CN113952419B - 一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物及制备方法，该药物组合物由鹿血晶、茯苓、石斛、白术组成，制备方法为取茯苓、白术、石斛，加水煎煮两次，煎煮液浓缩后，加入鹿血晶和辅料，制成制剂。该药物组合物在保护肾功能、延缓慢性肾功能衰竭方面有显著作用。

Description

一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物及制备方法和应用。

背景技术

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由多种慢性肾脏疾病或累及肾脏的全身性疾病引起的慢性进行性肾实质损害，导致慢性肾功能减退，肾脏不能维持其排泄代谢废物、调节水盐和酸碱平衡、分泌和调节各种激素代谢等基本功能，从而出现氮质血症、代谢紊乱和各系统受累等一系列临床症状的综合征。尽管现代医学对CRF的发病机理进行了大量研究并取得了一定进展，但在临床治疗方面并未取得很大突破。目前，除进行肾移植外，慢性肾功能衰竭依然无法治愈，如何保护残余肾功能，延缓肾衰竭的进展速度就成为了治疗本病的核心问题。

慢性肾功能衰竭属祖国医学“水肿”、“关格”范畴。《黄帝内经·汤液醪醴论》载：“其有不从毫毛而生，五脏阳以竭也，津液充郭，其魄独居，孤精于内，气耗于外。”较早地提出了“水肿”的病因为“五脏阳以竭也”，认为水肿的发生，与人体阳气衰减密切相关。隋代巢元方《诸病源候论·水肿病诸侯》指出：“水病者，由肾脾俱虚故也。肾虚不能宣通水气，脾虚又不能制水，故水气盈溢，渗液皮肤，流遍四支。”认为其主要病位在“脾肾”。随着“水肿”病情发展，当出现少尿无尿、恶心呕吐等症状时，祖国医学称为“关格”，《伤寒论》载：“关则不得小便，格则吐逆”。这与现代医学中慢性肾功能衰竭导致的症状极为相似。《灵枢·脉度》载：“阴气太盛，阳气不能荣也，故曰关；阳气太盛，阴气不能荣也，故曰格，阴阳俱盛，不得相荣，故曰关格”。认为“关格”的发病机制在于“阴阳俱盛，不得相荣”。

根据查新资料，目前用于治疗CRF的上市中成药制剂有尿毒清颗粒、百令胶囊、海昆肾喜胶囊等。按照中医理论治疗CRF的上市中成药分析如下：尿毒清颗粒功效着重在“通腑降浊、健脾利湿、活血化瘀”，针对的证型为脾虚湿浊症和脾虚血瘀症者；百令胶囊功效为“补肺肾，益精气”。用于肺肾两虚型患者；海昆肾喜胶囊功效“化浊排毒”，用于慢性肾功能衰竭(代偿期、失代偿期和尿毒症早期)湿浊症。但未有针对气阴两虚型CRF的治疗相关的药物报道。

国家级名老中医王玉林教授认为：《灵枢·脉度》中所言关格的病机为“阴阳俱盛，不得相荣”，实指“气阴两虚，阴阳二气得不到相互荣养”，因此，对于慢性肾功能衰竭的治疗，当以“养阴生津、健脾益气”为主，调和阴阳二气，拟定“鹿苓安肾方”，用于临床治疗，取得良好疗效。

鹿苓安肾方由鹿血晶、茯苓、石斛、白术组成，方中鹿血晶味甘、咸，热，入肝、肾二经，重在养血益精，大补虚损，为君药；茯苓归心、肺、脾、肾经，重在健脾益气，为臣药。君臣相合，奏养阴健脾之效。石斛又名仙斛兰韵、不死草、还魂草，具益胃生津，滋阴清热之功，石斛得鹿血则津液精血生化有源，鹿血得石斛则咸热之性大减，养阴之力更强，为佐药。白术有运脾燥湿、化浊之效，得茯苓则健脾功效更著，茯苓得白术又增利水渗湿之效，亦为佐药。综观全方，彼此兼顾，互为辅助，相得益彰，共奏养阴生津、健脾益气、利水渗湿之功。达到保护肾功能、延缓慢性肾功能衰竭进展的目的。

为了适应中药现代化的要求，本发明团队根据医院制剂鹿苓安肾颗粒的制备基础及处方药材中化学成分的理化性质，对鹿苓安肾颗粒的制备工艺及稳定性进行研究，研制成院内制剂鹿苓安肾颗粒及其它剂型。颗粒剂体积小，稳定，服用方便，释药迅速，疗效确切，且操作相对简便，院内生产条件具备，通过预试验所选工艺亦可行，将鹿苓安肾颗粒申报为医院制剂，为CRF患者提供安全、有效、价廉的医院中药制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物。

本发明的另一目的是提供一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物在制备治疗慢性肾功能衰竭药物方面的应用。

本发明提供一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物，该组合物由原料鹿血晶、茯苓、石斛、白术组成。

本发明所述原料优选由以下重量份的药物组成：鹿血晶40-50份、茯苓400-500份、石斛400-500份、白术400-500份。

优选的，本发明所述原料由以下重量份的药物组成：鹿血晶45份、茯苓450份、石斛450份、白术450份。

本发明所述药物组合物的制备方法为：

1)取茯苓、白术、石斛，加入10-12倍量的水浸泡40-60min，再煎煮40-60min，过滤；再加入6-10倍量水煎煮40-60分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至60-80℃时浸膏密度为1.25～1.28；

2)在浸膏中加入鹿血晶混匀，加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。

优选的，本发明所述药物组合物的制备方法为：

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩70℃时浸膏密度为1.25～1.28；

2)在浸膏中加入鹿血晶混匀，加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的制剂。

本发明所述制剂为固体制剂或液体制剂；所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂；所述液体制剂为口服液。

本发明所述颗粒剂制备方法为：在制备方法步骤2)中加入720～750g可溶性淀粉，混合均匀，20目筛制粒，50-70℃干燥2-4h，14目整粒，即得颗粒剂。

优选的，

本发明所述颗粒剂制备方法为：在制备方法步骤2)中加入720～750g可溶性淀粉，混合均匀，20目筛制粒，60℃干燥3h，14目整粒，即得颗粒剂。

本发明所述药物组合物在制备治疗慢性肾功能衰竭药物方面的应用。

本发明所述的辅料为可溶性淀粉、淀粉浆、滑石粉、炼蜜、单糖浆、苯甲酸钠。

本发明所述的重量份可以是本领域的常规单位，可以是g、kg等。

有益效果

1、本发明药物组合物主要以“重在养阴生津、健脾益气”为主的中医理论，用于中医辨证属气阴两虚型CRF的治疗，填补治疗气阴两虚型CRF品种的空缺，具有广泛的市场应用前景。

