:近期疗效观察本发明中药组合物可改善慢性肾衰患者的肾功能指标BUN、Scr、Ccr,其中Ccr治疗后较治疗前上升(P<0.05),而Scr、BUN治疗后较治疗前下降(P<0.01),对照组能降低BUN、但对Scr、Ccr无作用,血脂方面:本发明中药中药组合物对血清甘油三脂(TG),总胆固醇(TC)有明显改善,对照组疗效不明显,见表1。
表1 CKD治疗前后患者肾功能、血脂的变化
与治疗前相比*P<0.05 **P<0.01
2.3.2、氧化抗氧化系统指标:
如表2所示:治疗组治疗后,SOD、GSH明显增高,MDA明显下降,而对照组的变化无统计学意义(表2)。治疗组治疗后能明显增高一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS),而对照组的变化无统计学意义。
表2治疗组与对照组氧化抗氧化系统指标比较
与治疗前相比:*P<0.05,**P<0.01;与对照组治疗后相比:#P<0.05。
2.3.3治疗组与对照组肾血液动力学指标变化结果
2.3.3.1患者血浆AT-I、AT-II经本发明中药组合物治疗后,皆比治疗前明显下降,具有统计学意义(P<0.05),而对照组的变化无统计学意义。
2.3.3.2血浆ET、CGRP、TXB2、6-Keto-PGF1α的变化本发明中药组合物治疗组血浆ET下降,同时伴有CGRP的升高,与治疗前对比P均<0.05,而对照组治疗后虽有ET、CGRP变化,但与治疗前比较在统计学上没有意义,P>0.05,血TXB2较治疗前下降,具有统计学意义(P<0.01),血6-Keto-PGF1α治疗前后有显著性差异(P<0.05),治疗后血6-Keto-PGF1α上升。
2.3.3.3血浆LN、FN、PC-III、C-IV:经本发明中药复方治疗后血FN较治疗前上升,血LN、PC-III、C-IV治疗后明显下降,P<0.05,对照组的变化无统计学意义,见表3;
与治疗前相比:*P<0.05。
2.4细胞因子TNF-α:治疗前为52.43±19.25pg/ml,经本发明中药组合物治疗后为35.18±11.13pg/ml,可见血浆TNF-α的明显下降,与治疗前对比P<0.01;对照组治疗前为53.47±21.39pg/ml,治疗后47.33±20.19pg/ml,对照组的变化无统计学意义。
实验例二、动物实验研究
(一)本发明中药组合物改善肾纤维化的作用研究
实验例1:对Platt法5/6肾切除作CRF大鼠肾功能、微量蛋白尿等方面研究
1材料与方法
1.1实验用药:本发明中药组合物由本院制剂室制成水煎剂。
1.2实验动物及造模方法:SD雄性大鼠(180-200g)100只,大鼠分笼饲养于室温,1周后用Platt法5/6肾切除作大鼠慢性肾衰模型,分两期完成,先背部切口切除左肾2/3,一周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜,保留肾上腺。
1.3动物分组及治疗方法:分为4组,假手术对照组“A”10只;模型组“B”10只、本发明中药组合物组“C”10只、对照组科索亚10只,按成人常规用量的20倍给药,其中造模组及治疗组大鼠根据手术后二周所测血肌酐值分组,疗程60天,经统计学处理使分组后各组血肌酐尿素氮值无明显差异。
1.4观察肾功能、24h蛋白定量和微量蛋白尿(a1-MG、β2-MG、TRF、NAG)等,结果如下:治疗前模型组与假手术组BUN、Scr比较,P<0.05有显著差异,提示慢性肾衰模型建立。手术各组治疗前BUN、Scr比较,P>0.05无差异。治疗后中药复方组与模型组B组比较,BUN、Scr明显下降,P<0.05-0.01有显著差异,见表4。本发明中药组合物组能显著降低a1-MG、β2-MG、TRF、NAG,统计学检测有显著性意义,见表5。
