CN107513107B - 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用 - Google Patents

抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107513107B
CN107513107B CN201610423430.3A CN201610423430A CN107513107B CN 107513107 B CN107513107 B CN 107513107B CN 201610423430 A CN201610423430 A CN 201610423430A CN 107513107 B CN107513107 B CN 107513107B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
tumor
protein
tumor fusion
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610423430.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107513107A (zh
Inventor
王庆诚
叶丹荣
沈如凌
费俭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Model Organisms Center Inc
Original Assignee
Shanghai Model Organisms Center Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Model Organisms Center Inc filed Critical Shanghai Model Organisms Center Inc
Priority to CN201610423430.3A priority Critical patent/CN107513107B/zh
Publication of CN107513107A publication Critical patent/CN107513107A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107513107B publication Critical patent/CN107513107B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了一种由核糖核酸酶Amphinase和转化生长因子TGFα或表皮生长因子EGF构成的抗肿瘤融合蛋白。本发明的抗肿瘤融合蛋白不仅保持有Amphinase的原有活性，还具有显著地抑制高表达EGFR的肿瘤细胞生长的活性，可以广泛用于抗肿瘤的治疗。本发明还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，和制备所述融合蛋白的方法。

Description

抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
技术领域
本发明涉及DNA重组技术和生物药物领域。具体地，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用。更具体地，本发明还涉及编码所述抗肿瘤融合蛋白的DNA序列，含有所述DNA序列的载体，含有所述载体的宿主细胞，生产所述抗肿瘤融合蛋白的方法，含有抗肿瘤融合蛋白的药物组合物，以及所述抗肿瘤融合蛋白在肿瘤治疗方面的应用。
背景技术
免疫毒素用于抑制癌细胞生长或抗肿瘤治疗方面的研究已经有很长时间的历史。早期的免疫毒素大多采用植物毒素作为弹头药物，由于过敏原性问题以及生成的免疫毒素抗肿瘤活性较低，目前已很少采用。目前在临床上成功应用的免疫毒素多由细菌毒蛋白(如白喉毒素或绿脓杆菌外毒素)构建，这些免疫毒素已用于白血病，淋巴肉瘤及脑瘤等的治疗上。然而，由于细菌毒蛋白很高的免疫原性的限制，在采用全身性用药治疗肿瘤时，病人体内会很快产生对免疫毒素的中和抗体，严重削弱其抗肿瘤活性。因此，迄今免疫毒素仍然不能在临床上广泛应用于许多实体瘤的治疗。。
与此同时，几十年来一直有人试图用RNase治疗肿瘤。由于肿瘤细胞内固有的RNase抑制蛋白的存在，许多RNase在细胞内的抗肿瘤活性非常低，无法成为实用的抗肿瘤药物。直到两栖类RNase的酶活性被发现不受哺乳动物细胞内固有的RNase抑制蛋白的抑制，对肿瘤细胞的生长具很强的抑制活性，而且免疫原性很低，用RNase或其衍生物治疗肿瘤的课题才重新活跃起来。豹蛙卵或早期胚胎中含有一系列强烈抑制肿瘤的RNases，其中Onconase已被应用于恶性间皮细胞瘤的治疗，并被证明具很低的免疫原性。与其同源的Amphinase和Onconase一样，具广谱的抗肿瘤活性。肿瘤转化因子TGFα是一种与EGF结构相似并共享其受体EGFR的多肽，由其与细菌毒蛋白构建的免疫毒素已在脑瘤治疗中开始临床试验。但由于很高免疫原性以及对正常肝细胞具一定毒性，在其他实体肿瘤的治疗上尚有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用。
本发明的另一目的在于提供编码所述抗肿瘤融合蛋白的DNA、含有所述DNA序列的载体以及含有所述载体的宿主细胞。
本发明的另一目的在于提供生产所述抗肿瘤融合蛋白的方法以及含有抗肿瘤融合蛋白的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种抗肿瘤融合蛋白，所述的抗肿瘤融合蛋白具有式Ia或Ib所述结构：
D-A-B-C (Ia)
D-C-B-A (Ib)
其中，
A为Amphinase蛋白元件；
B任选的连接肽元件；
C为TGFα蛋白元件或EGF蛋白元件；
D为任选的信号肽和/或前导肽序列；
“-”表示连接上述各元件的肽键。
在另一优选例中，所述的Amphinase蛋白来源于两栖动物，较佳地来源于豹蛙。
在另一优选例中，所述的Amphinase蛋白包括野生型和突变型。
在另一优选例中，所述的Amphinase蛋白包括全长的、成熟形式的Amphinase，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的Amphinase蛋白的序列如SEQ ID NO.:2中第1-114位所示。
在另一优选例中，所述的元件C为TGFα蛋白元件。
在另一优选例中，所述的TGFα蛋白来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的TGFα蛋白包括野生型和突变型。
在另一优选例中，所述的TGFα蛋白包括全长的、成熟形式的TGFα，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的TGFα蛋白的序列如SEQ ID NO.:2中第120－169位所示。
在另一优选例中，所述的EGF蛋白来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的EGF蛋白包括野生型和突变型。
