CN107334798A - 树参提取物及制法及在治疗类风湿性关节炎病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种树参提取物及制法及在治疗类风湿性关节炎病药物中的应用，其提供树参提取物的提取方法，以树参植物枝体为原料，以水为提取剂，采用水提取工艺，包括1)将树参植物枝体切成中药饮片状；2)制树参滤液；3）制树参提取物；本发明所述树参提取物在制备防治风湿、类风湿性关节炎病药物制剂中的应用，所述的制剂为药物学上所述制剂如包括但不限于有树参提取物的水剂、颗粒制剂、胶囊、粉剂等，或者是为生物制剂。同时公开树参提取物应用于风湿、类风湿关节炎疾病的防治，具有较好疗效，且利用树参提取物对风湿、类风湿关节炎防治具有副作用小、不容易产生耐药性、经济适用等优点。

Description

树参提取物及制法及在治疗类风湿性关节炎病药物中的应用

技术领域：

本发明属于树参提取物的制备及应用于技术领域，特别是涉及一种树参提取物及制法及在治疗类风湿性关节炎病药物中的应用。

背景技术：

树参（Dendropanax dentiger (Harms) Merr.）为五加科（Araliaceae）的一种药用植物，植物分类上树参与人参属在同一个科，五加科植物在医药上有多方面的用途，人参、三七、五加皮等是著名的药材。与著名中药人参、五加皮、三七同一科，目前植物分类专家认为与树参类似的有数十个不同种，形态相似而遗传可能是远亲。主要分布于江西、广东、广西、福建、湖南、浙江等长江以南各省区海拔500米以上的高山。

树参属植物中己经被发现的化学成分有多炔类，皂苷，萜类等等。

多炔类化合物及其衍生物是含有乙炔基团的一类化合物，具有抗癌、抗菌等生物活性活性，主要存在于五加科、檀香科、木犀科、菊科、桔梗科、伞形科等植物中。

皂苷类化合物常见于五加科中，如人参、三七等，它们所含有的皂普类成分已经被大量研究，现在皂苷类成分在树参属植物中也已经被发现。如Tanaka^]等发现Dendropanax trifidus的甲醇提取液中含有人参皂苷-Re。树参嫩芽中的皂苷含量为人参根中皂苷含量的3倍之多，高达8.79%，从其根茎中还提取到了丁香苷、鹅掌揪苷等皂苷类化合物。Dendropanax trifidus果实中被发现含有花青苷。

从树参属中分离得到最多的一类化学成分是萜类化合物，它在该属植物的各个部位如花、叶、果实及树皮中都有发现。迄今为止从树参属植物中已经分离得到羽扇豆醇等多个三萜类化合物^[53]。

树参属植物树参（Dendropanax dentiger (Harms) Merr.）或变叶树参（Dendropanax proteus (Champ.) Benth.）的根、茎或树皮，又名半枫荷。药用半枫荷的种类很多，包括多个科的不同属的植物。大多数为我国民间的传统常用中药，有着悠久的药用历史，被载录《中华本草》、《中国畲族医药学》、《江西草药》等各种中草药书籍中。它的药用部位广泛，包括：根、茎、枝、叶以及树皮和花蜜，都具有祛风除湿、活血消肿的独特药用活性，是有很好发展前景的新型药用植物资源。

树参的根，又名鸭掌柴、半架风、半边枫，是我国江浙一带的畲医经常使用的三十种畲药的一种，被用于治疗类风湿性关节炎、半身不遂等。据《中国民族药志要》记载，树参的苗药名为小荷风、届招觅、清凉伞、雪花盖顶，其根用于治疗风湿骨痛；在瑶药中又称阴阳风，用于治疗风湿、类风湿性关节炎、偏瘫等。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis , RA)在中医学上隶属于“痹症”的范畴。《皇帝内经》中对此做过论述：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹。”引起痹证的病因有邪气所凑之外因和正气不足之内因：内因是脏腑气机失调，正气虚弱，导致卫气失其温煦、推动以及防御外邪之功能，风寒湿等外淫邪气，由肌表侵犯人体，致使脉络闭阻，筋肉拘挛疼痛，而发为痹证；外部因素是久居风、寒、湿之地，或者风、寒、湿等外邪太盛，正不抗邪，侵犯关节之筋肉，脉络而发为相应的痹症。

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种通过细胞因子介导的以关节发生慢性炎症为主要表型的自身免疫病，其主要显著特征是滑膜组织的异常增生和关节的破坏，而且伴随 RA滑膜细胞凋亡发生障碍，滑膜成纤维细胞（Fibroblast-likeSynoviocytes，FLS）的不可控的增殖与大量单核巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，滑膜细胞凋亡与增殖的平衡被打破，因而，滑膜组织发生病理性改变。

