CN101328219B

CN101328219B - 纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY及其组合制剂

Info

Publication number: CN101328219B
Application number: CN200810068439.2A
Authority: CN
Inventors: 包晟
Original assignee: SHENZHEN YACHEN BIOTECHNOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shenzhen elegant intelligent biological engineering Co., Ltd.
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2008-07-09
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2028-07-09
Also published as: CN101328219A

Abstract

本发明涉及一种纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY及其组合制剂。优选产蛋禽类，分别制备瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原和基因重组蛋白抗原以及细菌病毒复合抗原免疫产蛋禽类，亲和层析纯化抗人乳头瘤病毒特异性IgY和抗妇科炎症病原体特异性IgY，并将其纳米脂质体化，制得纳米脂质体特异性复合IgY。其有益效果是：应用纳米脂质体技术，增加渗透能力和延效作用，提高疗效。可制成各种阴道或其它喷雾剂、洗液、凝胶剂、胶囊、栓剂、阴道膜、片剂和泡腾片以及软膏、霜剂等。纳米脂质体复合IgY能渗入阴道粘膜层有效清除吸附在阴道表层和粘膜内的HPV病毒和妇科炎症病原体，并经阴道粘膜吸收进入体内发挥预防和治疗作用，还可有效防止复发。

Description

纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY及其组合制剂

技术领域

本发明涉及医疗卫生技术领域，尤其涉及到一种纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY以及含这种纳米脂质体复合IgY的组合制剂。

背景技术

目前宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，每年约有50万新发病例，25万人死亡，是引起妇女死亡的第二大原因，其中大部分在发展中国家，占80％左右。现代医学在大量试验研究的基础上，已证实子宫颈癌源自一种人乳头瘤病毒(HPV)，这是目前人类所有癌症中唯一一个病因明确的癌症。

大量检测资料显示，HPV感染在18～28岁之间的青年人中最常见。可以说，所有在性生活上活跃的人，50％以上会在其一生中的某个时刻发生生殖器HPV感染。而比例高达80％的绝大多数妇女，在50岁之前有过HPV感染。世界卫生组织的统计数字表明，全球被感染总数约达到6.3亿人之多，占人口总数10％，其中女性占绝大多数；这是一个令人触目惊心的大数字。

比较麻烦的是，多数HPV感染没有体征和症状，但是病毒却可以通过性生活传染，这就增加了这种病毒广泛传播的危险性。所以，一般说来，如16岁前过早就有性生活的人，自己或配偶有多个性伴侣的人，都是HPV的高危人群。此外，无论何种原因导致免疫力处于低下状况的人，也都属于HPV病毒的易感者，如多孕早产的妇女、HIV病毒(艾滋病毒)感染者、器官移植者或化疗患者，以及吸烟、吸毒和营养不良的妇女等。

不过，迄今为止，医药界还没有开发出用于治疗HPV感染的抗病毒药物，抗生素和其它杀菌药、消毒药对HPV病毒完全没有作用。目前，除了美国刚刚推出进行临床试验的一种疫苗作为预防用外，还没有可用于治疗HPV感染的药物；对已经发生的HPV感染更没有任何根除方法，现有的治标方法仅为去除外生的疣体；而且，各种暂时的处置手段均有复发的可能。一旦受到高危类型HPV病毒感染，最终往往会发展成为癌症。虽然美国已经研发出HPV疫苗，不过经大量的临床试验证明，仅仅没有感染过HPV病毒的人，经过3针免疫注射，预防HPV病毒感染的效果可以达到100％；但是，绝大多数妇女，在50岁之前都曾受到HPV病毒感染，另外HPV疫苗对HPV病毒感染只有预防作用，并没有治疗作用，对于已受到HPV病毒感染的人注射这种疫苗是无能为力的。更何况，要求每个女性特别是年青健康的青少年在未受到感染前都一律要强制注射这种疫苗也不太现实；而且，现在也还没有足够证据表明这种疫苗可使注射者获得终身免疫。

目前的现状是：1.临床上尚无预防HPV病毒感染的措施；2.对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果不理想；3.宫颈癌的复发率较高，治疗费用又相当高；4.现有疫苗存在许多缺陷。

另外，妇科感染也是危害女士健康的一种常见病，多发病。在健康女性中检查中，往往有将近半数的人检查出患有轻重不同的妇科感染疾病。而且，女性一旦受到HPV病毒感染，就很容易发生各种妇科炎症继发感染；而妇科炎症继发感染又反过来加剧HPV病毒感染的病情。目前，世界各地的女士普遍采用抗生素或其它各种化学药剂来治疗这类感染性疾病。可是，当人们服用抗生素或者用普通洗液、杀菌泡腾片、栓剂清洁阴道时，会把女士阴道内的乳酸杆菌等有益菌也一道杀灭；从而，破坏阴道中起天然屏障作用的菌群生态平衡，造成各种病原体乘机大量繁殖；结果，使不少女性因没有能根治的药物而终生受各种妇科感染和HPV病毒感染的困扰。

