CN103877327A - 一种治疗肾病综合征的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗肾病综合征的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：木贼154-462份、石韦154-462份、益母草192.5-577.5份、鱼腥草257-771份、白花蛇舌草257-771份、贯众192.5-577.5份、萆薢154-462份、木蝴蝶154-462份。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物组合物具有改善肾功能的作用，能显著减少尿蛋白的排泄、改善低蛋白血症、调节血脂代谢，改善肾脏组织结构的病理损伤，并具有利尿、解热、调节免疫功能及活血化瘀的功效，对肾病综合征，特别是难治性肾病综合征有较好的治疗作用，有效率高，症状改变明显，复发率低，具有良好的临床应用前景。

Description

一种治疗肾病综合征的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种治疗肾病综合征的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

肾病综合征是指由多种病因和多种病理类型引起以肾小球基底膜受损后通透性增加为特征的一组临床综合征，其典型表现为大量蛋白尿（＞3.5g/日)、低蛋白血症(血浆白蛋白<30g/L)、水肿或伴有高脂血症、脂质尿和肾小球滤过率降低，以肾小球病变为主的综合征。根据发病原因的不同，传统上将肾病综合征分为原发性和继发性两类，其中约有75%是由于原发性肾小球疾病引起的，25%为继发性肾小球疾病引起，如系统性红斑狼疮、糖尿病、多发性骨髓瘤性肾病、淀粉样变和过敏性紫癜等。

难治性肾病综合征(RNS)是指激素抵抗、激素依赖或反复发作，且不能耐受激素副作用而难以继续用药的原发性肾病综合征。其发生多与病理类型、感染因素、激素用药不规范、高脂血症及高凝状态有关。常见于晚期膜性肾病(MN)、系膜毛细血管性肾炎(MCGN)、系膜增生性肾炎(MsPGN)和局灶阶段性肾小球硬化(FSGS)以及部分IgA肾病。RNS病变进程主要为肾小球硬化和肾间质纤维化，导致慢性肾衰，最终发展为终末期肾病，呈不可逆的病理改变。预后不佳，严重影响患者身心健康和生活质量。

用于治疗RNS的西药主要有：肾上腺皮质激素，如甲基强的松龙；免疫抑制剂，如环孢素A，他克莫司（FK506）、来氟米特（LEF）、麦考酚吗乙酯（MMF）；细胞毒物，如环磷酰胺；抗凝剂，如低分子肝素；等等。RNS病程缠绵难愈，易反复发作，许多患者对现有免疫抑制剂不敏感，或者敏感但因停用或减量后复发；而近几年使用的MMF等新型免疫抑制剂又存在价格昂贵、效果不确定及副作用大等缺点。

中医药治疗难治性肾病具有一定的优势，各学者从不同角度对难治性肾病综合症的治法进行了探讨，主要有：活血化瘀法、养阴清痢法、益肾健脾、祛瘀通络法、疏肝调气法等。从文献中看，绝大部分中医疗法都是与西医治疗配合进行的，如李静在西药治疗基础上加中药组方(柴胡10g、白芍15g、当归15g、川芎10g、佛手10g、香附15g、枳实10g、薤白10g、桂枝10g、全瓜蒌30g、炙甘草6g)治疗难治性肾病综合症，，提高了患者的抗病能力和临床疗效，减少了西药的毒副反应及感染复发等（李静.中西医结合治疗难治性肾病综合征临床研究，中医学报，2002年，第9期）。刘韵璐报道了一种利肾胶囊，该方主要成分是木贼、莪术、射干、白花蛇舌草、鱼腥草、半枝莲等，对实验性肾病的动物有一定的治疗效果（刘韵璐.利肾胶囊治疗难治性肾病综合征的药效学研究，成都中医药大学硕士学位论文，2011年）。

发明内容

本发明提供了一种治疗肾病综合征的药物组合物。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途

本发明提供了一种治疗肾病综合征的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

木贼154-462份、石韦154-462份、益母草192.5-577.5份、鱼腥草257-771份、白花蛇舌草257-771份、贯众192.5-577.5份、萆薢154-462份、木蝴蝶154-462份。

优选地，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

木贼308份、石韦308份、益母草385份、鱼腥草514份、白花蛇舌草514份、贯众385份、萆薢308份、木蝴蝶308份。

本发明药物组合物是由上述重量配比的原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述制剂为口服制剂。

进一步地，所述口服剂为颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、胶囊剂、软胶囊剂、片剂或口服液。

本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：

（1）按所述重量配比称取原料药；

（2）加水或有机溶剂提取，浓缩至清膏，加入药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述的有机溶剂为50-95%乙醇。

本发明还提供了上述药物组合物在制备改善肾功能的药物中的用途。

其中，所述的药物是具有减少尿蛋白的排泄，升高血清白蛋白，降低尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、低密度胆固醇的功效的药物。

本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗肾病综合征的药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗难治性肾病综合征的药物。