治疗前:与B组相比,*P<0.05;治疗后:与B组比较:*P<0.05,**P<0.01。
与B组比较:*P<0.05,**P<0.01。
实验例2对Platt模型大鼠残余肾小球细胞凋亡的抑制作用研究
1 材料与方法
1.1实验动物与造模方法:成年雄性SD大鼠100只,采用Platt法制作大鼠的慢性肾衰模型,分两期完成。分为9组,假手术对照组“A”10只;模型组“B”10只、本发明中药组合物组“C”10只、对照组科索亚10只,按成人常规用量的20倍给药,其中造模组及治疗组大鼠根据手术后二周所测血肌酐值分组,疗程60天,处死大鼠,取出肾脏,固定于10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋,切片,待测。
观察肾小球细胞凋亡:阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕褐色着染,部分细胞浆也可因核DNA碎片的逸出呈阳性着染,组织切片酶消化处理过程或聚合酶浓度过高时,可出现微弱的背景染色,少量坏死细胞可呈阳性反应,但位于坏死灶内可资鉴别。每张切片至少观察500个水平细胞,计算每个细胞中的阳性细胞数,即为凋亡指数(Apoptotic Index AI)。
肾小球硬化指数(RI):每例切片肾小球硬化指数:根据Raij法,分0-4级,硬化达到肾小球总数25%为I级,依次类推,达到75-100%为4级。
2 研究结果显示:模型组肾小球固有细胞凋亡指数最高,正常细胞数目减少,肾小球硬化增加,本发明中药组合物组对过度的细胞凋亡均有不同程度的抑制作用,从而使凋亡指数下降。其中应用本发明中药组合物抑制作用最好,改善了肾小球硬化。
3 光镜下肾组织结构观察(见图1-8)
3.1 A组:肾脏发育正常,肾皮质内肾小球形态、结构正常,每一低倍镜视野内有6-8个肾小球,呈球形、染色弱嗜碱性;肾小管壁较厚,管腔较小;肾小管之间间质含量少,见图1和图5。
3.2 B组:同样的视野内,只有1-2个肾小球结构基本正常,其余5-6个肾小球变性,肾小囊腔扩大,囊周纤维化,肾小球间距缩小;肾小管壁薄,管腔扩大、缩小相间隔,并可见蛋白管型和红细胞管型;间质结缔组织增生,并有大量炎症细胞浸润;肾血管壁增厚,管壁玻璃样变性;肾包膜增厚。Masson染色见蓝染纤维在系膜区、小球周围明显增加,见图2和图6。
3.3 C组:同样的视野内,有6-7个肾小球结构基本恢复正常,肾小囊腔扩大减轻,囊周纤维化减轻;肾小管结构也较正常,管壁较厚,间质结缔组织增生明显减少,少量蛋白管型;间质有少量炎症细胞浸润。Masson染色见蓝染纤维在系膜区、小球周围明显减少,见图3和图7。
3.4对照组:同样的视野内,有4-5个肾小球结构基本正常,2-3个肾小球囊腔扩大,囊周纤维化;肾小管壁薄;管腔轻度扩大,见蛋白管型;间质结缔组织增生,间质有少量炎症细胞浸润。Masson染色见蓝染纤维在系膜区、小球周围有所减少,见图4和图8。
实验例3:对UUO法单侧输尿管结扎作肾间质纤维化大鼠肾功能、微量蛋白尿等方面研究
1 材料与方法
1.1实验用药:本发明中药组合物由本院制剂室制成水煎剂。
1.2实验动物及造模方法:SD雄性大鼠(180-200g)100只,大鼠分笼饲养于室温,1周后大鼠用UUO法作肾间质纤维化大鼠模型,选择左侧腹纵行切口,依次切开皮肤至腹腔,游离输尿管,将左侧输尿管用组织钳托起中段,1号丝线分别结扎输尿管,两结扎线相距5mm,不剪断输尿管,手术时注意不碰伤肾包膜并保护好周围组织,手术后把将肾脏、输尿管复位,然后连续缝合腹膜,间断缝合皮肤。假手术组仅背部切口。
1.3动物分组及治疗方法:分为4组,假手术对照组“A”10只;模型组“B”10只、本发明中药组合物组“C”10只、对照组科索亚10只,按成人常规用量的20倍给药,疗程14天,其中造模组及治疗组大鼠根据体重分组,经统计学处理使分组后各组无明显差异。
