FR2796396A1 - Gene de calicivirus felin et vaccin recombine les incorporant - Google Patents

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Philippe Guy Nicolas Baudu
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Abstract

L'invention concerne la séquence du gène de capside et une séquence d'ADNc correspondante, d'une souche FCV dominante dénommée FCV 431. Elle concerne aussi la séquence du gène de capside ainsi que la séquence d'ADNc d'une souche complémentaire dénommée G1. Les séquences d'ADNc peuvent être incorporées dans des vecteurs d'expression en vue de la préparation de préparations immunogènes et de vaccins recombinés permettant la vaccination contre la calicivirose féline.

Description

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La présente invention a trait à des gènes de souches particulières de calicivirus félins et leur utilisation pour la réalisation de préparations immunogènes et de vaccins recombinés contre la calicivirose féline. Ces préparations immunogènes et ces vaccins peuvent également être combinés avec des préparations immunogènes ou des vaccins préparés sur la base d'autres agents pathogènes félins, pour la réalisation de préparations immunogènes et de vaccins multivalents.
Les calicivirus félins (en anglais Feline Calicivirus ou FCV) ont été décrits pour la première fois en 1957 (Fastier L. B. Am. J. Vet. Res. 1957.18. 382-389). Les calicivirus félins sont avec les herpès virus félins les deux sources principales des affections virales du tractus respiratoire supérieur chez le chat.
Les virus FCV touchent un grand nombre d'animaux, avec des taux de portage du FCV de l'ordre de 15 à 25 %, et une séroprévalence anti-FCV de 70 à 100 % (Coutts et al. Vet. Rec. 1994.135. 555-556 ; Ellis T. M. Australian Vet. J. 1981.
57. 115-118 ; Harbour et al. Vet. Rec. 1991.128. 77-80 ; Reubel et al. Feline Dendistry 1992.22. 1347-1360). Après une phase initiale d'hyperthermie, ces affections respiratoires s'accompagnent généralement d'ulcérations buccales (palais, langue, lèvres, nez), de rhinite, de conjonctivite, éventuellement d'anorexie et d'asthénie. Les virus FCV peuvent également causer des pneumonies, des entérites, et des douleurs articulaires (syndrome de boiterie).
La transmission du virus FCV ne se fait qu'horizontalement, il n'y a pas de transmission verticale de la mère à son chaton lors de la gestation (Johnson R.P. Res. Vet. Sci. 1984.31. 114-119). La transmission du FCV se fait par contact entre animaux infectés et animaux sains ou par voie aérienne lors d'éternuements (Wardley RC. Arch. Virol. 1976.52. 243-249).
Les calicivirus félins sont des virus nus de la famille des Caliciviridae, ils sont pourvus d'un ARN positif simple brin, d'une taille d'environ 7,7 kilo paires de bases (kpb) (Carter M. J. Arch. Virol. 1994.9. 429-439).
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Comme de nombreux virus à ARN, une grande hétérogénéité existe au sein de la population virale de FCV. Les variations antigéniques, mises en évidence dès le début des années 70 par des expériences de séroneutralisations croisées, permettent de classer les FCV en plusieurs souches virales ou quasiespèces (Radfoord et al. Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997.93-99).
Plusieurs souches de FCV ont été isolées et séquencées, notamment la souche F9 (Carter et al. Arch. Virol. 1992.122. 223-235, séquence déposée dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accès M86379), CFI (Neill et al. J. Virol. 1991.65. 5440-5447, numéro d'accès GenBank U13992 et M32819), Urbana ou URB (Sosnovtsev et Green Virology 1995. 210. 383-390, numéro d'accès GenBank L40021), F4 (Tohya et al. Arch. Virol. 1991. 117. 173- 181, numéros d'accès GenBank D31836 et D90357), KCD (Fastier L. B. Am. J.
Vet. Res. 1957. 18. 882-889, numéro d'accès GenBank L09719), LLK (numéro d'accès GenBank U07131), NADC (numéro d'accès GenBank L09718), 2280 (numéro d'accès GenBank X99445) et 255 (Kahn et Gillepsie. Cornell Vet. 1970.
60. 669-683, numéro d'accès GenBank U07130).
La vaccination contre le FCV a été mise en place depuis la fin des années 70 à partir de souches FCV atténuées, principalement la souche F9 isolée en 1958 par Bittle (Bittle et al. Am. J. Vet. Res. 1960.21. 547-550) ou des souches dérivées de F9 par passage in vitro ou in vivo (" F9-like ").
Des vaccins inactivés sont aussi disponibles. Ils utilisent les souches 255 et 2280, isolées respectivement en 1970 chez un chat présentant une pneumonie (Kahn et Gillepsie. Comell Vet. 1970.60. 669-683) et en 1983 chez un chat atteint de boiterie (Pedersen et al. Fel. Prac. 1983.13. 26-35).
La réponse humorale est essentiellement dirigée contre la protéine de capside, aussi dénommée p65 (Guiver étal. J. Gen. Virol. 1992.73. 2429-2433).
Les gènes codant pour la protéine de capside de nombreux calicivirus félins ont été séquences et comparés sans que l'on puisse distinguer plus particulièrement certaines séquences (Glenn et al. Proc. 1 sI Int. Symp. Caliciviruses ESW 1997.
106-110 ; Geissler et al. Virus Res. 1997.48. 193-206 ; Neill et al. Proc. 1 sI Int.
Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 120-124).
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Le gène codant pour la protéine de capside a également été cloné et exprimé dans différents systèmes d'expression, notamment le gène codant pour la protéine de capside du virus FCV KS20 dans des plasmides (Geissler et al. J.
Virol. 1999.73. 834-838), les gènes codant les protéines de capside des virus FCV CFI-68, JOK63, JOK92, LS012 et F9 dans des baculovirus (DeSilver et al. Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997.131-143), le gène codant la protéine de capside du virus FCV F4 dans des virus herpès félins de type 1 (Yokoyama et al. J. Vet. Med. Sci. 1998.60. 717-723). Ces différentes constructions ont permis la production de protéines de capside recombinées.
Du fait de la dérive antigénique dans le temps, les antisérums produits contre d'anciennes souches vaccinales isolées dans les années 60-70, telles que les souches F9,255 ou 2280, ne neutralisent que peu d'isolats des années 90. Par exemple, le sérum anti-F9 neutralise 43 % des isolats de la période 1990-96, contre 56 % pour la période 1980-89 et 86 % pour la période 1958-79, et seulement 10 % des isolats anglais de la période 1990-96 (Lauritzen et al. Vet.
Microbiol. 1997. 56. 55-63).
La présente invention a pour objectif la mise en évidence de souches de FCV, induisant chez les chats des anticorps ayant un large spectre de neutralisation croisée.
L'invention a en particulier pour objectif, à partir des souches sélectionnées, l'isolement et la caractérisation, de gènes codant pour des protéines immunogènes utilisables pour la vaccination contre la calicivirose féline.
Un autre objectif de l'invention est de proposer des vecteurs d'expression in vitro et in vivo recombinés contenant et exprimant au moins une telle séquence nucléotidique.