类风湿性关节炎发病的早期会有游走性的关节疼痛和运动障碍，早晨容易关节僵直运动不灵活，发病晚期关节产生畸形和关节运动功能的缺失是其主要的临床表现，严重者可导致劳动力丧失甚至落下终生残疾。其中最为常见的关节畸形是手部的腕关节和肘部的关节，掌指关节产生半脱位、偏斜和呈钮孔花样的畸形。类风湿性关节炎重症患者关节往往呈显纤维性或骨性的强直，并且因为关节周围肌肉痉挛甚至萎缩失去关节的正常生理功能，导致患者在生活上不能自理，心理上也备受折磨。除关节症状外，还可出现关节以外的内脏损害，如心、肺、肾、神经等部位的病变。

据报道，全球有六千多万人饱受类风湿性关节炎的困扰，并且类风湿关节炎在自身免疫性结缔组织疾病中的发病率位列首位，在我国RA的平均发病率虽然稍低为5‰左右，但是我国人口基数庞大，RA患者也有近千万之多，其中近三分之一的患者可能在二十年内因此病而致残，值得注意的是女性患者的平均发病率相较于男性患者要高出二三倍。此外，类风湿性关节炎的发病年龄范围特别广，早至二十几岁，老至五十岁都有可能患病，所以研发抗类风湿性关节炎的药物刻不容缓。

RA发病与TNF-α和IL-1β之间的关系，

TNF-α和IL-1β都参与炎症反应的发生，类风湿关节炎患者体内TNF-α和IL-1β含量会明显上升，TNF-α是一种重要的生理性炎症介质，尤其在介导宿主炎症反应、导致组织损伤方面有重要作用。研究证实RA患者外周单核细胞（PBMC）和关节滑膜液的巨噬细胞都能分泌TNF-α，使外周血和关节滑液TNF-α增高，在RA中TNF-α和IL-1β通常同时合成和分泌。TNF-α和IL-1β与RA的发病有着密切的关系，它们参与了RA的发生与发展过程，许多研究治疗类风湿性关节炎的药物都是检测TNF-α和IL-1β等指标验证其抗风湿效果。

在病理生理学上类风湿性关节炎关节破坏的细胞间的互相作用有很多，其中巨噬细胞可能是疾病发生过程中至关重要的因素，它通过释放肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素-1 (IL-1)，刺激滑膜细胞和软骨细胞分泌酶来介导组织损伤。在类风湿性滑膜组织中促炎因子通过未知但可能包括细胞因子，直接接触T淋巴细胞，形成免疫复合物或可能的细菌来靶向激活巨噬细胞。

类风湿关节炎的经典疗法，

目前类风湿性关节炎（RA）的药物治疗的策略主要是：早期诊断、早期治疗、联合用药、长期观察。医院里现在治疗类风湿关节炎的经典药物主要有三类：非甾体抗炎药（Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）、缓解病情的抗风湿药物（Disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）、激素类药物。这些药物通常具有缓解患者关节红肿、疼痛等症状。为了控制RA疾病的蔓延恶化，尽量防止关节产生不可逆性的破坏，减低患者致残的可能性，保持并改善机体的正常生理功能。为达到此目的，最好的方法是采取严格控制的合适的治疗方案，在发病早期就使用能有效缓解病情的抗风湿药物（Disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）进行控制治疗，并通过及时检测的病情检查指标来评价类风湿关节炎病情的发展状况，依此修正诊疗方案，最大程度上改善类风湿性关节炎患者的预后情况。类风湿性关节炎管控方面所面临的挑战在于早期诊断很难发现、病情发展很难控制。

传统中药方剂，单方制剂

中国医药资源丰富，中医疗法有西医不可比的治疗优势，经常采用祛风、通络、散寒、除湿、清热等法祛邪，兼以扶正治疗类风湿性关节炎。常用的治疗类风湿的中药有雷公藤、青风藤、威灵仙、白芍、防己、马钱子、灵芝、乌头、胡椒等。

防己科植物青风藤对机体免疫功能有明显的抑制作用，可明显降低单核巨噬细胞系统炎症介质和细胞因子的含量，发挥出消炎和抗类风湿性关节炎的作用。刘继红等^[12]发现它可促进关节炎小鼠脾淋巴细胞含量的上升，CD₄ ⁺与CD₈ ⁺的比值下调。

