CN102166353B

CN102166353B - 一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备

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Publication number: CN102166353B
Application number: CN201010114710.9A
Authority: CN
Inventors: 孙介光; 孙雪然
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN102166353A; WO2011103794A1

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备方法。按体积比计，其喷剂成份为1ml的人用狂犬病纯化疫苗，9ml的制成质量体积浓度为0.01～0.03g/ml壳聚糖-醋酸溶液；其中所述壳聚糖-醋酸溶液为：10～30g壳聚糖加醋酸溶液完全溶解至1000ml。其制备：先通过制备0.3～1.0％醋酸溶液再制备壳聚糖-醋酸溶液；然后取活性含量5IU～20IU的人用狂犬病疫苗溶液1体积份加入至10体积份量瓶中，加壳聚糖-醋酸溶液稀释配制疫苗溶液。本发明着重对由HPV感染引起的宫颈癌患者、HPV感染人群进行跟踪治疗(Tc亚群检测、HPV检测及临床症状的改善)以及HPV感染引起的性病、宫颈糜烂、慢性宫颈炎，均取得良好的临床效果。

Description

一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂及制备。

背景技术

人用狂犬病纯化疫苗(KI)在临床使用过程中，发现其作为一种生物抗原刺激机体后，可诱发机体产生强有力的免疫反应，(抗原特异性免疫；非抗原特异性免疫)而宿主的免疫反应，对控制相关病变具有十分重要的作用。大量的文献研究资料证明：人体自身免疫力低下与癌症的发生有着相当密切的联系，一旦机体免疫力降低，各种疾病可以乘隙而入。临床的资料又证明，在肿瘤病毒与人类疾病关系的研究中，只有人乳头瘤病毒(humanpapilloma virus，HPV)与人类肿瘤的关系最为明确。1995年WHO和IARC已将HPV确定为是宫颈癌的病因。HPV主要侵犯人皮肤粘膜的上皮组织，引起皮肤粘膜上皮的良恶性增生，墨西哥医学专家指出，人乳头状瘤病毒(HPV)潜伏期很长，女性感染这种病毒后如果发现早、诊治及时，可防止病毒诱发宫颈癌。目前HPV已分离出100多型，根据诱发病变性质的不同，将HPV分为：13种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，低危型HPV主要包括：HPV(6、11、32、40、42、43、54、MM8)。高危型HPV病毒几乎是所有宫颈癌的元凶，在细胞学和分子生物学方面也获得了人乳头状瘤病毒致癌的有力证据。大量研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因，临床病理检查中，宫颈癌患者几乎100％的有高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，高危型HPV(16、18)亚型与肾恶性肿瘤有关(其中肾乳头状癌的HPV(16、18)基因阳性率明显高于肾透明细胞癌和肾颗粒癌)，证实了高危型HPV感染是肾癌的重要致癌原因，有资料证明了食管鳞癌与E6癌基因蛋白的关系。低危型HPV与某些性病有关，包括生殖器疱疹、尖锐湿疣以及宫颈糜烂、慢性宫颈炎等，其中HPV6和11是最常见的低危型HPV，90％的生殖道尖锐湿疣与之有关。目前抑制人乳头瘤病毒及治疗人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤和采用人用狂犬病纯化疫苗治疗性病的外用剂型及制备方法还尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗人乳头瘤病毒及治疗人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤和性病的喷剂及其制备方法，采用本发明除对肿瘤具有明显的治疗作用、无毒副作用外，本发明喷剂可保存人用狂犬病纯化疫苗的生物活性并对人体没有造成任何负面损伤，使局部用药成为可能，本发明所说的局部用药均指的是直接往感染病患处用药。

本发明技术方案如下：

本发明喷剂的制备方法：

本发明的成份为1ml的人用狂犬病纯化疫苗，加为0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液至10ml制成，其中所述0.005～0.015g/ml壳聚糖-醋酸为：10g壳聚糖及1000ml醋酸溶液。