Un autre objectif encore de l'invention est de proposer des préparations immunogènes ou des vaccins contre la calicivirose féline.
Un autre objectif encore de l'invention est de proposer des préparations immunogènes multivalentes et des vaccins multivalents contre la calicivirose féline et contre au moins un autre pathogène félin.
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L'invention concerne essentiellement deux souches FCV obtenues par écouvillonnages pharyngés pratiqués en France et au Royaume-Uni sur des chats présentant des signes d'infection par calicivirus félins. Il s'agit respectivement de la souche G1 (déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (ou CNCM) de l'Institut Pasteur, Paris, France, sous le numéro d'accès 1-2167) et de la souche 431 (déposée à la CNCM sous le numéro d'accès 1-2166), toutes les deux déposées le 12 mars 1999. Cette souche FCV G1isolée en France ne correspond pas à la souche FCV isolée au Royaume-Uni en 1978 par Tohya (Tohya Y. et al. Jpn. J. Sci., 1990,52, 955- 961) et nommée également G1.
La sélection des souches FCV 431 et G1a été réalisée par des tests de séroneutralisation croisée vis-à-vis des isolats FCV d'un panel de référence. Ce panel de référence est composé de 18 isolats actuels de FCV prélevés sur des chats présentant des signes d'infection par calicivirus félin et provenant de trois zones géographiques distinctes. 7 isolats sont américains, ces isolats sont
Figure img00040001

identifiés RMI1, RM12, RMI3, RMI5, RM16, RMI7 et RMI9. 7 isolats sont français, ils sont désignés A2, F1, G1, G3, F3031, H3-2 et H1-4. Les 4 derniers isolats sont anglais, ils sont désignés 431,388b, 337 et J5.
Les souches du panel sont accessibles auprès de la déposante sur simple demande. Ces souches sont également décrites dans un article actuellement sous presse et à paraître dans la revue Archives of Virology .
Lors de tests de séroneutralisations croisées entre les 18 isolats de FCV du panel de référence, il s'est avéré de manière surprenante que l'anti-sérum de l'isolat 431 neutralise 14 des 17 isolats hétérologues du panel de référence (le titre homologue de séroneutralisation n'est pas pris en compte). Par comparaison les anti-sérums des souches vaccinales " historiques " 255 et F9 ne neutralisent chacun que 2 des 18 isolats du panel.
De manière inattendue, la déposante a donc trouvé avec la souche FCV 431 une souche dominante qui peut être utilisée pour la protection des félidés et en particulier des chats contre la plupart des souches FCV. Grâce au panel de souches FCV divulguées ici, il est possible à l'homme du métier de sélectionner
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d'autres souches FCV dominantes. Par équivalence l'invention couvre aussi à travers la souche FCV 431 les souches FCV équivalentes à cette dernière, ayant des anticorps à large spectre de neutralisation croisée.
Il y a équivalence lorsque l'anti-sérum d'une souche FCV séroneutralise au moins 13 des 18 isolats hétérologues du panel de référence (c'est-à-dire incluant FCV 431), préférentiellement lorsqu'il séroneutralise au moins 14 des 18 isolats hétérologues du panel de référence, de manière encore plus préférée lorsqu'il séroneutralise au moins 15 des 18 isolats hétérologues du panel de référence.
On considère généralement qu'une souche de FCV séroneutralise une autre souche FCV lorsque le titre hétérologue de séroneutralisation est supérieur ou égal à 1,2 log10 VN50 (Povey C. et Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11,877-885). La déposante a pris cette valeur comme seuil de positivité.
Cependant, les résultats de séroneutralisation croisée obtenus par un isolat FCV ayant un titre homologue de séroneutralisation inférieur ou égal à 2 logio VN50 ne peuvent être interprétés.
Une seconde méthode pour établir l'équivalence d'une souche FCV vis-àvis de la souche FCV 431 est d'utiliser des anticorps monoclonaux spécifiques de la souche FCV 431 et de tester par immunofluorescence indirecte (IFI) la souche FCV candidate. La déposante a ainsi réussi à produire plusieurs anticorps monoclonaux qui se sont avérés spécifiques de la souche 431. L'un d'eux a été nommé 44. Il y a équivalence si il y a une réactivité en immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux spécifiques de 431, par exemple avec l'anticorps monoclonal 44. Cet anticorps monoclonal et l'hybridome correspondant sont disponibles auprès de la déposante sur simple demande et sont aussi divulgués dans l'article actuellement sous presse et à paraître dans la revue Archives of Virology . Il va de soit cependant que l'homme du métier est parfaitement à même de produire des anticorps monoclonaux par les techniques classiques et de sélectionner, par rapport au panel, ceux qui sont spécifiques de la souche 431.
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L'autre souche FCV G1 a été choisie pour sa complémentarité vis-à-vis de la souche FCV 431, à savoir que la combinaison des anti-sérums de 431 et de G1 séroneutralisent 100% des isolats du panel de référence, c'est-à-dire que la souche FCV G1a un titre homologue de séroneutralisation supérieur ou égal à 2 loglo VN50 et des titres de séroneutralisation hétérologues supérieurs ou égaux à 1,2 loglo VN50 vis-à-vis des isolats FCV du panel de référence contre lesquels l'anti-sérum 431 ne séroneutralise pas ou faiblement (valeur inférieure à 1,2 log10 VNso). L'invention couvre également les souches FCV équivalentes ayant la même complémentarité vis-à-vis de la souche FCV 431. On peut aussi produire et sélectionner des anticorps spécifiques de cette souche, ce qui permet de déterminer des équivalents sur cette autre base.
La déposante a en outre réussi à isoler, caractériser et séquencer le gène de la capside de FCV 431 et FCV G1, la protéine de capside, et a déterminé les séquences d'ADNc (ADN complémentaire) correspondantes.
L'invention a donc pour objet un fragment d'acide nucléique contenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la protéine de capside du virus 431 dont la séquence en acides aminés est représentée à la figure 2, ou un fragment immunologiquement actif de cette protéine, c'est-à-dire un épitope, peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activité immunogène de la protéine de capside.
L'invention a notamment pour objet un fragment d'ADN comprenant la séquence d'ADNc de la figure 2 ou un fragment conservant les propriétés essentielles de la séquence complète, c'est-à-dire codant pour un peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activité immunogène de la protéine de capside. L'invention a en particulier pour objet un fragment d'ADN comprenant cette séquence d'ADNc, notamment couplée avec des éléments de régulation de la transcription.
Il va de soi que l'invention recouvre automatiquement les fragments d'acide nucléique, fragments d'ADN et. séquences d'ADNc équivalents, c'est-àdire les fragments et séquences nucléotidiques ne changeant pas la fonctionnalité ni la spécificité de souche de la séquence décrite ou des
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polypeptides codés par cette séquence. Seront bien entendu incluses les séquences qui diffèrent par dégénérescence du code.
L'invention recouvre également automatiquement les séquences nucléotidiques (ARN, ADN, ADNc) équivalentes en ce sens qu'elles codent pour un peptide ou polypeptide capable d'induire in vivo chez l'espèce féline, en particulier chez le chat, des anticorps ayant sensiblement le même spectre de neutralisation croisée que l'antisérum de la souche FCV 431. Il s'agit en particulier des séquences provenant de souches FCV équivalentes selon la définition donnée plus haut vis-à-vis du panel et/ou de l'anticorps monoclonal 44.