夏伦祝等发现威灵仙总皂苷对AA大鼠的原发性和继发性RA都有良好的治疗作用，同时对IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)有比较明显的调控作用；王斌等发现从白芍提取物得到的白芍总苷可降低IL-1的生物活性而具有抗类风湿性关节炎效果。防己科干金藤属植物粉防己（Stephania tetrandra S.Moore）的根含有粉防己碱（tetrandrine），能很好的抑制大鼠关节炎症状，改善RA发生的病变，降低炎细胞浸润，消炎效果比阿司匹林要强。马钱子科植物马钱子（Strychnons nuxvoieal）是祛风湿药，味苦性寒，主要可以治疗风湿痹痛等症。现代药理研究表明其具有显著的抗炎和免疫抑制的作用，张则强等对马钱子碱对AA大鼠的治疗作用进行了研究，结果显示对AA大鼠的关节炎有很好的抑制效果。陈曦等实验发现灵芝多糖对AA大鼠的继发性足肿胀有着很好的控制和治疗作用，除此之外，对继发的全身症状也有很好的改善效果，其作用可能与其调节免疫功能有关。

复方制剂，

除了单方制剂，有许多研究表明，中药复方制剂对RA也有明显的抑制或改善作用。如孟明等用复方木防己汤（木防己、生石膏、桂枝、杏仁、生香附、炙甘草、苍术）对AA大鼠的治疗作用及其相关机制做了研究，显示它能明显延缓病情的发展，使足肿胀度下降，体重增加，淋巴细胞浸润显著减少，滑膜增生也得到控制，血清中IL-lβ，INF-α的含量显著降低。表明其抗类风湿的作用可能与其降低IL-lβ和INF-α的表达密切相关。

此外，痹痛定胶囊（由黄芪、清风藤、全蝎组成）对AA大鼠关节肿胀有很好的抑制作用，可以明显降低血清中C反应蛋白（CRP）、PGE2的含量，可以有效治疗RA。除了能抑制原发炎症外，对佐剂型关节炎(Collagen-induced arthritis,AA)大鼠的继发炎症也有抑制作用。杨敏美等^[22]证实了复原益肾汤（由党参、淫羊藿、黄芪、骨碎补、续断、秦艽、丹参、独活、地黄、当归十味中药组成）能够控制胶原诱导关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠足跖关节肿胀，降低血清IL-17、TNF-α水平，抑制基质金属蛋白酶（MMP-3）的表达，从抗炎、调节免疫、抑制滑膜增生、修复骨组织等多环节、多靶点来减缓RA的病情，起到防治RA的作用。解雪峰在实验研究中发现野菊花总黄酮可使肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）在AA模型组大鼠滑膜组织中的表达下降，同时与TNF-α的作用相反，野菊花总黄酮可上调TRAIL在AA大鼠膝关节滑膜组织中的过低表达，显著抑制AA大鼠滑膜细胞的增生。

中药制剂具有副作用小、不容易产生耐药性、经济适用等优点。

RA在中医学上隶属于“痹症”的范畴。《皇帝内经》中对此做过论述：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹。”引起痹证的病因有邪气所凑之外因和正气不足之内因：内因是脏腑气机失调，正气虚弱，导致卫气失其温煦、推动以及防御外邪之功能，风寒湿等外淫邪气，由肌表侵犯人体，致使脉络闭阻，筋肉拘挛疼痛，而发为痹证；外部因素是久居风、寒、湿之地，或者风、寒、湿等外邪太盛，正不抗邪，侵犯关节之筋肉，脉络而发为相应的痹症。刘日才等用树参麻木汤治疗痹证63例临床观察中发现治愈42例，好转14例，未愈7例，总有效率为88.9%。

黄敬耀等研究发现树参能够对抗AC和Adr性心率失常，缩短BaCl₂所致的心律失常的持续时间，降低CaCl₂诱发小鼠心率失常的发生率，除了良好的抗心率失常作用外，还能增强心肌细胞的抗缺氧能力。

针对目前对树参的研究现状，及其在民间使用的普遍性和循证医学证据的缺乏，因此，如何较好的利用树参的提取物应用于风湿、类风湿性关节炎病的治疗，具有较大的现实意义，同时可以确证其治疗类风湿性关节炎的实际效果。

发明内容：

本发明就是要提供一种树参提取物及制法及在治疗类风湿性关节炎病药物中的应用。其提供树参提取物的提取方法，同时公开树参提取物应用于风湿、类风湿关节炎疾病的防治，具有较好疗效。且利用树参提取物对风湿、类风湿关节炎防治具有副作用小、不容易产生耐药性、经济适用等优点。

