CN109694412A - 阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体、制备和应用 - Google Patents

阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体、制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种阻断PD‑1/PD‑L1通路的IgY及其Fab小分子抗体、制备方法和应用。本发明所制得的IgY及其Fab小分子抗体性能稳定，可以加至病灶处或通过病灶部位的组织液渗透进入粘膜层、外周组织和淋巴组织以及毛细血管后微静脉等微循环而与T细胞表面的PD‑1蛋白和肿瘤细胞表面的PD‑L1蛋白结合，阻断PD‑1/PD‑L1通路，激活T细胞攻击肿瘤细胞并将其将其杀死；最适合用于治疗早期癌症即粘膜上皮层内的“原位癌”的药物，第一时间阻止癌细胞侵破基底膜向下浸润生长而扩散。本发明将这些抗体纳米脂质体化并配合使用“皮肤渗透促进剂”，提高生物利用度和治疗指数。另外，IgY及其Fab小分子抗体外用不具免疫原性，可以制成外用或口服和喷雾制剂。

Description

阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体、制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗PD-1-IgY和
PD-L1-IgY以及小分子Fab抗体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是严重危害人类健康和生命的疾病，世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IARC)最新报告称，全世界罹患癌症的人数在“迅速增长”，仅2018年一年就新增1810万病例，死亡人数高达960万，平均每分钟有18人死于可怕的癌症。到本世纪末，癌症将成为全球头号“杀手”，也是阻碍人类预期寿命延长的最大“拦路虎”。
目前，世界各国对癌症都还是采取化疗和手术切除为主。但是，化疗效果差且副作用严重，手术切除风险大、复发率也相当高(根据中国医学科学院肿瘤医院统计，其中宫颈癌手术后2年内复发达84％)。
因此，研究开发一种既可预防又可治疗癌症还能减少复发的特效新药，是关系到世界各国人民健康和生命的大事，也是摆在国际医学科学界面前的一项重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子Fab抗体及其制备方法和应用，解决预防和治疗癌症中存在的问题。
本发明解决上述技术问题的方案为，提供一种阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、抗原的制备：采用基因工程技术克隆人PD-1/PD-L1通路相关蛋白作为抗原；
S2、制备免疫蛋：将所述抗原免疫产蛋鸡，取该产蛋鸡所产免疫蛋；
S3、分离：从所述免疫蛋中分离提取所述阻断PD-1/PD-L1通路的IgY抗体。
在本发明的一个实施例中，所述步骤S1中，所述抗原为人PD-1表达蛋白和/或人PD-L1表达蛋白。
在本发明的一个实施例中，所述人PD-1表达蛋白的cDNA序列克隆过程中，上、下游引物分别为：
5'-CCCAAGCTTGATGCAGATCCCAC-3'；
5'-GCTCTAGACAGAGGGGCCAAGAG-3'；
所述人PD-L1表达蛋白的cDNA序列克隆过程中，上、下游引物分别为：
5'-GCAGAATTCGTTCCCAAGGACCTATATGTG-3'；
5'-GCTGTCGACTTAATTTGGAGGATGTGCCAGAG-3'。
在本发明的一个实施例中，所述步骤S3中，蛋黄稀释液经过超滤浓缩后，先后经过海藻酸钠溶液、CaCl2溶液沉淀除杂，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗体纯品溶液。
在本发明的一个实施例中，所述步骤S3之后还包括：
S4、小分子化：使用生物技术切割改造所述阻断PD-1/PD-L1通路IgY抗体，得到小分子Fab抗体。
在本发明的一个实施例中，所述步骤S4之后还包括：
S4、修饰改造：使用大分子修饰剂对所述小分子Fab抗体进行蛋白质修饰，实现延长半衰期、长效性、降低毒副作用、增加稳定性、降低免疫原性、降低抗原性中的至少一种。
在本发明的一个实施例中，将所得抗体干燥得到抗体纯品干粉。
在本发明的一个实施例中，将所得抗体纳米脂质体化。
本发明还提供一种阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体，使用前述制备方法制得。
本发明还提供一种阻断PD-1/PD-L1通路的IgY以及小分子Fab抗体的应用，使用前述制备方法制得的抗体，作为制备用于预防和治疗癌症的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