本发明还提供了上述药物组合物在制备利尿、解热、调节免疫、活血化瘀的药物中的用途。

本发明药物组合物主要功效为清热解毒、利湿益肾。用于治疗难治性肾病中医辨证属于湿热证型者。本方采用病症结合治疗，既针对难治性肾病普遍存在湿热的征候，又兼顾到脾肾气虚、血虚水滞的病证，在临床治疗上起到标本兼治的作用。方中鱼腥草清热解毒、排脓消痈、利尿通淋；白花蛇舌草清热解毒、利尿消肿、活血止痛，二者配伍，以为君药。配以疏散风热之木贼，行气破血、清热凉血之贯众，消水之益母草，利水通淋，清肺泄热之石韦；利湿去浊，祛风除痹之萆薢；清热润肺之木蝴蝶,方中八药相辅相成共奏清热解毒、宜肾化瘀血之功。

本发明药物组合物具有改善肾功能的作用，能显著减少尿蛋白的排泄、改善低蛋白血症、调节血脂代谢，改善肾脏组织结构的病理损伤，并具有利尿、解热、调节免疫功能及活血化瘀的功效，对肾病综合征，特别是难治性肾病综合征有较好的治疗作用，有效率高，症状改变明显，复发率低，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1各组大鼠24小时尿蛋白定量的变化；

图2各组大鼠血清蛋白比较；

图3各组大鼠血脂比较；

图4各组大鼠肾功能比较；

图5各组大鼠肾脏大体观察图，A:假手术组；B:模型组；C:本发明药物大剂量组；D:本发明药物中剂量组；E:本发明药物小剂量组；F:强的松组；

图6光镜下观察各组大鼠肾组织病理形态学改变（HE×100）；①假手术组②模型组；③本发明药物大剂量组；④本发明药物中剂量组；⑤本发明药物小剂量组；⑥强的松组；

图7本发明药物对水负荷大鼠尿量的影响；

图8本发明药物对兔各时间点体温变化的影响。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明药物的制备

【处方】木贼308g、石韦308g、益母草385g、鱼腥草514g、白花蛇舌草514g、贯众385g、萆薢308g、木蝴蝶308g、糊精20g、乳糖20g；

制成1000粒

【制法】以上八味药物，加入6倍量60%乙醇回流提取3次，每次1h，滤过，回收乙醇，浓缩至清膏，加入适量糊精和乳糖，干燥，粉碎，制成颗粒，60℃干燥，整粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

服用方法：一次三粒一日三次。

实施例2本发明药物的制备

（1）称取下述重量配比的原料药：木贼340g，鱼腥草440g，白花蛇舌草340g，萆薢340g，石韦340g，益母草340g，贯众340g，木蝴蝶340g。

（2）取木贼、鱼腥草，加水蒸馏3h，提取芳香水，收集芳香水备用；

（3）步骤（2）提取芳香水后的药渣与白花蛇舌草、萆薢、石韦、益母草、贯众、木蝴蝶加水煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.2～1.3（40～50℃）的清膏，加乙醇纯化，取上清液，回收乙醇，加入步骤（2）制备的芳香水，加纯化水，制备成口服液。

实施例3本发明药物的制备

（1）称取下述重量配比的原料药：木贼26g，鱼腥草36g，白花蛇舌草26g，萆薢26g，石韦26g，益母草26g，贯众26g，木蝴蝶26g；

(2)直接将各原料药用水煎煮，浓缩，制备成口服液。

以下通过具体的药效学试验证明本发明的有益效果

受试药物：本发明药物，按实施例1方法制备，浓度为10g原生药/g浸膏。

主要试剂与药品：

醋酸泼尼松，5mg/粒，产地：浙江仙琚制药股份有限公司，批号：10944；

盐酸柔比多星，10mg/瓶，产地：浙江海正药业股份有限公司，批号09072B；

灭菌注射用水，2ml/瓶，产地：天津药业焦作有限公司，批号10010731；

尿蛋白定量试剂盒，批号20110218，南京建成生物工程研究所；

血清总蛋白试剂盒，批号2310441；血清白蛋白试剂盒，批号0220372；尿素试剂盒，批号11893540591；肌酐试剂盒，批号1710242，德赛诊断系统（上海）有限公司；

甘油三酯试剂盒，批号100441201005；胆固醇试剂盒，批号，090601200910，中生北控生物科技股份有限公司；

氢氯噻嗪片，25mg/粒，产地：江苏方强制药厂有限责任公司，批号：20091016；

生理盐水：太极集团西南药业股份有限公司，批号：10081004；

电解质试剂：梅州康立高科技有限公司，批号：DE1001010；

甘露聚糖肽胶囊：规格：5mg/粒，成都利尔药业有限公司，批号：100102；

注射用环磷酰胺：规格：0.2g/瓶，通化茂祥制药有限责任公司，批号：090301；

丙酮，批号：20090613；甲醇，批号：20090923；柠檬酸钠，批号：20100221；氯化钠，批号：20091119；成都市科龙化工试剂厂；

柠檬酸，成都市联合化工试剂研究所，批号：060704/1；

葡萄糖，中国成都化学试剂厂，批号：011026；

瑞士-姬姆萨A溶液，批号：409072；瑞士-姬姆萨B溶液（PH6.8），批号：407091；珠海贝索生物技术有限公司；

血红蛋白测定试剂盒（HiCN法），四川迈克生物科技股份有限公司，批号：0510111；

肝素钠注射液，规格：2ml:12500u，产地：上海第一生化药业有限公司。批号：H31022051；

阿司匹林肠溶片，规格:25mg/片，产地：南京白敬宇制药有限责任公司，批号090620；

布洛芬胶囊，规格：0.3g/粒，产地：珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，批号：90302002；

