CN103865899B - 具有vegfr2/kdr受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用 - Google Patents

具有vegfr2/kdr受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素（rhVEGF121KDR/rGEL30）及其编码基因与其在制备抗肿瘤药物中的应用。所述融合毒素是通过连接肽在白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的氨基端（N端）连接重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）得到的融合毒素，且所述融合毒素的羧基端（C端）具有内质网定位序列。其中VEGF121KDR作为运载工具，可使该融合毒素与VEGFR2/KDR以高亲和力特异结合并内化进入肿瘤新生血管内皮细胞，然后核糖体失活蛋白rGEL30发挥毒素效应，杀伤肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，达到抑制肿瘤的目的，并且，融合毒素C-末端的内质网定位信号KDEL可促进游离rGEL30毒素在粗面内质网富集，进一步增强融合毒素的抗肿瘤效果。

Description

具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有VEGFR2/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体与白树籽核糖体失活蛋白的融合毒素（rhVEGF121KDR/rGEL30）及其编码基因，以及该融合毒素的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康。根据国际抗癌联盟（UICC）统计数据，全球每年新增病例都在1000万人以上，死亡700多万人。目前，我国恶性肿瘤患者约2000万人，每年新增发病人数约180-200万，死亡约140-150万。
传统化疗药物对机体肿瘤采取地毯式轰炸的杀灭方式，特异性差，且对骨髓、消化道、肝、肾等正常组织均造成严重损害，具有很大的局限性。近年来兴起的肿瘤靶向治疗改变了传统化疗药物全面杀伤所有快速分裂细胞的治疗方式，只针对肿瘤特定标志对肿瘤实施精确打击，定点清除，因此特异性高、抗癌效果好、毒副作用低，已成为将来抗癌药发展的主要方向。
肿瘤血管靶向药物是肿瘤靶向治疗的重要领域。研究表明，肿瘤组织必须依赖其周围血管获得足够的营养和氧气、并排出有害代谢产物，才能迅速增长，否则肿瘤生长最多不超过2mm3。只要有效抑制肿瘤新生血管的形成，或者阻断肿瘤已有的血管网络，肿瘤细胞就无法获得足够营养而延缓生长，并逐渐萎缩、凋亡、坏死，最终被机体消除。
在肿瘤血管形成过程中，血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体家族发挥重要作用，与肿瘤的生长、浸润和转移关系密切，是抗癌药物设计的重要靶标。人类VEGF由于mRNA的剪接而产生几种不同的异构体，即VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF208，其中VEGF121和VEGF165为可溶性的细胞因子，具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流动等功能。VEGF受体（VEGFR1/Flt1和VEGFR2/KDR）具有酪氨酸激酶活性，其中VEGFR1/Flt1表达于所有分化成熟的血管内皮细胞表面，VEGFR2/KDR则只在肿瘤组织的血管内皮细胞表面高表达，而在正常组织的血管内皮细胞表达水平很低乃至几乎无法检测出，是一种特异性比较高的肿瘤新生血管内皮细胞的生物标志。
核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingproteins，RIPs)是一类广泛存在于植物中的天然毒蛋白，它具有N2糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体的28SrRNA上4324位腺苷酸的N2C糖苷键，使核糖体失活，从而抑制蛋白质合成。根据肽链的组成和性质，RIPs通常分为两类：Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型为单链，Ⅱ型为双链，由一条类似I型RIP的肽链和一条具有凝集素活性的肽链通过二硫键连接形成。RIPs具有抗病毒和抗肿瘤等广泛的生物学和药学活性。RIPs已被用作免疫毒素的弹头，临床上用于治疗恶性肿瘤。其中，本发明所涉及的白树籽核糖体失活蛋白rGEL30是一种Ⅰ型RIP，又名GAP30或Gelonin，最初从亚热带植物白树（Geloniummultiflorum）的种籽中分离纯化而得，SDS电泳测定分子量约为30kD。以后克隆测序后，知其由251个氨基酸组成，准确分子量应为28kD，故亦可将基因重组的该蛋白称之为rGEL或rGelonin。已证明rGEL30具有对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤力强、对正常细胞毒性低的优点，是一种比较理想的抗肿瘤蛋白分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有VEGFR2/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素。
本发明所提供的具有VEGFR2/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素，是通过连接肽在白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的氨基端（N端）连接重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）得到的融合毒素，且所述融合毒素的羧基端（C端）具有内质网定位序列。
所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中SEQIDNO：3所示，其编码基因的核苷酸序列可如序列表中SEQIDNO：4所示。
所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。
所述内质网定位序列的氨基酸残基序列可如序列表中序列SEQIDNO：5所示，其编码基因的核苷酸序列可如序列表中SEQIDNO：6所示。
具体来讲，所述融合毒素，命名为rhVEGF121KDR/rGEL30，是下述氨基酸残基序列之一：
1）序列表中的SEQIDNO：1；
2）将序列表中SEQIDNO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有VEGFR2/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。