2、本发明为了适应中药现代化的要求，发明团队根据医院制剂鹿苓安肾颗粒的制备基础及处方药材中化学成分的理化性质，对鹿苓安肾颗粒的制备工艺，质量标准及稳定性进行研究，研制成院内制剂鹿苓安肾颗粒及其它剂型。该制剂体积小，稳定，服用方便，释药迅速，疗效确切，且操作相对简便，院内生产条件具备，通过预试验所选工艺亦可行，将鹿苓安肾颗粒申报为医院制剂，为CRF患者提供安全、有效、价廉的医院中药制剂。

3、本发明药物组合物提取工艺通过了药材吸水率、浸泡时间、煎煮工艺的考察，结果优选出“首次加10.5倍水浸泡1小时，第二次加8倍水，每次煎煮45分钟”，并对三批样品的提取工艺进行了验证实验，结果表明：出膏率平均值为20.61％，RSD为1.83％，说明工艺稳定可行，可作为提取工艺条件。

4、本发明以颗粒剂为代表对制剂成型工艺进行了研究，分别从鹿苓安肾颗粒浸膏相对密度的确定、辅料的选择及辅料用量的考察三个方面进行试验，从成型性、吸湿率和流动性等方面对鹿苓安肾颗粒剂进行质量评价，筛选出鹿苓安肾颗粒剂的最佳成型工艺，并通过了三批样品工艺验证，结果成型率、吸湿率和休止角的RSD值分别为0.43％、0.29％和0.87％，表明该工艺具有较好的重现性和操作性。

5、本发明对颗粒流动性及临界相对湿度测定，结果本品在72h后吸湿基本达到平衡，吸湿率不再明显增大，该药粉的吸湿平衡时间为72h；颗粒的临界相对湿度约在59％，因此在制粒、分装及贮存时，环境湿度必须控制在59％以下，以减少水分对药物性质及稳定性的影响。

6、本发明根据原临床处方药材量(鹿血晶除外)为60g，为成人每日服用量，按20％的出膏率计算，成人每日服用浸膏总量(含鹿血晶)为14g，现按制剂处方量换算，成人每日服用颗粒量约30g，拟定日服3次，每次服用一袋，每袋10克。基本满足原临床处方日服生药量。

7、本发明通过了中试实验，结果表明颗粒剂成品实际得率不低于85％。工艺生产条件符合工厂大生产要求，可操作性较强，成品、药材、半成品质量可控，成品质量稳定。

8、本发明通过了药理实验考察，结果表明鹿苓安肾颗粒能降低CRF大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量，抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF在肾组织的表达，降低血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度，并能下调Bax、Caspase-3的表达，上调bcl-2的表达，从而抑制CRF大鼠肾脏微炎症状态和细胞凋亡，从而延缓CRF的进展。

9、本发明通过了急性毒性实验考察，结果表明大鼠灌胃给予鹿苓安肾颗粒后,观察到用药组和对照组大鼠活动均减少，30min内两组大鼠均迅速恢复正常，饮食饮水正常，观察期内无动物死亡，连续14d观察中均未见不良反应，其被毛、肤色、鼻、眼、口腔分泌物均未见异常；未见任何中毒症状，无动物死亡，提示本品的安全范围较大。

附图说明：

图1鹿苓安肾颗粒吸湿曲线图；

图2HE染色显微镜下观察各组大鼠肾组织形态；

图3各组大鼠肾组织中bFGF的蛋白表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

组方：鹿血晶45g、茯苓450g、石斛450g、白术450g。

实施例2

组方：鹿血晶40g、茯苓400g、石斛400g、白术400g。

实施例3

组方：鹿血晶50g、茯苓500g、石斛500g、白术500g。

实施例4

组方：鹿血晶、茯苓、石斛、白术。

实施例1-4的组方分别按以下任一种制备方法制备。

实施例5

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min，过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至70℃时浸膏密度为1.25～1.28；

2)在浸膏中加入鹿血晶混匀，再加可溶性淀粉720～750g，混合均匀，20目筛制粒，60℃干燥3h，14目整粒，即得颗粒剂。

实施例6

1)取茯苓、白术、石斛，加入10倍量的水浸泡40min，再煎煮40min，过滤；再加入6倍量水煎煮40分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至60℃时浸膏密度为1.25；

2)在浸膏中加入鹿血晶混匀，再加入可溶性淀粉720g，混合均匀，20目筛制粒，50℃干燥2h，14目整粒，即得颗粒剂。

实施例7

1)取茯苓、白术、石斛，加入12倍量的水浸泡50min，再煎煮60min，过滤；再加入10倍量水煎煮60分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至80℃时浸膏密度为1.28；

2)在浸膏中加入的鹿血晶混匀，再加入可溶性淀粉750g，混合均匀，20目筛制粒，70℃干燥4h，再14目整粒，即得颗粒剂。

实施例8

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min，过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至70℃时浸膏密度为1.26；

2)在浸膏中加入的鹿血晶混匀，加入5％淀粉浆，制粒，干燥，压片，制备得到片剂。

实施例9

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min，过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至70℃时浸膏密度为1.26；

2)在浸膏中加入的鹿血晶混匀，加入0.5％滑石粉，混合均匀，烘干，粉碎，装入胶囊壳中，得胶囊剂。

实施例10

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min，过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至70℃时浸膏密度为1.26；

2)在浸膏中加入的鹿血晶混匀，干燥，制成粉末，再每100g粉末加炼蜜100g制成丸剂。

实施例11

1)取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min，过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至70℃时浸膏密度为1.26；

2)在浸膏中加入的鹿血晶混匀，加入乙醇，搅拌，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，加单糖浆250ml，以10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，加水使成1000ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，即得口服液。

为了进一步验证本发明的有效性，发明进行了一系列的验证试验，具体如下：

一、处方组成、来源、理论依据

1.处方组成：鹿血晶45g 茯苓450g 石斛450g 白术450g

可溶性淀粉720～750g

2.处方来源

“鹿苓安肾方”基于国家级名老中医王玉林教授对慢性肾功能衰竭的深刻理解，以“养阴生津、健脾益气”为治疗大法，在40余年临床经验的基础上，通过其传承人李正胜教授不断临床实践钻研、调整、优化而成。全方由鹿血晶、茯苓、石斛、白术组成，具有养阴生津、健脾益气、利水渗湿之功效。使用多年，由于疗效较好，使用量逐渐增加，为了方便患者服用，且应患者提出要求，从2021年起，我院制剂室代为病人加工成颗粒制剂，2021年起开始进行鹿苓安肾颗粒剂的临床观察。

3.理论依据

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由多种慢性肾脏疾病或累及肾脏的全身性疾病引起的慢性进行性肾实质损害，导致慢性肾功能减退，肾脏不能维持其排泄代谢废物、调节水盐和酸碱平衡、分泌和调节各种激素代谢等基本功能，从而出现氮质血症、代谢紊乱和各系统受累等一系列临床症状的综合征。尽管现代医学对CRF的发病机理进行了大量研究并取得了一定进展，但在临床治疗方面并未取得很大突破。目前，除进行肾移植外，慢性肾功能衰竭依然无法治愈，如何保护残余肾功能，延缓肾衰竭的进展速度就成为了治疗本病的核心问题。

