TWI419901B - 利用腦衰蛋白反應媒介蛋白-１（ｃｒｍｐ-１）及其片段治療癌症之組合物及方法 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一可抑制癌症增生(proliferation)、轉移(metastasis)以及/或侵犯(invasion)之腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1)的活性片段，以及包含該CRMP-1之活性片段的醫藥組成物，藉以利用於癌症之治療。
腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1)別名二氫嘧啶酶相關蛋白-1(dihydropyrimidinase related protein-1,DRP-1)係為一分子量62kDa的磷酸蛋白(phosphoprotein)，CRMP-1最初於大腦組織中發現，且被視為一於神經發展期間與腦衰蛋白所誘發的生長椎(growth cone)衰退有密切關聯之腦特定蛋白質(Torres et al.(1998)DNA Res.5(6)：393-395)。
腦衰蛋白反應媒介蛋白(Collapsin response mediator proteins,CRMPs)屬於磷酸蛋白家族，其可媒介膜蛋白(semaphorin)/腦衰蛋白所誘發的生長椎衰退，並被認為與軸突引導和神經分化二者有密切關聯。CRMPs主要表現於神經系統，尤其是在胚胎發生時期。免疫細胞化學研究顯示CRMPs分佈於生長椎的層狀足(lamellipodia)與絲狀足(filopodia)、軸突的軸幹(shaft)以及神經細胞本體中。雖然目前它們作用的分子機制仍未明確，但其表現與磷酸化會在發展期間作時間與空間的調控。
CRMPs的成員係具有與線蟲蛋白UNC-33同源(homology)的序列，若其缺乏會引起線蟲(Caenorhabditis elegans)的軸突異常延伸(elongation)及不協調的運動(Li et al.(1992)Genetics.132(3)：675-689)。CRMP的家族成員具有50%~70%的胺基酸序列同源性。數個不同實驗室已獨立地選殖出能轉
譯成接近60~66kDa蛋白質的CRMP基因家族中的五個成員(crmp-1,crmp-2,crmp-3,crmp-4,crmp-5)。每個CRMP均被認為具有獨特的功能。CRMP家族的成員可被稱為腦衰蛋白反應媒介蛋白(CRMP)、在64-kDa蛋白分裂後開啟之蛋白(turned on after division of a 64kD protein,TOAD-64)、UNC-33類磷酸蛋白(UNC-33 like phosphoprotein,Ulip)、二氫嘧啶酶相關蛋白(DRP)以及TUC(TOAD/Ulip/CRMP)。然而CRMP係為醫學文獻中最常被使用的名稱。
CRMP基因的轉錄被分化調控(Inagaki et al.(2000)Histochem.Cell Biol.113：37-41；Matsuo et al.(2000)J.Biol.Chem.275(22)：16560-16568；Quach et al.(2000)Gene.242(1-2)：175-182)。小鼠的CRMP-1、CRMP-4與CRMP-5主要表現於胚胎的腦部，而非成年小鼠的腦部中。另一方面，CRMP-2與CRMP-3於胚胎與成年小鼠的腦部中均有表現。然而，在成年小鼠中，CRMP-3是位於小腦內。在PC-12細胞中，藉由神經生長因子(nerve growth factor,NGF)誘發神經分化後，CRMP-4強烈地向上調控(up-regulated)，而CRMP-1與CRMP-2僅少許增加，CRMP-3則向下調控(down-regulated)(Byk et al.(1998)Eur.J.Biochem.254(1)：14-24)。此時，僅有人類CRMP-4的啟動子曾被分離並分析之(Matsuo et al.(2000)J.Biol.Chem.275(22)：16560-16568)。CRMP家族中其他成員的調控元件並未被研究過。
近來研究指出編碼人類CRMP-1基因(以下稱為”hCRMP-1基因”)之表現量會反向地影響癌症侵犯與轉移(亦即表現量越高，癌症侵犯與轉移的發生率就越低)，因此將CRMP-1基因視為一侵犯抑制(invasion supression)基因。下述研究發現CRMP-1表現量低的病人，其病程較為惡化，且有淋巴結轉移，而CRMP-1表現量高的病人則有明顯較長的無病存活期(disease-free survival period)與總存活期(overall survival period)(Shih et al.(2001)J.Natl.Cancer Inst.93(18)：1392-1400；Chu et al.(1997)Am.J.Respir.
Cell Mol.17：353-360；Shih et al.(2003)Clinical & Exper.Metastasis.20：69-76)。
然而前述文獻僅檢視hCRMP-1全長蛋白質之生物活性，hCRMP-1片段之影響仍係未知，且hCRMP-1全長蛋白質之活性部分亦未被確認。此外，先前技術僅研究CRMP-1對癌症侵犯與轉移的影響，而其對細胞增生之作用並未被確認。
依據本發明揭示內容，研發某種活性片段，且其較全長CRMP-1更易製備並容易有較大之產量，同時其仍保留所有或大部分抗癌之原始生物活性，此可使其商業化產品更具經濟價值與技術可實施性。
此外，相較於全長CRMP-1，該種活性片段可達成較佳且更廣之癌細胞抑制增生能力(antiproliferation)，例如本發明所述CN3係顯示超越全長CRMP-1之某種增進生物活性之結果。在癌細胞抑制增生能力方面，其他片段亦具有較全長CRMP-1更好之選擇性，例如CN5與CN7片段具有良好選擇性，其可於不影響正常細胞生長之情況下抑制肺癌細胞生長。而全長CRMP-1並未具有該選擇性。此外，CRMP-1全長蛋白質會抑制正常細胞的生長，而某種片段例如CN5則無此種副作用。下述內容將說明該些片段係具有超越先前技術之優點，因此確認CRMP-1活性片段係為於本發明所屬技術領域中一直以來未被滿足之需求，此研究可使具有與CRMP-1全長蛋白質相同或更佳活性之蛋白質片段大量生產。
除此之外，確認其他可作用於細胞增生之試劑係為必需的，如同前述所言，於先前肺癌細胞研究中全長CRMP-1被認為無法抑制肺腺癌細胞增生，然而本發明確認全長CRMP-1可抑制攝護腺癌、直腸癌與乳癌之細胞增生，且不論先前研究結果，本發明亦確認全長CRMP-1對於抑制肺腺癌細胞之增生能力比較有限。例如Shih等人利用建立自病人的低分化人類肺腺癌細胞，發現全長CRMP-1並無抑制細胞增生能力(J.Natl.Cancer Inst.(2001).93(18)：1392-1400)，反之，本發明內容顯示全長CRMP-1對於人類肺大細胞癌細胞株H460係具有抑制細胞增生能力。
本發明之目的係提供包括一CRMP-1之活性片段，其包含選自SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25以及39-43之一胺基酸序列，其中該活性片段可抑制癌細胞之增生(proliferation)、轉移(metastasis)以及/或侵犯(invasion)，且對正常細胞具有一選擇性抑制率，其中該SEQ ID NO：15之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：17、39之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：19、40之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌；該SEQ ID NO：21、41之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：23、42之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及該SEQ ID NO：25、43之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。且此活性片段具有109至500個胺基酸長度。於本發明某些具體實施例中，此活性片段包含SEQ ID NO：17，於本發明其他具體實施例中，此活性片段係為一包含轉錄活化子(transactivator,TAT)序列之融合蛋白質(fusion protein)。
於本發明一具體實施例中，該活性片段係包含選自與SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25以及39-43所示序列至少有95%相似性之一胺基酸序列，其中該活性片段可抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且此活性片段具有109至500個胺基酸長度。
本發明另一具體實施例進一步包括一編碼CRMP-1活性片段之核酸序列，其係包含選自SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、33、34、35、36、37以及38之一序列，其中該活性片段可抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且不會對正常細胞生長具有一選擇性抑制率，其中該選擇性抑制率係為0%至30%；該SEQ ID NO：16、33之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：18、34之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：20、35之核酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌；該SEQ ID NO：22、36之核酸酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：24、37之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及該SEQ ID NO：26、38之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。且該核酸序列具有327至1500個核酸長度。於本發明某些具體實施例中，該核酸序列包含SEQ ID NO：18。於本發明其他具體實施例，該核酸序列係編碼一CRMP-1之活性片段的融合蛋白以及一TAT序列。
本發明其他具體實施例包括一編碼CRMP-1活性片段的核酸序列，其係包含選自與SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、33、34、35、36、37以及38所示序列至少有95%相似性之一核酸序列，其中該活性片段可
抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率，且該核酸序列具有327至1440個核酸長度。
本發明的一具體實施例進一步包含一治療癌症之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如申請專利範圍第1項所述之CRMP-1活性片段，其中該CRMP-1活性片段可抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率。
於本發明另一具體實施例中，該CRMP-1活性片段係與一化學治療藥物(chemotherapeutic agent)同時被給予，其中CRMP-1活性片段可進一步增進該化學治療藥物例如paclitaxel之功效，但化學治療藥物之種類並不限於此。
本發明又一具體實施例係包括一抑制癌細胞增生之方法，該方法包含給予有需要的病患CRMP-1，並使該CRMP-1抑制癌細胞之增生。
此外，本發明之一具體實施例包括一可用於表現CRMP-1之活性片段的載體，此載體包含：(a)至少一調控元件(regulatory element)；以及(b)一編碼部份，係主要由一核酸序列所組成，該核酸序列係編碼一CRMP-1之活性片段，該活性片段包含選自SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、33、34、35、36、37以及38之一序列，其中該活性片段可抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率，其中該SEQ ID NO：16、33之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：18、34之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：20、35之核酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌；
該SEQ ID NO：22、36之核酸酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：24、37之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及該SEQ ID NO：26、38之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。該載體之編碼部份係具有327至1440個核酸長度。不同CRMP-1之活性片段變異體亦可應用於此載體中。