本发明公开一种树参提取物的制备方法，以树参植物枝体为原料，以水为提取剂，采用水提取工艺，包括如下工艺步骤，

1）将树参植物枝体切成中药饮片状，洗净，置于干燥装置中，于70℃以下干燥至恒重，为干燥树参；2）制树参滤液，将干燥树参置于提取装置中，称取干燥树参，向干燥树参中加入占称取干燥树参的20～30倍质量体积的水，加热蒸煮沸后煎煮，控制煎煮时间在60 min以上，经过滤得树参滤液和树参残渣，将树参残渣加水，重复上述煎煮操作若干次，合并上述所得滤液为树参上清液；3）制树参提取物，将2）步树参上清液置于提取装置中继续进行加热浓缩至为加入上清液体积的1/10-1/20的浓缩液，将上述浓缩液经高温高压蒸汽灭菌、消毒即为树参提取物。

本发明所述的一种树参提取物的制备方法，其所述干燥为恒温干燥，所述煎煮控制煎煮温度为50-80℃，控制重复煎煮操作2-3次，控制浓缩温度为40-90℃。

本发明一种树参提取物在治疗风湿、类风湿性关节炎病中的应用。

一种树参提取物在制备治疗风湿、类风湿性关节炎病药物制剂中的应用。

本发明所述树参提取物在制备防治风湿、类风湿性关节炎病药物制剂中的应用，所述的制剂为药物学上所述制剂如包括但不限于有树参提取物的水剂、颗粒制剂、胶囊、粉剂等，或者是为生物制剂。

利用本发明制备的树参提取物其应用于防治治疗风湿、类风湿性关节炎时，具有副作用小、不容易产生耐药性、经济适用等优点。

附图说明

图1，本发明树参水提液对佐剂关节炎大鼠血浆 TNF-α的影响，

图2，本发明树参水提液对佐剂关节炎大鼠血浆IL-1β的影响，

图1、2中，ZCZ代表正常组，MXZ代表模型组，LGT代表雷公藤组，SS代表树参组；

图3，未给药治疗的类风湿关节炎模型对照组图片，即模型对照组显微照片

于图3所示的类风湿关节炎模型对照组，未给药治疗，关节发炎严重，可见大量炎性细胞浸润，并可见有非常明显的滑膜增生现象，如图3左边所示，同等放大倍数的一个视野内单核巨噬细胞和淋巴细胞，数量远远超过治疗组和正常组即如图3右边所示；

图4，给与大鼠树参水提液治疗后的与类风湿关节炎模型对照组对照照片；

如图4所示的与类风湿关节炎模型对照组对照，给于大鼠树参水提液治疗后，关节发炎减轻，只可见少量炎性细胞，仅见1-2层的滑膜细胞增生现象即如图左边所示；同等放大倍数的一个视野内单核巨噬细胞和淋巴细胞，数量也低于模型组，如图右边所示；

图5，大鼠足体变化图，如图5所示A：正常组和模型组大鼠足体积变化C：树参组和模型组大鼠足体积变化。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明方法进一步的详细说明。下述具体实施方式中以树参水剂的形式用于对类风湿性关节炎治疗情况说明。

1、类风湿性关节炎大鼠模型，

类风湿性关节炎是一种主要表现为慢性关节炎症的全身性自身免疫性疾病，其发病机制还没有完全研究清楚。临床上类风湿性关节炎患者急性期病变出现急性炎症反应，如关节发炎，滑膜充血、肿胀、组织疏松；慢性病变则表现为滑膜组织的不规则增厚，关节软骨的损坏等，以滑膜的持续性增生和软骨及骨的破坏作为其重要的病理学特征。大鼠的类风湿性关节炎动物模型其中较为经典的有两种：一种是胶原诱发大鼠类风湿关节炎模型（CIA），另一种是佐剂诱发的大鼠类风湿关节炎模型（AA）。

胶原诱导的大鼠关节炎模型，

从类风湿性关节炎关节软骨的生化分析中发现其主要的化学成分为胶原Ⅱ型。在某些病理的条件下，胶原Ⅱ型又可以作为一种自身抗原诱发而产生关节炎症。胶原诱导性关节炎是由具有种属特异性的胶原Ⅱ型免疫后所诱导的实验动物模型。

Ⅱ型胶原诱发大鼠关节炎模型是将酸溶性Ⅱ型胶原蛋白用不完全弗氏佐剂配成浓度为2.5 空格mg/ml的乳剂，按每只大鼠100 空格μl乳剂，含CⅡ250 空格μg，于大鼠左后足跖皮内注射诱导；实验中用每只注射100 空格μl生理盐水的大鼠作为正常组。

