CN115281149A - 一种临床前类风湿关节炎(Pre-RA)小鼠模型 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种临床前类风湿关节炎(Pre‑RA)小鼠模型，包括小鼠造模方式和造模剂，所述造模方式包括具体造模步骤，所述造模剂包括2‑4mg/mlⅡ型牛胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂和无结核杆菌的不完全弗氏佐剂；本发明通过改造实验步骤和方法获得一种具有Pre‑RA特点的小鼠模型，用于临床前的实验研究。本发明通过配制新的乳化剂，尾根部注射后，可以维持小鼠免疫激活或产生轻微关节炎症状模拟类风湿关节炎患者临床前期的病理特点，用于临床前类风湿关节炎的相关研究。
Description
技术领域
本发明涉及小鼠模型制备领域，具体是一种临床前类风湿关节炎(Pre-RA)小鼠模型。
背景技术
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的侵蚀性、对称性多关节炎。其主要发生过程是个体丧失自我耐受性，自身抗体产生，形成的一种慢性关节炎。该关节炎以全身炎症、关节持续滑膜炎、软骨破坏和骨破坏为主要表现。患病人数约占总人数的1％人口，主要发病于老年女性，女性约为男性的三倍。不予治疗，其２年的致残率约为60%。长期的慢性炎症，也可导致多种并发症的发生，危机全身各系统，严重影响患者的生活质量，为个人和家庭带来巨大的经济负担。RA病因目前尚不明确，可能与遗传、感染等因素有关。ACCP、RA等抗体具有较高诊断特异性，但无金标准。RA从发病经历了一个漫长的发展阶段，一般可经历At risk、Pre-symptomatic RA 、Transition to symptomatic RA、symptomatic RA、Rheumatoid arthritis五个阶段。抗体阳性可持续3～10年发病。目前其诊断沿用美国风湿病学院（ACR）1987标准，早期诊断沿用美国风湿病学院（ACR）2010标准。其治疗关键在控制或延迟疾病发展，主要药物有非甾体抗炎药、抗风湿药、激素、生物制剂和小分子靶向药等。通过慢病管理，增加早期诊断，研发新药等方式RA的治疗水平明显提高，但目前治疗仅限于控制或延缓病程，并不能治愈，其并发症也会随病程延展而增加。即使是最有效的疗法也不会逆转关节损伤，其中软骨损伤比骨质损伤对不可逆性残疾的贡献更大。
CIA是RA疾病的重要模型，通过注射Ⅱ型胶原、弗氏佐剂和结核杆菌，对具有较强免疫体系的小鼠（例如BDA/1、C57）造模，21-27天获得关节炎模型。CIA与人类RA有着许多相似之处，已成为RA研究最广泛的模型。CIA的免疫发病机制涉及对II型胶原（CII）的T细胞和B细胞特异性反应。CII是软骨和RA靶组织中的主要蛋白质，CⅡ进入血液后，被免疫细胞识别激活CD4+的细胞可能是CIA发病的关键。完全弗氏佐剂（CFA）中乳化的CII免疫，在遗传易感小鼠品系中诱发CIA。发病机制与RA共很多病理特征一致，其中包括滑膜增生，单核细胞浸润，软骨降解。且与RA一样，易感性与特定MHC II类基因的表达有关。CIA模型与RA之间的最显着的区别是类风湿因子（EF）不存阳性。同样的早期CIA模型中有报道，科学家通过单次注射Ⅱ型胶原、弗氏佐剂和结核杆菌，获得的关节炎模型和两次免疫后的模型病理上相似，但症状轻且发展缓慢。在4～5周的出模率在2～50%。单次注射免疫后的小鼠接近于Pre-CIA模型，此时具有全身的炎症和免疫应答，但关节的炎症相对不足，在5周以后CIA可发病升高，但关节肿胀不如CIA。有文献指出，单次注射免疫后可以用于关节炎临床前的药物筛选。RA中软骨破坏是一个较为复杂的病变过程，一方面，在软骨机械或者炎症损伤后，软骨的残端会降解Ⅱ型胶原，Ⅱ型胶原端口的氨基酸随着毛细血管进入血液，血液中免疫细胞发现，并形成抗体，在血液中的抗体经过毛细血管回到软骨，对软骨形成进一步破坏。同样，另一方面随着炎症的加剧，免疫细胞分泌包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17和TNFα等促炎因子，这些因子通过血管到达软骨表面，在滑膜中和软骨上附着，促进基质蛋白酶（如MMPs和ADAMTS）表达，进一步降解软骨基质。炎症因子持续的刺激，关节腔正常的滑膜组织免疫不耐受后自限性被打破，大量的滑膜增生形成滑膜炎，滑膜炎又进一步分泌炎症因子，破坏软骨。CIA直接通过Ⅱ型胶原刺激，诱发关节炎的炎症，与RA软骨破坏形成过程十分相似。
