CN112442129B - 肿瘤酶响应型重组焦亡蛋白递药系统及其抗肿瘤用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤酶响应型重组焦亡蛋白递药系统及其抗肿瘤用途。具体地，本发明提供了一种融合蛋白，其从N端到C端具有式I所示的结构：Z0‑Z1‑Z2‑Z3‑Z4(式I)式中，Z0为任选的标签元件；Z1为焦亡蛋白的N结构域元件；Z2为穿膜肽序列元件；Z3为能够被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶特异性切割的肽序列元件；Z4为焦亡蛋白的C结构域元件；“‑”表示连接上述元件的肽键；其中，在融合蛋白中，所述Z4元件通过特异性地结合Z1元件来抑制Z1元件的活性。本发明的融合蛋白在体内外实验中表现出非常好的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体而言，本发明涉及一种肿瘤酶响应型重组焦亡蛋白递药系统及其抗肿瘤用途。
背景技术
焦亡蛋白是一类能够介导细胞焦亡的蛋白家族(gasdermin protein family)，成员之间具有45％的序列同源性，包括GSDMA(1-3)、GSDMB、GSDMC(1-4)、GSDMD、DFNA5(GSDME)、DFNB59(GSDMF)。
除了DFNB59，其他的焦亡蛋白都有着相似的结构：包括N结构域(N-domain)和C结构域(C-domain)这两个结构域以及连接这两个结构域的接头(linker)。正常情况下，两个结构域紧密结合处于自抑制状态。
一旦linker被切割，则破坏C结构域对N结构域的抑制作用，释放出活性的N结构域。活性的N结构域和细胞膜内叶的磷脂酰肌醇(PI)或磷脂酰丝氨酸(PS)结合，或者直接和细菌质膜外侧的心磷脂结合，在细胞膜上聚集形成孔洞，导致细胞肿胀、细胞膜破裂、内含物释放，以及引起炎症反应并最终导致细胞清除。这个过程被称为细胞的焦亡。
细胞的焦亡被定义为一种新型的、促炎的细胞程序性死亡方式。研究发现，焦亡以及焦亡蛋白和多种疾病相关。焦亡过程中会释放大量胞内因子包括高迁移率蛋白(HMGB1)、乳酸脱氢酶(LDH)、钙网蛋白(CRT)、IL-1β等，因而焦亡的过程也可以定义成继发性死亡过程。
肿瘤细胞的焦亡在引起炎症的同时，释放的免疫原性相关分子，能提高树突状细胞(dendritic cells,DC)对肿瘤的识别及其抗原提呈能力，DC能激活毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对肿瘤特异性的杀伤，并降低胞内ATP的水平。
然而，目前在肿瘤细胞的焦亡研究中，仍然存在一些难以克服的难点。焦亡蛋白的N结构域必须要在细胞内才能发挥作用，而现有的技术中难以保证焦亡蛋白的入胞效率。此外，如何使有活性焦亡蛋白的高特异性地靶向肿瘤细胞，或如何使焦亡蛋白高特异性地在肿瘤微环境中被激活，也是本领域亟待解决的问题。
因此，本领域迫切需要开发一种能够使焦亡蛋白高特异性地在肿瘤微环境中被激活，并且高效进入肿瘤细胞的技术手段。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够使焦亡蛋白高特异性地在肿瘤微环境中被激活，并且高效进入肿瘤细胞的技术手段。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构：
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4 (式I)
式中，
Z0为任选的标签元件；
Z1为焦亡蛋白的N结构域元件；
Z2为穿膜肽序列元件；
Z3为能够被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶特异性切割的肽序列元件；
Z4为焦亡蛋白的C结构域元件；
“-”表示连接上述元件的肽键；
其中，在融合蛋白中，所述Z4元件通过特异性地结合Z1元件来抑制Z1元件的活性。
在另一优选例中，所述Z0元件中，所述标签选自下组：His标签、GST标签、HA标签、c-Myc标签、Flag标签，或其组合。
在另一优选例中，所述焦亡蛋白具有诱导细胞膜破裂并释放大量内含物引起机体炎症反应的功能。
在另一优选例中，所述焦亡蛋白选自人源焦亡蛋白或鼠源焦亡蛋白。
在另一优选例中，所述人源焦亡蛋白选自下组：GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5(GSDME)、DFNB59(GSDMF)，或其组合。
在另一优选例中，所述鼠源焦亡蛋白选自下组：GSDMA1、GSDMA2、GSDMA3、GSDMC1、GSDMC2、GSDMC3、GSDMC4，或其组合。
在另一优选例中，所述焦亡蛋白为GSDMA3。
在另一优选例中，所述Z1中，所述N结构域为具有在细胞膜上形成孔洞的活性蛋白结构域。
在另一优选例中，所述Z1中，所述N结构域的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:1所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:1的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Z2中，所述穿膜肽具有携带不同成分穿过细胞膜的功能。
在另一优选例中，所述Z2中，所述穿膜肽选自下组：阳离子细胞穿膜肽(如TAT)、疏水性细胞穿膜肽、两亲性细胞穿膜肽。
在另一优选例中，所述Z2中，所述穿膜肽为TAT。
在另一优选例中，所述Z2中，所述穿膜肽的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:3所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:3的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Z3中，所述肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶选自下组：天冬酰胺内肽酶(Legumain)、基质金属蛋白酶，或其组合。
在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶选自下组：MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12，或其组合。
在另一优选例中，所述Z3中，所述肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶为天冬酰胺内肽酶。
在另一优选例中，所述Z3中，所述肽序列选自:Legumain特异性识别并切割的底物肽序列PTN。
在另一优选例中，所述Z3中，所述肽序列的氨基酸序列选自下组：
(i)序列PTN；
(ii)在序列PTN的基础上，进行N端或C端一个或多个氨基酸残基的插入，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Z4中，所述N结构域的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO:2所示的序列；