LPS：SIGMA公司，批号：116k4100；

石蜡油：南昌白云医药化有限公司，批号：030109。

主要仪器：

紫外可见光分光光度计，型号：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；

0412-1台式低速离心机，上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂；

电子恒温水浴锅，型号：DZKW-4，北京中兴伟业有限公司；

大鼠尿液代谢笼，型号：B6型1410×400×1550mm，达硕生物科技有限公司；

R80A型全血粘度测试仪，北京中勤世帝科技有限公司；

日立7100全自动生化分析仪，日本日立公司；

RM2235莱卡切片机，德国莱卡公司；

TSJ-1A全自动封闭式组织脱水机，天津天利航空机电有限公司；

BMJ-Ⅲ包埋机、PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪，常州市中威医疗仪器有限公司；

OLYMPUS BH-2显微镜，日本奥利巴斯公司；

PAS8000病理摄像系统；

电解质仪器，AFT-500电解质分析仪，中国梅州康立高科技有限公司；

隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；

全自动立式灭菌器LMQ-C3885型，山东新华医疗器械股份公司；

TD5A-WS台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

OLYMPUS Cover-018光学显微镜，Olympus Com.Japan生产；

AB204-E电子天平；

全自动凝血测试仪SF-8000，北京赛科希德科技发展有限公司；

欧姆龙MC-3数字电子温度计；

刻度离心管；载玻片；秒表；剪刀；毛细玻管。

实验动物：

SD大鼠，体重180～200g，雌雄各半，清洁级，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号为SCXK（川）-2008-24；

KM小鼠，体重22～25g，雌雄各半，清洁级，由四川省中药研究所实验动物中心提供，合格证号为SCXK（川）2008-19；

公鸡，菜市场购买；

豚鼠，由四川省实验动物专委会养殖场提供，合格证号为SCXK（川）2008-14；

日本大耳白兔，体重2～2.2kg，全雄，由四川省实验动物专委会养殖场提供，批号SCXK（川）2008-14。

实验环境：

试验在四川省中医药科学院中医研究所药理毒理研究室进行，试验场地为大鼠、小鼠、兔、豚鼠屏障系统，许可证号：SYXK(川)2008-057。室温20～23℃，相对湿度55±15%；荧光灯照明，12h/12h明暗相间；洁净空气（1万洁净度），换气频度20次/h，梯度压差20～50Pa，气流速度0.1～0.2m/s，氨浓度<14mg/M³。大、小鼠均按性别于鼠笼中饲养，每笼5只，大鼠笼体积为45cm×35cm×25cm、小鼠笼体积为25×16×14cm。大、小鼠从鼠笼不锈钢丝分隔外饲料箱中自由取食，水瓶自由饮水，水为清洁水，水瓶容量500ml，每日更换新鲜水。

统计方法：采用T-test方法进行统计。

试验例1本发明药物在临床上治疗难治性肾病综合征的情况

1、病例纳入及治疗方法、疗效观察

1.1收治患者情况：共38例，男性18例，女性20例，年龄在3至60岁之间。

1.2纳入病例标准：

（1）尿蛋白大于3.5g/d；

（2）血浆白蛋白低于30g/L；

（3）水肿；

（4）高脂血症；

其中（1）、（2）两项为诊断所必需；

且经强的松标准疗程治疗缓解但常复发，一年内复发3次或半年内复发超过2次者；

或经强的松标准疗程治疗无效者。

1.3治疗方法：

成人每次服10g由实施例1制备的本发明药物，每日3次，治疗15天为一个疗程，4个疗程后观察疗效。

1.4疗效观察

1.4.1观察指标治疗4个疗程（60天）后，观察患者症状、舌苔、脉象、血常规、尿常规、大便常规、24小时尿蛋白定量、肝功、肾功、血脂。

1.4.2疗效标准

(1)完全缓解:3次以上尿蛋白定量<0.2g/24h，血浆白蛋白正常或接近正常;

(2)基本缓解:3次以上尿蛋白定量<1.0g/24h，血浆白蛋白明显上升;

(3)有效:3次以上尿蛋白定量<3.0g/24h，血浆白蛋白上升;