因此，寻找一种可同时对抗HPV病毒感染和妇科炎症，既可预防又具有治疗作用的新药，是世界各国千百万女性的迫切需求，也是摆在国际医学科学界面前的一项重要课题。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足所要解决的技术问题是：提供乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)基因表达蛋白两种方法，分别用乳头瘤瘤体细胞蛋白和基因工程重组HPV病毒L1、L2基因表达蛋白制作抗原，用淘汰法选择高免疫应答产蛋禽类，以免疫激活方法免疫产蛋禽类，制成高活性抗HPV特异性IgY，以被动免疫的方式弥补现有注射疫苗方法之不足；同时，应用纳米脂质体技术将所制得的抗HPV特异性IgY超微囊化，增加渗透能力和延效作用，提高实际疗效。另外，本发明还制备一种纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY，并将其与纳米脂质体抗HPV特异性IgY复合成纳米脂质体抗HPV及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY。这种纳米脂质体化的抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY具有很强的渗透能力和延效作用，会渗透阴道粘膜并进入体内抑灭人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体；完全可用于治疗和辅助治疗HPV病毒感染以及妇科多种病毒和致病菌混合感染。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一.制备抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY

1筛选引致女性生殖器疣和宫颈瘤的有代表性的几种人乳头瘤病毒。

HPV病毒是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链死循环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的E6、E7蛋白引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV病毒的衣壳。

根据流行病学调查，人乳头瘤病毒(HPV)是一个大家族，共有100多型，约30型可以引起男女生殖器部位的持续感染。HPV6、11为低危型，而HPV31、33、35、39、51、52和58为中危型，HPV16、18、45和56为高危型。低危类型的HPV病毒可引起生殖器疣的形成，即在生殖器表面或周围出现肉质的非癌变的生长物，6型和11型感染造成的生殖器疣占所有病例的90％。高危类型的HPV病毒有16、18、31和45型及其它型，感染如果长期存在，会导致宫颈癌和阴道癌以及外阴癌等，其中16和18型感染导致的宫颈癌占70％左右。因此本发明选择6、11、16、18、31和45型六种型作为有代表性的病原体。

2.制备免疫用抗原。

本发明采用以下两种方法制作免疫用抗原：

2.1乳头瘤瘤体细胞蛋白

2.1.1把从患者体内切割的乳头瘤瘤体组织置入“组织捣碎匀浆机”中，用8000-12000rpm高速捣碎匀化，得到含乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白悬浮浆液。

乳头瘤瘤体组织经过“组织捣碎匀浆机”高速捣碎匀化后，其中的瘤体细胞和人乳头瘤病毒(HPV)就都以蛋白形式存在于所制成的蛋白悬浮浆液中。根据本发明人的试验，以这两种成份作为抗原免疫产蛋禽类，除了可得到抗人乳头瘤病毒(HPV)的抗体外，还可获得抗人乳头瘤的抗体。因此，本发明没有必要从乳头瘤瘤体组织中分离人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。这也是本发明的新颖和独创之处。

2.1.2制备免疫用抗原：

将所制得的含乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白悬浮浆液以1-10∶1-10的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原。

2.2基因工程表达蛋白

根据对HPV病毒结构的基因分析，HPV中的L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV病毒的衣壳。因此，选择L1和L2作为有代表性的共同抗原决定簇成份，应用基因工程技术重组HPV病毒L1、L2基因表达蛋白，并将这种重组基因表达蛋白作为抗原成份。如果只选择L1或者只选择L2，都将影响所制备的抗体的功效。

具体实施方法如下：

2.2.1应用基因工程技术制作抗原成份

用RT-PCR方法从HPV病毒RNA克隆HPV.L1、L2基因，去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及Sephacry1 S-200和Sephacry1 S-100柱层析后，即获得纯化的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份。

2.2.2制备免疫用抗原：

将所制得的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份以1-10∶1-10的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原。

3.制备含高活性抗体的免疫蛋

本发明可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。

首先采用淘汰法选择产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟等)，再用所制备的抗原免疫所选择的禽类获得免疫蛋。现以产蛋母鸡为代表说明如下：

3.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

3.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上叙制得的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

3.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到300只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗HPV特异性IgY浓缩液体。

3.1.3分别以6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗HPV特异性IgY浓缩液体中每批对6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒的抗体结合效价。

3.1.4将凡是对6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒的抗体结合效价达到1∶102,400以上的该批抗HPV特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.2免疫高免疫应答能力的正在产蛋母鸡

将所选择的具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，分别采用乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原和HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检免疫蛋按不同抗原进行编码登记。

4.抗HPV特异性IgY粗品的制备：

将所获得的两种高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用UltiporVFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得两种抗HPV特异性IgY粗品。

5.抗HPV特异性IgY纯品制备

将所制得的两种抗HPV特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得两种高活性的抗HPV特异性纯IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求，根本不能用于对HPV病毒感染的预防，更不可能用于治疗。

将所制得的两种抗特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得两种抗HPV特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的两种抗HPV特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98％以上。

6.取所制得的两种抗HPV特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的两种纳米化抗HPV特异性IgY纯品干粉。

7.分别将以上所制得的两种纳米化抗HPV特异性IgY纯品制成脂质体液晶微囊。具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再分别将两种纳米化抗HPV特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得两种抗HPV特异性IgY脂质体。