1.4观察肾功能、24h蛋白定量和微量蛋白尿(a1-MG、β2-MG、TRF、NAG)等,结果如下:治疗后本发明中药组合物组与模型组B组比较,BUN、Scr明显下降,P<0.05-0.01有显著差异,见表6。本发明中药组合物组能显著降低a1-MG、β2-MG、TRF、NAG,统计学检测有显著性意义,见表7。
与B组比较:*P<0.05。
与B组比较:*P<0.05,**P<0.01。
实验例4对UUO法单侧输尿管结扎作肾间质纤维化大鼠肾间质胶原和TGF-β增殖的抑制作用研究
1 材料与方法
1.1实验动物与造模方法:采用UUO法作肾间质纤维化大鼠模型,分为4组,假手术对照组“A”10只;模型组“B”10只、中药复方组“C”10只、对照组科索亚10只,按成人常规用量的20倍给药,疗程14天,处死大鼠,取出肾脏,固定于10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋,切片,待测。
I型胶原(Col-I)、III型胶原(Col-III)、转化生长因子-β(TGF-β):测定方法为免疫组化ABC法。石蜡切片脱蜡水,阻断内源性过氧化物酶,正常马血清封闭,依次滴加抗体,DAB显色,苏木素复染,树胶封片,用PBS代替一抗作阴性对照片,应用真彩色医学图象分析系统由计算机自动单盲计数每例肾小管棕褐色阳性颗粒面积与整个肾小管面积的百分比。每例切片的肾小管数≥3个。
2 研究结果显示:模型组间质水肿伴有炎症细胞浸润,纤维组织增生,部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死,部分管腔内有红细胞管型,小管间质区增宽,而Col-I、Col-III等细胞外基质成分含量明显增加,小管结构遭到严重破坏。应用本发明中药组合物显著抑制了细胞外基质的增生,改善了肾间质纤维化,见表8。表8治疗后各组Col-I、Col-III、TGF-β水平比较
与B组比较:*P<0.05,**P<0.01。
3 光镜下肾组织结构观察(见图9-16)
3.1 A组:肾脏发育正常,肾皮质内肾小球形态、小管结构正常,肾小球呈球形、染色弱嗜碱性;肾小管壁较厚,管腔较小;肾小管之间间质含量少,见图9和图13。
3.2 B组:同样的视野内,只有1-2个肾小管结构基本正常,其余6-8个肾小管上皮细胞胞浆疏松、浊肿和空泡变性,间质水肿伴有炎症细胞浸润,纤维组织增生,部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死,部分管腔内有红细胞管型,小管间质区增宽,小管结构遭到严重破坏。Masson染色见蓝染纤维在小管周围明显增加,见图10和图14。
3.3 C组:同样的视野内,有5-7个肾小管结构基本恢复正常,肾小管上皮细胞胞浆疏松、浊肿、空泡变性减轻,间质水肿伴有少量炎症细胞浸润,纤维组织增生明显减少,部分管腔内有红细胞管型,小管间质区增宽减轻。Masson染色见蓝染纤维在小管周围明显减少,见图11和图15。
3.4对照组:同样的视野内,有4-5个肾小管结构基本恢复正常,3-5个肾小管上皮细胞胞浆疏松、浊肿、空泡变性减轻,间质水肿伴有少量炎症细胞浸润,纤维组织增生明显减少,部分管腔内有红细胞管型,小管间质区增宽减轻。Masson染色见蓝染纤维在小管周围有所减少,见图12和图16。
实验例5对UUO法单侧输尿管结扎作肾间质成纤维细胞重塑及ECM增殖的作用
1 材料与方法
1.1实验动物与造模方法:采用UUO法作肾间质纤维化大鼠模型,分为4组,假手术对照组“A”10只;模型组“B”10只、本发明中药组合物组“C”10只、对照组科索亚10只,按成人常规用量的20倍给药,疗程14天,处死大鼠,取出肾脏,固定于10%福尔马林缓冲液中,石蜡包埋,切片,待测。