在另一优选例中，所述的EGF蛋白包括全长的、成熟形式的EGF，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的EGF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中，所述的EGF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
在另一优选例中，所述连接肽的长度为0-10氨基酸，较佳地为1-5个氨基酸。
在另一优选例中，所述连接肽元件包括序列为GGGGS(SEQ ID NO.:2中第115-119位)的连接肽。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白是由大肠杆菌表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白是不经糖基化修饰的蛋白。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白选自下组：
(A)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有抑制肿瘤细胞生长的活性；
(C)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留抑制肿瘤细胞生长活性的衍生多肽。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括高表达EGFR的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述抗肿瘤融合蛋白具有抑制肿瘤细胞生长的活性。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗肿瘤融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体包括：慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体包括表达载体。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的第五方面，提供了一种生产抗肿瘤融合蛋白的方法，包括步骤：
(a)在适合表达条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的抗肿瘤融合蛋白；
(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的抗肿瘤融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的抗肿瘤融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述抗肿瘤融合蛋白的用途，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌，非小细胞肺癌，食道癌，胃癌，肠癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫内皮与子宫颈癌，前列腺癌，肾癌，膀胱癌，肝癌，神经母细胞瘤，头颈部癌，甲状腺癌，脑癌等。
在本发明的第八方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的抗肿瘤融合蛋白存在的条件下，培养所述肿瘤细胞。
在本发明的第九方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗肿瘤融合蛋白。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。
在另一优选例中，所述的对象是人。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了含AGT免疫毒素基因的大肠杆菌表达质粒pET22b-AGT的图谱。
图2显示了AGT融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。
其中，图2A显示了诱导前和诱导后的AGT菌液的SDS-PAGE电泳图，各泳道如下：1，2，3，4，5，6，7分别是不同单克隆诱导表达前，8，9，10，11，12，13，14分别是对应的单克隆诱导表达后；M为分子量标准，箭头所指为AGT目标条带，分子量为19KD。
图2B显示了纯化后的AGT融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。各泳道如下：1为分子量标准，2为AGT纯化后样品；
图3显示了AGT和Amph对人表皮癌细胞A431的细胞毒性效果图。
图4显示了AGT和Amph对人宫颈癌细胞Caski的细胞毒性效果图。
图5显示了AGT和Amph对人食道癌细胞TE-1的细胞毒性效果图。
图6显示了AGT和Amph对人乳腺癌细胞MDA-MB-468的细胞毒性效果图。
图7显示了AGT和Amph对人神经母细胞瘤BE2C的细胞毒性效果图。
图8显示了动物实验中AGT对实体肿瘤的抑制效果图。图中，AGT-H、AGT-M、AGT-L、A15GT分别表示AGT高剂量，中剂量低剂量和阴性对照
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，终于成功地获得了一种抗肿瘤融合蛋白，所述的抗肿瘤融合蛋白由核糖核酸酶Amphinase和转化生长因子TGFα或表皮生长因子EGF构成。实验表明，本发明的抗肿瘤融合蛋白不仅保持有Amphinase的原有活性，还具有显著地抑制高表达EGFR的肿瘤细胞生长的活性，可以广泛用于抗肿瘤的治疗。本发明还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，和制备所述融合蛋白的方法。
具体地，本发明人将Amph基因和编码TGFα或EGF的核苷酸序列融合在一起，并在大肠杆菌中进行了高效表达，经纯化获得了抗肿瘤融合蛋白，所述蛋白既保留了Amphinase以及TGF或EGF各自的生物活性，又提高了其抑制癌细胞生长的能力，使其有可能成为一种新的更有效的抗肿瘤药物。
Amphinase
如本文所用，Amphinase是一种豹蛙卵或其早期胚胎中含有的RNases。Amphinase不受RNase抑制蛋白的抑制，能够显著抑制肿瘤的生长，而且免疫原性很低，Amphinase或其衍生物可用于治疗肿瘤。在豹蛙卵中存在4种Amphinases。它们的结构十分相似，分子量大致相同，均为14000道尔顿。它们的均为糖蛋白。它们均具很强抑制多种肿瘤细胞生长的活性。因为其中只有Amphinase-2(Amph-2)的天然和基因重组(非糖基化)两种形式的三级结构已被解出，并发现重组Amphi-2与野生型具有相同的活性，因此我们采用Amph-2与人源TGF一起构建AGT融合蛋白。
TGFα
如本文所用，肿瘤转化因子TGFα是一种与EGF结构相似并共享其受体EGFR的多肽，由其与细菌毒蛋白构建的免疫毒素已在脑瘤治疗中开始临床试验，但由于其较高免疫原性以及对正常肝细胞的毒性，在其他实体肿瘤的治疗上尚有待改进。