制备人用狂犬病纯化疫苗的病毒株为但不限于狂犬病毒PM株、PV株、CTN株或AG株。

用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂的制备方法，按如下步骤操作：

首先，配制壳聚糖-醋酸溶液：

1)制备0.3～1.0％醋酸溶液：将冰醋酸3～10体积份加入至1000体积份容量瓶中，加纯水至刻度，得到体积百分浓度为0.3～1％的醋酸溶液；

2)制备壳聚糖-醋酸溶液：称取壳聚糖10～30g加入至1000ml容量瓶中，加上述的醋酸溶液，完全溶解至刻度，制成0.01～0.03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液；

3)根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.1mol/L的醋酸溶液调节pH至3.8～5.0；

其次，配制疫苗溶液

取活性单位为5IU～20IU的人用狂犬病纯化疫苗1ml，加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml，获得活性浓度为5IU～20IU/10ml的疫苗溶液，根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.1mol/L的醋酸溶液调节pH至3.8～5.0，优选pH值为4.9～5.0。

其中所述人用狂犬病纯化疫苗可以为溶液型或冻干型。

其中所述冰醋酸采用分析纯或化学纯。

其中所述纯水采用重蒸馏水。

本发明的喷剂用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的宫颈癌、人乳头瘤病毒感染引起的生殖器疱疹或生殖器尖锐湿疣、人乳头瘤病毒感染引起宫颈糜烂、人乳头瘤病毒感染引起的慢性宫颈炎。

本发明的喷剂为外用剂型。

本发明具有如下有益效果：

1.使用带有正离子并能在酸性条件下可完全溶解的壳聚糖作为粘附剂，使人用狂犬病纯化疫苗完全溶解，并使本发明的喷剂喷出之后具有好的气雾性，从而使药物喷出后均匀覆盖于病灶粘膜表层，有利于机体对药物的吸收。

2.本发明外用喷剂及制备方法着重对由HPV感染引起的宫颈癌患者、生殖器疱疹和尖锐湿疣患者、宫颈糜烂、慢性宫颈炎，HPV感染人群进行跟踪治疗(Tc亚群检测、HPV检测及临床症状的改善)，均取得良好的临床效果。

3.采用本发明主要成分为人用狂犬病纯化疫苗，通过对人宫颈癌Hela人源性肿瘤细胞的体外MTT法检测实验证明本发明主要成份人用狂犬病纯化疫苗对肿瘤细胞的直接杀伤作用。通过裸鼠移植性肿瘤抑瘤实验得知：主要成份人用狂犬病纯化疫苗局部注射对裸鼠异种移植瘤人宫颈癌Hela肿瘤生长显示明显抑制作用。本发明在对机体免疫调节作用中使小鼠单核细胞、腹腔吞噬细胞的吞噬能力增强，说明对网状内皮系统吞噬功能具有明显的激活、增强作用。所以本发明发现人用狂犬病疫苗可诱发机体产生强有力的免疫反应，HPV感染者经系统治疗后(未经其它治疗途径)，HPV检测阳转阴。

4.本发明的毒理实验证明：该外用剂和皮肤重复接触中致敏反应强度为弱致敏性。小鼠以及家兔急性毒性实验未见明显毒性反应。小鼠微核实验结果表明：小鼠肌肉注射给药＜375U+25mg/kg剂量下未诱发骨髓嗜多染红细胞微核率的增高。

5.在本发明阴道刺激试验中，通过则定家兔或大鼠连续阴道给药后未见明显血管充血和水肿等异常改变。多次给药刺激试验也证明本发明外用剂对实验动物阴道黏膜无明显刺激反应。

6.在对家兔连续给药12周长期毒性试验中，确定出无毒性反应的用药剂量，为临床人用剂量提供了参考。

附图说明

图1本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela细胞周期分布的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，本发明并不受这些实施例的限制。

制剂实施例1

本发明喷剂成分：

按体积比计，成份为1ml的人用狂犬病纯化疫苗，加质量体积浓度为0.01g/ml壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。

具体配备方法如下：

1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH＝3.2)

(1)制备0.3％的醋酸溶液：将冰醋酸3ml(分析纯)加入至1000ml容量瓶中，加纯水至刻度，这里的纯水采用重蒸馏水，得到体积百分浓度为0.3％的醋酸溶液；

(2)制备质量体积浓度为0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液：称取壳聚糖10g加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液；

(3)根据壳聚糖-醋酸溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或者体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至3.2。