(4)无效:未达上述标准者。

2结果

2.1近期疗效统计：

结果如表1所示：

表1近期疗效统计结果

结果表明：本发明药物治疗的38例肾病综合征，总有效率为89.5%，显效率为81.6%，其中完全缓解率为71.1%，基本缓解率为10.5%。

2.2主要症状变化：

结果如表2所示：

表2治疗前后主要症状对比

结果表明：经本发明药物治疗后，病人主要症状有明显改善，其中水肿消退平均时间为10.8±4.1天。

2.3尿蛋白定性对比：

结果如表3所示：

表3治疗前后尿蛋白定性对比

结果表明：治疗后，38例患者尿蛋白定性检查结果：（一）21例，（±）7例，（+）2例，（++）2例，（+++）6例。尿蛋白转阴时间为14.3±4.8天。（p>0.001）。

2.4实验室指标检测结果：

结果如表4所示：

表4治疗前后实验室指标变化对比（×±S）

注：与治疗前比较，P<0.05。

结果表明：治疗后，病人24小时尿蛋白定量、胆固醇等实验室指标有明显改善。

2.5复发率统计：

结果见表5所示：

表512例频繁复发患者中药治疗前后复发率对比

结果表明：对12例频繁复发患者撤减激素后因感染诱发者用本方药治疗后，复发率明显减低，从而使患者得以撤除激素或不加用原有激素用量。

2.612例频繁复发患者治疗后疗效结果：

结果见表6所示：

表612例频繁复发患者中药治疗前后疗效对比

结果表明：用本发明药物治疗后，明显提高了频繁复发患者的疗效，使完全缓解率从0提高到50%。

综上：本发明药物组合物对难治性肾病综合征有较好的治疗作用，有效率高，症状改变明显，复发率低，具有良好的临床应用前景。

试验例2本发明药物对大鼠实验性肾病综合征的治疗作用

1.1实验原理

肾病综合征在临床上以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症为特征，且存在高凝状态血流变异常。改善这些症状对肾病的治疗具有重要意义。文献报道研究阿霉素（ADR）具有强烈的细胞毒作用，可直接损害肾细胞，从DNA水平直接干预足突细胞的蛋白合成，使足突细胞结构发生紊乱，造成足突细胞的形态学改变；其次，阿霉素含有醒式结构，在肾脏内代谢还原为半醒型自由基，后者与氧反应产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，破坏滤过膜结构和功能，其模型大鼠能表现为典型肾病综合征症状。合并单侧肾脏摘除，可加速在动物身上复制出实验性肾病模型。

1.2动物模型的建立

体重180～200g的SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为假手术对照组、模型对照组、强的松组（0.02g/kg）、本发明药物大（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、小（7.83g/kg生药量）剂量组，每组10只。大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，除假手术组大鼠只做肾脂肪剥离外，其余各组大鼠行左肾摘除术。方法：常规消毒，背部切口1～1.5CM，暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾，缝合切口。术后青霉素G肌肉注射，2万U/只。术后7d，大鼠尾静脉注入阿霉素6mg/kg，术后第20d重复注射2mg/kg。于摘除肾脏后同时给予药物治疗。实验期间大鼠自由取食饮水，治疗组每日灌服强的松或本发明药物大、中、小剂量，药物干预治疗后5周结束实验。

1.3观察指标和测定方法

1.3.1观察一般情况

观察大鼠的精神状况、体貌、饮水、活动、水肿、体重等。

1.3.224小时尿蛋白定量

分别于造模前（0周）、造模后（尾静脉注射ADR）第1周末、第2周末、第3周末及第4周末将各组大鼠分别置于清洁的代谢笼中，禁食，自由饮水的条件下留取24h尿液，用尿蛋白试剂盒测定24h尿蛋白定量。

1.3.3血生化检查

各组大鼠于实验第5周末处死，股动脉采血测定血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平。

1.3.4血液流变学指标

大鼠处死采血后，采用全自动血流变学仪测定不同切变率的全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数。

1.3.5肾脏形态学检查

将取出的肾脏进行大体观察。肾脏组织剥离肾包膜，于10%福尔马林中固定，进行脱水、透明、石蜡包埋，切成3μm切片，作苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察，100倍光镜下摄影采图，观察肾组织病理变化。

1.4实验结果

1.4.1一般情况

尾静脉注射ADR大鼠于造模后一周普遍出现不同程度的腹泻、毛发暗淡脱落、精神萎靡、尾部红肿溃烂，并伴有消瘦的体症。治疗各组大鼠症状较模型组轻，但均不及假手术组。在整个实验过程中，假手术组体重增加明显，与之相比其余各组增长明显较低。以强的松组体型最为瘦削。第一次注射ADR后五天内，因为严重腹泻，模型组和治疗组共有7只大鼠死亡，故用候补大鼠补足。

1.4.224小时尿蛋白定量

观察造模前（0周）、造模后（尾静脉注射ADR）1周、2周、3周及4周24小时尿蛋白定量，总计观察时间为5周，结果如表7、图1所示。

表7：各组大鼠24小时尿蛋白定量的变化（

）

注：与假手术组比较，^*P＜0.01；与模型组比较，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01；与强的松组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