CRF属祖国医学“水肿”、“关格”范畴。《黄帝内经.汤液醪醴论》载：“其有不从毫毛而生，五脏阳以竭也，津液充郭，其魄独居，孤精于内，气耗于外。”较早地提出了“水肿”的病因为“五脏阳以竭也”，认为水肿的发生，与人体阳气衰减密切相关。隋代巢元方《诸病源候论·水肿病诸侯》指出：“水病者，由肾脾俱虚故也。肾虚不能宣通水气，脾虚又不能制水，故水气盈溢，渗液皮肤，流遍四支。”认为其主要病位在“脾肾”。随着“水肿”病情发展，当出现少尿无尿、恶心呕吐等症状时，祖国医学称为“关格”，《伤寒论》载：“关则不得小便，格则吐逆”。这与现代医学中慢性肾功能衰竭导致的症状极为相似。《灵枢·脉度》载：“阴气太盛，阳气不能荣也，故曰关；阳气太盛，阴气不能荣也，故曰格，阴阳俱盛，不得相荣，故曰关格”。认为“关格”的发病机制在于“阴阳俱盛，不得相荣”。

国家级名老中医王玉林教授认为：《灵枢·脉度》中所言关格的病机为“阴阳俱盛，不得相荣”，实指“气阴两虚，阴阳二气得不到相互荣养”，因此，对于慢性肾功能衰竭的治疗，当以“养阴生津、健脾益气”为治疗大法。其传承人李正胜教授在王玉林教授理论的基础上，根据养阴生津、健脾益气的治疗大法不断临床实践钻研、调整、优化而成鹿苓安肾方。该方由鹿血晶、茯苓、石斛、白术组成，方中鹿血晶是由梅花鹿或马鹿的新鲜血液经过冷冻干燥而制成。鹿血中的营养成分高，包含多种脂类、糖类及微量元素，属于机体大补品，鹿血性热，其功效是止血、壮阳、益精，在李时珍的《本草纲目》中记载，鹿血具有弥补亏虚、益精血及止痛等作用。另外还有很多造血因子和造血干细胞，对改善血小板减少症具有积极效果，其效果相比西药白细胞介素-11的药效价值高，药物毒副作用小。鹿血晶味甘，咸、热，入肝、肾二经，重在养血益精，大补虚损，为君药；茯苓归心、肺、脾、肾经，重在健脾益气，为臣药。君臣相合，共奏养阴健脾之效。石斛又名仙斛兰韵、不死草、还魂草，具益胃生津，滋阴清热之功，石斛得鹿血晶则津液精血生化有源，鹿血晶得石斛则咸热之性大减，养阴之力更强，为佐药。白术有运脾燥湿、化浊之效，得茯苓则健脾功效更著，茯苓得白术又增利水渗湿之效，亦为佐药。综观全方，彼此兼顾，互为辅助，相得益彰，共奏养阴生津、健脾益气、利水渗湿之功，达到保护肾功能、延缓慢性肾功能衰竭进展的目的。用于慢性肾功能衰竭中医证属气阴两虚者的治疗。现代药理研究证实，鹿苓安肾颗粒组成药物均可以单体或配方方剂形式在各种肾脏疾病中发挥作用。

二、制备工艺的研究

本品源于贵州中医药大学第二附属医院肾内科临床经验方，由鹿血晶、茯苓、白术、石斛4味药组成，原为医院协定方，用于临床多年，疗效确切，但需临用煎煮，口服剂量大，使用不方便，不适应现代用药的需要，故考虑选择制成固体制剂。为保证疗效，本品的每日生药使用量应与经验方每日生药服用量相当，故因本品日服剂量较大，相当于提取物14g左右，较难以制成片剂和胶囊剂，考虑制成颗粒剂。同时，颗粒剂具有在水中溶解快速、起效快、生物利用度高、易于携带、贮存与使用，易于工业化生产等优点；再结合大生产条件及临床用药的需要，初步选择将其制成颗粒剂，为扩大使用人群，使糖尿病、肥胖病等患者也能长期服用，将其制成无糖型颗粒剂。

1.处方药物理化性质及药理研究

鹿血晶，系名贵中药，为鹿科动物梅花鹿或马鹿的新鲜血液经过冷冻干燥而制成。鹿血中含有丰富的营养物质，有机物占98％以上，其中主要是蛋白质，蛋白质中富含19种氨基酸及多种酶类；另外还含有多种脂类、游离脂肪酸类、固醇类、磷脂类、激素类、嘌呤类、微生物类和多糖类等，还含有多种有益微量元素。鹿血中还含有Y球蛋白、精氨酸和赖氨酸，以及具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。特别是精氨酸的含量极高。

鹿血晶呈不规则小薄片状，大小不等，紫红色或紫黑色，有角质样光泽，质坚脆，气微腥，味甘，微咸。具有术后康复、益肾壮阳，补血养颜作用，主治精血不足，血虚心悸，虚损腰痛，阳痿遗精，肺痿吐血等症。临床用于血小板减少症、白细胞减少症、再生障碍性贫血以及苯中毒引起的血液病等治疗。我院使用鹿血晶预防NSCLC化疗后白细胞减少症。

现代药理研究表明，鹿血晶能够治疗乳腺浸润导管癌患者化疗后白细胞减少症[2]，改善消化道肿瘤化疗后骨髓功能[3]。鹿血晶可预防非小细胞肺癌(NSCL)患者化疗所发生的白细胞减少症，机制可能与鹿血晶含有多种造血因子，包括G-CSF、M-CSF、GM-CSF等刺激因子及定量的IL-3、IL-6等生物因子，能诱导G0期血细胞进入增殖周期，促进细胞增殖、分化有关[4]。由此提示，相同的机制鹿血晶是否能促进其他血细胞如血小板升高，防治化疗引起的血小板减少症，值得开展新的后续临床研究加以证实。此外，鹿血晶还能够活化mTOR信号通路，上调mTOR下游4EBP和S6的磷酸化水平，提高巨噬细胞中炎症因子的表达水平，促进炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和一氧化氮的分泌。含有上述炎症因子的细胞上清能够降低黑色素瘤细胞活力，促进肿瘤细胞发生凋亡。此外，鹿血晶还能提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，增强巨噬细胞清除肿瘤细胞的能力。

结合鹿血晶的有效成分、药理学的研究、临床应用及功能主治的特色，鹿血晶在本方中加入稠浸膏的制备工艺是合理的。

茯苓(多孔菌科茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核)化学成分归纳起来有以下几类：(1)多糖类成分：茯苓聚糖、茯苓次聚糖及高度(1，3)、(1，6)分支的β-D-葡聚糖H11；(2)三萜类：去氢茯苓酸、去氢土莫酸、茯苓酸、土莫酸及依布里酸等。(3)甾醇类：ergosterol，(22E)-ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3β-ol，ergosta-5,7-dien-3β-ol，(22E)-ergosta-8(14),22-dien-3β-ol，(22E)-ergosta-6,8(14),22-trien-3β-ol，(22E)-ergosta-7,22-dien-3β-ol,ergost-7-en-3β-ol；(4)其他类：此外，茯苓中还含有麦角甾醇、辛酸、十二烷酸、月桂酸、十二碳烯酸、十二碳烯酸酯等化合物。