2.疫苗溶液配制

取活性单位为5IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗1ml(本实施例采用两支，每支0.5ml，2.5IU)溶液加入至10ml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗制备病毒株采用狂犬病毒PM株，加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得活性浓度为5IU/10ml的疫苗溶液。根据疫苗溶液的pH值选用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至3.2，溶液具有澄明度。

说明：pH值保持在3.8到5.0之间，如pH值超过5.0或低于3.8壳聚糖与醋酸脱离，溶液变成不透明状，成份发生了改变，在使用时，喷出的溶液将不呈现雾状。

制剂实施例2

与实施例1不同之处在于：

1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH＝4.9)：

制备0.4％的醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为(化学纯)；用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或者体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至4.9。

制备质量体积浓度为0.02g/ml的壳聚糖-醋酸溶液：称取壳聚糖20g加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0.02g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

2.疫苗溶液配制

取活性单位为15IU的冻干型人用狂犬病纯化疫苗1ml(本实施例采用两支，每支0.5ml，7.5IU)加入至10ml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒PV株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得活性浓度为15IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至4.9，溶液具有澄明度。

制剂实施例3

与实施例1不同之处在于：

1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH＝5.0)：

制备1.0％醋酸溶液采用的冰醋酸10ml为化学纯；用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH至5.0。

制备质量体积浓度为0.03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液：称取壳聚糖30g加入至上述的醋酸溶液完全溶解至1000ml，溶液不允许出现不溶性颗粒或不溶物，制成质量体积浓度为0.03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

2.疫苗溶液配制

取活性单位为10IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗1ml(本实施例采用两支，每支0.5ml，5IU)溶液加入至10ml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒CTN株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为10IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至5.0，溶液具有澄明度。

制剂实施例4

与实施例1不同之处在于：

1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH＝4.2)：

制备0.4％醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为化学纯；用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH至4.2。

2.疫苗溶液配制

取活性单位为20IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗1ml(本实施例采用两支，每支0.5ml，10IU)溶液加入至10ml量瓶中，其中人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒AG株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为20IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至4.2，溶液具有澄明度。

制剂实施例5

与实施例1不同之处在于：

1.配制壳聚糖-醋酸溶液(pH＝4.9)：

制备0.4％醋酸溶液采用的冰醋酸4ml为化学纯；用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH至4.9。

2.疫苗溶液配制

取活性单位15IU的溶液型人用狂犬病纯化疫苗1ml(本实施例采用两支，每支0.5ml，7.5IU)溶液加入至10ml量瓶中，人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为狂犬病毒PM株。加壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml。获得浓度为15IU/10ml的疫苗溶液。用体积摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液或体积摩尔浓度为0.1mol/L的醋酸溶液调节pH值至4.9，溶液具有澄明度。

病情治疗案例一：孙某某

病理诊断：宫颈鳞癌前变，CINII；经宫颈椎切术后，HPV阳性，干扰素针剂注射及干扰素药膏局部用药治疗2个月，HPV依然阳性。

具体临床用量：取制剂实施例4中活性浓度为20IU/10ml经本发明喷剂局部用药，每日4次，一次一喷(140μl)，用药45天，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

病情治疗案例二：周某某

病理诊断：宫颈鳞癌，II期B；术后化疗两个周期，HPV检测为阳性。

具体临床用量：取制剂实施例5中活性浓度为15IU/10ml的本发明喷剂外用，每日4次，一次一喷(140μl)，20天为一个疗程，共两个疗程，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

病情治疗案例三：安某

临床诊断：生殖器疱疹，HPV阳性；

具体临床用量：取制剂实施例3中活性浓度为10IU/10ml的本发明喷剂外用，每日4次，一次一喷(140μl)，20天为一个疗程，共三个疗程，停药后疱疹消失，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

病情治疗案例四：田某某

临床诊断：生殖器尖锐湿疣，HPV阳性；

具体临床用量：取制剂实施例4中活性浓度为20IU/10ml的本发明喷剂外用，每日6次，一次一喷(140μl)，20天为一个疗程，共四个疗程，停药后疣体干瘪部分脱落，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

