CN109821007B - 苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用，尤其是用于防治由人乳头瘤病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变、阴道炎、宫颈糜烂、宫颈息肉、宫颈癌和尖锐湿疣等疾病。采用本发明所提供的一种含有苦瓜蛋白的药物，在抗人乳头瘤病毒(HPV)感染中具有意想不到的治疗效果，抗HPV病毒有效率达到90％以上。且苦瓜来源广泛，易于种植，药食同源，无毒无副作用，制备成本低，易于推广使用。

Description

苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用

本申请要求于2018年04月23日提交中国专利局，申请号为2018103680382，发明名称为“苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及药物制剂应用领域，尤其涉及一种苦瓜蛋白以及含有该蛋白的药物在防治人乳头瘤病毒感染中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV，human papilloma virus)是一种具有人际传染性的球形DNA病毒。据统计在全球的性病中，HPV感染引起的生殖器疣占15-20％，而2003-2004年美国国家健康和营养研究课题的一个关于HPV流行情况的调查结果显示，14-59岁的女性生殖道HPV的总感染率为26.8％。目前，科学家已成功分离出200多种HPV亚型，不同的亚型存在不同的临床表现形式，其主要分为高危型和低危型。常见的高危型包括HPV-16、18、30、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等亚型，与高危型HPV相关疾病为外阴癌、前列腺癌、膀胱癌和宫颈癌等；常见的低危型包括HPV-6，11，13，32，34，40，42，43，44，53，54等亚型，与低危型HPV相关疾病为寻常疣、扁平疣、跖疣、湿疣等疾病。其中高危型的HPV-16和HPV-18是引起女性宫颈癌的主要原因，具有很强传染性；在中国，几乎所有的宫颈癌都与感染HPV有关。目前，针对HPV临床症状的治疗方法包括：

(1)物理治疗，通过激光、微波、光动力疗法等手术切除肉眼可见的瘤体和亚临床感染。但物理疗法主要针对病毒所导致肿瘤，并非从源头消灭病毒的存在；

(2)药物疗法，目前尚无针对该病毒的特效抗病毒药物；

(3)免疫疗法，包括干扰素、白介素、胸腺肽、转移因子、卡介苗、异维A酸、自体疫苗等，缺陷是价格昂贵、稳定性差、治疗程序复杂；

(4)疫苗治疗，美国FDA批准了Merck公司开发生产的4价(6，11，16，和18型)HPV疫苗GARDASIL，用于预防宫颈癌和性疣的疫苗。但是其只针对部分病毒亚型、目标人群不够广泛(13-26岁女子)、免疫有效期短(有效时间3-5年)、价格昂贵等不易于在发展中国家推广。因此，急需研究出一种特异性防治人乳头瘤病毒感染的药物。

在医药领域，从植物提取的活性成分具有不同的药理效果，如核糖体蛋白通常大量存在于葫芦科、大戟科、禾本科和石竹科等多种植物。由于其具有降血糖、降血脂、抗菌、调节免疫能力、抗肿瘤和抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)等多种功效，受到广泛关注。苦瓜是一种药食两用植物，果实性寒味苦，具有清热解毒、滋养强壮等功效。近年来，从苦瓜果实和种子中先后提纯得到多种有效成分，比如苦瓜蛋白MAP30(momordica anti-HIV protein of 30kDa)具有广谱抗病毒活性，除了抗HIV-1病毒外，对乙肝、乙脑、流感及腺病毒等均有明显的抑制作用。但目前还未有苦瓜蛋白在防治人乳头瘤病毒(HPV)感染方面的研究报道。

发明内容

本发明实施例提供了一种苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用，解决了现有技术中没有有效治疗人乳头瘤病毒感染疾病方面的药物问题。

本发明一方面提供了苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。

优选地，苦瓜蛋白分子量为28-30k D。

优选地，苦瓜蛋白为苦瓜蛋白MAP30。

另一方面还提供了一种含有苦瓜蛋白的药物用于防治由人乳头瘤病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变、阴道炎、宫颈糜烂、宫颈息肉、宫颈癌和尖锐湿疣。