结果表明：造模前各组大鼠间尿蛋白量无明显差异。

造模后1周，模型组大鼠的尿蛋白量显著增加，与假手术组比较有极显著性差异（P＜0.01）；各给药组与模型组比较尿蛋白量均降低，其中本发明药物大、中剂量组及强的松组尿蛋白排泄量降低最为明显（P＜0.01）。

造模后2周，模型组大鼠的尿蛋白量继续显著增加，与假手术组相比有极显著性差异（P＜0.01）；各给药组与模型组大鼠相比，尿蛋白排泄量显著减少（P＜0.01）。

造模后3周，模型组大鼠的尿蛋白量达到最高峰，与假手术组相比有极显著性差异（P＜0.01）；各给药组与模型组大鼠比较，尿蛋白量的降低均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），以本发明药物大、中剂量组及强的松组最为显著（P＜0.01）；其中本发明药物大剂量组尿蛋白量显著低于强的松组（P＜0.05）。

造模后4周，模型组大鼠尿蛋白排泄量依旧极显著高于假手术组（P＜0.01）；与模型组相比，本发明药物大剂量组的尿蛋白量极显著降低（P＜0.01），其余给药组尿蛋白量降低，但无显著性差异。

提示本发明药物大剂量组能稳定、持续地降低ADR肾病模型大鼠的24小时尿蛋白量，对肾病中普遍存在的尿蛋白量增高有良好的抑制作用。

1.4.3血生化检查

（1）血清蛋白

结果如表8、图2所示：

表8：大鼠血清蛋白比较（

）

注：与假手术组比较，^*P＜0.01；与模型组比较，^ΔP＜0.05^ΔΔP＜0.01；

结果表明：实验第五周末，模型组大鼠血清总蛋白和白蛋白降低，与假手术组比较有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，本发明药物大、中、小剂量组的血清总蛋白均有所升高，但无统计学意义；本发明药物大、中剂量组能显著提高血清白蛋白量（P＜0.05）。

（2）血脂

结果如表9、图3所示：

表9：大鼠血脂比较（）

注：与假手术组比较，^*P＜0.01；与模型组比较，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01。

结果表明：实验第五周末，模型组大鼠血清甘油三酯、总胆固醇和低密度胆固醇升高，与假手术组比较有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，本发明药物大、中、小剂量组血清甘油三酯无显著性差异；本发明药物大剂量组能显著降低血清总胆固醇水平（P＜0.05）；本发明药物大、中剂量组的低密度胆固醇水平均显著降低（P＜0.05）。提示本发明药物大、中剂量组能降低模型大鼠血脂水平。

（3）肾功能

结果如表10、图4所示：

表10：大鼠肾功能比较（

）

注：与假手术组比较，^*P＜0.01；与模型组比较，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01。

结果表明:实验第五周末，模型组大鼠血清尿素氮、肌酐升高，与假手术组比较有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，本发明药物大剂量组能显著降低血清肌酐水平（P＜0.05）。提示本发明药物大剂量组能改善模型大鼠肾功能。

1.4.4血流流变学指标

结果如表11所示：

表11：大鼠血流变指标比较（

）

注：与假手术组比较，^*P＜0.01；与模型组比较，^ΔP＜0.05^ΔΔP＜0.01；

结果表明：实验第五周末，模型组大鼠全血高、中、低切粘度和血浆粘度、红细胞聚集指数升高，与假手术组相比有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，各给药组均在不同程度上降低全血低切粘度（P＜0.05，P＜0.01）；本发明药物大、小剂量组能显著降低全血中切粘度（P＜0.01，P＜0.05）；本发明药物大剂量组能极显著降低全血高切粘度（P＜0.01）；各给药组血浆粘度无显著性差异；本发明药物大剂量组能显著降低红细胞聚集指数（P＜0.05）。提示本发明药物可以改善肾病模型大鼠血液黏滞栓塞状态。

1.4.5肾脏形态学检查

（1）肾脏大体观察情况

结果如表12、图5所示：

表12：肾脏大体观察情况

（2）肾组织病理形态学观察

结果如图6所示：

假手术组：肾脏皮质、髓质结构清晰正常；肾小球毛细血管丛未见增生、管壁未见增厚、血管腔未见狭窄或扩张，系膜区未见系膜细胞及基质增生，基底膜未见增生；肾小管及集合管结构清晰正常，小管上皮细胞未见细胞内水肿、颗粒样、空泡变性，未见扩张、萎缩、坏死，未见管型；肾间质未见炎性反应、扩张及充血，未见间质纤维化。

模型组：肾髓质可见灶性水肿变性；肾小球毛细血管扩张淤血，球囊粘连，系膜区中重度系膜细胞增生，基底膜中重度增厚，呈局灶节段性；肾小管结构紊乱，上皮细胞可见空泡变性，肾近曲、远曲、髓袢及集合小管上皮可见灶性水肿变性，管腔扩张，腔内可见大量蛋白管型、伴有透明管型、颗粒管型、及内红细胞；肾间质可见严重灶性淋巴细胞及浆细胞浸润的炎症反应，伴有轻度间质纤维化。