序列表中的SEQIDNO：1由377个氨基酸残基组成，自氨基端第1-121（121aa）位氨基酸残基为重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自氨基端第122-126（5aa）位氨基酸残基为连接肽，自氨基端第127-377（251aa）位氨基酸残基为白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，同时，需要特别指出的是：与天然白树籽核糖体失活蛋白相比，在本发明中，融合毒素的末两位氨基酸残基分别由Pro376和Lys377突变为Glu376和Leu377，即将天然白树籽核糖体失活蛋白的末两位氨基酸残基Pro250和Lys251突变为Glu250和Leu251，使得融合毒素自氨基端第374-377（4aa）位氨基酸残基，即白树籽核糖体失活蛋白自氨基端第248-251（4aa）变为粗面内质网定位序列Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL），使融合毒素具有粗面内质网定位功能，进而提高毒素对细胞的杀伤力。
与天然型的人血管内皮生长因子VEGF121的氨基酸残基序列相比较，所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30中重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）的氨基酸序列含有以下氨基酸残基的改变：VEGF121序列中的氨基酸残基Asp63、Gly65、Leu66和Lys115，在rhVEGF121KDR序列中分别突变为Ser63、Met65、Arg66和Asn115。Asp63、Gly65、Leu66和Lys115是VEGF121分子中参与VEGFR1/Flt1作用的关键氨基酸，突变为Ser63、Met65、Arg66和Asn115后，VEGF121突变体则失去了与VEGFR1/Flt1结合的能力，但具有VEGFR2/KDR受体特异性，蛋白的稳定性也大大提高。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的多肽片段、衍生物和类似物也是本发明要保护的，是指与本发明rhVEGF121KDR/rGEL30具有相同生物学功能或活性的多肽片段、衍生物或类似物，其中，多肽片段可定义为：1）由一个或多个保守或非保守氨基酸残基（优选为保守性氨基酸残基）所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2）在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3）成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4）附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其它抗原配体序列的融合毒素），或是将编码另一个多肽的核酸序列（或其部分）与本发明的核酸序列（或其部分）融合就可以获得融合多肽的编码序列，再使该融合多肽的编码序列获得表达，就可产生融合多肽。所述产生融合多肽的技术为本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且使融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的衍生物是指采用本发明中VEGF121突变体VEGF121KDR与其它毒素分子融合构建而成的融合毒素。
所述rhVEGF121KDR/rGEL30的类似物与rhVEGF121KDR/rGEL30的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。所述类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明融合毒素的氨基酸残基序列并不限于上述例举的具有代表性的序列。
所述rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素还可为经过修饰的，或经修饰提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的rhVEGF121KDR/rGEL30多肽。修饰（通常不改变一级结构）形式包括：1）体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2）糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3）具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸）的序列。
编码上述融合毒素的基因（rhVEGF121KDR/rGEL30)，是下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQIDNO：2的DNA序列；
2）编码序列表中SEQIDNO：1的DNA序列；
3）与序列表中SEQIDNO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性并具有VEGFR2/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQIDNO：2由1131个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1131位碱基，编码具有序列表中SEQIDNO：1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基编码重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自5’端第364-378位碱基编码连接肽，自5’端第379-1131位碱基编码白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，其中，自5’端第1120-1131位碱基编码内质网定位信号。
编码本发明rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
本发明还提供了所述融合毒素多核苷酸的变异体，其编码与rhVEGF121KDR/rGEL30有相同氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
