JPH04504125A - 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現発明の背景 本発明はポリペプチドの制御された発現を達成するために、脊椎動物内に裸のＤ ＮＡおよびＲＮＡ配列を導入することに関する。これは、遺伝子治療、ワクチン 投与および生体内細胞に対しポリペプチドを投与する必要があるいかなる治療の 状況においても役立つものである。

遺伝子治療における現在の研究は、ＤＮＡが患者のゲノム内に組込まれる、「永 久の」治癒に焦点がおかれている。

ウィルスのベクターは、患者の細胞を形質転換させかつＤＮＡをゲノム内に導入 するための手段として現在最も頻繁に使用される手段である。間接的な方法にお いては、新しい遺伝子情報を保持する、ウィルスベクターが身体から取り除かれ た標的細胞に感染させるために使用され、かつこれらの細胞はその後再移植され る。生後の動物への直接の生体内遺伝子移植については、リポソーム内にカプセ ル化されたＤＮＡおよびウィルス外膜受容体タンパク質を含むプロテオリポソー ムに包含されたＤＮＡの処方が報告されまた、肯定的な結果かリン酸カルシウム 共沈ＤＮＡと共に遺伝子治療の医療への応用および組換型レトロウィルスベクタ ーの利用は、安全性への配慮から遅れている。細胞のゲノム内へ外因性ＤＮＡを 導入することでＤＮＡに障害を引起こしかつ悪性疾患の素因となり得る、受容細 胞の遺伝子の変化を引起こし得る。これらの潜在的問題を回避する方法は、遺伝 子治療を安全でかつ有効なものにするうえで重大な利益を有するものと考えられ る。

免疫原性タンパク質と共にワクチン投与を行なうことで多くの疾病の発生を根絶 しまたは低減してきたが、免疫原として、他の病原体および疾病状態と関連して タンパク質を使用することには大きな困難が存在している。多くのタンパク質の 抗原は本来免疫原性のものではない。むしろ、それらは免疫系が働（態様から、 ワクチンとしては効果的ではない。

を椎動物の免疫系は幾つかの相互作用的要素から構成される。最もよく特徴が表 われかつ最も重要な部分は体液性および細胞性（細胞溶解性の）ブランチである 。体液性免疫は、体液内に分泌しかつ直接的に抗原を認識するタンパク質、すな わち抗体を含む。細胞系は、対照的に、外来の抗原を作り出している他の細胞を 認識しかつこれらを殺す特別な細胞に依存している。この基本的機能の違いが免 疫防御の２つの異なる戦略を反映している。体液性免疫は主に動物にとって外因 性のものである抗原に向けられ、一方細胞系は動物内で活発に合成される抗原に 応答する。

体液性免疫のエフェクタである抗体分子は特殊なりリンパ細胞、すなわち抗原に 応答するＢ細胞により分泌される。

抗体は抗原に結合および直接的にこれを不活性化しく抗体を中和し）または抗原 を破壊するために免疫系の他の細胞を活性化することか可能である。

細胞の免疫認識は特殊なりラスのリンパ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞により 行なわれる。これらの細胞は抗原全体を認識しないが、クラスＩ主要組織適合複 合体（ＭＭＣ）分子と呼ばれるタンパク質に結合した標的細胞の表面」二に現わ れる、抗原の分解したペプチドフラグメントに応答する。本質的にすべての核の ある細胞はクラス１分子を有している。細胞内で生産されるタンパク質は正常な 細胞の代謝の一環として連続的にペプチドに分解されると考えられている。これ らのフラグメントはＭＨＣ分子に結合しかつ細胞の表面に輸送される。こうして 、細胞の免疫系は常に身体のすべての細胞に生産されるタンパク質のスペクトル を常にモニターしかつ外来の抗原を生産するいかなる細胞をも除去すべく平衡を 保っている。

ワクチン投与は動物を抗原に応答させる準備のプロセスである。ワクチン投与は 免疫認識よりもより複雑でかつＢ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含むのみならず 、他のタイプのリンパ細胞をも含む。ワクチン投与の間、抗原を認識する細胞（ Ｂ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）はクローン的に拡張される。加えて、抗原に特 異的な補助細胞（ヘルパーＴ細胞）の数もまた増大する。ワクチン投与はまた抗 原をプロセスしかつ２つの経路のうちの１つを刺激し得る形でそれを表示し得る 特殊化された抗原提示細胞をも含む。

ワクチン投与は、ルイ・パスツール（ＬＯＵＩＳ　ＰＡＳＴＥＵＲ）の時代から ほとんど変化し１ていない。外来の抗原か動物内に導入され、これが表面免疫グ ロブリンに結合することにより特異的Ｂ細胞を活性化する。これはまた抗原プロ セシング細胞によっても吸収され、分解されかつクラスＩ［ＭＨＣ分子に結合す るこれら細胞の表面上にフラグメントとなって現われる。クラスＩＩ分子に結合 するペプチドはヘルパークラスＴ細胞を刺激することが可能である。ヘルパーＴ 細胞および活性化されたＢ細胞の双方が活性体液性免疫化を生成することが必要 である。細胞性免疫は類似するも、あまりよく理解されていないメカニズムによ り刺激を受けると考えられている。

こうして、２つの異なりかつ顕著な抗原処理の経路がＩＩクラスＭＭＣ分子に結 合した外因性抗原を生産し、それらはＴヘルパー細胞を刺激し、同様に分解され かつクラスＩＭＨＣ分子に結合しかつ細胞傷害性クラスのＴ細胞により認識され る内因性タンパク質を刺激することができる。

ＭＨＣ分子の分布においてはほとんどまたは全く違いが存在しない。本質的にす べての核を育する細胞はクラス１分子を発現し、一方クラスＩ　ＩＭＨＣタンパ ク質は幾つかのタイプのリンパ細胞に制限される。

通常のワクチン投与方法によれば常にヒトの免疫反応がもたらされることになる 。これらはまた細胞傷害性免疫をももたらす。体液系は病原体からの引き続いて 起こる攻撃からワクチンを投与されたヒトを保護しかつもし病原体がその生存期 間内に細胞外の段階を経るならば、細胞内感染か広がることを防止することがで きるが、しかし、細胞内の病原体を除去するためには相対的にあまり有効ではな い。

細胞傷害性免疫は感染した細胞を除去することにより体液系を補う。したがって 、有効なワクチン投与により双方のタイプの免疫か活性化されるはずである。

細胞傷害性Ｔ細胞の応答はウィルス等の細胞内病原体および悪性の細胞を除去す るために必要である。十分な応答を確保するために、クラス１分子と関連して十 分な濃度で外因的に投与された抗原を提供することは困難であることがわかって いる。このことが、腫瘍に特異的な抗原（たとえば乳癌または結腸癌の細胞に対 する）、および免疫原性が弱いウィルスタンパク質（たとえばＨＩＶ、ヘルペス 。

非−Ａ型および非−Ｂ型肝炎、ＣＭＶおよびＥＢＶ）に対するワクチンの開発を 著しく妨げてきた。

抗体が感染性を増大することを示しているウィルス等の因子に対して免疫処置を 行なううえで、細胞性免疫応答たけて提供することが望ましいと考えられる。ま たこのような応答を慢性および潜伏しているウィルス感染ならびに悪性細胞に対 して与えることも育苗であると考えられる。

合成ペプチドワクチンの使用はこれらの問題を解決することにはならない、とい うのもペプチドは、組織適合分子と容易に関連せず、短い血清半減期を有し急速 にタンパク質分解されまたは抗原提示単球およびマクロファージに対して特定的 に局在化しないからである。最高でも、すべての外因的に投与された抗原は抗原 提示マクロファージに結びつく自己タンパク質の母集団と競合しなければならな い。

ヘルペスウィルス、非−Ａおよび非−Ｂ型肝炎、ＨＩＶその他から免疫原性に乏 しいウィルスタンパク質に対する免疫反応を引き出すために多くの努力がなされ てきた。こた危険なものである。上記のとおり、ウィルスによりコード化された タンパク質に対応する合成ペプチドワクチンが作られてきたが、これらは決定的 な落とし穴を伴うものであった。他のウィルスからタンパク質を発現させるため にワクシニアウィルスベクターを使ルする試みもなされてきた。しかしながら、 結果は満足のいくものではなかった、というのも（ａ）組換型ワクシニアウィル スが既に免疫のあるヒトにおける循環から急速に除去されかつ（ｂ）複雑なウィ ルス抗原の投与が「抗原競合」として知られる現象を誘因し得るからであり、こ れはウィルスの免疫原的に弱い部分が免疫反応を引き出すことができず、という のもそれらは投与された抗原のうち他のより潜在能力ある領域に負けてしまうか らである。

タンパク質またはペプチドワクチンに関するもう１つの大きな問題というのは、 潜在的免疫反応をもたらすための努力として抗原の注射を繰返し行なう場合に発 生し得る過敏反応である。この現象においては抗原に応答して形成されたＩｇＥ 抗体が激しいかつ時には死に至るアレルギー反応を引き起こす。

したがって、この種のタンパク質またはポリペプチドに対して安全でかつ有効な 免疫応答を引き起こすための方法が必要とされている。そのうえ、細胞傷害性Ｔ 細胞反応を誘因し、過敏症および血清内の物質のタンパク質分解を回避しかつ単 球およびマクロファージへの物質の局在化を容易にするために、これらの抗原を 細胞表面上の■クラス組織適合抗原に関連づける方法が非常に必要とされている 。

治療用ペプチドの投与は数多くの疾病状態に有効である。

このようなペプチドには、インターロイキン−２，腫瘍壊死因子、およびインタ ーフェロン等のリンホカインと、神経成長因子、表皮増殖因子およびヒト成長ホ ルモン等の成長因子と、組織プラスミノーゲン活性化因子と、因子ＶＩ１１：Ｃ と、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子と、エリスロポエチンと、インシ ュリンと、カルシトニンと、チミジンキナーゼなどが含まれる。そのうえ、（リ ジン、ジフテリア毒素またはコブラの毒液因子等の）毒性ペプチドを疾病のある または新生物細胞に選択的に運搬することにより大きな治療上の利益かもたらさ れ得る。現在のペプチド運搬システムは、機能的細胞表面受容体を細胞膜に有効 に組込むことができないこと、および標的細胞内へまたはこれに対して治療に必 要な量のペプチドを運搬するために、大量のペプチドを全身的に投薬することの 必要性（これは結果として望ましくない全身の副作用をもたらす）を含む重大な 問題が存在している。

遺伝子治療、免疫および細胞への治療用ペプチドの運搬に伴う上記の問題に本件 発明は取組むものである。

本件発明は、生体内でを推動物の細胞の内部に薬物学的または免疫原性のポリペ プチドを運搬するための方法を提供し、この方法は薬物学的に許容可能で注射可 能な担体およびポリペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを含む 調製物を細胞を含む組織の間質的空間へ導入するステップとを含み、これにより 裸のポリヌクレオチドが細胞の内部に取込まれかつを推動物に対して免疫原性ま たは薬理学的効果をもたらすものである。また生体内の筋肉細胞内へポリヌクレ オチドを導入するための方法も提供され、これは薬物学的に許容可能な担体内に 裸のポリヌクレオチドチドが組織の筋肉細胞に導入されるステップとを含む。こ のポリヌクレオチドはアンチセンスポリヌクレオチドでもよい。代替的には、こ のポリヌクレオチドはを推動物に対し治療を施す接触ステップの後に筋肉細胞に より発現される治療用のペプチドをコードしてもよい。同様に、接触ステップの 後に筋肉細胞により発現されかつ免疫反応を発生して、それによりを推動物に免 疫処置を行なう免疫原性ペプチドをコードしてもよい。

この発明の１つの特定的に興味をひかれる局面は、を推動物に対するポリペプチ ドの長期にわたる投与を行なうための方法であって、この方法はを推動物の組織 内に、ポリペプチドを作動的にコードする裸のＤＮＡ配列を間質的に導入し、こ れにより組織の細胞か少なくとも１力月または少なくとも３力月、より好ましく は少なくとも６力月にわたってポリペプチドを生産するというステップを含む。

本件発明のこの実施例においては、ポリペプチドを生産する細胞は筋肉細胞等の 非増殖性の細胞である。

本件発明に従うもう１つの方法は、を推動物におけるポリペプチドの一過性の発 現を得るための方法であり、この方法はポリペプチドを作動的にコードする裸の ｍＲＮＡ配列を間質的にを推動物の組織内に導入し、これによりその組織の細胞 が約２０日未満、通常は約１０日未満、およびしばしば３日または５日未満にわ たってポリペプチドを生産するというステップを含む。本件発明の方法の多くに 関しては、固体組織への投与が好まれる。

本件発明の１つの重要な局面は、筋ジストロフィーの治療のための方法であり、 筋ジストロフィーを患う動物の筋肉細胞内へ、生体内で薬物的に許容可能な注射 できる担体で、シストロフィンを作動的にコードするポリヌクレオチドを含む組 成物の治療量を導入し、これによりポリヌク１７オチドか細胞内に取込まれかつ シストロフィンが生体内で生産されるというステップを含む。好ましくは、ポリ ヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドでありかつその組成物は筋肉組織内に間質 的に導入される。

本件発明はまたここに記載された方法においてすべての使用か考慮される薬物学 的生産物をも含む。たとえば、生物学的に活性のポリヌクレオチドを作動的にコ ードする裸のポリヌクレオチドを含む薬物学的生産物かあり、これは容器内に、 生理学的に許容可能な投与可能な形で、薬物の生産、使用または販売を規制する 政府の省庁により規定された形の容器に付随する注意書を有し、その注意書がヒ トまたは動物への投与のためのポリヌクレオチドのその形態に関してその省庁か 承認したということを表わすものである。このような注意書は、たとえば米国食 品医薬品局により承認された処方薬のためのラベルまたは承認された生産物であ るという挿入物でもよい。

もう１つの実施例においては、この発明は薬物学的生産物を提供し、この生産物 は組織の細胞にポリヌクレオチドを発現させるために組織内へ間質的に導入する ためのおよびこれに適した生理学的に許容可能な注射可能な担体内の溶液中の生 物学的に活性のペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドと、その溶 液を含む容器と、この容器に付随する注意書とを含み、その注意書は薬物の製造 、使用または販売を規制する政府の省庁により規定された形式のものであり、そ の注意書というのは、ヒトまたは動物に投与するためのポリヌクレオチドの溶液 の製造、使用または販売に関してその省庁が承認を与えたということを反映する 。そのペプチドは免疫原性のものでよくかつその溶液の投与かヒトまたは動物に 対するワクチン処置の役割を果たし得る。同様に、このペプチドは治療用にもな り得、かつポリペプチドに関しこの治療の必要性から、この溶液をを推動物に投 与することにより治療上の効果かもたらされる。

この発明はまた薬物学的生産物を提供し、この生産物というのは組織の細胞か生 理学的に許容可能な注射可能な担体中のポリヌクレオチドを取込むことを引き起 こし、かつ治療上の効果をもたらすへく組織内への間質的な導入に適した溶液で の裸のアンチセンスポリヌクレオチドと、その溶液を収める容器と、薬物の製造 、使用または販売を管轄する政府の省庁により規定された形式での容器に添付さ れた注意書とを含み、その注意書かヒトまたは動物への投与のためのポリヌクレ オチドの溶液の製造、使用、または販売に関してその省庁か承認したということ を反映するものである。

この発明の１つの特に重要な局面は、無菌で、薬物学的に許容可能な担体と、シ ストロフィンを作動的にコードする薬物学的に有効な量の裸のポリヌクレオチド と、担体およびポリヌクレオチドを無菌状態に収める容器とを含む、筋ジストロ フイー治療のための生産物に関する。

好ましくは、このポリヌクレオチドとはＤＮＡである。

もう１つの側面からは、この発明はを推動物に生物学的に活性のポリペプチドを 供給するうえで使用される薬物学的生産物を含み、この生産物はポリヌクレオチ ドを作動的にコードする薬物学的に有効な量の裸のポリヌクレオチド、無菌状態 で担体とポリヌクレオチドとを収める容器、およびこの容器に付随して、この容 器から組織の間質的空間へポリヌクレオチドを運搬することを可能にし、これに より組織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現する手段とを含むも のである。このような運搬を可能にする手段には針等により突き刺すことが可能 な従来の隔壁を含み辱る。代替的には、その容器が注射器の場合には、その手段 は注射器のプランジャーまたは注射器に取付けられた針を含むと考えられ得る。

本件発明で使用される容器は通常１または２以上の単位投薬量を提供するために 少なくともｌ、好ましくは少なくとも５またはｌＯおよびより好ましくは少なく とも５０または１００マイクログラムのポリヌクレオチドを有することになる。

多（の適用に関しては、この容器は少なくとも５００マイクログラムまたは１ミ リグラムを有することになりかつしばしば少なくとも５０または１００ミリグラ ムのポリヌクレオチドを含有することになるであろう。

この発明のもう１つの局面は、を推動物に免疫処置を行なううえでの使用のため の薬物学的生産物を提供し、この生産物というのは免疫原性ポリペプチドを作動 的にコードする薬物学的に有効な量の裸のポリペプチドと、無菌状態でこのポリ ヌクレオチドを収める封止された容器と、この容器に付随して、容器から組織の 間質的空間にポリヌクレオチドを運搬することを可能にし、これによりその組織 の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現させるための手段とを含む。

この発明のもう１つの局面は、組織を含む細胞にポリペプチドを生産させるため に間質的に組織内に導入するための薬物の調製物での生理学的に活性のポリペプ チドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを使用することである。その薬 物とは、たとえば筋肉組織内への導入により筋肉細胞がポリペプチドを生産する ためのものでもよい。また、ペプチドがシストロフィンでありかつ薬物が筋ジス トロフィーの治療のためのものである場合のような使用も考えられる。

この発明に従うもう１つの用途は、を椎動物の細胞内でのポリヌクレオチドの翻 訳を抑制するためにを椎動物の組織内に間質的に導入するための薬物の調製にお いて裸のアンチセンスポリヌクレオチドを使用することである。

ポリヌクレオチドが導入される組織は持続的非分裂細胞であり得る。ポリヌクレ オチドはＤＮＡまたはＲＮＡ配列のいずれでもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡ である場合、それ自体は非複製型であるが、プラスミドに挿入されかつそのプラ スミドがさらにレプリケータ−を含むＤＮＡ配列でも可能である。ＤＮＡは宿主 細胞ゲノム内へ組込まれないように作られた配列でもよい。ポリヌクレオチドの 配列は細胞内に含有されるかもしくはそこから分泌されるかいずれかのポリペプ チドをコードすることが可能で、またはペプチドの分泌を命令する配列を含み得 る。

ＤＮＡ配列はまたプロモータ配列を含み得る。１つの好ましい実施例においては 、ＤＮＡ配列は予め定められた細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を可能に する細胞特異的プロモータを含む。ＤＮＡはまたＤＮＡを転写するためのポリメ ラーゼをコードし、かつポリメラーゼのための認識サイトを含み得、かつ注射可 能な調製物は初回量のポリメラーゼを含み得る。

多くの場合、ポリペプチドの運搬が一過性のものであるようにポリヌクレオチド の翻訳が限定された期間の間で行なわれることが好まれる。このポリペプチドは 有利に治療用ポリペプチドでも良く、かつ酵素、ホルモン、リンホカイン、受容 体、特に細胞表面の受容体、成長因子または他の調節因子等の調節タンパク質、 または生きたを椎動物内の細胞に運搬することを所望されかつこれに関し対応す るＤＮＡまたはｍＲＮＡが得られ得る他のいかなるタンパク質またはペプチドを も含み得る。

好ましい実施例においては、ポリヌクレオチドは筋肉組織内に導入され、他の実 施例においてはポリヌクレオチドは皮膚、脳、肺、肝臓、牌臓または血液の組織 内へ組込まれる。調製物は様々なルートによりを椎動物に注射され、その経路と は皮肉、皮下、くも膜下もしくは静脈でもよく、または身体の腔内に行なわれて もよい。好ましい実施例では、ポリヌクレオチドは筋肉内に注射される。他の実 施例においては、ポリヌクレオチドを含む調製物は皮膚内に圧入される。吸入と 同様、経皮的投与についても考慮される。

１つの好ましい実施例では、ポリヌクレオチドはＤＮＡを転写するためのポリペ プチドとポリメラーゼ双方をコードするＤＮＡであり、かつＤＮＡはポリメラー ゼのための認識サイトを含み、かつ注射可能な調製物はさらに初回量のポリメラ ーゼを細胞内に提供するための手段を含む。ポリメラーゼの初回量はＤＮＡと共 に物理的に提供され得る。

代替的には、そのｍ　ＲＮ　Ａコードを含むことにより提供され得、そのｍＲＮ Ａは細胞により翻訳される。本件発明のこの実施例においてはＤＮＡは好ましく はプラスミドである。好ましくは、ポリメラーゼはファージエフポリメラーゼで あり、かつその認識サイトは複製配列のＴ７オリジンである。

この発明のもう１つの局面に従い、を椎動物における特異的ポリペプチドの欠陥 またはその欠如に関連する疾病を治療するための方法か提供され、この方法は特 異的ポリペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを含む薬物学的に許容可能 な注射可能な担体を含む注射可能な調製物を得るステップと、注射可能な調製物 をを椎動物内に導入しかつそのポリヌクレオチドが細胞内へ組込まれることを可 能にするステップを含み、そこではポリペプチドがポリヌクレオチドの翻訳生産 物として形成されかつそれによりポリヌクレオチドの欠陥またはその欠如か補わ れる。好ましい実施例においては、この調製物は筋肉組織内へ導入されかつこの 方法は反復して適用される。この方法は欠陥またはその欠如が遺伝的欠陥による ものである場合に有利に適用される。ポリヌクレオチドは好ましくは非複製ＤＮ Ａ配列であり、ＤＮＡ配列はまた複製開始点を含むプラスミドベクター内へ組込 まれ得る。