茯苓，甘、淡，平。归心、肺、脾、肾经。具有利水渗湿，健脾，宁心。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠。

现代药理研究表明，茯苓具有抗肿瘤、免疫调节、治疗肾病、抗炎、抗氧化、抗衰老、提高记忆力等多种生物活性。其主要活性成分是三萜类和多糖。Zan等研究了茯苓的水醇提取物(主要含三萜类成分)对阿霉素诱导的肾病综合征小鼠模型的治疗作用，给药30d后，与模型组比较，给药组和阳性对照组小鼠尿蛋白量明显下降，尤其是中剂量组，尿肌酸酐量以及血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇、细胞因子IL-4均有恢复趋势，因此推断该提取物可能对肾病综合征有治疗作用。谢健航等通过脂多糖及刀豆素A刺激小鼠脾细胞活化，采用兔红细胞免疫小鼠制备体液免疫反应模型，采用二硝基氟苯制备小鼠迟发型超敏反应(细胞免疫反应)模型，制备大鼠佐剂性关节炎模型，灌胃模型动物茯苓总三萜，通过对各个模型的结果进行检测，显示出茯苓总三萜能抑制小鼠的免疫反应，对大鼠佐剂性关节炎有治疗作用。

茯苓的主要有效成分多糖类和三萜类均易溶于水，故在本方中采取水提合理。

白术[菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎]化学成分归纳起来有以下几类：(1)挥发油类：苍术酮、香橙烯、榄香烯和异香橙烯；(2)多糖类：白术多糖是由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖组成，其比例为0.03:0.25:0.15:0.41:0.15；(3)内酯类：白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、atractylenother、8-epiatractylenolide Ⅲ、4(R)，15-epoxy-8b-hydroxyatractylenolide Ⅱ、(3S，4E，6E，12E)1-acetoxy-tetradeca-4，6，12-triene-8,10-diyne-3，14-diol、3β-acetoxyl atractylenolide I、双炔内酯II；(4)其它类：氨基酸、维生素、树脂等[9]。

白术性苦、甘，温。归脾、胃经。白术为“补气健脾第一要药”，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎。用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安。临床以中药复方的形式应用于胃肠道疾病、心血管疾病、免疫系统疾病、肝脏疾病等治疗。

药理研究资料表明，白术具有抗肿瘤、抗炎、胃肠调节功能和免疫调节等作用：挥发油和白术多糖可促进胃肠道蠕动，而白术内酯则起相反作用，在这3种主要成分的共同作用下，可双向调节胃肠功能。白术内酯与白术多糖的抗炎作用则主要通过抑制炎症因子生成，调节免疫等方式实现。此外，白术内酯与白术多糖还可以诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖，可用于抗癌。白术的有效成分及复方对免疫器官具有促进作用，也可增强特异性免疫和非特异性免疫作用，提高机体的免疫力，这也为临床应用白术治疗脾弱之虚证提供了理论佐证。

白术主要有效成分易溶于水，在本方中采取水提合理。

石斛[兰科植物金钗石斜Dendrobium nobile Lindl.、霍山石斛Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng、鼓槌石斛D.chrysotoxum Lindl或流苏石斛D.fimbriatum Hook.的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎]化学成分归纳起来有以下几类：(1)多糖类：鼓槌石斛多糖主要由阿拉伯糖和甘露糖组成；流苏石斛的多糖类成分主要由半乳糖、甘露糖和葡萄糖组成；(2)生物碱类：石斛碱、金石斛碱、石斛副碱、石斛星、石斛酮碱、6-羟基石斛碱、石斛醚碱、石斛次碱、N-甲基石斛季铵碱、N-异戊烯基石斛季铵碱；(3)联苄类及其苷类：石斛酚、4-(3-羟基-4-甲氧基苯乙基)-2,6-二甲氧基苯酚、3,4′-二羟基-3′,4,5-三甲氧基联苄、大叶兰酚、山药素、4,4′-二羟基-3,5,3′，α-四甲氧基联苄、fimbriadimerbibenzyls B、C、D、E、F、G；大叶兰酚-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-甲氧基-9,10-二氢菲-2,5-二醇、2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲-7-醇、9,10-二氢菲-2,4,7-三醇；(4)其他类：挥发油类、氨基酸及微量元素等。

石斛甘，微寒。归胃、肾经。具有益胃生津，滋阴清热。用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。临床上主要用于肿瘤、糖尿病、循环系统疾病等。

现代药理研究表明，石斛具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、降血糖等药理作用。其中联苄类成分、菲类和多糖类成分是其主要化学成分，并且这些存在的主要化学成分发挥着不同的药理作用。毕志明[13]等研究从流苏石斛中分离得到的流苏菲可以抑制BGC人胃癌细胞的增殖，但其作用机制还需进一步研究。张展等比较了流苏石斛水溶性多糖(WDFP)、碱溶性多糖(BDFP)及酸溶性多糖(ADFP)的免疫活性差异，结果显示，WDFP可以显著增加小鼠脾细胞增殖，且存在剂量依赖效应。

石斛多种成分易溶于水，在本方中采取水提合理。

三、药材来源及标准要求

鹿血晶依据的是贵州省广济堂药业有限公司的《企业标准》。茯苓、白术、石斛3味饮片均为《中国药典》2020年版一部标准，方中饮片均由贵州中医药大学第二附属医院韩云霞主任药师鉴定。

鹿血晶应符合贵州省广济堂药业有限公司的的《企业标准》中鹿血晶项规定。

茯苓应符合《中国药典》2020年版一部251页茯苓项规定。

白术应符合《中国药典》2020年版一部107-108页白术项规定。

石斛应符合《中国药典》2020年版一部94-97页石斛项规定。

四、工艺条件的筛选

(一)提取工艺研究

1.药材吸水率的测定

取处方量药材(鹿血晶除外)60g，加8倍量水浸泡，浸泡不同时间，滤过，称湿药重量(至药材重量不再增加为止)，测定药材吸水率，计算公式如下，结果见表1。

mb—药材吸水饱和状态下的质量(g)

mg—药材在干燥状态下的质量(g)

表1药材吸水率考察(n＝2)

由表1可知，药材浸泡24小时饮片吸水率为2.15倍，为方便操作，以吸水率为2.5倍计算，即药材吸水量为药材重的2.5倍。因此首次水提时应该多加药材重量的2.5倍量的水。

2.浸泡时间的单因素考察

在满足饮片吸水率的条件下，以出膏率为考察指标，优选出对水煎液出膏率影响最大的浸泡时间。

2.1试验方法和结果

2.1.1样品制备

取临床处方量药材(鹿血晶除外)60g，首次加10.5倍量水，第2次加8倍量水，考虑到以水为溶媒的浸泡液，浸泡时间过长容易滋生细菌和变质，并结合医院制剂室大生产实际情况，分别浸泡0h、0.5h、1h、2h、3h和5h，煎煮2次，每次30分钟，过滤，合并滤液，药液定容至200ml，备用。