L'invention a aussi pour objet un fragment d'acide nucléique contenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour la protéine de capside du virus G1 telle que représentée à la figure 1., ou un fragment immunologiquement actif de cette protéine, c'est-à-dire un épitope, peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activité immunogène de la protéine de capside.
L'invention a notamment pour objet un fragment d'ADN comprenant la séquence d'ADNc de la figure 1 ou un fragment conservant les propriétés essentielles de la séquence complète, c'est-à-dire codant pour un peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activité immunogène de la protéine de capside. L'invention a en particulier pour objet un fragment d'ADN comprenant cette séquence d'ADNc, notamment couplée avec des éléments de régulation de la transcription. Il va de soi que l'invention recouvre automatiquement les fragments d'acide nucléique, fragments d'ADN et séquences ADNc équivalents, c'est-à-dire les fragments et séquences nucléotidiques ne changeant pas la fonctionnalité ni la spécificité de souche de la séquence décrite ou des polypeptides codés par cette séquence. Seront bien entendu incluses les séquences qui diffèrent par dégénérescence du code.
L'invention recouvre également automatiquement les séquences nucléotidiques (ARN, ADN, ADNc) équivalentes en ce sens qu'elles codent pour un peptide ou polypeptide capable d'induire in vivo chez l'espèce féline, en particulier chez le chat, des anticorps ayant sensiblement le même spectre de
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neutralisation croisée que l'antisérum de la souche FCV G1. Il s'agit en particulier des séquences nucléotidiques provenant de souches FCV complémentaires selon le sens donné plus haut.
Le gène codant pour la protéine de capside des virus FCV G1 et FCV 431 a une taille de 2007 nucléotides pour FCV 431 et de 2010 nucléotides pour FCV G1. La protéine de capside a une taille de 668 acides aminés pour FCV 431 et de 669 acides aminés pour FCV G1, et une masse de 60-65 kDa (protéine p65).
L'invention a aussi pour objet un vecteur d'expression contenant au moins un fragment d'ADN selon l'invention dans des conditions permettant son expression in vivo. Suivant une modalité particulière, le vecteur d'expression comprend un ADNc type 431 et un ADNc type G1. Par type , il faut entendre que l'ADNc est complémentaire d'une séquence ARN de la souche considérée.
Ces vecteurs d'expression peuvent être des poxvirus, par exemple le virus de la vaccine, les avipox (canarypox, folwpox), y compris les poxvirus spécifiques d'espèce (swine pox, raccoonpox et camelpox), les adénovirus et les herpèsvirus, tels que les virus herpès félins. Pour les Poxvirus, l'homme du métier peut se reporter à WO-A-9215672, WO-A-9526751, WO-A-9012882, et WO-A-9527780.
Plusieurs stratégies d'insertions peuvent être utilisées pour l'expression de plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues à partir du même vecteur d'expression in vivo. Ces stratégies d'insertion sont notamment l'utilisation d'une double cassette d'expression ayant une orientation opposée, ou l'utilisation d'une double cassette d'expression ayant une orientation identique, ou encore une cassette multiple d'expression avec un élément " IRES " (Internai Ribosome Entry Site) situé entre chaque insert (brevet EP-A1-0803573).
Les séquences nucléotidiques hétérologues sont insérées sous la dépendance de signaux régulateurs de la transcription et notamment de promoteurs, de préférence apportés lors de l'insertion. Il n'est toutefois pas exclu de faire exprimer ces séquences nucléotidiques hétérologues sous le contrôle de signaux propres au vecteur d'expression utilisé. Pour les vecteurs d'expression canarypox, un des promoteurs préférés est le promoteur vaccine H6 (Taylor J. et
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al. Vaccine, 1988,6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989,63, 4189-4198; Perkus M. et al. J. Virol., 1989,63, 3829-3836).
Les vecteurs d'expression in vivo peuvent également être des plasmides.
Le terme plasmide entend recouvrir toute unité de transcription ADN sous forme d'une séquence polynucléotidique comprenant une séquence d'ADNc selon l'invention et les éléments nécessaires à son expression in vivo. On préfère la forme plasmide circulaire, superenroulée ou non. La forme linéaire entre également dans le cadre de cette invention.
Chaque plasmide comprend un promoteur apte à assurer, dans les cellules hôtes, l'expression de l'ADNc inséré sous sa dépendance. Il s'agit en général d'un promoteur eucaryote fort et en particulier d'un promoteur précoce du cytomégalovirus CMV-IE, d'origine humaine ou murine, ou encore éventuellement d'une autre origine telle que rat, cobaye. De manière plus générale, le promoteur est soit d'origine virale, soit d'origine cellulaire. Comme promoteur viral autre que CMV-IE, on peut citer le promoteur précoce ou tardif du virus SV40 ou le promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous. Comme promoteur cellulaire, on peut citer le promoteur d'un gène du cytosquelette, tel que par exemple le promoteur de la desmine, ou encore le promoteur de l'actine.
Un sous-fragment de ces promoteurs, conservant la même activité promotrice est compris dans la présente invention, e.g. les promoteurs CMV-IE tronqués selon WO-A-98/00166.
Lorsque plusieurs séquences hétérologues (ADNc et/ou gènes de FCV ou d'autres pathogènes félins) sont présents dans le même plasmide, ceux-ci peuvent être présentés dans la même unité de transcription ou dans deux unités différentes.
Les plasmides peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de transcription, tels que par exemple des séquences stabilisatrices du type intron, de préférence intron Il du gène de la p-globine de lapin (van Ooyen et al. Science, 1979,206: 337-344), séquence signal de la protéine codée par le gène de l'activateur du plasminogène tissulaire (tPA ; Montgomery et al. Cell.
Mol. Biol. 1997,43: 285-292), et signal de polyadénylation (polyA), notamment
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du gène de l'hormone de croissance bovine (bGH) (US-A-5 122 458) ou du gène de la (3-globine du lapin.
L'invention a également pour objet l'utilisation des ADNc selon l'invention pour la production in vitro des protéines de capside ou de leurs fragments immunologiquement actifs et leur incorporation dans des préparations immunogènes et vaccins sous-unitaires. La production est effectuée dans des vecteurs d'expression in vitro appropriés, par exemple d'origine virale, tels que Baculovirus, notamment propagé sur cellules d'insectes, ou des cellules d'origine procaryote (par exemple Escherichia colt) ou eucaryote, en particulier des levures, notamment Saccharomyces cerevisiae, des cellules eucaryotes de mammifères, notamment des cellules de hamster (par exemple les cellules ovariennes d'hamster ou CHO) et des cellules félines. L'invention couvre donc également ces vecteurs d'expression incorporant un ADNc selon l'invention, les protéines de capside ou fragments ainsi produits et les préparations immunogènes et vaccins sous-unitaires les incorporant dans un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et de préférence en présence d'un adjuvant.
