实施例20:
称取茯苓多糖1000g,白术内酯300g,按照常规工艺加入常规辅料,制备成泡腾剂。
下面通过具体的药学试验来验证本发明的有益效果
1茯苓多糖的制备
1.1试验材料
茯苓采用多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。
1.2仪器
电子天平SartoriusBP211D型,循环水真空泵SHB-Ⅲ型,真空干燥箱DZG-6050型,WR-100型高速粉碎机。
1.3试剂
无水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮,成都科龙化工厂。
1.4茯苓多糖提取与精致
称取茯苓饮片250g,用微型高速粉碎机均匀粉碎茯苓饮片,然后过60目筛得到茯苓粗粉。将粗粉放置在提取器中,先以石油醚(60℃~90℃)回留1小时除去脂类,加入90%乙醇5000ml,在80℃下回流,浸提2次,每次2小时。然后用旋转蒸发仪挥去溶剂,再用水提取多糖,提取液在50℃经减压浓缩至原体积的1/3,浓缩后在水溶液中加入4倍量的95%乙醇,静置过夜,运用抽滤瓶进行抽滤,沉淀,依次运用无水乙醇、丙酮、乙醚洗脱,所得到的提取物在60℃真空干燥箱中烘干至恒重,所得到的粉末状提取物即为茯苓多糖。除按上述方法制备茯苓多糖外,也可以用其它常规提取分离方法制备茯苓多糖。
2白术内酯的制备
2.1试验材料
白术采用菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoids的干燥根茎。
2.2仪器及试剂
电子天平SartoriusBP211D型,循环水真空泵SHB-Ⅲ型,真空干燥箱DZG-6050型,KQS200B型超声波清洗器,正己烷分析纯。
2.3白术内酯提取及精致
称取白术饮片药材250g,用500ml水在室温下浸泡24h,然后超声30min用300目的滤布过滤得到提取液。滤渣再加250ml水超声30min,用滤布再过滤,如此重复一次。经过三次超声提取白术内酯之后,白术内酯已基本提取完全。提取液在65℃减压浓缩,得浓缩提取液500ml。浓缩提取液用200ml正已烷70℃下回流提取1.5h后,用分液漏斗分离,浓缩提取液再用正已烷重复回流2次。合并正已烷,减压回收正已烷后得到正己烷浓缩液10ml,在室温下冷却,得淡黄色针晶,即白术内酯粗品。该针晶经正己烷加热溶解重结晶纯化后得到白色针晶,即白术内酯精制品。除按上述方法制备白术内酯外,也可以用其它常规提取分离方法制备白术内酯。
3本发明药物对克罗恩病大鼠细胞因子的影响
3.1实验材料
3.1.1实验动物
SPF级SD大鼠170只,雌雄各半,体重200±20g,由成都达硕生物科技有限公司提供,合格证号:SCXK(川)2008-11,检疫后备用。适应性饲养1周,自由摄食颗粒饲料,动物房温度维持在18~25℃左右。动物标准颗粒饲料由成都中医药大学实验动物中心提供。
3.1.2主要药品及试剂
3.1.2.1药材
白术、茯苓、大黄、厚朴、枳实均购自同仁堂药店成都分店,经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定,各药材均符合《中国药典》(2010版第一部)药品相关项目检查,为菊科植物白术AtractyodesmacrocephalaKoidz的根茎,为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。茯苓多糖、白术内酯为自制品。
3.1.2.2试剂
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),Sigma公司提供,批号:P2297;
肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)定量试剂盒,美国RD公司提供,批号:201106;
白介素-1β(Interleukin-1,IL-1β)定量试剂盒,美国RD公司提供,批号:201106;
白介素-4(Interleukin-4,IL-4)定量试剂盒,美国RD公司提供,批号:201106;
白介素-10(Interleukin-10,IL-10)定量试剂盒,美国RD公司提供,批号:201106;
无水乙醇,成都科龙化工厂;水合氯醛,成都科龙化工厂;
二甲苯,成都科龙化工厂;40%甲醛,成都科龙化工厂。
3.1.3主要仪器
海尔BCD-258WBCSTX冰箱,Hair;Bp6181036539型电子分析天平,SartoriusAG;
LegendRT+230v台式冷冻离心机,Thermo;酶标定量测定仪,ThermoMultiskanAsCant;
GE1160型包埋机,Leica;HI1210型摊片机,Leica;