好ましい一実施例においては、ポリヌクレオチドは非分泌のポリペプチドをコー ドし、かつポリペプチドは［（ｅ　ｆｔにとどまる。この実施例によれば、ポリ ヌクレオチドがポリペプチド　シストロフィンをコードする場合、デュシエーヌ 症候群（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｓ’ｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のための治療法を提供し 、代替的には、ポリヌクレオチドがポリペプチドフェニールアラニンヒドロキシ ラーゼをコードする場合には、この方法はフェニールケトン尿症のための治療法 を含む。

もう１つの好ましい実施例においては、細胞により分泌されかつを椎動物の循環 内へ解き放たれるポリペプチドをコードし、特に好ましい実施例においては、ポ リヌクレオチドがヒトの成長ホルモンをコードする。

この方法のもう１つの好ましい実施例においては、高コレステロール血症のため の治療法を提供し、コレステロールホメオスタシスに関連する受容体をコードす るポリヌクレオチドか肝細胞内に導入されかつ受容体が細胞により発現される。

この発明のもう１つの局面に従い、を椎動物に免疫処置を施すための方法か提供 され、この方法は免疫原性翻訳生産物をコードする発現可能なポリヌクレオチド を含む調製物を得るステップと、を椎動物内にその調製物を導入するステップと を含み、そこでは、ポリヌクレオチドの翻訳生産物がを推動物の細胞により形成 され、これが免疫原に対する免疫反応を引き出す。この方法のもう１つの実施例 においては、注射可能な調製物は免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリ ヌクレオチドを含む薬物学的に許容可能な担体を含みかつを椎動物内への調製物 の導入の際には、このポリヌクレオチドがを推動物の細胞内に組込まれ、そこで はそのポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産物が形成され、これが免疫原に対す る免疫反応を引き起こすのである。

代替的実施例においては、この調製物は、を推動物から得られかつ生体外でポリ ヌクレオチドでトランスフェクトされる１つまたは２つ以上の細胞を含み、これ によりポリヌクレオチドは前記細胞内に組込まれ、そこではポリヌクレオチドの 免疫原性翻訳生産物が形成され、かつこれによりその調製物のを椎動物内への導 入の際には、免疫原に対する免疫反応が引起こされる。この発明のどの実施例に おいても、免疫原性生産物は細胞により分泌され得、または主要組織適合抗原の 状況においてを推動物の細胞により提供され得、これにより免疫原に対する免疫 反応を引起こす。

この方法は、を推動物からの非分裂、分化細胞を使用して行なうことが可能で、 その細胞とは血液サンプルから得られるリンパ球でもよく、代替的には分裂可能 な部分的に分化した繊維芽細胞を使用して行なわれ得る。好ましい実施例におい ては、免疫抗原性翻訳生産物をコードするポリヌクレオチドを筋肉組織内に組込 むことにより行なわれる。

免疫処置のために使用されるポリヌクレオチドは好ましくはｍＲＮＡ配列である が、非複製ＤＮＡ配列も使用され得る。ポリヌクレオチドは注射可能担体のみを 使用して身体の組織内に導入され得るし、リポソーム調製物は、を推動物から得 られた細胞の生体外トランスフェクションが行なわれる方法には好ましい。

担体は好ましくは等浸透圧、低浸透圧、または若干低浸透圧のものでありかつス クロース溶液によりもたらされるような比較的低いイオン強度を有する。調製物 はさらにポリペプチドの形式でまたはポリヌクレオチドとしてリポソーム内に組 込まれるサイトカインの源を有利に含み得る。

この方法は体液性免疫反応、細胞性免疫反応、またはこれらの組合わさったもの を選択的に引起こすために使用され得る。細胞がクラス■の主要組織適合複合体 を発現しかつ免疫原性ペプチドがクラス■複合体のコンテキストで提示される実 施例においては、免疫反応は細胞的なものでありかつ細胞傷害性Ｔ細胞の生産を 含む。

このような実施例の１つにおいては、免疫原性ペプチドはウィルスと関連し、ク ラス■抗原のコンテキストで提示されかつウィルスに感染した細胞を破壊する能 力がある細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞反応もまた、ポリヌク レオチドが体液性エピトープを欠（端を切られたウィルス抗原をコードする場合 の方法に従いもたらされ得る。

これらのうちもう１つの実施例においては、免疫原性ペプチドは腫瘍と関連し、 クラスＩ抗原のコンテキストて提示されかつ腫瘍細胞を破壊する能力がある細胞 傷害性Ｔ細胞を刺激する。注射可能な調製物か動物から採取した細胞および生体 外においてトランスフェクトされたクラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合抗 原を発現する細胞を含むさらにもう１つの実施例においては、免疫反応は双方と も体液性および細胞性のものでありかつ抗体および細胞傷害性Ｔ細胞の生産を含 む。

もう１つの実施例においては、を推動物に免疫処置を施す方法か提供され、この 方法は免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含むプラス に荷電されたリポソームを得るステップと、を推動物にそのリポソームを導入す ることによりそのリポソームが単球、マクロファージまたは他の細胞に組込まれ るステップとを含み、そこではポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産物が形成さ れかつその生産物か主要組織適合複合体のコンテキストにおいて細胞によりプロ セスされかつ提示され、それにより免疫原に対する免疫反応か引起こされる。こ こでも、ポリヌクレオチドは好ましくはｍＲＮＡであるか、ＤＮＡが使用されて もよい。そして先程と同様、この方法は注射可能な担体中のポリヌクレオチドの みを使用して、リポソーム抜きで実施されてもよい。

この発明はまた、ポリペプチドと、ＤＮＡを転写するためのポリメラーゼとをコ ードする他のＤＮＡの使用をも包含し、かつＤＮＡはポリメラーゼのための認識 サイトを含む。ポリメラーゼの初回量は調製物の中にそれをコードするｍＲＮＡ を含むことにより提供され、そのｍＲＮＡは細胞により翻訳される。このｍＲＮ Ａは好ましくは細胞におけるその分解を遅延させる手段を設けられる。これには 、−ｍＲＮＡをキャッピングすること、ｍＲＮＡを環状化すること、またはｍＲ ＮＡの５′末端を化学的にブロックすることを含み得る。この発明で使用される ＤＮＡは線状ＤＮＡの形式でもよいしまたはプラスミドでもよい。エピソームの ＤＮＡも考えられる。１つの好ましいポリメラーゼとしてはファージＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼがありかつ好ましい認識サイトとしてはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプ ロモータ本件発明の実施には、を推動物の細胞内へ組込まれるポリペプチドを作 動的にコードする裸のポリヌクレオチドを得ることが必要である。ポリヌクレオ チドは、プロモータ等の標的細胞による発現のために必要なすへての遺伝子情報 を有している場合にポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドはを 椎動物の細胞に注射可能な物質を運搬するいかなる方法によっても、たとえば筋 肉または皮膚等の組織の間質的空間内へ注射することにより、循環系または身体 のキャビティ内への導入、または吸入もしくは吹込み等によりを椎動物に対して 投与され得る。裸のポリヌクレオチドは注射されるかまたは他の態様では薬物学 的に許容可能な液体の担体で動物に運搬される。すべての適用に関し、この液体 の担体は水または部分的に水であり、無菌の、パイロジエンを含まない水を含む 。調製物のｐＨは適当に調節されかつ緩衝される。

リポソームの使用を必要とする本件発明の実施例においては、たとえば、ポリヌ クレオチドがリポソームと関連づけられる場合に、リポソーム、好ましくはカチ オン性のまたはプラスに荷電されたリポソームを形成するための材料が必要であ りかつリポソームの調製物がこれらの材料から作られることが必要である。リポ ソームの材料が準備できれば、ポリヌクレオチドは免疫を施す因子として使用す るため生体外の細胞をトランスフェクトするために有利に使用されることが可能 で、またはリポソームが食細胞により取込まれ得る身体の部位へポリヌクレオチ ドを投与するために有利に使用され得る。

ポリヌクレオチドの材料 本件発明の方法に従い使用される裸のポリヌクレオチドの材料はＤＮＡおよびＲ ＮＡの配列または治療上育苗な適用を有するポリペプチドをコートするＤＮＡお よびＲＮＡ配列を含む。これらのポリヌクレオチドの配列は、細胞内への侵入を 容易にするために作用するいかなる運搬用媒介物からもそれらが自由であるとい う意味で裸なのであり、たとえばポリヌクレオチドの配列はウィルスの配列、特 に遺伝情報を運び得るいかなるウィルスの粒子からも自由である。それらはトラ ンスフェクションを促進するいかなる物質、たとえばリポソームの製剤、リボフ エクチン等の荷電された脂質またはＣａＰ○４等の沈澱する因子から同様に自由 でありかつこれらに対して裸である。

これらの方法において使用されるＤＮＡの配列は宿主細胞のゲノム内に統合しな い配列か可能である。これらは非複製のＤＮＡ配列か、またはゲノム−統合能力 に欠けるように遺伝学的に作られた特異的な複製配列でもよい。

この発明のポリヌクレオチドの配列は細胞により取込まれた後に治療的な効果を 有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。それら自身が治療用であるポリヌクレオ チドの例としてはアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコー ドするＤＮＡ、または欠陥のあるまたは不良の内因性の分子を置換するｔＲＮＡ もしくはｒＲＮＡをコードするＤＮＡがある。この発明のポリヌクレオチドはま た治療用ポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドは大きさに関わ りなくかつグリコジル化しているかどうかに関わりなくポリヌクレオチドの何ら かの翻訳生産物であると理解されている。治療用ポリペプチドは原始的な例とし ては、動物における欠陥のあるまたは欠失のある種を補うことができるポリペプ チド、または毒性の効果を通じて身体から存寄な細胞を制限または除去する役割 を果たすものを含む。

この発明により提供される治療用ポリヌクレオチドはまた体液性または細胞性反 応またはその双方を引起こす内因性の免疫原として作用し得る免疫供与ポリペプ チドをコードする。本件発明に従い使用されるポリヌクレオチドはまた抗原をコ ードし得る。この点に関しては、「抗体」という用語はどのクラスの全体の免疫 グロブリン、キメラ抗体および二重または多重の抗原もしくはエピトープ特異性 、および雑種フラグメントを含むＦ　（ａｂ）２　、Ｆａｂ’　。

Ｆａｂ等のフラグメントを存する雑種抗体をも包含する。

「抗体」の意味に含まれるものとしてはこの他にこのようなフラグメントの接合 体および、たとえば米国特許第４．７０４、６９２号に記載されるようないわゆ る抗原結束タンパク質（単鎖抗体）を含んでおり、この特許の内容はここに引用 により援用される。

したかって、抗体の可変な領域をコードする分離されたポリヌクレオチドが本件 発明に従い導入されることが可能で、これは処置を受けた対象が生体内原位置で 抗体を生産することを可能にする。抗体コード化ポリヌクレオチドを得ることに 関する代表的な方法に関しては、Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ。

８０５−８１０（１９８９）を参照のこと。抗体の方は、たとえば病原体と関連 する表面抗原に結びつくことにより治療的効果を奏すると考えられる。代替的に は、エンコードされた抗体としてはたとえば米国特許第４．６９９．８８０号に 記載されたような非イディオタイプ抗体（他の抗体を結束する抗体）か可能であ る。このような非イディオタイプ抗体は治療を受けるヒトに内因的または外来の 抗体を結束させることが可能で、それによりたとえば自己免疫疾患が原因の免疫 反応に関連する病的状態を改善したりまたはこれを防止することになる。

この発明のポリヌクレオチドの配列は好ましくは治療のまたは免疫原性ポリペプ チドをコードし、かつこれらの配列はこれらポリペプチドの発現を制御する調節 タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列との関連において使用され得 る。この調節性タンパク質はそのトランスフェクションを調節するようにゲノム のＤＮＡに結合することにより作用し、代替的にはメッセージャーＲＮＡに結合 してその安定性または翻訳効率を増加させたりまたは減少さ々な形式をとること か可能で、かつ本件発明は何か特定のポリペプチドまたはポリペプチドの群に関 してコード化する何か特定のポリペプチドに限定されているわけてはない。

遺伝子のフラグメントのみを含んでもよいしまたは多重のポリペプチド配列をコ ードし、かつ付加的に認識およびプロモータ配列を含んでもよい。多数の生理学 的に活性のペプチドおよび抗原または免疫原をコードする遺伝子を含むプラスミ ドか文献で報告されておりかつ当業者により容易に入手可能である。

ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、様々なを椎動物系においての使用に適す るプロモータがよく知られている。

たとえば、マウスの生体系における使用に関しては、適当な強いプロ％−夕てＲ ８Ｖ　ＬＴＲ，ＭＰＳＶ　ＬＴＲ１ＳＶ４０　１ＥＰ、およびメタロチオネイン プロモータが含まれる。これに対し、ヒトにおいてはＣＭＶ　ＩＥＰ等のプロモ ータが有利に使用され得る。すべての形態のＤＮＡ、それが複製型または非複製 型であるとにかかわらず、ゲノムに統合されずかつ発現可能であるものはこの発 明により考慮される方法の範囲内にある。

自動化された核酸合成装置が入手可能であるので、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方とも 、ヌクレオチド配列か知られているときまたはＰＣＲクローンおよび醗酵の組合 せにより直接合成され得る。そのうえ、所望のポリペプチドの配列か知られてい る場合には、ポリヌクレオチドのための適当なコーディング配列が推定され得る 。

ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、生体外の対応するＤＮＡから容易に準 備することが可能である。たとえば、従来技術では、個々のりボヌクレオシドト リホスフエイトが存在すればＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを準備するために ファージＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３またはＴ７を利用する。複製開始点Ｔ ７等の適切なファージプロモータは転写されるべき遺伝子のすぐ上流のテンプレ ートＤＮＡに配置されている。このような態様でＴ７を利用するシステムがよく 知られており、かつ文献にも記載され、たとえばＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　’Ａ　３　。

８　（ＶＯＬ、　１１９８８）等に記載されている。

本件発明において使用されるｍＲＮＡを入手するための１つの特定的に好まれる 方法が例２−５に示されている。

一般的には、しかしながら当該技術の一般的な技術者により容易に製作され得る ｐＸＧＢプラスミドまたはいかなる類似のプラスミドも本件発明を実施するうえ でほぼ無制限な数のＣＤＮＡ５と共に使用され得ることは明らかなはずである。

このようなプラスミドは５′非翻訳領域、３′非翻訳領域およびポリメラーゼの ためのテンプレートに伴われる所望のＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを 有利に含み得る。これら５′および３′領域の間にはいかなる所望のｃＤＮＡを もプラスミド内に挿入することを容易にする独自の制限が存在するはずである。

そこで、所望の遺伝子を含有するプラスミドがクローン化された後、ポリアデニ ル化領域において切断することにより直線化されかつｍＲＮＡ転写物を形成する ため生体外で転写される。これら転写物は好ましくは例５て示されるような５′ キヤツプを設けられる。代替的には、５′キヤツプを必要としないＥＭＣ等の５ ′非翻訳配列が使用され得る。

上記かｍＲＮＡを準備するための好ましい方法を表わしている一方、当業者には 多くの代替的方法がまた存在することは明らかとなるであろう。たとえば、ｍＲ ＮＡは商業的に入手可能なヌクレオチド合成装置により準備され得る。

代替的には、環状形式のｍＲＮＡが準備され得る。抗エキソヌクレアーゼＲＮＡ たとえば環状ｍＲＮＡ、化学的にブロックされたｍＲＮＡおよび５′キヤツプを 有するｍＲＮＡ等か好ましく、というのはそれらか先庄りにおいてより長い半減 期を有しているからである。

特に、１つの好まれるｍＲＮＡとしては興味の遺伝子がポリオのウィルスの５′ 非翻訳領域によって先行される自己環状化ｍＲＮＡである。環状ｍＲＮＡか極度 に長い半減期を育しくＨａｒｌａｎｄ　＆　Ｍｉｓｈｅｒ、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ　１０２　：　８３７−８５２（１９８８乃かつポリオのウィルス５′非 翻訳領域が通常の５′キヤツプなしでｍＲＮＡの翻訳を促進することができる（ Ｐｅ１１ｅｔｉｅｒ　＆　Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３４　： 　３２０−３２５（１９８８）ここに引用により援用する）ことが実証されてい る。

この材料は、自己スプライシングであり、かつ環状の「ラリアットＪ　ｍＲＮＡ を発生するＤＮＡテンプレートから、Ｂｅｅｎ　＆　Ｃｅｃｈ、　Ｃｅ１ｌ　４ ７：　２０６−２１６　（１９８６）（ここに引用により援用する）の方法を利 用して調製され得る。我々は、このテンプレートをＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ−ｅ ｔ　ａｌ　−ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮ［ＮＧ　：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲ Ｙ　ＭＡＮＵＡＬ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒ ｋ（１９８２）の方法に従い、興味の遺伝子のすぐ上流のポリオウィルスの５′ 非翻訳領域を含めることにより修飾した。

加えて、本件発明はＲＮＡ５ｅによるアクセスを防止する目的で５′および／ま たは３′末端で化学的にブロックされたｍＲＮＡの使用を含む。（この酵素はエ キソヌクレアーゼでありかつしたがって鎖の真ん中でＲＮＡを分割することはな い）。このような化学的ブロックにより先庄貴でのＲＮＡの半減期を実質的に延 ばすことは可能である。

ＲＮＡを修飾するために使用され得る２つの因子がＣ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ ａ　から入手可能であり、これらはＣ２Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　（カタ ログ番号５２０４−１）と、Ａｍ１ｎｏ−７−ｄＵＴＰ　（カタログ番号Ｋ１０ ２２−１）である。これらの材料はＲＮＡに反応性の基を付加する。これらの因 子のうちいずれかを興味のＲＮＡ分子に導入した後、適切な反応性の置換基が製 造者の指示に従いＲＮＡに連結され得る。十分な大きさを有する基を付加するこ とによりＲＮＡ５ｅによる化学的に修飾されたＲＮＡへのアクセスが防止され得 る。

一過性の遺伝子治療 過去に提案された遺伝子治療と異なり、本件発明の１つの主要な有利点は、細胞 におけるポリヌクレオチドの合成か一過性の性質のものである点である。（我々 はこれを可逆遺伝子治療またはＴＧＴと呼ぶ）。本件発明に従いｍＲＮＡを導入 すると、その効果は一般的には約１日持続することになる。また過去に提案され た遺伝子治療と対照をなす点としては、ｍＲＮＡがタンパク質の合成を命令する ために核を突き抜ける必要がない点であり、したがってｍＲＮＡが遺伝子的性質 を有している必要がない。

しかしながら、幾つかの状況においては、宿主の生体のゲノム内へ外因的ポリ核 酸を組込むことなしに効果がより持続することが所望される。このような効果を 奏するためには、本件発明の好ましい実施例は細胞内へ特異的ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列を導入するステップを設ける。我々か発見したところによる と、この発明の方法に従えば、非複製型ＤＮＡ配列は細胞内に導入され所望のポ リペプチドを約６カ月までの期間にわｉこって生成することが可能でかつ我々の 観察ではＤＮＡ配列が細胞のゲノムに統合されていることを示す証拠は発見され ていない。代替的には、さらに長い効果が内部にＤＮＡ配列を挿入されたベクタ ープラスミドにより細胞内にＤＮＡ配列を導入することにより達成され得る。好 ましくは、プラスミドはさらにレプリケータを含む。このようなプラスミドは当 業者には周知であり、たとえば、レプリケータｐＭＢＩを有するプラスミドｐＢ Ｒ３２２またはレプリケータＣｏ１Ｅ１を存するプラスミドｐＭＫ１６がそれで ある。（Ａｕｓｕｂｅｌ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄＳｏｎｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）　＠　Ｉｆ　：　１．５．２゜例１および１ ３に記載されるような筋肉細胞内へ導入されるＤＮＡおよびｍＲＮＡの発現の過 程の研究結果から、ＤＮＡ発現よりも持続時間は短いが、ｍＲＮＡの発現はより 急速であることが示された。迅速でかつ長く持続する遺伝子の発現は、ＤＮＡと 、たとえばファージポリメラーゼＴ７、Ｔ３およびＳＰ６などのＲＮＡポリメラ ーゼとを含むリポソームの調製物を細胞内に投与することにより達成され得る。

リポソームもまた実際の酵素自体を含むかまたは代替的にはその酵素をコードす るｍＲＮＡのいずれかを含むことにより適切なＲＮＡポリメラーゼの開始源を含 む。

リポソームが生体内に導入される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの開始 源が細胞へ運搬される。ＲＮＡポリメラーゼは導入されたＤＮＡ上のプロモータ を認識して双方の遺伝子を転写し、結果としてより多くのＲＮＡポリメラーゼお よび所望のポリペプチドを含む翻訳生産物を生じることになる。これらの材料の 生産は、導入されたＤＮＡ（通常プラスミドの形態である）か分解するまで継続 する。

この態様で、生体内での所望のポリペプチドの生産が２〜３時間で達成されかつ １力月またはそれ以上の期間にわたって継続され得る。

遺伝子疾病の治療に限定されているわけではないが、本件発明の方法はしたがっ て失なわれたまたは欠陥のある遺伝子の運搬および機能的発現を要する治療対策 に適切に適用され得る。

ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、膵臓、骨髄、胸腺、心臓、リン パ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、塞丸、卵巣、子宮、直腸、神 経系、目、腺および結合組織の組織を含む動物の身体の組織の間質的空間に運搬 され得る。組織の間質的空間とは、生体組織の網状繊維、血管もしくはチャンバ ーの壁の弾性繊維の間の細胞間の、体液の、ムコ多糖マトリクス、または筋肉細 胞を収める結合組織内のまたは骨小腔の同様のマトリクスを含む。これは循環の プラズマおよびリンパ管チャネルのリンパ流体により占められる空間である。筋 肉組織の間質的空間への運搬は以下の理由により好まれる。これら細胞を含む組 織への注射により都合よく運搬され得る。それらは好ましくは分化した持続して 非分裂細胞へ運搬されかつそれらにおいて発現されるが、運搬および発現は非分 化されたまたはより不完全に分化した細胞、たとえば血液の幹細胞または皮膚の 繊維芽細胞において達成され得る。我々の発見によれば、生体内の筋肉細胞は特 にポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現する能力に優れている。この能力は 、多核細胞、筋小胞体および横行管状システムを含む、筋肉の単独の組織構造に 起因するものかもしれない。ポリヌクレオチドは横行管状システムを介し筋肉に 侵入することか可能で、このシステムは細胞外体液を含みかつ筋肉細胞の奥深く 延びる。ポリヌクレオチドか損傷を受けた筋肉細胞に侵入しそれからその細胞が 回復するということも可能である。

筋肉もまた数多くの治療上の適用におけるポリヌクレオチドの運搬および発現の ための場所として有利に使用され得る、というのも動物は比例した大きな筋肉の 量を有しており、それは皮膚を介する直接的注射により都合よくアクセスされ、 この理由から比較的多量のポリヌクレオチドが複数回の注射により筋肉に与えら れることが可能で、長期間にわたって治療を延長するために繰返し注射を行なう ことが簡単に達成されかつ特別の熟練または装置なしに安全に執り行なわれ得る 。

一般的な対策の一環としてポリヌクレオチドを注射しかつ発現させるための場所 として筋肉組織を使用することが可能で、これは典型的なやり方でありかつ消耗 的なものではない。第１に、欠陥のあるまたは欠損のある遺伝子生産物に関連す る筋肉の障害は非分泌遺伝子生産物をコードするポリヌクレオチドを疾病のある 筋肉組織内に導入することにより治療され得る。第２の対策としては遺伝子生産 物の欠如による他の生体または組織の障害およびその結果としての循環する毒性 代謝物の蓄積は、非分泌遺伝子生産物が発現されかつ循環する代謝物を浄化する 筋肉組織内に特異的な治療用のポリペプチドを導入することにより治療され得る 。第３の対策としては、分泌可能な治療用のポリペプチドをコードするポリヌク レオチドが、ポリペプチドが循環系に放出され代謝物の標的を探す場所から筋肉 組織内に注射され得る。この使用は例１８の、筋肉内へ注射された成長ホルモン 遺伝子の発現において示される。ある種のＤＮＡセグメントは分泌を命令する「 信号」としての役割を果たすことが知られており、（Ｗｉｃｋｎｅｒ、　Ｌ　Ｔ 、　ａｎｄ　Ｈ。

Ｆ、　Ｌｏｄｉｓｈ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　４００−４０７　（１９ ８５）、かつこれらは有利に使用され得る。最後に、免疫処置の対策としては、 筋肉細胞は免疫原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを注射されてもよく、 かつこれらのペプチドが免疫原に対し選択された免疫反応を誘因する主要組織適 合複合体の抗原のコンテキストにおいて筋肉細胞により提示されることになる。

筋肉以外および注射されたポリヌクレオチドをより非効率的に取込みかつ発現さ せる他の組織は、それでも治療用のポリペプチドまたはある種の条件のポリヌク レオチドを生産するための注射場所として有利に使用され得る。そのような条件 の１つが、特異的タイプ、たとえばコレステロールホメオスタシスと関連する肝 細胞の細胞表面受容体等の特異的形態の細胞と関連して提供されなければ有効で ないポリペプチドを提供するポリヌクレオチドの使用である（Ｂｒｏｗｎ　ａｎ ｄ　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　：　３４−４７　（１９８ ６））　。

この適用においてかつたとえば酵素またはホルモンか遺伝子生産物であるような 場合の多（の他の適用においては、貴重な治療の結果をもたらすために、高いレ ベルの発現を達成する必要がない。

ＴＧＴの１つの応用は筋ジストロフィの治療におけるものである。筋ジストロフ ィの遺伝子的根拠はちょうど解かれ始めたところである。デュシエーヌ／ベツカ ー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ／Ｂｅａｋｅｒ）筋ジストロフィに関する遺伝子は近年ク ローン化され、シストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）と呼ばれる比較的大き なタンパク質をコードする。レトロウィルスのベクターはそれほど有用ではない ようであり、なぜならそれらはシストロフィンのための比較的大きなサイズのｃ ＤＮＡ（約１３ｋｂ）を収容することができないからである。ごく最近の報告さ れた研究は筋芽細胞を移植することに集中されるが、この方策の利用性は依然と して決定されるべき状態のままである。明らかに、魅力的な方策はデュシェーヌ を有する患者の筋肉の中においてシストロフィン遺伝子を直接発現することであ るだろう。はとんどの患者が呼吸不全で死ぬので、呼吸に関与する筋肉が第１の 目標になるであろう。

別の応用は嚢胞性線維病の治療においてである。嚢胞性線維病に対する遺伝子が 最近確認された（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、　Ｐ。

１９８９）　；　Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ、Ｔ、ｅｔａｌ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２６１（５）　：　２８−３０（＋９８９）。徴候の著し い改善は適当な肺細胞内の機能不全性タンパク質の発現によって達成可能である はずである。気管支の上皮の細胞は適当な目標の肺細胞であると仮定され、かつ それらは遺伝子の肺への点滴注入に続く遺伝子移植に利用しやすいであろう。嚢 胞性線維病は常染色体の劣性障害であるので、肺の徴候を著しく改善するために は嚢胞性線維病遺伝子産物の通常のレベルのたったの約５％だけを達成すること が必要であろう。

中間代謝の生化学的遺伝子欠陥もまたＴＧＴによって治療され得る。これらの病 気はフェニルケトン尿症、ガラクトース血症、カエデシロップ病、ホモシスチン 尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、およびアデノシンデアミナーゼ 欠乏症を含む。これらの障害のほとんどにおける病気の病因は、循環毒性代謝物 のフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のモデルに適合する。すなわち、酵素ブロック ゆえに、体に対して毒性のある生化合物か体液内に蓄積される。これらの障害は 多数の理由から遺伝子療法に理想的である。第一に、患者が著しく改善するため 、循環毒性代謝を顕著に十分に取除くために酵素活性の通常のレベルのたった５ ％だけを、達成すればよいと考えられる。第二に、移植された遺伝子は様々な組 織において最もよく発現され得るであろうし、かつまた毒性半化合物を取除くこ とができるであろう。

可逆的遺伝子療法もまた、細胞室内または核内のタンパク質発現を必要とする治 療対策において使用され得る。幾つかのタンパク質は核ＤＮＡにおける特異的プ ロモータ領域に結合することによって転写を制御することかできるということが 知られている。他のタンパク質はＲＮＡに結合し、その減成、核からの輸送、ま たは翻訳能率を制御する。

このクラスのタンパク質は活性のために細胞内に運搬されねばならない。組換転 写または翻訳制御のタンパク質の細胞外の運搬は生物学的活性を有すると予期さ れないであろうが、しかしＴＧＴによるＤＮＡまたはＲＮＡの機能的運搬は活性 であるであろう。ＴＧＴから恩恵を被るであろうこの型の代表的なタンパク質は ＮＥＦ、ＴＡＴ、ステロイド受容体および網膜様の受容体を含む。

遺伝子療法はＡＩＤＳ患者のＨＩＶ感染に対する抵抗を増加するための対策にお いて使用され得る。ＡＩＤＳ抵抗遺伝子、たとえば、ＮＥＦ遺伝子または溶解性 ＣＤ４遺伝子のような発芽を防ぐものをＡＩＤＳ患者のＴ細胞に導入することに より、その患者のＴ細胞はそれほど活性ＡＩＤＳウィルスを生産することができ なくなるであろうし、こうして免疫系の細胞を節約し、Ｔ細胞依存免疫応答を装 備する能力を改善する。こうして、この発明に従って、ＡＩＤＳ患者自身のＴ細 胞の集団は患者の血液から分離される。

これらの細胞は、次に生体外でトランスフェクトされ、かつそれから患者の血液 内に再導入される。ウィルス抵抗細胞は通常の細胞に対して選択的な利点を有し 、かつ結局、患者のリンパ系を再増殖する。マクロファージまたは他の標的細胞 に対するＤＮＡの系統的運搬は、体外の治療対策に加えて使用され得る。この対 策はマクロファージ保存者においてウィルスを全滅させることは予期されないで あろうが、それはＴ細胞のレベルを増加し、かつ患者の免疫応答を改善する。

ここに示された系統的対策のすべてにおいて、効果的なりＮＡまたはｍＲＮＡ投 与量は、通常、約０．０５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲で、通常的０ ．００５−５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇであるだろう。しかしながら、理解されるで あろうように、この投与量はＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードされるペプチ ドおよび使用される特定のペプチドの活性に従って当業者には明白な態様で変化 するであろう。

アデノシンデアミナーゼのマウスまたはヒトへの運搬のためには、たとえば、翻 訳の適当なレベルは約０．５ないし５ｍｇ／ｋｇのＤＮＡまたはｍ　ＲＮ　Ａの 投与量で達成される。例１０を参照されたい。この情報から、知られた活性の他 のペプチドに対する投与量が容易に決定され得る。

重要なタンパク質の欠乏に起因する病気は、これらのタンパク質をコードするＤ ＮＡまたはｍＲＮＡを分化した細胞に導入することによって適当に治療されても よい。神経成長因子および繊維芽細胞成長因子のような様々な成長因子かアルツ ハイマー病の動物モデルにおいて生存するニューロンの細胞に影響を及はすこと か示された。年をとったラットのモデルでは、ＮＧＦ注入がコリン作動のニュー ロンの損失を逆転させた。房脳弓外傷のラットにおいては、遺伝子的に修飾され た線維芽細胞からのＮＧＦ注大または分泌もまたコリン作動性の機能の損失を防 いだ。コリン作動性活性はアルツハイマー病を有する患者において減少する。成 長因子を発現する導入された遺伝子の脳内での発現は特異ニューロンの群の機能 の損失を逆転することができた。

アルツハイマー病の治療におけるこの発明に従い、ニューロン成長因子のための 遺伝子の、頭蓋腔に沿って並ぶ細胞へのトランスフェクションによるＤＮＡまた はｍＲＮＡの導入が使用され得る。特に、この発明は三次元挿入装置の使用を介 する実質組織の中への約ＩＯμｇないし約１００μｇのＤＮＡまたはｍＲＮＡの 頭蓋内注射によってこの病気を治療する。具体的には、注射は中央の隔壁におけ るコリン作動性ニューロンを目標にされる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ注射は、５′ キヤツプされた３′ポリアデニル化ｍＲＮＡについて１日ないし３日置きに、か つ環状ｍＲＮＡについて１週間ないし２１日置きに、かつＤＮＡについて３０日 ないし６０日置きに繰返される。この発明に従ってＤＮＡの注射もまた意図され る。ＤＮＡは対応する量で注射されるが、しかし、注射の頻度は非常に減少され るであろう。エビソームのＤＮＡは、たとえば、数カ月にわたり活性であり得る だろうし、かつ再注射は患者による著しい後退のときに必要にすぎないであろう 。

さらに、神経伝達物質合成に対して責任のある酵素か導入された遺伝子から発現 され得る。たとえば、アセチルコリントランスフエラーセに対する遺伝子が特定 領域の脳細胞にニューロンまたはダリア）内に、アセチルコリンレベルを増しか つ脳機能を改善するために発現され得るであろう。

ドーパミン、ノルエピネフリン、およびＧＡＢＡのような他の神経伝達物質の合 成に関わる重大な酵素はクローン化されかつ入手可能である。重大な酵素は、脳 の局部的に集中された領域の中への遺伝子移植によって局部的に増加され得るで あろう。これらおよびその他の神経伝達物質の増加された生産は、局部的に集中 された神経伝達物質機能の操作に、かつこうして妨害された神経伝達物質機能が 重大な役目を果たす広い範囲の脳の病気に広く関連するであろう。具体的には、 これらの病気は、精神分裂症および燥営病およびパーキンソン病を含むことがで きるであろう。

パーキンソン病を有する患者は、脳幹神経節内におけるドーパミン合成物の欠如 ゆえの次第に無能化する運動性割面に苦しむということはよく認められているこ とである。ドーパミン合成のための律速段階は、酵素、チロシンヒドロキシラー ゼによるチロシンからＬ−ＤＯＰＡへの変換である。Ｌ−ＤＯＰＡは、それから 混存酵素、ＤＯＰＡデカルポキシラーセによってドーパミンに変換される。それ ゆえＬ−ＤＯＰＡでの定着した療法は効果的である（少なくとも最初の数年の治 療のためには）。遺伝子療法は、チロシンヒドロキシラーゼおよび恐ら＜ＤＯＰ Ａデカルポキシラーセに対する遺伝子を発現することによって同様の薬理学目的 を達成することができるであろう。チロシンはＣＮＳ内で容易に利用可能である 。

アルファーｌ−抗トリプシン欠乏の遺伝子型か肝臓および肺疾患のどちらの結果 ももたらし得る。肝臓疾患は、それほとよく起こらないが、異常タンパク質の蓄 積によって引起こされ、かつ遺伝子療法にそれほど馴染みやすくはないだろう。

しかしながら、肺合併病は、肺内のアルファー１−抗トリプシンの増加した発現 に馴染みやすいであろう。

これは無能化しかつ最終的には致命的な気腫が発展するのを妨げるはずである。

アルファー１−抗トリプシン欠乏はまたタバコ喫煙者においても起こり、なぜな らタバコ喫煙がアルファー１−抗トリプシン活性を減少し、かつこうして気腫に 導くセリンプロテアーゼ活性を減少する。さらに、ある最近のデータはタバコ喫 煙の抗トリプシン効果を大動脈の動脈瘤に結びつける。動脈瘤もまた、アルファ ーｌ−抗トリプシンの血液レベルを上昇することによって防ぐことかでき、なぜ ならこれが動脈瘤を導くプロテアーゼ活性を減少するであろうからである。

肺の変性疾患を有する患者もまた、疾患の肺組織において蓄積する傾向がある他 の毒性代謝物を取除くことができる酵素の発現から利益を得ることができる。ス ーパーオキシドジスムターセおよびカタラーゼはこれらの問題を改善するために ＴＧＴによって運搬されることかできるであろう。

ＴＧＴは細胞表面受容体の運搬を必要とする治療対策において使用され得る。遺 伝子の機能的な生体内運搬のための原理体系を解読する必要がないということが 議論され得るであろう。結局、合成およびタンパク質の大規模生産のための確立 された技術があり、タンパク質は遺伝子発現の最終結果である。この論理は多く のタンパク質分子に適用され、それらは細胞外で作用するか、または組織プラス ミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、成長ホルモン、インシュリン、インターフェ ロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（０ＭＣ３Ｆ）、エリスロポエチ ン（ＥＰ○）などのような細胞表面受容体と相互作用する。しかしながら、機能 的受容体のための適当な配向でその標的細胞のプラズマ膜に挿入されるべき組換 細胞表面受容体を適切に運搬することに関する薬剤運搬の問題は今まで手に負え ないもののよってあった。

細胞表面受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡがこの発明に従って細胞内に運 搬されるとき、起因したタンパク質か効果的にかつ機能的に標的細胞表面上に発 現され得る。

組換細胞表面受容体の機能的な運搬の問題か処理しにくいままであるならば、こ の療法様式に取り組む唯一の方法は遺伝子運搬を介してであるであろう。遺伝子 発現の核または細胞質制御のための同様の論理が、ＲＮＡ転写を制御する（増加 または減少）ためにＤＮＡに結合された核制御因子および翻訳効率または減成を 増加または減少させるためにＲＮＡに結合される細胞質制御因子に適用される。

この態様でＴＧＴは嚢胞性線維病、筋ジストロフィおよび高コレステロール血症 の治療のための療法対策を提供することができるであろう。

血液におけるコレステロールの上昇したレベルは、この発明に従いＬＤＬ表面受 容体をコードするｍＲＮＡを肝細胞に供給することによって減少され得る。上昇 したＬＤＬを有する患者の肝臓内のこの受容体の生産における僅少な上昇は著し い療法上の利益を有する。組換タンパク質の系統的な投与に基づく療法はこの発 明と競合することはできず、なぜならただ単に組換タンパク質を投与することは 標的細胞のプラズマ膜の中に受容体を入れることができないであろうからである 。受容体はその生物学的効果を及ぼすために膜の中に適切に挿入されなければな らない。受容体発現のレベルを規制することは通常必ずしも必要ではないが、よ り多くの発現があるとより良い。これは、この発明における使用のためのｍＲＮ Ａの調製に関わる分子生物学を単純化する。たとえば、ＬＤＬ受容体遺伝子を含 む脂質／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合物は調製され、反復的な１．Ｖ。

注射によって患者に供給され得る。脂質複合物は肝臓によって主として摂取され るであろう。複合物の幾つかは肝細胞によって摂取されるであろう。肝臓におけ るＬＤＬ受容体のレベルは注射の回数か増えるにつれ次第に増加するであろう。

より高い肝臓ＬＤＬ受容体レベルはＬＤＬおよびコレステロールの療法の低下を 導くであろう。効果的なｍＲＮＡ服用量は、通常、約０．　１ないし約５ｍｇ／ ｋｇになるであろう。

ＴＧＴの他の有益な応用の例は、ＨＩＶウィルスで感染した患者のマクロファー ジにチミジンキナーゼ遺伝子を導入することを含む。チミジンキナーゼ遺伝子の マクロファージ貯蔵器への導入は、それらの細胞がＡＺＴをリン酸化することを より可能にするであろう。これは、それらのＡＺＴ療法に対する抵抗を克服し、 ＡＺＴがマクロファージにおけるＨＩＶ保育体を全滅することができるようにす る傾向にある。チミジンキナーゼ遺伝子を含む脂質／ＤＮＡ複合物が調製され、 かつ反復静脈注射を介して患者に投与され得る。脂質複合体はマクロファージ貯 蔵器によって主に摂取され、マクロファージにおけるチミジンキナーゼの上昇さ れたレベルをもたらすであろう。これは、ＡＺＴ抵抗細胞がＡＺＴでの治療を受 けやすくする。チミジンキナーゼ療法はまた、ＨＴＬＶ　ＩＩＩプロモータの制 御の下にチミジンキナーゼ遺伝子をおくことによっても集中され得る。この対策 に従い、チミジンキナーゼはＨＩＶウィルスによる細胞の感染およびプロモータ を活性化する１見エタンバク質の製造において合成されるにすぎないであろう。

類縁の療法は同じＨＴＬＶ　ＩＩＩプロモータの制御下でジフテリアトキシンに 対する遺伝子を細胞に供給し、致命的な結果はＨＩＶ感染の後にのみ細胞内に起 こるであろう。

これらのＡＩＤＳ患者は、ＴＧＴ法に従ってマクロファージにインターフェロン 遺伝子を供給することによってもまた治療され得るであろう。マクロファージに おいて局部的に集中したインターフェロン生産の増加したレベルは、それがＨＩ Ｖ感染の結果に対してより抵抗性があるようにすることができるであろう。イン ターフェロンの局部的なレベルが高い間は、全体の系統的なレベルは低いままで あり、それにより組換インターフェロン投与後に観察されるような全身性の毒性 効果を避けるであろう。インターフェロン遺伝子を含む脂質／ＤＮＡまたはＲＮ Ａ複合物は、調製され、かつ反復静脈注射により患者に投与され得る。脂質複合 物はマクロファージ貯蔵器によって主に採取され、マクロファージにおけるイン ターフェロンの局部的に集中した上昇したレベルの結果をもたらすであろう。こ れは、それらがＨＩＶ感染に対してそれほど感染しやすくないようにするであろ う。

ＤＮＡテンプレート上のジフテリアトキシン遺伝子に癌細胞内の遺伝子の発現を 集中させるために組織特異的エンハンサを供給することにより、ＴＧＴを使用し て様々な癌か治療され得る。ジフテリアトキシンの細胞内発現は細胞を殺す。こ れらのプロモータは膵臓癌のための膵臓特異的プロモータを使用するような組織 特異的なものであるだろう。膵臓細胞に運搬された機能的ジフテリアトキシン遺 伝子は膵臓全体を全滅させ得るだろう。この対策は膵臓癌患者のための治療とし て使用し得るであろう。患者は膵臓なしで生存するのに克服できないような困難 を伴うことはないだろう。組織特異的エンハンサは、ジフテリアトキシンの発現 が膵臓細胞において起きるにすぎないであろうことを確かにするであろう。組織 特異的エンハンサの制御下でジフテリアトキシン遺伝子を含むＤＮＡ／脂質複合 物はカニユーレ挿入された膵臓に注ぎ込む動脈の中に直接導入されるであろう。

注入は膵臓組織を全滅するのに必要である限りの間、ある服用計画に基づき起こ るであろう。リシンまたはコブラの毒液因子またはエンテロトキシンに対する遺 伝子のようなジフテリアトキシン以゛外の他の致命的な遺伝子が同様の効果で用 いられるであろう。

また、癌細胞のような迅速に循環する（分裂する）細胞だけを殺すであろう細胞 周期特異的なプロモータを使用することによって癌を治療することもできるであ ろう。細胞周期特異的な抹殺はまた循環する細胞においてのみ安定しているキラ ータンパク質（たとえば、８期の間だけ安定するヒストンｍＲＮＡ）をコード化 するｍＲＮＡを設計することによってもまた達成されるであろう。また、胎児の 肝臓細胞において、かつより胎児の状態へ脱分化した胚芽腫細胞においてのみ発 現されるアルファーフェトプロティンの使用のような発生上特異的なプロモータ を使用することもてきるであろう。