本发明药物大剂量组：肾小球病变轻于模型组，略重于激素组，肾小球毛细血管轻度扩张，球囊轻度粘连，系膜区轻度系膜细胞增生；部分肾小管结构清晰，与模型组相比，小管上皮水肿变性程度明显减轻，偶见蛋白管型；肾间质炎性程度明显减轻，与激素组相当，呈现轻度灶性淋巴细胞浸润，未见纤维化。

本发明药物中、小剂量组：肾小球、肾小管间质病变呈不同程度的介于模型组和激素组之间，病变程度普遍较大剂量重。

强的松组：肾小球毛细血管丛未见增生，血管腔轻度扩张或狭窄，少数伴有球囊粘连，系膜区轻度增生及基底膜增厚病变程度较模型组明显改善；肾小管上皮细胞未见细胞水肿，偶见管腔扩张，腔内管型多为蛋白管型；与模型组比较，肾间质炎性程；度大大改善，未见间质纤维化。

试验例3本发明药物的免疫调节作用

实验前准备：

配制阿氏液：

葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后将pH值调到6.1，经过115℃，10min的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。

制备鸡红细胞悬液：

（1）采血在灭菌操作下，自鸡翼下静脉采血，置于配制好的阿氏液中，鸡血与阿氏液体积比为1:5。

（2）10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心2000r/min，5min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗涤3次，前2次离心速度为（2000r/min，15min），弃上清液和界面的白细胞层。最后1次离心（2000r/min，10min），准确观察刻度离心管中红细胞体积(ml)，加入9倍体积(ml)的生理盐水，用吸管反复吹吸，使生理盐水与红细胞混合均匀。

（3）5%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心2000r/min5min，弃去上清液，洗涤方法同上，准确观察刻度离心管中红细胞体积(ml)，加入20倍体积(ml)的生理盐水，用吸管反复吹吸，使生理盐水与红细胞混合均匀。

补体的制备：

10%豚鼠血清制备，于实验当天，豚鼠心脏或股动脉取血后离心（2000rpm，10min）取上清液，用灭菌生理盐水配制为10%的豚鼠血清。

1、对免疫功能低下小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

1.1实验分组及给药

取KM小鼠60只，雌雄各半。实验随机分为空白组、模型组、阳性组（甘露聚糖肽胶囊,0.005g/kg）、本发明药物大（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、小（7.83g/kg生药量）剂量组。除空白组外，其余各组均建立腹腔注射环磷酰胺(20mg/kg于第9d、11d、13d给药)致小鼠免疫抑制模型。于造模第1天，各药物组以相应药物灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。1次/d，连续15d。

1.2实验方法

于末次给药30min后每鼠腹腔注射10%鸡红细胞混悬液0.5ml/只，60min后颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射生理盐水1ml，轻轻的按摩1分钟，吸出腹腔洗液0.5ml滴两滴于处理的载玻片上，放入垫有纱布的塑料盒内，37℃孵箱30min，用生理盐水漂洗去未贴壁的细胞，晾干后置于1:1的丙酮-甲醇溶液中，固定10min，瑞氏-姬姆萨液染色15min，再用蒸馏水漂洗晾干，用100×显微镜计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数，计数200个巨噬细胞。吞噬率(％)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／计数的巨噬细胞数×100％，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数／计数的巨噬细数。

1.3实验结果

结果如表13所示：

表13本发明药物对免疫抑制模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（

）

注：与空白组比较ΔP＜0.01；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明：与空白组比较，模型组的吞噬率和吞噬指数均极显著降低（P＜0.01），说明模型组小鼠的免疫功能受到抑制，模型复制成功。与模型相比较。本发明药物各剂量组均能不同程度显著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数（P＜0.05或P＜0.01），说明本发明药物能显著提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫功能。从表13亦可以看出，本发明药物大、中剂量的作用力最强。

2、对免疫功能低下小鼠溶血素抗体生成的影响

2.1实验分组别及给药

同本试验例中1.1方法。

2.2实验方法

于给药第9天每鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2ml进行免疫，免疫6d后眼眶取血约0.020ml置1ml生理盐水中，同时加入0.5ml4%鸡红细胞悬液和0.5ml10%的豚鼠血清，37℃水浴30min，然后冰浴终止反应，以2000rpm离心10min，取上清液1ml加入3ml临用前配制的红细胞应用液中，反应5min，在540nm处比色，记录OD值。

3.3.3实验结果

结果如表14所示：

表14本发明药物对免疫功抑制模型小鼠溶血素抗体生成的影响（

）

注：与空白组比较^*P＜0.01

结果表明：与模型组、对照组相比，本发明药物各剂量组溶血素生成无显著差异性，表明本发明药物对免疫抑制模型小鼠的体液免疫无增强作用。

3、对小鼠免疫器官重量的影响

3.1实验分组别及给药

同本试验例中1.1方法。

3.2实验方法

取KM小鼠60只，雌雄各半。实验随机分为空白组、模型组、阳性组（甘露聚糖肽胶囊，0.005g/mg）、本发明药物大（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、小（7.83g/kg生药量）剂量组。除空白组外，其余各组均建立腹腔注射环磷酰胺(20mg/kg于第9d、11d、13d给药)致小鼠免疫抑制模型。于造模第1天，各药物组以相应药物灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。1次/d，连续15d。末次给药后1h处死小鼠，迅速将胸腺、脾脏取出称湿重，以胸腺或脾脏重量（mg）与体重（g）之比作为胸腺或脾指数。