HI1220型烘片机,Leica;RM2245型切片机,Leica;
BX51型研究显微镜,Olympus;DFC-300FX型摄像系统,Leica。
3.1.4实验动物设施条件
成都中医药大学基础医学院SPF级动物实验室进行。设施合格证:四川省实验动物管理委员会实验动物设施条件合格证书:川实动管使第2003-015号。
3.1.5实验场地
成都中医药大学基础医学院,国家中医药管理局病理三级实验室。证书登记编号:TCM-2009-315。
3.2实验方法
3.2.1药物制备
3.2.1.1造模药物制备
按厚朴:枳实:大黄=3:3:2的比例称取适量饮片,厚朴、枳实浸泡40min,生大黄浸泡20min,厚朴、枳实先煎沸10min,再下大黄共煎10min,过滤,二煎煎煮10min,过滤后合并2次煎液,60℃水浴浓缩为1:1(即每毫升药液含原生药1g)药液,4℃冰箱保存备用。
TNBS灌肠液的制备:无水乙醇加双蒸水配成50%乙醇75ml,然后将5%TNBS10ml×15与50%乙醇(2:1=V:V)混合均匀,灭菌后装瓶4℃保存。
3.2.1.2供试药物制备
运用“基线等比增减设计法”对白术、茯苓剂量配比进行设计,以《中国药典》(2010版)记载的白术用量6~12g、茯苓用量10~15g,在总量恒定的前提下以二药最大运用剂量为配比基线即12/15,其剂量设计具体见表1。
表1白术、茯苓剂量配比(单位:g)
按照上述比例,称取适量白术茯苓饮片,混合浸泡30min,煎煮30min,过滤,共煎2次,合并滤液,60℃水浴浓缩为1:1(即每毫升药液含原生药1g)药液,4℃冰箱保存备用。
白术内酯:按照1mg/ml的浓度配制溶液,以1ml/100g的剂量给药;茯苓多糖:按照1mg/ml的浓度配制溶液,以1ml/100g的剂量给药;白术内酯+茯苓多糖(等比混合)组合高、中、低剂量组按2mg/ml、1mg/ml及0.5mg/ml/100g的剂量给药。
3.2.2动物模型制备
本研究采用耗气破气加饥饱失常之复因脾虚造模法结合TNBS/乙醇法建立脾气虚CD动物模型。170只SD大鼠,雌雄各半,按体重随机分为2批,10只常规饲养,为空白组,160只造模。空白组10只,常规饲养;160只造模大鼠采用耗气破气水煎剂按20ml(kg.d),1次/d的剂量灌胃,加隔天禁食造成饥饱失常,连续14d,复制脾气虚模型。并于造模第7天开始禁食不禁水24h。用2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,予TNBS灌肠液1ml灌肠。灌肠器插入肛门约6~8cm,注入灌肠液1ml。大鼠头朝下体位,且灌肠器拔出后再继续保持1min左右,以防灌肠液溢出。每隔5d重复灌肠1次,共5次。
3.2.3实验分组及给药方法
造模结束后,造模大鼠随机分为1个模型组、白术内酯、茯苓多糖、白术内酯+茯苓多糖(等比)高、中、低剂量组、白术茯苓不同配比B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10组。空白组从实验开始至实验结束正常饮水、喂食;各治疗组以白术茯苓汤不同配比之水煎液按10ml/Kg灌胃,每日1次,连续7d;模型组灌胃等量0.9%氯化钠溶液,每日1次,连续7d;白术内酯、茯苓多糖、白术内酯+茯苓多糖(等比混合)组合高、中、低剂量组按3.2.1.2供试药物制备中记载的剂量给药。
3.2.4标本采集及制作
给药7天后,各组动物禁食不禁水24h,股动脉取血处死大鼠,取血后不抗凝4℃静置保存2-3h。用离心机2500r/min离心15min,取上清液,即为待测样本,用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。沿腹正中线剪开,从肛门上8cm处至肛门将结肠取出并用5ml注射器将针头缓慢插入结肠内灌入4℃生理盐水反复冲洗洁净组织。把结肠分为两段,距肛门4cm至8cm处为上半段,肛门至4cm处为下半段。然后将结肠下半段切下并沿纵轴剪开,用生理盐水冲洗干净,并用滤纸吸干水,观察结肠组织有无充血水肿,计算溃疡面积,然后取肠段病变最严重部位2cm10%甲醛固定,组织脱水,石蜡包埋。将蜡块切片,进行常规HE染色,光学显微镜下观察结肠组织形态学变化。
3.3指标检测及方法
3.3.1一般情况观察
观察大鼠的体重、大便、食欲、活动度、皮毛光泽度、精神状态等,以及有无死亡情况,并做记录。
3.3.2脾气虚CD大鼠结肠损伤评价
将结肠下半段切下并沿纵轴剪开,用生理盐水冲洗干净,并用滤纸吸干水,观察炎症和溃疡发生的情况,参照相关方法及标准评价结肠组织损伤指数评分(CMDI)。评分标准见表2。
表2结肠组织形态学评分标准