8.分别以6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒以及未作为免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测以上所制得的两种抗HPV特异性IgY脂质体对6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒的抗体结合效价都高达1∶102,400以上。对未作为免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒的抗体结合效价也可达1∶25,600以上；这就证实了本发明所采取的两种特殊的抗原制作方法以及选择高应答能力免疫鸡种的方法和免疫激活措施，对提高免疫原性和增强抗原交叉性是确切有效的。

这是一般的常规免疫方法所做不到的，这样高的生物活性和抗原交叉性才有可能对多种不同型的HPV病毒引致的女性生殖器感染都有确切功效，也才真正具有实际应用的价值。

二.制备脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY

1.筛选引致阴道炎症的有代表性的病毒和致病菌、原虫。

根据流行病学调查，引致阴道炎症的病原体主要有淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒。因此本发明选择淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为阴道炎有代表性的病原体。

2.制备免疫用抗原。

2.1培养病原体

与“江西省微生物研究所合作从阴道炎患者体内摄取淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒，并采用常规方法培养这些病原菌、毛滴虫和疱疹病毒。

2.2制备复合抗原：

先将所制得的四种致病菌和毛滴虫按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例(通常按1∶1∶1∶1∶1)混合并用常规方法粉碎，然后以5∶1的比例与疱疹病毒提纯液混合，并置入“组织捣碎匀浆机”中以8000-12000rpm充分捣碎搅拌均匀。然后将这种细菌病毒蛋白混合液以1-10∶1-10的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得细菌病毒蛋白复合抗原。

3.制备含高活性抗体的免疫蛋

首先采取与前叙相同方法选择产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟等)，再用所制备的抗原免疫所选择的禽类获得免疫蛋。现以产蛋母鸡为代表说明如下：

3.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

3.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只，并一一用数字进行编号标记。然后用上叙制得的细菌病毒蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

3.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到300只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗妇科炎症病原体特异性IgY浓缩液体。

3.1.3分别以淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗妇科炎症病原体特异性IgY浓缩液体中每批对淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒的抗体结合效价。

3.1.4将凡是对淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒的抗体结合效价达到1∶51,200以上的该批抗妇科炎症病原体特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.2免疫高免疫应答能力的正在产蛋母鸡

将所选择的具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用上叙制得的细菌病毒蛋白复合抗原进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。

4.抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品的制备：

分别将所产的高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品。

5.抗妇科炎症多种病原体特异性IgY纯品制备

将所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱以及亲和层析柱进行纯化，即得抗妇科炎症病原体特异性纯IgY；

将所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品或抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY粗制品干粉和抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量为98％以上。

6.分别以淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测以上所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗制品对这五种致病菌和疱疹病毒的抗体结合效价。对五种致病菌的抗体结合效价都高达1∶51,200以上，对疱疹病毒的抗体结合效价更高达1∶102,400以上，完全达到了医疗的要求。

7.取所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉。

8.将以上所制得的纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY制成脂质体液晶微囊。具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀释，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体。

三.制备抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体

分别将所制得的两种抗HPV特异性IgY脂质体按10-10∶1-10比例(通常以1∶1)与抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体混合，加入匀质机充分混合均匀，然后再用超声波进一步匀化，即制得两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体。

四.实际应用：

上述所制得的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体可以再加入其它化学药品成份或中药成份制成各种复方药品，用于预防和治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染以及妇科多种病毒和致病菌混合感染。

将上述两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体与各种化学药品、中药等配成的复方成份配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的溶剂，可制成各种阴道喷雾剂、阴道洗液等剂型，也可制成男士用喷雾剂等；或者配以99.99-80.0％的各种适宜的辅料制成各种临床可接受的剂型，如阴道凝胶剂、阴道软胶囊和硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂和泡腾片以及软膏、霜剂等，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。含抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体的洗液可供女士日常清洁阴部，有效消除人乳头瘤病毒(HPV)以及各种阴道致病菌和疱疹病毒的感染；其它各种剂型可直接置入阴道内，在阴道局部杀灭人乳头瘤病毒(HPV)以及各种阴道致病菌和疱疹病毒。

由于近年来，发现一些海藻蛋白具有杀灭HIV病毒和HPV病毒以及疱疹病毒的功效，特别是其中一种褐藻蛋白M对HPV病毒和疱疹病毒有相当强的杀灭作用；只要达到十万分之一的浓度就可有效杀灭HPV病毒和疱疹病毒。因此，本发明采用抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体和褐藻蛋白M组成复合物，再与各种化学药品、中药等配成复方成份并配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的溶剂，可制成各种阴道喷雾剂、阴道洗液等剂型，也可制成男士用喷雾剂等；或者配以99.99-80.0％的各种适宜的辅料制成各种临床可接受的剂型，如阴道凝胶剂、阴道软胶囊和硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂和泡腾片以及软膏、霜剂等，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。含抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体和褐藻蛋白M的洗液可供女士日常清洁阴部，有效消除人乳头瘤病毒(HPV)以及各种阴道致病菌和疱疹病毒的感染；其它各种含抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体和褐藻蛋白M的剂型可直接置入阴道内，在阴道局部杀灭人乳头瘤病毒(HPV)以及各种阴道致病菌和疱疹病毒。