2.1.2总固体物收率测定

从上述药液中各精密量取25ml，平行2次，至已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃下干燥3h，测定总固体物重量，计算出膏率，结果见表2。计算公式如下：

W为25ml滤液中固体物的重量，V为定容体积，Wt为样品投料重量。

表2浸泡时间的考察(n＝2)

由表2可知，浸泡1h后，提取物总固体物收率无显著性差异。根据节约时间及成本的需要，选用浸泡时间优选为1小时。

3.煎煮工艺筛选

在满足饮片吸水率的条件下，浸泡1h，考察加水量、煎煮时间、煎煮次数三个影响煎煮效果的主要因素，按每个因素3水平，用L9(34)正交表安排试验(表4)。水煮工艺采用正交试验进行筛选(表3)，为了使工艺能充分反映药物疗效，并结合本方药物组成的特点及本方的功能主治，以出膏率对工艺进行评价，优选水提条件。正交结果方差分析及因素水平分析见表3，表4。

表3煎煮正交因素水平表

3.1样品制备

取临床处方量药材(鹿血晶除外)60g，装入2层灭菌过滤袋，按正交试验表(表4)进行试验(第一次浸泡1h)，药液滤过，合并滤液，浓缩，药液定容至200ml，备用。

3.2出膏率的测定

精密吸取上述药液25ml，放入已精确称量的恒重蒸发皿中，水浴蒸干，浸膏干燥至恒重，精密称定重量，记录，计算含量，结果见表4，表5。

表4水提工艺条件L₉(3⁴)正交试验安排及结果

表5方差分析表

F_0.01(1,2)＝99.00F_0.05(1,2)＝19.00

结果分析：从直观分析看，各因素对出膏率的影响为B>C>A，煎煮次数影响最大，其次为提取时间，加水量的影响最小。B因素中煎煮2次和煎煮3次无显著性差异，最佳方案为A₃B₂C₃；但是从方差分析结果可见三个因素均无显著性差异，为次要因素。考虑到加水过多会导致后续浓缩时间过长，煎煮的时间太长，那些芳香的易挥发的有效成分就会损失。因此我们选择煎煮2次，每次45分钟，加水倍数为8倍作为最佳提取工艺，即A₁B₂C₂。结合吸水率及浸泡时间研究结果，我们最终确定的提取工艺为首次优选加10.5倍水浸泡1小时，第二次加8倍水，每次煎煮45分钟。

3.3三批样品的提取工艺验证实验

取临床处方饮片(除鹿血晶外)，根据最佳水提工艺条件A₁B₂C₂，即煎煮2次，第一次加10.5倍量水(扣除饮片吸水)，第二次加8倍量水，每次提取45分钟，滤过，滤液浓缩。据此条件验证三批，测定出膏率。结果见表6：出膏率平均值为20.61％，RSD为1.83％，说明工艺稳定可行，可作为提取工艺条件。

表6水提工艺验证结果表

(二)制剂成型工艺研究(以制备成品为颗粒剂进行研究)

本实验采用机械法湿法制粒，先制备鹿苓安肾浸膏，加入鹿血晶混匀后，再加一定比例辅料混匀，制软材，以“握之成团，捏之即散”为度，将软材通过20目筛网制得湿颗粒，放于60℃烘箱中干燥，干燥约30min，颗粒水分控制在3～5％，干燥后，过14目筛整粒。下面从鹿苓安肾颗粒浸膏相对密度的确定、辅料的选择及辅料用量的考察三个方面进行试验，从成型性、吸湿率和流动性等方面对鹿苓安肾颗粒剂进行质量评价，筛选鹿苓安肾颗粒剂的最佳成型工艺。

1.鹿苓安肾颗粒剂浸膏相对密度的确定

中药浸膏本身存在一定粘性，相对密度过低时含水量较高，辅料用量过多，增大患者服用量和生产成本；相对密度过大时，辅料用量虽少，但制粒困难，且所得颗粒硬度过大，溶出度低。因此有必要筛选最佳浸膏相对密度。

本实验制备不同相对密度浸膏，加入鹿血晶混匀后，再加入适量辅料混匀进行湿法制粒，考察最佳浸膏相对密度。取25倍临床处方量药材(除鹿血晶外)约1500g，按照最佳水提工艺提取，合并煎液，滤过，常压浓缩至1000ml。备用。精密量取等量提取液，常压浓缩至不同相对密度(70℃)，待冷却后加入鹿血晶混匀后，再加入适量的可溶性淀粉混匀后进行湿法制粒，考察不同相对密度浸膏对颗粒剂制备的影响，考察结果见表7。

表7不同相对密度浸膏对颗粒剂制备的影响

由上所述，鹿苓安肾颗粒剂水提液浓缩至相对密度为1.25-1.28(70℃)时，制粒软材的软硬度适宜，易于制粒。因此选择将浸膏浓缩至相对密度1.25～1.28(70℃)为优选。

2.辅料的选择

中药颗粒剂的处方组成中除主药外，常需加入各种作用的辅料，如降低吸湿性的辅料，具有粘性成分的主药则只要加入润湿剂，粘性差的主药应加入粘合剂使之成粒等等。随着新辅料的不断涌现，逐步代替冲剂中的蔗糖，制成外观成粒的低糖或无糖颗粒剂。为扩大使用人群，兼顾肥胖症或糖尿病人使用，将其制成无糖型颗粒剂。

根据提取物主药的性质，服用量，辅料可以是单一的，也可以是多种辅料的组合，在处方中起填充、稀释、润滑、润湿、粘合以及崩解等作用。在现代中药制剂工艺中，无糖型颗粒常用的辅料有糊精、可溶性淀粉、微晶纤维素。本方所得的稠膏粘性大，为了使颗粒具有相对较小的吸湿性和较好的流动性，本实验考察不同辅料对颗粒剂成型性、休止角和吸湿性的影响，并用综合评分法筛选出制备颗粒剂的最优辅料及处方组成。

将鹿血晶与相对密度为1.25～1.28(70℃)的稠浸膏混合物：辅料＝1∶1.2配比混合均匀，采用湿法制粒制得颗粒。通过计算颗粒剂的成型率、休止角和吸湿率进行综合评分，筛选出最佳制备颗粒剂的辅料。颗粒的成型率、吸湿率和休止角测定方法及计算公式如下：

2.1成型率测定

根据颗粒剂(《中国药典》2020年版四部通则0104)项下对粒度的要求，采用双筛法筛选合格颗粒剂，即能通过一号筛和不能通过五号筛的颗粒为合格颗粒，公式如下：

2.2吸湿率测定

在已干燥至恒重的称量瓶(5×3cm)底部放入约1g的颗粒，轻摇使其分布均匀，精密称定，称量瓶盖揭开，置于恒温恒湿箱(设定温度25℃，湿度75％)内，放置72h，取出立即称定并计算吸湿率。

2.3休止角测定

以颗粒休止角进行评价，采用固定漏斗法，即将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上适宜高度处，使漏斗下口距坐标纸的距离为h，缓缓地将颗粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中，直到最下面漏斗药粉的圆锥体尖端接触到漏斗口为止，此时由坐标纸测出圆锥体底部的直径d，计算出休止角(tgα＝h/(d/2))，α越小表明流动性越好。

2.4综合评分及结果分析

对上述测试结果进行综合评价，对于颗粒剂的制备，吸湿性及成型性较为重要，权重各占40分，休止角占20分。按下列公式计算综合评分。综合评分＝(最小吸湿率/吸湿率)×40％+(成型率/最大成型率)×40％+最小休止角/休止角)×20％，结果见表8。

表8辅料的选择考察结果表

由上述试验结果可知，用糊精和微晶纤维素作赋形剂制粒虽都能成型，但用糊精制成的颗粒比较硬，溶出率低；微晶纤维素制成的颗粒细粉过多。而可溶性淀粉与稠膏混合，易制粒，其制成的颗粒形状、吸湿性及流动性均好于糊精和微晶纤维素制成的颗粒，故选择可溶性淀粉作为本方的优选赋形剂，即选处方2。

3.辅料用量的考察

为了减少辅料用量，提高载药量，降低生产成本。本实验以可溶性淀粉作为辅料来制粒，考察辅料最佳用量。

取5倍临床处方量药材(除鹿血晶外)约300g，按照最佳水提工艺提取，合并煎液，滤过，常压浓缩至相对密度为1.28(70℃)，待冷却后加入鹿血晶10g混匀，备用。称取等量的加入鹿血晶后的稠浸膏，再加入不同用量的可溶性淀粉混匀后进行湿法制粒，通过制粒难易程度、颗粒性状和成型率等指标，考察辅料最佳用量。结果见表9。

表9辅料用量的考察结果表

由表9的试验结果，选择浸膏加鹿血晶与辅料比例为1：1.15～1.20制粒时，颗粒制粒效果最好，故优选比例1：1.15～1.20为。

4.最佳成型工艺的验证

为了验证上述试验的结果，根据优选工艺重复制粒三次。按5倍临床处方比例称取药材(鹿血晶除外)约300g，共三批，按照最佳水提工艺提取，浓缩至相对密度为1.28(70℃)的浸膏，待浸膏冷却后加入鹿血晶10g混匀，再加入可溶性淀粉1.15～1.20倍制软材，过20目筛湿法制粒，60℃干燥3h，过14目筛整粒。测定颗粒成型率、休止角、吸湿率，结果见表10。

表10最佳成型工艺验证结果表

由表10可知，三批样品成型率、吸湿率和休止角的RSD值分别为0.43％、0.29％和0.87％，表明该工艺具有较好的重现性和操作性。

(三)颗粒流动性及临界相对湿度的测定

1.休止角的测定

根据“(二)2.3”项下方法测定颗粒的流动性，重复测定6次。结果见表11。

表11休止角测定结果

测得颗粒休止角平均值为34.1°，说明颗粒流动性较好，能保证颗粒装量符合要求。

2.颗粒临界相对湿度测定

分装环境湿度对颗粒分装影响很大，有必要测定颗粒的临界相对湿度。

2.1吸湿平衡时间的确定

取底部盛有NaCl过饱和溶液(相对湿度75％)的玻璃干燥器，干燥器内置一称量瓶(5×3cm)，在25℃恒温干燥箱内达到恒重。取样品约1g，置已恒重的称量瓶中，轻摇使其分布均匀，精密称定，将称量瓶盖打开，放入干燥器上部，于25℃恒温干燥箱内保存，分别于1，2，4，8，12，24，36，48，72h称重一次，计算不同时间的吸湿率。计算公式：吸湿率＝(吸湿后总重－吸湿前总重)/吸湿前散剂量×100％。试验结果表明3种批号样品分别进行实验，实验结果数值相近，现取实验结果列表进行分析。颗粒的吸湿平衡时间见表12。

表12吸湿平衡时间(n＝3)

由表12可见，本品在72h后吸湿基本达到平衡，吸湿率不再明显增大，该药粉的吸湿平衡时间为72h。

2.2颗粒临界相对湿度的测定

分别精密称取颗粒7份，每份1g，平铺于已干燥恒重的(5×3cm)称量瓶中，精密称定，分别放入恒温恒湿箱(设定湿度见表13)打开称量瓶盖，于25℃下保持72h后称重，测定样品的重量变化，计算吸湿率，以吸湿率为纵坐标，相对湿度(RH％)为横坐标绘制曲线。从曲线两端分别作切线，两切线交点对应的横坐标即为临界相对湿度(CRH)，结果表明颗粒的临界相对湿度约在59％，见图1。因此在制粒、分装及贮存时，环境湿度必须控制在59％以下，以减少水分对药物性质及稳定性的影响。

表13颗粒临界相对湿度测定

(四)处方日服用量确定

根据原临床处方药材量(鹿血晶除外)为60g，为成人每日服用量，按20％的出膏率计算，成人每日服用浸膏总量(含鹿血晶)为14g，现按制剂处方量换算，成人每日服用颗粒量约30g，拟定日服3次，每次服用一袋，每袋10克。基本满足原临床处方日服生药量。

(五)中试

1.仪器

G400-Q夹层锅(400L，重庆市长寿湖机械制造有限公司)，XR3190-A12+EK称重显示控制器(电子秤，上海耀华称重系统有限公司)，CT-C型热风循环烘箱(中国常州建达干燥设备有限公司)，YK-160摇摆式制粒机(湖南吉首市中诚制药机械厂)，HWY100Ⅲ槽式混合机(山东银鹰炊事机械有限公司)，不锈钢密封桶(上海剑威不锈钢制品有限公司)，SK5210HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)。

2.实验方法及结果

按拟订制备工艺条件进行三批放大10倍生产，对生产工艺指标进行全面考核，对成品进行质量评定，考察本品制备工艺的合理性。由表14中数据显示，按所投料理论应生产1000袋(10g/袋)成品计，颗粒剂成品实际得率不低于85％。工艺生产条件符合工厂大生产要求，可操作性较强，成品、药材、半成品质量可控，成品质量稳定。中试生产工艺参数及中试产品质量检验数据，见表14。

表14中试生产工艺参数及中试产品质量检测数据

五、药理试验

1.材料与方法

1.1动物分组及模型制作

所有大鼠均适应性饲养1周后，随机分为正常组(10只)、对照组(10只)和造模组(50只)。对照组大鼠灌胃等体积蒸馏水；造模组大鼠均参照文献方法建立CRF模型：即灌胃25％腺嘌呤混悬液(以水为溶剂)200mg/kg，每天1次，连续28d。第29d对照组和模型组从眼底静脉丛取血0.5mL，室温静置2～3h，离心取血清，测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，若p＜0.05，即视为造模成功。造模成功，将造模组大鼠随机分为模型组、阳性药组、鹿苓安肾颗粒低、中、高剂量组，每组10只。正常组未做任何处理，自由饮食进水。