病情治疗案例四：许某某

临床诊断：宫颈糜烂，HPV阳性；

具体临床用量：取制剂实施例1中活性浓度为5IU/10ml的本发明喷剂外用，每日6次，一次一喷(140μl)，20天为一个疗程，共四个疗程，停药后检查宫颈粘膜恢复正常，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

病情治疗案例四：白某

临床诊断：慢性宫颈炎，HPV阳性；

具体临床用量：取制剂实施例2中活性浓度为15IU/10ml的本发明喷剂外用，每日6次，一次一喷(140μl)，30天为一个疗程，共四个疗程，停药后炎症消失，停药20天后做HPV检测，结果显示为阳转阴。

实验实施例

本发明对肿瘤细胞的起到直接杀伤的作用通过如下实验可以得到进一步了解。

实验实施例1

对人源性肿瘤细胞的体外MTT法检测实验

实验试剂与药品：

本发明外用喷剂，根据实际需要选用不同的活性浓度。

阳性对照药：氟尿嘧啶注射液，批号050806，为上海旭东海普药业有限公司产品。

细胞株：

Hela(人宫颈癌细胞)由中国医科院药物研究所培养传代。

仪器：BIORAD 550型酶标仪

实验方法：四氮唑盐

[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT]还原法。

收集生长良好的肿瘤细胞，于96孔培养板内接种，培养24小时后加药。受试样品培养4天。用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长405nm下测定个孔的吸光度(OD)值。实验数据经处理得到半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果显示：本发明所采用的主要成分为人用狂犬病纯化疫苗对HelaIC₅₀＜0.1IU/ml。表明了本发明主要成份为人用狂犬病纯化疫苗对人源癌细胞均有体外增殖抑制作用。

实验实施例2

利用流式细胞仪对人宫颈癌Hela细胞周期分布产生影响的测试。

实验试剂与药品：本发明疫苗溶液，根据实际需要选用不同的活性浓度。

细胞株：

采用实验实施例中的Hela细胞。

结果提示：人用狂犬病疫苗对人宫颈癌Hela细胞周期分布产生影响，人用狂犬病纯化疫苗可使人宫颈癌细胞周期阻滞于G2/M期，提示人用狂犬病纯化疫苗对肿瘤增殖抑制作用与诱导肿瘤细胞周期阻滞有关，参见图1。药物可通过诱导G2/M期周期阻滞抑制肿瘤细胞增殖(图谱的第二个峰为周期阻滞抑制峰)。

实验实施例3

本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植瘤生长抑制作用。

受试药物：制剂实施例1中疫苗溶液，活性单位为5IU/ml。

实验材料：

1.裸鼠，北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2007-0001。

2.人宫颈癌细胞株Hela，自体外培养细胞接种于裸鼠成瘤。发明人传代保存。

3.饲养小鼠颗粒料，由沈阳实验动物颗粒饲料厂提供。

4.对照药：阿霉素批号：060303B，提供单位：浙江海正药业股份有限公司，用生理药水稀释0.1mg/ml备用。

实验方法：

选择肿瘤生长良好的荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成直径2-3mm的瘤块，套管针接种于裸鼠腋部皮下。7天后可见肿瘤生长。用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，按瘤体积大小分层分组。每组7只动物。设阴性对照组(不给药)，本发明疫苗溶液0.2ml肿瘤局部给药1组，本发明疫苗溶液0.1ml肿瘤局部给药加0.1ml肌肉注射给药1组，本发明疫苗溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml肌肉注射给药各1组。阿霉素5mg/kg腹腔注射给药作为阳性对照。自分组当日开始给药，每日1次，给药20天。给药后，每周2～3次对实验动物肿瘤的长、宽径及体重进行测量记录，观察动物肿瘤生长及一般情况。20天之后将动物处死后剥离肿瘤，称瘤重，计算药物对肿瘤生长抑制率。计算肿瘤体积(TV)及相对肿瘤体积(RTV)，比较各组动物肿瘤重量、肿瘤体积、相对肿瘤体积(RTV)等指标的统计学差别(见表1与表2)。

解组织肉眼可见：肿瘤周围轻度水肿，瘤组织块体积小，表面有破溃或结痂。剥离肿瘤见肿瘤壁薄，内容物为黄绿色豆渣样。肌肉给药改局部注射组的肿瘤则可见肿瘤包膜薄，瘤组织整体泛黄色，瘤组织质软，无张力。