本发明的有益效果是：由于本发明的特异性IgY脂质体具有更强的靶向性、延效性和表皮渗透性，显着提升了治疗指数，能更有效地渗透深入阴道粘膜层；因此，这种脂质体化的特异性IgY抗体纳米液晶微囊很容易通过阴道粘膜吸收，并通过阴道粘膜分布丰富的血管进入体内，达到局部治疗作用和经粘膜吸收发挥全身治疗作用相结合的效果，这是常规方法制备的一般抗人乳头瘤病毒(HPV)IgY所做不到的；另外，本发明不采用常规的从瘤体组织分离病毒蛋白的做法，而是直接采用经过“组织捣碎匀浆机”加工的“人乳头瘤瘤体细胞蛋白”制作抗原，其中既包含了瘤体细胞蛋白，又包含了人乳头瘤病毒蛋白；用这种复合蛋白浆液作为抗原成份免疫禽类，就可制成一种含抗人乳头瘤抗体成份的抗人乳头瘤病毒(HPV)复合抗体。含有这种复合抗体的抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体除了可有效抑灭人乳头瘤病毒(HPV)以及各种阴道致病菌和疱疹病毒外，还具有抑制肿瘤细胞的功效，以下的实施方案中的实验例4也证明了这一点。这也是本发明的一个重要突破。

根据最新的研究揭示，人乳头瘤病毒(HPV)病毒和疱疹病毒也可感染男士，是男性得口腔癌的主要原因。因此，本发明的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY也可制成一种口喷剂和外用清洁喷剂供男士使用，消除男士口腔中和下阴部可能感染的人乳头瘤病毒(HPV)和疱疹病毒；也可杜绝通过接吻、性接触等途径将人乳头瘤病毒(HPV)和疱疹病毒从男士身上传染给女士，这也是本发明的新颖性。

本发明利用脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY保护阴道局部粘膜细胞不受人乳头瘤病毒(HPV)以及妇科多种病毒和致病菌的侵染，这是阻断其感染的关键，对人乳头瘤病毒(HPV)和妇科多种病毒的吸附直接起到封闭作用，是本发明的抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体具有预防和治疗作用的机理之一。本发明的抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体还可对受感染者被侵染局部新释放的病毒进行中和，使其丧失再行扩散传播的能力，因而达到既可治疗又可防止人乳头瘤病毒(HPV)以及妇科多种病毒和致病菌通过性接触等途径传染的双重目的。这是其创新独到之处。

由于抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体及其各种组合制剂天然安全，无任何毒副作用，完全是从发病根源上有效杜绝人乳头瘤病毒(HPV)感染和其它各种妇科感染。它能专一杀灭病原体，保护乳酸杆菌等有益菌，维护阴道菌群生态平衡，形成天然抗菌抗病毒屏障，产生特殊的长效作用。既可用于平日随时随地预防，特别是可用于房事前后最直接、最及时的预防，抑灭阴道内的各种病原体；又可用于已受感染者的治疗，使用又十分简便。因此，它一方面可解决目前国际医药界还没有开发出用于治疗HPV感染和疱疹病毒感染的抗病毒药物，抗生素和其它杀菌药、消毒药对HPV病毒和疱疹病毒完全没有作用的问题；另一方面，它还解决了已经发生的HPV和疱疹病毒感染没有任何根除方法，各种暂时的处置手段均有复发的可能的难题。同时，本发明的相关组合制剂的问世，也在一定程度上克服了HPV疫苗使用不便，以及对HPV病毒感染只有远期预防作用，无法及时预防，更没有治疗作用，对疫苗靶抗原之外的其它许多型的人乳头瘤病毒(HPV)感染也没有保护作用的不足。

具体实施方式

本发明是这样实施的：

10.1实验例1：

两种抗HPV特异性IgY和抗妇科炎症病原体特异性IgY中的IgY含量检测

应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的两种抗HPV特异性IgY和抗妇科炎症病原体特异性IgY粗提物进行检测，结果含IgY45-52％。将这三种IgY粗提物经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示：

IgY纯品	纯IgY含量
		抗HPV特异性IgY-I纯品(人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原)	99.99％
抗HPV特异性IgY-II纯品(基因重组表达蛋白抗原)	99.99％
		抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品	99.99％

10.2实验例2：

检测两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体对有代表性的六种HPV病毒的抗体结合效价

分别以采用人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原和HPVL1、L2基因表达蛋白抗原的两种免疫抗原方案所制备的两种抗HPV特异性IgY和抗HPV特异性IgY脂质体，用6、11、16、18、31和45型六种型HPV病毒作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体的抗体效价。结果如下表：

从以上检测结果可看出，无论采取乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原或者采用HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原来免疫产蛋禽类，所制备的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体对直接作为抗原免疫的六种HPV病毒都有很高的抗体结合效价。其中“乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原”由于含有HPV病毒全蛋白，以其作为抗原免疫鸡，所制备的脂质体IgY效价更高。试验结果证明，本发明所采用的方法对提高所制备的IgY的抗体效价有十分理想的效果。

10.3实验例3：

检测两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体对未作为抗原免疫的其它型的HPV病毒的抗体结合效价。

分别采用“人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原”和HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原免疫所制备的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体，以未作为免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体的抗体效价。结果如下表：