(ii)在SEQ ID NO:2的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:5所示。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体中含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体选自下组：pET载体、pMAL载体、pGEX载体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：pET28a、pMAL-2c、pGEX-4T-2，或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有如本发明第三方面所述的载体，或基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BL21(DE3)、Rosetta、Origami，或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种生产如本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出如本发明第一方面所述的融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，包括：
(a)如本发明第一方面所述的融合蛋白或其编码基因；
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组分(a)的含量为0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态组合物。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物可单独使用，或与其他抗肿瘤药物联合使用。
在本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的融合蛋白、如本发明第二方面所述的多核苷酸、如本发明第三方面所述的载体和如本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于选自下组的一种或多种：
(a)杀死肿瘤微环境中的肿瘤细胞；
(b)提高肿瘤微环境中的M1型巨噬细胞的数量，并降低肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的数量；
(c)提高肿瘤微环境中的抗癌细胞因子、抗原提呈分子、效应T细胞、免疫原性细胞死亡(ICD)相关特征分子(如ATP、HMGB1、CRT)、LDH等促炎因子的水平；
(d)降低肿瘤增殖转移相关蛋白、促癌细胞因子的表达水平。
在另一优选例中所述免疫原性细胞死亡(ICD)相关特征分子选自下组：ATP、HMGB1、CRT，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢肿瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为4T1细胞或CT26结肠癌细胞。
在另一优选例中，所述抗癌细胞因子选自下组：TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ，或其组合。
在另一优选例中，所述抗原提呈分子为MHC I类分子或MHC II类分子。
在另一优选例中，所述效应T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+&GranzymeB+T细胞、CD8+&IFN-γ+T细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤增殖转移相关蛋白为MR或Legumain。
在另一优选例中，所述促癌细胞因子为TGF-β。
在本发明的第八方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：向有所需要的对象施用如本发明第一方面所述的融合蛋白、如本发明第二方面所述的多核苷酸、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组焦亡蛋白的FPLC脱盐柱及分子筛纯化图。
其中，(A-C)依次为GSDMA3、GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN经过脱盐柱的FPLC色谱图；(D-E)依次为GSDMA3、GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN经过分子筛纯化的FPLC色谱图。
图2显示了重组蛋白表征图。
其中，泳道M为Marker；泳道1-3、泳道4-6、泳道7-9依次为GSDMA3-TAT-PTN、GSDMA3-PTN、GSDMA3经过Superdex 75纯化后三个吸收峰的蛋白样品。
图3显示了体外培养的细胞系表达Legumain酶的水平。
图4显示了融合焦亡蛋白体外Legumain酶切实验。
其中，泳道M是Marker；泳道1是Legumain酶切后的GSDMA3-TAT-PTN；泳道2和3是Legumain酶切后的GSDMA3-PTN；泳道4是Legumain酶切后的GSDMA3。
图5显示了细胞摄取实验的结果。
其中，(A)显示了流式细胞仪检测酶切后焦亡蛋白的摄取结果；(B)显示了摄取结果的统计分析结果。
图6显示了焦亡蛋白的毒性实验结果。
其中，(A)显示了焦亡蛋白对4T1细胞的杀伤作用；(B)显示了焦亡蛋白对DC2.4细胞的杀伤作用。
图7显示了重组蛋白处理后的细胞形态变化情况。
其中，(A-D)依次为PBS、GSDMA3、GSDMA3-PTN、GSDMA3-TAT-PTN给药处理组的细胞的明场拍摄结果。
图8显示了焦亡蛋白介导肿瘤细胞免疫原性死亡中引起CRT外翻实验结果。
其中，(A-D)依次为PBS、GSDMA3、酶切后的GSDMA3-PTN、酶切后的GSDMA3-TAT-PTN处理肿瘤细胞的结果；(E)显示了CRT的统计分析。
图9(A)显示了HMGB1的释放量；(B)显示了释放到胞外的ATP的含量。
图10显示了DC的体外致敏实验结果。
其中，(A)显示了焦亡蛋白处理后CD80+的DC细胞量；(B)显示了焦亡蛋白处理后CD86+的DC细胞量；(C)显示了焦亡蛋白处理后CD80+/CD86+双阳性的DC细胞量。
图11显示了焦亡蛋白对抗原呈递的作用。
图12显示了重组焦亡蛋白在鼠源4T1乳腺癌原位瘤上的药效实验结果。
其中，(A)为肿瘤体积变化图；(B)为药效流程图；(C)为小鼠体重变化曲线图；(D)显示了实验终点肿瘤的重量图；(E)显示了实验终点时各治疗组的抑瘤率；(F)为实验终点剖出的肿瘤照片(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001)。
图13显示了脾脏中T细胞及其颗粒酶的示意图。
其中，(A-C)显示了以PBS组脾脏为例，流式画门的示意图；(D-G)依次显示了PBS组、GSDMA3组、GSDMA3-PTN组和GSDMA3-TAT-PTN组的CD8+T细胞的颗粒酶分泌量的变化情况。
图14显示了各治疗组的脾脏中T细胞及其其分泌的因子的变化情况。
其中，(A)显示了脾脏中CD4+T细胞量的变化情况；(B)显示了脾脏中CD8+T细胞量的变化情况；(C)显示了治疗后各组脾脏中CD8+&GranzymeB+T细胞的变化情况；(D)显示了治疗后各组脾脏中CD8+&IFN-γ+T细胞的变化情况。