L'invention a également pour objet une préparation immunogène ou un vaccin contre la calicivirose féline comprenant au moins un vecteur d'expression in vivo recombiné selon l'invention et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant.
La notion de préparation immunogène recouvre toute préparation susceptible, une fois administrée au chat, d'induire une réponse immunitaire dirigée contre le pathogène félin considéré. Par vaccin, on entend une préparation capable d'induire une protection efficace.
De préférence, cette préparation immunologique ou ce vaccin comprend un vecteur d'expression in vivo dans lequel est inséré un ADNc type FCV 431, ce qui inclut ses équivalents.
Selon une première particularité très avantageuse, cette préparation immunologique ou ce vaccin comprend un vecteur d'expression dans lequel est
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inséré un ADNc type FCV 431, ce qui inclut ses équivalents, et un ADNc type FCV G1, ce qui inclut aussi ses équivalents.
Selon une deuxième particularité très avantageuse, cette préparation immunologique ou ce vaccin comprend deux vecteurs d'expression, dans le premier est inséré un ADNc type FCV 431, ce qui inclut ses équivalents, et dans le second un ADNc de la souche FCV G1, ce qui inclut aussi ses équivalents.
Pour adjuver les préparations et vaccins conformes à l'invention, on préfère soit les formuler sous forme d'émulsions huile-dans-l'eau, soit leur ajouter des polymères de l'acide acrylique ou méthacrylique ou des copolymères d'anhydride maléique et de dérivé alcényle, ou encore un lipide cationique contenant un sel d'ammonium quaternaire.
Parmi les polymères, on préfère les polymères de l'acide acrylique ou méthacrylique réticulés, notamment par des éthers polyalcényliques de sucres ou de polyalcools. Ces composés sont connus sous le terme carbomère (Pharmeuropa vol. 8, n 2, juin 1996). L'homme de l'art peut aussi se référer à US-A-2 909 462 (incorporé par référence) décrivant de tels polymères acryliques réticulés par un composé polyhydroxylé ayant au moins 3 groupes hydroxyle, de préférence pas plus de 8, les atomes d'hydrogène d'au moins trois hydroxyles étant remplacés par des radicaux aliphatiques insaturés ayant au moins 2 atomes de carbone. Les radicaux préférés sont ceux contenant de 2 à 4 atomes de carbone, e.g. vinyles, allyles et autres groupes éthyléniquement insaturés.
Les radicaux insaturés peuvent eux-mêmes contenir d'autres substituants, tel que méthyl. Les produits vendus sous la dénomination Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) sont particulièrement appropriés. Ils sont réticulés par un allyl saccharose ou par de l'allylpentaérythritol. Parmi eux, on peut citer les Carbopol 974P, 934P et 971 P.
Parmi les copolymères d'anhydride maléique et de dérivé alcényle, on préfère les EMA# (Monsanto) qui sont des copolymères d'anhydride maléique et d'éthylène, linéaires ou réticulés, par exemple réticulés par du divinyléther. On peut se référer à J. Fields et al., Nature, 186 : 4 juin 1960 (incorporé par référence). Sur le plan de leur structure, les polymères d'acide acrylique ou
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méthacrylique et les EMA# sont formés de préférence de motifs de base de formule suivante :
Figure img00120001

dans laquelle : - Ri et R2, identiques ou différents, représentent H ou CH3 - x = 0 ou 1, de préférence x = 1 - y =1 ou 2, avec x + y = 2
Pour les EMA#, x = 0 et y = 2. Pour les carbomères, x = y = 1.
Ces polymères sont dissous dans l'eau ou dans de l'eau physiologique (NaCI à 20 g/l) et le pH est ajusté à 7,3-7,4 par de la soude, pour donner la solution adjuvante dans laquelle le vecteur d'expression ou les sous-unités seront incorporés
La concentration en polymère dans la composition vaccinale finale sera de 0,01 % à 1,5 % P/V, plus particulièrement de 0,05 à 1 % P/V, de préférence de 0,1 à 0,4 % P/V.
Parmi les lipides cationiques contenant un sel d'ammonium quaternaire, qui sont particulièrement mais pas exclusivement adaptés pour les vecteurs d'expression plasmidiques, on préfère le DMRIE (N-(2-hydroxyéthyl)-N,N- diméthyl-2,3-bis(tetradécyloxy)-1-propanammonium ; WO-A-9634109), de préférence couplé avec un lipide neutre, le DOPE (dioléoyl-phosphatidyl- éthanolamine), pour former le DMRIE-DOPE. De préférence, le mélange plasmide avec cet adjuvant se fait de manière extemporanée et l'on préfère, avant son administration à l'animal, laisser le temps au mélange ainsi constitué
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de se complexer, par exemple pendant une durée allant de 10 à 60 minutes, notamment de l'ordre de 30 minutes.
Lorsque du DOPE est présent, le ratio molaire DMRIE : DOPE va de préférence de 95 : à 5 : 95,plus particulièrement de 1 : 1.
Le ratio pondéral plasmide : adjuvant DMRIE ou DMRIE-DOPE peut aller notamment de 50 : à 1 : notamment de 10 : à 1 : de préférence de 1 : 1 à 1 : 2.
Les vecteurs d'expression in vivo codant pour un ADNc type FCV selon l'invention peuvent également coder pour le GM-CSF félin ou être associés à un second vecteur codant pour le GM-CSF félin (e. g. les plasmides pJP089 et pJP090, respectivement figure 5 et figure 6). Dans le cas de plasmides, on préfère un mélange de deux plasmides. Dans le cas de vecteurs viraux, on préfère un seul vecteur. Ce vecteur d'expression ou ce mélange de vecteurs d'expression peut aussi être adjuvé tel que décrit précédemment.
L'invention a aussi pour objet une préparation immunogène multivalente ou un vaccin multivalent contre la calicivirose féline et contre au moins un autre pathogène félin, utilisant un même vecteur d'expression in vivo recombiné contenant et exprimant au moins un ADNc type FCV selon l'invention et au moins une séquence nucléotidique d'un immunogène d'un autre pathogène félin ou d'un fragment immunologiquement actif de cet immunogène.
L'invention a également pour objet une préparation immunogène multivalente ou un vaccin multivalent comprenant au moins un vecteur d'expression in vivo dans lequel est insérée au moins un ADNc type FCV selon l'invention et au moins un deuxième vecteur d'expression dans lequel est insérée une séquence codant pour un immunogène, ou un fragment immunologiquement actif, d'un autre pathogène félin. Des plasmides appropriés dans lesquels est insérée une séquence codant pour un immunogène, ou un fragment immunologiquement actif, d'un autre pathogène félin, peuvent être notamment ceux décrits dans les exemples 7 à 15 et 17 à 19 de la demande de brevet WOA-9803660 (pPB179, pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083, pAB041).
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Les vaccins recombinés monovalents ou multivalents tels que décrits précédemment peuvent également être associés avec au moins un vaccin classique (inactivé, vivant atténué, sous-unités) dirigé contre au moins un pathogène félin différent.
Lesdits autres pathogènes félins sont notamment choisis parmi le groupe comprenant le virus de la rhinotrachéite féline ou virus herpès félin (FHV), le virus de la leucémie féline (FeLV), les parvovirus félins (FPV), le virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de la rage, Chlamydia.