3.3.3大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的检测
采用ELISA方法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10,严格按照试剂盒说明书操作具体步骤如下:⑴从冰箱中取出试剂盒,在室温下平衡20min后,取出所需板条。⑵设置标准品孔和样品孔,标准品孔加各不同浓度的标准品50μL。⑶样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。⑷除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育10min。⑸洗板机洗板。⑹每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。⑺每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。⑻在EXECL工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值做纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,根据曲线方程计算各样本浓度值。
3.4数据分析与统计方法
实验数据以形式表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
3.5实验结果
3.5.1一般情况
空白组:大鼠饮食正常,大便成形,毛色光润,形体肥壮,反应灵活,喜活动。
模型组:大鼠造模后第4天出现不成形稀便,6天可见水样便,肛周糊状稀便粘附,食欲减退,喜静扎堆,反应欠灵敏等症状。8天后出现粘液脓血便、水样便,精神萎靡,食欲减退,明显消瘦,毛色不荣、脱毛等症状。上述症状一直持续,逐渐加重。造模结束仍见粘液便、少量脓血便,肛周糊有少量稀便、活动较少、反应差、毛色不光泽。
治疗组:造模过程中症状同模型组。经过白术内酯、茯苓多糖、白术内酯+茯苓多糖组合物组及白术茯苓汤各组经治疗后,各组大鼠食量逐日改善,体重逐渐增加,毛色渐变有光泽,B1、B2、B9、B10组大鼠仍有少量粘液便、肛周糊有少量稀便,大便部分不成形;其余治疗组大鼠大便基本恢复正常,肛周逐渐变干净,体重增加。
3.5.2本发明药物对CD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的影响
CD的发生与促炎因子和抗炎因子之间的平衡失调关系密切[17],促炎性细胞因子包括TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8等;抗炎性因子,又称免疫调节因子,包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、集落刺激因子(CSF)和γ干扰素(IFN-γ)等。检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的水平,以了解机体炎症情况。结果见表3、表4。
表3本发明药物对CD大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响
与空白组相比:▲P﹤0.05;与模型组相比:*P﹤0.05
与空白组比较,模型组TNF-α水平显著升高(P﹤0.05);与模型组比较,组合物高、中、低、B5组、B6组及B7组显著降低TNF-α水平(P﹤0.05)。与空白组比较,模型组大鼠IL-1β水平显著升高(P﹤0.05);与模型组比较,组合物高、中、B6组及B7组IL-1β水平显著降低(P﹤0.05)。
表4本发明药物对脾气虚CD大鼠血清IL-4、IL-10的影响
组别 |
数量(n) |
IL-4(pg/ml) |
IL-10(pg/ml) |
正常 |
10 |
63.68±5.42* |
103.32±6.99* |
模型 |
6 |
57.84±5.41▲ |
92.13±3.84▲ |
白术内酯 |
7 |
60.25±4.25 |
95.75±5.62 |
茯苓多糖 |
8 |
59.79±4.36 |
97.87±4.57 |
组合高剂量 |
7 |
63.52±6.36* |
101.56±4.46* |
组合中剂量 |
7 |
63.57±4.46* |
98.98±3.58* |
组合低剂量 |
8 |
61.81±3.53 |
98.37±5.51 |
B1 |
7 |
58.19±4.27 |
93.23±9.42 |
B2 |
6 |
58.21±4.85 |
94.10±6.00 |
B3 |
7 |
58.51±2.70 |