3.3实验结果

结果如表15所示：

表15本发明药物对免疫抑制模型小鼠免疫器官重量的影响（

）

注：与空白组比较ΔP<0.01；与模型组比较^*P<0.05，^**P<0.01。

结果表明：与模型对照组比较，本发明药物各剂量组对免疫抑制模型小鼠的胸腺/体重、脾脏/体重均有不同程度的增加（P＜0.05或P＜0.01），说明本发明药物具有对抗免疫抑制模型小鼠的免疫器官重量下降的作用。

综上，本发明药物能提高免疫抑制模型小鼠的免疫力。

试验例4本发明药物活血化瘀的作用

1、对小鼠凝血时间的影响

1.1实验原理

活血化瘀用于治疗“血瘀”证。按中医的认识，血行应“如水之流”，“行有经纪”。血瘀证基本上同现代血液动力学中的血流量减少或组织供血不足等症相似。活血化瘀就是一种通过调整血管功能以及改善血凝状态等，从而消除或抑制已经发生的病理状态、促进循环的药物功效。本次实验采用小鼠毛细玻管法、大鼠凝血功能实验，观察本发明药物对小鼠凝血时间及大鼠凝血四项指标的影响。

1.2实验方法

KM小鼠50只，雌雄各半。随机分为5组：空白组、阳性组（阿司匹林组，0.025g/kg）、本发明药物高（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、低（7.83g/kg生药量）剂量组。动物每日给药一次，连续6d。空白组给予等体积生理盐水。末次灌胃1h后，用用内径1mm，长15cm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦后静脉丛，深5mm，自血液流进毛细玻管时开始计时，待血液注满玻管后，取出平放于桌面上。每隔30s，折断玻管约5mm，并缓慢向左右拉开观察折断处是否有血凝丝出现，直至有血凝丝出现所需时间即为凝血时间。

1.3实验结果

本发明药物对小鼠全血凝血时间的影响如表16所示：

表16本发明药物对小鼠全血凝血时间的影响（

）

注：与空白组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

结果表明：与空白组比较，本发明药物高（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、低（7.83g/kg生药量）剂量组在不同程度上都能延长小鼠凝血时间。其中尤以大、中剂量组最为明显（P＜0.01,P＜0.05）。

2、对大鼠凝血功能的影响

2.1实验方法

SD大鼠50只，雌雄各半。随机分为5组：空白组、阳性组（肝素钠，60μ/kg）、本发明药物高（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、低（7.83g/kg生药量）剂量组。动物每日给药一次，连续7d，阳性组于实验当天iv60μ/kg。空白组给予等体积生理盐水。末次给药2h后颈动脉放血，取血4.5ml,以3.8%枸橼酸钠1：9抗凝。分别测定凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）。

2.2实验结果

本发明药物对大鼠凝血功能的影响结果如表17所示：

表17本发明药物对大鼠凝血功能的影响（

）

注：与空白组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

结果表明：与空白组相比，本发明药物大、中剂量组均能明显延长凝血活酶（PT）时间（P＜0.01，P＜0.05）；大剂量组亦能显著降低纤维蛋白原（FIB）含量（P＜0.05）、极显著延长部分凝血活酶时间（APTT）（P＜0.01）；本发明药物不同剂量组还有不同程度延长凝血酶原（TT）的作用（P＜0.05，P＜0.01）。说明本发明药物可以通过调节凝血因子起到活血化瘀的作用。

试验例5本发明药物对水负荷大鼠利尿作用的影响

1、实验原理

在急慢性肾病过程中炎性损伤是一个水湿内生，湿热导致水液代谢失衡的过程。故在研究药物防治难治性肾病综合征的任何实验中，利尿实验是必不可少的考察内容。选在高渗尿的情况下采用水负荷试验验证药效。

2、实验方法

SD大鼠预先使适应代谢笼环境1～2日，观察自由饮水条件下尿量是否稳定。实验前18h禁食不禁水，按2.5ml/100g体重灌以蒸馏水，使动物体内水平衡。收集2h尿液，筛选尿量超过1ml水负荷者，并按照体重随机分为本发明药物大（31.33g/kg生药量）、中（15.67g/kg生药量）、小（7.83g/kg生药量）三个剂量组、阳性药氢氯噻嗪对照组（0.025g/kg）、空白对照组等5组，灌胃给药7d。阳性药氢氯噻嗪于实验当日给药。末次给药前18小时给各组大鼠禁食不禁水。分别以5ml/100g体重灌胃给予含有各组药物的盐水溶液，空白组只灌服生理盐水。然后压迫大鼠下腹，使膀胧内余尿排尽，放入代谢笼观察给药后的5h内各时间段尿量。每60min收集尿液一次并测量尿液体积并测量5h总尿量。比较各个不同时间点尿量的变化情况。并测定尿液中纳、钾、氯离子电解质含量。