於本發明某些具體實施例中，該載體係為一病毒載體；且於本發明其他具體實施例中，該病毒載體係選自星狀病毒(astrovirus)載體、冠狀病毒(coronavirus)載體、正黏液病毒(orthomyxovirus)載體、乳多空病毒(papovavirus)載體、副黏液病毒(paramyxovirus)載體、細小病毒(parvovirus)載體、小核糖核酸病毒(picornavirus)載體、痘病毒(poxvirus)載體、或披膜病毒(togavirus)載體。於本發明其他具體實施例中，至少一調控元件為組織特異性(tissue-specific)調控元件。
本發明的目的係提供包括具有不超過500個胺基酸CRMP-1之活性片段，其係保留CRMP-1全長蛋白質之活性，且於某些例子中甚至超過CRMP-1全長蛋白質的活性，該些片段係命名為CN1、CN3、CN4、CN5、CN6以及CN7。本發明所示該些活性片段係可抑制癌細胞之增生、轉移以及侵犯，然而並不限於某種細胞型式之活性，下述表一係列有該些活性片段之活性。
相較於與表一所示序列，本發明之活性片段亦可包括具有置入突變(addition mutation)、刪除突變(deletion mutation)或取代突變(substitution mutation)之序列，該些活性片段係與本發明確認之序列(如第15、17、19、
21、23與25圖所示序列)具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相似性。
不同活性片段之變異體亦可包括可以相同類別之胺基酸進行保留性(conservative)取代，例如以具有不帶電側鏈之胺基酸(例如天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸與酪胺酸)進行取代、以具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸與組胺酸)進行取代、以具有酸性側鏈之胺基酸(例如天門冬胺酸與麩胺酸)進行取代以及以具有非極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸與半胱胺酸)進行取代。此外，不同活性片段之變異體尚可包括以非天然胺基酸或偽胺基酸(pseudo amino acid)取代天然胺基酸，該些修飾不會明顯減少該些活性片段之生物活性。
於本發明某些具體實施例中，該些活性片段之長度為480、273、166、116、115、109個胺基酸或更短的長度；於本發明其他具體實施例，該些活性片段之長度為100~500、125~475、150~450、175~425、225~375、250~350、260~340或275~325個胺基酸；於本發明其他具體實施例，該些活性片段之長度為500、475、450、425、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150或125個胺基酸或更短的長度。
前述該些不同活性片段之變異體可以重組技術製備之或由來自其他種類之CRMP-1變異體衍生而得，因此，本發明之CRMP-1可來自人類或非人類之靈長類動物、大鼠或小鼠。
某些CRMP-1片段係於其表現構築體中包含一額外的甲硫胺酸(methionine；於胺基酸序列中以”M”表示)，藉以建立一開放讀取架構(open reading frame)，並可於哺乳動物細胞或原核細胞例如大腸桿菌(E.coli)中表現蛋白質；於本發明一些具體實施例中，甲硫胺酸殘基可加於各片段之起始端；於本發明其他具體實施例中，甲硫胺酸可被移除。於本發明一特別預想之具體實施例中，前述具有甲硫胺酸殘基之各序列於構築時可不需甲
硫胺酸殘基，相同的，所示不具有該元件之各序列亦可於構築時加入甲硫胺酸殘基。
於本發明其他具體實施例中，製備融合蛋白方式可提昇該些活性片段之功效或穩定性，例如本發明之活性片段可被融合至一轉錄活化子(transcriptional activator of transcription,TAT)序列，TAT係為一具有86個胺基酸參與人類免疫缺陷病毒第1型(Human Immunodeficiency Virus,HIV-1)複製，研究指出當以外源性方式(exogenously)添加TAT蛋白質時，其係具有進入培養細胞之潛力(Harada et al.(2006)Breast Cancer,Vol.13(1)：16-26)，TAT胜肽係廣泛用於傳送巨分子進入細胞內以進行治療。相關文獻已提及數種TAT融合蛋白，其係將TAT編碼序列連接至有興趣蛋白質之編碼序列(Albarran et al.(2005)Protein Engineering,Design & Selection,Vol.18(3)：147-152)。將活性片段例如CN3接合至TAT序列可改善該片段進入癌細胞之轉送(translocate)能力，進而增進該活性片段的功效。於本發明一特別預想之具體實施例中，前述具有TAT融合之各序列於構築時可不需該元件，相同的，所示不具有該元件之各序列亦可於構築時加入該元件。
於本發明其他具體實施例中，可利用重組技術將組胺酸(His tag)附加(affixy)至片段以助於蛋白質純化；於本發明一具體實施例，該His tag可具有4、5、6、7、8、9或10個組胺酸殘基。於本發明一特別預想之具體實施例中，前述具有組胺酸(His tag)之各序列於構築時可不需該組胺酸(His tag)，相同的，所示不具有該元件之各序列亦可於構築時加入組胺酸(His tag)。
本發明亦包含分離編碼CRMP-1之活性片段(例如CN1、CN3、CN4、CN5、CN6以及CN7)之核酸序列，該些核酸序列長度不超過1500個鹼基，編碼該些片段之具代表性的核酸序係列於表二，如同所屬技術領域悉知者，核酸序列係利用引子並藉由聚合酶鍊鎖反應合成而得，因此，於本發明某些具體實施例，本發明係包含如表二所示於核酸序列之3’端以及/或5’
端加入非編碼引子序列之該些片段；於本發明其他具體實施例，該些核酸序列係編碼在N端不具有甲硫胺酸或在C端不具有His tag之片段，此外，由於基因密碼之簡併性(degeneracy)，需考量編碼相同胺基酸序列之其他序列。如同之前所述，關於胺基酸序列，於本發明一特別預想之具體實施例中，前述編碼甲硫胺酸、TAT融合蛋白、以及/或組胺酸(His tag)之各序列於構築時可不需該些元件，相同的，所示不具有該元件之各序列亦可於構築時加入。
本發明不同核苷酸或胜肽可為人工合成或非人工合成，其可為DNA或RNA序列，並獲自藉由以原始序列為基礎之探針所建立之篩選序列資料庫，此資料庫可利用對於本發明所屬技術領域者悉知之分子生物技術製備。
本發明之核苷酸序列亦可藉由化學合成或混合方法例如由篩選電泳帶而得化學或酵素修飾的序列，該些核苷酸序列允許製備核苷酸探針，該些
核苷酸探針具有與一核酸序列、一基因體DNA序列、一本發明編碼胜肽之訊息RNA序列或一活性片段序列很強與高特異度之雜交(hybridize)能力。
編碼本發明活性片段的核酸序列亦可包括相較於表二所示序列具有置入突變、刪除突變或取代突變之序列，該些序列係與本發明確認之序列(如第16、18、20、22、24與26圖所示序列)具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相似性。
前述該些不同核酸序列變異體可以重組技術製備之或由來自其他種類之CRMP-1變異體衍生而得，因此，本發明之CRMP-1可來自人類或非人類靈長類動物、大鼠或小鼠。
此外，本發明亦包含可與第16、18、20、22、24與26圖所示序列或其互補序列於嚴謹條件下雜交之序列，舉例而言該嚴謹條件包括於65℃以含有0.5M磷酸氫鈉(NaHPO4)、7%硫酸十二酯鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)與1mM EDTA之溶液進行雜交，並於42℃下以0.2X SSC/0.1% SDS清洗之(Ausubel,et al(eds).(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.)(John Wiley & Sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)；又或者，舉例來說此嚴謹條件可包括於65℃以含有0.5M磷酸氫鈉(NaHPO4)、7% SDS與1mM EDTA之溶液進行雜交，並於68℃以0.1X SSC/0.1% SDS清洗之(Ausubel,et al(eds).(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.)(John Wiley & Sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)。雜交條件亦可視待研究的序列而依據習知方法做修飾(Tijssen.(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,N.Y.)。一般而言，所選擇之嚴謹條件係為於一定義之離子強度與pH值下，低於該特定序列熱熔點大約5℃以下。舉例而言，嚴謹之雜交可為在42℃於5X SSC與50%甲醯胺(formamide)中反應後，再
於65℃以包含0.1X SSC的沖洗液清洗之，嚴謹雜交之清洗例如可進行至少15、30、45、60、75、90、105或120分鐘。
於本發明某些具體實施例中，活性片段係包含1440、819、498、348、345、327個核酸或更短者；於本發明其他具體實施例，活性片段係具有300~1500、375~1425、450~1350、525~1275、600~1200、675~1125、750~1050、780~1020、825~975、300~900、325~500、375~525或300~400個核酸長度；於本發明另外具體實施例，片段係包含1500、1425、1350、1275、1125、1050、755、900、825、750、675、600、525、450或375個核酸或更短者。
本發明之活性片段可用於治療癌症之方法上，該方法包含給予有需要的病患至少一CRMP-1之活性片段，並使該CRMP-1之活性片段抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯；此CRMP-1之片段抑制增生效果係顯示於直腸癌、乳癌、肺癌以及攝護腺癌細胞株上，特別是，至少一片段於上述一種細胞株可顯示其功效。
該結果指出CRMP-1片段係具有高度選擇性且預期可應用作為較低副作用的治療試劑。此外，相較於全長CRMP-1，某些片段對於癌細胞生長係呈現較佳且較廣之抑制效果，因此可預期該些片段係可抑制不同組織型態中多種形式之癌細胞，目前已可證實本發明至少一片段能抑制直腸癌、乳癌、肺癌以及攝護腺癌，特別是，至少一片段可抑制肺腺癌(lung adenocarcinoma)、肺鱗狀細胞癌(lung squmous cell carcinoma)、肺大細胞癌(lung large-cell carcinoma)、攝護腺癌(prostate adenocarcinoma)、攝護腺上皮細胞癌(prostate carcinoma)、直腸腺癌(colon adenocarcinoma)、及乳腺癌(breast ductal carcinoma)。
於本發明某些具體實施例中，該病患係為哺乳動物，且於本發明其他具體實施例，其係為人類；獸醫之處理方法亦列入考量並包含農場動物
例如馬、牛、豬、家庭寵物如狗或貓以及其他動物包含非人類之靈長類動物、大鼠或小鼠。
更進一步地，本發明係關於活性片段與至少一種化學治療藥物結合之應用，同時給予該些CRMP-1於本質上可增進化學治療藥物之效果，於本發明一些具體實施例，此可能有助於增加癌細胞之化學治療敏感性(chemosensitivity)並可降低該些化學治療藥物之使用劑量，其亦可減少有害且會導致問題之副作用。
化學治療藥物包含COX-2抑制劑例如caffeic acid phenethyl ester(CAPE)、細胞週期專一性抗生素例如AdriamycinTM(doxorubicin)以及G2細胞週期專一性藥物例如paclitaxel；可替代之化學治療藥物包含烷化基藥劑(alkylating agent)例如cisplatin、carboplatin、cyclophosphamide與oxaliplatin、抗代謝物質(anti-metabolites)例如azathioprine與5-fluorouracil、植物生物鹼(alkaloid)與帖類(terpenoid)例如vinca alkaloids與podophyllotoxin以及第一型與第二型拓撲異構酶(topoisomerase)抑制劑例如camptothecins、etoposide與teniposide。此外，也可使用前述試劑的混合物。
活性片段可於給予化學治療藥物之前、給予化學治療藥物的同時或給予化學治療藥物之後施予，於該治療時間係包含相隔1分鐘、相隔2分鐘、相隔3分鐘、相隔4分鐘、相隔5分鐘、相隔10分鐘、相隔10分鐘、相隔20分鐘、相隔30分鐘、相隔1小時、相隔2小時、相隔1天或相隔2天，或者應用於同一次治療(cycle)。
本發明一具體實施例係關於一包含至少一CRMP-1之活性片段以及至少一藥學可接受載體(pharmaceutically acceptable carrier)之醫藥組成物。
依據所治療之特別癌症種類，本發明醫藥組成物的給予係經由任何一般途徑，只要該標的組織係可經由該途徑而被有效治療，此途徑包含口服(oral)、鼻腔給藥(nasal)、口頰給藥(buccal)、直腸給藥(rectal)、陰道給藥
(vaginal)或部份注射(topical)，部份注射係特別有益於治療皮膚類癌症，再者，注射可藉由原位(orthotopic)、皮內(intradermal)、皮下(subcutaneous)、肌肉內(intramuscular)、腹腔(intraperitoneal)、靜脈(intravenous)之注射(injection)方式給藥。該組成物可視為包含生理學可接受載體、緩衝溶液或其他賦形劑(excipient)之藥學可接受組成而被正常給予。