94.39±5.04 |
B4 |
8 |
61.18±4.58 |
95.68±5.15 |
B5 |
8 |
62.81±4.88 |
98.18±3.94 |
B6 |
7 |
63.42±4.94* |
98.77±3.90* |
B7 |
7 |
63.08±4.63* |
98.17±4.48 |
B8 |
7 |
59.88±2.22 |
95.75±4.60 |
B9 |
6 |
58.47±2.78 |
94.09±5.81 |
B10 |
6 |
57.90±4.85 |
93.90±5.76 |
与空白组相比:▲P﹤0.05;与模型组相比:*P﹤0.05
与空白组比较,模型组IL-4水平显著降低(P﹤0.05);与模型组比较,组合物高、中、B6组和B7组IL-4水平显著升高(P﹤0.05)。与空白组比较,模型组IL-10水平显著降低(P﹤0.05);与模型组比较,组合物高、中和B6组IL-10水平显著升高(P﹤0.05)。
4本发明药物对脾气虚CD大鼠结肠VIP、VIPR1的影响
4.1实验材料
4.1.1实验动物
同实验3,见3.1.1。
4.1.2主要药品及试剂
4.1.2.1药材
同实验3,见3.1.2.1。
4.1.2.2试剂
VIP免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司,批号:BAO132;
VIPR1免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司,批号:BAO156。
4.2.3主要仪器
海尔BCD-258WBCSTX冰箱,Hair;Bp6181036539型电子分析天平,SartoriusAG;
RM2245型切片机,Leica;HI1210型摊片机,Leica;
HI1220型烘片机,Leica;GE1160型包埋机,Leica;
BX51型研究显微镜,Olympus;免疫组化图像分析软件:IMAGE-PROPLUS6.0;
DFC-300FX型摄像系统,图形分析系统:Mias-2000,四川大学图像图形研究所。
4.2实验方法
4.2.1药物制备
同实验3,见3.2.1。
4.2.2脾气虚CD动物模型制备
同实验3,见3.2.2。
4.2.3实验分组及给药方法
同实验3,见3.2.3。
4.2.4标本采集及制作
标本采集同实验3,见3.2.4。
标本制作:常规石蜡包埋、切片,采用免疫组化实验方法对大鼠结肠组织VIP、VIPR1进行检测。免疫组化实验操作步骤:⑴石蜡切片脱蜡至水。⑵3%H2O2室温孵育5~10min,以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min。⑷10%的正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10min。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育1~2h或4℃过夜。⑸PBS冲洗,5min×3次。⑹滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30min;⑺PBS冲洗,5min×3次。⑻滴加适当比例稀释的辣根酬酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30min。⑼PBS冲洗,5min×3次。⑽DAB显色剂显色。⑾自来水充分冲洗,复染,封片。
2.2.5结果判定
免疫组化染色结果以细胞浆或膜上出现棕黄色或棕褐色为阳性,阴性细胞核为兰色,均作定量分析。
2.2.6图象分析
各组大鼠组织染色后的切片在显微镜和Mias-2000型图形分析系统下用200倍物镜随机选取3个不同的视野进行拍照,用计算机图象分析软件(IMAGE-PROPLUS6.0)对拍好的照片进行半定量分析。测定其累积积分光密度(Integratedoptiondensity,IOD),对每张切片的3个IOD求平均值并进行统计分析。
2.3数据分析与统计方法
实验数据以形式表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.4实验结果
镜下观察发现VIP、VIPR1表达染色呈棕黄色,在大鼠结肠粘膜各层均有表达。空白组:结肠组织肌间丛与粘膜下可见散在的VIP、VIPR1棕黄色神经元和神经纤维,分布较稀疏,数量较少,纤维及纤维元较细小,染色较淡,呈阴性或弱阳性反应。模型组:大鼠结肠组织肌间丛与粘膜下丛则可见VIP、VIPR1阳性神经元,神经纤维明显增多,互相交织成网状,染色普遍较深,呈阳性或呈强阳性反应。治疗组:经白术内酯、茯苓多糖、药物组合物组及白术茯苓汤不同配比组治疗后,药物组合物高、中、低、B5、B6、B7结肠组织VIP及其受体VIPR1表达减弱,染色较模型组淡,数量较少,成弱阳性反应。图像分析系统对样本VIP、VIPR1的IOD值进行分析结果见表5。