ある種の癌の癌特性を抑制する網膜芽腫遺伝子（およびその仲間の他のもの）の ような遺伝子の移植によって特殊化された癌もまた治療することができるであろ う。

ＴＧＴ対策はペプチドの制御され持続される運搬を提供するために使用され得る 。従来の薬剤および組換タンパク質薬剤は制御された放出装置から利益を得るこ とができる。

制御された放出装置の目的はより長い期間にわたり薬剤を運搬することであり、 そのため必要とされる服用の数が減少される。これは、患者の便利さおよび服従 における改善の結果をもたらす。制御された放出を達成することを意図された様 々な種類の技術が現われている。

ＴＧＴは療法のペプチドの制御された運搬を得るために使用され得る。制御され た発現は細胞特異的プロモータを含む適当なプロモータを使用することによって 得られ得る。

この発明によって運搬される適当なペプチドは、たとえば、成長ホルモン、イン シュリン、インターロイキン、インターフェロン、０ＭＣ３Ｆ、ＥＰＯｌおよび 同様のものを含む。特定の応用に依存して、ＤＮＡまたは選択されたＲＮＡ構成 物が、注射された細胞から、かつ系統的循環の中に、分泌される遺伝子生産物を 結果としてもたらすように設計され得る。

ＴＧＴはまた、治療上のポリペプチドまたはペプチドの制御された運搬を含み、 それは細胞において発現されるべきポリヌクレオチドと共に、転写および翻訳の プロセスを制御する制御タンパク質をコードする付加的なポリヌクレオチドを含 むことによって達成される。これらのポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現を 促進制御または抑制制御のどちらかをするように作用し、かつ核内においてかま たは細胞質内におけるタンパク質翻訳事象を制御することによってのどちらかで それらの効果を及ぼすものを含む。

Ｔ７ボリメラーゼ遺伝子は、ＴＧＴのより長い持続期間の効果を得るために関心 のある遺伝子に関連して使用され得る。エプスタインパールウィルスに対する複 製領域の超厚から得られるようなエピソームのＤＮＡが、哺乳類細胞において機 能的に活性であり、かつ好ましくはヒトの細胞において活性である、他の複製超 厚からのものとともに使用され得る。これは、レトロウィルスベクターに共通で ある好ましくない統合事象の危険を冒すことなく、多くの細胞分裂の後、細胞か ら発現を得る方法である。カルシトニンの制御された放出は、それ自身のプロモ ータ制御下のカルシトニン遺伝子が肝臓または皮膚のようなある部位の中に機能 的に導入され得るのであれば、得られ得るであろう。

高カルシウム血症を有する癌患者はこの療法が適用され得るグループであるだろ う。

ＴＧＴを使用する他の遺伝子療法は、ポリペプチドに翻訳されることな（、療法 の効果を有するポリヌクレオチドの使用を含むことができる。たとえば、ＴＧＴ は特定の遺伝子の発現を止めるためのアンチセンスポリヌクレオチドの運搬にお いて使用され得る。従来のアンチセンス方法論は乏しい有効性に苦しみ、それは 部分的には、運搬されたオリゴヌクレオチド配列が短すぎるからである。しかし ながら、ＴＧＴでは十分な長さのアンチセンス配列が短いオリゴマーと同様に容 易に運搬され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、内因性のヌクレオチド配 列へそれら自身が交雑する（かつそれによってその転写または翻訳を妨げる）Ｄ ＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。その代わりに、アンチセンスＤＮＡは内因性 の配列に交雑するＲＮＡをコードして、翻訳を妨げてもよい。この特質における ＴＧＴの他の使用は、その存在が病理状態を引起こす欠陥性または不完全な内因 性ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡを置き替えるためにｔＲＮＡまたはｒＲＮＡをコード 化するポリヌクレオチドを運搬することを含む。

細胞特異的プロモータは、また、標的細胞にのみ遺伝子の発現を許容するために 使用され得る。たとえば、ある遺伝子は腫瘍の特定の型においてのみ成人におい て高度にプロモートされる。同様に、特殊化された組織、たとえば、目の水晶体 組織のようなもののための組織特異的プロモータもまた確認され、かつ異種の発 現系において使用された。

記述された療法を越えて、この発明の方法は乳牛の牛乳の生産を増加するため家 畜動物に、または食肉のために育成されている動物の筋肉塊に、ポリヌクレオチ ドを運搬するために使用され得る。

ＤＮＡおよびｍＲＮＡワクチン この発明の方法に従って、発現可能なりＮＡおよびｍＲＮＡはそこでポリヌクレ オチド翻訳産物を形成するために細胞に運搬され得る。もし核酸が適切な制御配 列を含むのであれば、それらはコード化されたタンパク質の比較的多量の合成を 方向づける。細胞に運搬されたＤＮＡおよびｍＲＮＡは免疫ペプチドをコードす るとき、細胞内ウィルスを含む感染因子に対して、かつまた腫瘍細胞に対して改 善されかつより効果的な免疫を達成するためにその方法は適用され得る。

すべてのを椎動物の免疫系は同様に作用するので、記述された応用は哺乳類およ び鳥類および魚類を含むすべてのを椎動物系において実現され得る。

この発明の方法は、生体内に動物の細胞内にポリヌクレオチドを直接注射するこ とにより、またはその後動物の体内に再導入される動物の細胞の幾つかの生体外 トランスフェクションにより適用され得る。ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳 、肺、肝臓、膵臓、または血球を含む動物の体の様々な細胞に運搬され得る。ポ リヌクレオチドの生体内での直接的運搬は筋肉または皮膚の細胞に対するものか 好ましい。ポリヌクレオチドは注射器を使用して筋肉または皮膚に注射されても よい。それらはまたワクチンガンを使用して筋肉または皮膚に運搬されてもよい 。

ある応用において、特に生体外のトランスフェクションでカチオン性脂質が細胞 のトランスフェクションを容易にするために使用され得ることが最近示されてき た。カチオン性脂質に基づくトランスフェクション技術は、他の方法より好まし く、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはエレクトロポレーション（ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法より能率的でかつ便利であり、かつ前述の ように、レトロウィルス仲介のトランスフェクションはオンコジーン活性化の結 果または他の不所望な結果をもたらすホスト細胞ゲノムにおける統合事象に通じ 得る。カチオン性脂質技術がメツセンジャーＲＮＡで動くという知識は、この方 策に対するさらに他の利点であり、なぜならＲＮＡは細胞内ヌクレアーゼにより 迅速に変換され、かつホストゲノムに統合されないからである。可逆性発現の高 レベルの結果をもたらすトランスフェクションシステムは、安定した変形された クローンの選択および拡大を必要とする代替の方法論より好ましく、なぜなら望 ましい第１の標的細胞の多くは培養液の中で迅速に分裂しないからである。

細胞を高能率にカチオン性リポソームでトランスフェクトする能力は免疫化のた めの代替の方法を提供する。抗原のための遺伝子が動物から取出された細胞に導 入される。

今、抗原を発現するトランスフェクトされた細胞は、免疫系が（今）内因性抗原 に応答し得る動物の中に再注入される。このプロセスは、リンパ細胞をさらに刺 激するため、アジュバントまたはリンフ才力インのどちらかの同時注射により恐 らく高められ得る。

抗原のための遺伝子を含む核酸でのワクチン処置もまた、細胞の免疫応答を特に 目標にする方法を提供し得る。分泌されるタンパク質を発現する細胞は、通常の 抗原処理経路に入り、かつ体液と細胞毒性の応答の両方を生ずるであろう。分泌 されないタンパク質に対する応答はより選択的である。クラスＩ　ＭＨＣ分子だ けを発現する細胞において合成された分泌されないタンパク質は、細胞毒性のワ クチンのみを生産することが予期される。クラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方 を有する細胞における同じ抗原の発現は、細胞毒性およびヘルパＴ細胞の両方を 刺激することにより、より強力な応答を生じ得る。免疫応答の強化はまた、抗原 のための遺伝子を抗原のペプチドフラグメントと共に注入することによって可能 であり得る。抗原は細胞の免疫系にクラスＩ　ＭＨＣ分子を介して与えられ、一 方ペプチドはヘルバＴ細胞を刺激するためにクラスＩＩＭＭＣ分子を介して与え られる。いずれかの場合でも、この方法は以前可能でなかった方法で免疫応答を 刺激しかつ変調する方法を提供する。

サブユニットワクチンの主たる不利は、糖タンパク抗原は抗原を作るために使用 される組換発現系において正確に修飾されることかほとんどないということであ る。糖タンパク質抗原のための遺伝子を導入することは、タンパク質生産物か病 原体タンパク質がされるであろうのと同じ種および細胞において合成され、修飾 されかつ処理されるということを保証するであろう。こうして、ヒトウィルス糖 タンパク質のための遺伝子の発現は、糖残基の正しい補体を含むであろう。これ は重要であり、なぜなら幾つかのウィルス系における中性化抗体の本質的な成分 が炭水化物エピトープに向けられるということが示されているからである。

免疫応答としての候補であるどの適当な抗原も、体液のものであろうと細胞のも のであろうと、核酸形状において使用され得る。細胞の源はクラスＩ　ＭＨＣ分 子のみを発現する細胞の便利な源を提供する個々から取られた繊維芽細胞であり 得る。その代わりに、クラスＩおよびクラス■Ｉ　ＭＨＣタンパク質の両方を含 む細胞の源を提供するために周辺血球が迅速に全血から分離され得る。それらは さらに、もし所望されれば、Ｂ細胞、ヘルパＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞またはマク ロファージ／単球細胞に分別される。

骨髄細胞はそれほと分化されていないリンパ細胞の源を提供し得る。すべての場 合において、細胞は抗原のための遺伝子を含むＤＮＡでか、またはその遺伝子ま たは環状ＲＮＡから転写された適当にキャップされかつポリアデニル化されたｍ ＲＮＡ、化学的に修飾されたＲＮＡ、または５′キャッピングを必要としないＲ ＮＡによってかのどちらかでトランスフェクトされるであろう。トランスフエフ １へするヌクレオチドの選択は所望される発現の持続期間に依存し得る。ワクチ ン接種の目的のためには、ｍＲＮＡ、トランスフェクションにおいて起きるよう に、免疫原性ペプチドの可逆的発現が好ましい。トランスフェクトされた細胞は 動物に注射され、かつ発現されたタンパク質は処理され、かつ通常の細胞の経路 により免疫系に与えられる。

このような方策はマウスにおけるモデル系において細胞毒性免疫を生ずるために 使用されてきた。細胞株９悪性持続性成長細胞はＤＮＡで安定して形質転換され 得る。細胞が動物に注射されたとき、それらは発現された抗原に対する細胞の免 疫を誘導する。カチオン性脂質配達システムは、この方策が患者から取られた通 常の悪性でない細胞にまでこの方策を拡張することを許容するであろう。

細胞免疫を目標とするこの方策に対する幾つかの応用かある。第１のものは、ウ ィルスに対抗するワクチン接種であり、抗体が必要とされ、またはウィルス感染 を強化することが知られている。ここで適用し得る２つの対策がある。

免疫化の間、細胞経路を特に目標とし、こうして強化抗原を除去する。その代わ りとして、感染性を強化する体液性エビドームを排除する切断された抗原のため の遺伝子でワクチン接種することかできる。

ＤＮＡまたはｍＲＮＡワクチン療法の使用は、弱い抗原腫瘍に対する効果的な細 胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する手段を同様に提供することかできるであろう。我々 は、たとえば、もし細胞の内側で既に処理された型でｍＲＮＡによって腫瘍特異 的抗原か発現され、かつ細胞表面上においてクラス１分子の中に直接組込まれる ならば、細胞毒性Ｔ細胞応答が引出されるであろうことを提案する。

第２の応用は、この方策が潜在性のウィルス感染を治療するための方法を提供す るということである。幾つかのウィルス（たとえば、Ｂ型肝炎、ＨＩＶおよびヘ ルペスウィルス群の成員）か、ウィルスが細胞内で非活性または部分的に活性な 型で維持される潜在性感染を確立し得る。このような感染を治療する方法はほと んどない。しかしながら、潜在性ウィルスタンパク質に対抗する細胞溶解の免疫 を誘導することによって、潜在的に感染された細胞は標的とされかつ除去される であろう。

この方策の関連のある応用は、慢性の病原感染の治療に対してである。ゆっくり 複製され、かつ細胞から細胞へ直接法がる病原の多数の例がある。これらの感染 は慢性であり、幾つかの場合は数年または数十年続く。これらの例は緩慢なウィ ルス（たとえばビスナ）、スクラビー因子およびＨＩＶである。病原のタンパク 質に対する細胞の応答を誘導することによって感染した細胞を除去することがで きる。

最後に、この方策は悪性の疾患の治療に対しても適用可能であり得る。悪性状態 に対して特異的であるタンパク質に対する細胞の免疫応答を開始するワクチン接 種は、もし活性化されたオンコジーン、胎児性抗原、または活性化マーカーであ れば、これらの細胞の除去を結果としてもたらすであろう。

Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ｍ　ＲＮ　Ａワクチンの使用は、このように、あるウィルスタ ンパク質および癌特異性抗原の免疫抗原性を大いに強化し、それは通常乏しい免 疫応答を引出す。ｍＲＮＡワクチン技術は、ヘルペスウィルス、非Ａ型、非Ｂ型 肝炎、およびＨＩＶからの不十分な免疫抗原性のウィルスタンパク質に対抗する 細胞毒性Ｔ細胞免疫の誘起に適用可能であるべきで、かつそれはこれらのウィル スの生体外増殖に伴う危険および困難を避けるであろう。ウィルス被覆タンパク 質のような細胞表面抗原（たとえば、ＨＩＶｇｐ１２０）には、抗原は主要組織 適合複合体（ＭＨＣ）の状況において標的細胞の表面上に発現され、それはより 適当な強力でかつ現実的な免疫応答の結果をもたらすことが予期されるであろう 。弱毒化ウィルスワクチンでしばしば観察されるより有効な免疫応答を結果とし てもたらすのはこの因子である。ＴＧＴによる単一抗原遺伝子の運搬は不適当な 弱毒化ゆえに低頻度の疾患を結果としてもたらし得る弱毒化されたウィルスより 遥かに安全である。

ワクチン開発段階の間に活用され得るＴＧＴのさらに他の利点がある。ワクチン 開発に伴う困難の１つは、最適な免疫応答のための抗原の異なった構造的変形物 をスクリーニングするという要求である。もし変形物が組換源から誘導されれば 、タンパク質は大抵は発現され、かつそれが抗原性に対して試験され得る前に純 化されねばならない。これは骨の折れ、かつ時間のかかるプロセスである。生体 外変異誘発では、所与の抗原の多数のクローンを得、かつ配列することが可能で ある。もしこれらの抗原がＴＧＴによるＤＮＡまたはＲＮＡレベルで抗原性に対 してスクリーニングされ得るならば、ワクチン開発プログラムはより早く進行さ れ得るであろう。

最後に、Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ｍ　ＲＮ　Ａワクチンの場合では、タンパク質抗原は 決して直接血清抗体に晒されないが、ｍＲＮＡの翻訳に続き、トランスフェクト された細胞自身によって常に生産される。これゆえ、アナフィラキシ−は問題で あるはずはない。こうして、この発明は患者がアレルギー反応の恐れなく、繰返 し免疫化されることを許容する。この発明のＤ　Ｎ　Ａ　／　ｍ　ＲＮ　Ａワク チンの使用はこのような免疫化を可能にする。

この技術が抗原の免疫抗原性をさらに強化するように修飾され得る態様は、容易 に想像し得る。Ｔ細胞免疫化は、マクロファージまたは他の細胞表面上のクラス ＩおよびクラスＩＩ組織適合抗原の密度を増加することによって、および／また は、リンパ球増殖をプロモートするサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を放出 するトランスフェクトされた細胞を誘発することに、よって増大さね得る。この 目的のために、抗原に対するｍ　ＲＮ　Ａを含む同じリポソームにインターフェ ロンまたはインターロイキン−１をコード化する他のｍＲＮＡ種を組込んでもよ い。これらのサイトカインはマクロファージ活性化を強化することか知られてい る。それらの全身的な使用は副作用ゆえに阻止されてきた。しかしながら、ｍＲ ＮＡに、抗原に対するｍ　ＲＮ　Ａと共に包含されるときには、ぞれらは抗原を 協同で発現する細胞によってのみ発現されるはずである。この状況下て、Ｔ細胞 免疫性の誘導は大いに強化され得る。

治療上の処方 ポリヌクレオチド塩：ここに記述された薬事的に許容可能なポリヌクレオチドの 塩の投与は、この発明の範囲内に含まれる。このような塩は有機塩基および無機 塩基を含む薬事的に許容可能な非毒性塩基から調製されてもよい。塩はナトリウ ム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、および同 様のものを含む無機塩基から誘導された。塩は、１級、２級および３級アミンの 塩、塩基性アミノ酸等を含む薬事的に許容可能な有機非毒性塩基から誘導された 。薬事的な塩についての役に立つ議論として、その開示がここに引用され援用さ れる、Ｓ、Ｍ、パージ（Ｂｅｒｇｅ　）他の薬事科学機関誌（Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　６６　：　１−１ ９．１９７７年を参照されたい。

好ましい運搬の方法である注射のためのポリヌクレオチドはアンプルで単一・の 投薬でまたは多重服用の容器で準備されてもよい。ポリヌクレオチドは、油性の または好ましくは水性の賦形剤において、懸濁液、溶液、または乳濁液のような 形で存在してもよい。その代わりとして、ポリヌクレオチド塩は、投与のときに 無菌の、パイロジエンを含まない水のような適当な賦形剤で再形成するために凍 結乾燥された形であってもよい。液体および再形成されるべき凍結乾燥された形 の両方とも、注射される溶液のｐＨを適当に調整するのに必要な量の、作用物質 、好ましくは緩衝液を含むであろう。いかなる非経日の使用のためにも、特にも し処方物が静脈に投与されるべきであれば、溶質の総濃度は製剤が等張、低張、 または弱く高張であるように制御されるべきである。糖のような非イオン材料は 、張度を調整するために好ましく、かつスクロースは特に好ましい。

これらの形のいずれもでんぷんまたは糖、グリセロールまたは塩化ナトリウム水 溶液のような適当な処方の作用物質をさらに含んでもよい。１単位の投薬毎の組 成物は、液体であろうと固体であろうと、０．１％から９９％のポリヌクレオチ ド材料を含んでもよい。

ポリヌクレオチドが使用の前に包装される単一の投薬アンプルまたは多重服用の 容器は、薬事的に効果的な服用量として適当なポリヌクレオチドを含むポリヌク レオチドまたは溶液の量、または効果的な服用量の倍数を封入する気密に封じら れた容器を含む。ポリヌクレオチドは無菌の処方物として包装され、かつ密封さ れた容器は使用まで処方物の無菌性を保つよう設計される。

ポリヌクレオチドか包装されている容器にはラベルか貼られ、かつそのラベルは 政府機関、たとえば食品医薬品局（ｔｈｅ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄ ｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって規定された形式において注意書を載せ、そ の注意書は、ヒト投与のためのその中のポリヌクレオチド材料の製造、使用、ま たは販売の連邦法（Ｆｅｄｅｒａｌ　ｌａｗ）の下でのその機関による承認の反 映である。

連邦法は、ヒトの療法における薬事的な作用物質の使用は連邦政府の機関によっ て承認されることを要求する。施行に対する責任は食品医薬品局の責任であり、 それは２１Ｕ、Ｓ、Ｃ，３０１−３９２において詳細に示されているこのような 承認を確実にするための適当な規制を公布する。

動物の組織から作られる製品を含む生物学的材料に対する規制は４２Ｕ、Ｓ、Ｃ ，２６２の下で規定される。同様の承認が大抵の外国によっても要求される。規 制は国によって違うが、個々の手続は当業者によく知られている。

投薬量および投与の方法 投与されるへき投薬量は、治療されている被験者の状態および大きさならびに治 療の頻度および投与の方法に大きく依存する。服用量および頻度を含む療法を継 続するための養生法は、最初の応答および臨床判断によって導かれてもよい。組 織の間質の空間の中への注射の非経口法か好ましいが、しかしエアロゾル処方の 吸入のような他の非経口法か、たとえば、鼻、喉、気管支組織または肺の粘膜へ のような特定の投与において必要とされるかもしれない。

好ましいプロトコルでは、水性担体における裸のポリヌクレオチドを含む処方は 、部位毎に１０μｌから約１ｍｌの量で組織に注射される。処方におけるポリヌ クレオチドの濃度は約０．１μｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌである。

ＴＧＴの制御 ＤＮＡに基づく遺伝子移植プロトコルがｍ　ＲＮ　Ａ転写を転写（プロモータ、 エンハンサ）および処理する（スプライシング信号、ポリアデニル化信号）のた めの適当な信号を要求するように、ｍＲＮＡに基づ＜ＴＧＴも、トランスフエフ されたｍ　ＲＮ　Ａの安定性を強化するであろう要素と共に、効率的でかつ正確 な翻訳のために適当な構造および配列要素を必要とする。

一般的には、翻訳効率は、ＲＮＡの５′非コーデイングまたは翻訳されていない 領域（５’　ＵＴＲ）における特異的配列要素によって制御されることが発見さ れている。正び５’７メチルｃｐｐｐａキヤツプ構造（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ　ｅｔ 　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３　：　７３７５（１９８５））を含 む。負の要素は分子内５’ＵＴＲステムループ（ｓｔｅｍ−１ｏｏｐ）構造（Ｍ ｕｅｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　４８　：　６９］（１９８７））およ びＡＵＧ配列または５’ＵＴＲにおける適当なＡＵＧによって先行される短い開 かれた読取枠（Ｋｏｚａｋ、上記、　Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏｌ　ａｎｄ　 Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　８　：　２８４（１９８８））を含む。さらに、ベータグロブリン ５’ＵＴＲのようなある配列モチーフは知られていない機構によって翻訳を強化 するように作用し得る（異種５’ＵＴＲに隣接して置かれるとき）。環境信号に 応答して真核生物の翻訳効率を制御する特定の５’ＵＴＲ配列の例もまたある。