佐剂诱导的大鼠关节炎模型，

上世纪中期，细菌学家 Freund创立了佐剂性关节炎诱导大鼠关节炎模型，故又称弗氏佐剂性关节炎。它的主要发病机制为：结核杆菌是相对分子量为 65 kD 的热休克蛋白(HSP65) ，与 AA 大鼠关节软骨的自身抗原 HSP60有高度相似的保守序列，通过分子模拟和交叉反应，激活处于静止状态的淋巴细胞克隆，发起对于II型胶原为抗原的免疫反应，因此引发自身的免疫反应^[72]。佐剂性关节炎诱导的关节炎模型大鼠表现为各个关节发炎，局部肿胀，最好引发关节病变直至畸形。病理形态学上的变化为增生性的滑膜炎，关节软骨损害、骨侵蚀，同时有大量炎性细胞浸润。这些模型上的各种表现与人类风湿性关节炎病发的症状特别相似，是筛选和研究治疗类风湿性关节炎药物的非常理想的动物实验模型。

2 、实验研究

实验材料及处理方法。

树参茎枝，采自于江西省宜春市明月山；采自于江西省丰城市玉华山；

将树参枝茎切成中药饮片状，洗净后放入恒温干燥箱，在70℃以下干燥至恒重。称取1000 g干燥药材，加入20～30倍体积的蒸馏水，加热煮沸后小火煎煮60 min以上。经洁净纱布过滤得树参上清液，残渣再加蒸馏水适量如前法操作，重复两次后，合并三次所得的滤液，浓缩至 100 ml，经高压蒸汽灭菌后放冰箱备用。

实验动物及分组方法，

实验动物是健康的Sprague-Dawley系大白鼠，雄性，体重200±10 g，购自湖南某实验动物有限公司SPF和饲料；共进行三次重复性试验，每次25只大鼠。

将25大鼠（造模不成功的剔除）随机分为以下5组：

(1). 正常对照组（ZCZ，n=3）：作为空白对照，大鼠不进行任何处理；

(2). 模型对照组（MXZ，n=4）：作为阴性对照，在AA大鼠造模成功后，灌服蒸馏水8 ml/kg·d；

(3). 树参提取物水溶液，治疗组（SS，n=4）：实验组，在AA大鼠造模成功后，灌服树参提取物水溶液8 ml/kg·d；

(4). 雷公藤多苷治疗组（LGT，n=4）：作为阳性对照组，在AA大鼠造模成功后，灌服雷公藤多苷液8 ml/kg·d。

实验仪器与试剂，仪器与设备，容声冰箱，立式超低温冰箱，艾本德移液器，小型高速冷冻离心机，电热恒温水浴锅，半自动台式组织脱水机，电子天平，iMark酶标仪。上述所需仪器设备均通过市售获得。

佐剂及检测试剂盒，完全弗氏佐剂，Complete Friend′s Adjuvant，10 空格mL/瓶，美国某公司，大鼠TNF-α ELISA试剂盒，Rat TNF-α ELISA Kit （96 Tests），某生物科技有限公司，大鼠IL-1β ELISA试剂盒，Rat IL-1β ELISA Kit （96 Tests），某生物科技有限公司。

实验药品，雷公藤多苷片，上海某药业有限公司。剂量为每粒2 mg，研钵研碎后用蒸馏水配成2 mg/ml的药液。

实验方法，大鼠关节炎模型建立，

本本发明实验按照方法文献用完全弗氏佐剂诱导，模型组和实验组的每只大鼠脚趾下注射完全弗氏佐剂 100 μl/只；正常组每只大鼠注射 100 μl生理盐水作为对照。记录初次免疫时间，7 d后进行二次加强免疫。

给药方法，

实验组验证造模成功在初次免疫7 d后开始给药治疗，树参组灌服树参水提液即树参提取物水溶液下同，每次8 ml/kg（相当于80 g生药），相当于70 kg成人用药等效剂量，每天灌服1次；藤石松组灌服藤石松水提液每次8 ml/kg（相当于80 g生药），相当于70 kg成人用药等效剂量，每天灌服1次；雷公藤组灌服雷公藤多苷液每次8 ml/kg（相当于2 mg药），为70kg成人临床用药等效剂量；模型对照组每天灌服8 ml/kg的蒸馏水；正常对照组让其自由饮水。不同给药剂量。

关节炎症状评分，

关节炎指数评分法，评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况进行关节指数评分表1。关节炎指数评分越高，表明关节症状越严重。

表1，

	关节症状	关节炎得分
			1	无红肿	0分
2	足小趾关节红肿	1分
			3	趾关节、足趾均红肿	2分
4	踝关节以下均红肿严重	3分
			5	包括踝关节全部红肿不能负重	4分

在造模后和每次给药前对大鼠的关节症状进行评分，每七天统计一次，记录每次所得分值，以其均数±标准差（X±S）表示，用数理统计方法采用单变量方差分析，阳性对照组与模型组相比，如果P<0.01表明统计学上有显著性差异，各组数据与阳性对照组进行检验分析，如果P>0.05表明差异无统计学意义。