本发明还提供了上述的抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体、长效化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体(包括这些IgY及其小分子Fab抗体的粗提物和纯品)作为制备用于预防和治疗宫颈癌、阴道癌、恶性上皮组织肿瘤、麟状细胞癌、口腔癌、直肠癌、腔门癌、胃癌、皮肤癌、唇癌、舌癌、齿龈癌、鼻咽癌、阴茎癌、外阴癌、头颈鳞癌等多种癌症的药物、消毒产品、保健品或医疗器械的应用。
本发明还提供了一种组合物，包括了上述的抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体、长效化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体(包括这些IgY及其小分子Fab抗体的粗提物和纯品)以及至少一种其它药学上可接受的组分。
在本发明的组合物中，所述抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体、长效化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY及其小分子Fab抗体或抗人PD-1-IgY及其小分子Fab抗体、抗人PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体(包括这些IgY及其小分子Fab抗体的粗提物和纯品)添加辅料或基料或者化学药、中药，制成液晶微囊、纳米脂质体液晶微囊、凝胶、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂(包括口服片和口含片、咀嚼片)、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、口服液、滴眼剂、喷雾剂(包括口喷剂和鼻喷剂)中的至少一种，用于预防和治疗宫颈癌、阴道癌、恶性上皮组织肿瘤、麟状细胞癌、口腔癌、直肠癌、腔门癌、胃癌、皮肤癌、唇癌、舌癌、齿龈癌、鼻咽癌、阴茎癌、外阴癌、头颈鳞癌等多种癌症。
本发明还提供了上述的组合物作为制备用于预防和治疗宫颈癌、阴道癌、恶性上皮组织肿瘤、麟状细胞癌、口腔癌、直肠癌、腔门癌、胃癌、皮肤癌、唇癌、舌癌、齿龈癌、鼻咽癌、阴茎癌、外阴癌、头颈鳞癌等多种癌症的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
所述制剂包括但不限于这些制剂：
优选地，该制剂还包括皮肤渗透促进剂、赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
优选地，该制剂为阴道凝胶、栓剂、洗液等中的至少一种。
优选地，该制剂为片剂(包括口服片和口含片、咀嚼片)、喷雾剂(包括口喷剂和鼻喷剂)、滴眼剂、粉剂、口服液剂或胶囊中的至少一种。
以上所有产品最适合治疗癌症早期粘膜上皮层内的“原位癌”，可第一时间阻止癌症侵破基底膜而向下浸润生长。在癌症已突侵破基底膜的情况下，应配合使用市面上抗PD-L1、抗PD-L1的单抗注射剂，达到协同治疗的效果。当“原位癌”已演变成“浸润癌”后，可视病情选择结合化疗和手术切割等传统治疗手段；化疗和手术后，采用本发明产品可有效减少传统治疗方法的高复发率。
癌症治疗相关的研究，一直是全球性的研究课题。随着医学研究的逐步深入，免疫治疗作为一种新型癌症治疗方法在近几年逐渐发展起来，并接连创造数起晚期癌症“临床治愈”的奇迹。2013年，【科学】杂志将免疫治疗列为年度十大科学突破之首。
本发明提供的是一种与众不同的抗PD-1/PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体的免疫疗法，它通过IgY和小分子Fab抗体而不是常规的“单抗”阻断PD-1/PD-L1通路，激活人体自身的免疫系统攻击肿瘤细胞。
我们的身体由数万亿个细胞组成，它们一起合作使我们保持身体健康。白细胞中的T细胞，是我们的“警卫队”。T细胞用它们表面特定的蛋白受体去锚定细胞表面的特定蛋白，以检查这些细胞是否为肿瘤细胞。一旦它们确认识别了肿瘤细胞，便会发起攻击。但有时T细胞无法对肿瘤细胞进行识别，原因是肿瘤细胞携带了一些带有伪装作用的蛋白质，与正常细胞混在一起。PD-L1就是肿瘤细胞拥有的起到伪装作用的蛋白质之一。当T细胞表面的PD-1蛋白与肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白相结合，T细胞就会将肿瘤细胞识别为正常细胞，从而不会对其发动攻击，任其在身体中繁衍生息。本发明提供的多种抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY抗体以及小分子Fab抗体及其组合物可以有效阻挡肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与PD-1发生作用；这样，T细胞就会对失去保护的、“裸身”的肿瘤细胞发起攻击而将其清除。
实施和应用本发明的多种抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子Fab抗体及其组合物，具有以下六个方面的有益效果：