表5本发明药物对脾气虚CD大鼠结肠VIP和VIPR1的影响
空白组 |
10 |
16079.92±2595.82 |
20841.71±1207.41 |
模型组 |
6 |
27067.81±3647.52▲ |
31338.47±2441.31▲ |
白术内酯 |
7 |
23281.35±2852.56 |
27806.25±2642.23 |
茯苓多糖 |
8 |
23625.63±2645.72 |
28032.63±2783.53 |
组合高剂量 |
7 |
18869.47±2753.39* |
22574.83±3562.35* |
组合中剂量 |
7 |
18673.25±2883.56* |
23675.56±3234.51* |
组合低剂量 |
8 |
19547.27±2782.45* |
23985.42±3674.37* |
B1 |
7 |
24339.31±3887.01 |
30224.41±3772.87 |
B2 |
6 |
24171.60±3517.57 |
29132.47±2265.80 |
B3 |
7 |
23843.34±2777.90 |
28668.29±2773.63 |
B4 |
8 |
23689.11±2649.14 |
28402.63±2581.24 |
B5 |
8 |
19533.66±3292.07* |
24024.59±2942.41* |
B6 |
7 |
19078.20±2687.32* |
23720.84±3035.31* |
B7 |
7 |
23206.07±3936.99* |
27179.76±2184.93* |
B8 |
7 |
23526.06±3795.47 |
28361.76±3211.11 |
B9 |
6 |
24758.39±3722.26 |
29504.07±3760.94 |
B10 |
6 |
24848.93±2088.52 |
29622.70±2681.23 |
注:与空白组,▲P<0.05,与模型组比较*P<0.05。
5本发明药物对脾气虚CD大鼠TLR4、NF-κB基因表达的影响
5.1.实验材料
5.1.1实验动物
同实验3,见3.1.1。
5.1.2主要药品及试剂
5.1.2.1药材
同实验3,见3.1.2.1。
3.1.2.2试剂
DEPC(美国,Sigma);Trizol(美国,Invitrogen);
FirstStrandcDNASynthesisKit(美国,Fermentas);
Bio-RadiQSYBR荧光定量PCR超混液(美国,BIORAD)。
3.1.2.3主要仪器
紫外分光光度计(美国,Beckman);高速冷冻离心机(德国,Eppendorf);
荧光定量PCR仪(美国,BIORAD)。
3.2实验方法
3.2.1药物制备
同实验3,见3.2.1。
3.2.2脾气虚CD动物模型制备
同实验3,见3.2.2。
3.2.3实验分组及给药方法
同实验3,见3.2.3。
3.2.4标本采集及制作
给药7天后,各组动物禁食不禁水24h,股动脉取血处死大鼠,沿腹正中线剪开,从肛门上8cm处至肛门将结肠取出,并用5ml注射器将针头缓慢插入结肠内灌入4℃生理盐水反复冲洗干净粪便。把结肠分为两段,距肛门4cm至8cm处为上半段,肛门至4cm处为下半段。然后将结肠上半段切下并沿纵轴剪开,生理盐水清洗,用载玻片刮取肠粘膜组织,置于1.8mlEP管中,迅速置放于液氮罐中快速冷却,-70℃保存备检。
3.2.5指标检测方法
3.2.5.1RT-PCR引物
基因NF-kBp65和TLR4的检测引物及内参β-actin引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,见表6。
表6NF-kBp65、TLR4和Β-actin的引物序列
5.2.5.2总RNA的抽取
采用Trizol一步法抽提RNA,用紫外分光光度计测定其总RNA的浓度及纯度,筛选OD260/OD280的比值在1.8~2.0之间的样品,计算每份样品的浓度,将全部样品的浓度都配成统一的50ng/μL。具体操作如下:⑴每100mg组织加入1mlTrizol,用2ml玻璃匀浆器将其制成组织悬液,15~30℃放置裂解5min;⑵将裂解悬液转移至1.5ml的灭菌EP管中,并做好标记;⑶加入氯仿(0.2ml氯仿/1mlTrizol),振摇15sec;⑷15~30℃孵育2~3min,4℃12,000rpm离心15min;⑸取上清移入新管,加入0.5ml异丙醇混匀,15~30℃孵育10min,4℃12,000rpm离心10min;⑹弃上清,加入1ml75%乙醇,涡旋振荡30sec,4℃7500rpm离心5min;⑺弃上清,空气中静置干燥3~5min;⑻加入20μLDEPC处理的去离子水溶解沉淀,-70℃保存。