足体积测量。

在造模前、造模后、给药后用排水法测量大鼠的足体积，每七天测量一次，记录每次测量的数据，以其均数±标准差（X±S）表示，用数理统计方法采用单变量方差分析，阳性对照组与模型组相比，P<0.01表明统计学上有显著性差异，各组数据与阳性对照组进行检验分析，P>0.05表明差异无统计学意义。

取材方法。

血浆取材方法，通过眼眶取血法取正常组、模型组、治疗组、阳性对照组大鼠的血液，用抗凝剂EDTA抗凝，4℃下在低温高速离心机离心 10 min（转速3000 r/min），将分离的血浆取出，置于超低温冰箱-80℃冷冻保存待测。

组织取材方法，最后一次取血后用乙醚麻醉引颈处死大鼠，切取其踝趾关节，立即浸泡于10%的福尔马林溶液中固定；取大鼠关节横切面，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红染色。

病理组织形态学观察，

观察实验大鼠病情进展状况，用乙醚麻醉引颈处死大鼠后，取大鼠踝关节横切面，立即放入10%甲醛溶液中固定，经过12 h常规梯度脱钙处理后，石蜡包埋，切片，片厚约3-5 μm，苏木精-伊红染色，制片后在光学高倍显微镜下观察滑膜病理变化并照相，计数视野炎性细胞和巨噬细胞的数目，与模型组比较是否有炎性细胞浸润，显微组织增生，滑膜组织细胞增生，巨噬细胞增生，验证其是否有抗类风湿性关节炎的疗效。

指标检测，

TNF-α和IL-1β都参与炎症反应的发生，类风湿关节炎患者体内TNF-α和IL-1β含量会明显上升，TNF-α是一种重要的生理性炎症介质，尤其在介导宿主炎症反应、导致组织损伤方面有重要作用。研究证实RA患者外周单核细胞（PBMC）和关节滑膜液的巨噬细胞都能分泌TNF-α，使外周血和关节滑液TNF-α增高，在RA中TNF-α和IL-1β通常同时合成和分泌。TNF-α和IL-1β与RA的发病有着密切的关系，它们参与了RA的发生与发展过程，许多研究治疗类风湿性关节炎的药物都是检测TNF-α和IL-1β等指标验证其抗风湿效果。

在病理生理学上类风湿性关节炎关节破坏的细胞间的互相作用有很多，其中巨噬细胞可能是疾病发生过程中至关重要的因素，通过释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)，刺激滑膜细胞和软骨细胞分泌酶来介导组织损伤。在类风湿性滑膜组织中促炎因子通过未知但可能包括细胞因子，直接接触T淋巴细胞，形成免疫复合物或可能的细菌来靶向激活巨噬细胞。

大鼠血浆TNF-α含量的测定。

大鼠血浆TNF-α的含量用ELISA试剂盒测定。ELISA试剂盒采用双抗体夹心法：抗大鼠TNF-α单抗包被于酶标板上，血浆和标准液中的大鼠TNF-α会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗大鼠TNF-α和辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素和亲和素特异性结合；大鼠TNF-α抗体与结合在单抗上的大鼠TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有大鼠TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂显蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值，大鼠TNF-α浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠TNF-α的浓度。

大鼠血浆中TNF-α含量检测步骤如下：

（1）、从ELISA试剂盒的密封袋中取出已经平衡至室温的试验所需板条；

（2）空白孔加标准品＆标本通用稀释液，其余相应孔中加不同组的大鼠血清和不同浓度标准品（100 μl/孔），用封板胶封住反应孔，36℃孵箱孵育90 min；

（3）提前20 min准备生物素化抗体工作液，用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。稀释后的生物素化抗体需在当日使用；

（4）甩尽孔内的液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 μl，静止30 s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗板5次；

（5）空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液（100 μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60 min；

（6）提前20 min准备酶结合物工作液，用酶结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液，避光室温（22-25℃）放置。稀释后的酶结合物工作液需在当日使用；

（7）甩尽孔内的液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，并洗板5次；

（8）空白孔加酶结合液稀释液，其余孔加酶结合物工作液（100 μl/孔）。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育30 min；并打开酶标仪，预热仪器，并设置好检测程序；

（9）甩尽孔内的液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 μl，静止30 s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。并洗板5次。加入显色底物（TMB）100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min；