很多种肿瘤细胞由上皮衍化而来，其中相当一部分高表达EGFR，它们往往对TGFα，即对本发明的融合蛋白相当敏感，因此本发明的融合蛋白可以作为广谱的抗癌药物。
EGF
EGF上皮生长因子是一个53个氨基酸残基构成的多肽，分子量约6000道尔顿。其一级结构与TGFα有30-40％相似性；其二级结构与TGFα十分相似，都含有三个二硫键。它有对应的受体，EGFR与其专一地结合，一旦结合，将加速细胞的生长。
抗肿瘤融合蛋白
如本文所用，术语“抗肿瘤融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“本发明免疫毒素”可互换使用，是指具有式Ia或Ib所述结构，即由核糖核酸酶序列和TGFα或EGF氨基酸序列融合而成的免疫毒素，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
如本文所用，术语“AGT融合蛋白”、“AGT”、“核糖核酸酶Amphinase与转化生长因子α融合蛋白”、“免疫毒素Amph-G-TGFα”可互换使用，是本发明融合蛋白的一种优选的实施方式，其是由三个单元构成的免疫毒素(融合蛋白)：TGFα(T)-G-linker(G)-Amphinase(A)。其中T负责将免疫毒素靶向EGFR，一种优选的G是序列为GGGGS的五肽，供链接用，A是Amphinase-2，对肿瘤细胞具很强毒性，与天然Amphinase强度相似。天然Amphinase具糖链，但在大肠杆菌中表达的Amphinase及其免疫毒素不具糖链，因此没有糖链带来的免疫原性问题。三个单元的位置可以互换。本发明的免疫毒素对各种高表达EGFR的肿瘤细胞表现广谱的细胞毒性。对高表达EGFR的细胞，其细胞毒性比游离Amphinase增强几十到几千倍。在体内实验中，本发明的免疫毒素几近完全地抑制肿瘤生长达三个月以上，但对小鼠未显示明显的毒性。本发明的新型免疫毒素对实体肿瘤的治疗具很大潜力。
本发明的AGT融合蛋白要求靶细胞上的EGFR表达量超过一定值才显现远高于Amph独用时的细胞毒性，同时也降低了对肝细胞等正常细胞的毒性。这个特点虽然限制了其应用的范围，但换来了对动物整体不常见的低毒性，是非常值得的。
本发明的融合蛋白，可任选地含有连接肽。连接肽大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，连接肽应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免连接肽中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。连接肽的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地1-5个氨基酸。
应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0001017635350000071
Figure BDA0001017635350000081
一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。
此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。
上表是目前获取基因变种的通用方法
多核苷酸
本发明的多核苷酸，是编码本发明免疫毒素的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得编码核糖核酸酶和TGFα氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明免疫毒素的DNA序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
在获得了编码本发明免疫毒素的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，并分离纯化得到本发明的免疫毒素。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
本发明融合蛋白或其元件(如Slit2D2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列地转录，那么它就是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新免疫毒素的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
药物组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对肿瘤患者，通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物可以是仅含有AGT融合蛋白，也可以含有其他抗肿瘤的刺激免疫的蛋白。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的融合蛋白能很好地抑制EGFR高表达的癌细胞生长；
(b)本发明融合蛋白的免疫原性很低；
(c)本发明融合蛋白的毒性极低；
(d)本发明的融合蛋白非常稳定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
AGT免疫毒素编码基因的合成以及大肠杆菌表达质粒的构建
为保证Amphinase和TGFα连接后的活性，以一段5个氨基酸的连接序列GGGGS(简称G)将Amph和TGFα连接起来。通过全合成方法获得G-TGFα基因(SEQ ID NO.:3)，根据Amph和TGFα的基因序列设计并合成了下列一对引物：
AGT-U：5’CTCGCAGCcatatgAAACCGAAAGAAG 3’(SEQ ID NO.:4)
AGT-L：5’AAAGGATCCTCAGGCCAGCAGGTC 3’(SEQ ID NO.:5)
以AGT-U和AGT-L为引物，含Amph基因片断和G-TGFα基因片断的混合物为模板，用高保真DNA聚合酶PCR扩增AGT基因序列，产物经凝胶纯化后用Nde I和BamH I酶切，1％琼脂糖凝胶电泳割胶回收得到AGT的插入片断。将质粒pET22b(+)分别用Nde I和BamH I酶切，1％琼脂糖凝胶电泳割胶回收得到pET22b的载体片断，将插入片断和载体片断用T4DNA连接酶连接得到pET22b-AGT质粒(图1)。
经测序验证，得到的融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.:1所示，其中第1-342位为Amph序列；第343－357位为连接肽的编码序列，第358－507位为TGFα序列。
所述融合基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，其中第1-114位为Amph；第115－119位为连接肽，第120－169位为TGFα。
实施例2
AGT融合蛋白的表达
将实施例1中构建的表达质粒转化常规的大肠杆菌BL21(DE3),隔夜挑单克隆于50ml LB培养基中,于37℃培养过夜.次日按1:20转接1L TB培养基,于37℃培养至A600＝2.0,加IPTG浓度至0.5mM诱导3h30min,4℃,6000rpm*10min离心收集菌体,菌体用于下一步的包涵体收集和纯化。