(1)本发明的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY及其小分子Fab抗体性能稳定，所制成的产品可在常温下保存和运输，这是目前全球热捧的抗PD-1-IgY和PD-L1单抗产品所不可相比的(这些单抗注射剂都必须冷涷保存和冷链运输)；
(2)本发明的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子Fab抗体制备工艺相对简便，一致性又好，且免除了宰杀动物和繁杂提取工艺，可带来动物福利和经济优势；
(3)由于本发明提供的抗PD-1小分子Fab抗体和抗PD-L1小分子Fab抗体的分子量(45KD)比抗PD-1-IgY、抗PD-L1-IgY的分子量(180KD)和市面上的“抗PD-1和PD-L1单抗针注射剂产品”中的抗PD-1单抗、抗PD-L1单抗的分子量(150kD)小得多；因此，更容易穿透深入粘膜层和外周组织并渗透入淋巴组织和毛细血管后微静脉等微循环发生作用，本发明还进一步将小分子Fab以及IgY抗体纳米脂质体化并配合使用“皮肤渗透促进剂”(Azone等)，使其穿透粘膜层和细胞间隙的能力更强，可显著提高生物利用度和治疗指数；
(4)本发明的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子抗体Fab属于“卵黄抗体”，由于“卵黄抗体”(IgY)比“单抗”更耐温和耐酸耐碱，性能十分稳定，可制成外用凝胶、液晶微囊、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂(阴道用或口服)、泡腾片(阴道用或口服)、胶囊剂(阴道用或口服)、软胶囊(阴道用或口服)、喷雾剂等外用产品，这些外用或口服产品中所含“抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子抗体Fab”可直接作用于相关的几种癌症之病灶部位：其中宫颈癌发生部位是在阴道内的子宫颈，阴道癌发生部位在阴道内壁粘膜层，口腔癌发生部位是在口腔粘膜上的上皮，直肠癌发生部位主要在直肠粘膜高级上皮，肛门癌发生部位是在肛门内皮层细胞，胃癌发生部位是在胃壁最表层的粘膜上皮细胞，皮肤癌主要发生在头、面、颈、手等暴露部位，麟状细胞癌常发生在身体鳞状上皮覆盖的部位(如皮肤、口腔、唇、子宫颈、阴道、食管、喉、阻茎处)，头颈鳞癌主要发生在鼻、咽、喉、眼眶等部位。而“PD-1和PD-L1”两种靶抗原都是在病灶部位的外周组织中存在，PD-1存在于T细胞表面，而PD-L1在多种实体瘤细胞(包括宫颈癌细胞、阴道癌细胞、头颈鳞癌细胞、胃癌细胞等)表面持续表达；因此，完全可通过外用或口服和喷雾以及滴鼻的施药方式将“抗PD-1和PD-L1-IgY以及小分子抗体Fab”直接加至病灶处或通过病灶部位的组织液渗透进入粘膜层、外周组织和淋巴组织以及毛细血管后微静脉等微循环而与靶抗原结合；特別是由于上皮层缺乏血管，在癌症早期“原位癌”阶段，通过注射方式由血管输送到上皮层的抗体数量有限，造成常规的注射抗体方式对“原位癌”的作用效果反而不如直接将IgY抗体或相应小分子Fab抗体输送到病灶处好。在癌症发生早期使用本发明的产品，比注射药物入血液再间接输送到病灶部位更直接、更精准，这方面比常规“抗PD-1单抗和PD-L1单抗注射剂”更有优势；
(5)由于本发明的抗PD-1和PD-L1-IgY以及小分子抗体Fab可制成外用药，正如瑞典Uppsala大学博士论文【禽类IgY抗体—体内与体外】(ACTAUNIVERSITATIS UPSALIENSISUPPSALA 2002)所指出的：“口服IgY包括在其它皮肤和粘膜部位外用IgY不具有免疫原性，即不会产生抗抗体”。由于本发明的主流产品是外用或口服和喷雾药品，因此，不存在产生抗抗体的问题。而静脉注射IgY或“非完全人源化的单抗”(如市面上的“抗PD-1和PD-L1单抗产品”)入动物体内(包括人体内)，IgY或“非完全人源化的单抗”就是一种免疫原，则一定会引起典型的抗IgY或抗单抗的IgM和IgG反应而产生强烈副作用，甚至有危及生命之虞。有鉴于此，也就没有将本发明所提供的主要用于外用和口服的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子抗体Fab加以“人源化”的必要；
(6)本发明将主流产品制成外用或口服和喷雾制剂，与注射剂相比将给患者带来更轻松方便的用药体验，而且不存在注射用药的风险；同时，对制造设备和生产环境条件的要求低得多，生产批文的获准也容易得多，产业化投入也将大幅度降低。这样一来，其最终产品的成本和售价就变成只有市面上“天价级”的“抗PD-1和PD-L1单抗产品”的几十分之一，将给患者提供价廉、特效又使用简便的早期治疗癌症之“平民化”药品，并迅速得到普及应用，成为现有抗PD-1、抗PD-L1的单抗注射剂和其它免疫治疗药的最佳搭配和补充。万一不幸罹患癌症的病人只要趁早使用本发明的产品，就可将癌症扼杀在摇篮之中；从而，摆脱化疗和手术之苦且延长宝贵的生命，对宫颈癌患者来说还能幸免割去子宫的大劫。因此，本发明的产品将成为防治癌症药物的新秀，而为人类攻克癌症治疗这一国际医药界旷世难关开辟出一条崭新的途径。
抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY以及小分子Fab抗体产品用途一览表
具体实施方式
下面结合试验例和实施例，对本发明的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY抗体以及小分子Fab抗体制备方法及其组合物和应用作进一步说明：
本发明实施例中解决技术问题所采用的技术方案是：一种抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY抗体以及小分子Fab抗体，所述抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY抗体以及小分子Fab抗体由如下方法制备得到：
一、应用基因工程技术制备PD-1蛋白抗原和PD-L1蛋白抗原：
采用基因工程技术制备PD-1和PD-L1蛋白抗原的方法有多种，本发明以其中一种方法为例进行详细说明，但对于本领域技术人员来说，采用其它方法进行简单的变换实现，均在本发明的保护范围之内。
1.基因工程重组人PD-1和PD-L1表达蛋白
A.人PD-1分子基因克隆并重组人PD-1表达蛋白
(1)PCR扩增人PD-1cDNA
a.PCR的引物设计：
根据人PD-1全长cDNA序列,利用引物设计软件Primer Premier5.00进行设计。上、下游引物分别为：
5′-CCCAAGCTTGATGCAGATCCCAC-3′；
5′-GCTCTAGACAGAGGGGCCAAGAG-3′。
b.PCR循环条件：
以人T细胞cDNA文库为模板,94℃变性5min—Auto touchdown94℃30s；65～50℃30s；72℃1min，共15个循环—94℃30s；50℃30s；72℃1min，共30个循环—72℃10min。
(2)PD-1重组质粒的构建和鉴定
a.构建
UNIQ-10DNA试剂盒回收纯化PCR产物。用HindIII和XbaI对质粒pcDNA3.1(+)和纯化后的PCR产物分别进行双酶切。然后将PD-1和pcDNA3.1(+)按1:5的摩尔比混合,T4连接酶16℃连接4h。将连接产物转化入感受态菌DH5α,用含氨苄的平板进行筛选。取阳性单克隆进行扩增,抽提重组质粒备用。
b.鉴定
重组质粒HindIII/XbaI双酶切,然后在1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送基康公司测序。
(3)脂质体法转染COS-7细胞
COS-7细胞于10％小牛血清的DMEM完全培养基中培养至对数生长期,转染前1天传代,再培养至次日40％～60％满底。按DOTAP使用说明书将PD-1-pcDNA3.1(+)转染至COS-7细胞中,37℃培养24h后以胰酶消化按1：4比例传代,继续培养4h，收集细胞进行检测。
(4)流式细胞仪检测PD-1的表达
待转染后的COS-7细胞生长72h后,以胰酶消化后收集细胞,用0.01mol·L-1PBS(pH7.4)洗涤2次,以200μl按1：600稀释的小鼠抗人PD-1单抗重悬细胞，4℃孵育30min。PBS洗涤2次,以200μl按1：100稀释的FITC-羊抗小鼠IgG重悬细胞,4℃孵育30min。再以PBS洗涤2次后，0.5％多聚甲醛固定，用FACS 440型流式细胞仪检测COS-7细胞表面PD-1分子的表达。
(5)对所获得的人PD-1表达蛋白采用常规“蛋白质亲和层析技术”进行纯化。
(6)对纯化后的人PD-1表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Westernblot法检测，证明其正确后，再鉴定其生物学活性。
(7)得到纯化的人PD-1表达蛋白。
B.人PD-L1基因克隆并重组人PD-L1表达蛋白
(1)PD-L1-cDNA的分离纯化和鉴定
取PD-L1阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-231扩大培养。用Trazol提取细胞总RNA RT-PCR试剂盒分离纯化人PD-L1cDNA胞外编码区。
上游引物：
5'-GCAGAATTCGTTCCCAAGGACCTATATGTG-3'；5'端引入ECORT酶切位点(下划线)；
下游引物：
5'-GCTGTCGACTTAATTTGGAGGATGTGCCAGAG-3'；5'端引SalT酶切位点(下划线部分)。RT-PCR反应条件为94℃、5min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，30个循环,72℃延伸10min。
(2)PD-L1原核表达载体的构建
用胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物后，用ECORI和SalI双酶切PD-L1、PCR产物和PGEX-4T-1质粒，用T4DNA连接试剂盒将PD-L1插入PGEX-4T-1构建大肠杆菌表达载体PGEX-PD-L1，转化E.coli DH5a感受态细胞。Amp抗性生长菌落经PCR筛选阳性克隆后，集菌处理、纯化质粒测序、酶切、PCR鉴定。
(3)PD-L1蛋白在E.coli中的诱导表达