5.2.5.3逆转录合成cDNA
按逆转录试剂盒的操作说明进行,将上述抽提的RNA逆转录成cDNA。
20μL逆转录反应体系
RNA |
2μL |
OligoPrimer |
1μL |
5XReactionBuffer |
4μL |
RiboLockTMRNaseInhibitor |
1μL |
10mMdNTPMix |
2μL |
M-MuLVReverseTranscriptase |
1μL |
Water,nuclease-free |
9μL |
上述各物质混合后于42℃孵育60min,70℃5min以终止反应。
5.2.5.4扩增特异性基因片断
25μLPCR反应体系:
Forwardprimer(10pmol/μL) |
1μL |
Reverseprimer(10pmol/μL) |
1μL |
Template(cDNA) |
2μL |
RealMasterMix/20SYBRsolution |
11.25μL |
ddH2O |
upto25μL |
5.2.5.5PCR反应条件
NF-kBp65反应条件:94℃预变性20S;设计PCR循环程序,95℃变性10S;63℃退火20S;72℃延伸16S,共40个循环。
β-actin反应条件:94℃预变性20S;设计PCR循环程序,95℃变性10S;63℃退火20S;72℃延伸16S,共40个循环。
TLR4反应条件:94℃预变性20S;设计PCR循环程序,95℃变性10S;54℃退火20S;72℃延伸16S。共40个循环。
5.3数据分析与统计
RT-PCR反应结束后,用荧光定量PCR仪自带的分析软件分析PCR过程各检测样本的CT(Thresholdcycle)值。CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。本研究以β-actin为内参采用2-ΔΔCt法计算NF-κB、TLR4相对mRNA表达水平:
△CTintervention=CTinterventionNF-KB-CTinterventionβ-actin
△CTblank=CTblankCaspase-CTblankβ-actin
△△CT=△CTintervention-△CTblank
TLR4、NF-κBmRNA表达差别倍数以2-△△CT表示。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。
结果以均数和标准差表示,数据统计使用SPSS17.0软件,计量资料用One-WAYANOVA方差分析;计数资料采用秩和检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。
5.4实验结果
对β-actin、NF-kBp65和TLR4引物的PCR结果进行分析,熔解曲线显示,β-actin在87℃出现特异性单峰,NF-kBp65在大约85℃的位置出现特异性单峰,TLR4在大约78℃的位置出现特异性单峰,这些结果表明各引物均具有较高的特异性。对TLR4和NF-kBp65引物的PCR结果进行分析,以β-actin为内参2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。结果见表7。
表7NF-kBp65和TLR4基因的相对含量
与空白组相比:▲P﹤0.05;与模型组相比:*P﹤0.05
空白组大鼠结肠组织TLR4mRNA、NF-κBmRNA仅有少量的表达,模型组大鼠结肠组织TLR4、NF-κBmRNA表达显著升高,与空白组比较有显著性差异(P<0.05);经治疗后,组合物高、中、B5及B6组TLR4mRNA、NF-κBmRNA表达明显下降,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。
白术内酯是从白术饮片中提取得到的有效成分,茯苓多糖是从茯苓饮片中提取得到的有效成分。通过上述实验证明白术内酯和茯苓多糖进行配伍后对克罗恩病具有较好的治疗作用,当单独应用白术内酯和茯苓多糖对克罗恩病的疗效较差,当两者配伍后疗效则增强,说明两者配伍后在治疗克罗恩病时具有协同增效的作用。从上述实验数据可以看出,白术、茯苓经过有效成分提取后进行组合配伍,其疗效更为优越。另外通过实验表明本发明药物组合物对溃疡性结肠炎也具有类似的治疗作用。