これらは、ヒトフェリチン５　’　ＵＴＲ（Ｈｅｎｔｚｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：６７３０（１９ ８７））およびショウジヨウバエｈ　ｓ　ｐ’　０５　’　ＵＴＲ（Ｋｌｅｍｅ ｎｚ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４　：　２０５３（１９８５） ）を含む。最後に、通常のキャップ依存翻訳および翻訳制御を迂回し、かつウィ ルスまたはキメラのｍ　ＲＮ　Ａの能率的な翻訳を仲介することができるウィル ス５’ＵＴＲ配列がある（Ｄｏｌｐｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、６２　：　２０５９（１９８８））　、Ｐｅ１ｌｅｔｉｅｒ 　ａｎｄ　Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３４，３２０（１９８８））　、したがって、ＭＲＮＡに基づ （ＴＧＴプロトコルは関心のあるタンパク質に対するコード配列に隣接する適当 な５’ＵＴＲ翻訳要素を含む。

翻訳関係に加えて、ｍＲＮＡ安定性はｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルの開発 の間、考慮されねばならない。一般的な意見として、キャッピングおよび３′ポ リアデニル化は真核性ｍＲＮＡ安定性の主たる正の決定因子であり（Ｄｒｕｍｍ ｏｎｄ、上記、　Ｒｏｓｓ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　５．１　（１ ９８８））かつｍＲＮＡの５′および３′末端を分解から保護するよう機能する 。しかしながら、真核生物のｍ　ＲＮ　Ａの安定性に影響を及ぼす制御要素もま た規定に示され、かつしたかってｍＲＮＡ　ＴＧＴプロトコルの開発において考 慮されねばならない。これらのうち最も注目に値しかつ明らかに規定されたもの は、多くの短い半減期のｍＲＮＡにおいて発見されたウリジンの多い３′非翻訳 領域（３’　ＵＴＲ）デスタビライザー（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）配列であ り（Ｓｈａｗ　ａｎｄＫａｍｅｎ　Ｃｅ１ｌ　４６：６５９（１９８６））、　 けれども、それらがｍＲＮＡＲＮＡ化の結果をもたらす唯一の配列モチーフでな いという証拠がある（Ｋａｂｎｉｃｋ　ａｎｄ　Ｈｏｕｓｍａｎ、　Ｍｏ１．　 ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８　＋３２４４（１９８８））。さらに、環 境刺激に応答して細胞のｍＲＮＡ半減期を変調する特異的制御配列もまた示され た。

これらは、ビテロゲニンｍＲＮＡ安定性のエストロゲン仲介された変調（Ｂｒｏ ｃｋ　ａｎｄ　５ｈａｐｉｒｏ、　Ｃｅ１ｌ　３４：２０７（１９８３））、特 異的３’ＵＴＲモチーフに依存するトランスフェリン受容体ｍＲＮＡの安定性の 鉄依存制御（Ｍｕｌｌｎｅｒ　ａｎｄ　Ｋｕｈｎ。

Ｃｅ１ｌ　５３：８１５（１９８８））、カゼインｍＲＮＡの安定性のプロラク チン仲介された制御（Ｇｕｙｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　１７：ｌ０ １３（１９８９））　、多数の刺激に応答するフィブロネクチンｍＲＮＡの安定 性の制御（Ｄｅａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０６： ２１５９（１９８８））　、およびヒストンｍ　ＲＮ　Ａ安定性の制御（Ｇｒａ ｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４８：６１５（１９８７））を含む。最後 に、通常の真核生物のｍＲＮＡ翻訳制御を迂回するウィルスＲＮＡ配列が案出さ れたように、同様に、あるウィルスＲＮＡ配列が３′ポリアデニル化なしに安定 性を与えることかできるよってある（ＭｃＧｒａｅ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｌａｎｄ 、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１１６：４６７（１９８１））。例２１に従いＥＭＣのような幾つかの５′はキ ャップなして機能することが知られている。安定変調要素のこの不協音（ｃａｃ ｏｐｈｏｎｙ）もまたｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルを発展させるとき注意 深く考慮されねばならす、かつｍＲＮＡ治療の効果を変調するのに使用され得る 。

リポソーム形成材料 リポソームを形成する科学は今ではよく開発されている。

リポソームは単一層または多重層賦形剤であり、脂肪親和性の材料で形成された 膜部分および内部の水性部分を育する。水性部分はこの発明において標的細胞に 運搬されるへきポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。

ここで使用されるリポソーム形成材料は、４価アンモニウム基のようなカチオン 性基、および約６ないし約３０の炭素原子を有する飽和されたまたは飽和されて いないアルキル基のような１つまたはそれ以上の脂肪親和性基を有することか好 ましい。適当な材料の１つの群はヨーロッパ特許公開番号第０１８７７０２号に おいて記述される。これらの材料は次の式を育し、 ＯＲ２Ｒ５ ここではＲ１およびＲ２は同じかまたは異なり、かつ６ないし２２の炭素原子の アルキルまたはアルケニルであり、Ｒ２，Ｒ’、およびＲ５は同一または異なり 、かつ水素、Ｉないし８炭素のアルキル、アリル、７ないし１１炭素のアラルキ ル、またはＲ’、Ｒ’、およびＲ４の２つまたは３つか共に取られたとき、それ らはキヌクリジン、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリノを形成し、ｎは １ないし８、かつＸは薬事的に受入可能なハロゲンのような陰イオンである。こ れらの化合物は上で示された特許出願において詳しく書かれているように準備さ れてもよいし、その代わりどして、少なくともそれらの化合物のうちの１つ、Ｎ −（２，３−ジー（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−ｐｒｏｐ−１−イ ルーＮ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）がベセスダ・ リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）（Ｂ　ＲＬ）　。

ゲティスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　、メリーランド州（Ｍａｒｙｌ ａｎｄ）　２０８７７、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）から商業的に入手可能である 。

これらの４級アンモニウムジエーテル化合物は、しかしれているとき、これらの 材料が組織に蓄積し、究極的には脂質蓄積疾患および毒性副作用の結果をもたら す可能性がある。したがって、この発明における使用のための組成物の好ましい クラスは次の式を有し、 Ｒ３ ここではＲ’およびＲ２は同−又は異なり、かつアルキルマタＩｔ　５ないし２ １炭素原子のアルケニルてあり、Ｒｊ。

Ｒ４，およびＲ５は同一または異なり、かつ水素、■ないし８炭素のアルキル、 アリル、７ないし１１炭素のアラルギルであり、またはＲ’、Ｒ’、およびＲ５ の２つまたは３つが共に取られたとき、それらはキヌクリジン、ピペリジノ、ピ ロリジノ、またはモルホリノであり、ｎは１ないし８であり、かっＸはハロゲン のような薬事的に許容可能な陰イオンである。これらの化合物はカルボン酸およ びアルキルハロゲン化物を含む核置換のような従来の技術を使用しで、エステル 交換、または酸もしくは酸ハロゲン化物を用いるアルコールの縮合により調製さ れてもよい。

さらに、多くの適当なリポソーム形成カチオン性脂質化合物か文献に記述されて いる。たとえば、Ｌ、　Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ。

ｃｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：３９！７−７−３９２５（ １９８；　Ｈ，巳ｉｂ１．　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ＩＯ：２６１−２７１（１９７９）を参照されたい。

リポソームの調製 この発明における使用のための適当なリポソームは商業的に入手可能である。た とえば、ＤＯＴＭＡリポソームはベセスダ・リサーチ・ラブ、ゲティスバーグ、 メリーランド州からりボッエフチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の商標で入手可能 である。

その代わりとして、容易に入手可能な、または新たに合成された開始材料の前述 の形から調製され得る。ＤＯＴＡＰリポソームの調製は例６に詳細に記述されて いる。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献において説明され、たとえば、Ｐ、　 Ｆｅｌｇｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ニア４１３−７４１７を参照されたい。同様の方法が他 のカチオン性脂質材料からリポソームを調製するのに使用され得る。

さらに、従来のリポソーム形成材料が負の電荷または中性の電荷を有するリポソ ームを調製するのに使用され得る。

このような材料はホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタ ノールアミン、等を含む。これらの材料もまた有利に、０％から約７５％の割合 でＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡ開始材料と混合され得る。

従来の方法が他の非カチオン性リポソームを調製するのに使用され得る。これら のリポソームはカチオン性リポソームと同様に容易に細胞壁と融合しない。しか しながら、それらはを止車でマクロファージによって摂取され、かっこうしてポ リヌクレオチドのこれらの細胞への運搬のために特に効果的である。たとえば、 市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファ チジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノー ルアミン（ＤＯＰＥ）がコレステロールの添加と共にまたは添加なしで、従来の リポソームを作るのに様々な組合せで使用され得る。こうして、たとえば、Ｄ　 ＯＰ　Ｇ／Ｄ　ＯＰ　Ｃ小胞か音波処理バイヤルの中への窒素ガスの流れの下で ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各々５０ｍｇを乾燥することによって準備され得る。

サンプルは真空ポンプ下に一装置かれ、かつ脱イオン水で次の日、水和される。

サンプルはそれからキャップされたバイヤルで、水浴（ｂａｔｂ）か１５°Ｃて 循環される間最大に設定される倒置されたカップ（バス型）プローブを備えたヒ ートシステムモデル３５０ソニケータを使用し、２時間音波処理される。

その代わりどして、負に荷電された賦形剤が多重層賦形剤を生産するために音波 処理なしで、または別々のサイズの単一層賦形剤を生産するためにヌクレオボア （ｎｕｃｌｅｏｐ。

ｒｅ）膜を介する射出によって調製され得る。他の方法が当業者に知られ、かつ 利用可能である。

この発明は以下に与えられた２３の例を使用して詳細に以下で説明されるか、し かしながら、記述される方法は、ここで記述されるように広く適用可能であり、 かつそれらの例によって制限されるように意図されていない。

例１　リポソームを形成するＤＯＴＡＰの調製カチオン性リポソーム形成材料１ ．２−ビス（オレオイルｔ−１’−シ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパ ン（ＤＯＴＡＰ）が、Ｌ、　Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ、　ｅｔ　ａｌ、　（上記） またはＨｌＥｉｂｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（上記）によって報告されているように 調製される。

端的には、ＳｔａｍａｔａｔＯＳ、　ｅｔ　ａｌ、は、１ｍｍｏｌの３−ブロモ −１，２−プロパンジオール（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））　カ、５ｍｍ ｏｌの乾燥ピリジンを含む乾燥した、アルコールを含まないジエチルエーテル（ ２０ｍｌ）において３ｍｍｏｌのすレイルクロリド（オレイン酸およびオキサロ イルクロリドから新たに調製された）で２０’Ｃで４８時間アシル化されたとい うことを報告している。ピリジニウムヒドロクロリドの沈澱物がフィルタ除去さ れ、かつ濾液は窒素下で濃縮され、かつ１０ｍ１へギサンにおいて再溶解される 。ヘキサン溶液は、ｐＨ３，０の等しい量の１：ｌメタノール１０．ＩＮ水性Ｎ ＣＯＯＮａで３回、１：１メタノール１０．ＩＮ水性ＮａＯＨで３回、および１ ％の水性ＮａＣｌで１回流われた。租３〜プロモー１．　２−ビス−（オレオイ ルオキシ）プロパンは、それから２５°Ｃで乾燥したジメチルスルホキシド（３ ０ｍｌ）における１５％のトリメチルアミンの溶液で封じられた管において７２ 時間攪拌された。この反応の生成物はクロロフォルム（２００ｍｌ）で溶解され 、それは１：１メタノール／１００ｍＭ水性ＨＣＯＯＮａ、ｐＨ３，０で繰返し て洗われ、がつそれから真空で淡黄色のオイルを生ずるように蒸発させられた。

この材料は、シリシック酸（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　Ａ、　Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）のカラム上で精製され、９−１ｅ％メタノールにおける純粋な 型で所望される産物を与えるためにクロロホルムにおけるＯないし１５％グラジ ェントのメタノールで溶出される。精製された産物は無色で、５０：１５：５： ５：２のＣＨＣｌ２／アセトン／ＣＨ，ＯＨ／ＣＨ。

Ｃ０ＯＨ／Ｈｆ　Ｏて展開された薄層クロマトグラフィープレート（シリカゲル Ｇ）上の０．４のＲ，で移動する粘性油であった。

例２：［Ｈｆ心のあるいかなる遺伝子のためのＤＮＡテンプレートを作るための プラスミドの調製 所望されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生産のための適当なテンプレー トＤＮＡは標準の組換ＤＮＡ方法論に従って調製されてもよい。以前に報告され ているように（Ｐ、　Ｋｒｅｉｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ’Ｒｅｓ、　１２ニア０５７−７０７０（１９８４））、５′キヤツプはｍ 　ＲＮ　Ａの翻訳を容易にする。

さらに、３′フランキング領域およびポリＡ尾部は生体内のｍＲＮＡの半減期を 増加すると信じられている。

ベクターｐＳＰ６４Ｔをクローン化する容易に入手可能なＳＦ３は、β−グロビ ンから効率的に翻訳されたｍＲＮＡを５′および３′フランキング領域に与える 。このプラスミドの構成はＫｒｅｉｇ、　ｅｔ　ａｌ、　（上記）によって詳細 にされ、かつここに引用により援用される。開始コドンを含むいかなるｃＤＮＡ がこのプラスミドに導入され得、かっｍＲＮＡが結果として生じたテンプレート ＤＮＡから調製され得る。この特定のプラスミドは、関心のあるポリペプチドを コードするいかなる所望されるｃＤＮＡをも挿入するためにＢｇｌＩ［で切断さ れ得る。

直線化されかつそれから生体内でＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼで転写されるとき 、良い結果はｐＳＰ６４Ｔで得られ得るけれども、我々はファージＴ７ＲＮＡポ リメラーゼと共にｐＳＰ６４Ｔのアフリカッメガエルβ−グロビン隣接配列を使 用することを好む。これらの隣接配列は小さな（約１５０　ｂ　ｐ）　Ｈｊｎｄ ｌｌｌとしてのｐｓＰ６４ＴからＥｃｏ　ＲＩフラグメントへ精製される。これ らの配列は、それから、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼと共にｐＩＢＩ３１　（インター ナショナル・バイオチクノロシーズ・インコーホレイティラド（Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　［ｎＣ，）＝、−ヘブン（ Ｎｅｗｈａｖｅｎ）からの、コネチカット州（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）　０６ ５３５）から市場で入手可能）精製された直線状のＨｉｎｄ　ＭＬ／εｃｏ　Ｒ １フラグメント（約２，９Ｋｂｐ）の中へ挿入される。結果として生じたプラス ミド、指定されたｐＸＢＧは、配向のためスクリーニングされ、かっＥ、ｃ、ｌ 、ｃ　にトランスフオームされる。これらのプラスミドは、２つのアフリカッメ ガエルβ−グロビン配列の間に位置する独自のＢｇｌ　ＩＩ制限部位において関 心のあるいかなる遺伝子をも受けとるように適合される。

例３：クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーセをコードするプラスミ ドの調製 外因性ポリヌクレオチドの生体内発現を示す便利なマーカー遺伝子は、クロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡＴである。アフリカッメガエル β−グロビン５′および３′配列によって隣接されるＣＡＴ遺伝子を含むプラス ミドｐＳＰ−ＣＡＴは、ＣＡＴ遺伝子をｐＳＰ６４ＴのＢｇｌＩＩ部位に加える ことによって生産された。

我々はｐＳ　Ｖ　２−　ＣＡＴ　（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、３７１５５　ｔ ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、から入手可能）からの小さいＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントの形態でＣＡＴ遺伝子を使用した。し かしながら、ＣＡＴ遺伝子は通常は分子生物学で使用され、数多くのソースから 入手可能である。ＣＡＴ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびＢｇ ｌＩＩ−開裂ｐＳＰ６４Ｔの双方は、平滑末端を形成するためにフレノウ（Ｋｌ ｅｎｏｗ）フラグメントとともにインキュベートされ、それからＴ４ＤＮＡリガ ーゼで結合されｐＳＰ−ＣＡＴを形成した。

小さいＰｓ　ｔ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｔ　Ｉ　Ｉフラグメントはそれから発生されて 精製され、このフラグメントはｐＳＰ６４Ｔの５′および３′β−グロビンフラ ンキング配列の間のＣＡＴ遺伝子を含む。ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３１　（Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）はＰｓｔ ｌとＨｉｎｄＩＩＩとで開裂され、長い線状の配列は精製された。このフラグメ ントはそれからＣＡ　Ｔ−遺伝子含有配列と結合され、フラグメントはＴ４　Ｄ ？’ＪＡリガーゼで結合されプラスミドで表わされるｐＴ７ＣＡＴ　Ａｎを形成 した。クローンはＸｇａｌとアンピシリン耐性とを有するβ−ガラクトシダーゼ 活性に基づいて選択される。

例４：精製されたＤＮＡテンプレートの調製例３からのプラスミドＤＮＡは、Ｒ ＮＡ５ｅかない場合を除いて、細菌ＲＮＡを取り除くために２　ＣｓＣｌスピン を使用してマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　（上述）により増殖されかつ調 製される。特定的には、例３からのｐＴ７ＣＡＴ　Ａｎを含むＥ、ｃｏｌｉはア ンピシリン含ｆＬＢ培地で増殖された。細胞はそれから５ＯｒＶａｌｌ　ＲＣ− ５遠心分離機（Ｅ、　［、ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ ａ　９１５１０　）において１０分間５０００　ｒ　ｐｍで遠心することによっ てベレット化され、冷ＴＥ、ｐＨ８，０で再懸濁され、再び、５０００ｒｐｍ、 で１０分間遠心分離され、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）　 −ＣＩ　ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび４０ｍｇ／ｍｌリゾチームの溶 液で再懸濁された。ときどき倒置しなから５ないし１０分間インキュベーション した後、１％ＳＤＳを含む０．２ＮＮａＯＨが加えられ、０°Ｃて１０分経過後 ３Ｍ酢酸カリウムおよび２Ｍ酢酸か続いた。さらに１０分後、材料は再び６００ ０ｒｐｍで遠心分離され、その上澄みはピペットで取除かれた。ベレットはそれ から０．６容量のイソプロパノ−ル（−２０°Ｃ）に混合され、混ぜられ、かつ １５分間＝２０°Ｃで保存された。材料はそれから今回はＨＢ４揺動パケットロ ータ装置（ＤｕＰｏｎ　ｔ、上述）において、２０分間ｌＯ，ＯＯＯｒｐｍで再 び遠心分離され、その後上澄みは取除かれ、ペレットは７０％ＥｔＯＨで洗われ るとともに室温で乾燥された。次に、ペレットは３．５　ｍｌ　ＴＥて再懸濁さ れ、それに続いて３．４ｇ　ＣｓＣ１および３５０μｍの５ｍｇ／ｍｌ　ＥｔＢ ｒが加えられた。結果として生じる物質は鉱油で上部まで満たされた急速密封管 の中に置かれた。管はＶＴｉＳＯ遠心分離機（Ｂｅｅｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ、　Ｐａ５ａｄｅｔ＋ａ、　Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ、９１０５１　） において８０．００Ｏｒｐｍで３．５時間遠心された。バンドは取除がれ、材料 は再び遠心分離されて、０．９５ｇ　ＣｓＣ１／ｍｌおよびＴＥにおける０、１ ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌ　ＥｔＢｒ／ｍｌで容量を補った。ＥｔＢｒは、バンド に３容量のＴＥを加えて、上層がきれいになるまで上層を捨てた後、等しい容量 のＴＥ飽飽和−ブタノールで抽出された。次に、２．５容量の、ＥｔＯＨが加え られ、その材料は一２０’Ｃで２時間沈澱された。結果として生じるＤＮＡ沈澱 物は、ｉｔ　Ｋ　％でのｍＲＮＡの調製のためのＤＮＡテンプレートとして使用 される。

例５：トランスフェクションのためのｍＲＮＡの調製例４からのＤＮＡは、ポリ 八尾部の下流で５倍過剰のＰｓｌｌて線状にされた。線状にされたＤＮＡはそれ がら２回のフェノール／クロロホルム抽出で精製され、それに続いて２回のクロ ロホルム抽出か行なわれた。ＤＮＡはそれからＮａ０Ａｃ　（０，３Ｍ）および ２容量のＥｔＯＨとともに沈澱された。ペレットはＤＥＰ−処理された脱イオン 水中、約１ｍｇ／ｍｌで再懸濁された。

次に、転写緩衝液が調製され、これは４００ｍＭ）’ＪスＨＣＩ　（ｐＨ８，０ ）、８０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭＤＴＴおよび４０ｍＭスペルミジンを含む 。それから、以下の材料が室温で順に１容量のＤＥＰ−処理された水に加えられ た、すなわちそれらは、上で調製されたｌ容量Ｔ７転写緩衝液、１ｍＭ濃度まで のｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＰ、ｒＧＴＰを０．５ｍＭ濃度で、７ｍｅ Ｇ（５’　）　ｐＩ）ｌ）　（５”）　Ｇ　キャップ類縁体（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｊｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、０１ ９５１　）を０．５ｒｎＭ濃度で、上で調製された線状にされたＤＮＡテンプレ ートを０．５ｍｇ／ｍ１ｉ１度で、ＲＮＡ　ｓ　ｉ　ｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ ａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　）を２０００Ｕ／ｍｌ濃度で、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ　）を４０００Ｕ／ｍ１濃度で加 えられた。