图15显示了药物治疗后肿瘤内T细胞及其分泌的因子的变化情况。
其中，(A)显示了肿瘤组织中CD4+T细胞量的变化情况；(B)显示了肿瘤组织中CD8+T细胞量的变化情况；(C)显示了治疗后各组肿瘤肿瘤中CD8+&Granzyme+T细胞的变化情况；(D)显示了治疗后各组肿瘤组织中CD8+&IFN-γ+T细胞的变化情况。
图16显示了药物治疗后肿瘤内T细胞及其其分泌的因子的变化情况。
其中，(A)显示了淋巴结中CD4+T细胞量的变化情况；(B)显示了淋巴结中CD8+T细胞量的变化情况；(C)显示了治疗后各组淋巴结中CD8+&Granzyme+T细胞的变化情况；(D)显示了治疗后各组淋巴结中CD8+&IFN-γ+T细胞的变化情况。
图17显示了给药治疗后肿瘤内巨噬细胞及NK细胞的变化。
其中，(A-B)显示了M1型巨噬细胞的变化；(C-D)显示了M2型巨噬细胞的变化；(E-F)显示了NK细胞的变化。其中(A、D、E)均是以GSDMA3-TAT-PTN治疗组的肿瘤细胞为例。
图18显示了不同治疗组肿瘤组织中相关蛋白表达量的变化情况。
图19显示了肿瘤组织中细胞因子的变化。
其中，A-B依次表示实验终点肿瘤组织中IL-2和TGF-β的变化情况。
图20显示了主要脏器的重量改变。
图21显示了主要脏器的病理切片。
其中，标尺为100μm。
图22显示了实验终点小鼠的肝功能和肾功能的检测结果。
其中，(A-C)分别表示肝功能相关的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素含量的变化；(D-F)分别表示和肾功能相关的血清尿素、血清肌酐和血清尿酸的含量变化。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种重组焦亡蛋白递药系统。
本发明人以细胞焦亡作用及焦亡蛋白Gasdermin A3(GSDMA3)为研究对象，采用基因工程技术对其进行了结构改造，在焦亡蛋白两个结构域之间引入Legumain底物肽序列PTN。并且，选用富含精氨酸的阳离子穿膜肽TAT(RKKRRQRRR)，将其构建在PTN序列相邻位置并靠近焦亡蛋白N端一侧(N-GSDMA3-TAT-PTN-GSDMA3-C，或记为记为GSDMA3-TAT-PTN)。实验结果表明，本发明中的GSDMA3-TAT-PTN蛋白在体内外实验中表现出非常好的抗肿瘤活性。
在此基础上完成了本发明。
本发明融合蛋白及其编码序列
如本文所用，术语“本发明融合蛋白”、“重组焦亡蛋白”、“融合焦亡蛋白”可互换使用，是指本发明第一方面所述的融合蛋白，其具有诱导细胞膜破裂并释放大量内含物引起机体炎症反应的功能。
在本发明中，提供的融合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构：
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4 (式I)
式中，
Z0为任选的标签元件；Z1为焦亡蛋白的N结构域元件；Z2为穿膜肽序列元件；Z3为能够被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶特异性切割的肽序列元件；Z4为焦亡蛋白的C结构域元件；“-”表示连接上述元件的肽键；
其中，在融合蛋白中，所述Z4元件通过特异性地结合Z1元件来抑制Z1元件的活性。
在本发明中，所述的焦亡蛋白可选自人源焦亡蛋白(例如GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5(GSDME)、DFNB59(GSDMF)等)或鼠源焦亡蛋白(例如GSDMA1、GSDMA2、GSDMA3、GSDMC1、GSDMC2、GSDMC3、GSDMC4等)。
在一个优选的实施方式中，所述焦亡蛋白为GSDMA3。
在本发明的融合蛋白中，所述Z1中，所述N结构域为具有在细胞膜上形成孔洞的活性蛋白结构域；所述Z2中，所述穿膜肽具有携带不同成分穿过细胞膜的功能。
优选地，所述Z2中，所述穿膜肽选自下组：阳离子细胞穿膜肽(如TAT)、疏水性细胞穿膜肽、两亲性细胞穿膜肽。在一个优选的实施方式中，所述穿膜肽为TAT。
在本发明的融合蛋白中，所述Z3中，所述肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶选自下组：天冬酰胺内肽酶(Legumain)、基质金属蛋白酶(例如MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12等)，或其组合。
在一个优选的实施方式中，所述Z3中，所述肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶为天冬酰胺内肽酶。
优选地，所述Z3中，所述肽序列选自：Legumain特异性识别并切割的底物肽序列PTN。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因是鼠源的，但是来源于其它类似的物种(尤其是哺乳动物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:5所示)具有一定同源性(保守性)的重组焦亡蛋白的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它物种(尤其是哺乳动物)中分离得到该序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码融合蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO:5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
编码融合蛋白的多核苷酸包括:只编码融合蛋白的编码序列；融合蛋白的编码序列和各种附加编码序列；融合蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码融合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明融合蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明融合蛋白序列中。
本发明涉及一种用于抗肿瘤递药系统的重组焦亡蛋白融合蛋白，在本发明的一个优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明的多肽能够有效诱导细胞膜破裂并释放大量内含物引起机体炎症反应。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO:4所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指：“有效诱导细胞膜破裂并释放大量内含物引起机体炎症反应”。