临床RA的临床表现，与CIA模型十分相似，因此，以CIA模型类比RA临床研究。在RA的发病过程中，将RA分为At risk、Pre-symptomatic RA 、Transition to symptomaticRA、symptomatic RA、Rheumatoid arthritis五个不同时期，每个时期其表现不同。在没有能够诊断RA足够证据以前，但又有RA部分表现，我们称之为Pre-RA（包括前四个阶段）。Pre-RA 经历了从高风险期到临床症状期的漫长过程，是RA免疫混乱的主要时期。由于目前在RA发病机制上尚不明确，加上中后期的滑膜增生迅速，与疾病活动度和发展密切相关，因此研究最为广泛的是以滑膜炎为主的中后期抗炎治疗和机制阻断。基于临床研究有学者提出，后期滑膜炎类癌生长，掩盖了RA中免疫异常的主要原因。事实上RA一旦进入慢性炎症期，就很难逆转已有的关节和关节外的器官损害，即使是最新的生物制剂，也只能延缓RA的发病进程并不能逆转RA的慢性发展。当前的药物，不管是甾体抗炎药，还是免疫制剂、糖皮质激素、生物靶向药，仅仅是针对临床期的用药，缺乏对Pre-RA 的预防和干预，从更早的病理阶段治愈或控制RA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种临床前类风湿关节炎(Pre-RA)小鼠模型，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种临床前类风湿关节炎(Pre-RA)小鼠模型，包括小鼠造模方式和造模剂，所述造模方式包括具体造模步骤，所述造模剂包括2-4mg/mlⅡ型牛胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂和无结核杆菌的不完全弗氏佐剂；本发明通过改造实验步骤和方法获得一种具有Pre-RA特点的小鼠模型，用于临床前的实验研究。本发明通过配制新的乳化剂，尾根部注射后，可以维持小鼠免疫激活或产生轻微关节炎症状模拟类风湿关节炎患者临床前期的病理特点，用于临床前类风湿关节炎的相关研究。
作为本发明进一步的方案：所述小鼠模型选用BDA/1J，8-9周，雄性，SPF级小鼠，其自身免疫较强，易于造模，且成模比例较高。
作为本发明再进一步的方案：所述乳化剂配制2-4mgⅡ型胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂，2-4mgⅡ型胶原+含0mg/ml结核杆菌的不完全弗氏佐剂。
作为本发明再进一步的方案：所述造模方式，尾根皮下注射方法，要求皮丘长期存在。
作为本发明再进一步的方案：所述乳化过程，采用低温水域超声乳化。
作为本发明再进一步的方案：所述乳化检验，乳化后用10μl 移液枪吸少许乳化剂置于水中，乳化剂不扩散表示已乳化完全。
作为本发明再进一步的方案：所述模型检验，可见IgM +。
作为本发明再进一步的方案：所述模型特点，可见单关节或少关节肿胀，小鼠体重下降，关节软骨和骨侵蚀，Th1/2/17、TfH升高，关节可见少量滑膜增生，小鼠促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-17A升高。
作为本发明再进一步的方案：所述模型与临床前类风湿关节炎相似。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中可以通过调整造模乳化剂和造模方式，实现一种低表现的类风湿关节炎模型，其特点为可见单关节或少关节肿胀，小鼠体重下降，关节软骨和骨侵蚀，Th1/2/17、TfH升高，关节可见少量滑膜增生，小鼠促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-17A升高的一种较CIA模型更弱的临床前CIA模型。
2、本发明中涉及一些列模型检验和质控，可以有效提高临床前类风湿关节炎模型小鼠的检验。