Entrent aussi dans le cadre de l'invention les préparations immunogènes et vaccins multivalents dans lesquels la valence FCV est une valence sousunitaire comme décrit ci-dessus.
La présente invention a aussi pour objet une méthode d'immunisation des chats, contre les maladies dues aux virus de la calicivirose féline.
Cette méthode comprend l'administration d'une préparation immunologique ou d'un vaccin selon l'invention à des chats. Cette administration peut se faire notamment par la voie parentérale, par administration souscutanée, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale. De préférence, l'administration se fait par la voie sous-cutanée ou intramusculaire.
Différents moyens d'administration peuvent être utilisés pour les préparations immunogènes et les vaccins plasmidiques, notamment des particules d'or enrobées d'ADN et projetées de façon à pénétrer dans les cellules de la peau du sujet à immuniser (Tang et al. Nature 1992.356. 152-154) et les injecteurs par jet liquide permettant de transfecter à la fois des cellules de la peau et des cellules des tissus sous-jacents (Furth et al. Analytical Bioch.
1992. 205. 365-368).
L'homme de l'art possède les compétences nécessaires pour définir précisément le nombre d'administration et les doses à utiliser pour chaque protocole d'immunisation.
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L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel : Figure 1 : Séquence d'ADNc et de la protéine capside de la souche FCV G1 Figure 2 : Séquence d'ADNc et de la protéine capside de la souche FCV 431 Figure 3 : Carte de restriction du plasmide pJCA151 Figure 4 : Séquence de la région C6L du génome du canarypox virus (souche
ALVAC) Figure 5 : Carte de restriction du plasmide pJP089 Figure 6 : Séquence du gène GM-CSF félin 3R3 Figure 7 : Carte de restriction du plasmide pJP090 Figure 8 : Séquence du gène GM-CSF félin 3R4 Figure 9 : Tableau des titres de séroneutralisation croisée Liste des séquences SEQ ID pour les constructions de la présente invention SEQ ID NO 1 : Oligonucléotide PB331 SEQ ID NO 2 : Oligonucléotide PB333 SEQ ID NO 3 : Oligonucléotide PB332 SEQ ID NO 4 : Séquence d'ADNc capside FCV G1 SEQ ID NO 5 : Séquence de la protéine capside FCV G1 SEQ ID NO 6 : Séquence d'ADNc capside FCV 431 SEQ ID NO 7 : Séquence de la protéine capside FCV 431 SEQ ID NO 8 : Oligonucléotide JCA289 SEQ ID NO 9 : Oligonucléotide JCA290 SEQ ID NO 10 : Séquence de la région C6L du canarypox virus (souche ALVAC) SEQ ID NO 11 : Oligonucléotide C6A1 SEQ ID NO 12 : Oligonucléotide C6B1 SEQ ID NO 13 : Oligonucléotide C6C1 SEQ ID NO 14 : Oligonucléotide C6D1 SEQ ID NO 15 : Oligonucléotide JCA291
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SEQ ID NO 16 : Oligonucléotide JCA292 SEQ ID NO 17 : Oligonucléotide JCA293 SEQ ID NO 18 : Oligonucléotide JCA294 SEQ ID NO 19 : Oligonucléotide JCA295 SEQ ID NO 20 : Oligonucléotide JP578 SEQ ID NO 21 : Oligonucléotide JP579 SEQ ID NO 22 : Séquence du gène GM-CSF félin 3R3 SEQ ID NO 23 : Séquence du gène GM-CSF félin 3R4 EXEMPLES Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire (clonage, digestion par les enzymes de restriction, synthèse d'un ADN complémentaire simple brin, amplification en chaîne par polymérase, élongation d'un oligonucléotide par une ADN polymérase...) décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention, ainsi que les divers fragments d'amplification en chaîne par polymérase (= ACP ou PCR), ont été isolés et purifiés en utilisant le kit "Geneclean7" (BI0101 Inc. La Jolla, CA).
Exemple 1 : Isolement et culture souches de calicivirus félin G1 et 431 La souche de calicivirus félin désignée G1 a été obtenue à partir d'un prélèvement réalisé en France sur un chat présentant des signes de calicivirose.
Cette souche FCV G1 a été déposée le 12 mars 1999 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (ou CNCM) de l'Institut Pasteur, Paris, France, sous le numéro d'accès 1-2167.
La souche de calicivirus félin désignée 431 a été isolée à partir d'un prélèvement réalisé en Angleterre sur un chat présentant des signes de calicivirose. Cette
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souche FCV 431 a été déposée le 12 mars 1999 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (ou CNCM) de l'Institut Pasteur, Paris, France, sous le numéro d'accès 1-2166.
Pour leur amplification, les souches de calicivirus félin ont été cultivées sur cellules de la lignée de rein de chat (Crandell-Reese Feline Kidney ou CRFK, N ATCC CCL-94, Crandell étal. In Vitro 1973, 9, 176-185).
Les cellules CRFK sont mises en culture en plaque de 96 puits ou en Falcon 25 cm2avec du milieu DMEM supplémenté de 5 % de sérum de veau foetal contenant environ 100 000 cellules par ml. Les cellules sont cultivées à +37 C en atmosphère contenant 5% de CO2.
Après 3 jours la couche cellulaire arrive à confluence. Le milieu de culture est alors remplacé par du milieu DMEM sans sérum mais additionné de 50 mg/l de gentamycine et les isolats viraux FCV sont ajoutées à raison d'un volume de 100 l de dilutions sériées de quart en quart par puit pour le clonage en dilutions limites des virus FCV ou de 1 ml par Falcon.
Lorsque l'effet cytopathique (CPE) est complet (24-48 heures après le début de la mise en culture), les suspensions virales sont récoltées et congelées à -70 C.
3 à 4 passages successifs sont généralement nécessaires à la production d'un lot viral. Le lot viral est stocké à -70 C.
Exemple 2 : Extraction de l'ARN viral des souches G1 et 431 de calicivirus félin Les cellules CRFK sont cultivées à 37 C en flacons roulants de 2 litres (850 cm2) en milieu Eagle modifié (MEM, Gibco BRL) supplémenté avec 2,5 % d'hydrolysat de lactalbumine (Gibco BRL) et de 5% de sérum de veau foetal (Gibco BRL). On ajoute par flacon roulant 300 ml d'une suspension cellulaire en milieu MEM à environ 100 000 cellules/ml. Après 3 jours la couche cellulaire est confluente. Le milieu de culture cellulaire est alors remplacé par du milieu MEM sans sérum et le virus FCV ajouté à une multiplicité d'infection (moi) de 0,5 DICC50/cellule. La culture virale est maintenue à 37 C pendant 24 à 48 heures jusqu'à l'obtention
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d'un effet cytopathique pour l'ensemble du tapis cellulaire. La suspension virale est récoltée puis clarifiée par centrifugation.