於本發明某些具體實施例中，藥學配方包含與一藥學可接受介質例如生理食鹽水(saline)、緩衝之生理食鹽水、溶於水之5%葡萄糖(dextrose)或其相似物結合之CRMP-1活性片段；配方可進一步包含一個或多個賦形劑、防腐劑(preservative)、增溶劑(solubilizer)、緩衝劑(buffering agent)、白蛋白(albumin)以防止非特異性結合並延長半衰期(half-life)等。CRMP-1片段以及一加入之抗癌藥物可分開給予或結合成一單一組成而給予，因此該配方可以單一配方或以多成份套組(multicomponent kit)型式提供。配方方法係為本發明所屬技術領域習知且已揭露之方法例如文獻(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton Pa.1990)所述者。
一組成物之醫療應用亦被考量，為能適於延伸應用，製備醫藥組成物係為必要的，一般製備醫藥組成物時，必須完全無對人體或動物體有害之不純物質，且亦須置入適當鹽類與緩衝液以使醫藥組成物穩定且可被標的細胞所吸收。
於本發明之進一步具體實施例中，該活性片段可與長效型(time-release)物質例如微脂體(liposome)與多醣體(polysaccharide)一同使用，藉以使該片段可持續有效釋放其劑量。長效型配方一般包括一含有位於基質(matrix)中之生物相容性溶液、膠體、膏狀物、包裹物(puttee)之龐大(monolithic)運送裝置，而該組成物係陷於或溶於其中。長效型配方係藉由該基質透過擴散(diffusion)以及/或基質侵蝕(erosion)而釋出，一醫藥組成物透過膜而擴散之儲存系統亦可應用於此。
於本發明某些具體實施例中，亦包含經試管培養後再移植至生物體內(ex vivo)之基因治療，經試管培養後再移植至生物體內之基因治療係關於自病患移除標的細胞，該細胞係先於病患體外進行治療後再移回病患體內；經試管培養後再移植至生物體內(ex vivo)之基因治療之一例示係與自體骨髓移植(autologous bone marrow transplant,ABMT)有關，由於部分癌細胞係存在於抽出之骨髓中，當該骨髓移回接受治療之病患體內後，導致病患體內癌細胞重新聚集，進而多次造成自體骨髓移植的失敗。然而於本發明一具體實施例中，抽出的骨髓細胞可於病患體外利用一可以癌細胞為標的並殺死該癌細胞之病毒粒子治療之，一但該癌細胞被清除，該抽出的骨髓細胞便可被再導入病患體內，此可助益於血液性癌症。
本發明所屬技術領域之醫師可斟酌給藥劑量與頻率而給予病患本發明之活性片段以及任何預期之合併治療。
有效量係指一對受治療主體可產生醫療需求之組成物的量，以腫瘤治療為例，相較於一未受治療主體，需要結果包含抑制癌細胞之增生、轉移以及/或侵犯，且可減少腫瘤大小、生長速率、轉移、緩和症狀、延長病患生命以及/或改進病患生活品質。實際給藥劑量係視疾病之種類、擴散範圍或症狀而定，同時須考量被給藥主體之健康狀況、年齡、性別、體重或對藥物耐受性，給藥量亦可隨腫瘤擴散範圍、嚴重程度與種類而改變。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據前述或其他因素決定適當之給藥劑量。
該治療可包括不同之單位劑量(unit dose)，單位劑量係定義為包含一醫藥組成物的預先決定量，該量係經計算而可產生與其給予即適當途徑與治療方法相關之需要反應；給予量、及特定途徑與配方係屬於醫療領域之相關技術，而治療的主體亦很重要，特別是主體的狀態以及主體所欲保護的部分。一單位劑量不單可視為給予一單一注射，也可包含於一特定時間內的連續擴散。
一般而言，本發明組成物係依約1μg/kg~約20mg/kg、約1μg/kg~約10mg/kg、約1μg/kg~約1mg/kg、約10μg/kg~約100μg/kg、約10μg/kg~約1mg/kg、約100μg/kg~約1mg/kg、約100μg/kg~約10mg/kg或約200μg/kg~約1mg/kg之藥量範圍而給予病患，例如，本發明之組成物可依下列藥量範圍被給予病患：約80μg~約1600mg、約80μg~約800mg、約80μg~約80mg、約800μg~約8mg、約800μg~約80mg、約8mg~約80mg、約8mg~約800mg或約16mg~約80mg。於本發明另一具體實施例，本發明之組成物可依下列藥量範圍被給予病患：約50μg~約1000mg、50μg~約500mg、50μg~約50mg、500μg~約5mg、500μg~約50mg、5mg~約50mg、5mg~約500mg或10mg~約50mg。
本發明的目的係關於一可為質體(plasmid)之表現載體(vector)，其包含一可插置外加DNA片段之環狀雙股DNA。
本發明之表現載體包含一編碼CRMP-1之活性片段的聚核苷酸(polynucleotide)，表現載體亦包含操作連接(operatively linked)至被表現之聚核苷酸的一個或多個調控序列(regulatory sequence)，該些調控序列係基於所用宿主細胞的種類而篩選出。依據所選宿主細胞以及所欲表現程度來設計表現載體，係為本發明所屬技術領域中具有通常知識者可知悉。
於本發明一具體實施例中，該表現載體包含組織特異性調控元件(tissue-specific regulatory element)，適當組織特異性調控元件之例示包含肝臟特異性白蛋白啟動子(liver-specific albumin promoter)、淋巴結特異性啟動子(lymphoid-specific promoter)、T細胞接受子(T-cell receptor)之啟動子與免疫球蛋白(immunoglobulin)之啟動子、神經元特異性啟動子(neuron-specific promoter)例如神經纖維絲啟動子(neurofilament promoter)、胰臟特異性啟動子(pancreas-specific promoter)、乳腺特異性啟動子(mammary gland-specific promoter)例如乳清啟動子(milk whey promoter)以及腫瘤特異性啟動子(tumor specific promoter)。
於本發明另一具體實施例，該表現載體包含一可調控表現系統，適用於本發明之系統包含但不限於Tet-on/off系統(Gossen et al.(1995)Science 268：1766-1769；Kistner et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：10933-10938)、蛻皮激素(ecdysone)系統(No et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：3346-3351)、黃體素(progesterone)系統(Wang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：8180-8184；Wang et al.(1997)Nat.Biotech.15：239-243)以及雷帕霉素(rapamycin)系統(Magari et al.(1997)J.Clin.Invest.100：2865-2872；Ye et al.(1999)Science.283：88-91)。
可進一步考量將一些特異性載體用於本發明之具體實施例中，於本發明的一具體實施例，該表現載體係為一病毒載體，病毒載體之例示包含但不僅限於逆轉錄病毒(retroviral)載體、慢病毒(lentivirus)載體、腺病毒(adenoviral)載體、腺相關病毒(adeno-associated viral,AAV)載體、皰疹病毒(herpes)載體、或阿爾發病毒(alphavirus)載體；病毒載體亦可為星狀病毒(astrovirus)載體、冠狀病毒(coronavirus)載體、正黏液病毒(orthomyxovirus)載體、乳多空病毒(papovavirus)載體、副黏液病毒(paramyxovirus)載體、細小病毒(parvovirus)載體、小核糖核酸病毒(picornavirus)載體、痘病毒(poxvirus)載體、或披膜病毒(togavirus)載體。
於本發明某些具體實施例，可於編碼活性片段之核酸加入ATG序列，以確保有適當的讀取架構(reading frame)與適當的表現。
先前研究結果顯示全長CRMP-1對肺癌細胞並無影響，然而現今已意外地發現全長CRMP-1可抑制癌細胞增生，之前認為CRMP-1僅藉由抑制侵犯與轉移而抑制癌症，特別是，目前研究(Shih et al.,J.Natl.Cancer Inst.(2001)93(18)：1392-1400)報導CRMP-1的表現可抑制肺癌細胞之侵犯與轉移，再者，先前技術暗示CRMP-1無法抑制細胞增生，事實上，Shih等人判定hCRMP-1對於由病患建立之低分化肺腺癌細胞株中癌細胞的增生並無影響。
因此本發明揭示全長hCRMP-1可抑制兩種攝護腺癌細胞株(PC-3與DU145)、直腸癌細胞株CC-M1、乳癌細胞株MCF-7以及人類肺大細胞癌細胞株H460之癌細胞增生且抑制侵犯活性與轉移，係為出乎意料之結果。
因此，本發明另一目的，係提供全長或實質全長CRMP-1以抑制肺癌增生；於本發明另一具體實施例，CRMP-1係用以抑制肺癌，包含肺腺癌、肺鱗狀細胞癌與肺大細胞癌；攝護腺癌，包含攝護腺癌與攝護腺上皮細胞癌；直腸癌包含直腸腺癌；以及乳癌包含乳腺癌之增生，並觀察到高量表現hCRMP-1時惡性細胞的生長特徵。
關於胺基酸與核酸變異體、治療方法、給藥配方與途徑、給藥劑量與頻率以及核酸表現之前述討論，皆可如使用片段般，應用於全長或實質全長CRMP-1的方法，但本發明係以利用全長或實質全長CRMP-1抑制增生為重點，反之利用該些片段之發明方法包含增生、轉移以及/或侵犯。
「活性(activity)」一詞在此意指CRMP-1及其片段之任何生物特質，活性可為例如因應治療而抑制增生、轉移以及/或侵犯，該活性可藉由本發明所屬技術領域對增生、轉移以及/或侵犯之標準測試方法而決定。
「細胞增生(cell proliferation)」一詞在此意指細胞的再產生(reproduction)或增殖(multiplication)。
「有效量(effective amount)」一詞在此意指可抑制癌症之增生、轉移以及/或侵犯試劑之量，試劑之有效量係可減少、降低、抑制癌細胞生長或消滅癌細胞、誘發細胞凋亡、抑制腫瘤細胞之血管新生(angiogenesis)、抑制轉移或誘發細胞內的細胞毒性，因此一有效量係為一足以偵測且多次改善(ameliorate)、降低、縮小或限制疾病或其症狀範圍之量，更精確的定義可為疾病之消除(elimination)、消滅(eradication)或治癒(cure)。
「基因(gene)」一詞在此意指一聚合物(polymer)，其核苷酸係編碼一具有方向性之線型多胜肽(如酵素)所構成的胺基酸。該「基因」可為單股如
RNA或雙股如DNA。舉例而言，DNA可為以酵素將信使RNA(mRNA)反轉錄所得之cDNA、由染色體(chromosome)而來的基因體DNA(genomic DNA)或為化學合成的DNA。
「同源性(homology)」一般係利用一序列分析軟體組例如基因電腦集團出品的序列分析軟體組(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705)而決定，為獲得同源性(例如如同前述之相同性或相似性)之最大程度，相似胺基酸序列係被並列(align)，為達此目的，需以人工方式將空隙置入序列中，一旦產生最理想的並列結果，藉由紀錄被比對的兩胺基酸相同序列之位置與位置的總數可建立同源性程度。
「侵犯性(invasiveness)」係為一有機體例如癌細胞可由一區域例如腫瘤所在原始位置透過體內擴散之程度。
「分離的(isolated)」、「純化的(purified)」、「實質分離的(substantially isolated)」或「實質純化的(substantially pure)」分子例如一聚胜肽或聚核苷酸係為相較於其存於自然中，其已經由製備而具有較高濃度，例如當與自然相關之非標的蛋白質材料之至少50%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多被移除時，一標的蛋白質即為被分離的、被純化的、被實質分離的或被實質純化的；分離的、純化的、實質分離的或實質純化的分子在此包含重組分子。
「轉移(metastasis)」係為癌症由原發腫瘤(primary tumor)最初形成位置擴散至體內遠處位置之過程，轉移需視具有增加之移動性與侵犯性兩種獨立能力之癌細胞而定，可轉移之細胞基本上與原始腫瘤細胞係屬相同種類，倘若肺臟產生癌症並轉移至肝臟，該位於肝臟之癌細胞係為肺癌細胞，然而，該細胞具有增加之移動性以及侵犯另一器官之能力。
「核酸序列(nucleic acid sequence)」一詞在此意指DNA、cDNA或RNA分子，亦指一大型聚核苷酸構築體(large polynucleotide construct)的分離片段或部份分子。
「病患(patient)」、「主體(subject)」、「個體(individual)」與「宿主(host)」於此係交替使用且意指活的動物體包含人類與非人類動物，例如該主體可為具有免疫細胞的有機體，該免疫細胞係能對抗原刺激、刺激以及藉由細胞表面接受子結合之抑制訊息傳導有反應；該主體可為哺乳動物例如人類與非人類哺乳動物，如農場動物馬、牛、豬；家庭寵物如狗或貓等；以及其他動物包含非人類之靈長類動物、大鼠或小鼠。「主體」一詞並不排除完全正常無疾病或於各方面皆正常的個體。
表現載體可為包含插入有外加DNA片段之環狀雙股DNA的「質體」，其他型式之載體包含表現載體以及基因傳送載體。