1.2给药

造模成功后给药，如下：

对照组，蒸馏水；1ml/100g每日1次，连续28天灌胃；

模型组，蒸馏水；1ml/100g每日1次，连续28天灌胃；

阳性组，尿毒清颗粒；2.25×10³mg/kg(1ml/100g)，每日1次，连续28天灌胃；

鹿苓安肾颗粒高剂量组，鹿苓安肾颗粒；10×10³mg/kg(1ml/100g)，每日1次，连续28天灌胃；

鹿苓安肾颗粒中剂量组，鹿苓安肾颗粒；5×10³mg/kg(1ml/100g)，每日1次，连续28天灌胃；

鹿苓安肾颗粒低剂量组，鹿苓安肾颗粒；2.5×10³mg/kg(1ml/100g)，每日1次，连续28天灌胃。

1.3相关指标的观察与检测

1.3.1肾功能检测

各组治疗28d后，禁食1d，用水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，收集后经高速低温离心(3000r/min，15min)分离出血清，用比色法以全自动生化分析仪，测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)指标。

1.3.2ELISA法

各组治疗28d后，禁食1d，用水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，收集后经高速低温离心(3000r/min，15min)分离出血清，采用ELISA法以酶标仪检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.3.3HE染色

灌胃结束第二天，麻醉取左肾，剥去外层薄膜，10％甲醛固定(PBS稀释)，48h后切取所需部位并置于组织包埋盒，全自动脱水机脱水完毕后石蜡包埋，4℃存放备用；取包埋好的组织，切片机切片，控制片厚为4μm，切片先放在常温蒸馏水中展开，玻片捞片，再次将玻片垂直放入60℃左右蒸馏水中，待片子充分展开后捞起，60℃烘箱烘2h；取选好玻片脱蜡完全后，苏木精染色15min，然后置于自来水中数秒洗去表面苏木精，盐酸乙醇分化数秒，再用自来水冲洗10min，脱水后用中性树胶封片。光镜下观察。

1.3.4免疫组化法

免疫组化检测肾脏组织中bFGF蛋白表达每组均选取4张不同切片做免疫组化，另分别选取模型组和鹿苓安肾颗粒高剂量组各一张切片做阴性对照，步骤参照免疫组化染色试剂盒方法，脱蜡、抗原修复、灭活、加一抗、加二抗、DAB显色及封片。

1.3.5Real-time PCR法

灌胃结束第二天，麻醉取右肾，剥去外层薄膜，采用Trizol法提取各组大鼠肾组织总RNA100mg，加入TrizolTM试剂1mL，反复吹打，按第1链cDNA合成试剂盒说明书反转录得cDNA。以所得cDNA为模板，参照试剂盒说明书进行扩增，以β-actin作为内参，采用2－ΔΔCt法计算Bax、Bcl-2mRNA相对表达量的比值(Bax/Bcl-2)及Caspase-3mRNA的相对表达量。

1.4统计方法

采用GrapPad Prism9.0软件进行数据处理，计量资料以平均数±标准差(x±s)表示，组间数据比较采用单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1实验大鼠一般状态的观察

正常组：毛发光滑且柔顺，精神状态良好，反应灵活，活动度较好，行为未见异常，进食量及饮水量均正常，排便未见异常。

模型组：毛色干枯蓬松欠光滑易脱毛，精神状态萎靡，应激能力差，活动减少，拱背蜷缩，喜欢蜷缩在一起，进食量减少，饮水量增加，大便稀，目色淡红，口周淡白，尾巴湿冷。

鹿苓安肾颗粒组：毛色略有干枯，精神轻度萎靡，反应尚可，活动度尚可，偶有蜷缩，进食量尚可，饮水量稍有增多，便质正常，目色稍红，口周淡白。

尿毒清组：毛色发黄干枯、脱落，精神中度萎靡，反应略有迟钝，活动减少，蜷缩好卧，进食量减少，饮水量增多，便稀，目色淡红，尾巴湿冷。

2.2大鼠血肌酐、尿素氮检测结果

与正常组比较，模型组血肌酐、尿素氮显著升高(P＜0.01)，证明CRF大鼠模型制作成功；与模型组比较，鹿苓安肾颗粒组及尿毒清组血肌酐、尿素氮均明显降低(P＜0.01)；与尿毒清组比较，鹿苓安肾颗粒高剂量组血肌酐、尿素氮下降显著(P＜0.01)，见表15。

表15大鼠血肌酐、尿素氮检测结果

注：与正常组比较，^#P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与尿毒清组比较，^▲P＜0.05。

2.3ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的表达

与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量升高(P＜0.01)；与模型组相比较，鹿苓安肾颗粒组及尿毒清组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量降低(P＜0.01)；与尿毒清组比较，鹿苓安肾颗粒高剂量组中大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著降低(P＜0.05)，效果较中、低剂量组明显，见表16。说明鹿苓安肾颗粒通过降低IL-1β、TNF-ɑ水平，抑制IL-6分泌，减慢了炎性因子的致炎效应，从而延缓CRF的炎症进程，且以鹿苓安肾颗粒高剂量组效果最佳。

表16大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量

注：与正常组比较，^#P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与尿毒清组比较，^▲P＜0.05。

2.4HE染色显微镜下观察大鼠肾组织病理形态

正常组：肾小球结构、大小，形态、肾小球囊腔与血管球比例均正常；近端与远端的小管管腔大小正常，管壁薄厚正常、无炎性细胞浸润。见图2A。模型组：肾小球结构、形态、大小有所改变，血管球萎缩、肾小球囊腔变大，比例失调，近端小管与远端小管的管壁薄厚不匀，上皮细胞变性呈片状坏死、肿胀，出现大量浸润的炎性细胞。见图2B。

尿毒清组：肾小球基底膜轻度增厚，肾小管浊肿，部分肾小管上皮细胞水样变性，部分区域可见炎性细胞浸润，局部可见蛋白管型。见图2C。

鹿苓安肾颗粒高剂量组：肾小球形态、结构、大小接近正常，皮质少数肾小球基底膜轻度增厚，肾小管浊肿，部分肾小管上皮细胞水样变性，少数区域可见灶状炎细胞浸润，局部可见蛋白管型，未见明显坏死。见图2D。

鹿苓安肾颗粒中剂量组：肾小球基底膜轻度增厚，肾小管浊肿，部分肾小管上皮细胞水样变性，部分区域可见灶状炎细胞浸润，偶见可见蛋白管型及肾小管坏死。见图2E。

鹿苓安肾颗粒低剂量组：肾组织结构未见明显异常，皮髓质结构正常，皮质肾小球基底膜增厚，肾小管浊肿，部分肾小管上皮细胞水样变性，少数区域可见灶状炎细胞浸润，局部可见蛋白管型，局部肾小管坏死。见图2F。