优选地，药物中苦瓜蛋白重量占比为0.1-5％。

优选地，一种含有苦瓜蛋白的抗人乳头瘤病毒感染药物剂型为冻干粉、喷雾剂、凝胶剂、片剂、丸剂、软膏剂和缓控释制剂等，根据临床应用需要制备。

采用本发明所提供的一种含有苦瓜蛋白的药物，在抗人乳头瘤病毒感染中具有突出的效果，其抗病毒有效率达到95％以上。且苦瓜来源广泛，苦瓜蛋白不仅可从苦瓜果实或种子提取、而且通过基因重组表达获得，易于获取，生产成本低，易于推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例苦瓜籽中提取的MAP30示意图；

图2是本发明实施例基因重组表达的MAP30示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明一方面提供了苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。

优选地，苦瓜蛋白分子量为28-30k D。

优选地，苦瓜蛋白为苦瓜蛋白MAP30。

另一方面还提供了一种含有苦瓜蛋白的药物用于防治由人乳头瘤病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变、阴道炎、宫颈糜烂、宫颈息肉、宫颈癌和尖锐湿疣。

优选地，药物中苦瓜蛋白重量占比为0.1-5％。

优选地，一种含有苦瓜蛋白的抗人乳头瘤病毒感染药物剂型为冻干粉、喷雾剂、凝胶剂、片剂、丸剂、软膏剂和缓控释制剂等，根据临床应用需要制备。

苦瓜蛋白主要包括苦瓜凝集素、α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素、ε-苦瓜素和MAP30等几十种，其中本实验主要以MAP30、α-苦瓜素、β-苦瓜素为例，MAP30分子质量为30k D，α-苦瓜素的分子质量为29k D；β-苦瓜素的分子质量为28k D。

采用现有通常使用的提取方法：取苦瓜果肉或种子，研磨成粉，浸提，过滤，分离，提取、透析或通过柱色谱纯化获得并进行表征，见图1。

或采用现有通常使用的重组方法：通过将苦瓜中的相应蛋白基因克隆出来，转化到大肠杆菌或酵母菌等中大量表达，重组获得苦瓜蛋白，见图2。

现有研究均表明苦瓜蛋白MAP30、α-苦瓜素、β-苦瓜素对正常细胞无毒性无副作用。

实施例一：利用苦瓜提取的苦瓜蛋白MAP30在制备抗人乳头瘤病毒感染的药物中的应用，包括以下步骤：将现有方法提取的冻干的苦瓜蛋白MAP30 0.5g，硬脂酸镁79.5g、羧甲基纤维素200g、微晶纤维素720g充分搅拌混合获得抗人乳头瘤病毒药物D-MAP30，使每克药物中含有苦瓜蛋白MAP30 0.1％。

溶解液采用灭菌水和葡萄糖洗必泰(葡萄糖洗必泰含量为0.15％)，使用前和抗人乳头瘤病毒药物复配使用。

实施例二：利用苦瓜提取的α-苦瓜素制备抗人乳头瘤病毒感染的冻干粉剂，包括以下步骤：将α-苦瓜素0.5g，硬脂酸镁79.5g、羧甲基纤维素200g、微晶纤维素720g充分搅拌混合获得抗人乳头瘤病毒药物D-α-苦瓜素。

实施例三：利用苦瓜提取的β-苦瓜素制备抗人乳头瘤病毒感染的冻干粉剂，包括以下步骤：将β-苦瓜素0.5g，硬脂酸镁79.5g、羧甲基纤维素200g、微晶纤维素720g充分搅拌混合获得抗人乳头瘤病毒药物D-β-苦瓜素。

实施例四：实施例四和实施例一的区别在于不加入苦瓜蛋白MAP30，仅将硬脂酸镁80g、羧甲基纤维素200g、微晶纤维素720g充分搅拌获得D-sample。

实施例五：利用苦瓜提取的苦瓜蛋白MAP30制备抗人乳头瘤病毒感染的凝胶剂，取卡波姆边搅拌边加入苦瓜蛋白MAP30 50g，2g葡萄糖洗必泰，以三乙醇胺调PH4.5～5.5，加水至1000mL定容，使苦瓜蛋白MAP30质量浓度约为5％，搅匀，分装，即得凝胶剂N-MAP30。

实施例六：实施例一至五制备的抗人乳头瘤病毒感染药物对细胞毒性的测定

分别将上述实施例一至四制备的苦瓜蛋白D-MAP30、D-α-苦瓜素、D-β-苦瓜素、D-sample冻干粉药物、苦瓜蛋白N-MAP30凝胶剂进行细胞毒性实验，证明其不影响正常细胞的生长。另外经动物阴道粘膜刺激试验、皮肤变态反应试验、致突变和生殖毒性试验，证实是安全的，对阴道没有刺激性、没有发现皮肤变态反应、对染色体没有诱变性和对雌性动物生殖能力没有影响。