本发明的融合蛋白可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的融合蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的融合蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有本发明融合蛋白的活性的其他多肽片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的融合蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明中，所述的融合蛋白变体是如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-10个，较佳地1-8个，更佳地1-4个，最佳地1-2个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或N末端添加一个或数个(如1-3个)氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
表1
本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:4差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
药物组合物及其施用方法
本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：如本发明第一方面所述的融合蛋白或其编码基因。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的主要优点包括：
1)本发明使用基因工程技术对焦亡蛋白进行改造，可实现焦亡蛋白多功能递药，在焦亡蛋白里引入穿膜肽序列，赋予了焦亡蛋白入胞能力，从而发挥焦亡作用。
2)本发明将焦亡蛋白应用于诱导免疫原性细胞死亡(ICD)及肿瘤免疫治疗。
3)本发明使用Legumain-PTN等肿瘤相关酶作为激活焦亡蛋白的响应式设计，具有较广泛的应用范围，并提高了肿瘤杀伤作用的选择性，降低其毒副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
方法
利用基因工程技术对原核表达质粒pET28a-GSDMA3为模板进行亚克隆构建，将部分氨基酸序列替换成Legumain特异性酶切的底物肽序列PTN，并融入细胞穿膜肽序列TAT。构建成pET28a-PTN-GSDMA3、pET28a-PTN-TAT-GSDMA3质粒。重组的质粒在体外进行转化、并在大肠杆菌中实现高效表达，利用蛋白的His-tag标签进行初步纯化，然后通过分子筛进一步纯化，最后得到重组蛋白。
重组焦亡蛋白质粒的构建
以pET28a-GSDMA3为模板进行亚克隆构建，构建成pET28a-PTN-GSDMA3、pET28a-PTN-TAT-GSDMA3质粒。
重组融合蛋白的表达及纯化
将质粒转入感受态细胞进行培养，然后扩大培养并诱导蛋白表达，将得到的蛋白进行纯化，首先利用蛋白自带的His-tag进行Ni结合柱纯化，使用
purifier 10(FPLC)将初步纯化的蛋白进行分子筛(Superdex 75)纯化，采用SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。
细胞水平实验
使用FITC染料标记蛋白，然后使用体外制备的Legumain酶切介质进行重组蛋白的酶切，将酶切后的重组蛋白进行细胞摄取实验。检测酶切后的重组蛋白对肿瘤细胞的杀伤能力并使用显微镜进行观察。检测重组蛋白引起细胞焦亡的过程中释放的ICD相关分子(包括CRT和HMGB1等)的量变化。观察重组蛋白对DC的致敏及提呈的影响。
动物水平实验
构建4T1乳腺癌皮下瘤原位模型，当肿瘤体积达到约40mm3时，使用重组焦亡蛋白进行治疗，进行药效学研究，并在实验终点的时进行摘眼球取血(用于肝功能和肾功能检测)，然后将小鼠进行安乐死，解剖取出老鼠的肿瘤以及脏器(心、肝、脾、肺、肾)。对它们进行称重并拍照，一部分肿瘤浸泡于4％多聚甲醛中固定用于后续的切片实验和生物安全性(病理切片等)检测实验；另一部分用于研究脾脏、淋巴结、肿瘤组织中体内T细胞及分泌的因子的变化情况，并检测肿瘤组织巨噬细胞、NK细胞的变化情况。采用WB检测给药治疗后肿瘤组织中的legumain、MR、TGF-β、TNF-α变化，使用ELISA试剂盒检测给药治疗后各组肿瘤组织中的细胞因子(TGF-β、TNF-α)的变化情况。
实施例1：FPLC的纯化结果
将经过镍柱初步纯化的蛋白(GSDMA3、GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN)，依次经过脱盐柱(HiTrap Desalting)(图1A-C)和凝胶排阻层析柱(Superdex 75)(图1D-F)进行纯化。三个蛋白的峰形和出峰位置基本是一致的，这初步表明本实验通过基因工程改造的蛋白并没有影响它的结构和功能。
实施例2：融合蛋白的纯化鉴定
将Superdex 75的前三个吸收峰的蛋白样品制样，进行SDS-PAGE电泳进行验证，结果如图2所示。泳道1-9分别是GSDMA3-TAT-PTN、GSDMA3-PTN和GSDMA3的三个吸收峰的蛋白。GSDMA3的条带符合理论分子量约为55kDa(泳道7)；GSDMA3-PTN的条带(泳道4)基本和GSDMA3的条带基本保持同一水平上，这表明两者分子量接近和理论一致；重组蛋白GSDMA3-TAT-PTN条带(泳道1)有明显上移；而其他泳道都存在着杂带，这表明：第一个吸收峰的蛋白纯度较好，而其他两个吸收峰都存在着大量杂蛋白，所以后续实验使用的都是第一个吸收峰的蛋白。
实施例3：WB检测细胞Legumain的表达水平
利用Western Blot检测诱导成M2型巨噬细胞的RAW 264.7以及4T1细胞的Legumain表达水平。如图3所示，Legumain在肿瘤相关的巨噬细胞中高表达，本研究在体外培养4T1细胞发现确实低表达Legumain酶。
实施例4：融合焦亡蛋白体外Legumain酶切实验
图4依次展示的是GSDMA3-TAT-PTN、GSDMA3-PTN和GSDMA3被酶切的结果。底物肽PTN被Legumain酶切开后，释放重组焦亡蛋白的N-domain和C-domain，GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN蛋白产生的片段大小近似，所以条带位置接近，结果显示重组蛋白能被Legumain酶切割。
实施例5：细胞摄取
将标记了FITC的重组蛋白事先经Legumain酶切割激活后再进行4T1细胞的摄取实验。实验结果如图5所示，酶切后的GSDMA3-TAT-PTN的摄取效果最佳。其中GSDMA3、酶切后的GSDMA3-TAT-PTN和GSDMA3-PTN的平均荧光强度值分别约为51.8、109和67.4，GSDMA3-TAT-PTN的摄取效率是GSDMA3-PTN的1.6倍，是GSDMA3的2.1倍。这表明GSDMA3-TAT-PTN经过Legumain酶切割激活后产生的活性片段，在穿膜肽TAT作用下具有较高的入胞效率。
实施例6：细胞毒性实验
采用4T1和DC2.4细胞检测焦亡蛋白的毒性。对于4T1细胞：在实验浓度范围内随着蛋白浓度的增加，细胞的存活率下降，其中酶切后的重组蛋白GSDMA3-TAT-PTN杀伤4T1肿瘤细胞的效果明显好于其他两组(图6A)。所有的焦亡蛋白在测试浓度范围内对于DC2.4细胞基本没有杀伤作用(图6B)，具有较好的生物相容性，所以焦亡蛋白不会影响抗原提呈细胞的功能。
实施例7：明场显微镜观察(Bright field imaging)