结果如图2A所示。目标蛋白的分子量与预测值相同，为19kD。
实施例3
包涵体收集和洗涤
将收集到的菌体悬浮在缓冲液SSB_A(20mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)中，用超声波破碎仪破碎菌体；4℃,12000rpm*10min离心,收集包涵体；WIBB(20mM Tris-HCl,1MGuanidine-HCl,65-650mM DTT,2mM EDTA,pH 8.0)悬浮包涵体，搅拌过夜，4℃,12000rpm*10min收集包涵体。
实施例4
蛋白变复性
将1L菌液得到的包涵体溶解于6ml DIBB(20mM Tri s-HCl,7M Guanidine-HCl,65-650mM DTT,2mM EDTA,pH 8.0)中,搅拌过夜；4℃,12000rpm*15min,离心收集上清，将蛋白定量至浓度为10mg/ml；将1ml包涵体溶液缓慢稀释到20-200ml RB(0.1-1.0M Arginine-HCl,20mM Tris-HCl,0.6-6mM oxidized Glutathione,1mM EDTA,pH8.0-11.0),4-37℃,12000rpm*30min离心弃沉淀；在复性缓冲液RB中4-37℃复性24～48小时后,用透析液(0.5MUrea,1mM EDTA,20mM Na-PO4,pH6.0)透析或超滤膜超滤去盐。蛋白溶液存于4℃备用.
实施例5
蛋白纯化
将复性好的蛋白溶液定量后上强阳离子交换柱
(1)层析柱为SP-Sepharose(2×2cm，Pharmacia)，流动相为PB1(20mM Na-PO4,pH6.0)和PB2(20mM Na-PO4,1M NaCl,pH6.0)，流速4ml/min。0-100％PB2梯度洗脱30个柱体积并收集吸收峰对应洗脱样品。
(2)层析柱为Mono S(HR5/5，1ml，pharmacia)，流动相为PB1(20mM Na-PO4 pH6.0)和PB2((20mM Na-PO4,1M NaCl,pH6.0)，流速1ml/min。
洗脱方法：0-100％PB1-PB2梯度洗脱30个柱体积,收集洗脱样品。
结果如图2B所示。目标蛋白的分子量与预测值相同，为19kD。
实施例6
AGT和Amph蛋白的细胞毒性测定
1.AGT和Amph对人表皮癌细胞A431的细胞毒性测定
人表皮癌细胞A431培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/m1)，链霉素(100μg/ml)的DMEM(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×104cells/m1)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，按设定的浓度梯度加蛋白样品10μl，对照组加PBS，培养24h后，MTT法检测细胞存活率。
结果如图3所示，AGT和Amph对于A431的IC50约为1.92nM和19.6μM。
2.AGT和Amph对人宫颈癌细胞Caski的细胞毒性测定
人宫颈癌细胞Caski培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/m1)，链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×104cells/m1)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，按设定的浓度梯度加蛋白样品10μl，对照组加PBS，培养72h后，MTT法检测细胞存活率。
结果如图4所示，AGT和Amph对于Caski的IC50约为2.3nM和2.087μM。
3.AGT和Amph对人食道癌细胞TE1的细胞毒性测定
人食道癌细胞4T1培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/m1)，链霉素(100μg/ml)的RPMI1640(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×104cells/m1)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，按设定的浓度梯度加蛋白样品10μl，对照组加PBS，培养72h后，MTT法检测细胞存活率。
结果如图5所示，AGT和Amph对于TE1的IC50约为4.2nM和7.15μM。
4.AGT和Amph对乳腺癌细胞MDA-MB-468的细胞毒性测定
培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/m1)，链霉素(100μg/ml)的L15(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×104cells/m1)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，按设定的浓度梯度加蛋白样品10μl，对照组加PBS，培养72h后，MTT法检测细胞存活率。
结果如图6所示，AGT和Amph对于MDA-MB-468的IC50约为1.3nM和10.97μM。
5.AGT和Amph对人神经母细胞瘤BE2C的细胞毒性测定
人神经母细胞瘤BE2C培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/m1)，链霉素(100μg/ml)的DMEM/High(Invitrogen)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液(5×104cells/m1)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，按设定的浓度梯度加蛋白样品10μl，对照组加PBS，培养72h后，MTT法检测细胞存活率。
结果如图7所示，AGT和Amph对于BE2C的IC50约为144.7μM和2.47μM。
实施例7
动物试验
30只6-8周龄、接种人宫颈癌细胞Caski的裸鼠随机分为6组，每组5只；肿瘤长至约20mm3后给药；给药方式为药物注射进osmotic pump后埋入小鼠腹腔；药物分别是生理盐水，4.2mg/ml Amph，7.5mg/ml AGT(AGT-H)，0.75mg/ml AGT(AGT-M)，0.075mg/ml AGT(AGT-L)和7.5mg/ml A15GT(阴性对照)，每隔3-4天记录肿瘤体积变化情况。
结果如图8所示，AGT-H和AGT-M组的肿瘤体积维持在很低的水平，比其他药物分组有明显的优势。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001017635410000011
Figure IDA0001017635410000021
Figure IDA0001017635410000031
Figure IDA0001017635410000041