从以上检测结果可看出，无论采取人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原或者采用HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原来免疫产蛋禽类，所制备的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体对没有作为抗原免疫的33、35、39、51、52、58、56型HPV病毒也有理想的抗体结合效价。其中“人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原”由于含有HPV病毒全蛋白，以其作为抗原免疫鸡，所制备的脂质体IgY效价相对更高。本试验结果进一步证明，本发明所采用的方法对提高所制备的IgY的抗体效价有十分理想的效果。

10.4实验例4：

采用经过“组织捣碎匀浆机”加工的“人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白”作为检测用抗原，使用“ELISA”方法检测以“人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原”免疫禽类所制得抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体的抗体效价。结果如下表：

IgY	抗原	抗体结合效价
			抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体-I(人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原)	人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白	1∶256

以上检测结果表明，由于“人乳头瘤细胞、病毒蛋白复合抗原”中包含有大量的肿瘤细胞蛋白成份，以其作抗原免疫母鸡，所制得的抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体将包含有抗肿瘤的抗体成份。把这种含抗肿瘤的抗体成份的IgY脂质体用于人乳头瘤病毒(HPV)感染的患者身上，除了可以抑灭人乳头瘤病毒(HPV)之外，还具有抑制肿瘤细胞的作用。

10.5实验例5：

检测抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体对有代表性的几种妇科炎症病原体的抗体结合效价。

把抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体，分别以淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY的抗体结合效价。结果如下表：

11.实施例

11.1实施例1：

用瘤体组织捣碎法制备纳米化抗HPV特异性IgY(I)。

(1)制备瘤体组织蛋白抗原成份：

把从患者体内切割的乳头瘤瘤体组织置入“组织捣碎匀浆机”中，用8000-12000rpm高速捣碎匀化，得到含人乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白悬浮浆液。

(2)制备免疫用抗原：

(3)制备免疫蛋

A.选择具有高免疫应答能力的良种母鸡

选择雅臣在中国福建的免疫基地600只产蛋母鸡作为免疫试验用母鸡。

用所制得的乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原免疫这600只产蛋母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋母鸡所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只母鸡所产蛋制成的IgY的效价大于1∶10,240，则选出该只母鸡作为选择的高免疫应答能力的特种母鸡，其它不符合要求的母鸡则淘汰不用。

B.分别对选择的特种母鸡进行强化免疫

用所制备的乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原，采用皮下注射的强化免疫法，分别对选择的特种母鸡进行免疫，每只每次注射量达到1～2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸡所产免疫蛋。

(4).制备抗HPV特异性IgY粗提物

用流动水洗净免疫鸡蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋机将免疫蛋打碎，蛋黄筛滤去蛋清，留下蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的4～6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用1.0NHCI溶液调pH至5.5～6.0；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2～6℃，静置12小时～24小时；将上述稀释液于10000rpm条件下，离心20分钟；取分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩15倍；加入2.0％海藻酸钠溶液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊沉淀，再加入2.0％CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，并于4℃条件下过夜；于8000rpm条件下离心20分钟，取上清，再用0.45um膜过滤除菌；再进行冷冻干燥，即制得备抗HPV特异性IgY粗提物干粉。

(5).抗HPV特异性IgY提纯

将所制得的抗HPV特异性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)，再先后过离子交换柱、凝胶层析柱以及亲和层析柱纯化，再用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，即得到纯化的抗HPV特异性IgY纯品。

(6)取所制得的抗HPV特异性IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗HPV特异性IgY-I干粉。

11.2实施例2：

用基因工程法制备纳米化抗HPV特异性IgY(II)。

(1)制备HPV-、L1L2基因表达蛋白抗原成份，具体包括以下步骤：

用RT-PCR方法从HPV病毒RNA克隆HPV.L1、L2基因，去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及Sephacry1S-200和Sephacry1S-100柱层析后，即获得纯化的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份。

(2)制备基因工程表达蛋白抗原

将以上所制成的基因工程所述方法而制得的纯化的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份以1∶1加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，采用30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得基因工程表达蛋白抗原。

(3)制备免疫蛋

A.选择具有高免疫应答能力的良种母鸡

用所制得的基因工程表达蛋白抗原免疫这600只产蛋母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋母鸡所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只母鸡所产蛋制成的IgY的效价大于1∶10,240，则选出该只母鸡作为选择的高免疫应答能力的特种母鸡，其它不符合要求的母鸡则淘汰不用。

B.分别对选择的特种母鸡进行强化免疫

用所制备的基因工程表达蛋白抗原，采用皮下注射的强化免疫法，分别对选择的特种母鸡进行免疫，每只每次注射量达到1～2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸡所产免疫蛋。

(4).制备抗HPV特异性IgY粗提物

(5).抗HPV特异性IgY提纯

(6)取所制得的抗HPV特异性IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗HPV特异性IgY-II干粉。

11.3实施例3：

脂质体抗HPV特异性IgY的生产，提高靶向性、延效性和渗透能力。

具体实施步骤如下：

A.把卵磷脂和胆固醇各50％按1∶5比例溶于乙醚中；

B.将实施例1中所制得的两种纳米化抗HPV特异性IgY干粉中的任意一种按1∶100比例加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度1％的IgY溶液；