一般而言，「蛋白質」一詞係指具有兩個或更多個別胺基酸(不論是否為自然產生者)並經由胜肽鍵連接之任何聚合物，其中當羧酸基團(carboxylic acid group)之羧基碳原子鍵結至一胺基酸或胺基酸殘基之α碳後，鍵結至鄰近胺基酸之α碳的胺基酸基團的氮原子會形成共價結合，該些胜肽鍵連接以及該些原子包含該些來自蛋白質胜肽鍵骨架者例如α碳原子、羧基碳原子(與其取代氧原子)以及胺基氮原子(與其取代氫原子)；此外，「蛋白質」一詞於此係可理解的包含「多胜肽」以及「胜肽」之詞彙，且該兩詞彙於此可交替使用；相同地，蛋白質片段、相似物(analog)、衍生物(derivative)以及變異體(variant)於此可指「蛋白質」，且除非特別指明其係可視為「蛋白質」。蛋白質之「片段(fragment)」一詞係指包含少於蛋白質所有胺基酸殘基之多胜肽，其可認定，蛋白質之「片段」可為胺基末端、羧基末端以及/或內部被截斷(例如被自然剪斷)之蛋白質的型式，且亦可為變異體以及/或衍生物。蛋白質之「區域(domain)」亦係為片段，並包含可給予符合自然產生蛋白質之生化活性蛋白質之胺基酸殘基。
「重組(recombinant)」一詞在此係用以描述意指基因體、cDNA、病毒、半合成或合成源之多核苷酸的核酸分子，並利用其和與自然相關之多核苷酸的全部或部份無關之來源或製備的優點；「重組」一詞係關於蛋白質或多核苷酸，其意指藉由重組多核苷酸表現而產生之多核苷酸。
「嚴謹條件(stringent condition)」一詞在此係為嚴謹度，其係發生於約Tm值-5℃(亦即低於探針之熔點溫度[melting temperature,Tm]5℃)至約低於Tm值20℃至25℃的範圍內，如同可被本發明所屬技術領域具有通常知識者可瞭解者，雜交之嚴謹度可為確認或偵測確認的或相關的多核苷酸序列而作改變，舉例而言，嚴謹條件包含65℃下以含有0.5M磷酸氫鈉(NaHPO4)、7%硫酸十二酯鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)與1mM EDTA之溶液進行雜交，並於42℃下以0.2X SSC/0.1% SDS清洗之(Ausubel,et al(eds).(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.)(John Wiley & Sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)；又或者，舉例來說此嚴謹條件可包括於65℃下以含有0.5M磷酸氫鈉(NaHPO4)、7% SDS與1mM EDTA之溶液進行雜交，並於68℃下以0.1X SSC/0.1% SDS清洗之(Ausubel et al(eds).(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.)(John Wiley & Sons,Inc.,New York,at p.2.10.3)。
「治療(treatment)」一詞係指治療性或預防性之手段，該治療可施予具有醫學疾病之主體，或最終具有疾病、為了預防、治療、延遲、減少嚴重程度之主體，或改善疾病或再復發疾病之一個或多個症狀，或為延長在無該種治療時超出期望之主體的存活。
「變異體(variant)」係指蛋白質、胜肽、核酸與片段，且其係藉由取代(substitution)、刪除(deletion)以及/或插入(insertion)方式而不同於原始CRMP-1、CRMP-1片段以及編碼CRMP-1與CRMP-1片段之核酸；於本發明一些具體實施例，該些修飾一般不會造成原始生物功能實質上的改變例
如減少或增進，然而，於本發明其他例示，CRMP-1片段之變異體可減少或增進原始片段的生物活性，此改變於本發明仍為有用的。
多胜肽變異體包含該些保留性(conservative)取代，其係為相同類別胺基酸之取代，例如以具有不帶電側鏈之胺基酸(例如天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸與酪胺酸)進行取代、以具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸與組胺酸)進行取代、以具有酸性側鏈之胺基酸(例如天門冬胺酸與麩胺酸)進行取代以及以具有非極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸與半胱胺酸)進行取代。此外，不同活性片段尚可包括以非天然胺基酸或偽胺基酸(pseudo amino acid)取代天然胺基酸，該些修飾未明顯減少hCRMP-1或其活性片段之生物活性。
「載體(vector)」一詞於此係指可運送已被連接之另一核酸的核酸分子，質體(plasmid)係載體的一種，其係為接合有外加DNA片段之環狀雙股DNA圈環(loop)；另一種載體為病毒載體，其中外加DNA片段係可接合至病毒基因體中，某些載體係可於其導入宿主細胞中自行複製(autonomous replication)，例如細菌載體具有細菌之複製起始點(origin)以及附加型哺乳類細胞載體(episomal mammalian vector)；其他載體例如非附加型哺乳類細胞載體導入宿主細胞時，可被合併至宿主細胞之基因體中，因此可隨著宿主細胞之基因體一起進行複製；某些載體可引導被操作連接之基因的表現，該種載體於此意指重組表現載體或簡稱為表現載體，一般而言，利用於重組DNA技術中的表現載體通常為質體型式，於本發明說明書中，質體與載體可交替使用，因質體為最常見之載體使用型式，然而，本發明尚包含其他型式之表現載體例如病毒載體，諸如複製偵測型逆轉錄病毒載體、腺病毒載體與腺相關病毒載體，其係具有相等功能。
以phenol試劑為基礎之方法(TRIzol reagent,Texas,USA)萃取1 x 107的人類肺腺癌細胞，CL1-0的總量RNA(total RNA)。依照SuperScript II Reverase Transcriptase(Invitrogen生產)說明書建議方式，取0.005mg的總量RNA進行反轉錄反應合成cDNA。
人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1的胺基酸序列與cDNA序列分別列於SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2。經由聚合酶鍊鎖反應(PCR)方法，複製出約1.8kb的DNA片段，包含人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(GenBank資料庫之登錄號(Accession No)為D78012,NCBI)核苷酸序列第+142到+1866。以下兩個引子(primer)用於聚合酶鍊鎖反應中：
(1)前置引子(forward primer)：NeocF
5’-GATTCTCGAGGGGGCCATGTCGTACCAGGGCAAG-3’(SEQ ID NO：3，位於+142到+168，5’端附有一個人造核酸限制酶XhoI的切點位置(斜體字部分))；以及
(2)反置引子(reverse primer)：NeocR
5’-GTCTAGA TCAgtgatggtggtggtgatgACCGAGGCTGGTGATG-3’(SEQ ID NO：4，互補序列位於+1866到+1851，5’端附有一個人造核酸限制酶XbaI的切點位置(斜體字部分)、6個組胺酸(Histidine)(6x His tag)的核苷酸序列(小寫標示部分)以及終止密碼(stop-codon)(粗體字部分)。
利用聚合酶鍊鎖反應(PCR)複製的產物經過純化之後，以XhoI與XbaI限制酶處理，並插入已預先以XhoI與XbaI限制酶處理成直線型式的pCI-neo(Promega生產)哺乳類細胞表現載體中(pCI-neo Mammalian Expression Vector)。此構築體命名為pNCRMP1。插入的片段中，含有核苷酸序列上一個單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP；refSNP ID：
rs12331)，轉譯出的胺基酸序列與已公開發表的序列(Hamajima et al.(1996).Gene 180：157-163)完全相同。pCI-neo哺乳類細胞表現載體可持續於哺乳類細胞中表現所選殖基因並可使用抗生素進行篩選。
六個人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1基因部分片段的合成，均以pNCRMP1為DNA模板(template)，利用聚合酶鍊鎖反應(PCR)複製後，接合入市售的哺乳類表現載體，pCI-neo(Promega生產)。六個不同的構築體分別命名為：pNCN1、pNCN3、pNCN4、pNCN5、pNCN6與pNCN7。用於合成各基因片段的引子資訊，包括引子的組合、引子的序列以及各個人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1基因部分片段所對應的胺基酸區域，分別列於表三至表五中。人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1各基因片段構築體的胺基酸序列與cDNA序列分別列於表五中。部分人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1片段附有一個額外的甲硫胺酸(methionine；於胺基酸序列中以”M”表示)，以確保構築體在哺乳類細胞或原核細胞(prokaryote)(如大腸桿菌)中表現時具有正確的讀取架構(open reading frame)。
為確保在哺乳類細胞中轉譯時具有正確的讀取架構(reading frame)，在前置引子如CN3-F、CN4-F、CN5-F、CN6-F與CN7-F中額外加入起始密碼子(Start-codon)(ATG，以陰影標示)(請參閱表四)。CN1-F、CN3-F與CN4-F
三個前置引子於5’端附有一個人造核酸限制酶XhoI的切點位置(斜體字部分)，反置引子CNR，於5’端附有一個人造核酸限制酶XbaI的切點位置(斜體字部分)以及終止密碼(粗體字部分)。其餘三個前置引子，包括CN5-F、CN6-F與CN7-F，於5’端附有一個人造核酸限制酶SalI的切點位置(斜體字部分)，CN5-R、CN6-R與CN7-R三個反置引子於5’端附有一個人造核酸限制酶NotI的切點位置(斜體字部分)、6個組胺酸(Histidine)(6 x His tag)的核苷酸序列(小寫標示部分)以及終止密碼(粗體字部分)。
用於構築pNCN1、pNCN3與pNCN4表現質體的DNA片段先以XhoI與XbaI限制酶處理，而用於構築pNCN5、pNCN6與pNCN7表現質體的DNA片段，則先以SalI與NotI限制酶處理。經過限制酶處理後的DNA片段再接入已先經由相同限制酶處理過的pCI-neo載體中。
所有細胞株來自不同組織和器官，皆購自位於台灣新竹市的食品工業研究所的生物資源保存及研究中心，包括：(1)人類肺癌細胞株：肺腺癌(adenocarcinoma)A549(BCRC 60074)、鱗狀細胞癌(squmous cell carcinoma)H520(BCRC 60124)及大細胞癌(large-cell carcinoma)H460(CCRC 600373)；(2)人類攝護腺癌細胞株：二種攝護腺腺癌(adenocarcinoma)PC-3(CCRC60112)及DU 145(CCRC60348)，其中DU145細胞株是取自轉移至腦部硬塊腫瘤培養而得的細胞株；(3)人類直腸癌細胞株：三種直腸腺癌(adenocarcinoma)SW480(CCRC60249)、CC-M1(BCRC60448)及DLD-1(CCRC60132)；(4)人類乳癌細胞株：三種乳腺癌(ductal carcinoma)BT-474(CCRC60359)、
MCF-7(CCRC60436)及ZR-75-1(CCRC60055)；(5)中國倉鼠肺上皮細胞株：V79-4(BCRC60183)；和(6)人類攝護腺正常細胞株：PZ-HPV-7(CCRC60136)。
以上肺癌、攝護腺癌、直腸癌、乳癌細胞株及中國倉鼠肺上皮細胞株的培養方法同生物資源保存及研究中心所提供的資訊，細胞培養液中含有10%的胎牛血清(fetal bovine serum)(JRH Biosciences,USA)，人類攝護腺正常細胞株PZ-HPV-7是以市售的培養液套組Keratinocyte- SFM(Life Technologies,Inc.US)進行培養。
所有細胞株在轉染前每孔以2~8×105的細胞密度先植入6孔盤(Corning Inc.,USA)，先置於37℃培養箱18~20小時後，再以市售的轉染試劑LipofectamineTM(Invitrogen,#18324-020)進行轉染，每種細胞分別短暫轉染pCI-neo質體(PCI-neo Mammalian Expression Vector；Promega,USA)或含有CRMP-1基因相關的DNA表現質體。一系列建構的DNA表現質體(Expression plasmid)，包含hCRMP-1基因全長或其部分基因片段，分別為pNCRMP1、pNCN1、pNCN3、pNCN4、pNCN5、pNCN6及pNCN7，DNA表現質體的建構方法參考實施例一及實施例二的說明。
轉染細胞命名是依照「細胞名稱/質體名稱」的方式。轉染細胞置放於37℃培養箱5天後利用血球計數器(hemocytometer)的方法(R.Ian Freshney(2000)Culture of Animal cells,A Manual of Basic Technique,Chapter 20,pp.309-312,WILEY-LISS,Canada)計算控制組與實驗組活細胞數目。
抑制增生率(百分比)以下列方式計算：增生抑制率=100%×[1-(7種質體轉染細胞數目/pCI-neo質體轉染細胞數目)]
每種細胞株轉染pNCRMP1質體後預期可持續性高量表現(constitutive over-expression)人類CRMP-1全長蛋白質。轉染一系列DNA表現質體時，包括pNCN1、pNCN3、pNCN4、pNCN5、pNCN6及pNCN7，細胞內也會
