CN101070342A - 一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与其在制备抗肿瘤和/或病毒感染药物中的应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1；2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的蛋白质。该蛋白具有以下特点：1)抗肿瘤和病毒感染效果显着；2)安全性高；3)蛋白表达条件简单，易于纯化，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产，同时降低了制药成本，从而可减轻病人的经济负担。本发明为抗肿瘤和病毒感染提供了一条新途径，在医药学领域具有广阔的应用前景。

Description

一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因与其在制备抗肿瘤和/或病毒感染，特别是肿瘤靶向以及抗HIV和肝炎病毒感染的药物中的应用。

背景技术

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是广泛存在于植物界的一类毒蛋白，是真核生物蛋白合成的抑制剂。它能够作用于哺乳动物核糖体大亚基上的28S rRNA，并产生脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖体的结构，抑制蛋白质的翻译；同时RIP还参与细胞凋亡的调节。

根据RIP一级结构的不同，可将其分成两类：I型和II型。I型RIP由一条肽链组成；II型RIP由两条多肽链组成，分别称为A链和B链，两条链通过二硫键相连。A链和I型RIP都具有RNA N-糖苷酶活性，能使核糖体失活。天花粉蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜毒素蛋白和苦瓜籽核糖体失活蛋白是I型RIP的典型代表，II型RIP主要包括蓖麻毒蛋白、相思子蛋白和香樟毒蛋白等。从结构和遗传特点上看，II型RIP可能是由I型RIP进化而来的。

I型RIP特别适合做细胞毒性治疗药物的弹头部分，即可将RIP连接到靶向性试剂(如单克隆抗体或是肿瘤抗原配体等)上，利用这种靶向性试剂可将RIP带到体内某一特定种类的细胞(如肿瘤细胞)内，选择性地杀死这种细胞，因而具有较高的疗效和较低的毒性。例如，利用二硫键将靶向性试剂和毒素相连，在体内二硫键被还原，释放出毒素从而产生细胞内毒性；另一策略是将RIP基因和靶向性模块融合表达，从而产生靶向性毒素蛋白。

苦瓜中含有多种核糖体失活蛋白，如α-苦瓜素、β-苦瓜素和MAP30等，这些蛋白成分已被证明是良好的抗肿瘤、抗病毒活性物质，因而引起了人们的广泛关注，但目前，获得苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法主要依赖于天然提取，其缺点在于对原材料的依赖性强，得率低，不利于进一步制备免疫毒素，而克隆核糖体失活蛋白的基因不仅可以比较容易地获得活性较高核糖体失活蛋白，而且可以有效地进行多种重组免疫毒素的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一个苦瓜籽核糖体失活蛋白及其编码基因。

本发明所提供的苦瓜籽核糖体失活蛋白，名称为α-Momorcharin，来源于葫芦科植物苦瓜(Momordica charantia)，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由286个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-23位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第24-286位氨基酸残基为苦瓜籽核糖体失活蛋白，RNA N-糖苷酶的功能区主要集中在自氨基端第24-269位氨基酸残基。

编码所述苦瓜籽核糖体失活蛋白的基因(α-Momorcharin)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由861个碱基组成，其编码序列为5’端第1-861位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第1-69位碱基编码信号肽，自5’端第70-861位碱基编码苦瓜籽核糖体失活蛋白。

在本发明中，苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin包括含有或不含有起始甲硫氨酸(蛋氨酸)的α-Momorcharin。

本发明还提供了所述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物，以及编码这些多肽的多核苷酸。

所述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin，包括具有α-Momorcharin功能相同，且具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，尤其优选为1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内)氨基酸残基。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基通常也不会改变蛋白质的功能；还包括α-Momorcharin的活性片段和活性衍生物。

本发明还提供了α-Momorcharin蛋白活多肽的类似物。这些类似物与天然α-Momorcharin的差别可以是氨基酸残基序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同与天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

所述α-Momorcharin的片段、衍生物和类似物，是指保持有本发明天然α-Momorcharin蛋白相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可定义为：1)由一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其他抗原配体序列的融合蛋白)，或是将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合产生的融合多肽。产生融合多肽的技术可采用本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