Claims (13)

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的抗肿瘤融合蛋白具有式Ia所述结构：
D-A-B-C (Ia)
其中，
A为Amphinase-2蛋白元件；
B为任选的0-10个氨基酸的柔性连接肽元件；
C为成熟形式的TGFα蛋白元件；
D为任选的信号肽和/或前导肽序列；
“-”表示连接上述各元件的肽键。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的Amphinase-2蛋白的序列如SEQ ID NO.:2中第1-114位所示。
3.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述B为1-5个氨基酸的柔性连接肽。
4.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述连接肽元件为GGGGS。
5.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的TGFα蛋白的序列如SEQ IDNO.:2中第120－169位所示。
6.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述连接肽元件为序列为SEQ IDNO.:2中第115-119位的连接肽。
7.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的抗肿瘤融合蛋白是不经糖基化修饰的蛋白。
8.如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
12.一种权利要求1所述抗肿瘤融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防肿瘤的药物。
13.一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤：在如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白存在的条件下，培养所述肿瘤细胞。
CN201610423430.3A 2016-06-15 2016-06-15 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用 Active CN107513107B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610423430.3A CN107513107B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610423430.3A CN107513107B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107513107A CN107513107A (zh) 2017-12-26
CN107513107B true CN107513107B (zh) 2022-03-15