原核表达载体PGEX-PD-L1转化感受态BL-21，挑选单个抗性菌落接种于5mlLB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜。然后以1：1000接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养3h后，取1ml菌液离心，做SDS-PAGE电泳，剩余的菌液中加入终浓度为0.4mmol.L-1的IPTG诱导4h，取1ml菌液离心做10％SDS-PAGE电泳。收集剩余细菌,加入3ml.g-1菌(湿重)含0.1mmol.L-1PMSF的B-PER细菌蛋白提取试剂重悬细菌，超声破碎菌体，于4℃、1.4×104r.min-1离心20min，分别收集上清液和沉淀,取部分做10％SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达形式，其余样品于-80℃下保存。
(4)包涵体的溶解和复性
沉淀部分先用含1％TrionX－100PBS的包涵体洗涤液洗涤3次，每次于4℃下，1×104r.min-1离心10min，弃上清液，在沉淀中加入包涵体溶解液(3ml.g-1)室温下静置30min溶解，4℃，1×104r.min-1离心10min,收集上清液。上清液在用包涵体释液(1：10)稀释后加入透析袋中，再用复性透析液进行透析，从尿素浓度为4mol.L-1开始，经历2mol.L-1到0.8mol.L-1，最后用PBS透析平衡。
(5)PD-L1融合蛋白的纯化
将透析后的上清液于4℃下，1.2×104r.min-1离心15min，取上清液用0.45μm过滤器过滤。制备GST亲和柱，将过滤后的PD-L1融合蛋白液采用常规“蛋白质亲和层析技术”进行纯化，清除GST标签蛋白。
(6)对纯化后的人PD-L1表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Westernblot法检测，证明其正确后，再鉴定其生物学活性。
(7)得到纯化的人PD-L1表达蛋白。
2.人PD-1表达蛋白抗原和人PD-L1表达蛋白抗原及其复合抗原的制备
(1)将获得的人PD-1表达蛋白和人PD-L1表达蛋白按(1-10)：(10-1)的比例混合均匀，然后按质量比(1-10)：(10-1)加入弗氏佐剂，再置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人PD-1表达蛋白和人PD-L1表达蛋白复合抗原。
(2)分别在所获得的人PD-1表达蛋白和人PD-L1表达蛋白中加入弗氏佐剂，人PD-1表达蛋白或人PD-L1表达蛋白与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10)：(10-1)，然后置于高速匀浆器中高速匀化，分别得到免疫用的人PD-1表达蛋白抗原和人PD-L1表达蛋白抗原。
二、制备免疫蛋：分别采用人PD-1表达蛋白和人PD-L1表达蛋白复合抗原或人PD-1表达蛋白抗原、人PD-L1表达蛋白抗原免疫产蛋鸡；每隔两周分别对产蛋鸡注射一次免疫用的人PD-1表达蛋白和人PD-L1表达蛋白复合抗原或人PD-1表达蛋白抗原、人PD-L1表达蛋白抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，分别得到抗人PD-1和人PD-L1复合免疫蛋或抗人PD-1免疫蛋、抗人PD-L1免疫蛋。
三、制备抗人PD-1-IgY和抗人PD-L1-IgY粗提物：
可采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法等任何一种方法制备抗人PD-1和人PD-L1复合IgY粗提物或抗人PD-1-IgY粗提物、抗人PD-L1-IgY粗提物。
本发明以纯水提取法制备抗人PD-1和人PD-L1复合IgY粗提物或抗人PD-1-IgY粗提物、抗人PD-L1-IgY粗提物为例进行详细说明，但对于本领域技术人员来说，采用其它方法进行简单的变换实现提取，均在本发明的保护范围之内。
具体包括：分别把所制备的抗人PD-1和人PD-L1复合免疫蛋或抗人PD-1免疫蛋、抗人PD-L1免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；高速离心并取上清液，分别得到抗人PD-1和人PD-L1复合IgY粗提物或抗人PD-1-IgY粗提物、抗人PD-L1-IgY粗提物。
四、制备抗人PD-1和人PD-L1-IgY纯品溶液：
分别将制得抗人PD-1和人PD-L1复合IgY粗提物或抗人PD-1-IgY粗提物、抗人PD-L1-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/L的M PB(磷酸盐缓冲液)中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，分别得到抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY纯品溶液。
具体做法如下：