结论：在实验选用的剂量范围内，本发明所采用的主要成份人用狂犬病纯化疫苗局部给药和局部肌肉注射给药对裸鼠异种移植瘤人宫颈癌Hela肿瘤生长显示明显抑制作用。

表1本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植瘤体重抑制作用

注：与阴性对照组相比，P＜0.05

表2本发明疫苗溶液对人宫颈癌Hela裸鼠异种移植瘤体积抑制作用

注：与阴性对照组相比，P＜0.05

实验实施例4

本发明研究了药物对荷瘤小鼠免疫指标的调节作用、增效解毒作用，对放化疗损伤修复的调节作用及预防作用。

1.小鼠单核吞噬细胞功能的实验结果；用药后小鼠单核吞噬细胞功能明显提高，吞噬指数与吞噬活性分别为0.3480和8.2870。其研究结果经数据处理具有显著性差异，组间比较P＜0.1。

2.用药后使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率达35.02％，吞噬指数亦明显提高，达1.02，还可增加吞噬细胞消化功能；使血清半数溶血值增加，对化疗后抗体形成有较强的调节作用(免疫功能的调节作用)。

3.可迅速回升外周血白细胞总数达正常水平、用药后可使白细胞在7-10天回升至正常水平(解毒作用)。

4.荷瘤小鼠单用药物抑瘤率为39.03％，如与化疗并用，可达59.53％(增效作用)。

5.用药后可增强小鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的活性，SOD水平为662.97ug/ml。化疗时并用为452.69ug/ml，高于对照组，与正常对照组相当(抗氧化作用)。

6.对辐射损伤的修复也较明显，如照射后动物开始出现死亡较晚，出现头部皮肤及粘膜损伤较轻，而对照组损伤较重，头面部皮肤、粘膜溃疡严重，大部脱毛并伴有腹泻等症状。实验组小鼠骨髓微核率未见明显升高。而且30天存活率为82.07％，平均月生存时间为24.62天，均高于对照组(放化疗损伤修复的调节作用)。

7.药物可延长小鼠游泳时间达75％，明显增强耐力(预防作用)。

结果提示，通过免疫和抗氧化等动物实验，可对免疫功能产生了明显的抑制作用，使抗体的形成有所提高，促进吞噬细胞的趋化、黏附作用，促进细胞内活性物质的释放，进而促进吞噬和消化功能。

实验实施例5

毒理实验：

以下试验均按照<新药临床前抗肿瘤药指导原则>和<第三届全国肿瘤药理及化疗会议制定方案>进行。

一.皮肤过敏试验：

受试药物：根据本发明制备方法制成活性单位：10IU/ml外用喷剂。

实验材料：

1.受试动物：豚鼠，雌、雄各半，体重250-300g，实验动物使用许可证号：SCXK(辽)2003-0011，由沈阳市于洪区前民养殖场提供。

2.对照药：

1)阳性对照药：2，4-二硝基氯代苯(批号：20070622)天津市津科精细化工研究所提供；用生理盐水稀释为体积浓度为1％与0.1％，待用。

2)赋形剂组：0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

实验方法：

取豚鼠30只，雌雄各半，每组10只，用8％硫化钠脱背部毛，每侧脱毛面积约为3×3cm²，将三组动物左侧脱毛区分别涂敷0.2ml赋形剂、本发明疫苗溶液和体积浓度为1％2，4-二硝基氯代苯，给药后固定6小时，于给药后第7、14天重复上述给药过程，于末次给药14天后重复上述给药过程，给药部位为右侧脱毛区，阳性对照药物体积浓度改为0.1％。6小时洗掉药物，即刻观察，然后于24、48、72小时再次观察皮肤过敏反应。)

结果：给药组和赋形剂组对豚鼠给药处接触处皮肤无红斑或水肿形成，2，4-二硝基氯代苯反应强度为极度致敏性。

结论：采用本发明外用喷剂和皮肤重复接触，未发现对受试动物皮肤引起明显过敏反应。致敏反应强度为弱致敏性。

二.小鼠微核实验：

了解本发明主要成份人用纯化狂犬疫苗是否存在引起动物体内染色体畸变的遗传毒性。

受试药物：冻干型人用纯化狂犬疫苗和聚肌胞注射液的混合液体，冻干型人用纯化狂犬疫苗(批号20050802-4)，由辽宁成大生物技术有限公司提供；聚肌胞注射液(生产批号060418)，2mg/2ml，由浙江万马药业有限公司提供。聚肌胞注射液2.0ml溶解冻干人用纯化狂犬疫苗30IU/12ml，其最大溶解浓度为15IU+1mg/ml。