实施例七：利用D-MAP30、D-α-苦瓜素、D-β-苦瓜素、D-sample冻干粉剂、苦瓜蛋白N-MAP30凝胶剂分别在防治高危HPV阳性患者的临床应用

方法：对100例高危HPV阳性患者进行随机分为5组，将冻干药物和溶解液按1:6比例混合后采用阴道推注器给药至宫颈部位，第一组使用苦瓜蛋白D-MAP30+溶解液；第二组使用等量的D-α-苦瓜素冻干粉+溶解液；第三组使用D-β-苦瓜素+溶解液；第四组直接使用苦瓜蛋白N-MAP30，第五组使用实施例四制备的粉剂+溶解液。每天使用1次。每次1支(0.5克)，给药3个月后观察高危型HPV阳性患者的治疗效果，根据患者自觉症状、妇科检查及阴道分泌物镜检结果，分析药物对高危HPV阳性患者的临床疗效，以病毒载量下降为50％以上(包括50％)为有效(病毒检测方法采用HC2 HPV DNA检测)，反之为无效，另外统计HPV转阴率，具体数据如表1所示。

表1苦瓜蛋白抗人乳头瘤病毒药物用于高危HPV阳性患者的临床效果

组别	病例数	有效	无效	有效率(％)	转阴率
						第一组	20	19	1	95	70
第二组	20	15	5	75	55
						第三组	20	12	8	60	55
第四组	20	15	5	75	60
						第五组	20	8	12	40	15

实施例八：利用D-MAP30、D-α-苦瓜素、D-β-苦瓜素、D-sample冻干粉剂；N-MAP30凝胶剂分别在治疗低危型HPV感染临患者的临床应用

方法：对100例女性低危型HPV感染患者进行随机分为6组，将冻干药品和溶解液按1:6比例混合后采用阴道推注给药，第一组使用苦瓜蛋白D-MAP30冻干药品+溶解液；第二组使用等量的D-α-苦瓜素冻干药品+溶解液；第三组使用D-β-苦瓜素冻干药品+溶解液；第四组使用苦瓜蛋白N-MAP30；第五组使用D-sample冻干粉剂+溶解液。每日一次，连用一个月，停药1周进行检查，分析药物对低危型HPV感染患者的临床疗效，统计DNA转阴率，具体数据如表1所示。

表2苦瓜蛋白抗人乳头瘤病毒药物

用于治疗低危型HPV感染患者的临床效果

组别	病例数	转阴数	转阴率(％)
				第一组	20	19	95
第二组	20	16	80
				第三组	20	16	80
第四组	20	16	80
				第五组	20	0	0

在另外一个实施例中，基因重组获得的苦瓜蛋白MAP30在抗HPV病毒应用上具有与苦瓜提取蛋白MAP30一样的治疗效果。

本发明所指的苦瓜蛋白药物产品包括但不仅限于片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、软膏剂、凝胶剂、喷雾剂和缓控释制剂，使用时根据需要可直接涂抹或者喷涂在生殖道部位，操作简单方便，更加人性化。

综上所述，采用本发明所提供的一种含有苦瓜蛋白的药物，在抗人乳头瘤病毒(HPV)感染中具有意想不到的治疗效果，其抗HPV病毒有效率达到90％以上。且苦瓜来源广泛，药食同源，相对于商陆等中药提取的蛋白毒性小，提取蛋白或重组蛋白均可应用，制备成本低，易于推广。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用，其特征在于：所述苦瓜蛋白为MAP30。

2.根据权利要求1所述的苦瓜蛋白在制备抗人乳头瘤病毒感染药物中的应用，其特征在于：所述苦瓜蛋白MAP30的分子量为30k D。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于防治由人乳头瘤病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变、阴道炎、宫颈糜烂、宫颈息肉、宫颈癌和尖锐湿疣。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述苦瓜蛋白在所述药物中苦瓜蛋白的重量占比为0.05-5％。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为冻干粉、喷雾剂、凝胶剂、片剂、丸剂、软膏剂和缓控释制剂。

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