（10）加入终止液100 μl/孔，混匀后即刻测量OD₄₅₀值（3 min内）。入库保存好测量的实验结果。

大鼠血浆IL-1β含量的测定。

测量大鼠IL-1β含量的ELISA试剂盒也是采用双抗体夹心法，大鼠血浆中IL-1β含量的检测步骤同上。

统计学处理。

用统计软件，实验结果以X±S表示，两样本均数的比较采用t检验；P＜0.05认为有差异；用Excel软件做曲线图。用医药数理统计方法验证大鼠在各水提液治疗前后是否有明显差异。对照组和实验组若有显著性差异（P<0.01），证明此水提液对CIA大鼠有一定的治疗作用。对照组和实验组比较若无显著性差异（P>0.05），说明各组之间对CIA大鼠的治疗作用相差不大。

实验应用佐剂诱发的大鼠类风湿关节炎模型（AA）；病理形态学上的变化为增生性的滑膜炎，关节软骨损害、骨侵蚀，同时有大量炎性细胞浸润。这些模型上的各种表现与人类风湿性关节炎病发的症状特别相似，是筛选和研究治疗类风湿性关节炎药物的非常理想的动物实验模型。

空白对照组大鼠一切正常，无异常症状产生，模型组大鼠饮食明显减少，足趾关节明显肿胀，平均体重较正常组减轻40±10g，发病后期可见毛发枯燥、食欲不振等症状，且负重困难。实验前后发现树参水提液治疗组的体重与正常组相比，未发现体重明显减轻的现象。两治疗组症状轻微，足趾仅是稍微有些肿胀，甚至有些大鼠未见以上表现。

关节炎指数评分，表2。

表2 AA大鼠关节炎指数评分（X±S）

与模型组比较，*P＜0.01；与雷公藤多苷液对照组比较，**P >0.05 。

通过对各组大鼠关节炎指数的统计，结果如表2所示。可以看出模型组大鼠的关节炎指数得分很高，说明大鼠关节肿胀严重。雷公藤多苷液治疗组与模型组相比，统计学上有显著性差异（P<0.01），说明其有很好的治疗效果。

树参水提液治疗组和雷公藤多苷液治疗组相比，统计学无显著性差异（P >0.05），说明树参水提液治疗组和藤石松水提液治疗组与雷公藤多苷液治疗组一样，都对类风湿性关节炎有很好的治疗效果。

足体积指标观察。

如图5所示，正常组大鼠未造模，未用药物，大鼠足体积略微增长，属于正常生理增长范围之内。而模型对照组大鼠足体积有很大的增长，说明关节肿胀严重，可以判断建模方法可行，大鼠类风湿性关节炎病症已经发生，建模获得成功。说明树参水提液与雷公藤多苷一样具有抗炎作用，抑制了大鼠类风湿性关节炎的病情恶化，起到了肿胀等症状的控制作用。树参水提液治疗组的大鼠足体积变化与雷公藤多苷液对照组相比略微偏高但是相差不大，说明树参水提液与雷公藤多苷一样具有抗炎作用，抑制了大鼠类风湿性关节炎的病情恶化，起到了肿胀等症状的控制作用。

病理组织学观察结果。

正常组：正常组未造模，未给药治疗，显微镜下观察无关节炎发生，未见炎性细胞浸润，也未见有明显的滑膜增生现象，同等放大倍数的一个视野内单核巨噬细胞和淋巴细胞，数量都很稀少。

如图3 模型对照组显微照片，类风湿关节炎模型对照组，未给药治疗，关节发炎严重，可见大量炎性细胞浸润，并可见有非常明显的滑膜增生现象如图左边所示，同等放大倍数的一个视野内单核巨噬细胞和淋巴细胞，数量远远超过治疗组和正常组，如图右边所示。

如图4 树参水提液治疗组，即给于大鼠树参水提液治疗后的与类风湿关节炎模型对照组对照照片，与类风湿关节炎模型对照组对照，给于大鼠树参水提液治疗后，关节发炎减轻，只可见少量炎性细胞，仅见1-2层的滑膜细胞增生现象如图4左边所示。同等放大倍数的一个视野内单核巨噬细胞和淋巴细胞，数量也低于模型组如图4右边所示。

指标检测。

血浆TNF-α含量的检测结果，表3

表3 水提液对佐剂关节炎大鼠血浆 TNF-α的影响

组别	n	TNF-α（pg/ml）
			正常组	9	2.856±0.178
模型组	16	3.462±0.214
			雷公藤组	16	2.903±0.187**
树参组	16	2.956±0.196*

与模型组比较，**P＜0.01；与雷公藤组比较，*P >0.05。

通过对各组大鼠血浆中TNF-α含量的测定，结果如表3所示。可以看出模型组大鼠血浆中的TNF-α含量远高于正常组的TNF-α含量。雷公藤多苷液治疗组与模型组相比，统计学上有显著性差异（P<0.01），说明其有很好的治疗效果