实验材料：

1.受试动物：小鼠，雄、雌各半，体重22-24g，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2006-0004号，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

2.对照药

阳性对照药：环磷酰胺(批号06071721)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，购于北京医院药房。用注射用水配制成浓度为2mg/ml的溶液。

实验方法：

受试药物按最大溶解浓度((15IU+1mg)/ml)和最大给药容积(0.5ml/20g)作为高剂量，共设三个剂量组((375IU+25m)/kg、(125IU+8mg)/kg和(42IU+3mg)/kg)，每组10只小鼠，小鼠颈背部肌肉注射给药，第1次给药后24小时进行第2次给药，给药6小时后，脱颈椎处死小鼠，常规取股骨骨髓，涂片，计数100个嗜多染红细胞(P)与正染红细胞(N)的比例。)

结果：受试药物各剂量组的微核率均＜1.9‰；阳性对照组的微核率＞29.0‰。

结果表明：小鼠肌肉注射给药＜375IU+25mg/kg剂量下未诱发骨髓嗜多染红细胞微核率的增高。提示：本发明主要成份人用纯化狂犬疫苗在试验剂量范围内，小鼠微核实验为阴性结果。

三.小鼠急性毒性实验：

受试药物：冻干型人用狂犬病纯化疫苗(批号20050802-4)，由辽宁成大生物技术有限公司提供。实验前用注射用水溶解为活性浓度为15IU/ml。

实验材料：

小鼠，雄、雌各半，体重19-21g，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2006-0004号，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

实验方法：

1)静脉注射最大给药量的测定：小鼠受试药物按活性单位(15IU/ml)和最大给药容积(0.5ml/20g)，1日内2次静脉注射给药，连续给药14日，未见明显毒性反应。其最大给药量为750IU+50mg/kg，相当于临床人肌肉注射拟用量的(体重按60kg计算)20833倍。

2)皮下注射最大给药量的测定：小鼠受试药物活性单位(15IU/ml)、最大给药容积(0.5ml/20g)，一日内2次肌肉注射给药，连续给药14日，未见明显毒性反应。其最大给药量为750IU+50mg/kg，相当于临床人肌肉注射拟用量的(体重按60kg计算)20833倍。)

结论：小鼠急性毒性实验表明，本发明外用喷剂的毒副作用小。

四.家兔急性毒性实验：

受试药物：采用本发明所制成的活性单位为10IU/ml的外用喷剂。

赋形剂：0.02g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

实验材料：雌性家兔，体重2.1-2.5kg，合格证号：SCXK[辽]2003-011号，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

实验方法：

取家兔12只分为给药组和对照组，每组6只，给药组动物经阴道给予10IU/ml浓度受试药物，给药容积为1ml/kg，给药剂量为10IU/kg(为临床人用剂量1786倍，按女性成人50kg计算)，对照组动物经阴道给予等容积赋形剂。给药后正常饲养并观察动物的一般状况，并记录死亡情况，连续观察14天，并于给药后第4、7、11、14天称重一次。完毕，处死动物，系统尸检观察主要脏器有无改变。)

实验结果：

家兔阴道给予本发明喷剂或赋形剂后，即刻观察未见有异常体征及死亡动物出现。连续观察14天，家兔体重正常增长，未见毛发、呼吸、四肢、皮肤和行为等方面有异常改变，也未见死亡动物出现。系统尸检主要脏器未见肉眼可见的病理改变。

结论：对家兔阴道局部给药的急性毒性实验结果表明，本发明喷剂对家兔阴道局部给药的最大给药量为10IU/kg(为临床人用剂量1786倍，按女性成人50kg计算)，本发明外用喷剂的毒副作用小。