L'ARN viral contenu dans 100 ml de suspension virale de la souche FCV G1, qui vient d'être préparée, a été extrait avec les solutions du kit High PureTM Viral RNA Kit Cat # 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals), en suivant les instructions du fournisseur pour les étapes d'extraction. Le culot d'ARN obtenu à la fin de l'extraction a été re-suspendu avec 10 ml d'eau distillée stérile sans RNase.
L'ARN viral de la souche FCV 431 a été extrait dans les mêmes conditions à partir de 100 ml de suspension virale de la souche correspondante. Le culot d'ARN obtenu à la fin de l'extraction a été re-suspendu avec 10 ml d'eau distillée stérile sans RNase.
Exemple 3 : Synthèse des ADN complémentaires des gènes capsides des souches G1 et 431 de calicivirus félin Les ADN complémentaires correspondant aux gènes capsides des souches G1 et 431 de calicivirus félin ont été synthétisés avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Pour la souche FCV G1, une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction TI-ACP ou RT-PCR ) a été réalisée avec 1 ml de la suspension d'ARN viral FCV G1 (exemple 2) et avec les oligonucléotides suivants : PB331 (33 mer) (SEQ ID NO 1) 5' TTGCGGCCGCTGTGATGTGTTCGAAGTTTGAGC 3' et PB333 (36 mer) (SEQ ID NO 2) 5' TTGGCGCCGYTGACCMAGTGCAGCYTTRTCCAATTC 3' Les conditions de synthèse du premier brin d'ADN complémentaire sont une température de 42 C pendant 15 min, puis 99 C pendant 5 min, et enfin 4 C pendant 5 min. Les conditions de la réaction ACP sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 35 cycles (95 C pendant 1 min, puis 62 C pendant 1 min, et
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72 C pendant 2 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment RTPCR d'environ 2000 paires de bases (pb) qui a été identifié G1-4 .
Pour la souche FCV 431, une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction TI-ACP ou RT-PCR ) a été réalisée avec 1 ml de la suspension d'ARN viral FCV 431 (exemple 2) et avec les oligonucléotides suivants : PB331 ( 33 mer) (SEQ ID NO 1) et PB332 (38 mer) (SEQ ID NO 3) 5' TTGGCGCCAAYWGTRTTWGHTACAGTRTCAATYARRCC 3' Les conditions de synthèse du premier brin d'ADN complémentaire sont une température de 42 C pendant 15 min, puis 99 C pendant 5 min, et enfin 4 C pendant 5 min. Les conditions de la réaction ACP sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 35 cycles (95 C pendant 1 min, puis 62 C pendant 1 min, et 72 C pendant 2 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment RTPCR d'environ 2000 paires de bases (pb) qui a été identifié 431-2 .
Exemple 4 : Clonage du gène codant pour la protéine capside de la souche G1 du calicivirus félin Le fragment RT-PCR G1-4 a été digéré par Narl puis par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Narl-Notl d'environ 2000 pb.
Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBlueScript# Il KS+ (Cat # 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), préalablement digéré par Notl et Clal, puis déphosphorylé, pour donner le plasmide pG1-4-5 (5033 pb).
Le fragment Notl-Narl cloné dans ce plasmide a été entièrement séquence sur les deux brins pour déterminer la séquence du gène capside. La séquence du gène capside de la souche FCV G1 (2010 pb) (SEQ ID NO 4), ainsi que la séquence de la protéine capside (p65) (668 acides aminés) (SEQ ID NO 5) codée par ce gène, sont présentées sur la figure 1.
Exemple 5 : Clonage du gène codant pour la protéine capside de la souche 431 du calicivirus félin
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Le fragment RT-PCR 431-2 a été digéré par Narl puis par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Narl-Notl d'environ 2000 pb.
Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBlueScript# Il KS+ (Cat # 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), préalablement digéré par Notl et Clal, puis déphosphorylé, pour donner le plasmide p431-2-1 (4985 pb).
Le fragment Notl-Narl cloné dans ce plasmide a été entièrement séquence sur les deux brins pour déterminer la séquence du gène capside. La séquence du gène capside de la souche FCV 431 (2007 pb) (SEQ ID NO 6), ainsi que la séquence de la protéine capside (p65) (668 acides aminés) (SEQ ID NO 7) codée par ce gène, sont présentées sur la figure 2.
Exemple 6 : Construction du plasmide pJCA151 Une réaction ACP a été réalisée en utilisant le plasmide p431-2-1 (exemple 5) comme matrice et les oligonucléotides suivants : JCA289 SEQ ID NO 8 (36 mer) : 5' AAACGCGTCGACATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' et JCA290 SEQ ID NO 9 (33 mer) : 5' TTTTGATATCTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 2030 pb. Ce fragment a été digéré avec les enzymes de restriction Sali et EcoRV pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, un fragment Sall-EcoRV de 2014 pb. Ce fragment de restriction a alors été ligaturé avec le plasmide pVR1012 (Hartikka J. et al. Human Gene Therapy. 1997.7. 1205-1217), préalablement digéré par Sali et EcoRV, pour donner le plasmide pJCA151 (6908 pb) (Figure 3).
Exemple 7 : Construction du plasmide donneur pour l'insertion dans le site C6L du canarypox virus La figure 4 (SEQ ID NO 10) montre la séquence d'un fragment de 3700 pb de l'ADN génomique du canarypox virus. L'analyse de cette séquence a révélé un cadre ouvert de lecture (COL) qui a été appelé C6L, qui commence à la position 377 et se termine à la position 2254. La construction d'un plasmide d'insertion
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aboutissant à la délétion du COL C6L et à son remplacement par un site de clonage multiple flanqué de signaux d'arrêt de transcription et de traduction a été réalisée comme décrit ci-après.
Une réaction ACP a été réalisée à partir de la matrice constituée par l'ADN génomique du canarypox virus et avec les oligonucléotides suivants : C6A1 (SEQ ID NO 11) (42 mer) 5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3' et C6B1 (SEQ ID NO 12) (73 mer) 5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTC GTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3' pour isoler un fragment ACP de 432 pb (fragment A).
Une réaction ACP a été réalisée à partir de la matrice constituée par l'ADN génomique du canarypox virus et avec les oligonucléotides suivants : C6C1 (SEQ ID NO 13) (72 mer) 5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAG TATATATAATTGAAAAAGTAA 3' et C6D1 (SEQ ID NO 14) (45 mer) 5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3' pour isoler un fragment ACP de 1210 pb (fragment B).
Les fragments A et B ont été hybridés ensemble pour servir de matrice à une réaction ACP réalisée avec les oligonucléotides C6A1 (SEQ ID NO 11) et C6D1 (SEQ ID NO 14) pour générer un fragment ACP de 1630 pb. Ce fragment a été digéré par les enzymes de restriction Sacl et Kpnl, pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, un fragment Sacl-Kpnl de 1613 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBlueScript# II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), préalablement digéré par les enzymes Sacl et Kpnl , pour donner le plasmide pC6L. La séquence de ce plasmide a été vérifiée par séquençage. Ce plasmide contient 370 pb de séquences situées en amont du COL C6L ( bras flanquant gauche C6 ), un signal vaccine d'arrêt précoce de transcription, des codons stops dans les 6 phases de lecture, un site de clonage
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multiple contenant les sites de restriction Smal, Pstl, Xhol et EcoRI, et enfin 1156 pb de séquences situées en aval du COL C6L ( bras flanquant droit C6 ).