具体来讲，α-Momorcharin的保守性变异多肽，是指与序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列相比，有至多10个，优选为至多8个，更优选为至多5个，尤其优选为至多3个氨基酸残基被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成的多肽。例如，在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷安酰氨和天冬酰氨)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常见的替换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。

所述α-Momorcharin还可为经过修饰的，或经修饰提高了抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的α-Momorcharin多肽。修饰(通常不改变一级结构)的形式包括：1)体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工过程中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于具有糖基化功能的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的序列。

本发明α-Momorcharin的多核苷酸可以是DNA或RNA形式。DNA形式包括cDNA和人工合成DNA，可为单链或双链，也可以是编码链或非编码链。本发明还提供了所述α-Momorcharin多核苷酸的变异体，其编码与α-Momorcharin有相同的氨基酸残基序列的多肽、多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体，如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增α-Momorcharin中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述苦瓜籽核糖体失活蛋白

α-Momorcharin的方法。

本发明所提供的表达苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin方法，是将所述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因、该基因的变异体，或含有苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，并从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin。

所述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因可通过含有α-Momorcharin或其同源序列的表达载体导入宿主细胞。用于构建所述含有α-Momorcharin或其同源序列的重组表达载体的出发载体，可为任意一种本领域所熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(AH Rosenberg，et al.Vectors for selective expression of clonedDNAs by T7 RNA polymerase.Gene.1987，56(1)：125-135)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(SJ Lee and D Nathans.Proliferin secreted by culturedcells binds to mannose 6-phosphate receptors.J.Biol.Chem.1988；263：3521-3527)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

其中，以pET28a(+)为出发载体，构建的含有苦瓜籽核糖体失活蛋白

α-Momorcharin基因的重组表达载体为pET28a(+)-α-MMC-Thr155。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的表达载体，如重组DNA技术，DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a Laboratory Manual.Cold spring harborlaboratory.New York，1989)。所述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的启动子上，以指导mRNA的合成；所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子，噬菌体启动子，反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体中还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母；植物细胞：果蝇S2或Sf9的昆虫细胞：CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常包含有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进行分离纯化。

用于培养含有本发明的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-1.0mmol/L，优选为0.2mmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为30℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。

本发明还提供了一种抗肿瘤和/或病毒感染的免疫性药物。

本发明提供的免疫性药物，其活性成份为上述苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂或胶囊口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。

该药物的成人口服用量一般为0.01-0.5mg/kg体重/天，可以一次或多次使用，疗程一般为10至20天。

本发明提供了一个苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin及其编码基因。该蛋白具有糖苷酶活性和抑制核糖体功能的作用，因而该蛋白与其它核糖体失活蛋白一样具有抗肿瘤和病毒感染的作用，可用于制备抗肿瘤和病毒感染(特别是肿瘤靶向药物以及抗HIV和肝炎病毒感染)等多种免疫性药物。该蛋白具有以下特点：1)抗肿瘤和病毒感染效果显着；2)安全性高；3)蛋白的表达条件简单，易于纯化，因而生产成本低廉，适宜进行工业化生产，同时降低了制药成本，从而可减轻病人的经济负担。本发明为抗肿瘤和病毒感染提供了一条新途径，在医药学领域具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin氨基酸残基序列的序列分析结果

图2为表达后经纯化的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155的10％SDS-PAGE检测结果

图3为核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155对肿瘤细胞生长的抑制作用检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例1、苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的获得

用下述方法获得本发明苦瓜籽核糖体失活蛋白(命名为α-Momorcharin，又称α-Momorcharin-Thr155)的编码基因，具体过程包括以下步骤：

一、苦瓜籽总RNA的提取

取北京产苦瓜籽置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，再加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，然后4℃、120000rpm离心10分钟，取上清，加入氯仿，添加比例为200ul氯仿/1mL TRIzol，剧烈振摇15-30秒，室温放置3分钟，再4℃、120000rpm离心15分钟，取上层水相溶液，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟，再4℃、120000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用预冷的75％乙醇(DEPC水配制)洗涤，放置至沉淀透明后加入无核酸酶的重蒸水溶解，-70℃保存备用。