3、实验结果

本发明药物对水负荷大鼠尿量的影响结果如表18、图7所示：

表18本发明药物对水负荷大鼠尿量的影响（

）

注：与空白组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

结果表明：与空白组比较，不同剂量本发明药物对水负荷大鼠的总排尿量均有显著或极显著的促进作用（P＜0.05或P＜0.01）；其中本发明药物大剂量组在给药后1～5h各时间段，对水负荷大鼠的利尿程度最为明显，与空白组比较有显著性和极显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）。

本发明药物对大鼠尿液中K+、Na+、Cl-离子浓度的影响如表19所示：

表19本发明药物对大鼠尿液中K+、Na+、Cl-离子浓度影响（

）

注：与空白组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

结果表明：与空白组比较，不同剂量本发明药物可以及显著增加尿中钾离子的排除（P＜0.01）；本发明药物大、中剂量组同时能显著增加钠离子的排除（P＜0.05）；本发明药物大剂量组亦有显著增加氯离子排出的作用（P＜0.05）。

试验例6本发明药物对脂多糖LPS致家兔发热的影响

1、实验原理

湿热证中，久郁化热，热郁成毒。LPS通过激活内生致热源细胞产生和释放内生致热原，再经一些后继环节引起体温升高，在反应前释放的IL-1细胞介导因子，而IL-1正是引起肾小球炎症反应的介质，在肾脏疾病的转归中起主要因素，很好的复制了“湿热蕴毒”的模型。

2、实验方法

2.1动物及体温测定

健康雄性日本大耳白，体重2.0±0.2kg。实验室温度控制在20～25℃，相对湿度40%～60%。采用颈部固定，用数字温度计探头插入肛门4～5cm测定肛温。筛选方法：每日用数字温度计测量肛温两次，连续3日，选择体温范围在(39.05±0.45)℃之间、且体温波动不超过0.3℃的大耳兔30只备用。给药前测定大耳兔肛温，每隔10min测1次，总共3次，取取其体温平均值为基数。

2.2模型制备与分组给药

30只大耳兔随机分为5组：模型组、阳性组（布洛芬，0.15g/kg）、本发明药物大（15.67g/kg生药量）、中（7.83g/kg生药量）、小（3.92g/kg生药量）剂量组，每组6只。造模前预防性给药7d，模型组给予等量生理盐水。末次给药0.5h后，建立内毒素发热模型，采用一次性耳缘静脉注射脂多糖（Lioioilysaccharide,LPS）250ng/kg方法。

2.3观测指标与测定方法

于LPS注射30min、1、2、3、4、6h后各测肛温一次。以给药测定体温平均值为基数，计算各测定时间家兔体温的变化。并用注射LPS后时间为横坐标、体温变化为纵坐标作体温曲线图。比较各组动物ΔT,ΔTmax。观察本发明药物防治LPS家兔发热模型的效果。

3、实验结果

结果如表20、图8所示：

表20本发明药物对兔各时间点体温变化的影响（

）

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明：各组动物实验前体温均在正常范围，各组之间无明显差异（p＞0.05）。与模型组比较，本发明药物各剂量组在各时间点的ΔT及ΔTmax均低于模型组。说明本发明药物在发热潜伏期及发热过程中，对发热都有一定抑制作用，且以大剂量最为优。

综上，本发明药物组合物具有改善肾功能的，能显著减少尿蛋白的排泄、改善低蛋白血症、调节血脂代谢，改善肾脏组织结构的病理损伤，并具有利尿、解热、调节免疫功能及活血化瘀的功效，对肾病综合征，特别是难治性肾病综合征有较好的治疗作用，有效率高，症状改变明显，复发率低，具有良好的临床应用前景。

Claims (10)

1.一种治疗肾病综合征的药物组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

木贼154-462份、石韦154-462份、益母草192.5-577.5份、鱼腥草257-771份、白花蛇舌草257-771份、贯众192.5-577.5份、萆薢154-462份、木蝴蝶154-462份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

木贼308份、石韦308份、益母草385份、鱼腥草514份、白花蛇舌草514份、贯众385份、萆薢308份、木蝴蝶308份。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：它是由所述重量配比的原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的口服制剂；进一步地，所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、胶囊剂、软胶囊剂、片剂或口服液。

4.权利要求1～3任意一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）按所述重量配比称取原料药；

（2）加水或有机溶剂提取，浓缩至清膏，加入药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为50-95%乙醇。

6.权利要求1～5任意一项所述药物组合物在制备改善肾功能的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的药物是具有减少尿蛋白的排泄，升高血清白蛋白，降低尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、低密度胆固醇的功效的药物。

8.权利要求1～3任意一项所述药物组合物在制备治疗肾病综合征的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗难治性肾病综合征的药物。

10.权利要求1～3任意一项所述药物组合物在制备利尿、解热、调节免疫、活血化瘀的药物中的用途。

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