分別表現其所對應hCRMP-1蛋白質部分片段，分別命名為CN1、CN3、CN4、CN5、CN6和CN7。表六顯示癌細胞株經各別轉染不同表現質體後對於增生的抑制效果。
二種攝護腺癌細胞株(PC-3和DU145)經過短暫轉染pNCRMP1及pNCN3質體後，其細胞增生呈現50%以上的抑制率。轉染細胞DU145/pNCN6與DU145/pNCN7之增生分別呈現46%和28%的抑制率。實驗結果表示hCRMP-1全長蛋白質或其部分片段CN3、CN6及CN7在攝護腺癌細胞內高量表現時，將有效地影響細胞增生。特別是CN3片段在攝護腺癌細胞內高量表現，例如PC-3與DU145，相較於在正常攝護腺細胞PZ-HPV-7高量表現，其抑制細胞增生可呈現高出20%選擇性。CN7片段在DU145細胞內高量表現時，比CN3片段高量表現時抑制增生影響低，但因對於正常攝護腺細胞PZ-HPV-7完全無抑制增生影響，反而具有較高的選擇
性抑制率達28%。利用CN3或CN7作為治療藥物設計之優點，可因其選擇性抑制增生作用而達到減少副作用。因此，pNCN3抑制攝護腺癌增生；pNCN4及pNCN6抑制轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌增生；pNCN7抑制攝護腺癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌增生。
人類鱗狀肺癌細胞株H520分別短暫轉染DNA表現質體，包括pNCN1、pNCN3、pNCN4、pNCN5及pNCN7後，分別呈現15%~44%抑制增生率，以H520/pNCN7呈現最好的抑制增生影響。將pNCN5及pNCN7表現質體分別送入H520細胞株時，顯示最好的選擇性抑制增生影響，各別具34%和44%抑制率，卻對中國倉鼠肺上皮細胞轉染株之增生完全無抑制作用，例如V79-4/pNCN5與V79-4/pNCN7。應用高選擇性藥物進行治療有降低副作用的優點，若是合併其他藥物進行治療呈現協同(synergetic)或加成(additional)作用時，對於正常細胞也不會有附加的毒性影響。
細胞株人類肺腺癌細胞A549及大細胞肺癌細胞H460短暫轉染DNA表現質體，呈現不同的抑制增生影響。僅有A549/pNCN4轉染細胞株的增生情形呈現些微抑制率，轉染其他表現質體後均無呈現抑制作用。H460細胞株在短暫轉染pNCRMP1和pNCN3質體後，分別呈現19%和6%的抑制增生作用。因此，pNCN1、pNCN3抑制肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌增生；pNCN4抑制肺腺癌及肺癌的鱗狀細胞癌增生；pNCN5、pNCN6及pNCN7抑制肺癌的鱗狀細胞癌增生。
三種人類直腸癌細胞株CC-M1、DLD-1及SW480分別進行短暫轉染pNCRMP1、pNCN3、pNCN5、pNCN6和pNCN7表現質體後，評估抑制增生影響。每一種直腸癌細胞轉染表現質體後之細胞數會先利用轉染控制組質體pCI-neo之細胞數作標準化，取得相對抑制增生比例。短暫轉染直腸癌細胞株CC-M1/pNCRMP1與CC-M1/pNCN3，呈現最好的抑制增生作用，
達90%以上。短暫轉染直腸癌細胞株之增生也分別呈現40%及29%的抑制率，例如CC-M1/pNCN5和CC-M1/pNCN6。
DLD-1直腸癌細胞株分別轉染表現質體後，呈現14%~52%不同的抑制增生影響，以DLD-1/pNCN3短暫轉染株呈現最好的抑制率可達52%。SW480直腸癌細胞株各別短暫轉染表現質體均無呈現抑制增生影響。因此，pNCN3、pNCN5、pNCN6及pNCN7抑制直腸癌細胞增生。
三種人類乳癌細胞株BT-474、MCF-7及ZR-75-1分別進行短暫轉染pNCRMP1、pNCN3、pNCN5、pNCN6和pNCN7的表現質體。MCF-7乳癌細胞株短暫轉染pNCRMP1與pNCN3表現質體後，呈現明顯的抑制增生作用，可達70%以上，短暫轉染pNCN5、pNCN6及pNCN7表現質體，可呈現43%~25%的抑制率。
ZR-75-1乳癌細胞株短暫轉染pNCRMP1與pNCN3表現質體，分別呈現26%及17%的抑制率，短暫轉染其他DNA質體則無呈現抑制增生影響。BT-474乳癌細胞株各別短暫轉染表現質體均無呈現抑制增生作用。因此，pNCN3、pNCN5、pNCN6及pNCN7抑制乳癌細胞增生。
人類鱗狀肺癌細胞株H520和二種人類攝護腺癌細胞株PC-3和DU145分別短暫轉染pNCRMP1、pNCN3、pNCN5、pNCN6和pNCN7表現質體，控制組則轉染DNA質體pCI-neo。短暫轉染程序與實施例三所述相同。
轉染細胞的群落形成能力分析參考Bartholomeusz等人發表之實驗方法(Cancer Research(2005)65(18)：8406-8413)並做以下修改：轉染後的細胞先更新培養液置放於37℃培養箱2-5天後，再將轉染細胞以1：3~1：6稀釋比
例分配植入6孔盤中，加入含有濃度0.5-0.9mg/ml之抗生素G418的培養液，持續培養三週，以結晶紫(crystal violet)染色方法(R.Ian Freshney,WILEY-LISS(2000)Protocol 15.3；pp.235-236)分析轉染細胞的群落形成能力。
轉染細胞的群落形成能力(以百分比表示)是各別轉染表現質體的細胞與轉染控制組質體(pCI-neo)之細胞相比得到的結果，如下式所列：相對抑制群落形成能力=100%×[1-(轉染表現質體細胞形成群落之數目/轉染控制組質體細胞形成群落之數目)]
進一步研究hCRMP-1全長與其部份片段在人類癌細胞高量表現時，對於群落形成能力的影響。表七為人類鱗狀肺癌細胞株H520和二種攝護腺癌細胞株PC-3和DU145經過短暫轉染表現質體後之相對抑制群落形成比率。hCRMP-1全長或其部分片段CN3、CN5、CN6和CN7分別在其轉染細胞呈持續性高量表現(constitutive over-expression)。
轉染細胞DU145/pNCRMP1、DU145/pNCN3及DU145/pNCN6等的相
對群落形成能力呈現降低50%以上，其中DU145/pNCN3呈現到最好的抑制影響，達67%。換言之，CN3片段持續性高量表現(constitutive over-expression)會使攝護腺癌細胞株DU145的群落形成能力巨幅降低。轉染細胞DU145/pNCN7呈現失去25%的相對群落形成能力，但是轉染細胞DU145/pNCN5沒有呈現任何改變。
觀察轉染細胞PC-3/pNCRMP1的相對群落形成能力呈現降低約30%，其他轉染細胞PC-3/pNCN3、PC-3/pNCN5及PC-3/pNCN7呈現些微的抑制群落形成影響(13-15%)。因此，pNCN3、pNCN5、pNCN6及pNCN7抑制攝護腺癌群落形成。
轉染細胞H520/pNCN5與控制組轉染細胞H520/pCI-neo相比大約失去30%群落形成能力，顯示CN5片段高量表現會引發人類鱗狀肺癌細胞株H520轉型(transformation)，但是hCRMP-1全長或部分片段CN3及CN7高量表現時則否。因此，pNCN3、pNCN5、pNCN6及pNCN7抑制鱗狀肺癌細胞株群落形成。
人類肺癌細胞株A549、H460及H520分別短暫轉染DNA質體pCI-neo(控制組)及四種hCRMP-1基因相關之表現質體，包括pNCRMP1、pNCN1、pNCN3和pNCN4(實驗組)。短暫轉染方法與實施例三所述相同。
不依賴依附生長分析參考Freshney所述實驗方法(Culture of Animal cells,A Manual of Basic Technique(2000)Chapter 20,pp.200-202,WILEY-LISS,Canada)並做以下修改。將轉染細胞加入含有濃度
0.5-0.9mg/ml之抗生素G418的培養液置放於37℃培養箱2-5天後，再將轉染細胞與軟凝膠(soft-agarose)混合並稀釋為每毫升含有4,000-6,000的細胞數目，取含有轉染細胞的軟凝膠半固體物質植入已經先鋪有洋菜膠(agarose)的24孔盤中，培養4-8週。最後以倒立式顯微鏡觀察，計算懸浮生長於軟凝膠中直徑大於0.05mm的細胞群落數目，所有轉染細胞均進行三重複測試。
hCRMP-1全長和其部分片段高量表現對在軟凝膠中群落生長的抑制影響，如下式所列計算方式：相對抑制率=100%×[1-(實驗組細胞群落生長數目/控制組細胞群落生長數目)]
能夠在半固體洋菜膠(semi-solid agarose)不依賴依附生長是轉型細胞(transformed cell)具有的生物特性之一，三種肺癌細胞株分別轉染表現質體pNCRMP1、pNCN1、pNCN3和pNCN4及轉染pCI-neo(控制組質體)，觀察在軟凝膠系統中懸浮細胞群落形成的能力。
三種轉染肺癌細胞株在軟凝膠系統中懸浮細胞群落形成的能力呈現50%~100%之抑制比率(表八)。二種肺癌轉染細胞H460/pNCN3及H460/pNCN4，分別高表現CN3及CN4片段，在不依賴依附生長的環境中呈現完全失去細胞群落生長的能力，對於其他二種轉染細胞H460/pNCRMP1和H460/pNCN1而言，抑制不依賴依附生長能力也呈現高達75%。
在不依賴依附生長實驗，肺腺癌細胞株A549轉染pNCN4質體呈現最好的抑制影響(超過80%)。這些結果顯示CN4片段對於在軟凝膠中細胞群落的抑制扮演重要的角色，特別是針對肺腺癌和大細胞癌種類，但對鱗狀細胞肺癌則無影響。
如表八所示，在不依賴依附生長實驗中，四種H520轉染細胞呈現失去將近一半細胞群落生長的能力。因此，pNCN1、pNCN3及pNCN4抑制肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌群落形成。
利用三種人類癌細胞株，包括鱗狀肺癌細胞株H520及二種人類攝護腺癌細胞株(PC-3及DU145)建立穩定轉染細胞株。四種pNCRMP1、pNCN1、pNCN3、pNCN4表現質體和pCI-neo(作為控制組質體)作為轉染用質體。一般細胞培養與轉染程序與實施例三所述相同。轉染細胞係以與其母細胞(parental cell)相同條件進行培養，並以含0.6-1mg/ml濃度之抗生素G418的培養液進行轉染株選擇(Kao et al.(1998)Oncogene 16：546-554；Xiaolin et al.(2005)Cancer Research 65：9762-9770)。
三種化學治療藥物包括caffeic acid phenethyl ester(CAPE；Sigma,USA)、AdriamycinTM(doxorubicin)(Pharmacia & Upjohn S.P.A.Milan,Italy)
及paclitaxel(Taxol；Bristol-Myers Squibb Co.,Wallingford,CT)，分別溶於有機溶劑DMSO(dimethyl sufoxide；Sigma)作儲備試劑(stock solution)，化學治療敏感性測試所需求的藥物濃度以DPBS緩衝試劑(buffer)進行連續稀釋。人類鱗狀肺癌H520的穩定轉染細胞株分別加入四種不同濃度之CAPE與AdriamycinTM，例如0.05、0.01、0.002及0.0004mM，和加入paclitaxel時之濃度為1000、200、40及8nM。二種攝護腺癌的穩定轉染細胞株僅以paclitaxel測試，其添加濃度為介於0.1mM~1.28nM範圍內之八種濃度，且各濃度間具5倍差。
細胞毒性影響是應用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；Sigma Inc.)方法作為呈色試劑(Monks,A.et al.(1991)J.Natl.Cancer Inst.83：757-766；Paull,K.D.et al.(1989)J.Natl.Cancer Inst.81：1088-1092)，利用可讀取96孔盤讀取儀(spectrophotometer reader)(Emax,Molecular Device Inc.,California,USA)以二種波長545nm與690nm(背景值；需扣除)測量吸光值(Absorbance)(Chen,C.F.et al.(1990)Zhonghua Yi Xue Za Zhi(Taipei),46(1)：7-16)。相對生長抑制率計算如下式所列：相對生長抑制率=100% x[1-(OD545nm-OD690nm(含藥物細胞)/OD545nm-OD690nm(未含藥物細胞))]
每種轉染細胞的50%抑制率濃度(IC50)是依據spectrophotometer讀值應用電腦軟體“EXCEL”計算繪圖所得。
穩定轉染細胞株所加入的三種藥物caffeic acid phenethyl ester(CAPE)、AdriamycinTM(doxorubicin)及paclitaxel分別為COX-2抑制劑、細胞生命週期相關的抗生素類和特殊作用於G2生命週期的藥物。表九係為轉染細胞的50%抑制率濃度(IC50)之結果。
表九、化學治療藥物對穩定轉染細胞株的50%抑制率濃度(IC50)(μM)之結果
穩定轉染細胞株以持續加入含有抗生素G418的培養液篩選而得，人類鱗狀肺癌細胞株H520的穩定轉染細胞株包括H520/pCI-neo/1(作為控制組)、H520/pNCRMP1/1、H520/pNCN1/1、H520/pNCN3/1與H520/pNCN4/1。攝護腺癌細胞株PC-3的穩定轉染細胞株包括PC-3/pCI-neo/11-1(作為控制組)、PC-3/pNCRMP1/1304與PC-3/pNCN3/15-5。DU145的穩定轉染細胞株包括DU145/pCI-neo(作為控制組)與DU145/pNCRMP1/2。
穩定轉染攝護腺癌細胞株DU145/pNCRMP1/2對paclitaxel化學治療敏感性的改善最佳，達400倍。最具有優勢的抗癌藥物是臨床應用時僅需使用較低的濃度，可減少對正常細胞之毒殺。