2.5鹿苓安肾颗粒对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达的影响

免疫组化检测大鼠肾组织中bFGF的蛋白表达：镜下观察显示正常组肾脏组织bFGF的蛋白表达为阴性,模型组bFGF的蛋白表达呈强阳性表达,尿毒清颗粒和鹿苓安肾颗粒组均能不同程度的减少bFGF的蛋白表达(P<0.01)，鹿苓安肾颗粒高剂量组bFGF的蛋白表达受到明显的抑制。见图3。

2.6鹿苓安肾颗粒对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织凋亡相关因子mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠肾组织中Bax/Bcl-2及Caspase-3mRNA的相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，各组大鼠肾组织中Bax/Bcl-2以及Caspase-3mRNA的相对表达量均显著降低，且尿毒清组Bax/Bcl-2显著高于鹿苓安肾颗粒高剂量组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表17。说明鹿苓安肾颗粒能下调Bax、Caspase-3的表达，上调bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，延缓CRF的进展。

表17各组大鼠肾组织中Bax/Bcl-2及Caspase-3mRNA的相对表达量

注：与正常组比较，^#P＜0.05；与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与尿毒清组比较，^▲P＜0.05。

由以上研究结果可知，鹿苓安肾颗粒能降低CRF大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量，抑制碱性成纤维细胞生长因子bFGF在肾组织的表达，降低血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度，并能下调Bax、Caspase-3的表达，上调bcl-2的表达，从而抑制CRF大鼠肾脏微炎症状态和细胞凋亡，从而延缓CRF的进展。对照组相比：^#P＜0.01；与模型组比较，^*P＜0.05。

六、急性毒性实验

1.材料与方法

1.1实验动物

本次研究我们选择动物为SPF清洁级的Wistar大鼠，健康状况良好，体重180～200g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006。

1.2实验方法

1.2.1急性毒性预实验

按照半数急性毒性实验要求先进行毒性实验预实验预测本品的致死量(LD50)。Wistar大鼠20只，标记，称重，按体质量随机分为鹿苓安肾颗粒组和空白对照组，每组雌、雄各半，禁食不禁水12h后，给药组以本品可供灌胃的最大浓度(0.5g/ml)，大鼠灌胃可承受的最大体积(20ml/Kg)，给药后自由进食和饮水，对照组给予等容积的蒸馏水，连续观察14d。实验结束后根据每组动物死亡数量，查询霍恩氏表(Horn氏)求得大鼠的半数致死量(LD50)及其95％可信区间。

在实验过程中若大鼠未出现任何中毒症状或中毒症状不明显，因该剂量远大于中药无毒剂量标准(LD50>50g/kg)，则初步说明鹿苓安肾颗粒无毒副作用或毒副作用不明显，此时可使用该剂量直接进行正式实验。若大鼠出现中毒症状则需根据具体结果，重新设定给药梯度。

1.2.2急性毒性正式实验

Wistar大鼠20只适应性饲养7d后，随机分为正常组与用药组，每组10只，雌雄各半。用药组每日间隔6h分2次给予10g/kg鹿苓安肾颗粒灌胃，正常组给予等体积水灌胃，连续观察14d。

1.2.3观察指标

每天都对两组大鼠称重并记录，包括进食量以及饮水量。

大鼠14d观察期结束后，摘除眼球取血，分别进行血常规白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LYM)的检测。

1.2.4统计方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间数据比较采用单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1急性毒性预实验结果

大鼠灌胃给予鹿苓安肾颗粒后,观察到用药组和对照组大鼠活动均减少，30min内两组大鼠均迅速恢复正常，饮食饮水正常，观察期内无动物死亡，连续7d观察中均未见不良反应，其被毛、肤色、鼻、眼、口腔分泌物均未见异常；未见任何中毒症状，无动物死亡，提示本品的安全范围较大。

2.2鹿苓安肾颗粒对大鼠体质量的影响

如表18所示，用药组与对照组比较，雌、雄性大鼠体质量差异无统计学意义(P均>0.05)，说明给药后，鹿苓安肾颗粒对大鼠体质量无影响。

表18鹿苓安肾颗粒急毒实验对大鼠体质量的影响(x±s，m/g)

2.3鹿苓安肾颗粒对大鼠进食量的影响

用药组与对照组比较，雌、雄性大鼠体进食量差异无统计学意义(P均>0.05)，说明给药后，鹿苓安肾颗粒对大鼠进食量无影响，见表19。

表19鹿苓安肾颗粒急毒实验对大鼠进食量的影响(x±s，m/g)

2.4鹿苓安肾颗粒对大鼠饮水量的影响

用药组与对照组比较，雌、雄性大鼠体饮水量差异无统计学意义(P均>0.05)，说明给药后，鹿苓安肾颗粒对大鼠饮水量无影响，见表20。

表20鹿苓安肾颗粒急毒实验对大鼠饮水量的影响(x±s，V/mL)

2.5鹿苓安肾颗粒对大鼠血常规指标的影响

用药组与对照组比较，雌、雄性大鼠体白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白数(HGB)、血小板(PLT)以及淋巴细胞绝对值(LYM)差异无统计学意义(P均>0.05)，说明给药后，鹿苓安肾颗粒对大鼠的血常规指标无影响，详见表21。

表21鹿苓安肾颗粒对大鼠血常规指标量的影响

以上研究结果表明用药组大鼠体重、进食量、饮水量以及血常规指标变化趋势与对照组基本一致，说明鹿苓安肾颗粒无明显的急性毒性反应，是安全可靠的。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于慢性肾功能衰竭的药物组合物，其特征在于，该药物组合物由以下重量份的

药物制成：鹿血晶40-50份、茯苓400-500份、石斛400-500份、白术400-500份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由以下重量份的药

物制成：鹿血晶45份、茯苓450份、石斛450份、白术450份。

3.一种权利要求1或2所述药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

1）取茯苓、白术、石斛，加入10-12倍量的水浸泡40-60min，再煎煮40-60min,过滤；再加入6-10倍量水煎煮40-60分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩至60-80℃时浸膏密度为1.25～1.28；

在浸膏中加入鹿血晶混匀，加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。

4.根据权利要求3所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

1）取茯苓、白术、石斛，加入10.5倍量的水浸泡60min，再煎煮45min,过滤；再加入8倍量水煎煮45分钟，过滤，合并煎液，常压浓缩70℃时浸膏密度为1.25～1.28；

2）在浸膏中加入鹿血晶混匀，加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的制剂。

5.根据权利要求3或4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制剂为固

体制剂或液体制剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述固体制剂为颗

粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂；所述液体制剂为口服液。

7.根据权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述颗粒剂制备方

法为：在权利要求3或4步骤2）中加入720～750份可溶性淀粉，混合均匀，20目筛制粒，50-70℃干燥2-4h，14目整粒，即得颗粒剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述颗粒剂制备方

法为：在权利要求3或4步骤2）中加入720～750份可溶性淀粉，混合均匀，20目筛制粒，60℃干燥3h，14目整粒，即得颗粒剂。

9.权利要求1-2任一项所述的药物组合物在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用。

Images