分别将上面粗制的抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY粗提溶液经任何常规方法高速离心和超滤，然后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，将层析收集物透析浓缩，再经过细菌病毒滤除设备处理，滤除细菌病毒，即制成纯化的抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY溶液。细菌病毒滤除设备可采用美国PallUltrafine Filtration Company制造的或其他公司制造的细菌病毒滤除装置，其第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌，第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体，第三道病毒滤除装置是用UltiporVFTMDV50除病毒过滤器除去病毒。
五、制备抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体
生物技术切割改造大分子抗体有多种方法，本发明以其中一种方法和实施步骤说明，但不限于这种方法和实施步骤。如前所指出的，本领域技术人员可以对以下说明的方法和实施步骤作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明权利要求书所限定的范围。
具体操作方法如下：
分别将抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，再按质量比的比例为0.01％-0.1％加入木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等催化蛋白质酶；然后，低温高速离心；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，分别得到抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体或抗人PD-1小分子Fab抗体、抗人PD-L1小分子Fab抗体。
六、抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体修饰改造：
本发明采用蛋白质修饰所制备的抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体，以实现延长半衰期、长效性、降低毒副作用、增加稳定性、降低免疫原性和抗原性等。
可采用聚乙二醇、右旋糖苷、聚氨基酸等大分子修饰剂进行修饰改造。
下述以其中一种利用聚乙二醇进行长效化修饰为例进行详细说明，但不限于这种方法和实施步骤。对于本领域技术人员来说，采用其它方法进行简单的变换实现，均在本发明的保护范围之内。
工艺条件如下：
调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，分别在抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体或抗人PD-1小分子Fab抗体、抗人PD-L1小分子Fab抗体中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体或抗人PD-1小分子Fab抗体、抗人PD-L1小分子Fab抗体的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗人PD-1和人PD-L1-IgYFab抗体与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。
七、制作抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体纯品干粉或抗人PD-1小分子抗体纯品干粉和人PD-L1-小分子抗体纯品干粉：
分别将所得到的抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体纯品溶液或抗人PD-1小分子Fab抗体纯品溶液、抗人PD-L1小分子Fab抗体纯品溶液经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式干燥，分别得到抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体纯品干粉或抗人PD-1小分子Fab抗体纯品干粉、抗人PD-L1小分子Fab抗体纯品干粉。
八、抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体纳米脂质体化，使其更易通过组织液渗透进入粘膜上皮层并穿透组织间隙与T细胞表面的PD-1和癌细胞表面的PD-L1发生作用。
(一)将抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体纯品干粉或抗人PD-1小分子Fab抗体纯品干粉、抗人PD-L1小分子Fab抗体纯品干粉制成纳米微粒。本发明以其中一种超微纳米球制作方法为例说明，实际应用中不限于这种方法：