使用三组焦亡蛋白处理4T1细胞48h后如图7所示：正常的4T1细胞会成片生长成网状(图7A)；GSDMA3和酶切后的GSDMA3-PTN处理细胞后，形态发生变化，也有大量的细胞正在吸水肿胀(图7B和7C)，这与它们的细胞杀伤效果是和摄取实验结果相一致。酶切后的GSDMA3-TAT-PTN处理细胞后大量的细胞已经死亡，在清洗的过程中已经被洗去，剩余被固定的细胞中也可以看到大量吸水胀破的细胞，基本没有完整的细胞存在(图7D)。
实施例8：钙网蛋白(CRT)测定实验
如图8显示的是胞外CRT量的变化，对照组肿瘤细胞会有左边阴性峰和右边阳性峰(图8A)，用焦亡蛋白处理4T1细胞后，所有组的阳性峰均明显上升，其中酶切后的GSDMA3-TAT-PTN处理的细胞的阴性峰明显下降、阳性峰显著升高(图8B、8C和8D)。酶切后的GSDMA3-TAT-PTN和GSDMA3-PTN以及GSDMA3的平均荧光强度分别是：132、87和80.7，GSDMA3-TAT-PTN的强度分别是后两者的1.5倍和1.6倍。
实施例9：HMGB1的迁移及胞外ATP释放实验
如图9所示，GSDMA3和GSDMA3-PTN给药组，能提高HMGB1的释放量，但和PBS组没有显著性差异。而GSDMA3-TAT-PTN给药组则能大幅度提高HMGB1的释放量，它的HMGB1释放的浓度分别是GSDMA3组和GSDMA3-PTN组的1.9倍和2.4倍，具有显著性差异。所有实验组的胞外ATP含量都显著性增加，其中GSDMA3-TAT-PTN处理组的胞外ATP含量和其他处理组相比均有显著性差异，表明ATP从细胞内释放到细胞外，认为是通过焦亡蛋白形成的孔洞释放到胞外或者是焦亡激活的膜通道释放到胞外。
实施例10：树突状细胞体外致敏实验
如图10所示，焦亡蛋白处理BMDC后，CD80+和CD86+的DC细胞量基本保持上升趋势，但各组间CD80+DC细胞量没有显著性差异(图10A)，各蛋白处理组的CD86+DC细胞量能达到阳性对照组的水平(图10B)，而蛋白处理组CD80+/CD86+双阳性的DC数量也能达到阳性对照组的水平，其中GSDMA3-TAT-PTN处理过的DC细胞双阳量最高(图10C)。
实施例11：重组焦亡蛋白对抗原提呈的作用
如图11所示，和PBS组相比，所有的蛋白处理组均能提高MHC-I类分子的表达强度(图11A)，其中GSDMA3和GSDMA3-TAT-PTN处理DC后的量约是PBS组的两倍，形成了显著性差异。GSDMA3处理组MHC-II类分子的量比PBS组略微下降，但没有显著性差异(图11B)。而GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN处理组均能显著增加MHC-II的量，其中GSDMA3-TAT-PTN处理组增强的效果最佳。
实施例12：重组焦亡蛋白在皮下移植瘤模型上的药效学研究
药效学结果如图12所示：其中图12B为流程图。各治疗组的瘤体积均增加，但焦亡蛋白治疗组均能减缓增长趋势(图12A)，在实验终点三组的抑瘤率分别能达到21％、34％和62％(图12E)，其中GSDMA3-TAT-PTN治疗组和对照组形成显著差异。蛋白治疗期间小鼠体重变化不大(图12C)，表明无明显毒副作用。图12D和12F是在实验终点(第31天)解剖出肿瘤后并称重拍照，发现焦亡蛋白治疗组的肿瘤都有所减小，其中GSDMA3-TAT-PTN组肿瘤最小，和其它组相比有显著性差异。
实施例13：给药治疗后体内T细胞及其分泌的细胞因子的变化
13.1脾脏
图13(A-D)以PBS治疗组的小鼠脾脏细胞为例，显示整个流式圈门的示意图。图(13E-F)依次为GSDMA3、GSDMA3-PTN、GSDMA3-TAT-PTN治疗小鼠后脾脏中分泌的颗粒酶量的变化情况。肿瘤和淋巴结的颗粒酶及其干扰素的分泌实验结果也参照此部分进行分析。
图14是脾脏中T细胞、颗粒酶及干扰素的统计学结果。给药治疗后各组CD4+T细胞量都没有显著性变化(图14A和14B)，GSDMA3-TAT-PTN治疗组CD8+T细胞数最多并且分泌的颗粒酶和干扰素也是最多的(图14B、14C和14D)，这表明本实验采用GSDMA3-TAT-PTN治疗荷瘤小鼠后能有效激活脾脏中的T细胞并释放大量细胞因子对肿瘤进行杀伤。
13.2肿瘤
实验终点肿瘤组织中T细胞及其分泌的因子变化情况如图15所示，蛋白药物治疗后各组CD4+T细胞和CD8+T细胞都没有显著性变化(图15A和15B)。但GSDMA3-TAT-PTN治疗组的小鼠肿瘤CD8+T细胞中颗粒酶B的表达量显著性上升，而另外几个治疗组则没有明显变化(图15C)，这表明本研究构建的GSDMA3-TAT-PTN具有非常好的肿瘤杀伤作用。所有焦亡蛋白治疗过的肿瘤的CD8+T细胞分泌的干扰素都有明显增加，均和PBS组形成显著性对比，其中GSDMA3-TAT-PTN分泌的量最多(图15D)。
13.3淋巴结
如图16展示的肿瘤周边部位腋下淋巴结中T细胞、颗粒酶及干扰素的统计学结果。GSDMA3-TAT-PTN治疗组和其他组相比CD4+T并没有显著性变化，但是GSDMA3和GSDMA3-PTN治疗组的CD4+T细胞和PBS组相比显著性减少(图16A)；而所有的蛋白治疗组的CD8+T细胞和PBS组相比均有显著性增加(图16B)。所有焦亡蛋白治疗组的CD8+T细胞中颗粒酶B和干扰素表达量都增加，其中GSDMA3-TAT-PTN治疗组的表达量显著性上升(图16C和16D)。
实施例14：肿瘤中巨噬细胞和NK细胞的变化
14.1巨噬细胞
如图17A和17B所示：所有蛋白治疗组的M1型巨噬细胞均有所增加，其中GSDMA3-TAT-PTN组肿瘤的M1型巨噬细胞显著性提高。所有蛋白治疗组和PBS组相比均下调M2型巨噬细胞(图17C和17D)，其中GSDMA3-PTN和GSDMA3-TAT-PTN治疗组的M2型巨噬细胞显著性下降。
14.2 NK细胞
图17(E-F)表明：GSDMA3-TAT-PTN治疗组的肿瘤组织中NK细胞显著增加，而其他几组则没有明显变化。
实施例15：各组肿瘤组织中的legumain、MR、TGF-β、TNF-α的变化情况
如图18所示，使用WB结果分析实验终点时肿瘤组织中相关蛋白的表达情况，GSDMA3-TAT-PTN治疗后瘤内促炎因子(TNF-α)显著上升，同时利于肿瘤增殖转移的相关蛋白(MR、Legumain)、因子(TGF-β)的表达水平均显著下降。这表明本研究构建的重组蛋白有非常好的抗肿瘤效果。
实施例16：肿瘤组织中细胞因子的变化
使用ELISA试剂盒检实验终点时各组肿瘤组织中的细胞因子的分泌情况，如图19所示。发现各治疗组促癌细胞细胞因子(TGF-β)分泌下降，结合图18的结果分析：GSDMA3-TAT-PTN治疗组它能增强机体免疫和细胞杀伤并减低肿瘤的转移，有着良好的抗肿瘤效果。
实施例17：生物安全性评价
17.1脏器系数
将实验终点的老鼠的主要脏器(心、肝、肺、肾、脾)取出称重，如图20所示，荷载有4T1乳腺癌的小鼠有明显的脾脏肿大的现象，而GSDMA3-TAT-PTN治疗组在治疗终点时小鼠的脾脏较PBS组小，各组的其他脏器并没有明显区别。
17.2病理切片
将实验终点的老鼠的主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)进行病理分析，如图21所示。发现GSDMA3治疗组肺泡变形，其他组肺泡形状正常，无明显细胞脱落；而各组其他脏器均无明显病变，表明重组蛋白的生物安全较好，对脏器无明显损伤。
17.3生化指标