在持續加入含有抗生素G418的培養液篩選期間，DU145/pNCN3無法形成細胞群落生長，所以無法建立穩定轉染細胞株。在進行生長抑制分析時，短暫轉染DU145細胞在CN3片段高量表現時仍有細胞生長，但由於該轉染細胞的特定生長功能被破壞，使其無法進行延長培養，因此無法建立具CN3高量表現的DU145穩定轉染細胞以進行合併化學治療藥物的測試。
二個攝護腺癌的穩定轉染細胞株PC-3/pNCRMP1/1304和
PC-3/pNCN3/15-5對paclitaxel化學治療敏感性沒有影響。
人類鱗狀肺癌細胞株H520高量表現CN3或CN4片段時，即H520的2個穩定轉染細胞株H520/pNCN3/1及H520/pNCN4/1，顯示對paclitaxel化學治療敏感性提高至少4倍。
具有CRMP-1全長或CN3、CN4片段表現的人類鱗狀肺癌細胞株H520之穩定轉染細胞株，對AdriamycinTM化學治療敏感性至少增加二倍。
穩定轉染細胞株H520/pNCRMP1/1對CAPE化學治療敏感性增加至少三倍，而H520的其他種穩定轉染細胞約增加二倍。
根據這些數據顯示，在藥物應用前或期間藉由轉入含有hCRMP-1基因相關片段之表現質體，可提升化學治療藥物包括caffeic acid phenethyl ester(CAPE)、AdriamycinTM及paclitaxel之治療效果。
在改善癌細胞的化學治療敏感性實驗中有六種人類癌細胞株被測試，包括直腸癌細胞株Caco-2、CC-M1、DLD-1；攝護腺癌細胞株PC-3、DU145；乳癌細胞株MCF-7，分別轉染pNCRMP-1、pNCN3表現質體和pCI-neo載體(控制組質體)。細胞培養與轉染程序與實施例三所述相同。
在轉染後，化學治療藥物係依下列(1)-(4)所示立刻加入短暫轉染細胞，置放37℃培養箱3天後利用血球計數器(hemocytometer)計算活細胞數目。
(1)5-fluorouracil藥物加至三種直腸癌短暫轉染細胞株。
(2)AdriamycinTM(doxorubicin)、cyclophosphamide和etoposide藥物加至DU145攝護腺癌短暫轉染細胞株。
(3)Cyclophosphamide、etoposide和paclitaxel藥物加至PC3攝護腺癌短暫
轉染細胞株。
(4)AdriamycinTM(doxorubicin)和paclitaxel藥物加至MCF-7乳癌短暫轉染細胞株。
表十顯示各種藥物對轉染細胞的50%抑制率濃度(IC50)。兩種短暫轉染細胞株MCF-7/pNCRMP1及MCF-7/pNCN3變成對AdriamycinTM(doxorubicin)有高化學治療敏感性，IC50數據顯示合併策略可以改善AdriamycinTM(doxorubicin)對MCF-7細胞的治療作用，對於以pNCRMP1及pNCN3短暫轉染的細胞可分別提高20倍和6倍的化學治療敏感性。
當PC-3細胞被短暫轉染pNCN3時可以改善paclitaxel藥物的治療效用達8倍之多。相反的，如前所述，當使用穩定轉染細胞PC-3/pNCRMP1/1034和PC-3/pNCN3/15-5進行研究時沒有改善paclitaxel藥物的治療效用(未提供數據)。
當使用5-fluorouracil藥物加至短暫轉染的直腸癌細胞株時，化學治療敏感性沒有提高(結果未示)。
利用聚合酶鍊鎖反應(PCR)方法，複製出包含人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(GenBank Accession No.D78012,NCBI)核苷酸序列第+151到+1866的1716bp的DNA片段。聚合酶鍊鎖反應中採用的引子如下：(1)前置引子(forward primer)：2F 5’-ATTGAAAGCTTATGTCGTACCAGGGCA-3’(SEQ ID NO：27，位於+151到+166，5’端附有一個人造核酸限制酶HindIII的切點位置(斜體字部分))；以及(2)反置引子(reverse primer)：2R 5’-ATATCCTCGAGACCGAGGCTGGTGATG-3’(SEQ ID NO：28，互補序列位於+1866到+1851，5’端附有一個人造核酸限制酶XhoI的切點位置(斜體字部分))。
經聚合酶鍊鎖反應(PCR)複製的產物經過膠體回收(agarose gel elution)與有機溶劑酚及氯仿萃取(phenol/isopropanol extraction)之後，以HindIII與XhoI限制酶處理，再插入pET-22b(+)(Novagen生產)質體的HindIII/XhoI位置上。包含編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1cDNA序列之全部572個胺基酸序列(GenBank Accession No.BAA11190,NCBI)的構築體命名為
pET22bCRMP1。pET system是一個常用的系統，能在大腸桿菌中有效調控噬菌體T7啟動子進行重組蛋白質的表達。本實驗中採用的pET-22b(+)載體，於選殖進入的基因5’端含有39個胺基酸組成的訊息胜肽(signal peptide)。
利用聚合酶鍊鎖反應(PCR)方法，複製出人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(GenBank Accession No.D78012,NCBI)核苷酸序列第+772到+1591約820bp的DNA片段。聚合酶鍊鎖反應(PCR)中採用的引子如下：(1)前置引子(forward primer)：CN3PF 5’-AGCAAGCTTGAACAAAAGCGGATCCTG-3’(SEQ ID NO：29，位於+772到+789，5’端附有一個人造核酸限制酶HindIII的切點位置(斜體字部分))；以及(2)反置引子(reverse primer)：CNPR 5’-TAACTCGAGCTGGTACAGGTGCTCC-3’(SEQ ID NO：30，互補序列位於+1591到+1575，5’端附有一個人造核酸限制酶XhoI的切點位置(斜體字部分))。
經聚合酶鍊鎖反應生成的產物經過膠體回收與有機溶劑酚/氯仿萃取之後，以HindIII與XhoI限制酶處理，再插入pET-22b(+)(Novagen生產)質體的HindIII/XhoI位置上。包含編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1cDNA序列中第208到480的胺基酸序列(GenBank Accession No.BAA11190,NCBI)的構築體命名為pE22bCN3。
將二種表現質體pET22bCRMP1與pE22bCN3表現質體依據Maniatis等人發表之方法(Maniatis et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Habor)分別轉型進入大腸桿菌BL21(DE3)中。利用SDS-PAGE electrophoresis分析，進而分別篩選出位於hCRMP1與e-rCN3之預期分子量處有最高重組蛋白表現量的二個轉型株(transformant)：WJ4-1(E.coli BL21(DE3)/pET22bCRMP1)與WJ60-2(E.coli BL21(DE3)/pE22bCN3)。
二個轉型株於37℃下培養於含有0.05mg/ml安比西林(ampicillin)的100ml LB培養基中。當細胞生長到於600nm下吸光值約為0.4-0.6時，加入使濃度為0.4-1mM的異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG；MDBio生產)，於37℃下繼續培養3小時。
菌體以離心的方式收集後，重新懸浮於PBS緩衝液中，加入玻璃珠(glass bead)，以震盪(vortex)30秒後置於冰上1分鐘方式，反覆震盪15次將菌體打破。經由離心的方式取得內涵體(inclusion body)後，以Buffer B(8M urea,100mM Na2HPO4,10mM Tris,pH8)將內涵體重新懸浮，以溶解重組蛋白。依照Novagen的使用說明，以His-Bind resin(Ni-NTA His‧Bind® Resin,Novagen生產)進行重組蛋白的純化工作，利用含有50到400mM的imidazole elution buffer(8M urea,100mM Na2HPO4,100mM NaCl,pH8)將重組蛋白析出。純化所得的重組蛋白經由SDS-PAGE分析與胺基酸序列分析鑑定。
收集含有預期的e-rCN3蛋白質溶液，置於50mM Tris-HCl(pH8)溶液中進行透析以去除蛋白質溶液中的尿素成分。e-rCN3存於透析後蛋白質溶液生成的沉澱物中，經由離心步驟分離出沉澱物，以100mM Tris-NaOH溶液(pH12)將沉澱物重新懸浮，以獲得預期濃度的重組蛋白質溶液。
利用五種人類細胞株測試重組蛋白e-rCN3的細胞抑制生長影響，包括人類直腸癌細胞株CC-M1、人類乳癌細胞株MCF-7、二種人類攝護腺癌細胞株PC-3及DU 145和人類攝護腺上皮細胞株PZ-HPV-7。e-rCN3溶於pH12的Tris-buffer溶液中，以加入細胞培養液稀釋製備最終濃度，e-rCN3的製備方法如實施例八所述，測試結果顯示Tris-buffer溶液對將進行測試之細胞株均無任何細胞毒性影響。細胞毒性分析方法參考Monks等人發表之MTT方法(J.Natl.Cancer Inst.(1991)83：757-766)及利用血球計數器(hemocytometer)方法(R.Ian Freshney(2000)186,309-312)計算細胞數目。取5μM e-rCN3加入細胞6小時之後，取出藥物溶液置換成細胞培養液再培養16小時，對於三種攝護腺細胞株重複此步驟二次，人類直腸癌與乳癌細胞株重複三次。生長抑制率以下列方式計算：生長抑制率=100%×[1-(細胞數目(加入藥物)/細胞數目(未加入藥物))]
以5μM e-rCN3處理人類直腸癌細胞株CC-M1與乳癌細胞株MCF-7可達成大於60%的生長抑制影響，但對具高轉移性的人類攝護腺癌細胞株PC-3呈現約40%抑制率。最特別的是，相同濃度之e-rCN3對人類攝護腺上皮細胞株PZ-HPV-7沒有生長抑制影響。換言之，e-rCN3會呈現高選擇性的細胞毒性影響，將來應用於治療藥物時預期會降低可能產生的副作用影響。
蛋白質傳送區域(Protein transduction domains,PTDs)或細胞穿透胜肽(cell penetrating peptides,CPPs)最早是在研究能自行進入細胞的人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)反式激活蛋白(transactivator,TAT)時被發現。TAT蛋白參與人類免疫缺陷病毒(HIV)的複製，並具有通過細胞膜的能力(Vivès et al.(1997)Journal of Biological Chemistry,
272：16010-16017)。近期的研究顯示，當蛋白質、胜肽以及反義核苷酸(antisense nucleotides)與PTDs鍵結(conjugate)時，可以增加其進入細胞的效力(Lindsay.(2002)Current Opinion in Pharmacology,2：587-594)。PTDs為短胜肽序列，其中以TAT蛋白上一段具有高度正電性(highly cationic)的11個胺基酸序列(YGRKKRRQRRR)，為研究分析最完整的一段轉送胜肽(translocating peptide)(Albarran et al.(2005)Protein Enginerring Design & Selection,18：147-152)。
本發明之策略為，生產額外一段TAT蛋白的轉送胜肽融合到CN3蛋白的N端，以增加在體外(in vitro)試驗研究中細胞吸收蛋白質的效率，進而增加蛋白質對腫瘤細胞的抑制增生能力(antiproliferation)。
二個寡核苷酸(Oligonucleotides)，5T1與3T1R，以相同的濃度混合均勻後，於94℃下作用5分鐘，72℃下作用30秒，60℃下作用10分鐘後再緩慢降溫至室溫(Arakawa et al.(2001)BMC Biotechnology,1：7)。將此黏合好的短的核苷酸片段插入pET-22b(+)(Novagen生產)質體的NdeI/BamHI位置上。此構築體命名為pETAT。
寡核苷酸(Oligonucleotides)序列如下：(1)5T1(SEQ ID NO：31)：5’-TATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGG-3’(粗體字標示序列為長11個胺基酸的人類免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白的傳送區域(transduction domain)對應的核苷酸序列)以及(2)3T1R(SEQ ID NO：32)：5’-GATCCCGACGACGCTGACGACGTTTTTTACGACCGTACA-3’(粗體字標示序列為與寡核苷酸5T1互補區域)。
pE22bCN3表現質體含有可轉譯出CN3區域的850bp的DNA片段(請參閱實施例七)，以二種限制酶HindIII與XhoI處理後，再以膠體回收與有機溶劑酚及氯仿萃取之。純化後的850bp的DNA片段，再插入pETAT質體的HindIII/XhoI位置上，形成pETAT-CN3表現質體。
將pETAT-CN3表現質體轉型進入大腸桿菌BL21(DE3)中。利用SDS-PAGE electrophoresis分析，進而篩選出位於e-rTCN3融合蛋白預期的分子量33kDa處有最高重組蛋白表現量的轉型株(transformant)：WJ72-3(E.coli BL21(DE3)/pETAT-CN3)。
WJ72-3轉型株的培養，以及接續誘導大腸桿菌過量表現(over-expression)重組e-rTCN3融合蛋白(fusion protein)的條件，與實施例八中敘述相同。