この混合物は３７°Ｃで１時間インキュベートされた。成功した転写反応は反応 混合物のくもりをふやすことによって示された。

ｍＲＮＡの生成に続いて、使用されるＤＮ、Ａテンプレートのマイクログラムあ たり２　Ｕ　ＲＱＩ　ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ　）が加えられ、１５分間テ ンプレートを消化することを許容された。それからＲＮＡはクロロホルム／フェ ノールで２回抽出されるとともに、クロロホルムで２回抽出された。上澄みは２ 容量のＥｔＯＨの中に０．３　ＭＮａＯＡｃで沈澱され、ペレットは５００μｍ 転写生産物あたり１００μｌのＤＥＰ−処理された脱イオン水て再懸濁された。

この溶液はＲＮＡ５ｅ−フリーセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　５０ カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｌ］ｅｉｍ　＃１００４１１）上を通 された。結果として生じるｍＲＮＡは生体内のを推動物のトランスフェクション で使用されるのに十分純粋であった。

例６：リポソームの調製 数多くのリポソーム調製方法はこの発明の実施において有利に使用され得る。１ つの特に好ましいリポソームは以下のようにＤＯＴＡＰから作られる： １ｍｌクロロホルム中の１０ｍｇジオレオイルホスファチジルエタノールアミン （ＰＥ）およびｌ　ＯｍｇＤＯＴＡＰ（例１より）溶液は、窒素の流れの下で乾 燥するまで蒸発され、残留溶剤は夜通しの真空下で取除かれる。リポソームは脂 質を脱イオン水（２ｍｌ）で再懸濁し、かつ閉バイアルで透明になるまで超音波 処理することによって調製される。これらの調製物は少なくとも６か月間安定し ている。

ポリヌクレオチド複合体は０．４ｍｇ／ｍｌで０．５ｍｌポリヌクレオチド溶液 （たとえば例５から）を一定に静かに攪拌しながら注射器によってゆっくり加え ることによって、２０ｍｇ／ｍｌで超音波処理されたＤＯＴＭＡ／ＰＥまたはＤ ＯＴＡＰ／ＰＥリポソームの０．５ｍｌ溶液に、室温で混ぜることによって調製 された。この方法はポリヌクレオチドを生体内で細胞に自発的に輸送する正に荷 電された複合体を結果として生じる。正に荷電されたリポソームのポリヌクレオ チドに対する様々な比率は、いずれの特定の状態での特定の必要性に合うように 使用され得る。代替的に、フェルブナ（Ｆｅｌｇｎｅｔ　）　、他（上述）によ って報告されるように、材料を結合してリポソーム／ポリヌクレオチド複合体を 自発的に形成する前に、ヘベス（Ｈｅｐｅｓ　）緩衝塩類液（１５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１；２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，４）でポリヌクレオチド（ＤＮＡまた はＲＮＡ）を希釈することは有利であるかもしれない。多くの例で、しかしなが ら、塩類溶液の代わりに低いイオン強度を有する溶液（スクロースのような）を 使用することは好ましいと考えられる、特に、かかる溶液はポリヌクレオチド／ 脂質複合体の沈澱を最小限にすることによってポリヌクレオチドの細胞への輸送 を容易にすると考えられる。

例７：ネズミにリポソーム的および非リポソーム的に導入されたｍ　ＲＮ　Ａの 生体内発現 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするｍＲ ＮＡが生体内で細胞をトランスフエクトする能力およびＣＡＴタンパク質の結果 として起こる発現は、示されるように調製された以下の処方の各々の０．２００ ｍ１を、プレグを形成するネズミの腹筋に直接注射することによって示された。

各処方の６つの反復試験区がテストされた。１２ないし１４時間後、注射が行な われたおよそ０．　１ないし０．２グラムの重さがある腹筋のセグメントは切除 され、切り刻まれ、かつ以下の成分、２０ｍＭトリス、ｐＨ７，６；　２ｍＭ　 ＭｇＣ１２；およびｏ、ｉ％トリトン（Ｔｒｉｒｏｎ）　Ｘ　−１００界面活性 剤を有する２００μｍの水性処方物とともに１．５ｍｌ使い捨て乳鉢（Ｋｏｎｔ ｅｓ、Ｍｏｒｔｏｎ　Ｇｒｏｖｅ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）の中に置かれた。乳鉢 の中身はそれから使い捨て乳棒で１分間磨り潰された。

乳鉢はそれから（パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で）で覆われ、１リツトル バール（Ｐａｒｒ）細胞粉砕器ボンベ（Ｐａｒｒ　［ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ、Ｍｏ１ｉｎｅ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）に置かれるとともに、４° Ｃの窒素で６気圧に押圧された。３０分後、圧力は組織を粉砕して粗溶解産物を 生み出すためにすみやかに解放された。溶解産物はそれから１０分間１３．ＱＱ Ｏｒｐｍ。

４°Ｃでマイクロ遠心分離機で遠心分離された。上澄みはそれから別の容器に移 され分析されるまで一２０°Ｃで保存された。

溶解産物はそれから薄層クロマトグラフィによってＣＡＴタンパク質の存在を検 定された。まず、各サンプルの７５μｍ　（上に調製された上澄み）が５μＩＣ １４クロラムフエニコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　、２０　μｍ　４　ｍＭアセ チルＣｏＡおよび５０μｍ１Ｍトリス、ｐＨ７，８とともに３７℃で２時間イン キュベートされた。その後、２０μｍの４ｍＭアセチルＣｏＡが加えられ、その 混合物は再び３７°Ｃで２時間インキュベートされた。結果として生じる溶液は １ｍＩＥｔＯＡｃで抽出され、その有機相は取除かれ、真空遠心分離（Ｓｐｅｅ ｄＶａｃ、５ａｖａｎｔ　Ｃｏ、　）で凍結乾燥された。ペレットは２０μＩＥ ｔＯＡｃで再懸濁され、シリカゲル薄層クロマトグラフィプレート上にスポット された。プレートは９５％クロロホルム１５％メタノールで４５分間展開され、 乾燥されかつ放射ルミネセンスインジケータ　（Ｅｎｈａｎｃｅ　５ｐｒａｙ　 ｆｏｒ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐ、）で噴霧された。プレートはそれから一７０℃で夜 通し露出されたコダック（Ｋｏｄａｋ　）　ＸＡＲ５フイルムでサンドイッチさ れ、そのフィルムは製造業者の指示で現像された。以下の結果が入手された： 処方　ｍＲＮＡ　発現 （正の数／総数） １．１ｍｌ　Ｏｐｔｉｍｅｍ；３７，５μｇ　ＤＯＴＭＡＯ／６ ２．１ｍｌ　Ｏｐｔｉｍｅｍ；１５℃ｇ　ＣＡＴ　ＲＮＡ３、処方　１プラス　 １５℃ｇ　ＣＡＴ　ＲＮＡ４．１ｅ％スクロース、３７．５μｇ　ＤＯＴＭＡ； １５℃ｇ　ＣＡＴ　ＲＮＡ　３／６ ５．１０％スクロース、１８７μｇ　ＤＯＴＭＡ；７５℃ｇ　ＣＡＴ　ＲＮＡ　 Ｏ／６ ０ｐｔｉｍｅｍ：血清−フリー　培地　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、Ｇｒａｎｄ　［５ ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、　１４０７２　）ＤＯＴＭＡ　：　（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 　ブランド；　Ｂａｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ＣＡＴ　ＲＮＡ：例５から すべての処方はＤＥＰＣ−処理されたＲＮＡ５ｅ−フリー水中で補なわれた（Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、［ｎｃ、、Ｎｅ ｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ　０６５３５　）。

例８：ＨＩＶウィルスのｇｐ　１２０タンパク質を生産するためのマウスへのｍ ＲＮＡワクチン投与ＨＩＶウィルスのｇｐ１２０タンパク質をコードするｍＲＮ Ａを含むリポソーム的処方は、ｇ　ｐ　ｌ　２０　（Ｔｈｅ　ＡｉｄｓＲｅｓｅ ａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　２０８５２からのｐ［［Ｉｅｎｖ３−１ ）のための遺伝子が例４の方法でプラスミドｐＸＢＧの中に挿入される場合を除 いて、例１ないし５に従って調製される。例６に従って調製され、かつ１０％ス クロースの２００μｇ／ｍｌのｇｐ　１２０ｍＲＮＡおよび５００μｇ／μｍ　 １　：　ＩＤ０ＴＡＰ／ＰＥを含む処方の２００μｌの容量が、１日に３回マウ スの尾の静脈に注射される。最後の注射の後約１２ないし１４時間で、筋肉のセ グメントか注射部位から取除かれ、例７に従って細胞溶解産物として調製される 。ＨＩＶ特異タンパク質ｇｐ１２０はやはり例７の方法に従って溶解産物の中で 識別される。

ｍＲＮＡをワクチン投与されたマウスの血清に存在するｇｐ＋、２０抗体がＨＩ Ｖ感染を防御する能力は、ＨＴ４−６０プラ一ク還元検定によって以下のように 決定される。

ＨＴ４−６Ｃ細胞（ＣＤ４＋ヘラ（Ｈｅｌａ）細胞）はＤｒ。

ブルーメチェイスブロ（Ｂｕｒｃｅ　Ｃｈｅｓｅｂｒｏ）から入手され、ＲＰＭ Ｉ培地（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ　）の培養で増殖される。細 胞の集団はそれからバッチに分割される。バッチの中にはＨＩＶのおよそ１０’ ないし１０＠感染単位をおよそ１０７ＨＴ４−６Ｃ細胞に加えることによってＨ ＩＶに感染されるものもある。他のバッチはＨＩＶと２９１２０ｍＲＮＡをワク チン投与されたマウスからのおよそ５０μｌの血清との双方を加えることによっ て、ＨＩＶ感染に対するｇｐ１２０免疫血清の防御効果をテストされる。３日間 のインキュベーションの後、すべてのバッチの細胞は洗われ、固定され、クリス タルバイオレットで染色され、プラークの数が数えられる。ｇｐ１２０免疫血清 の防御効果は、ＨＩＶだけで処理されたバッチ中の数に比較しての、ｇ　ｐ　１ ２０　ｍＲＮＡ−ワクチン投与されたマウスの血清およびＨＴＶ双方で処理され た細胞のバッチにおけるプラークの数の減少として、決定される。

例９：ＨＴＶ抗原投与が続＜ＮＥＦ　ｍＲＮＡでのヒト幹細胞を保持する５ＣＩ ＤマウスへのｍＲＮＡワクチン投与 重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ？ウス（Ｍｏ　Ｉｅｃｕ　ｔａｒＢｉｏｌｏ ｇｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　、　（ＭＢｔ）　、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　９ ２０３７　）　）は、モジエル（Ｍｏｓｉｅｒ）　（Ｍｏｓｉｅｒ　他、　Ｎａ ｔｕｒｅ　３３５：２５６（１９８８））の方法に従って、腹腔への注射による 成人ヒト末梢血リンパ球とともに再構築された。ＨＩＶ−１の４００’ないし４ ０００感染単位の腹腔内注射はそれから行なわれた。

マウスは密封されたグローブボックスの中でＰ３レベル動物封じ込め設備の中で 維持された。

もしＨＩＶがプラスミド（ｔｈｅ　ＮｒＡＩＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　２ ０８５２からのｐＧＭ９２　）の形態のｎｅｆ遺伝子を獲得し、プラスミドから に工遺伝子を取除き、ｐＸＢＧプラスミドのユ且工遺伝子を転写のために挿入し および例２ないし例５に処方物に組込まれた。２００Ｍｇ／ｍ１ＮＥＦ　ＲＮＡ および５００Ｍｇ／ｍｌ　ｌ　：　ＩＤ０ＴＡＰ　：ＤＯＰＥ　（ＲＮＡ／リポ ソーム複合体形態における）を含む１０％スクロース溶液２００マイクロリツト ルの尾の静脈注射か実験動物に毎日行なわれる一方で、対照動物は２００Ｍｇ／ μｌ酵母ｔＲＮＡおよび５００Ｍｇ／ｍｌ　１　：　ＩＤ０ＴＡＰ／ＤＯＰＥリ ポソームを含むＲＮＡ／リポソーム複合体を同じように注射された。注射後２． ４および８週間で、生検標本は注射されたリンパ器官から採取され、免疫組織化 学のために調製された。同じ時間点で、血液サンプルが採取され、かつＥ、ＬＩ ＳＡキット（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＬＬ）による９２４レ ベルおよび例８のプラーク検定によるウィルス力価を検定された。ＨＩＶ−１の ための免疫染色が、ＨＩＶに感染した患者からの多クローン性血清を使って説明 されるように（Ｎａｍｉｋａｗａ他、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１６８４（１ ９８８））行なわれた。陽性の細胞は数えられ、高倍率フィールド（４００Ｘ） あたりの感染された細胞の数が決定された。

これらの検定を使って、少なくとも陽性の染色細胞の数の２倍還元が８週間で観 察され、力価およびｐ２４発現は少００日ｇ／ｍ１１　：Ｉ　ＤＯＴＡＰ　：　 ＤＯＰＥを含む処方物の２００μｍの容量が、ヒト幹細胞含有５ＣＩＤマウスの 尾の静脈に１日に３回注射される。免疫化に続いて、マウスはＨＩＶウィルスの 効果的な投与での感染によって抗原投与される。血液のサンプルは定期的に尾の 静脈から取出され、ＥＬＩＳＡキット検定（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ、　Ｃｈｉ ｃａｇｏ、　ＩＬ）による特徴的なＨＩＶタンパク質ｐ２４の生成のためにモニ ターされる。

例１００生体内ｍＲＮＡ　トランスフェクションによってマウスヘアデノシンデ アミナーゼを与える方法ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子のｃＤＮ Ａのためのフルレングスの配列は、クローンＡＤＡ２１１（Ａｄｒｉａｎ、　Ｇ 、他　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４：１７１２（１９８４））の１．　３０ ０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ａｃｃｌ　フラグメントから入手される。それは平滑末端 にされ、ＢｇＩＩＩリンカ−に結合され、それからＢｇｌｌＩで消化される。修 飾されたフラグメントはｐＸＢＧのＢｇＩＩＩ部位に挿入される。ＡＤＡ　ｍＲ ＮＡは例２ないし例５に従って転写されるとともに精製され、精製されたＡＤＡ 　ｍＲＮＡは例６に従って処方物の中に組込まれる。バルブ（Ｂａｌｂ）　３　 Ｔ　３マウスは、２００Ｍｇ／ｍｔのＡＤＡ　ｍＲＮＡおよび１０％スクロース の５００Ｍｇ／ｍ１ＤＯＴＡＰを含むこの処方物２００μｍを尾の静脈に直接注 射される。

マウスの肝臓、皮膚および筋肉の組織の中のヒトＡＤＡの存在は、等電点電気泳 動（ＩＥＦ）法によって確認される。組織抽出物は非変性ゲル上でｐＨ４および ５の間で等電点電気泳動された。ゲルはそれからヴアレリオ（ＶａｌｅｒｉＯ） ７Ｄ他、遺伝子　３１　：　１３７−１４３（１９８４）によって報告されるよ うに原位置でのＡＤＡ活性のために染色された。

ヒトおよび非ヒトＡＤＡの予備分離は、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ ＦＰＬＣ）によって実行される。

タンパク質は０．０５から０．５Ｍ　ＫＣＩに至る直線勾配での２０ｍＭトリス （ｐＨ７，５）でファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　（Ｐｉｓｃａｔａｗ ａｙ、ＮＪ　）モノク（ＭｏｎｏＱ　）カラム（ＨＲ５１５）上で分画される。

フラクション内でのＡＤＡの活性は、イノシンに変換される１４Ｃ−アデノシン （Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　［Ｌ　）でフラクションを反応させ ることによって測定される。薄層クロマトグラフィー（０，１Ｍ　ＮａＰｉ　ｐ Ｈ６，８飽和硫酸アンモニウム：ｎ−プロピルアルコール／１００：６０：２） は、基質アデノシンから放射性イノシンを分離するために使用される。

例１１：マウスの筋肉に直接注射された純粋ＲＮＡおよびＤＮＡの生体内発現 マウスの四頭筋は、１００μグラムのｐＲ３ＶＣＡＴＤＮＡ　プラスミドか１０ ０μグラムのβｇＣＡＴβｇＡｎ　ＲＮＡのどちらかを注射され、注射部位の筋 肉組織は後にＣＡＴ活性についてテストされた。

生後５ないし６週間の雌および雄バルブ（Ｂａｌｂ）／Ｃマウスは０．３ｍｌの ２．５％アベルティン（Ａｖｅｒｔｉｎ　）で腹腔内注射によって麻酔された。

ｌ、５ｃｍ切開が前大腿部で行なわれ、四頭筋は直接視覚化された。ＤＮＡおよ びＲＮＡは筋肉の末梢挿入部位から膝の中におよそ０．　５ｃｍでかつ約０．２ ｃｍの深さで１分間にわたって２７ゲージ針を通してｌｃｃ注射器中のＯ，１ｍ ｌの溶液で注射された。縫合部は将来の位置確認のために注射部位上に置かれ、 皮膚はそれからステンレススティールのクリップで閉じられた。

３Ｔ３マウス繊維芽細胞はまた、これらの細胞についてオプティメム（Ｏｐｊｉ −Ｍｅｍ）　（Ｇｉｂｃｏ）の中で登録商標リボフエクティン（Ｌｉｐｏｆｅｃ ｊｉｎ）　（ＢＲＬ　）　６０ｕｇと複合された２０μｇのＤＮＡまたはＲＮＡ とともに生体外でトランスフェクトされた。同じ繊維芽細胞はまた、アウスベル （Ａｕる方法に従って燐酸カルシウムを使用してトランスフェクトされた。

ｐＲｓＶｃＡＴ　ＤＮＡプラスミドおよびβｇｃＡＴβｇＡ　ＲＮＡは、先行す る例に述べられるように調製された。ＲＮＡは５′および３′β−グロビン非翻 訳配列および３′ポリ−Ａ領域によって隣接されるクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）コニド化配列を含んだ。

筋肉抽出物は全回頭筋を切除し、その筋肉を２００μｌの細胞溶液（２０ｍＭ） リス、ｐＨ７，４，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０，１％トリトン（Ｔｒ目ｏｎ） 　Ｘ）を含む１，５ｍｌミクロチューブの中に切り刻み、１分間プラスチック乳 棒（Ｋｏｎｔｅａ）ですり潰すことによって調製された。筋肉細胞の完全な粉砕 を確実にするために、筋肉組織はそれから１５分間４℃でボンベ（Ｐａｉｒ）の 中で６００ｐｓ　ｉのＮ２下に置かれた後、圧力を開放した。

繊維芽細胞はプレートからトリプシン分解された後同様に処理され、血清ととも に培地の中に取入れられ、ＰＢＳで２回洗われ、最終細胞ペレットは２００μｌ の細胞溶液の中に懸濁された。７５μｌの筋肉および繊維芽細胞抽出物は、Ｃ１ ４−クロラムフェニコールで２時間反応混合物をインキュベートすることによっ てＣＡＴ活性について検定され、それに続いて例７にすべて示されるように抽出 および薄層クロマトグラフィーが行なわれた。

図１は注射された四頭筋の抽出物内のＣＡＴ活性を示す２つの別個の実験からの オートラジオグラムを含む。レーン数はオートラジオグラムの一番上に現われ、 ％クロラムフェニコール変換は底に現われる。サンプル位置は以下のとおりであ る： レーン１および１３：対照繊維芽細胞 レーン２および１４：５％スクロースのみを注射された筋肉 レーン３および１５：０．００５単位の非注射、精製ＣＡＴ標準 レーン４および１６：０．０５単位の精製ＣＡＴ　（Ｓｉｇｍａ　）レーン５な いし８　：５％スクロースの中の１００μｇのβｇＣＡＴβｇＡｎ　ＲＮＡを注 射された筋肉レーン１１．１２および１７ないし２０：５％スクロースの中の１ ００μグラ ムのｐＲｓＶｃＡＴ　ＤＮＡを注射された筋肉レーン９および１０：６０μグラ ムのＤＯＴＭＡとともに７０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞（１０６）に 脂質導入された２０μグラムのβｇＣＡＴβｇＡｎ　ＲＮＡレーン２１．２２　 ：６０μグラムのＤＯＴＭＡとともに５０％集密６０ｍｍプレートの３７３細胞 に脂質導入された２０μグラム（７）ｐＲＳＶＣＡＴ レーン２３．２４　：５０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞の中に脂質導入 された２０μｇのｐＲ８ＶＣＡＴ燐酸カルシウム。

ＣＡＴ活性は注射後１８時間で４カ所のＲＡＮ注射部位すべてにおいて容易に検 出され、かつ注射後４８時間で６カ所のＤＮＡ注射部位すべてで検出された。４ カ所のＲＮＡ注射部位の２カ所（図１、レーン６および８）からの抽出物ならび に６カ所のＤＮＡ注射部位の２カ所（図１、レーン１１および２０）からの抽出 物は、最適の条件下（図１、レーン９．１０．２ｌ−２４）で生体外で一時的に トランスフェクトされた繊維芽細胞から得られたＣＡＴ活性のレベルに匹敵する ＣＡＴ活性のレベルを含んだ。筋肉で発現されたＣＡＴ活性の平均総量は、ＲＮ Ａ注射に対して９６０μｇおよびＤＮＡ注射に対して１１６μｇであった。。

異なる筋肉部位から回復されたＣＡＴ活性の変化はおそらく、注射および抽出技 術に固有の変化を表す、なぜなら純粋ＣＡＴ蛋白質またはｐＲ８ＶＣＡＴ−移入 された繊維芽細胞が筋肉部位に注射され、ただちにＣＡＴ活性の測定のために切 除されるときに大きな変化が観察されたからである。ＣＡＴ活性はまた、ＲＮＡ またはＤＮＡ　ＣＡＴベクターを注射された腹筋から回復され、他の筋肉類はポ リヌクレオチドを取込みかつ発現することが可能であることを示した。

例１２：マウスの筋肉に直接注射された純粋ＤＮＡの生体内発現の部位 注射された筋肉の遺伝子発現の部位は、ｐＲ３ＶＬａｃ置での細胞化学染色を観 察することによって決定された。

マウスの四頭筋は前の例で説明されたようにさらされた。

四頭筋は２０％スクロース中（７）ｐＲ８ＶＬＡｃ−Ｚ　ＤＮＡ　１００μｇを 一旦注射された。７日後個々の四頭筋はそのまま全部取除かれ、５つおきの１５ μｍ断面がβ−ガラクトシダーゼ活性のために組織化学的に染色された。

筋肉生検は液体Ｎ２−冷却イソペンタンの中で凍結された。１５μｍ連続断面は クリオスタットを使用してスライスされ、すぐにゲル化されたスライド上に置か れた。スライドは１．０分間ＰＢＳの１．５％グルタルアルデヒドの中で固定さ れるとともにβ−ガラクトシダーゼ活性のためにＵＳＡ　８４・＋５６−１．６ ０　（１９ｇ７）　）。筋肉はエオシンとともに対比染色された。

撮影された部分（図２）は以下のとおりである：（Ａ）：２０％のスクロースの みを含む液体を注射された対照筋肉の６０Ｘ倍率の断面図。

（Ｂ）（Ｃ）および（Ｄ）：ｐＲ８ＶＬａｃＺを注射された筋肉のそれぞれ２５ Ｘ、１６０Ｘおよび４００Ｘ倍率の断面図。

（Ｅ）　ｐＲ３ＶＬａｃＺを注射された他の筋肉の１６０Ｘ倍率の縦方向部分。

（Ｆ）（Ｇ）および（Ｈ）：　０．６ｍｍ離れた同じ筋肉の連続断面図。

全四頭筋を含むおよそ４０００細胞（１，５％）および注射領域内のおよそ１０ −３０％の細胞の中のおよそ６０筋肉細胞は青色に染色された（図２８．Ｃおよ びＤ）。２０％スクロース溶液のみを注射された対照筋肉は、何のバックグラウ ンド染色も示さなかった（図２Ａ）。いくつかの個々の筋肉細胞内での陽性のβ −ガラクトシダーゼ染色は、連続断面図（図２ＦＳＧおよびＨ）上で少なくとも １゜２ｍｍ深さであり、それは多重核へのトランスフェクションの結果であるか 、または筋肉細胞内に広く分配されるべき１つの核から発現された細胞質蛋白質 の能力かのどちらかであるかもしれない。縦方向断面はまた、少なくとも４００ μｍのための筋肉細胞内のβ−ガラクトシダーゼ染色を示した（図２Ｅ）。青色 の濃い細胞に隣接する細胞の中に、弱い青色染色がしばしばその境界領域に現わ れた。このことは反応Ｘ−ｇａｌ生成物が沈殿する前に拡散する組織化学β−ガ ラクトシダーゼ染色の人工産物を最もよく示すようである。

同様の結果が線状ＤＮＡを使って得られる。

例１３：マウスの筋肉に注射されたＲＮＡおよびＤＮＡの投与応答効果 ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌ　Ｕ　Ｃ）を使った実験は、注射さ れた筋肉から抽出された総ルシフェラーゼに対する投与レベルおよび時間のパラ メータの効果を探究した。

ＲＮＡおよびＤＮＡベクターが調製され、マウスの四頭筋は前に説明されたよう に注射された。全四頭筋の筋肉抽出物は、細胞緩衝液が１００ｍＭ　ＫＰｉ　ｐ Ｈ７，８゜１ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１％トリトンＸであることを除いては、例 １１に説明されたように調製された。２００μｌル抽出物のうちの８７．５μｍ がＬＫＢ１２５１蛍光計を使用してルシフェラーゼ活性について分析された（Ｊ 。

ｄｅ　Ｗｅ！他Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　ｌ１ｉｏ１．７＋７２５−７３７　（ １９８７）　）　。光単位は、対照筋肉抽出物内で精製されたホタルルシフェラ ーゼ（Ａｎａ１７ｊｉｃａｌ　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｊｏｒ ７）によって生成された光単位を測定することによって確立された標準曲線を使 用するルシフェラーゼのピコグラム（ｐ　ｇ）に変換された。注射の前のＲＮＡ およびＤＮＡの調製物は何の汚染ルシフェラーゼ活性も含まなかった。２０％ス クロースを注射された対照筋肉は何ら検出可能なルシフェラーゼ活性を有しなか った。上述の実験はすべて２ないし３回行なわれ、特に４０日より大きいＤＮＡ 時間点は３回行なわれた。

図３人ないし３Ｃは以下の結果を例示する：３（Ａ）２０％スクロースでのβｇ ＬＵＣβｇＡｎ　ＲＮＡの異なる量の注射後１８時間および２０％スクロースで のｐＲ３ＶＬの異なる量の注射後４日で測定されたルシフェラーゼ活性 ３（Ｂ）βｇＬＵＣＢｇＡ　ＲＮＡ２０μｇが１００万の３７３繊維芽細胞（Ｍ ａｌｏｎｅ、　Ｒ，他Ｐｔｏｃ、　、Ｎａｔ’１．ＡｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ　 ８６：６０７？−６０８１（１９８９））の中に脂質導入された後、および２０ ％スクロースでの１００μｇのβγＡＴ　βｇＡ　ＲＮＡが四頭筋に注射された 後様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。

３　（Ｃ）ｐＲ８ＶＬ　ＤＮＡが筋肉内に注射された後様々な時間で検定された ルシフェラーゼ活性。

Ａ、遺伝子発現のレベル 投与応答効果は、四頭筋が様々な量のβｇＬｕｃβｇＡｎＲＮＡまたはＤＮＡ　 ｐＲ３ＶＬ構成物を注射されたときに観察された（図３Ａ）。１０倍多いＤＮＡ を注射すると、ＤＮＡ時間点ｇの注射の後の３２０ｐｇルシフェラーゼからＤＮ Ａ　１００μｇの注射後の３２０ｐｇルシフェラーゼへとおよそ１０倍のルシフ ェラーゼ活性増加という結果になった。１０倍多いＲＮＡの注射はまた、およそ １０倍多いルシフェラーゼを生み出した。６０ｍｍ皿の中の１００万の３Ｔ３マ ウス繊維芽細胞は、登録商標オプテイメム（Ｏｐｊｉ−ＭＥＭ）　（Ｇｉｂｃｏ 　）　３ｍ　ｌ中の登録商標リポフエクティン（Ｌｉｐｏｌｅｃｔｉｎ）　（Ｂ ｅｊｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅｕｃｈ　Ｌａｂｓ）　６０ｔ１ｇと複合されたＤＮＡ またはＲＮＡ２０μｇとともに脂質導入された。２日後、細胞はルシフェラーゼ 活性について検定され、４つの別個のプレートからの結果は平均された。

繊維芽細胞に移入されたｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡ２０μｇは、合計でルシフェラーゼ １２０ｐｇ　（６μｇルシフェラーゼ／μｇＤＮＡ）を生み出す一方で、筋肉に 注射された２５μｇは平均１１６ｐｇのルシフェラーゼ（４，６μｇルシフェラ ーゼ／μｇＤＮＡ　：図３Ａ）を生み出した。ＲＮＡベクターからの発現は、注 射された筋肉におけるより移入された繊維芽細胞においておよそ７倍効果的であ った。繊維芽細胞に移入された２０μｇのβｇＬｕｃβｇＡｎ　ＲＮＡは、合計 で４５０ｐｇのルシフェラーゼを生み出し、一方で筋肉に注射された２５μｇは ７４μｇのルシフェラーゼを生み出した（図３Ａおよび３Ｂ）。輸送されたＤＮ Ａの量に基づいて、ＤＮＡベクターからの発現の効率性はトランスフェクトされ た繊維芽細胞および注射された筋肉の双方で同様であった。

Ｂ０発現の時間経過 時間経過もまた調査された（図３Ｂおよび３Ｃ）。ルシフェラーゼ活性は２５μ ｇの８ｇＬｕ　ｃβｇＡ　ＲＮＡまたは１００μｇのｐＲ８ＶＬ　ＤＮＡが注射 された模様々な時間で検定された。ＲＮＡ注射の後、平均ルシフェラーゼ活性は １８時間で最大量の７４９Ｈに達し、それから６０時間で急速に減少して２μｇ になった。トランスフェクトされた繊維芽細胞において、ルシフェラーゼ活性は ８時間で最大であった。筋肉へのＤＮＡ注射に続いて、相当量のルシフェラーゼ が少なくとも６０日間存在した。

図３Ｂのデータは、ルシフェラーゼ蛋白質および生体外ＲＮＡ転写が筋肉内で２ ４時間より少ない半減期を有することを示す。したがって、６０日間のルシフェ ラーゼ活性の持続性はルシフェラーゼ蛋白質の安定性または生体内ＲＮＡ転写の 安定性のためではないようである。

例１４：サザンプロット分析によって決定された注射の後の筋肉の中のＤＮＡの 持続性 筋肉ＤＮＡの調製物は対照、非注射四頭筋または四頭筋から、２０％スクロース でのｐＲ８ＶＬ１００μｇを注射した３０日後に得られた。同じ動物からの２つ の全四頭筋がプールされ、液体Ｎ２の中に切り刻まれるとともに乳鉢と乳棒を使 ってすり潰された。全細胞性ＤＮＡとＨＩＲＴ７））。１５μｇの全細胞性ＤＮ Ａまたは１００μｌのＨＩＲＴ上澄からの１０μｌは消化され、１．０％アガロ ースゲル上で精製され、「バキュプロット（ｙａｃｕｂｌｏｌ）　Ｊ器具（Ｌ　 Ｋ　Ｂ）を使って登録商標ニドラン（ＮＹＨａｎ）　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒお よび５ｃｈｕｅ１１．　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ　）に移され、かつ多重標識された３ ２ｐ−ルシフェラーゼプローブ（ｐＲ８ＶＬのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨｌ 　フラグメント）と交雑された。

夜通しの交雑に続いて、膜の最終洗浄が６８℃での０．５％ＳＤＳを含む０．２ ＸＳＳＣを使って行なわれた。コダックＸＡＲ５フィルムは一７５℃で４５時間 膜にさらされた。

図４は以下のようなサンプルパターンを有するサザンプロットのオートラジオグ ラムである： レーン１：０．０５ｎｇの非情化ｐＲ８ＶＬプラスミドレーン２：０．０５ｎｇ のＢａｍＨ１消化ｐＲ消化ｐ−８ＶＬレーン３ニ ブランク：対照筋肉からのＨＩＲＴ上澄のＢａｍＨ１消化レーン５：対照、非注 射筋肉からの細胞性ＤＮＡのＢａｍＨ１消化 レーン６．７　：　ｐＲ８ＶＬ注射筋肉の２つの異なるプールからのＨＩＲＴ上 澄のＢａｍＨ１消化 レーン８．９　：　ｐＲ８ＶＬ注射筋肉の２つの異なるプールからの細胞性ＤＮ ＡのＢａｍＨ１消化 レーン１０：ＢａｍＨｌおよびＤｐｎ　１で消化された細胞性ＤＮＡ　（レーン ９と同一） レーン１１：ＢａｍＨｌおよびＭｂｏｌで消化された細胞性ＤＮＡ　（レーン９ におけるのと同一）レーン１２：ＢｇｌＩＩで消化された細胞性ＤＮＡレーン１ ３：ＢｇＩＩＩで消化されたＨＩＲＴ上澄（大きさのマーカー（λ／ＨｉｎｄＩ ＩＩ）は左に示される）。

筋肉ＤＮＡのサザンプロット分析は、外来ｐＲ８ＶＬＤＮＡは少なくとも３０日 間（図４、レーン６−９）筋肉組織内に存在し、かつ注射後２日および１５日に 筋肉に存在するＤＮＡのレベルに類似することを示す。ＢａｍＨｌ（一旦ｐＲ８ ＶＬを切断する：図４、レーン６−９）で消化された筋肉ＤＮＡにおいて、線状 にされたｐＲ３ＶＬ（図４、レーン２）に対応する５、６ｋｂバンドの存在は、 ＤＮＡが環状の染色体外形態か、染色体に組込まれたプラスミドの大縦列反復の どちらかに存在することを示す。ＢｇＩ　Ｉ　Ｉ　（ｐＲ３ＶＬを切断しない） で消化された筋肉ＤＮＡにおいて、１０ｋｂより小さく（図４、レーン１２およ び１３）かつプラスミドｐＲ８ＶＬ　（図４、Ｌ／−：／１）のオープンの環状 形態と同じ大きさでのバンドの存在は、ＤＮＡはオープンの環状形態で染色体外 的に存在することを暗に示す。ＨＩＲＴ上澄（図４、レーン６．７および１３） およびＨＩＲＴ上澄との形質転換に続いてアンピシリン抵抗にされた細菌の中の ｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡの出現はまた、ＤＮＡが集積されずに存在することを示す。

外因性ＤＮＡの大半は染色体外であると思われるけれども、低レベルの染色体組 込みは決定的に除外することはできない。小滴（プロップ）の過度の露出は、ラ ンダムな部位で集積されたプラスミドＤＮＡを表わすであろう１０ｋｂより大き いハイブリッドＤＮＡのじみを明らかにしなかった。ｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡの感度 はＤＰＮＩ消化（図４、レーン１０）で増強され、そのＭｂｏＩ消化に対する抵 抗（図４、レーン１１）は、ＤＮＡは筋肉細胞内で複製しなかったことを示す。

例１５：・マウスの筋肉に直接移植された純粋ＤＮＡの生体内発現 ｐＲ８ＶＬ　ＤＮＡはエタノール中で沈殿され乾燥された。ベレットは鋭い鉗子 で拾い上げられ、先行する例で述べられたように様々な筋肉類の中に堆積された 。５日後筋肉は例１３で述べられたようにルシフェラーゼ活性について分析され た。ＤＮＡは以下のような様々な筋肉類で効率的に発現された： 移植：　ルシフェラーゼ活性　（光単位、ＬＵ）：２５μｇ　対照　二頭筋　仔 ウシ　四頭筋ｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡ ４５３　５３５８５　３４２９＋　３５５１２５３３９７　ＩＱｓ１７６ 例１６：肺への直接遺伝子輸送：　ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＣＬ複合体または純粋蛋白 質の気管内注射 登録商標リポフエクティン（Ｌｉｐｏ［ｅｃｊｉｎ）と複合されたＤＮＡルシフ エラーゼベク９−　（ｐＲ８ＶＬ）　は、２０％スクロースで（２匹のネズミ） または５％スクロースで（６匹のネズミ）のどちらかでネズミの気管内に注射さ れた。注射の２日後、ネズミの肺は７つの部分、つまりＬＵＬ、ＬＬＬ、ＲＵＬ ＳＲＭＬ、ＲＬＬ、ＡＬ　（以下のように規定される）および気管に分割された 。ネズミの肺は左主気管支から分かれた１つの大きな左肺を有するという点でヒ トの肺と異なっている。この研究のために左の肺は、左上部部分（Ｌ　Ｕ　Ｌ） と左下部部分（Ｌ　Ｌ　Ｌ）とに半分に切断された。右肺は４つの葉、右頭蓋葉 （ＲＵＬ）、右中葉（ＲＭＬ）、右低葉（ＲＬ　Ｌ）および附属葉（ＡＬ）を含 む。抽出物はこれらの肺を２００μリツトルの細胞溶液（２０ｍＭ）リス、ｐＨ ７，４，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１％トリトンＸ）を含む別個の１．５ｍ ｌミクロチューブに切り刻み、１分間プラスチックの乳棒（Ｋｏｎｔｅａ）で肺 をすり潰すことによって調製された。肺細胞の完全な粉砕を確実にするために、 肺組織はそれから１５分間４℃でパール（Ｐａ＋τ）ボンベの中で６００ｐｓ　 ｉのＮ２下に置かれた後圧力を開放された。ルシフェラーゼ検定は約３５０μｌ の全容量の中から８７．５μｍの肺抽出物上で行なわれた。

注射　ＲＵＬ　ＲＬＬ　ＬＵＬ　ＬＭＬ　ＬＬＬ　ＡＬ　気ｉｔモック　２２． ６　２２．４　２１．９　２１．３　２Ｑ、１　１９．８　−２５μｇＤＮＡ単 独　２１．２　２１．５　２１．８　２＋、６　２１．９　２１．２　−２５＋ ＋ｇＤＮＡ単独　２＋、７　２１．４　２１．３　−　２２．２　２１．５　− ２５０μｇＤＮＡ単独　２１．７　２３．２　２１．９　２８．５　２２．６　 ２２．０　２１．３２５０ｇｇＤＮ＾単検　２２．９　２２．５　二　２３．０ 　２５．土　２４４　２１．５２５０μｇＤＮＡ単独　２１．８　２１．５　２ １．８、２０．４　２０．７　２０．８　２０．７２５μｇＤＮ＾／ＣＬ　２０ ．８　２２．２　１９．６　２２．３　２２Ｊ　２２．０　−２５μｇＤＮＡ／ ＣＬ　２２．９　２２．０　２２．Ｌ２１．７　２２．８　−　２２．＋８２５ μｇＤＮＡ／ＣＬ　２２．２　２３．８　２２．１　２３．９　２２．８　−　 ２１．６２５ＪｇＤＮＡ／ＣＬ　２［１，９２０，９２０，９２０，６２０，３ −１９，３２５＋＋ｇＤＮＡ／ＣＬ　１．９．８　２Ｇ、０　２Ｑ、３　２Ｇ、 ２　２Ｇ、１　２（１，３２０，１２！ｎｇＤＮ＾／ＣＬ　２０．５　２０．５ 　１９．８　１９．５　＋９．９　１９．９　１９．８Ｌｕｃ　タンパク質 １ｂｌＱ’　１．ｕ、１０５．３　７？、１　９８．７　１１Ｑ、０　８Ｇ、３ 　Ｈ，６１７８，９ブランク　２２．５ モック；この値は食道の中に０．３ｍ１２０％スクロースでの２５μｇのＤＮＡ を摂取した動物に対する値である（水のみを含むサンプルは２２゜５１．ｕを生 み出す）２５μｇＤＮＡ単独＝２０％スクロース０．３ｍｌでの２５μｇｐＰＧ ＫＬｕｃの気管内注射を摂取した別の動物を表わす。

２５ＪｇＤＮＡ／ＣＬ　：　５％スクロース０．３ｍｌでの登録商標リポフェク ティン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）と複合された２５ＭｇのｐＰＧＫＬｕｃの気管 内注射を摂取した別の動物を表わす。

上述の動物は犠牲にされ肺抽出物は注射の２日後に調製された。

Ｌｕｃ蛋白質１０’　ｌ、ｕ、：精製されたホタルルシフヱラーゼ（Ｓｉｇｍａ 　）の３０，０００光単位（１，ｕ、　）の等量を摂取し、それからすぐに犠牲 にされた動物を表わす。

２５μｇＤＮＡ単独および２５μｇＤＮＡ／ＣＬ類の動物内でのルシフェラーゼ 活性は、モック動物内での活性はど大きくなかった、しかしながら、２５０μｇ ＤＮＡ単独の動物内では、対照肺またはブランク（太いアンダーラインの）を超 えて小さいがしかし信頼性をもって高められた１、ｕ、活性を示した。同一の抽 出物に対する二重の検定がその結果を確認した。ＬＫＢ１２５１蛍光計を使って の実験は、これらの値は、バックグラウンドを超えただけではあるが、真のルシ フェラーゼ活性を示すことを示す。

例１７　：　ＤＮＡ処方を直接注射されたマウスの肝臓の中のルシフェラーゼ活 性 ＤＮＡルシフェラーゼ発現ベクターｐＰＧＫＬｕｃは、マウスの左肝臓葉の下部 部分の中に肝臓内（ＩＨ）注射された。ｐＰＧＫＬｕｃ　ＤＮＡはそれ自体（２ ０％スクロース１．Ｑｍｌでの４５０ＭｇＤＮＡ）注射されるか、または登録商 標リポフエクティン（Ｌｉｐ［ｅｃｔｉｎ　）　（５％スクロース１．Ｑｍｌで の５ＱμｇＤＮＡ＋１５０μｇ登録商標リポフエクティン）と複合されるかであ った。注射の３日後、左肝臓葉は２つの部分（葉が注射された下部部分と注射部 位から離れた葉の上部部分）に分割されるとともに、先行する例に述べられたよ うにルシフェラーゼ活性について検定された。

ネズミ肝臓内　ルシフェラーゼ活性　（光単位、ＬＵ）肝臓注射　下部　上部 ブランク（２０，２ＬＵ　） 対照　、２Ｇ％　スフ叶ス　単独　２（１，１１２３，８５０ｕ　ｇ　ｐｌ’Ｇ ＫＬｕｃ＋リポフエクテイン　２２．１　２２．７４５（１１１ｇ　ｐＩ’ＧＫ ’ｌ、ｕｃ　２１．７　２０．８純粋ｐＰＧＫＬｕｃ注射を摂取した３匹の動物 のうちの２匹、およびｐＰＧＫＬｕｃ十登録商標リポフエクテすン注射を摂取し た３匹の動物のうちの２匹はバックグラウンドを著しく超える（太いアンダーラ インの）ルシフェラーゼ活性を有した。直接注射された肝臓葉の下部部分は、注 射部位から離れた上部部分より大量のルシフェラーゼ活性を有した。同様の結果 がｐＲ８ＶＣＡＴ　ＤＮＡ発現ベクターおよびＣＡＴ検定を使って入手された。

ルシフェラーゼ活性はｐＰＧＫＬｕｃ　（＋および一登録商標すポフエクティン ）類似の調製物がネズミの門脈循環に注射された３日後には検出されなかった。

例１８：肝臓および筋肉に注射された成長ホルモン遺伝子の発現 マウスは肝臓と筋肉の両方にｐＸＧＨ５（メタロチオネインプロモータ成長ホル モン融合遺伝子）　（５ｅｌｄｅｎ　Ｒｉｃｈａｄｄ他、Ｍｏ１ｅｅ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、６　：　３１７３−３１７９　（１９８６）　）を注射された。マ ウスは７６ｍＭ硫酸亜鉛水上に置かれた。

その後動物は採血され血清はニコルス（Ｎｉｅｈｏｌｓ　）　ＧＨキット（Ｋｉ ｔ　）を使用して成長ホルモンについて分析された。

Ａ、　２匹のマウスは５％スクロースでのりポフエクティン６０μｇ／ｍｌと複 合された２０日ｇのｐＸＧＨ５遺伝子を注射された。この溶液の１ｍｌは肝臓に 注射され、腹側および背側の腹筋は７部位に２回０．１ｍｌ注射された。

２日後、動物は採血された。１匹の動物の血清はバックグラウンドレベルのまま であったが、他方の血清は０．７５ｎ　ｇ／ｍ　ｌ成長ホルモンを含んだ。

８、３匹のマウスは５％スクロースでの　１ｍｇ／ｍ１ｐＸＧＨ５を０．１ｍｌ 注射され、２ｘは四頭筋に、１又はハムストリングに、１ｘは胸筋に、および１ ｘは小多角骨筋に２日の別個の日に注射された。結果は以下のようであった： 動物数　成長ホルモン（ｎｇ／ｍｌ　）　・１８目　２日目２　０．８　＋、０ ３　０．９５　０．８ バックグラウンド：　０．５　ｎｇ／ｍ１例１９：免疫ペプチドのための遺伝子 を直接注射されたマウス内での抗体生成 マウスはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータによって駆動されるｇｐ− １２０遺伝子を含む２０μｇの量のプラスミド構成物を注射された。ＤＮＡは例 １１に述べられた方法に従ってマウスの四頭筋に注射された。マウス５（図５Ａ ）は四頭筋に等張スクロースでの２０μｇのプラスミドＤＮＡを注射された。マ ウス２（図５Ｂ）はスクロース溶液単独を注射された。血のサンプルは注射の前 （０日月）に図５に示された時間に得られ、注射後４０日を過ぎるまで採られた 。各サンプルからの血清は連続的に希釈され、抗原としてイーストの中に作られ る組換型ｇｐ−１２０蛋白質を使って抗原の検出のための標準ＥＬＴＳＡ法検定 で検定された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の双方は、図５に示されるように検出さ れた。この研究は遺伝子はその信号配列を保持し、蛋白質は細胞から効率的に排 出されることを示す。

例２０：免疫ペプチドのための遺伝子を移入された細胞を注射されたマウスの抗 体生成 細胞腺ＢＡＬＢ／ＣＣ１，７（ＴＩＢ８０）は、ザ・アメリカン・タイプ・ティ シュ・カルチャ・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅ「１ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕ「ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）から入手された。これらの 細胞は例１９に述べられたｇｐ−ｉ２０遺伝子構成物を移入された。０．７５ｍ １登録商標オプテイメム（ＯｐｔｉＭＥＭ　）　（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｃ、　）に 対して加えられるのは６．１ｔｔｇのＤＮＡであった。３０μｇの量の陽イオン リポソーム（７０：３０のモル比率でＤＯＴＭＡおよびコレステロールを含む） は、他の０．７５ｍ１登録商標オプテイメム（ＯｐｊｉＭＥＭ　）に加えられた 。混合物は結合され、２０％（Ｖ／Ｖ）胎仔ウシ血清を含む１．５ｍｌの登録商 標オプティメムが加えられた。この溶液は８０％の集密的細胞（プレート当りお よそ１００万の総細胞）を含む６０ｍｍプラスチックペトリ皿の中に注がれた。

脂質導入後３．２時間で、細胞はトリプシンおよびＥＤＴＡ処理でプレートから 剥され、登録商標オプテイメム（ｏｐｔｉＭＥＭ　）で洗われるとともに１０％ 胎仔ウシ血清を含む０．１ｍｌ登録商標オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ　）で再 懸濁された。これらの細胞はマウスに注射された（ＩＰ）。マウスＩ２（図６Ａ ）はトランスフェクト細胞を注射された。マウス１１（図６Ａ）は同一数の非ト ランスフェクト細胞を摂取した。

血のサンプルは注射の前（０日月）に入手され、図６に示される時間に入手され た。血清サンプルは先行する例のように処理された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の 双方は図６に示されるように検出された。

例２１：生体外細胞に移入されたＤＮＡの直接翻訳のための無キャップ５′配列 の仕様 ２つの異なったＤＮＡテンプレートが構成され、その両者はＥ、ｃｏｌｉ　β− ガラクトシダーゼによりレポートされる遺伝子を発現するＲＮＡの合成をコード する。コザック（Ｋｏｚａｋ　）コンセンサス配列を含むＬ　ａ　ｃ　−Ｚ遺伝 子はｐβＧＬｕｃβＧＡ、テンプレートのルシフェラーゼコード化配列の場所に 挿入され、ｐ！ｊＧＬａｃＺβＧＡｎテンプレートを形成した。ｐＥＭＣＬａＣ ＺβＧＡｎテンプレートはｐβＧＬａｃＺβＧＡ、の５′β−グロビン非翻訳配 置／Ｎｃｏｌと置換えることによって作られた。これらのＥＭＣ５’非翻訳配列 は網状赤血球溶解産物の中で失体責の効率的な翻訳を開始することが可能である ことを以前に示した。我々はこれらの配列もまた培養において繊維芽細胞の中に トランスフェクトされたとき効率的な翻訳を命令することができることを示した 。青色細胞のパーセンテージは有キャップｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡ、ＲＮＡでト ランスフェクトされた細胞内より無キャップのＥＭＣＬａｃＺβＧＡｒｌＲＮＡ でトランスフェクトされた細胞内の方がわずかに大きかった。無キャップかキャ ップされたかどちらかのｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡｎＲＮＡとのトランスフェクジ ョンは、キャップされたβＧＬａｃＺβＧＡｎＲＮＡとのトランスフェクション より多い数の陽性のβ−ガラクトシダーゼ細胞を産出した。このＥＭＣ５’非非 翻訳列は、ワクシニア−Ｔ７ポリメラーゼベクターの成分として、無キャップｍ ＲＮＡの翻訳を７倍に増加させることが可能であることが最近水された（Ｅｌｒ ｏ７−８ｔｘｉｎ、　Ｏ，他、Ｐｔｏｃ、　Ｎｘｊｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８６：６１２６−６１３０　（１９８９）　）　、これらのＥＭＣ配列は従 って、無キャップメツセンジャーからの効率的な翻訳を命令する能力を有する。

例２２：トランスフェクトされた細胞培養におけるＴ７ポリメラーゼ転写 ＳＶ４０プロモータ（Ｄｕｎｎ、１．他、　Ｇｅｎｅ　６８：２５９　（１９１ １８））から発現されたＴ７ポリメラーゼプラスミドは、培養において３Ｔ３繊 維芽細胞の中にｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡ、テンブレー）ＤＮＡで同時に脂質導入 されて、Ｔ７ポリメラーゼ転写がプラスミドによって発生し得ることを示した。

２つの異なる５Ｖ４０−７７ポリメラ一ゼ発現ベクターが使用された； （ａ）　ｐ　５Ｖ−Ｇ　ｌ　−Ａ　＋細胞質に向けられるＴ７ポリメラーゼ蛋白 質の発現を駆動するｐＡＲ３１２６−８Ｖ４０プロモータ。

（ｂ）　ｐ　５ＶＮＵ−Ｇ　１−Ａ　：細胞質に向けられるＴ７ポリメラーゼ蛋 白質の発現を駆動するｐＡＲ３１３２−３Ｖ４０プロモータ これらの２つのプラスミドの各々は１：３および３：１の割合で、３Ｔ３細抱の ６０ｍｍプレートの中にｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡイと同時に脂質導入された。青 色のβ−ガラクトシダーゼ細胞の数は数えられ、以下に示されるように記録され た。

β−ｇａｌ　比率；テンプレート／　同時脂質導入　：テンプレート　ボリメラ ーゼベ９９−　ｐｓＶ−Ｇｌ−Ａ　ｐｓＶＮＵ−Ｇｌ−ＡＰＧＬｓｃｚｊＧＡｎ 　３：１　０　１例２３：メツセンジャーＲＮＡの制御された注入に続く脳のル シフェラーゼの発現 ２匹の大人のマウスと１匹の生まれたてのマウスは５′キヤツプを含み、例１７ に従って調製されたβｇＬｕｃβｇＡ、ｍＲＮＡを注射された。大人のマウスで は、注射は２０％スクロースでの３．６μｇ／μｌにおけるｍ　ＲＮＡの保存溶 液からであり、注射量は５μｍであり、両頭項の皮質の各々に２本の注射が行な われたのでマウスにつき４本の注射が行なわれた。組織は２００μＩの脳ホモジ エネートを使用して、パール（Ｐａｒｒ）ボンベで粉砕された例１３に従って注 射後１８時間で検定され、８７．５μＩは検定のためにとられた。結果は以下の とおりである：処理　動物１．Ｄ、　大脳半球： 左　右 Ｓｈａｍ注入　ＡＭ＋ａ　６４９　６２９βｇＬｕｃβＧＡｎＡＭｒｂ　１，７ ３４　１．９１１生まれたてのマウスは両側前脳に１μｌのβｇＬｕｃβｇＡｏ 　（３，５μｇ／μｌ：２０％スクロース）を注射され、組織は同様に処理され 分析された。

処理　動物１．Ｄ、　大脳半球： 例２４：生体内のジストロフィーマウス筋肉の中のシストロフィンの機能的発現 ロウスサルコーマ（Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ）ウィルスプロモータ゛　の制御 の下でシストロフィン遺伝子を含むプラスミドは、完全なシストロフィンコード 化領域およびＳＶ４０ポリを含むＸｐ２１プラスミドから調製された。セグメン トはクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）とその同僚によってクローン化された（Ｂｒｕｍ ｅｉｓｔｅｒ　Ｍ、、　Ｍｏｎａｃｏ＾Ｐ、　Ｇ１１ｌａｒｄ　ＥＦ、ｖａｎ　 Ｏｍｍｅｎ　ＧＪ。

Ａｌ［ａｒ＠ＮＡ、　Ｆｅｔｇａｓｏｎ−３ｍｉｔｈ　ＭＡ、にｕｎｋｅｌ　Ｌ Ｍ、　Ｌｅｈｔａｃｈ　Ｈ。

デュシエーヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）筋ジストロフイー遺伝子を含む、ヒトＸｐ２ １の１０メガベース物理的マツプ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９８８年４月　２日　 （３）　＋　１８９−２０２　：　Ｈｏ目ｍａｎ、ＥＰおよびＫｕｎｋｅｌ、　 Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ／Ｂｅｃｈｅ＋　筋ジストロフィーのＬＭシストロフィン の異常。Ｎｅｕｒｏｎ第２巻、　ＩｎＩ３−１１１２．９　（１９８９）：にｏ ｅｎｉｇ　Ｍ、、　Ｍｏｎａｃｏ　ＡＰ、　Ｋｕｎｋｅｌ　ＬＭ、シストロフィ ンの完全な配列は棒状のサイトスケルタル（ｃｉｔｏ−ｓｋｅｌｅｊａｌ　）蛋 白質を予測する。　Ｃｅ１ｌ　１９８８年４月２２日、　５３．　（２）＋　２ １９−２６　）。

１００μｌの燐酸塩緩衝塩類液での２００μｇのプラスミドはシストロフィン遺 伝子生産物が欠ける突然変異マウス系の四頭筋に注射された（ＭＤＸマウス：　 Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ）。

機能的シストロフィンの発現はＷａｔｋｉｎｉｓ他によって説明され、かつクン ケルから入手された同一の抗シストロフィン抗体（蛍光２次抗体を有する抗−６ ０ｋｄ抗体）を使用する手順に従って免疫組織化学により注射後７日間監視され た。ジストロフィーマウスのシストロフィン遺伝子生産物の機能的発現は、注射 された動物からの四頭筋の断面図で観察された蛍光のパターンを正常の動物で観 察された蛍光のパターンと比較することによって検出された。（Ｗａｔｋｉｎｓ 　Ｓ、Ｃ，、Ｈｏｔ！ｍａｎ　Ｅ、Ｐ、、５ｌａ７ｔｅｔ　Ｈ，Ｓ、、　Ｋｉｎ ｋｅｌ　Ｌ、Ｍ、　）、筋原繊維におけるシストロフィンの免疫電子顕微鏡的局 在化（Ｎａｔｕｒｅ　１９８８年６月３０日：　３３３　（６１７６：８６３− ６　）　、正常なシストロフィンの発現は筋肉繊維のプラズマ膜の下に局在化さ れるので、その結果口頭筋の断面図は細胞を取囲む蛍光パターンを与える。加え て、シストロフィンの発現はアフィニティ生成された抗−６０ｋｄ抗体を使用す るウェスタンプロット分析によって定量化された。

例２５：デュシエーヌ筋ジストロフィーの患者の筋肉への修正シストロフィン遺 伝子の直接投与筋ジストロフィーの患者は１００μｌの燐酸緩衝液塩類液での機 能的シストロフィン遺伝子（前の例を見られたい）を含むプラスミドの複合２０ ０μｇ注射を与えられる。軽い麻酔下にある間に、患者は手術をすることなく直 接皮膚を通して前骨格筋塊の中に５ｃｍ間隔で注射される。患者の回復は痙雫緊 張および最大随意収縮を監視することによって評価された。加えて、注射された 領域からの３００−５００の筋肉細胞の生検は組織学試験、筋肉構造の観察およ びデュシエーヌ筋ジストロフィーの患者にないシストロフィンの存在の生化学分 析のためにとられる。肋骨ケージおよび横隔膜を動かす肋間筋を含む呼吸筋は筋 ジストロフイー患者において特に重要な障害筋肉類である。肋間筋は他の骨格筋 類が可能であるように皮膚を通して注射によって到達可能である。ダイアフラム はプラスミドＤＮＡの直接注射に筋肉をさらすための外科的手順によってアクセ ス可能である。

開示された発明の様々な修正、改良および応用があり、それは当業者に明らかで あろうし、この発明の応用はかかる実施例をカバーすることを意図するものとす る。この発明をある好ましい実施例に関連して説明してきたが、これらの全範囲 は以下の請求項の範囲に関連して図られるものとする。

図面の簡単な説明 図１はマウスの筋肉におけるＣＡＴ遺伝子の発現を示すクロマトグラフィー研究 のオートラジオグラムを含む。

図２はｐＲ３ＶＬａｃ−Ｚ　ＤＮＡベクターを注射した後のベーターガラクトシ ダーゼの活性のために染色された筋肉組織の顕微鏡写真を含む。

図３はβｇＬｕｃＢｇＡ、の筋肉への注射の後の筋肉におけるルシフェラーゼの 活性に関するデータを提示する。

図４はｐＲ８ＶＬを注射した筋肉からの抽出液を分析した後のサザンプロットの オートラジオグラムを提示する。

図５は免疫原性ペプチドのための遺伝子の注射の後のマウスにおける抗体の生産 を示すグラフを含む。

図６は免疫原性ペプチドのための遺伝子を移入されたマウスの細胞の注射の後の 、マウスにおける抗体の生産を示すグラフを含む。

ＦＩＧ、　２Ａ　ＦＩＧ、　２Ｄ ＦＩＧ、　２８　ＦＩＧ、　２Ｅ ＦＩＧ、　２ＣＦＩＧ、　２Ｆ ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 Ｘ　Ｕ！９．　Ａ、４，６８９．コ２０　（ＫＡＪ工）　２５　Ａｕｇｕｓｔ　 １９８７．　ｌｌ−１９ｓａ　ｃｌａｉｍｓ　１−２２゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬物学的生産物であって、 容器内の、生理学的に許容可能な投与可能な形の、生物学的に活性のポリペプチ ドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドと、 薬物の製造、使用、または販売を規制する政府の省庁により規定された形で前記 容器に付随した注意書とを含み、その注意書がヒトまたは動物に投与するための 前記形式の前記ポリヌクレオチドが前記省庁により承認されていることを反映す る、生産物。 ２．薬物学的生産物であって、 生物学的に活性のペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを含み、 前記裸のポリヌクレオチドは組織の細胞に前記ポリペプチドの発現を引き起こさ せるために、生理学的に許容可能な注射可能な担体内において前記組織内への間 質的な導入に適した溶液の形態であり、前記溶液を包含する容器と、 前記容器に付随し、薬物の製造、使用、または販売を規制する政府の省庁により 規定された形式での注意書とを含み、その注意書がヒトまたは動物への投与のた めのポリヌクレオチドの前記溶液の製造、使用、または販売が前記省庁により承 認されていることを反映するものである、生産物。 ３．前記ペプチドが免疫原性でありかつ前記溶液のヒトへの投与が前記ヒトに対 するワクチン処置の役割を果たす、請求項２に記載の生産物。 ４．前記ペプチドが治療用のものでありかつ前記ポリペプチドに関連する治療の 必要上ヒトに前記溶液を投与することが治療上の効果を有する、請求項２に記載 の生産物。 ５．薬物学的生産物であって、 裸のアンチセンスポリヌクレオチドを含み、前記アンチセンスポリヌクレオチド が、前記ポリヌクレオチドを組織の細胞が取込みかつ治療上の効果がもたらされ ることを引き起こすために生理学的に許容可能な注射可能な担体において前記組 織内への間質的導入に適した溶液中にあり、前記溶液を包含する容器と、 薬物の製造、使用、または販売を規制する政府の省庁により規定された形式の前 記容器に付随する注意書とを含み、その注意書がヒトヘの投与のためのポリヌク レオチドの前記溶液の製造、使用、または販売を前記省庁が承認していることを 反映するものである、生産物。 ６．筋ジストロフィーの治療のための薬物学的生産物であって、 無菌の、薬物学的に許容可能な担体と、前記担体においてジストロフィンを作動 的にコードする薬物学的に有効な量の裸のポリヌクレオチドと、前記担体と前記 ポリヌクレオチドとを無菌状態で包含する容器とを含む、生産物。 ７．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項６に記載の生産物。 ８．生物学的に活性のポリペプチドを脊椎動物に供与するうえで使用するための 薬物学的生産物であって、前記ポリペプチドを作動的にコードする薬物学的に有 効な量の裸のポリヌクレオチドと、 前記担体と前記ポリヌクレオチドを無菌状態に包含する容器と、 前記容器に付随し、前記容器か組織の間質的空間への前記ポリヌクレオチドの運 搬を可能にし、それにより前記組織の細胞が前記ポリヌクレオチドを取込みかつ これを発現させることが可能な手段とを含む、生産物。 ９．前記容器が注射器である、請求項８に記載の生産物１０．前記容器内の前記 ポリヌクレオチドの量が少なくとも５マイクログラムである、請求項８に記載の 生産物。 １１．脊椎動物に免疫処置を施すうえで使用するための薬物学的生産物であって 、 免疫原性ポリペプチドを作動的にコードする薬物学的に有効な量の裸のポリヌク レオチドと、 前記ポリヌクレオチドを無菌状態に包含する封止された容器と、 前記容器に付随して、前記容器から組織の間質的空間への前記ポリヌクレオチド の運搬を可能にし、それにより前記組織の細胞が前記ポリヌクレオチドを取込み かつこれを発現させることを可能にする手段とを含む、生産物。 １２．前記容器が注射器である、請求項１１に記載の生産物。 １３．前記容器内の前記ポリヌクレオチドの量が少なくとも５マイクログラムで ある、請求項１１に記載の生産物。 １４．薬物学的生産物であって、 薬物学的に有効な量の裸のアンチセンスポリヌクレオチドと、 前記担体および前記ポリヌクレオチドを無菌状態に包含する容器と、 前記容器に付随して、前記容器から組織の間質的空間への前記ポリヌクレオチド の運搬を可能にし、それにより前記組織の細胞が前記ポリヌクレオチドを吸収す ることが可能な手段とを含む、生産物。 １５．間質的に組織内に導入し、前記組織を構成する細胞によるポリペプチドの 生産を引き起こすための薬物の調製における、生理学的に活性のポリペプチドを 作動的にコードする裸のポリヌクレオチドの用途。 １６．前記薬物が筋肉組織内へ導入されるためのものであり、それにより筋肉細 胞が前記ポリペプチドを生産する、請求項１５に記載の用途。 １７．前記ペプチドがジストロフィンでありかつ前記薬物が筋ジストロフィーの 治療のためのものである、請求項１５に記載の用途。 １８．間質的に脊椎動物の組織内へ導入し、前記脊椎動物の細胞内で相補的ポリ ヌクレオチドの翻訳を抑止するための薬剤の調製における裸のアンチセンスポリ ヌクレオチドの用途。 １９．生体内で脊椎動物の細胞の内部へ薬物または免疫原性ポリペプチドを運搬 する方法であって、薬物学的に許容可能な注射可能な担体と、前記ポリペプチド を作動的にコードする裸のポリヌクレオチドとを含む調製物を前記細胞を含む組 織の間質的空間に導入するステップを含み、それにより前記裸のポリヌクレオチ ドが前記細胞の内部に取込まれかつ前記脊椎動物に対し免疫原性のまたは薬理学 的効果を有する、方法。