在实验终点取血检测肝功能和肾功能，结果如图22所示：GSDMA3-TAT-PTN治疗组的AST和另外两组相比显著性下降，但和PBS组相比并无显著性差异，结合AST在急慢性肝炎和中毒性肝炎中的表达会增加的情况来分析，GSDMA3-TAT-PTN治疗后并不会导致肝损伤。各组的其他指标均无显著性变化，这表明使用焦亡蛋白治疗后并没有引起肝脏和肾脏的损伤和炎症。
讨论：
焦亡蛋白在未被切割激活的情况下不显毒性作用，一旦被切割激活将释放毒性末端，导致细胞膜穿孔、内含物释放、引起炎性反应，从而介导细胞死亡即焦亡，所以它是一类具有前景的生物大分子前药，但它是胞内作用蛋白，必须要克服细胞膜屏障进入胞浆内发挥作用，而且焦亡蛋白的作用缺乏细胞特异性，易造成毒副作用。
本发明人在设计重组焦亡蛋白递药系统时，考虑到肿瘤微环境(TME)内Legumain高表达的特征，选择了靶向TME激活的递药策略，通过基因工程重组技术，制备具有TME响应激活功能的焦亡蛋白，以增强肿瘤部位蛋白的作用并降低正常组织的毒副作用。
本发明利用TME中特异性高表达的蛋白酶Legumain酶，通过在焦亡蛋白两个结构域之间引入Legumain底物肽序列PTN来实现肿瘤酶激活的焦亡蛋白介导抗肿瘤作用。
在本发明中，选用了焦亡蛋白家族的GSDMA3进行研究，它的N-domain是活性结构域，能够引起细胞焦亡。本研究采用基因工程技术将PTN插入至GSDMA3的C-domain和N-domain之间的linker序列，使它能在TME中被切割，释放出活性N-domain。但蛋白本身的入胞效率不高，而N-domain需要进入细胞内发挥作用，于是本研究在N-domain与PTN之间引入了一段穿膜肽序列，通过穿膜肽促进入胞发挥作用。入胞后的N-domain在细胞膜上形成孔洞，导致细胞死亡，同时胞内ATP、HMGB1、LDH、IL-1β、钙网蛋白等大量释放到胞外，激活免疫细胞，抑制肿瘤的增殖。
本发明提供的GSDMA3-TAT-PTN蛋白在体内外实验中表现出非常好的抗肿瘤活性，这表明利用肿瘤酶激活及融合穿膜肽的焦亡蛋白递药策略这一设计的有效性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 肿瘤酶响应型重组焦亡蛋白递药系统及其抗肿瘤用途
<130> P2019-0604
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Pro Val Phe Glu Asp Val Thr Arg Ala Leu Val Arg Glu Leu Asn
1 5 10 15
Pro Arg Gly Asp Leu Thr Pro Leu Asp Ser Leu Ile Asp Phe Lys His
20 25 30
Phe Arg Pro Phe Cys Leu Val Leu Arg Lys Arg Lys Ser Thr Leu Phe
35 40 45
Trp Gly Ala Arg Tyr Val Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Leu Asp Leu Leu
50 55 60
Glu Pro Gly Ser Ser Pro Ser Asp Leu Thr Asp Ser Gly Asn Phe Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asn Met Leu Asp Val Gln Val Gln Gly Leu Val Glu Val Pro
85 90 95
Lys Thr Val Lys Val Lys Gly Thr Ala Gly Leu Ser Gln Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Glu Val Gln Thr Leu Ser Val Ala Pro Ser Ala Leu Glu Asn Leu
115 120 125
Lys Lys Glu Arg Lys Leu Ser Ala Asp His Ser Phe Leu Asn Glu Met
130 135 140
Arg Tyr His Glu Lys Asn Leu Tyr Val Val Met Glu Ala Val Glu Ala
145 150 155 160
Lys Gln Glu Val Thr Val Glu Gln Thr Gly Asn Ala Asn Ala Ile Phe
165 170 175
Ser Leu Pro Ser Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Asn Asn
180 185 190
Asn Lys Ala Val Thr Ile Pro Lys Gly Cys Val Leu Ala Tyr Arg Val
195 200 205
Arg Leu Leu Arg Val Phe Leu Phe Asn Leu Trp Asp Ile Pro Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Asp Ser Met Gln Thr Phe Pro Lys Ile Arg Arg Val Pro Cys
225 230 235 240
Ser Ala Phe Ile Ser Pro Thr Gln Met Ile Ser Glu Glu Pro Glu Glu
245 250 255
Glu Lys Leu Ile Gly
260
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Arg Glu Thr Gln Glu Val Glu Lys Leu Ser Pro Val Gly
1 5 10 15
Arg Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Ser His Leu Leu Gly Lys Lys Lys
20 25 30
Glu Leu Gln Asp Leu Glu Gln Lys Leu Glu Gly Ala Leu Asp Lys Gly
35 40 45
Gln Lys Val Thr Leu Glu Ala Leu Pro Lys Asp Val Leu Leu Ser Lys
50 55 60
Asp Ala Met Asp Ala Ile Leu Tyr Phe Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Leu Lys Ile Leu Val Lys Ser Leu Glu Lys Lys Ile
85 90 95
Leu Pro Val Gln Leu Lys Leu Val Glu Ser Thr Leu Glu Gln Asn Phe
100 105 110
Leu Gln Asp Lys Glu Gly Val Phe Pro Leu Gln Pro Asp Leu Leu Ser
115 120 125
Ser Leu Gly Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Glu Ala Leu Val Gly Leu
130 135 140
Ser Gly Leu Glu Val Gln Arg Ser Gly Pro Gln Tyr Ala Trp Asp Pro