树参水提液治疗组和雷公藤多苷液治疗组相比，统计学无显著性差异（P >0.05），说明树参水提液治疗组和雷公藤多苷液治疗组一样，都对类风湿性关节炎有很好的治疗效果。血浆IL-1β含量的检测结果，表4。

表 4 水提液对佐剂关节炎大鼠血浆IL-1β的影响

组别	n	IL-1β（pg/ml）
			正常组	9	0.125±0.025
模型组	16	0.211±0.078
			雷公藤组	16	0.160±0.097**
树参组	16	0.171±0.082*

与模型组比较，**P＜0.01；与雷公藤组比较，*P >0.05。

通过对各组大鼠血浆中IL-1β含量的测定，结果如表3所示。可以看出模型组大鼠血浆中的IL-1β含量远高于正常组的IL-1β含量。雷公藤多苷液治疗组与模型组相比，统计学上有显著性差异（P<0.01），说明其有很好的治疗效果。树参水提液治疗组和雷公藤多苷液治疗组相比，统计学上无显著性差异（P >0.05），说明树参水提液治疗组和雷公藤多苷液治疗组一样，都对类风湿性关节炎有很好的治疗效果。

实验总结，

1）本发明实验采用SD大鼠建立类风湿性关节炎模型，使用弗氏佐剂诱导，建模成功率达百分之八十以上。关节炎评分、足体积测量和病理切片结果可以确认，本实验大鼠类风湿性关节炎模型造模成功。

2）实验显示，AA大鼠关节肿胀与正常组比较差异显著，滑膜病理显示有滑膜增生现象及炎细胞浸润发生；树参水提液和藤石松水提液在用药后可显著抑制AA大鼠足趾关节的肿胀、改善关节的病理损害，减轻了关节炎病程中的炎症反应，改善AA关节炎症状，缓解了病情，表明两者具有抑制炎性细胞因子，减缓类风湿关节炎免疫介导炎症反应的作用。

3）实验结果显示，树参水提液在用药后能够减轻AA大鼠足肿胀程度，降低血清TNF-α含量，而TNF-α是类风湿性关节炎发生发展的关键促炎因子，提示树参水提取液对AA大鼠具有明显的抗炎作用，表明两者干预AA大鼠免疫炎症的作用机制可能与通过减少AA大鼠血清TNF-α的含量，降低相关炎症因子的释放有关，进而起到抗炎作用，结合滑膜病理变化提示树参水提液可通过抗炎效应，减缓滑膜及软骨组织的破坏。

4）IL-1β是使RA的炎症应答放大并使其转化为破坏反应的主要细胞因子。本研究结果显示树参水提液和藤石松水提液在用药后能够减轻AA大鼠足肿胀程度，降低血清IL-1β含量，提示树参水提液对AA大鼠的的抗炎作用的机制可能是通过减少AA大鼠血清IL-1β含量，降低相关炎症因子释放有关，进而起到抗炎效果，结合滑膜病理变化提示树参水提液可通过抗炎效应，减缓滑膜及软骨组织的破坏。

本发明结论：实验证明树参水提取物在对类风湿性关节炎的大鼠药效实验，经过组织病理切片和相关炎症因子的检测，与市场阳性药物雷公藤多苷比较，药效明显，表明可以作为治疗类风湿性关节炎的药物制剂应用。

Claims (4)

1.一种树参提取物的制备方法，以树参植物枝体为原料，以水为提取剂，采用水提取工艺，包括如下工艺步骤，

1）将树参植物枝体切成中药饮片状，洗净，置于干燥装置中，于70℃以下干燥至恒重，为干燥树参，2）制树参滤液，将干燥树参置于提取装置中，称取干燥树参，向干燥树参中加入占称取干燥树参的20～30倍质量体积的水，加热蒸煮沸后煎煮，控制煎煮时间在60 min以上，经过滤得树参滤液和树参残渣，将树参残渣加水，重复上述煎煮操作若干次，合并上述所得滤液为树参上清液；3）制树参提取物，将2）步树参上清液置于提取装置中继续进行加热浓缩至为加入上清液体积的1/10-1/20的浓缩液，将上述浓缩液经高温高压蒸汽灭菌、消毒即为树参提取物。

2.根据权利要求1所述的一种树参提取物的制备方法，其特征是所述干燥为恒温干燥，所述煎煮控制煎煮温度为50-80℃，控制重复煎煮操作2-3次，控制浓缩温度为40-90℃。

3.一种树参提取物在治疗风湿、类风湿性关节炎病中的应用。

4.一种树参提取物在制备治疗风湿、类风湿性关节炎病药物制剂中的应用。