Le plasmide pMP528HRH (Perkus M. et al. J. Virol. 1989.63. 3829-3836) a été utilisé comme matrice pour amplifier la séquence complète du promoteur vaccine H6 (N d'accès GenBank M28351) avec les oligonucléotides suivants : JCA291 (SEO ID NO 15) (34 mer) 5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' et JCA292 (SEQ ID NO 16) (43 mer) 5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3' pour amplifier un fragment ACP de 149 pb. Ce fragment a été digéré par les enzymes de restriction Smal et EcoRI pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, un fragment de restriction Smal-EcoRI de 138 pb. Ce fragment a alors été ligaturé avec le plasmide pC6L, préalablement digéré par Smal et EcoRI, pour donner le plasmide pJCA150.
Exemple 8 : Construction du virus recombiné vCP1710 (canarypox virus recombiné exprimant le gène capside de la souche FCV 431) Une réaction ACP a été réalisée en utilisant le plasmide p431-2-1 (exemple 5) comme matrice et les oligonucléotides suivants : JCA293 (SEQ ID NO 17) (55 mer) : 5'AAATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGCTCAACCTGCGCTAA CGTG 3' et JCA294 (SEQ ID NO 18) (33 mer) : 5' TTTTGTCGACTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 2050 pb. Ce fragment a été digéré avec les enzymes de restriction Nrul et Sali pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Nrul-Sall de 2035 pb (fragment A). Le plasmide pJCA150 (exemple 7) a été digéré par les enzymes de restriction Nrul et Sali pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment de restriction Nrul-Sall d'environ 4500 pb (fragment B). Les fragments A et B ont alors été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pJCA152.
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Le plasmide pJCA152 a été linéarisé par Notl, puis transfecté dans des cellules primaires d'embryons de poulets infectées avec du canarypox virus (souche ALVAC) selon la technique de précipitation au phosphate de calcium précédemment décrite (Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982.79. 4927- 4931 ; Piccini et al. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Des plages positives ont été sélectionnées sur la base d'une hybridation avec une sonde radiomarquée spécifique du gène capside de la souche FCV 431. Ces plages ont subi 4 cycles successifs de sélection/purification de plages jusqu'à ce qu'une population pure ait été isolée. Une plage représentative de la recombinaison in vitro entre le plasmide donneur pJCA152 et le génome du canarypox virus ALVAC a alors été amplifiée et le stock de virus recombiné obtenu a été désigné vCP1710.
Exemple 9 : Construction du virus recombiné vCP1711 (canarypox virus recombiné exprimant le gène capside de la souche FCV G1) Une réaction ACP a été réalisée en utilisant le plasmide pG 1-4-5 (exemple 4) comme matrice et les oligonucléotides suivants : JCA293 (SEQ ID NO 17) et JCA295 (SEQ ID NO 19) (33 mer) : 5' TTTTGTCGACTCATAGTTTTGTCATAGTACTCC 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 2050 pb. Ce fragment a été digéré avec les enzymes de restriction Nrul et Sali pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, un fragment Nrul-Sall de 2035 pb (fragment A). Le plasmide pJCA150 (exemple 7) a été digéré par les enzymes de restriction Nrul et Sali pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment de restriction Nrul-Sall d'environ 4500 pb (fragment B). Les fragments A et B ont alors été ligaturés ensemble pour donner le plasmide pJCA153.
Le plasmide pJCA153 a été linéarisé par Notl, puis transfecté dans des cellules primaires d'embryons de poulets infectées avec du canarypox virus (souche ALVAC) selon la technique de précipitation au phosphate de calcium précédemment décrite (Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982.79. 4927-
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4931 ; Piccini et al. In Methods in Enzymology. 1987.153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Des plages positives ont été sélectionnées sur la base d'une hybridation avec une sonde radiomarquée spécifique du gène capside de la souche FCV G1. Ces plages ont subi 4 cycles successifs de sélection/purification de plages jusqu'à ce qu'une population pure ait été isolée. Une plage représentative de la recombinaison in vitro entre le plasmide donneur pJCA152 et le génome du canarypox virus ALVAC a alors été amplifiée et le stock de virus recombiné obtenu a été désigné vCP1711.
Exemple 10 : Plasmide codant pour le GM-CSF félin Du sang de chat a été récolté par prise de sang sur un tube contenant de l'EDTA. Les cellules mononucléées ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll, puis mises en culture en boîte de Petri de 60 mm de diamètre.
Les cellules mononuclées de chat ont alors été stimulés avec de la concanavaline A (ConA) (concentration finale d'environ 4 g/ml) et avec de la phyto-hémagglutinine (PHA) (concentration finale d'environ 10 g/ml). Après stimulation, les lymphoblastes " ConA " et " PHA " ont été récoltés par grattage des boîtes de culture, et l'ARN total de ces cellules a été extrait en utilisant le kit " mRNA isolation kit for White Blood Cells " (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325).
L'ARN total extrait des lymphoblastes de chat stimulés par la ConA et la PHA a servi de matrice pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire. Ce premier brin d'ADN complémentaire a été produit par élongation de l'oligonucléotide p (dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). L'ADN complémentaire simple brin obtenu a été ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'ACP avec les oligonucléotides suivants : JP578 (SEQ ID NO 20) (33 mer) 5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' et JP579 (SEQ ID NO 21) (36 mer) 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3'
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pour amplifier un fragment ACP d'environ 450 paires de bases (pb). Ce fragment a été digéré par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Notl-Notl de 450 pb. Ce fragment a été alors ligaturé avec le plasmide pVR1012 (Hartikka J. et al. Human Gene Therapy. 1997.7. 1205-1217). Deux clones contenant la séquence GM-CSF félin (SEQ ID NO 22 et SEQ ID NO 23), dans la bonne orientation par rapport au promoteur hCMV/IE ont été identifiés respectivement pJP089 et pJP090. Ces deux plasmide ont une taille de 5364 pb (Figures 5 et 7).
La séquence du gène GM-CSF félin cloné dans le plasmide pJP089 contient 13 différences au niveau nucléotidique avec la séquence GM-CSF félin disponible sur GenBank (n d'accès AF053007). Le changement le plus important est une changement C # T qui entraîne un changement Leucine Phenylalanine pour l'acide aminé (première base du codon de l'acide aminé # 107 ; Figure 6). La séquence du gène GM-CSF félin cloné dans le plasmide pJP090 est équivalent à celle contenue dans le plasmide pJP089, sauf que le changement Leucine # Phenylalanine au n'existe pas pour l'acide aminé # 107 (Figure 8). La vérification de la séquence 3' du gène GM-CSF félin au moyen du kit 3' RACE a montré que, à cette position 107, on peut avoir chez le même chat, l'acide aminé Leucine ou l'acide aminé Phenylalanine.