观察指标与测定方法:肾间质成纤维细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),用半定量法,参照Floege分级标准,分别计数有/无硬化萎缩区的各10个肾小管内积分,取均值。0分间质弥漫染色很弱或无染色;1分间质弥漫性染色很弱或<25%间质区显示节段性染色;2分25-50%间质区节段性染色增强;3分50-75%间质区强染色;4分>75%间质区强染色。Col-I、Col-III免疫组化ABC法。应用真彩色医学图象分析系统由计算机自动单盲计数每例肾小管棕褐色阳性颗粒面积与整个肾小管面积的百分比。每例切片随机计数10只肾小管内积分,取均值。
2研究结果显示:模型组α-SMA的表达在肾小管上皮细胞内及局灶炎性细胞浸润处均有α-SMA的表达,细胞数减少,但Col-I、Col-III等细胞外基质成分含量不减少。而本发明中药组合物可使肾间质过度表达的α-SMA下调,抑制了活化的成纤维细胞增殖,削弱其对细胞重塑的不良影响,而且减少细胞外基质Col-I、Col-III过度积聚,见表9。
与B组比较:*P<0.05,**P<0.01。
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述:
实施例1
称取如下原料药:丹参15g,黄芪30g,仙灵脾15g,虫草菌丝9g,制大黄15g,将上述原料药用水煎煮,加水500ml,武火煮沸,文火煎煮20min,制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
实施例2
称取如下原料药:丹参10g,黄芪10g,仙灵脾10g,虫草菌丝5g,制大黄3g,将上述原料药用水煎煮,加水300ml,武火煮沸,文火煎煮15min,制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
实施例3
称取如下原料药:丹参50g,黄芪60g,仙灵脾30g,虫草菌丝30g,制大黄30g,将上述原料药用水煎煮,加水800ml,武火煮沸,文火煎煮30min,制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
实施例4
称取如下原料药:丹参30g,黄芪15g,仙灵脾20g,虫草菌丝15g,制大黄9g,将上述原料药用水煎煮,加水600ml,武火煮沸,文火煎煮25min,制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
实施例5
称取如下原料药:丹参20g,黄芪20g,仙灵脾18g,虫草菌丝10g,制大黄12g,将上述原料药用水煎煮,加水500ml,武火煮沸,文火煎煮20min,制成水煎剂,1日1剂,分两次口服,疗程为8周。
Claims (3)
1.一种改善肾功能并抑制肾组织纤维化的中药组合物,其特征在于:该中药组合物由以下重量份的原料药制成:丹参10-50份、黄芪10-60份、仙灵脾10-30份、虫草菌丝5-30份、制大黄3-30份。
2.按权利要求1所述的中药组合物,其特征在于:该中药组合物由以下重量份的原料药制成:丹参15-30份、黄芪15-30份、仙灵脾15-20份、虫草菌丝9-15份、制大黄9-15份。
3.一种如权利要求1所述的中药组合物在制备改善肾功能并抑制肾组织纤维化的药物中的应用,其特征在于:所述改善肾功能并抑制肾组织纤维化包括:降低血清尿素氮BUN、肌酐Scr,抑制肾组织α-SMA的表达,减少Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的沉积和TGF-β的分泌,减轻肾间质纤维化程度,延缓慢性肾功能减退进展,及用于其他原因导致的慢性肾功能不全和肾脏纤维化。
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