為分離出重組e-rTCN3融合蛋白(over-expressioned recombinant e-rTCN3 fusion protein)，首先應用修改自Chang等人發表的方法(Chang et al.(2002)Protein Enginerring,15：437-441)進行內涵體(inclusion body)的前處理。收得的大腸桿菌轉型株細胞，溶於相同的lysis溶液，但不含lysozyme，加入玻璃珠並以震盪方式將菌體打破。e-rTCN3融合蛋白的變性(denature)與復性(renature)依照Chang等人描述的方式(Biochemical and Biophysical Research Communications,340：1134-1138(2006))加以修改。所有的refolding buffer皆不含鎘離子(Cd2+)與錳離子(Mn2+)。最後一個refolding buffer的酸鹼值控制在9到10之間。最後含有e-rTCN3融合蛋白的溶液，依照說明書載明方式，以截留分子量(Molecular Weight Cut-Off)為10kDa的Amicon Ultra centrifuge filter(Millipore生產)進行濃縮。
以二種人類細胞株包括人類直腸癌細胞株CC-M1及人類乳癌細胞株MCF-7，測試重組蛋白e-rTCN3的細胞抑制影響。利用血球計數器
(hemocytometer)(如實施例三所述)計算細胞數目的方法測試e-rTCN3對細胞增生的影響。
本實驗所使用e-rTCN3蛋白的製備方法如實施例十一所述。
將二種癌細胞CC-M1及MCF-7分別加入含有5μM e-rTN3重組蛋白的培養液於37℃下培養24小時後，更新加入處理培養液(treatment medium)，再培養24小時後，評估抑制增生影響。
以5μM e-rTCN3處理乳癌細胞株MCF-7後，抑制增生率超過60%，對CC-M1為40%。e-rTCN3重組蛋白對癌細胞會呈現抑制增生影響，特別對於人類直腸癌及人類乳癌細胞，此蛋白具有開發成為治療藥物的潛力。
除非特別指明，本發明說明書(包含專利範圍)中成份與反應條件等之所有數字表現量，係可於各種情況下以「大約」一詞修飾之，因此，相反的除非特別指明，數值係為近似值且可隨本發明所載需要特性而改變；至少，但並非用以限制專利範圍中等同物之應用，各數值應被理解為根據有效數字(Significant Digits)以及一般捨位法(ordinary rounding approaches)之數字。
除非特別指明，位於一長串元件前之「至少」一詞可被理解為其係指該長串中的各元件，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應於不需進行過度實驗之情況下，認定或可確定本發明於此所述該些特殊具體實施例中的許多等同物，該等同物係被包含於下述專利範圍中。
由於本發明係以例示與具體實施例方式描述，因此應可理解其並非用以限定本發明，相反地，其係欲涵蓋不同修飾與相似內容(對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者係為顯而易知者)，因此，本發明之專利範圍應被給予最廣之解釋以包含所有該些修飾與相似內容。
本發明說明書係為依據說明書內容中所列該些參考資料之教示而可被完全理解者，說明書中的具體實施例提供一本發明具體實施例之說明，且並非用以限制本發明範圍，知悉該技術者可由閱讀本發明說明書內容而認定本發明尚可包含許多其他具體實施例；於本發明揭示之所有出版物與專
利係完全為參考之用，為延伸參考資料所結合之物質與本發明內容為牴觸或不一致，本發明將取代該物質；任何此處列舉之參考資料並非承認該些參考資料為本發明之前案。
第一圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。
第二圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)基因之核酸序列(SEQ ID NO：2；GenBank資料庫之登錄號(Accession No)為D78012,NCBI)。
第三圖係本發明實施例用於複製放大(amplify)人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：3)。
第四圖係本發明實施例用於複製放大(amplify)人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：4)。
第五圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1 DNA片段之引子的核酸序列(SEQ ID NO：5)。
第六圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3 DNA片段之引子的核酸序列(SEQ ID NO：6)。
第七圖係本發明實施例用於構築相對於人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域之CN4 DNA片段之引子的核酸序列(SEQ ID NO：7)。
第八圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1、CN3與CN4 DNA片段之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：8)。
第九圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5 DNA片段之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：9)。
第十圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6 DNA片段之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：10)。
第十一圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7 DNA片段之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：11)。
第十二圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5 DNA片段之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：12)。
第十三圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6 DNA片段之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：13)。
第十四圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7 DNA片段之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：14)。
第十五圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1區域之胺基酸序列(SEQ ID NO：15)。
第十六圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1區域之核酸序列(SEQ ID NO：16)。
第十七A-B圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域分別具有與不具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列(SEQ ID NO：17與39)。
第十八圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域之核酸序列(SEQ ID NO：18)。
第十九A-B圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域分別具有與不具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列(SEQ ID NO：19與40)。
第二十圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域之核酸序列(SEQ ID NO：20)。
第二十一A-B圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5區域分別具有與不具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列及C端His tag序列(SEQ ID NO：21與41)。
第二十二圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5區域之核酸序列(SEQ ID NO：22)。
第二十三A-B圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6區域分別具有與不具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列及C端His tag序列(SEQ ID NO：23與42)。
第二十四圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6區域之核酸序列(SEQ ID NO：24)。
第二十五A-B圖係本發明實施例人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域分別具有與不具有N端甲硫胺酸之胺基酸序列及C端His tag序列(SEQ ID NO：25與43)。
第二十六圖係本發明實施例用於構築人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域之核酸序列(SEQ ID NO：26)。
第二十七圖係本發明實施例用於大腸桿菌(E.coli)中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之異源性表現之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：27)。
第二十八圖係本發明實施例用於大腸桿菌(E.coli)中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之異源性表現之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：28)。
第二十九圖係本發明實施例用於大腸桿菌(E.coli)中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的異源性表現之前置引子的核酸序列(SEQ ID NO：29)。
第三十圖係本發明實施例用於大腸桿菌(E.coli)中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的異源性表現之反置引子的核酸序列(SEQ ID NO：30)。
第三十一圖係本發明實施例用於構築pETAT表現質體之一核苷酸片段之核酸序列(SEQ ID NO：31)。
第三十二圖係本發明實施例用於構築pETAT表現質體之一核苷酸片段之核酸序列(SEQ ID NO：32)。
第三十三圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1區域的的核酸序列(SEQ ID NO：33)。
第三十四圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的的核酸序列(SEQ ID NO：34)。
第三十五圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域的的核酸序列(SEQ ID NO：35)。
第三十六圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5區域的的核酸序列(SEQ ID NO：36)。
第三十七圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6區域的的核酸序列(SEQ ID NO：37)。
第三十八圖係本發明實施例編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域的的核酸序列(SEQ ID NO：38)。
<110> 怡發科技股份有限公司
<120> 利用腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)及其片段治療癌症之組合物及方法
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<212> 胺基酸
<213> 人工序列
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<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 編碼人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之核酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之前置引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之反置引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1 DNA片段之引子