Family

ID=60720018

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610423430.3A Active CN107513107B (zh) 2016-06-15 2016-06-15 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107513107B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3878461A4 (en) * 2018-11-09 2022-08-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF TGF-BETA RECEPTOR FUSION PROTEIN AND USE THEREOF

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101450214A (zh) * 2007-12-06 2009-06-10 上海南方模式生物科技发展有限公司 转铁蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶联物及其制法和用途
CN101613410A (zh) * 2008-06-25 2009-12-30 上海南方模式生物科技发展有限公司 核糖核酸酶与毒蛋白膜转位结构域融合蛋白及其制备方法和用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1720996A4 (en) * 2004-02-13 2007-03-21 Immunomedics Inc RECOMBINANT CYTOTOXIC RASES CONTAINING FUSION PROTEINS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101450214A (zh) * 2007-12-06 2009-06-10 上海南方模式生物科技发展有限公司 转铁蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶联物及其制法和用途
CN101613410A (zh) * 2008-06-25 2009-12-30 上海南方模式生物科技发展有限公司 核糖核酸酶与毒蛋白膜转位结构域融合蛋白及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A fusogenic dengue virus-derived peptide enhances antitumor efficacy of an antibody-ribonuclease fusion protein targeting the EGF receptor;Stefan Kiesgen，等;《Protein Engineering, Design ＆ Selection》;20141031;第27卷(第10期);全文 *
An EGF receptor targeting Ranpirnase-diabody fusion protein mediates potent antitumour activity in vitro and in vivo;Stefan Kiesgen，等;《Cancer Letters》;20150201;第357卷(第1期);全文 *
Antibody-targeted RNase fusion proteins (immunoRNases) for cancer therapy;Jürgen Krauss，等;《Current Pharmaceutical Biotechnology》;20080630;第9卷(第3期);全文 *
核糖核酸酶Onconase及其融合蛋白的表达;胡晓珺;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140615;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107513107A (zh) 2017-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8926972B2 (en) Anti-angiogenesis fusion proteins
EP3360893B1 (en) High-affinity and soluble pdl-1 molecule
KR20160067219A (ko) 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
US20190216898A1 (en) Interleukin Combination and Use Thereof
CN108949772A (zh) 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
KR101841211B1 (ko) 세포 투과성 펩티드 및 이를 이용한 생물학적 활성 물질의 전달방법
US11021690B2 (en) Mutant-type uricase, PEG modified mutant-type uricase, and application thereof
EP3917580A2 (en) Phlip® peptide-mediated epitope tethering at cell surfaces
CN106279423B (zh) Slit2D2-HSA融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用
CA3017689A1 (en) Use of pten-long leader sequence for transmembrane delivery of molecules
JP2001503617A (ja) 標的化腫瘍遺伝子治療のためのレセプターを介した遺伝子移送系
WO2015149708A1 (zh) 新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途
CN112442129B (zh) 肿瘤酶响应型重组焦亡蛋白递药系统及其抗肿瘤用途
CN103805621B (zh) 靶向性抗肿瘤融合蛋白质lpo的新型制备工艺
CN110357968B (zh) 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
CN107513107B (zh) 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
WO2015000181A1 (zh) 新型重组融合蛋白及其制法和用途
CN105884876B (zh) 一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用
CN111499766B (zh) 针对慢性淋巴细胞白血病的免疫效应细胞、其制备方法和应用
TWI419901B (zh) 利用腦衰蛋白反應媒介蛋白-１（ｃｒｍｐ-１）及其片段治療癌症之組合物及方法
CN103865899B (zh) 具有vegfr2/kdr受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用
JPH09510357A (ja) 酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードする組み換えアデノウィルス
CN114456274A (zh) 抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用
CN105985444B (zh) 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
CN106350578A (zh) Ny-eso-1在微卫星不稳定性肠癌的诊断和治疗中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 201203 Shanghai Jinke Road, Zhangjiang High Tech Park of Pudong New Area No. 3577 Building No. 2

Applicant after: Shanghai biomodel Polytron Technologies Inc

Address before: 201203 Shanghai Jinke Road, Zhangjiang High Tech Park of Pudong New Area No. 3577 Building No. 2

Applicant before: Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant