CN111909246B - 高效感染支持细胞的aav突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效感染支持细胞的AAV突变体。具体地，本发明提供了一种用于治疗听觉障碍疾病的基因表达载体，所述的表达载体为AAV突变体，其中，所述的AAV突变体中，插入有或携带有用于治疗听觉障碍疾病的治疗基因的表达盒；并且，所述的AAV突变体中，含有编码一种病毒衣壳蛋白突变体的基因序列。本发明所提供的AAV突变体在内耳的支持细胞中感染效率高、易生产、安全性好，并且靶向性高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效感染支持细胞的AAV突变体。
背景技术
内耳的耳蜗是我们的外周声音感知器官。耳蜗的听觉细胞在我们感知外周声音的过程中扮演着非常重要的角色，它把外界的声波信号转化为电生理信号，然后通过内耳螺旋神经节细胞逐步传递到大脑听觉中枢。
先天遗传性或者后天各种创伤引起的毛细胞死亡均可以引起不同程度的听力损伤，甚至终身性耳聋。根据世界卫生组织(WHO)的调查，0.3％的新生儿、5％的45岁以前的人群和50％的70岁以上的人群患有不同程度的听力损伤。听力损伤不仅仅影响听力本身，而且也能引起不同程度的社交障碍。
其中，遗传性耳聋是由于内耳中某些基因的突变所导致的。同时，内耳细胞的基因导入效率低下不仅影响了内耳基因功能的研究，而且阻碍了遗传性耳聋的基因治疗。
目前已知的导致耳聋的基因已经多达100多个。其中比例最高的是GJB2突变，约占遗传性耳聋的50％；其次是SLC26A4基因突变，约占遗传性耳聋的15％，这两个基因都是表达于支持细胞。Myo15A和OTOF基因则是表达于毛细胞，分别占遗传性耳聋的5～8％。
因此，筛选出可以高效转导进内耳细胞，尤其是内耳支持细胞的载体是非常重要的。
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)在人类基因治疗领域有着广阔的应用前景，由于其具有长时程的基因表达能力，且无致病性，在各种研究中被广泛应用于肝、肌、心、脑、眼、肾等组织。
然而，已经发现的能高效感染内耳细胞，尤其是内耳支持细胞的AAV载体还很少。
因此，本领域迫切需要开发一种易于获得的、能够高效感染支持细胞的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种易于获得的、能够高效感染支持细胞的方法。具体地，本发明的目的是提供一种能够高效感染内耳支持细胞的AAV突变体。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明提供的AAV突变体。
本发明的另一目的是提供本发明所述AAV突变体的用途，用于制备治疗听觉障碍疾病的制剂或药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种病毒衣壳蛋白突变体，所述的病毒衣壳蛋白突变体为非天然蛋白，并且所述病毒衣壳蛋白突变体相对于野生型病毒衣壳蛋白具有选自下组的一个或多个氨基酸突变：
第670位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，第251位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，和第534位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；
其中，所述的第670、251和534位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第670、251和534位。
在另一优选例中，所述病毒衣壳蛋白突变体具有促进AAV载体感染内耳支持细胞的活性。
在另一优选例中，所述的AAV载体为AAV-DJ载体。
在另一优选例中，所述的野生型病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述病毒衣壳蛋白突变体除所述突变(如670、251或534位氨基酸)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的病毒衣壳蛋白突变体仍具有促进AAV载体感染内耳支持细胞的活性。
在另一优选例中，所述病毒衣壳蛋白突变体的第670位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，且具有选自下组的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％的氨基酸序列；
其中，所述的第670位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第670位。
在另一优选例中，所述病毒衣壳蛋白突变体的第251位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，且具有选自下组的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％的氨基酸序列；
其中，所述的第251位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第251位。
在另一优选例中，所述病毒衣壳蛋白突变体的第534位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，且具有选自下组的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％的氨基酸序列；
其中，所述的第534位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第534位。
在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗听觉障碍疾病的基因表达载体，所述的表达载体为AAV突变体，其中，所述的AAV突变体中，插入有或携带有用于治疗听觉障碍疾病的治疗基因的表达盒；
并且，所述的AAV突变体中，含有编码如本发明第一方面所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列。
在另一优选例中，所述的AAV突变体为AAV-DJ突变体。
在另一优选例中，所述的AAV突变体中，含有编码如SEQ ID NO:2、3或4所示的氨基酸序列的基因序列。
在另一优选例中，所述的AAV突变体中，含有编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基因序列。
在另一优选例中，所述治疗基因包括：正常个体中表达的听力相关基因(即野生型的听力相关基因)，或用于基因编辑的相关基因。
在另一优选例中，所述用于基因编辑的相关基因包括：病毒衣壳蛋白突变体的编码基因和靶向特定位点的导向RNA(sgRNA)。
在另一优选例中，所述的听力相关基因是在内耳支持细胞中表达的基因。
在另一优选例中，所述的在内耳支持细胞中表达的基因选自下组：GJB2、SCL26A4、GJB3、Brn4等，或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，包括：
(i)如本发明第二方面所述的基因表达载体；
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70-99wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物是液态剂型的。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物是用于耳蜗内注射的注射剂。
在另一优选例中，所述的载体为注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物在治疗听觉障碍疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其他治疗听觉障碍疾病的药物联合使用。
在另一优选例中，所述的其他治疗听觉障碍疾病的药物包括：抗感染的抗生素类药物、神经营养因子类药物、离子通道调节剂类药物、维生素类药物等，或其组合。
在本发明的第四方面，提供了如本发明第二方面所述的基因表达载体的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于治疗听觉障碍疾病。
在另一优选例中，所述制剂或药物组合物用于治疗内耳支持细胞中发生基因突变所导致的听觉障碍疾病患者。
在另一优选例中，所述的听觉障碍疾病选自下组：遗传性耳聋、非遗传性耳聋，或其组合。
在另一优选例中，所述遗传性耳聋包括由选自下组的因素引起的耳聋：基因突变、基因缺失，或其组合。
在另一优选例中，所述非遗传性耳聋包括由选自下组的因素引起的耳聋：使用药物、外伤、感染、衰老，或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种治疗听觉障碍疾病的方法，给需要的对象施用如本发明第二方面所述的基因表达载体。
在另一优选例中，所述施用的方式为耳蜗内注射。
在另一优选例中，所述听觉障碍疾病的病因是表达于内耳支持细胞的听觉相关基因发生突变。
在另一优选例中，所述基因表达载体的使用剂量为1×1011-5×1012vg，较佳地为5×1011-4×1012vg，更佳地为1×1012-3×1012vg。
在本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第二方面所述的基因表达载体的方法，将用于治疗听觉障碍的治疗基因的表达盒连入AAV突变体，从而获得如本发明第二方面所述的基因表达载体。
在本发明的第七方面，提供了一种体外对听觉相关细胞进行转染的方法，包括步骤：用AAV突变体对所述听觉相关细胞进行转染；
其中，所述的AAV突变体中，含有编码如本发明第一方面所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列；
并且，所述的听觉相关细胞为内耳支持细胞。
在本发明的第八方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码如本发明第一方面所述的病毒衣壳蛋白突变体。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在本发明的第十方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第九方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述原核细胞包括：大肠杆菌。
在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞(如HEK293T细胞)，或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠支持细胞感染的筛选实验设计。
其中，分别包装AAV-DJ及其突变体(10种)的病毒，然后注射到P1 ICR小鼠的耳蜗中，2-3周后取材对支持细胞的感染情况进行荧光观察和表型分析。
图2显示了AAV-DJ及其突变体的体外感染HEK293T细胞效率分析。
其中，AAV-DJ及其突变体病毒分别在体外感染HEK293T细胞，48h后通过荧光显微镜观察tdTomato表达情况。AAV-DJ及其突变体病毒的滴度和用量如图所示。
图3显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗顶端部分支持细胞的感染结果。
AAV-DJ及其突变体病毒注射后，顶端部分支持细胞的代表性荧光图如图所示。P1ICR小鼠在病毒注射后3周取材。每只小鼠注射4×109vg AAV病毒。
图4显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗中间部分支持细胞的感染结果。
AAV-DJ及其突变体病毒注射后，中间部分支持细胞的代表性荧光图如图所示。P1ICR小鼠在病毒注射后3周取材。每只小鼠注射4×109vg AAV病毒。
图5显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗基底部分支持细胞的感染结果。
AAV-DJ及其突变体病毒注射后，基底部分支持细胞的代表性荧光图如图所示。P1ICR小鼠在病毒注射后3周取材。每只小鼠注射4×109vg AAV病毒。
图6显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗支持细胞的感染统计分析结果。
(A-C)通过统计随机100微米视野内顶端(A)、中间(B)和基底(C)部分支持细胞中mCherry+细胞比例来说明感染效率。AAV-DJ及其突变体病毒注射P1 ICR小鼠耳蜗后3周取材。每组小鼠注射4×109vg AAV病毒。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均数±标准差表示。*P<0.05，***P<0.001，不配对T检验。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种可以高效感染内耳支持细胞的AAV突变体。具体地，本发明人针对AAV-DJ的cap序列进行改造；其中，针对AAV-DJ中特异性酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸位点进行突变，研究其突变位点是否可以进一步提高支持细胞中的感染效率，并对大量的不同突变进行筛选。在实验中，分别包装表达tdTomato的突变体病毒并注射到小鼠的耳蜗中。注射后三周，对耳蜗(Apical、Middle、Basal)的细胞进行免疫荧光分析。实验结果表明，在支持细胞中，AAV-DJ的突变体(S670A)可以显著提高支持细胞的感染效率。在此基础上完成了本发明。
病毒衣壳蛋白突变体
在本发明中，提供了一种病毒衣壳蛋白突变体，所述的病毒衣壳蛋白突变体为非天然蛋白，并且所述病毒衣壳蛋白突变体在野生型病毒衣壳蛋白具有选自下组的一个或多个的氨基酸突变：
第670位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，第251位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，和第534位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；
其中，所述的第670、251和534位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第670、251和534位。
在本发明的一个实施方式中，所述的野生型病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述病毒衣壳蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中对应于所述野生型病毒衣壳蛋白序列发生了S670A的突变。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述病毒衣壳蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中对应于所述野生型病毒衣壳蛋白序列发生了T251A的突变。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述病毒衣壳蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中对应于所述野生型病毒衣壳蛋白序列发生了K534R的突变。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO:2、3或4所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指：“促进AAV载体感染内耳支持细胞的活性”。优选地，所述的AAV载体为AAV-DJ载体。
应理解，本发明病毒衣壳蛋白突变体中的氨基酸编号基于SEQ ID NO:2、3或4作出，当某一具体病毒衣壳蛋白突变体与SEQ ID NO:2、3或4所示序列的同源性达到80％或以上时，病毒衣壳蛋白突变体的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO:2、3或4的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似产生病毒衣壳蛋白突变体催化活性的突变体不在本发明病毒衣壳蛋白突变体的范围内。
本发明病毒衣壳蛋白突变体是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的病毒衣壳蛋白突变体可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的病毒衣壳蛋白突变体还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述病毒衣壳蛋白突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述病毒衣壳蛋白突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的病毒衣壳蛋白突变体片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的病毒衣壳蛋白突变体，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的病毒衣壳蛋白突变体，或(iii)成熟病毒衣壳蛋白突变体与另一个化合物(比如延长病毒衣壳蛋白突变体半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的病毒衣壳蛋白突变体，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此病毒衣壳蛋白突变体序列而形成的病毒衣壳蛋白突变体(如前导序列或分泌序列或用来纯化此病毒衣壳蛋白突变体的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；phe；Ala | Leu |
此外，还可以对本发明病毒衣壳蛋白突变体进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的病毒衣壳蛋白突变体的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在病毒衣壳蛋白突变体的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的病毒衣壳蛋白突变体。这种修饰可以通过将病毒衣壳蛋白突变体暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的病毒衣壳蛋白突变体。
术语“编码病毒衣壳蛋白突变体的多核苷酸”可以是包括编码本发明病毒衣壳蛋白突变体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或病毒衣壳蛋白突变体的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的病毒衣壳蛋白突变体的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的病毒衣壳蛋白突变体和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明基因表达载体
如本文所用，术语“基因表达载体”、“AAV突变体”可互换使用，是指如本发明所述的AAV突变体，其中，所述的AAV突变体中，插入有或携带有用于治疗听觉障碍疾病的治疗基因的表达盒；并且，所述的AAV突变体中，含有编码如本发明第一方面所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列。
在一个优选的实施方式中，所述的AAV突变体为AAV-DJ突变体。
优选地，所述治疗基因包括：正常个体中表达的听力相关基因(即野生型的听力相关基因)，或用于基因编辑的相关基因。
在一个优选的实施方式中，所述用于基因编辑的相关基因包括：病毒衣壳蛋白突变体的编码基因和靶向特定位点的导向RNA(sgRNA)。
在另一个优选的实施方式中，所述的听力相关基因是在内耳支持细胞中表达的基因。
在本发明的一个实施方式中，所述的在内耳支持细胞中表达的基因选自下组：GJB2、SCL26A4、GJB3、Brn4等，或其组合。
在一个优选的实施方式中，本发明所述的AAV突变体中，含有编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基因序列。
药物组合物和施用方法
在本发明中，还提供了一种药物组合物，它含有(i)安全有效量的本发明第一方面所述的基因表达载体；(ii)药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“包括”包括了“含有”、“基本上由……构成”和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在药物组合物中，除了含有有效活性成分或辅助成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。
术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
在一个优选的实施方式中，所述药物组合物是液态剂型的。
在一个更加优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型为注射剂。优选地，本发明所述药物组合物是用于耳蜗内注射的注射剂型。
在本发明的一个实施方式中，所述的载体为注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在本发明的一个实施方式中，所述的药物组合物在治疗听觉障碍疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。
在本发明中，所述的联合使用包括：与其他治疗听觉障碍疾病的药物联合使用。
在一个更加优选的实施方式中，所述的其他治疗听觉障碍疾病的药物包括：抗感染的抗生素类药物、神经营养因子类药物、离子通道调节剂类药物、维生素类药物等，或其组合。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点包括：
1)效率高：AAV-DJ突变体对内耳支持细胞的感染效率高。
2)易生产：本发明的AAV-DJ突变体载体出毒率高，稳定性也高，在生产过程中容易获得高滴度高质量的AAV。
3)安全性好：AAV是FDA批准用于临床治疗的载体，并且本发明的AAV-DJ突变体载体对内耳组织无损伤。
4)靶向性高：相对于小分子药物，本发明的AAV-DJ突变体载体具有组织和细胞特异性感染的特性，可以靶向特定的细胞类型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验材料和方法
小鼠
ICR小鼠(P1)被用于AAV病毒注射。动物的使用和照料都在动物伦理委员会的指导下完成。
细胞培养和感染
HEK293T细胞用10％FBS培养基，成分为杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco，11965-02)、10％胎牛血清(FBS)(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)和0.1mM非必需氨基酸(Gibco)。所有细胞都在5％CO2、37℃下培养。
HEK293T细胞用AAV感染后48小时，通过荧光显微镜观察tdTomato表达情况。
AAV病毒包装
三质粒系统转染293T细胞，转染4-6h后换液。收集第四天上清和细胞。上清用PEG沉淀过夜，4200rpm,4℃离心30min，再4400rpm离心10min，弃上清。用1xGB溶解。细胞用液氮反复冻融三次。上清及细胞都加benzonase、5M NaCl消化30min。消化完后，3000g离心10min，取上清。密度梯度超速离心，68000rpm18℃1h25min。取层，加PBS稀释后用超滤管浓缩。
AAV病毒注射
ICR P1小鼠，雌雄不限，按照不同的AAV血清型随机分组，每组4只小鼠。在体式显微镜下，以眼科剪于耳后沟2mm处剪开皮肤，稍分离皮下组织。可见面神经，听泡后壁以及二腹肌后腹。用玻璃微电极刺破耳蜗侧壁韧带并将1微升病毒注射至小鼠耳蜗。注射完毕后轻轻拔出玻璃电极，缝合切口。注射3周后取材分析表型。
免疫染色分析
免疫染色实验中，小鼠用戊巴比妥钠(50mg/Kg，Sigma)麻醉后，通过蠕动泵(Gilson)用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛进行心脏灌流，然后在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。第二天组织在10％EDTA中脱钙处理。在脱钙完成后，在解剖显微镜下分离出基底膜，并剪成三段(顶端，中间和基底部分)。分离后的基底膜用0.1M磷酸缓冲液(PB)洗三遍，然后用5％NGS稀释的一抗在4℃孵育过夜。第二天，切片用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗室温孵育两小时。最后切片用DAPI复染20分钟，在载玻片上用SlowFade Diamond AntifadeMountant(Life)进行封片。
抗体
支持细胞：
一抗：goat-anti-Sox2(Santa Cruz Biotechnology，sc-17320)
二抗：Alexa488 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch，705-545-003)
毛细胞：
一抗：rabbit anti-Myosin-VI polyclonal(Proteus Biosciences，25-6791)
二抗：CyTM5 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，711-175-152)
数据统计分析及软件
对支持细胞和毛细胞内的感染效率进行量化，通过统计随机100微米视野内支持细胞中mCherry+细胞比例来说明感染效率。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均数±标准差表示。*P<0.05，***P<0.001，不配对T检验。
Snapgene:用于质粒图谱构建设计
Excel:原始数据处理
NIS-Elements Viewer 4.0:实验图片处理
ImageJ:实验图片处理
Adobe photoshop CS6:实验图片处理
Adobe Illustrator CS4:实验图片处理
实施例1：AAV-DJ突变体筛选实验设计
在本实施例中，对AAV-DJ的cap序列进行基因改造，以筛选出可以高效感染支持细胞的AAV载体。
具体地，本发明人针对AAV-DJ的cap序列中特异性酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸位点进行突变，研究其突变体是否可以进一步提高支持细胞中的感染效率(图1)。
其中，分别设计了7种不同的AAV-DJ突变体(K137A、T251A、S278A、S503A、K534R、K546R和S670A)。
实施例2：AAV-DJ突变体感染体外HEK293T细胞
在本实施例中，将AAV-DJ及其突变体病毒分别在体外感染HEK293T细胞，48h后通过荧光显微镜观察tdTomato表达情况。
AAV-DJ及其突变体病毒的滴度和用量如图所示(图2)。
结果表明，AAV-DJ突变体(K137A、T251A、S670A)在体外HEK293T细胞中比AAV-DJ有较高的感染效率。
实施例3.
在本实施例中，将AAV-DJ及其突变体病毒分别注射至P1 ICR小鼠的耳蜗。每只小鼠注射4×109vg AAV病毒。同样的在注射3周后，对小鼠的耳蜗基底膜进行剥离并且染色，分别统计顶端、中间以及基底三个部分的支持细胞中mCherry+细胞比例。
实验结果显示，AAV-DJ突变体(T251A和S670A)在顶端部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有34.99±0.70％和69.30±2.96％的细胞为Tdtomato阳性，显著高于AAV-DJ的24.64±3.79％(图3，图6)。
AAV-DJ突变体(T251A,K534R和S670A)在中间部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有28.01±5.01％，31.84±10.63％和27.38±4.61％的细胞为Tdtomato阳性，高于AAV-DJ的16.1±3.00％，但无显著性差异(图4，图6)。
AAV-DJ突变体(S503A、K534R和S670A)在基底部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有25.61±20.99％、16.74±3.84％和44.28±7.37％，44.28±7.37％的细胞为Tdtomato阳性，显著高于AAV-DJ的5.61±3.22％(图5，图6)。
以上实验结果表明，在支持细胞中，AAV-DJ的突变体(S670A)可以显著提高支持细胞的感染效率，同时T251A和K534R也可以促进AAV-DJ对支持细胞的感染。
讨论
在本发明中，为了筛选出可以高效感染支持细胞的AAV载体，针对AAV-DJ的cap序列进行基因改造。
泛素-蛋白酶体降解机制被认为是AAV感染效率的主要障碍。其中，病毒衣壳蛋白cap的特异位点的点突变是最简单、最普遍的方法，可以使病毒载体避开细胞内的磷酸化和随后的泛素化以及蛋白酶体介导的降解。有文献报道在AAV2和AAV8型病毒的特异性酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸的点突变可以显著提高其感染效率，但是在体内具有特定的肝脏趋向性。
在本发明的具体实施方式中，针对AAV-DJ中特异性酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸位点进行突变，研究其突变体是否可以进一步提高支持细胞中的感染效率。
具体地，分别设计了7种不同的AAV-DJ突变体(K137A、T251A、S278A、S503A、K534R、K546R和S670A)。本发明人分别包装了表达tdTomato的AAV-DJ突变体的病毒，并注射到小鼠的耳蜗中。注射后三周，我们对耳蜗(顶端、中间、基底)的细胞进行免疫荧光分析。
通过体外和体内的实验结果发现，AAV-DJ的突变体(S670A)可以显著提高支持细胞的感染效率。这为针对耳朵支持细胞的基因功能研究以及基因治疗策略提供了非常巨大的帮助。
除了特定位置点突变之外，还有其他改造病毒蛋白外壳的方法，比如插入随机的序列，随机的点突变，打乱重排等等。这些都有可能进一步促进小鼠支持细胞感染效率的提升，需要更多的实验进行验证。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 高效感染支持细胞的AAV突变体
<130> P2019-0455
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Claims (36)
1.一种病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述的病毒衣壳蛋白突变体为非天然蛋白，并且所述病毒衣壳蛋白突变体相对于野生型病毒衣壳蛋白的氨基酸突变如下所示：
第137位的赖氨酸(K)突变为丙氨酸(A)，第503位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，第670位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，第251位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，或第534位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)；
其中，所述的第137、503、670、251、534位是对应于如SEQ ID NO: 1所示的序列的第137、503、670、251、534位；
所述病毒衣壳蛋白突变体具有促进AAV载体感染内耳支持细胞的活性。
2.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述的AAV载体为AAV-DJ载体。
3.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白突变体的第137位的赖氨酸(K)突变为丙氨酸(A)。
4.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白突变体的第503位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
5.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白突变体的第670位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，且具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；其中，所述的第670位是对应于如SEQ ID NO: 1所示的序列的第670位。
6.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白突变体的第251位的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，且具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；其中，所述的第251位是对应于如SEQ ID NO: 1所示的序列的第251位。
7.如权利要求1所述的病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白突变体的第534位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，且具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；其中，所述的第534位是对应于如SEQ ID NO: 1所示的序列的第534位。
8.一种用于治疗听觉障碍疾病的基因表达载体，其特征在于，所述的表达载体为AAV突变体，其中，所述的AAV突变体中，插入有或携带有用于治疗听觉障碍疾病的治疗基因的表达盒；
并且，所述的AAV突变体中，含有编码如权利要求1-7中任一项所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列。
9.如权利要求8所述的基因表达载体，其特征在于，所述的AAV突变体中，含有编码如SEQ ID NO: 2、3或4所示的氨基酸序列的基因序列。
10.如权利要求8所述的基因表达载体，其特征在于，所述治疗基因包括：正常个体中表达的听力相关基因，或用于基因编辑的相关基因；其中，所述正常个体中表达的听力相关基因即野生型的听力相关基因。
11.如权利要求10所述的基因表达载体，其特征在于，所述用于基因编辑的相关基因包括：病毒衣壳蛋白突变体的编码基因和靶向特定位点的导向RNA(sgRNA)。
12.如权利要求10所述的基因表达载体，其特征在于，所述的听力相关基因是在内耳支持细胞中表达的基因。
13.如权利要求12所述的基因表达载体，其特征在于，所述的在内耳支持细胞中表达的基因选自下组：GJB2、SCL26A4、GJB3、Brn4，或其组合。
14.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(i) 如权利要求8-13中任一项所述的基因表达载体；
(ii) 药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt%。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的10-99.9wt%。
17.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的70-99wt%。
18.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是用于耳蜗内注射的注射剂。
19.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括：其他治疗听觉障碍疾病的药物，所述的其他治疗听觉障碍疾病的药物包括：抗感染的抗生素类药物、神经营养因子类药物、离子通道调节剂类药物、维生素类药物，或其组合。
20.一种如权利要求8-13中任一项所述的基因表达载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于治疗听觉障碍疾病。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述制剂或药物组合物用于治疗内耳支持细胞中发生基因突变所导致的听觉障碍疾病患者。
22.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述的听觉障碍疾病选自下组：遗传性耳聋、非遗传性耳聋，或其组合。
23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述遗传性耳聋包括由选自下组的因素引起的耳聋：基因突变、基因缺失，或其组合。
24.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述非遗传性耳聋包括由选自下组的因素引起的耳聋：使用药物、外伤、感染、衰老，或其组合。
25.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述制剂或药物组合物施用的方式为耳蜗内注射。
26.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述制剂或药物组合物中所述基因表达载体的使用剂量为1×1011-5×1012vg。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述制剂或药物组合物中所述基因表达载体的使用剂量为5×1011-4×1012vg。
28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述制剂或药物组合物中所述基因表达载体的使用剂量为1×1012-3×1012vg。
29.一种制备权利要求8-13中任一项所述的基因表达载体的方法，其特征在于，将用于治疗听觉障碍的治疗基因的表达盒连入AAV突变体，从而获得如权利要求8-13中任一项所述的基因表达载体；其中，所述的AAV突变体中，含有编码如权利要求1-7中任一项所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列。
30.一种体外对听觉相关细胞进行转染的方法，其特征在于，包括步骤：用AAV突变体对所述听觉相关细胞进行转染；
其中，所述的AAV突变体中，含有编码如权利要求1-7中任一项所述的病毒衣壳蛋白突变体的基因序列；
并且，所述的听觉相关细胞为内耳支持细胞。
31.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1-7中任一项所述的病毒衣壳蛋白突变体。
32.如权利要求31所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
33.一种载体，所述的载体含有如权利要求31或32所述的多核苷酸。
34.如权利要求33所述的载体，其特征在于，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
35.一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如权利要求33或34所述的载体，或其基因组中整合有如权利要求31或32所述的多核苷酸。
36.如权利要求35所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
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