取所制得的抗人PD-1和人PD-L1复合小分子Fab抗体纯品干粉或抗人PD-1小分子Fab抗体纯品干粉、抗人PD-L1小分子Fab抗体纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得纳米化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体。
(二)将以上所制得的纳米化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、纳米化抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体制成脂质体液晶微囊或纳米脂质体干粉。脂质体包裹材料分磷脂类(包括天然磷脂和合成磷脂脂质体)和胆固醇以及其它可生物降解的聚合物，如：聚氰基丙烯基烷基酯、聚乳酸和聚己内酯、明胶、阿拉伯胶、壳聚糖等。可采用：(1)乳液聚合法，(2)薄膜分散法，(3)超声波分散法，(4)逆相蒸发法，(5)界面聚合法，(6)超临界流体技术等方法制备。本发明以其中一种方法为例说明，实际应用中不限于这种方法：
把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再分别将纳米化抗人PD-1和人PD-L1复合IgY或抗人PD-1-IgY、纳米化抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成抗体溶液，将抗体溶液与卵磷脂和胆固醇乙醚溶液混合充分搅拌均匀，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)或透析法等分离方法除去未包入的抗体，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀释，即分别制得抗人PD-1和人PD-L1复合IgY纳米脂质体液晶微囊或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体纳米脂质体液晶微囊。将所制得的抗人PD-1和人PD-L1复合IgY纳米脂质体液晶微囊或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体纳米脂质体液晶微囊经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式干燥，制得抗人PD-1和人PD-L1复合IgY纳米脂质体干粉或抗人PD-1-IgY、抗人PD-L1-IgY以及抗人PD-1和人PD-L1小分子Fab抗体纳米脂质体干粉。
试验例一：
将前述实施例中所得抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY，对相对应的PD-1和PD-L1蛋白进行抗体结合效价检测。
分别选择PD-1和PD-L1蛋白作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗宫颈癌PD-1和PD-L1-IgY的抗体效价，结果如下表所示：
抗体 抗原 抗体结合效价
抗PD-1-IgY PD-1蛋白 1：8192
抗PD-L1-IgY PD-L1蛋白 1：8192
注：测试样本中的抗PD-1和PD-L1-IgY抗体溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出，所制备的抗PD-1-IgY和PD-L1-IgY对相对应的PD-1和PD-L1抗原都有很高的抗体结合效价。
试验例二：
将前述实施例中所得抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体，对相对应的PD-1和PD-L1蛋白进行抗体结合效价检测。
分别选择PD-1和PD-L1蛋白作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗PD-1小分子抗体Fab和PD-L1小分子抗体Fab的抗体效价，结果如下表所示：
抗体 抗原 抗体结合效价
抗PD-1小分子Fab抗体 PD-1蛋白 1：8192
抗PD-L1小分子Fab抗体 PD-L1蛋白 1：8192
注：测试样本中的抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出，所制备的抗PD-1小分子Fab抗体和PD-L1小分子Fab抗体对相对应的PD-1和PD-L1抗原都有很高的抗体结合效价。
试验例三：
抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体凝胶治疗子宫颈鳞癌的疗效观察。
1.观察对象
疑诊为早期子宫颈鳞癌的65例患者为观察对象。患者年龄24～58岁，平均(39.77±5.53)岁，所有患者均签署知情同意书，疗效观察通过医院伦理委员会审核批准。纳入标准：(1)患者均接受SCC-Ag检查；(2)临床资料齐全。排除标准：(1)肝肾功能严重不全者；(2)全身慢性疾病者；(3)其他恶性肿瘤患者。
2.方法