3、本发明中首次提出临床前类风湿关节炎模型，为类风湿临床前的研究提供基础。
附图说明
图1为“正常－模型－CIA”关节炎图。
图2为“正常－模型－CIA”病理图。
图3为“正常－模型－CIA”胶原分布图。
图4为“正常－模型－CIA”Th1/2/17、TfH流式图。
图5为“正常－模型－CIA”外周血促炎因子图。
图6为“正常－模型－CIA”CT图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1～6，选用BDA/1J，8-9周，雄性，SPF级小鼠。选用超声乳化造模剂，用清水验证。在第０天时尾根注射2-4mgⅡ型胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂乳化剂，在21天时2-4mgⅡ型胶原+含0mg/ml结核杆菌的不完全弗氏佐剂乳化剂。第28天是获取小鼠外周血，检测IgM。观察小鼠单关节或少关节肿胀，小鼠体重下降，关节软骨和骨侵蚀，Th1/2/17、TfH升高，关节可见少量滑膜增生，小鼠促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-17A升高等特点。可用低剂量的LPS激发炎症或长期观察。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种临床前类风湿关节炎(Pre-RA)小鼠模型，其特征在于，通过制作Ⅱ型胶原乳化剂，在小鼠尾根部注射皮丘，使Ⅱ型胶原乳化剂通过毛细血管吸收后，与小鼠全身免疫发生作用，形成具有临床前类风湿关节炎特点的小鼠。
2.根据权利要求1所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠选取8-9周，雄性，SPF级，小鼠，其自身免疫较强，其特征实验性结核杆菌的易感性强、MHC H2基因位点突变、常应用II型胶原可以诱导强烈的自身免疫性反应，导致严重的多关节的炎症，表现为滑膜炎、软骨和骨的损伤，模拟类风湿关节炎。
3.根据权利要求1所述的Ⅱ型胶原乳化剂，其特征在于，所述乳化剂依据市场现有的胶原乳化剂和现有文献，对原本4mgⅡ型胶原+含4mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂，4mgⅡ型胶原+含0mg/ml结核杆菌的不完全弗氏佐剂，
改为2-4mgⅡ型胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂，2-4mgⅡ型胶原+含0mg/ml结核杆菌的不完全弗氏佐剂，
第28天可取5μl 外周血血（耳血或尾血）测量IgM，可判断模型是否成功，
或用10-20ugLPS腹腔注射，检验小鼠模型，
10-20ugLPS腹腔注射后，小鼠可迅速出现关节炎模型，正常BDA/1小鼠10-20ugLPS腹腔注射不可致关节炎。
4.根据权利要求3所述的造模，其特征在于，所述实验步骤在超声下乳化5min±，待完全乳化后，用水检验后，第0天尾根部注射2-4mgⅡ型胶原+含2.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂，第21天尾根部注射2-4mgⅡ型胶原+含0mg/ml结核杆菌的不完全弗氏佐剂。
5.根据权利要求3所述的乳化过程，其特征在于，所述乳化采用水域超声乳化，其参数为 Power 30%，Working 3s，Pause 3s, Total Time 5 min±。
6.根据权利要求3所述的以乳化剂完全乳化，其特征在于，所述乳化剂在权力5所述的步骤下完成，
完成后用1μl 移液枪吸取1μl 置于水中，若见乳剂迅速化开，则继续乳化；若乳剂聚团不散开，则为成功乳剂。
7.根据权利要求2所述的临床前小鼠特点，其特征在于，所述模型特点可见单关节或少关节肿胀，小鼠体重下降，关节软骨和骨侵蚀，Th1/2/17、TfH升高，关节可见少量滑膜增生，小鼠促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-17A升高。
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