含有本发明基因rhVEGF121KDR/rGEL30的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增rhVEGF121KDR/rGEL30中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种重组表达上述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的方法，是将含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体（AHRosenberg，etal.VectorsforselectiveexpressionofclonedDNAsbyT7RNApolymerase.Gene.1987,56(1):125-135）；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体（SJLeeandDNathans.Proliferinsecretedbyculturedcellsbindstomannose6-phosphatereceptors.J.Biol.Chem.1988;263:3521-3527）和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。所述出发载体优选为包括一种含有硫氧化还原蛋白（Trx）突变体（mTrx）的融合表达载体，命名为pmTrx载体，该载体是以pET32a(+)序列为基础，将其Trx序列中的Gly34和Pro35位氨基酸残基突变为Pro34和Tyr35后得到的，所述硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。Trx突变体（mTrx）在蛋白表达过程中更有效促进细菌胞浆中目的蛋白二硫键的形成，大大促进了融合蛋白的可溶性表达。
序列表中SEQIDNO：7由109个氨基酸残基组成，自氨基端第33-36（4aa）位氨基酸残基为Cys-Pro-Tyr-Cys（这四个氨基酸的此种排列组合具有更高的氧化势能，因而能促进重组蛋白质多肽链中二硫键的形成及正确折叠），自氨基端第34位氨基酸残基为突变氨基酸残基Pro34，自氨基端第35位氨基酸残基为突变氨基酸残基Tyr35。
其中，以pmTrx载体为出发载体，构建的含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体为pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述重组表达载体中pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30中氨基端（N端）连接硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）标签的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示，所述融合毒素基因上游添加限制性内切酶XbaI识别位点，下游添加限制性内切酶NotI识别位点。
可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等（Sambrook，etalMolecularcloing，aLaboratoryManual.Coldspringharborlaboratory.NewYork，1989）。所述具有KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白（GFP）基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。
所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。
可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。
培养含有本发明具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
此外，转化或转导有以pmTrx载体为出发载体构建的含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的宿主细胞中表达的融合蛋白具有mTrx标签，应用工具酶切割去除mTrx标签，最终得到融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述用工具酶切割去除mTrx标签的方法为：按每1单位凝血酶裂解5毫克融合蛋白，室温消化过夜。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30及其编码基因可用于制备抗肿瘤药物，因而本发明还提供了一种抗肿瘤药物。
本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分为上述具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30或其编码基因。
所述具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因可存在于真核表达载体中。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。荷瘤裸鼠试验结果表明，本发明的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30在静脉注射剂量为4mg/kg体重/次时，可明显延缓异体移植肿瘤的生长。
本发明提供了一种以VEGFR2/KDR受体为靶标设计的融合毒素，它由靶向分子重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）和效应分子（毒素分子）白树籽核糖体失活蛋白rGEL30两部分组成。靶向分子rhVEGF121KDR作为运载工具通过与VEGFR2/KDR以高亲和力特异结合和内吞机制，将融合毒素带入肿瘤新生血管内皮细胞，释放出白树籽核糖体失活蛋白rGEL30毒素分子通过其C-末端的内质网定位序列KDEL有效进入靶效应位点—粗面内质网，使其中核糖体大亚基的28SrRNA发生脱腺嘌呤作用，抑制细胞蛋白质的翻译，进而杀灭肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，达到抑制肿瘤的目的。与天然人血管内皮生长因子VEGF121功能不同的是，本发明对天然型VEGF121的受体特异性进行改造，获得了具有VEGFR2/KDR特异性并失去VEGFR1/Flt1结合活性的VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）。因为作为靶向分子，天然型VEGF121可与VEGFR1/Flt1和VEGFR2/KDR等至少两种受体结合，而癌症患者血液或者肿瘤组织中存在大量可溶性VEGFR1/Flt1，一些正常细胞（如造血干细胞、单核细胞），尤其是肾小球细胞也大量表达VEGFR1/Flt1。一方面，癌症患者血液或者肿瘤组织中的可溶性VEGFR1/Flt1将大大降低药物在作用靶点的有效浓度，另一方面，与肾小球细胞VEGFR1/Flt1的结合将导致药物在肾脏的蓄留，引起肾脏毒性。因此，只具有VEGFR2/KDR受体特异性的rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素，避免了癌症患者血液（或者肿瘤组织）中可溶性VEGFR1/Flt1以及肾小球细胞表面VEGFR1/Flt1与天然型VEGF121的结合问题，具有更好的靶向性，毒副作用更小，是一种具有良好临床应用前景的肿瘤血管靶向药物。
本发明融合毒素中VEGF121KDR作为运载工具，可使该融合毒素与VEGFR2/KDR以高亲和力特异结合并内化进入肿瘤新生血管内皮细胞，然后核糖体失活蛋白rGEL30发挥毒素效应，杀伤肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，达到抑制肿瘤的目的，并且，融合毒素C-末端的内质网定位信号KDEL可促进游离rGEL30毒素在粗面内质网富集，进一步增强融合毒素的抗肿瘤效果。此外，该融合毒素的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合毒素为活性成分制备成抗肿瘤药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为在大肠杆菌中表达的Trx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果
图2为大肠杆菌中表达并经纯化的mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果
图3为纯化的rhVEGF121KDR/rGEL30的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果
图4为rhVEGF121KDR/rGEL30对PAE/KDR和PAE/FLT细胞的毒性作用
图5为不同实验组人结肠癌HT-29细胞移植瘤大小情况
图6为不同实验组人结肠癌HT-29细胞移植瘤生长曲线
具体实施方式
本发明提供了一种具有VEGFR2/KDR受体特异性的重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素，是通过连接肽在白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的氨基端（N端）连接重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）得到的融合毒素，且所述融合毒素的羧基端（C端）具有内质网定位序列。
所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中SEQIDNO：3所示，其编码基因的核苷酸序列可如序列表中SEQIDNO：4所示。
所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。
所述内质网定位序列的氨基酸残基序列可如序列表中序列SEQIDNO：5所示，其编码基因的核苷酸序列可如序列表中SEQIDNO：6所示。
具体来讲，所述融合毒素，命名为rhVEGF121KDR/rGEL30，是下述氨基酸残基序列之一：
1）序列表中的SEQIDNO：1；
2）将序列表中SEQIDNO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有VEGFR2/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。
序列表中的SEQIDNO：1由377个氨基酸残基组成，自氨基端第1-121（121aa）位氨基酸残基为重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自氨基端第122-126（5aa）位氨基酸残基为连接肽，自氨基端第127-377（251aa）位氨基酸残基为白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，同时，需要特别指出的是：与天然白树籽核糖体失活蛋白相比，在本发明中，融合毒素的末两位氨基酸残基分别由Pro376和Lys377突变为Glu376和Leu377，即将天然白树籽核糖体失活蛋白的末两位氨基酸残基Pro250和Lys251突变为Glu250和Leu251，使得融合毒素自氨基端第374-377（4aa）位氨基酸残基，即白树籽核糖体失活蛋白自氨基端第248-251（4aa）变为粗面内质网定位序列Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL），使融合毒素具有粗面内质网定位功能，进而提高毒素对细胞的杀伤力。
与天然型的人血管内皮生长因子VEGF121的氨基酸残基序列相比较，所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30中重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR）的氨基酸序列含有以下氨基酸残基的改变：VEGF121序列中的氨基酸残基Asp63、Gly65、Leu66和Lys115，在rhVEGF121KDR序列中分别突变为Ser63、Met65、Arg66和Asn115。Asp63、Gly65、Leu66和Lys115是VEGF121分子中参与VEGFR1/Flt1作用的关键氨基酸，突变为Ser63、Met65、Arg66和Asn115后，VEGF121突变体则失去了与VEGFR1/Flt1结合的能力，但具有VEGFR2/KDR受体特异性，蛋白的稳定性也大大提高。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的多肽片段、衍生物和类似物也是本发明要保护的，是指与本发明rhVEGF121KDR/rGEL30具有相同生物学功能或活性的多肽片段、衍生物或类似物，其中，多肽片段可定义为：1）由一个或多个保守或非保守氨基酸残基（优选为保守性氨基酸残基）所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2）在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3）成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4）附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其它抗原配体序列的融合毒素），或是将编码另一个多肽的核酸序列（或其部分）与本发明的核酸序列（或其部分）融合就可以获得融合多肽的编码序列，再使该融合多肽的编码序列获得表达，就可产生融合多肽。所述产生融合多肽的技术为本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且使融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的衍生物是指采用本发明中VEGF121突变体VEGF121KDR与其它毒素分子融合构建而成的融合毒素。
所述rhVEGF121KDR/rGEL30的类似物与rhVEGF121KDR/rGEL30的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。所述类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明融合毒素的氨基酸残基序列并不限于上述例举的具有代表性的序列。
所述rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素还可为经过修饰的，或经修饰提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的rhVEGF121KDR/rGEL30多肽。修饰（通常不改变一级结构）形式包括：1）体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2）糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3）具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸）的序列。
编码上述融合毒素的基因（rhVEGF121KDR/rGEL30)，是下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQIDNO：2的DNA序列；
2）编码序列表中SEQIDNO：1的DNA序列；
3）与序列表中SEQIDNO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性并具有VEGFR2/KDR受体特异性和选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQIDNO：2由1131个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1131位碱基，编码具有序列表中SEQIDNO：1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基编码重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自5’端第364-378位碱基编码连接肽，自5’端第379-1131位碱基编码白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，其中，自5’端第1120-1131位碱基编码内质网定位信号。
编码本发明rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
本发明还提供了所述融合毒素多核苷酸的变异体，其编码与rhVEGF121KDR/rGEL30有相同氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
含有本发明基因rhVEGF121KDR/rGEL30的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增rhVEGF121KDR/rGEL30中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种重组表达上述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的方法，是将含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体（AHRosenberg，etal.VectorsforselectiveexpressionofclonedDNAsbyT7RNApolymerase.Gene.1987,56(1):125-135）；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体（SJLeeandDNathans.Proliferinsecretedbyculturedcellsbindstomannose6-phosphatereceptors.J.Biol.Chem.1988;263:3521-3527）和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。所述出发载体优选为包括一种含有硫氧化还原蛋白（Trx）突变体（mTrx）的融合表达载体，命名为pmTrx载体，该载体是以pET32a(+)序列为基础，将其Trx序列中的Gly34和Pro35位氨基酸残基突变为Pro34和Tyr35后得到的，所述硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。Trx突变体（mTrx）在蛋白表达过程中更有效促进细菌胞浆中目的蛋白二硫键的形成，大大促进了融合蛋白的可溶性表达。
序列表中SEQIDNO：7由109个氨基酸残基组成，自氨基端第33-36（4aa）位氨基酸残基为Cys-Pro-Tyr-Cys（这四个氨基酸的此种排列组合具有更高的氧化势能，因而能促进重组蛋白质多肽链中二硫键的形成及正确折叠），自氨基端第34位氨基酸残基为突变氨基酸残基Pro34，自氨基端第35位氨基酸残基为突变氨基酸残基Tyr35。
其中，以pmTrx载体为出发载体，构建的含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因的重组表达载体为pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述重组表达载体中pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30中氨基端（N端）连接硫氧化还原蛋白突变体（mTrx）标签的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示，所述融合毒素编码基因上游添加限制性内切酶XbaI识别位点，下游添加限制性内切酶NotI识别位点。
可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等（Sambrook，etalMolecularcloing，aLaboratoryManual.Coldspringharborlaboratory.NewYork，1989）。所述具有KDR受体特异性的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白（GFP）基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。
所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。
可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。
培养含有本发明具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
此外，转化或转导有以pmTrx载体为出发载体构建的含有融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因的重组表达载体pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的宿主细胞中表达的融合蛋白具有mTrx标签，应用工具酶切割去除mTrx标签，最终得到融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30。
所述用工具酶切割去除mTrx标签的方法为：按每1单位凝血酶裂解5毫克融合蛋白，室温消化过夜。
所述融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30及其编码基因可用于制备抗肿瘤药物，因而本发明还提供了一种抗肿瘤药物。
本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分为上述具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30或其编码基因。
所述具有抗肿瘤作用的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30基因可存在于真核表达载体中。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。荷瘤裸鼠试验结果表明，本发明的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30在静脉注射剂量为4mg/kg体重/次时，可明显延缓异体移植肿瘤的生长。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor）。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由北京奥科公司完成。
实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30的表达及纯化
一、构建重组表达载体pTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30和pET32a(+)-rhVEGF121KDR/rGEL30
1、构建重组表达载体pTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30
1）由北京奥科公司合成氨基端（N端）连接硫氧化还原蛋白（Trx）突变体（mTrx）（硫氧化还原蛋白突变体mTrx的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。序列表中SEQIDNO：7由109个氨基酸残基组成，自氨基端第33-36（4aa）位氨基酸残基为Cys-Pro-Tyr-Cys，自氨基端第34位氨基酸残基为突变氨基酸残基Pro34，自氨基端第35位氨基酸残基为突变氨基酸残基Tyr35）的重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素rhVEGF121KDR/rGEL30编码基因，并在上游添加限制性内切酶XbaI识别位点，下游添加限制性内切酶NotI识别位点，将该融合基因命名为mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示，序列表中的SEQIDNO：9由1602个碱基组成，自5’端第1-6位碱基为XbaI识别位点，自5’端第7-42位碱基为启动密码子上游序列，自5’端第43-369位碱基编码硫氧化还原蛋白突变体mTrx（其中自5’端第43-45位碱基为启动密码子），自5’端第391-408位碱基编码6个组氨酸标签（6×His），自5’端第418-435位碱基编码凝血酶识别序列（LVPRGS）。另外，需要指出的是：自5’端第370-390位碱基、第409-417位碱基不编码具有特定功能的氨基酸残基或多肽，并在下游纯化时和组氨酸标签一起经凝血酶切除。自5’端第436-798位碱基编码重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自5’端第799-813位碱基编码连接肽，自5’端第814-1566位碱基编码白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，自5’端第1555-1566位碱基编码内质网定位信号，自5’端第1567-1569位碱基为终止密码子（TAA），自5’端第1570-1602位碱基依次为EcoRI、SacI、SalI、HindIII、NotI识别位点。
2）对载体pET30a(+)和融合基因mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30用限制性内切酶XbaI和NotI进行双酶切，酶切体系（20ul）及酶切条件为：2μl10×Buffer2，16μl载体（或融合基因），1μlXbaI,1μlNotI，混匀，37℃酶切2小时。酶切后，用天根公司的凝胶DNA回收试剂盒回收并纯化pET30a(+)载体片段和mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合基因片段，然后将两个DNA片段进行连接，连接体系及连接条件为：1μlpET30a(+)载体片段，5μlmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合基因片段，3ul10×T4DNA连接酶缓冲液，1ulT4DNA连接酶，20μlH2O，混匀，16℃连接过夜。反应结束后，取5ul连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化子涂布于含有200ug/mL羧苄青霉素的LB抗性平板上，37℃培养过夜，对在抗性平板上长出的4个单菌落分别接种于5mL含有200ug/mL羧苄青霉素的LB培养基中，37℃、250rpm培养过夜，提取质粒，进行测序鉴定。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的携带融合基因mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的重组表达载体，命名为pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30。
2、构建重组表达载体pET32a(+)-rhVEGF121KDR/rGEL30
对载体pET30a(+)和重组表达载体pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30用限制性内切酶NdeI和NotI进行双酶切，酶切体系（20ul）及酶切条件为：2μl10×Buffer2，16μl载体，1μlNdeI，1μlNotI，混匀，37℃酶切2小时。酶切后，回收并纯化pET30a(+)载体片段和rhVEGF121KDR/rGEL30融合基因片段，然后将两个DNA片段进行连接，连接体系及连接条件为：1μlpET30a(+)载体片段，5μlrhVEGF121KDR/rGEL30融合基因片段，3ul10×T4DNA连接酶缓冲液，1ulT4DNA连接酶，20μlH2O，混匀，16℃连接过夜。反应结束后，取5ul连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化子涂布于含有200ug/mL羧苄青霉素的LB抗性平板上，37℃培养过夜，对在抗性平板上长出的4个单菌落分别接种于5mL含有200ug/mL羧苄青霉素的LB培养基中，37℃、250rpm培养过夜，提取质粒，进行测序鉴定。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的携带融合基因rhVEGF121KDR/rGEL30的重组表达载体，命名为pET32a(+)-rhVEGF121KDR/rGEL30，其中，融合基因rhVEGF121KDR/rGEL30的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示由1131个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1131位碱基，编码具有序列表中SEQIDNO：1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基编码重组人血管内皮生长因子VEGF121突变体（rhVEGF121KDR），自5’端第364-378位碱基编码连接肽，自5’端第379-1131位碱基编码白树籽核糖体失活蛋白rGEL30，自5’端第1120-1131位碱基编码内质网定位信号。
二、mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30和rhVEGF121KDR/rGEL30在大肠杆菌中的表达
具体表达方法包括以下步骤：
1）将pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30和pET32a(+)-rhVEGF121KDR/rGEL30质粒分别转化大肠杆菌Origami（DE3），37℃培养16-20小时。将单菌落接种于10mLLB培养基（含羧苄青霉素200ug/mL，卡那霉素30ug/mL和四环素25ug/mL）中，37℃、250rpm条件下培养过夜。
2）将10mL过夜培养物转接至1LLB培养基（含羧苄青霉素200ug/mL，卡那霉素30ug/mL和四环素25ug/mL）中，37℃、250rpm条件下培养至OD6000.6（约4hrs）。
3）加入IPTG至终浓度为0.1mM（加入1MIPTG溶液100ul），20℃、250rpm条件下继续培养过夜，6000rpm离心5分钟收获细菌。
4）将细菌沉淀重悬于40mL10mMTris·HCl（pH8.0）中，冰浴中超声破碎（功率300W，每次5秒，间隔5秒，共50次），4℃、12000rpm离心30分钟，收集上清。
取离心前、后样品进行12％SDS-PAGE电泳检测，鉴定蛋白可溶性，在大肠杆菌中表达的Trx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1（泳道1为诱导前的菌体蛋白，泳道2为诱导后的菌体蛋白，泳道3为裂解上清，泳道4为裂解沉淀）所示，在大肠杆菌中表达的mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图2（泳道1为诱导前的菌体蛋白，泳道2为诱导后的菌体蛋白，泳道3为裂解上清，泳道4为裂解沉淀）所示，经IPTG诱导表达后，获得了分子量为56kd的重组蛋白，与预期结果一致。mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30（pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30转化菌表达产物）主要以可溶的形式表达（蛋白存在于裂解上清中），而Trx-rhVEGF121KDR/rGEL30（pET32a(+)-rhVEGF121KDR/rGEL30转化菌表达产物）则主要以包涵体的形式存在（蛋白存在于裂解沉淀中），表明pmTrx载体明显促进rhVEGF121KDR/rGEL30中二硫键的形成进而促进融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。
三、mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素的纯化
1）应用Ni-SepharoseFF亲和层析纯化mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30融合蛋白：用5倍柱床体积的结合缓冲液（10mMTris·HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡镍柱。将细胞粗提液缓慢上柱，流速约0.5mL∕min；用10倍柱床体积的洗液（10mMTris·HCl，pH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑）洗脱杂蛋白。用含有300mMNaCl、250mM咪唑的10mMTris·HCl，pH8.0洗脱目的蛋白，收集3倍柱床体积的洗脱液。
取样，进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图2（泳道5为纯化的mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30）所示，表明获得了纯度较高的融合蛋白mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30。
2）融合蛋白mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的切割及mTrx标签的去除：按每1单位凝血酶裂解5毫克融合蛋白，室温消化过夜。
3）融合蛋白rhVEGF121KDR/rGEL30的进一步纯化：应用BlueSepharose6FastFlow亲和层析纯化rhVEGF121KDR/rGEL30蛋白。上柱：用5倍柱床体积的20mMTris·HCl（pH7.4），50mMNaCl缓冲液平衡凝胶柱。将步骤4酶切产物缓慢上柱，流速约为0.5mL/min。洗柱：用10倍柱床体积的20mMTris·HCl（pH7.4），150mMNaCl缓冲液洗脱杂蛋白。洗脱：洗脱液为20mMTris·HCl（pH7.4），2MNaCl，收集2个柱床体积。透析或凝胶过滤置换缓冲液：10mMTris·HCl（pH7.4），150mMNaCl。
取样，进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图3（泳道1、2为纯化的rhVEGF121KDR/rGEL30）所示，表明获得了高纯度的目的蛋白rhVEGF121KDR/rGEL30。
实施例2、rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素对PAE/KDR和PAE/FLT细胞的毒性检测
检测rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素对PAE/KDR和PAE/FLT细胞的毒性作用，具体方法包括以下步骤：
1）稀释对数生长期的PAE/KDR和PAE/FLT细胞至1.5×104/mL，加入96孔板，每孔200μl（3000个细胞/孔）（第一排不加细胞），37℃、5％CO2孵育过夜。在96孔板中梯度（10-3、10-2、10-1、100、101、102、103、104)释释rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素（起始浓度为1μM），每孔最终体积为200μl。倒掉细胞培养孔中的培养基，加入不同浓度的融合毒素（第一排加新鲜培养基，第二排不加毒素），37℃、5％CO2培养72小时。