C.将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY的PBS溶液按3∶1比例混合均匀；

D.超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)；

E.在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚；

F.超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY；

G.沉淀用水洗二次，置入高速离心机离心，得沉淀；

H.将所得的沉淀用10mmol/L PBS稀释，即制得两种抗HPV特异性IgY脂质体。

11.4实施例4：

制备抗妇科炎症病原体特异性IgY并将其纳米化

1.选择淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为阴道炎有代表性的病原体。

2.制备免疫用抗原。

2.1培养病原体

2.2制备复合抗原：

先将所制得的四种致病菌和毛滴虫按1∶1∶1∶1∶1比例混合并用常规方法粉碎，然后以5∶1的比例与疱疹病毒提纯液混合，充分搅拌均匀。然后将这种细菌病毒混合液以1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得细菌病毒复合抗原。

3.制备含高活性抗体的免疫蛋

首先采取与前叙相同方法选择产蛋母鸡，将所选择的具有高免疫应答能力的产蛋母鸡，应用免疫激活方法，采用上叙制得的细菌病毒复合抗原进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。

4.提取抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品：

5.制备抗妇科炎症多种病原体特异性IgY纯品

将所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱以及亲和层析柱纯化，进行纯化，即得抗妇科炎症病原体特异性纯IgY；

6..取所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉。

11.5实施例5：

制备抗妇科炎症病原体特异性IgY制成脂质体液晶微囊。

具体实施步骤如下：

I.把卵磷脂和胆固醇各50％按1∶5比例溶于乙醚中；

J.将实施例1中所制得的纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉按1∶100比例加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度1％的IgY溶液；

K.将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY的PBS溶液按3∶1比例混合均匀；

L.超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)；

M.在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚；

N.超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY；

O.沉淀用水洗二次，置入高速离心机离心，得沉淀；

P.将所得的沉淀用10mmol/L PBS稀释，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体。

11.6实施例6：

制备抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体。

具体步骤如下：

(1)分别按照实施例3的方法制备两种抗人乳头瘤病毒(HPV)脂质体各100kg

(2)按照实施例5的方法制备100kg抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体

(3)应用等量混合法，一边搅拌一边分别将所制得的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)脂质体中的其中一种徐徐加入抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体中，充分混和均匀；再采用超声波进一步分散处理，即制成200kg两种抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体。

11.7实施例7：

抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道凝胶剂生产。

具体实施方案如下：

配方

抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体(两种中任一种)

10.0g

褐藻蛋白. 0.1g

卡波姆 6.2g

丙二醇 250..0g

乙二胺四醋酸钠 0.5g

聚山梨醇 1.6g

氢气化钠 0.6g

蒸馏水加至1000g

(配方中也可不用褐藻蛋白)

工艺流程如下：

(1)把卡波姆溶于乙二胺四醋酸钠及适量蒸馏水中；

(2)一边搅拌一边加入10％氢气化钠溶液，制成凝胶基质；

(3)将抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体、褐藻蛋白.、聚山梨醇加入适量蒸馏水中搅拌均匀至澄清脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体溶液；

(4)抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY溶液加入凝胶基质中，充分搅拌混匀使成均质凝胶即得。

将上述制得的【抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道凝胶剂】装入软胶囊就成为【抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道软胶囊】，方便掳带和使用。

将所制得的【抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道凝胶剂】或【抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道软胶囊】置入阴道，这种液晶微囊化的【凝胶剂】与阴道粘膜表面分泌液接触后膨胀，【软胶囊】则先溶化后膨胀，然后与吸收处阴道粘膜局部紧密粘贴定位，可延长滞留时间；抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体在表皮渗透剂协同下缓缓释放渗入阴道粘膜层有效清除吸附在阴道表层和粘膜内的人乳头瘤病毒(HPV)和阴道炎症病原体。并经阴道粘膜吸收进入体内发挥治疗作用。既可平日定期使用预防人乳头瘤病毒(HPV)和阴道炎症多种病原体感染，也可经常使用防止复发。同时，由于本品可深入感染部位直接清除局部感染的病原体；因此，完全可作为对已经发生感染的患者的一种辅助治疗手段。

11.8实施例8

制备抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体常压喷雾剂

采用抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体(两种中任一种)50g，作为主要原料制成一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染和阴道炎症多种病原体感染的阴道喷雾剂。

配方：

抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体50g

褐藻蛋白.. 5.0g

甘油 1,000g

PEG400 1,250g

薄荷脑 50g

香精 15g

乙醇 500g

蒸馏水加至50,000g

(配方中也可不用褐藻蛋白)

生产工艺：将抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体、褐藻蛋白.溶于蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH流液调pH至6.5。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得2,500支可用于预防和治疗HPV感染和妇科炎症病原体感染的IgY常压喷雾剂。

这种喷雾剂使用十分方便，既可平日定期使用预防人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体感染，特别是可用于房事前后通过简单的局部喷雾方式进行最直接、最及时的预防，中和新感染的以及局部新释放的病毒，有效地阻断人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体通过性接触的传播途径；也可经常使用防止复发。同时，由于本品可直接喷雾进入感染部位清除局部感染的HPV病毒及抗妇科炎症病原体；因此，完全可作为对已经发生HPV感染或妇科炎症病原体感染的患者的一种辅助治疗手段。

11.9实施例9：

制备抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体女士洗液

配方：

2000g

褐藻蛋白.. 200.0g

甘油 40kg

芦荟精华 5000g

天然植物发泡剂 60kg

香精 600g

乙醇 20000g

蒸馏水加至2,000,000g

(配方中也可不用褐藻蛋白)