145 150 155 160
Asp Thr Arg His Asn Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Gly Leu Ser Leu Leu
165 170 175
His Leu Leu Ser Arg Lys Ser Asn Ala Leu Thr Tyr Cys Ala Leu Ser
180 185 190
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 4
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Met Pro Val Phe Glu Asp Val Thr Arg Ala Leu Val Arg Glu Leu Asn
1 5 10 15
Pro Arg Gly Asp Leu Thr Pro Leu Asp Ser Leu Ile Asp Phe Lys His
20 25 30
Phe Arg Pro Phe Cys Leu Val Leu Arg Lys Arg Lys Ser Thr Leu Phe
35 40 45
Trp Gly Ala Arg Tyr Val Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Leu Asp Leu Leu
50 55 60
Glu Pro Gly Ser Ser Pro Ser Asp Leu Thr Asp Ser Gly Asn Phe Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asn Met Leu Asp Val Gln Val Gln Gly Leu Val Glu Val Pro
85 90 95
Lys Thr Val Lys Val Lys Gly Thr Ala Gly Leu Ser Gln Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Glu Val Gln Thr Leu Ser Val Ala Pro Ser Ala Leu Glu Asn Leu
115 120 125
Lys Lys Glu Arg Lys Leu Ser Ala Asp His Ser Phe Leu Asn Glu Met
130 135 140
Arg Tyr His Glu Lys Asn Leu Tyr Val Val Met Glu Ala Val Glu Ala
145 150 155 160
Lys Gln Glu Val Thr Val Glu Gln Thr Gly Asn Ala Asn Ala Ile Phe
165 170 175
Ser Leu Pro Ser Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Asn Asn
180 185 190
Asn Lys Ala Val Thr Ile Pro Lys Gly Cys Val Leu Ala Tyr Arg Val
195 200 205
Arg Leu Leu Arg Val Phe Leu Phe Asn Leu Trp Asp Ile Pro Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Asp Ser Met Gln Thr Phe Pro Lys Ile Arg Arg Val Pro Cys
225 230 235 240
Ser Ala Phe Ile Ser Pro Thr Gln Met Ile Ser Glu Glu Pro Glu Glu
245 250 255
Glu Lys Leu Ile Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr
260 265 270
Asn Glu Val Gln Arg Glu Thr Gln Glu Val Glu Lys Leu Ser Pro Val
275 280 285
Gly Arg Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Ser His Leu Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Lys Glu Leu Gln Asp Leu Glu Gln Lys Leu Glu Gly Ala Leu Asp Lys
305 310 315 320
Gly Gln Lys Val Thr Leu Glu Ala Leu Pro Lys Asp Val Leu Leu Ser
325 330 335
Lys Asp Ala Met Asp Ala Ile Leu Tyr Phe Leu Gly Ala Leu Thr Glu
340 345 350
Leu Thr Glu Glu Gln Leu Lys Ile Leu Val Lys Ser Leu Glu Lys Lys
355 360 365
Ile Leu Pro Val Gln Leu Lys Leu Val Glu Ser Thr Leu Glu Gln Asn
370 375 380
Phe Leu Gln Asp Lys Glu Gly Val Phe Pro Leu Gln Pro Asp Leu Leu
385 390 395 400
Ser Ser Leu Gly Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Glu Ala Leu Val Gly
405 410 415
Leu Ser Gly Leu Glu Val Gln Arg Ser Gly Pro Gln Tyr Ala Trp Asp
420 425 430
Pro Asp Thr Arg His Asn Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Gly Leu Ser Leu
435 440 445
Leu His Leu Leu Ser Arg Lys Ser Asn Ala Leu Thr Tyr Cys Ala Leu
450 455 460
Ser
465
<210> 5
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
atgcctgtgt ttgaggatgt cacccgggcc ctggttagag agctgaaccc tcgaggggat 60
ctgacacccc tagacagcct catcgacttc aaacactttc gtcccttctg cctggtgctg 120
aggaagagga agagcacatt gttctgggga gcccgctatg tgcgcaccga ctacactctc 180
ctggatttgc tggagccggg cagctccccc tcagatctga cagacagtgg caactttagc 240
tttaagaata tgctggatgt ccaagtacag ggacttgtgg aagtgccaaa gacagtgaag 300