五阴道刺激试验

考察本发明外用喷剂对实验动物阴道黏膜的刺激作用和强度，为临床应用提供安全性评价依据。

测定家兔连续阴道给药后对阴道粘膜局部的刺激反应。

受试药物：采用本发明所制成的活性单位为1IU/ml的外用喷剂。

对照组药物：0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

实验材料：

受试动物：雌性家兔，体重2.0kg～2.5kg，合格证号：SCXK[辽]2003-011号，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

实验方法：

1单次给药刺激试验：

取家兔6只，分为对照组组和给药组，每组3只，直接用注射器缓慢注入2ml壳聚糖-醋酸溶液或本发明外用喷剂于家兔阴道内，给药后24小时后各组分别处死动物，纵向切开阴道，肉眼观察有无水肿，血管充血后，作病理组织学检查。

2多次给药刺激试验

取家兔6只，分为对照组组和给药组，每组3只，直接用注射器缓慢注入2ml壳聚糖-醋酸溶液或本发明外用喷剂于家兔阴道内，每天1次，共7天，末次给药后24小时后各组分别处死动物，纵向切开阴道，肉眼观察有无水肿，血管充血后，作病理组织学检查。

实验结果：

1)单次给药刺激试验：

采用本发明外用喷剂，单次给药后24h阴道组织肉眼观察结果：壳聚糖-醋酸溶液对照组与本发明外用喷剂给药组动物阴道组织表面光滑，未见明显血管充血和水肿等异常改变。

2)多次给药刺激试验：

壳聚糖-醋酸溶液对照组的动物阴道组织表面光滑，1只可见极少充血；

本发明外用喷剂给药组的动物阴道组织表面光滑，2只可见极少充血；

结论：采用本发明外用喷剂对实验动物阴道黏膜无明显刺激反应。

六.对家兔连续给药12周长期毒性试验

观察家兔阴道局部给予本发明外用喷剂12周由于蓄积产生的毒性反应及其严重程度，提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒性反应剂量，为临床人用剂量提供参考。

实验材料：

1.受试动物：雌性家兔，体重2.0kg～2.5kg，合格证号：SCXK[辽]2003-011号，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

2.对照组：0.01g/ml的壳聚糖-醋酸溶液。

实验方法：

取雌性家兔，设高、低二个剂量组和一个对照组，剂量组分别为1、0.3IU/kg，分别相当于临床人用剂量的179和54倍(按女性成人体重为50kg计算)，直接用注射器缓慢注入壳聚糖-醋酸溶液或本发明喷剂于家兔阴道内，每天给药1次，一次给药按家兔体重计，每千克体重给药容积为1ml，连续给药12周，作病理组织学检查。

实验结果：剂量组、对照组作病理组织学检查，各项检查指标在给药6周、12周后均未见异常，动物整体发育良好。在实验期间动物被毛光泽，自发活动正常，体重增长正常。血象检查，肝、肾功能等生化检查及主要脏器病理组织学检查均未见异常变化。主要器官组织学检查未见病理性变化，停药2周后进行恢复性观察，对照组、剂量组各项指标仍无异常改变。。

结论：本发明外用喷剂未见明显毒性作用，无蓄积性或延迟性毒性，长期连续用药安全性较好。

临床治疗过程中，发现本发明外用喷剂所采用的主要成份人用狂犬病纯化疫苗可诱发机体产生强有力的免疫反应，患者经系统治疗后，T-细胞亚群检测前，后对比有明显好转，HPV阳性病毒携带者经一疗程给药后，未经其它治疗途径，HPV检测转阴，可用于人乳头瘤病毒感染引起的宫颈癌、生殖器疱疹、生殖器尖锐湿疣、宫颈糜烂和慢性宫颈炎的治疗。

Claims

1.一种人用狂犬病纯化疫苗在制备用于治疗人乳头瘤病毒感染引起的疾病的喷剂中的应用，其特征在于：所述喷剂成份为1ml的人用狂犬病纯化疫苗，加0.01～0.03g/ml的壳聚糖-醋酸溶液稀释至10ml而制成，所述疾病为生殖器疱疹或生殖器尖锐湿疣、宫颈糜烂或慢性宫颈炎。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述人用狂犬病纯化疫苗的制备病毒株为但不限于狂犬病毒PM株、PV株、CTN株或AG株。