二、RT-PCR扩增α-Momorcharin基因

来源于同一种属植物的RIP基因的核苷酸序列具有保守性，因此已报道的同一种属植物的RIP基因的核苷酸序列设计PCR扩增苦瓜籽核糖体失活蛋白α-MomorcharincDNA基因的引物，引物序列如下：

F1(上游引物)：5’-ATgAgTAgATTCTCAgTTCTC；

R1(下游引物)：5’-TCAGTGTTTTGCAGGAATATCCTCGTC。

取1ug步骤一提取的苦瓜籽总RNA作为模板，用Superscript II(Invitogen公司)试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其cDNA；再取5ul反转录产物作为模板，在引物F1和R1的引导下，PCR扩增苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的cDNA基因，50ul PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5ul，25mM MgCl₂6ul，上、下游特异性引物各50pmol，10mM dNTPs 1ul，Taq聚合酶1U，用重蒸水补充反应体系至50ul。PCR反应条件为：先94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸7分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果从苦瓜籽总RNA中扩增出长度约为861bp的DNA片段，与预期结果一致。回收并纯化该目的片段，将其连接入测序载体pGEM-T(Promega公司)中，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，利用通用引物T7/SP6鉴定阳性克隆，小量培养阳性克隆，取菌液测定DNA序列，测序结果表明该基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由861个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-861位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID NO：1由286个氨基酸残基组成，该基因编码蛋白的氨基酸残基序列包含一种RNA N-糖苷酶的同工酶序列。对苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的氨基酸残基序列进行序列分析，结果如图1所示，在由286个氨基酸残基组成的蛋白序列中，自氨基端第1至第23位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第24至第286位氨基酸残基为功能蛋白。在RNA N-糖苷酶的功能区(自氨基端第24-269位氨基酸残基)有11个氨基酸，自氨基端第24位氨基酸残基开始计算，分别为V69、Y70、I71、S108、G109、N110、Y111、I155、E160、R163和E189，直接参与和底物的相互作用，并且在不同来源的核糖体失活蛋白中具有高度保守性。将本发明的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的氨基酸残基序列及其编码基因的核苷酸序列和已报道的核糖体失活蛋白的氨基酸残基序列及其编码基因的核苷酸序列进行比对，比对结果表明本发明的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因自5’端第533位核苷酸为C，而不是T，从而导致自氨基端第155位氨基酸残基为Thr，而不是Ile。分别独立克隆两次，重复测序，结果一致。将上述携带有苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的重组载体命名为pGEM-α-Momorcharin-Thr155。

实施例2、苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的表达和纯化

一、构建重组表达载体pET28a(+)-α-MMC-Thr155

设计PCR扩增实施例1获得的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin cDNA基因的引物，引物序列如下：

MMC-1/NdeI F：5’-GGAGATATA CATATGGATGTTAGCTTTCGTTTG(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)；

MMC-1/NotI R：5’-GAGT GCGGCCGCTCATTAAATATTTCGTGTGTTTAA(带下划线碱基为限制性内切酶Not I识别位点)。

以实施例1获得的携带有苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的重组载体pGEM-T-α-Momorcharin为模板，使用高保真聚合酶pyrobest(Takara公司)，在引物MMC-1/NdeI F和MMC-1/NotI R的引导下PCR扩增苦瓜籽核糖体失活蛋白

α-Momorcharin cDNA基因并在序列两端分别添加限制性内切酶Nde I和Not I识别位点，PCR反应条件为：先94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果从苦瓜籽总RNA中扩增出长度约为741bp的DNA片段，与预期结果一致。回收并纯化该目的片段，将其用限制性内切酶Nde I和Not I(均购自NEB公司)进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pET28a(+)(Novagen公司)连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，用引物MMC-1/NdeI F和MMC-1/NotI R进行PCR鉴定，对可PCR扩增出741bp DNA片段的菌落取样测序，测序结果表明获得了序列及插入位置正确的含有序列正确的阳性克隆，小量摇菌，提质粒，将该携带有苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin基因的重组表达载体命名为pET28a(+)-α-MMC-Thr155。

二、苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin在大肠杆菌中的表达

将步骤一构建的重组表达质粒pET28a(+)-α-MMC-Thr155转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，摇菌，再取100ul过夜培养(12-24小时)含重组子的宿主菌，将其接种到2mL含25ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下培养1小时，再将部分培养管中加入IPTG至终浓度为1mM，在相同条件下继续培养5小时。培养结束后，取500ul菌液，10000离心2分钟收集菌体，加入50ul上样缓冲液，100℃变性10分钟，再12000g离心1分钟，取10ul进行10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝染色，脱色。菌体蛋白的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图2(泳道1：诱导前的菌体蛋白；泳道2：诱导后的菌体蛋白；泳道M：蛋白分子量标准)中的泳道2所示，经IPTG诱导后，获得了分子量约为29Kd的重组蛋白(箭头所指条带)，与预期的分子量大小一致。将转化有pET28a(+)-α-MMC-Thr155的重组E.coli BL21(DE3)菌命名为BL21(DE3)-MMC-Thr155。

三、苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin的纯化与复性

取10mL步骤二经过夜培养的宿主菌接种到1000mLL含25ug/mL卡那霉素的抗性LB培养基液体中，37℃培养至OD＝0.4-0.6后，加入IPTG至终浓度为1mM，继续诱导培养5小时。培养结束后，离心收集菌体，将菌体溶于20mL 10mM Tris·HCl(pH6.5)中，再依次加入溶菌酶(华美生物工程公司，至终浓度1mg/mL)和蛋白酶抑制剂PMSF(SIGMA公司，终浓度为100ug/mL)，室温放置30分钟，冰浴，超声破碎10分钟，离心分别收集上清和沉淀，溶于2×上样缓冲液中，进行10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结果表明表达蛋白存在于沉淀中，即以包含体形式存在，然后用Qiagen公司的Ni-NTA树脂并按照操作说明书纯化蛋白。取10ul纯化蛋白进行10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图2中的泳道3所示，表明获得了纯度较高的苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155。将纯化的目的蛋白在复性缓冲液(0.4ML-精氨酸，0.1M TrisHCl，2mM EDTA，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，pH8.0)中进行复性，再将蛋白透析浓缩后，-20℃保存备用。

实施例3、苦瓜籽核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155的功能验证实验

稀释对数生长期的胃癌细胞SGC7901至1.5×10⁴个/mL，加入96孔板，每孔200μl(第一排不加细胞)在37℃、5％CO₂下孵育过夜(16小时)，在96孔板中按1：5梯度稀释α-Momorcharin-Thr155，使α-Momorcharin-Thr155的浓度依次为180000、36000、7200、1440、288、57.6、11.52和2.304nM，每孔最终体积为200μl，倒掉培养基，分别加入上述不同浓度的α-Momorcharin-Thr155(第一排加新鲜培养基，第二排不加α-Momorcharin-Thr155)，再在37℃、5％CO₂下培养72小时，倒掉培养基，加入100μl结晶紫溶液(0.5％)，室温孵育30min-1h，洗掉染料，风干，然后加入150μl Sorenson’s缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH 4.2，50％乙醇)，室温孵育60-90min，最后，在630nm下测定各孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率，并绘制细胞存活曲线。细胞细胞存活率的计算公式为：实验孔平均OD值/阴性对照孔平均OD值×100％。

胃癌细胞SGC7901的生长曲线如图3所示(横坐标为α-Momorcharin-Thr155浓度，纵坐标为细胞存活率)，本发明的核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155对胃癌细胞SGC7901的增长具有明显的抑制作用，IC₅₀约为3μM(87μg/mL)。上述实验结果表明本发明的核糖体失活蛋白α-Momorcharin-Thr155对肿瘤细胞的生长具有抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

序列表

<160>2

<210>1

<211>286

<212>PRT

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>1

Met Ser Arg Phe Ser Val Leu Ser Phe Leu Ile Leu Ala Ile Phe Leu

1               5                   10                  15

Gly Gly Ser Ile Val Lys Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Asp Pro Arg Ser Tyr Gly Met Phe Ile Lys Asp Leu Arg Asn Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Phe Arg Glu Lys Val Tyr Asn Ile Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val

    50                  55                  60

Ser Gly Ala Gly Arg Tyr Leu Leu Met His Leu Phe Asn Tyr Asp Gly

65                  70                  75                  80

Lys Thr Ile Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Leu Ala Asp Thr Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Pro Ala Ala Glu

            100                 105                 110

Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe Arg Asp Ala Arg Arg Lys Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Ile Ala Ala Gly Lys Pro

    130                 135                 140

Arg Glu Lys Ile Pro Ile Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Ser

145                 150                 155                 160

Thr Leu Leu His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val

                165                 170                 175

Leu Thr Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gln

                180             185                 190

Gln Ile Gln Glu Arg Ala Tyr Arg Asp Glu Val Pro Ser Leu Ala Thr

            195             200                 205

Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Gly Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu

        210             215                 220

Ala Gln Gly Asn Asn Gly Ile Phe Arg Thr Pro Ile Val Leu Val Asp

225                 230                 235                 240

Asn Lys Gly Asn Arg Val Gln Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Gln Leu Leu Leu Asn Thr Arg Asn Ile Ala Glu Gly

            260                 265                 270

Asp Asn Gly Asp Val Ser Thr Thr His Gly Phe Ser Ser Tyr

        275                 280                 285

<210>2

<211>861

<212>DNA

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>2

atgagtagat tctcagttct ctcatttcta attctcgcaa tcttccttgg aggttctatt      60

gtcaaaggcg atgttagctt tcgtttgtcg ggtgctgatc ctagatccta tgggatgttc     120

atcaaagatt tgaggaatgc tcttccattt cgagagaaag tgtacaatat acctctctta     180

cttccttccg tttcaggagc aggacgatac ttactaatgc atctcttcaa ttacgacgga     240

aaaaccatca cagtggccgt agatgtaaca aacgtttaca ttatgggcta tcttgccgat     300

acaacatcct acttttttaa cgagcctgct gctgaattag cttctcaata tgtattccga     360

gacgctagga ggaagattac acttccatat tctggcaatt acgaaaggct tcaaattgct     420

gcaggcaagc caagagaaaa aatccccatt ggactcccag cgttggatag tgcaataagc     480

accttgctgc attatgactc cacagctgcc gctggggcac tgcttgtact cactcagacc     540

actgcggagg ctgcgagatt taagtatatt gagcaacaaa ttcaagaaag agcttacaga     600

gacgaggtcc cgagtctagc aactataagt ttagaaaaca gttggtctgg tctctccaaa     660

caaatccagt tagcgcaggg caataatgga atatttagaa ctcctattgt gcttgtggat     720

aacaaaggaa atcgagtcca gataaccaac gttacttcaa aagttgtaac ctccaacata     780

cagttattgt taaacacacg aaatattgca gagggtgaca acggcgatgt ttctacaaca     840

catggctttt cgagctacta g                                               861

Claims (10)

1、苦瓜籽核糖体失活蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的蛋白质。

2、权利要求1所述的苦瓜籽核糖体失活蛋白的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物。

3、编码权利要求1所述苦瓜籽核糖体失活蛋白的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有抑制细胞内核糖体蛋白合成活性的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、编码权利要求2所述的苦瓜籽核糖体失活蛋白的保守性变异多肽、片段、类似物或其衍生物的多核苷酸。

6、含有权利要求3或4所述苦瓜籽核糖体失活蛋白基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

7、一种表达权利要求1所述苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，是将权利要求3或4所述的苦瓜籽核糖体失活蛋白基因、该基因变异体或含有所述苦瓜籽核糖体失活蛋白基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到苦瓜籽核糖体失活蛋白。

8、根据权利要求7所述的苦瓜籽核糖体失活蛋白的表达方法，其特征在于：所述重组表达载体为pET28a(+)-α-MMC-Thr155。

9、权利要求1所述的苦瓜籽核糖体失活蛋白在制备抗肿瘤和/或抗病毒感染的免疫性药物中的应用。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗病毒药物为抗HIV和肝炎病毒感染的药物。

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