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<212> DNA
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<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3 DNA片段之引子
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引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> 胺基酸
<213> 人工序列
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<212> 胺基酸
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<212> DNA
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<212> 胺基酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域具有N端甲硫胺酸及C端
His tag
<400> 25
<210> 26
<211> 415
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域之核酸
<400> 26
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大腸桿菌中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之異源性表現之前置引子
<400> 27
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大腸桿菌中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之異源性表現之反置引子
<400> 28
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大腸桿菌中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的異源性表現
之前置引子
<400> 29
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大腸桿菌中人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的異源性表現
之反置引子
<400> 30
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築pETAT表現質體之一核苷酸片段
<400> 31
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築pETAT表現質體之一核苷酸片段
<400> 32
<210> 33
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN1區域的核酸
<400> 33
<210> 34
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域的核酸
<400> 34
<210> 35
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域的核酸
<400> 35
<210> 36
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5區域的核酸
<400> 36
<210> 37
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6區域的核酸
<400> 37
<210> 38
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域的核酸
<400> 38
<210> 39
<211> 273
<212> 胺基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN3區域不具有N端甲硫胺酸
<400> 39
<210> 40
<211> 166
<212> 胺基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN4區域不具有N端甲硫胺酸
<400> 40
<210> 41
<211> 109
<212> 胺基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN5區域不具有N端甲硫胺酸及C
端His tag
<400> 41
<210> 42
<211> 116
<212> 胺基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN6區域不具有N端甲硫胺酸及C
端His tag
<400> 42
<210> 43
<211> 115
<212> 胺基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(hCRMP-1)之CN7區域不具有N端甲硫胺酸及C
端His tag
<400> 43
Claims (16)
- 一種腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段在製備抑制癌症增生(proliferation)且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率藥物之用途，該活性片段係選自SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25以及39-43之胺基酸序列所組成之群組，其中該SEQ ID NO：15之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：17、39之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：19、40之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌；該SEQ ID NO：21、41之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：23、42之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及 該SEQ ID NO：25、43之胺基酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該活性片段包含SEQ ID NO：17。
- 一種融合蛋白(fusion protein)，其包含如申請專利範圍第1項所述之腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段以及一轉錄活化子(transcriptional activator of transcription,TAT)序列。
- 一種編碼腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段的核酸序列在製備抑制癌症增生(proliferation)且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率藥物之用途，該活性片段係選自SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、33、34、35、36、37以及38所組成之群組，其中該SEQ ID NO：16、33之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：18、34之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：20、35之核酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗狀細胞癌；該SEQ ID NO：22、36之核酸酸序列抑制增生之癌症係為肺癌 的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：24、37之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及該SEQ ID NO：26、38之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。
- 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：18。
- 一種核酸序列，其係編碼如申請專利範圍第3項所述之融合蛋白(fusion protein)。
- 一種用於治療癌症之醫藥組成物，係包含一如申請專利範圍第1項所述之腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段，其中該活性片段可抑制癌細胞增生(proliferation)且對正常細胞生長具有該選擇性抑制率。
- 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，其中該腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段包含SEQ ID NO：17。
- 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，係包含一化學治療藥物(chemotherapeutic agent)，其中該腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之活性片段可增進該化學治療藥物之效用。
- 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該化學治療藥物係為太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
- 一種用於抑制癌症增生(proliferation)之醫藥組成物，該醫藥組成物係包含如申請專利範圍第1項所述之腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)，藉以抑制癌細胞增生且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率。
- 一種可表現腦衰蛋白反應媒介蛋白-1(CRMP-1)之一活性片段之載體，其包含：(a)至少一調控元件(regulatory element)；以及(b)一編碼部份，係主要由一核酸序列所組成，該核酸序列係編碼一CRMP-1之活性片段，該活性片段包含選自SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、33、34、35、36、37以及38所組成之群組，其中該活性片段可抑制癌症增生(proliferation)且對正常細胞生長具有一選擇性抑制率，其中該SEQ ID NO：16、33之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或大細胞癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌；該SEQ ID NO：18、34之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、肺癌的大細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌、肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：20、35之核酸序列抑制增生之癌症係為肺腺癌、肺癌的鱗狀細胞癌或轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺腺癌、肺癌的大細胞癌或肺癌的鱗 狀細胞癌；該SEQ ID NO：22、36之核酸酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌或攝護腺癌；該SEQ ID NO：24、37之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為轉移至腦部腫瘤的攝護腺癌；以及該SEQ ID NO：26、38之核酸序列抑制增生之癌症係為肺癌的鱗狀細胞癌、攝護腺癌、直腸腺癌或乳癌，而抑制菌落形成之癌症係為攝護腺癌。
- 如申請專利範圍第12項所述之載體，其中該載體係為病毒載體。
- 如申請專利範圍第12項所述之載體，其中該載體係選自星狀病毒(astrovirus)載體、冠狀病毒(coronavirus)載體、正黏液病毒(orthomyxovirus)載體、乳多空病毒(papovavirus)載體、副黏液病毒(paramyxovirus)載體、細小病毒(parvovirus)載體、小核糖核酸病毒(picornavirus)載體、痘病毒(poxvirus)載體、或披膜病毒(togavirus)載體。
- 如申請專利範圍第12項所述之載體，其中該至少一調控元件係為一組織特異性調控元件(tissue-specific regulatory element)。
- 如申請專利範圍第12項所述之載體，其中該載體之該編碼部份包含SEQ ID NO：17。
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