2）倒掉细胞培养孔中的培养基，加入100μl0.5％结晶紫溶液(用20％甲醇配制)，室温孵育30分钟，洗掉染料，风干。
3）加入150μlSorenson’s缓冲液（0.1M柠檬酸钠，pH4.2，50％乙醇），室温孵育60-90分钟，630nm测定吸光度。
4）测定各孔的吸光度（A）值，按公式计算成活率：（实验孔平均OD值／阴性对照孔平均OD值）×100％，并绘制细胞成活曲线。
结果如图4（横坐标为rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素浓度，纵坐标为细胞存活率）所示，VEGFR2/KDR阳性细胞PAE/KDR和VEGFR1/Flt1阳性细胞PAE/FLT的IC50分别为0.32nM和278nM，后者是前者的800倍，表明rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素对VEGFR2/KDR高表达的血管内皮细胞具有特异的毒性作用。
实施例4、rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素的动物抗肿瘤药效学观察
取5周龄Balb/c裸鼠，雌性，体重为18-20g。将结肠癌HT-29细胞系接种于裸鼠腰背部皮下,肿瘤生长至约200（mm）3后，取出并匀浆，如此体内传代2次，然后以1×106/0.2mL浓度再分别接种于裸鼠腰背部皮下，接种后将其送回动物饲养室继续饲养。接种后约一周左右，小鼠接种部位皮下可触及直径2-3mm大小的硬结节，表示小鼠移植瘤模型建立成功。将动物随机分为4组，每组6只。开始给药。
给药剂量、频率和用药期限：
阴性对照组（阴性对照组）：尾静脉注射治疗组等量的生理盐水，2天1次，连续5次。
化药治疗对照组（阳性对照组）：参照临床用药途径和剂量，每天给予亚叶酸钙10mg/kg,5-氟尿嘧啶（5-FU）20mg/kg腹腔注射，连续5天。
rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素组（10mg/kg低剂量组）：尾静脉注射，2mg/kg/次，2天1次，共5次。
rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素组（20mg/kg中剂量组）：尾静脉注射，4mg/kg/次，2天1次，共5次。
rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素组（40mg/kg高剂量组）：尾静脉注射，8mg/kg/次，2天1次，共5次。
绘制肿瘤生长曲线：从给药之日（设为0天）起开始用游标卡尺测量肿瘤大小，每2-3天测瘤径一次，同时观察动物的生长情况，直至实验结束。肿瘤体积（V）=a×b2×0.52，a为长径，b为短径，绘制肿瘤生长曲线。
计算治疗组相对肿瘤增长率：相对肿瘤增长率计算公式如下，T/C％=TRTV/CRTV*100％（TRTV:治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV）。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0，其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
不同实验组人结肠癌HT-29细胞移植瘤大小情况如图5所示，不同实验组人结肠癌HT-29细胞移植瘤生长曲线如6所示，rhVEGF121KDR/rGEL30对人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用如表1所示，在人结肠癌裸鼠移植瘤模型中，可见低、中、高剂量组和阳性对照组移植瘤增长明显减缓，相对肿瘤体积显著小于阴性对照组（P<0.01），相对肿瘤增殖率分别为36.36％、25.04％、24.53％和14.16％，表明rhVEGF121KDR/rGEL30融合毒素可显著抑制结肠癌HT-29细胞移植瘤生长。
表1rhVEGF121KDR/rGEL30对人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

Claims (3)

1.一种在大肠杆菌中表达并纯化具有VEGFR2/KDR受体特异性的重组融合毒素的方法，是将含有所述融合毒素的编码基因的重组表达载体转化大肠杆菌，培养大肠杆菌，从培养基或菌体中分离纯化蛋白，得到融合毒素；
构建所述重组表达载体的出发载体为一种含有硫氧化还原蛋白突变体mTrx的融合表达载体pmTrx，该载体是以pET32a(+)序列为基础，将其Trx序列中的Gly34和Pro35位氨基酸残基突变为Pro34和Tyr35后得到的，所述硫氧化还原蛋白突变体mTrx的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示；
合成人血管内皮生长因子VEGF121突变体与白树籽核糖体失活蛋白rGEL30的融合毒素的编码基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示；
以pmTrx载体为出发载体构建含有融合毒素编码基因的重组表达载体pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30；所述重组表达载体pmTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30中氨基端连接硫氧化还原蛋白突变体mTrx标签的融合毒素编码基因mTrx-rhVEGF121KDR/rGEL30的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示，其中序列表中SEQIDNO：2所示的融合毒素编码基因其氨基端连接序列表SEQIDNO：8所示的硫氧化还原蛋白突变体mTrx标签的编码基因，上游添加限制性内切酶XbaI识别位点，下游添加限制性内切酶NotI识别位点；
将重组表达载体转化大肠杆菌，在大肠杆菌中表达的融合蛋白具有mTrx标签，应用工具酶切割去除mTrx标签，最终得到所述融合毒素，其氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：1所示；所述用工具酶切割去除mTrx标签的方法为：按每1单位凝血酶裂解5毫克融合蛋白，室温消化过夜。
2.权利要求1方法制备得到的具有VEGFR2/KDR受体特异性的融合毒素，其氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO：1所示，其编码基因如序列表中SEQIDNO：2所示。
3.权利要求2所述的融合毒素或所述融合毒素的编码基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
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