生产工艺：将抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体、褐藻蛋白溶于蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加芦荟精华和天然植物发泡剂混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH流液调pH至6.5。将药液灌入带压泵头的塑料瓶中，每瓶400ml，全检合格后包装即得5000瓶可用于预防和治疗HPV和妇科炎症病原体感染的IgY女士洗液。

这种洗液最适宜女士平日使用预防人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体感染，特别是可用于房事前后通过简单的局部清洁方式进行最直接、最及时的预防，中和新感染的以及局部新释放的病毒，有效地阻断人乳头瘤病毒(HPV)和妇科炎症病原体通过性接触的传播途径；也可经常使用防止复发。同时，由于本品可采用一种灌洗器辅助灌入感染部位清除局部感染的人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体；因此，完全可作为对已经发生人乳头瘤病毒(HPV)感染或及妇科炎症病原体感染的患者的一种辅助治疗手段。

11.10实施例10：

预防和治疗抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体阴道泡腾片生产

[配方]

1.0g

褐藻蛋白 0.6g

碳酸氢钠(NaHCO₃) 140g

无水枸椽酸 113g

乳糖 125g

微晶纤维素(MCC) 180g

吐温-80(TW-80) 0.08g

硬脂酸镁 8.0g

2％羟丙甲基纤维素醇液(HPMC) 适量

共制成 1,000片(每片0.6g)

(配方中也可不用褐藻蛋白)

[制备工艺]

1.NaHCO₃60℃干燥2hr，加20％PEG 醇液适量制软材，14目尼龙筛制粒60℃干燥备用。

2.枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎，加于2％HPMC醇液中搅匀。

3.再加入抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY脂质体、褐藻蛋白混匀过一次14目筛，再加硬脂酸镁混匀压片即得。

4.检验合格后水泡眼包装，外套铝塑复合膜塑料袋密封，装盒，装箱入库。

这种阴道泡腾片掳带和使用都十分方便，既可平日使用预防HPV病毒感染，特别是可用于房事前后通过简单的给药片方式进行最直接、最及时的预防，有效地阻断人乳头瘤病毒(HPV)和妇科炎症病原体的传播途径；也可经常使用防止复发。同时，由于本品可直接深入感染部位清除局部感染的HPV病毒和妇科炎症病原体；因此，完全可作为对已经发生HPV抗人乳头瘤病毒(HPV)或妇科炎症病原体感染的患者的一种辅助治疗手段。

以上所述，仅是本发明纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY及其组合制剂的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，凡是依据本发明的技术实质对上面实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术的范围内。

Claims

1.一种纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法是：

1)、筛选引致女性生殖器疣和宫颈瘤的有代表性的人乳头瘤病毒以及引致妇科炎症的有代表性的病毒和致病菌、原虫；

2)、分别用人乳头瘤瘤体细胞、人乳头瘤病毒的蛋白；和基因工程重组HPV病毒L1、L2基因表达蛋白；以及引致妇科炎症的有代表性的病毒和致病菌、原虫；来制备三种免疫用复合抗原；

3)、采用淘汰法选择高免疫应答的产蛋禽类，应用免疫启动方法分别以人乳头瘤瘤体细胞、人乳头瘤病毒的复合抗原；和基因工程重组HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原；以及妇科炎症病原体复合抗原；免疫选择的产蛋禽类，制备含高活性抗体的免疫蛋；

4)、分别把三种含高活性抗体的免疫蛋制备成两种抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY和一种抗妇科炎症病原体特异性IgY；

5)、先后过离子交换柱、凝胶层析柱以及亲和层析柱，制得两种抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性纯IgY和一种抗妇科炎症病原体特异性纯IgY；

6)用冷冻干燥机干燥，制得两种抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性纯IgY干粉和一种抗妇科炎症病原体特异性纯IgY干粉；

7)、将所制得的两种抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性纯IgY干粉和一种抗妇科炎症病原体特异性纯IgY干粉超微粉碎，得到两种纳米化抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性纯IgY和一种纳米化抗妇科炎症病原体特异性纯IgY；

8)、将以上所制得的两种纳米化抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性纯IgY和一种抗妇科炎症病原体特异性纯IgY制成纳米脂质体液晶微囊；

9)、将所述两种抗人乳头瘤病毒特异性IgY脂质体液晶微囊中任一种与抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体混合，制成纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY；

其中，所述的步骤2)中的制备免疫用人乳头瘤瘤体细胞、人乳头瘤病毒蛋白复合抗原的方法是：(1)把从患者体内切割的乳头瘤瘤体组织置入“组织捣碎匀浆机”中，用8000-12000rpm高速捣碎匀化，得到含人乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白悬浮浆液；(2)将所制得的含人乳头瘤瘤体细胞蛋白和人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白悬浮浆液以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得人乳头瘤瘤体细胞、人乳头瘤病毒蛋白复合抗原。