gtaaagggga ctgcgggtct gtcacaaagc agcacactgg aggtgcagac actcagcgtg 360
gctccctcgg ctctggagaa cttgaagaag gagaggaaac tgtcagcaga ccactcgttc 420
ctgaacgaga tgaggtatca tgagaagaac ctgtatgtgg tgatggaggc agtagaagcc 480
aagcaggaag ttactgtgga gcaaactggc aacgcaaatg ccatcttctc tctccccagc 540
ttggctctac tgggactaca gggatccttg aacaacaaca aggctgtaac catccccaag 600
ggctgtgtcc tggcctatcg agtgagacta ctgagagtct ttttgttcaa tctttgggat 660
attccgtaca tttgcaatga cagcatgcaa accttcccta agatcaggcg tgtaccttgc 720
agtgccttca tatctcctac ccagatgata tctgaagagc cagaagaaga gaagctcatt 780
gggcgcaaaa aacgtcgtca gcgtcgccgt cctacaaatg aggttcagcg agagactcaa 840
gaagtggaga agttgagtcc agtgggtcga agctccctac tcacttccct cagccatctc 900
ctaggaaaga agaaagagct ccaggacctt gagcagaagc ttgaaggggc tttagacaag 960
ggtcagaaag tgaccctgga agcactcccc aaagatgtcc tgctgtcaaa ggacgctatg 1020
gatgccatcc tctacttcct cggggctctg acagagctaa ctgaagaaca actgaagatt 1080
ctagtaaaat ccttggagaa aaagatctta ccagtgcaac tgaagctggt tgaaagcacc 1140
ttggagcaga acttcctgca agataaagag ggtgttttcc ccctgcaacc tgatctgctc 1200
tcctccctcg gggaggagga actgacccta acggaagcac tggtgggact aagcggcctg 1260
gaagtccaga gatcaggccc ccagtacgcg tgggatccag acactcgcca caacctttgt 1320
gccctctatg ctggcctctc cctccttcac ctgctaagca ggaaatctaa tgcacttact 1380
tattgtgctc tatcttaa 1398
Claims (16)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构：
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4 (式I)
式中，
Z0为任选的标签元件；
Z1为焦亡蛋白的N结构域元件，所述N结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
Z2为穿膜肽序列元件，所述穿膜肽为TAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；
Z3为能够被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白酶特异性切割的肽序列元件，所述肽序列为天冬酰胺内肽酶（Legumain）特异性识别并切割的底物肽序列PTN；
Z4为焦亡蛋白的C结构域元件，所述C结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
“-”表示连接上述元件的肽键；
其中，在融合蛋白中，所述Z4元件通过特异性地结合Z1元件来抑制Z1元件的活性。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述焦亡蛋白具有诱导细胞膜破裂并释放大量内含物引起机体炎症反应的功能。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述焦亡蛋白为GSDMA3。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Z1中，所述N结构域为具有在细胞膜上形成孔洞的活性蛋白结构域。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Z2中，所述穿膜肽具有携带不同成分穿过细胞膜的功能。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述穿膜肽为阳离子细胞穿膜肽。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示。
8.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的融合蛋白。
9.如权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 5所示。
10.一种载体，其特征在于，所述载体中含有如权利要求8所述的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求10所述的载体，或基因组中整合有如权利要求8所述的多核苷酸。
12.一种生产如权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养如权利要求11所述的宿主细胞，从而表达出如权利要求1所述的融合蛋白。
13.一种药物组合物，其特征在于，包括：
（a）如权利要求1所述的融合蛋白或其编码基因；
（b）药学上可接受的载体。
14.一种如权利要求1所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求10所述的载体或如权利要求11所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于选自下组的一种或多种：
（a）杀死肿瘤微环境中的肿瘤细胞；
（b）提高肿瘤微环境中的M1型巨噬细胞的数量，并降低肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的数量；
（c）提高肿瘤微环境中的抗癌细胞因子、抗原提呈分子、效应T细胞、免疫原性细胞死亡（ICD）相关特征分子、促炎因子的水平；
（d）降低肿瘤增殖转移相关蛋白、促癌细胞因子的表达水平。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述免疫原性细胞死亡（ICD）相关特征分子包括ATP、HMGB1、CRT。
16.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述促炎因子包括LDH。
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