治疗前先采用SCC-Ag的检测方法检测疑诊为早期子宫颈鳞癌患者的血清，选SCC-Ag>1.5ng/mL为阳性的患者65名，随机分成观察组33名和对照组32名。然后，对照组患者采用市面上普通妇科凝胶(标明X凝胶)治疗140天，观察组患者采用抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体凝胶制剂治疗140天。嘱患者于睡前冲洗阴道后,将抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体凝胶制剂(标明I凝胶)1支或普通妇科凝胶(标明II凝胶)1支推注入阴道后穹窿或阴道残端,每日1次,连续使用140天。用药期问禁止坐浴和性生活。140天后，再采用以上方法采用SCC-Ag检测方法分别检测并统计对照组和观察组的阳性率。
3.SCC-Ag检测
于患者行TCT检查前采集其空腹静脉血，3,000r/min离心15min分离血清，应用化学发光检测仪检测血清中SCC-Ag的含量。
判断标准：血清SCC-Ag>1.5ng/mL为阳性。
4.统计学方法
采用SPPS17.0统计学软件对所搜集的资料进行统计学分析，计数资料采用t检验，计量资料材料X2检验。当P<0.05时，表示差异具有统计学差异。
5.结果
采用以上方法分别对A组(观察组)和B组(对照组)进行检测，A组(观察组)和B组(对照组)阳性率分别为9.1％、100.0％，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
详细情况见下表。
6.结论
抗PD-1和PD-L1小分子Fab抗体凝胶制剂治疗子宫颈鳞癌效果明显。
本发明所包含的信息，在未脱离下述权利要求的精神和保护范围下，本发明各种偏离精确的描述，对于与本发明相关的本领域技术人员来说是显而易见的。本发明并不认为限制在所定义的程序、性质或组成的范围内，因为优选的实施例和其他描述只用于说明目前提供发明的特定方面。对于在化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，实现本发明于各种修改的描述模式，都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种阻断PD-1/PD-L1通路抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、抗原的制备：采用基因工程技术克隆人PD-1/PD-L1通路相关蛋白作为抗原；
S2、制备免疫蛋：将所述抗原免疫产蛋鸡，取该产蛋鸡所产免疫蛋；
S3、分离：从所述免疫蛋中分离提取所述阻断PD-1/PD-L1通路的IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述抗原为人PD-1表达蛋白和/或人PD-L1表达蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人PD-1表达蛋白的cDNA序列克隆过程中，上、下游引物分别为：
5'-CCCAAGCTTGATGCAGATCCCAC-3'；
5'-GCTCTAGACAGAGGGGCCAAGAG-3'；
所述人PD-L1表达蛋白的cDNA序列克隆过程中，上、下游引物分别为：
5'-GCAGAATTCGTTCCCAAGGACCTATATGTG-3'；
5'-GCTGTCGACTTAATTTGGAGGATGTGCCAGAG-3'。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，蛋黄稀释液经过超滤浓缩后，先后经过海藻酸钠溶液、CaCl2溶液沉淀除杂，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗体纯品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3之后还包括：
S4、小分子化：使用生物技术切割改造所述阻断PD-1/PD-L1通路抗体，得到小分子Fab抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S4之后还包括：
S4、修饰改造：使用大分子修饰剂对所述小分子Fab抗体进行蛋白质修饰，实现延长半衰期、长效性、降低毒副作用、增加稳定性、降低免疫原性、降低抗原性中的至少一种。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，将所得抗体干燥，得到抗体纯品干粉。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将得到的所述抗体纳米脂质体化。
9.一种阻断PD-1/PD-L1通路的抗体，其特征在于，使用权利要求1-8中制备方法制得。
10.一种阻断PD-1/PD-L1通路抗体的应用，其特征在于，使用权利要求1-8中制备方法制得的抗体，作为制备用于预防和治疗癌症的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述癌症包括宫颈癌、阴道癌、恶性上皮组织肿瘤、麟状细胞癌、口腔癌、直肠癌、腔门癌、胃癌、皮肤癌、唇癌、舌癌、齿龈癌、鼻咽癌、阴茎癌、外阴癌、头颈鳞癌。
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