2.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中的制备免疫用HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原的方法是：用RT-PCR方法从HPV病毒RNA克隆HPV.L1、L2基因，去掉信号肽和穿膜区的片段；先插入pGEM-T载体；测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；转化大肠杆菌；挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌KM71和GS115；在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株；挑取单个菌落接种到培养基中，在28摄氏度摇床培养过夜；稀释后继续培养；待细菌浓度达到OD600的吸光值为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时；于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中血凝素的表达量；选表达量最高的时间收获；离心去除细胞沉淀；上清中即含大量表达产物；经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时，以及Sephacry1S-200和Sephacry1S-100柱层析后，即获得纯化的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份；将所制得的HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原成份以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原。

3.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中制备妇科炎症病原体复合抗原方法是：1)筛选出淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒作为妇科炎症有代表性的病原体；2)采用常规方法培养淋球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌、毛滴虫和疱疹病毒；3)将所培养的淋球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌四种致病菌和毛滴虫按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合并用常规方法粉碎，然后以5∶1的比例与疱疹病毒提纯液混合，充分搅拌均匀；然后将这种细菌病毒混合液以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得细菌病毒复合抗原。

4.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中制备含高活性抗体的免疫蛋的方法是：采用淘汰法选择的高免疫应答能力的产蛋禽类，应用免疫启动方法，分别采用上述制备的人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原和基因工程重组HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原以及妇科炎症病原体复合抗原对所选产蛋禽类进行注射免疫；在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量和方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。

5.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中采用人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原免疫时，抗HPV特异性IgY的制备方法是：将用人乳头瘤瘤体细胞、病毒蛋白复合抗原免疫的禽类所产高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；

然后采用细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌；细菌病毒滤除装置包括：第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

6.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中采用基因表达蛋白抗原免疫时，抗HPV特异性IgY的制备方法是：将HPV病毒L1、L2基因表达蛋白抗原免疫的禽类所产高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMn04溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；

7.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于：纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY由以下步骤制成：

1)、将两种抗人乳头瘤病毒特异性IgY制备成抗HPV特异性IgY纯品干粉；

2)、将两种抗HPV特异性IgY干粉制备成纳米化抗HPV特异性IgY纯品干粉；

3)、将以上所制得的纳米化抗HPV特异性IgY纯品制成纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY液晶微囊。

8.根据权利要求7所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤6)中制备抗HPV特异性纯IgY干粉的方法是：将所制得的两种抗HPV特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱以及亲和层析柱进行纯化，即得两种抗HPV特异性IgY纯品；然后将所制得的抗HPV特异性IgY粗品或抗特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗HPV特异性IgY纯品干粉。

9.根据权利要求7所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤7)中的制备纳米化抗HPV特异性纯IgY方法是：取步骤6)中所制得的两种抗HPV特异性IgY纯品干粉，分别加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得两种纳米化抗HPV特异性IgY纯品干粉。

10.根据权利要求8所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤8)中纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY的方法是：把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将两种纳米化抗HPV特异性IgY纯品干粉中之一种加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成IgY溶液，超声处理2min，在2min内每处理0.5min，间歇0.5min，经超声处理后立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY。

11.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤9)中制备纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的方法是：采用等量混合法将两种纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY中之任一种按10∶1-10比例与抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体加入匀质机充分混合均匀，再用超声波分散匀化而成。

12.根据权利要求10所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于采用等量混合法将所述两种纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)特异性IgY中之任一种按1∶1比例与抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体加入匀质机充分混合，再用超声波分散匀化而成。

13.根据权利要求1所述的纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)及抗妇科炎症病原体特异性复合IgY的制备方法，其特征在于所述抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体的制备方法如下：

1)、筛选引致妇科炎症的有代表性的病毒和致病菌、原虫；

2)、制备免疫用抗原：包括培养病原体与制备复合抗原两步骤；

3)、制备含高活性抗体的免疫蛋；

4)、制备抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品；

5)、制备抗妇科炎症多种病原体特异性纯IgY干粉；

6)、制备纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉；

7)、将以上所制得的纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY制成脂质体液晶微囊。

14.根据权利要求13所述的纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中制备含高活性抗体的免疫蛋的方法是：用淘汰法选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的健康无特定病原体携带的SPF健康产蛋禽类，应用免疫启动方法，采用权利要求1的步骤2)制备的细菌病毒复合抗原对所选产蛋禽类进行注射免疫；在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量和方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。

15.根据权利要求13所述的纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中制备抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品的方法是：分别将高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/1NaOH液或者1mol/1HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；

然后，采用除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌；细菌病毒滤除装置包括：第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

16.根据权利要求13所述的纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤5)中制备抗妇科炎症多种病原体特异性IgY纯品干粉的方法是：将上述所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱以及亲和层析柱进行纯化，即得抗妇科炎症病原体特异性纯IgY；将所制得的抗妇科炎症病原体特异性IgY粗品或抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY粗制品干粉和抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品干粉。

17.根据权利要求13所述的纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤6)中制备纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY干粉方法是：取步骤5)中所制得的抗妇科炎症病原体特异性纯IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗妇科炎症病原体特异性纯IgY干粉。

18.根据权利要求13所述的纳米脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY的制备方法，其特征在于所述的步骤7)中制备脂质体抗妇科炎症病原体特异性IgY液晶微囊的方法是：把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗妇科炎症病原体特异性IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液，超声处理2min，每处理0.5min，间歇0.5min，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而35000r/min、30min的超速离心，分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得抗妇科炎症病原体特异性IgY脂质体液晶微囊。