Exemple 11 : Fabrication des vaccins plasmidiques associés Les divers plasmides nécessaires à la fabrication d'un vaccin associé sont mélangés. Ces plasmides peuvent être notamment ceux décrits dans les exemples 6 et 10 (pJCA151, pJP089 et pJP090) et les exemples 7 à 15 et 17 à 19 de la demande de brevet WO-A-9803660 (pPB179, pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083, pAB041). Les mélanges sont réalisés de telle manière que la concentration finale de chaque plasmide corresponde à la dose efficace de chaque plasmide. Les solutions utilisables pour ajuster la concentration finale du vaccin peuvent être soit une solution NaCI à 0,9 %, soit du tampon PBS.
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Exemple 12 : Formulation des plasmides vaccinaux La solution d'ADN contenant un ou plusieurs plasmides selon l'exemple 11 est concentrée par précipitation éthanolique comme décrit dans Sambrook et al (1989). Le culot d'ADN est repris par une solution de NaCI 0. 9% de façon à obtenir une concentration de 1 mg/ml. Une solution de DMRIE-DOPE à 0,75mM est préparée par reprise d'un lyophilisât de DMRIE-DOPE par un volume adapté d'H20 stérile.
La formation des complexes ADN plasmidique-lipide est réalisée par dilution à parties égales de la solution de DMRIE-DOPE 0.75 mM par la solution d'ADN à 1 mg/ml dans NaCI 0. 9%. La solution d'ADN est introduire progressivement à l'aide d'une aiguille sertie 26G le long de la paroi du flacon contenant la solution de lipide cationique de façon à éviter la formation de mousse. On procède à une agitation douce dès que les deux solutions ont été mélangées. On obtient en final une composition comprenant 0,375 mM de DMRIE-DOPE et 500 g/ml de plasmide.
Il est souhaitable que l'ensemble des solutions utilisées soient à température ambiante pour l'ensemble des opérations décrites ci-dessus. On laisse la complexation ADN/DMRIE-DOPE se mettre en place à température ambiante pendant 30 minutes avant de procéder à l'immunisation des animaux.
Exemple 13 : Formulation des vecteurs canarypox vaccinaux Pour la préparation de vaccins, les virus recombinés canarypox vCP1710 (exemple 8) et vCP1711(exemple 9) peuvent être adjuvés avec des solutions de carbomère. Le carbomère préféré est le CarbopolTM 974P fabriqué par BF Goodrich, Ohio, USA (poids moléculaire d'environ 3 000 000).
Une solution stock à 1,5 % de CarbopolTM 974P est initialement préparée dans de l'eau distillée contenant 1 g/l de chlorure de sodium. Cette solution stock est alors utilisée pour l'élaboration d'une solution à 4 mg/ml de CarbopolTM 974P en eau physiologique. La solution stock est mélangée au volume adéquat d'eau physiologique, soit en une étape unique soit en plusieurs étapes successives, la valeur du pH est ajustée à chaque étape avec une solution d'hydroxyde de
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sodium 1 N (ou encore plus concentrée) afin d'obtenir une valeur finale de pH de 7,3-7,4.
La solution de CarbopolTM 974P prête à l'emploi ainsi obtenue peut être utilisée pour reprendre des virus recombinés lyophilisés (e. g. vCP1710, vCP1711) ou pour diluer des solutions stocks concentrées de virus recombinés (e.g. vCP1710, vCP1711). Par exemple, pour obtenir une suspension virale contenant 108 pfu par dose de 1 ml, on peut diluer une solution virale stock de manière à obtenir un titre de 108.3 pfu/ml, puis diluer à parties égales avec ladite solution de CarbopolTM 974P prête à l'emploi à 4 mg/ml.
Exemple 14 : Tests d'immunofluorescence indirecte (IFI) Les tests IFI sont effectués sur des plaques 96 puits contenant les cellules CRFK cultivées en monocouches et infectées par les virus FCV à tester.
200 l par cupule d'une suspension de cellules CRFK à 90 000 cellules/ml en milieu F15 (Gibco BRL, Cat # 045-1075) contenant 5 % de sérum de veau foetal sont mises en culture en plaque de 96 cupules. A la confluence, 320 DICC50 de FCV sont inoculés sous 100 l de milieu F15. Lorsque les premiers foyers d'ECP apparaissent, les cellules sont alors rincées par du PBS sans calcium ni magnésium (PBS-, Sigma) froid, puis fixées à -20 C pendant 30 minutes par de l'acétone froid contenant 5 % v/v d'eau. Après séchage, les cellules infectées et fixées sont mises en contact pendant 30 minutes à 37 C avec 100 l par cupule de liquide d'ascite correspondant à l'anticorps monoclonal 44 anti-FCV 431 (hybridome 431 2 0 17 E9 T), dilué au 1/5000 ème environ dans du tampon TRIS-HCI 50 mM pH7,6.
Après deux rinçages en PBS-, la fixation des anticorps est révélée par incubation dans les mêmes conditions d'un anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à de l'isothianate de fluorescéine (Biosys, conjugué FITC à 2mg/ml) et dilué à
1/150 en tampon TRIS-HCI 50 mM pH7,6. La lecture est faite sous microscope optique en lumière UV.
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Cet anticorps monoclonal a été testé vis-à-vis de chacun des isolats du panel. Il s'est fixé exclusivement sur les cellules CRFK infectées par le FCV 431.
Ce test peut être utilisé pour déterminer les équivalents de la souche FCV 431.
Ces équivalents sont ceux sur lesquels se fixe l'anticorps monoclonal 44.
Exemple 15 : Séroneutralisation croisée in vitro Des tests de séroneutralisation croisée ont été effectués entre 18 isolats de terrain obtenus par écouvillonnages pharyngés pratiqués sur des chats présentant des signes de calicivirose féline. 7 ont pour origine géographique la France, il s'agit des isolats identifiés A2, F3031, G1, G3, F1, H3-2 et H1-4. 4 ont pour origine géographique la Grande-Bretagne, il s'agit des isolats identifiés J5, 337,388b et 431. Enfin, 7 ont pour origine géographique les USA, il s'agit des
Figure img00280001

isolats identifiés RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 et RMI9. Pour chaque virus FCV, un antisérum a été produit par inoculation de chatons par la voie oronasale avec 1060 DICC50 du virus FCV concerné. Les chatons exempts de pathogènes spécifiques (EOPS) étaient âgés de 10 à 14 semaines.
Le sérum de chaque animal a été collecté un mois après l'infection. Les sérums ont été inactivés par la chaleur (30 minutes à 56 C), répartis, aliquotés et stockés à -20 C.
Le sérum obtenu pour chaque isolat a été testé pour son aptitude à neutraliser les 18 isolats. Les sérums ont été dilués en cascade au tiers avec du milieu DMEM dans des plaques à 96 puits pour culture cellulaire. A 0,05 ml du sérum dilué on a ajouté 0,05 ml de milieu de culture contenant approximativement 100 DICC50 de la souche virale sélectionnée. Ce mélange a été incubé pendant 2 heures à 37 C en étuve en atmosphère contenant 5% C02.
0,15 ml d'une suspension de cellules CRFK contenant environ 100 000 cellules par ml a été ensuite ajoutée à chaque mélange. L'effet cytopathique a été observé par microscopie à contraste de phase après 4 jours de culture à 37 C en atmosphère contenant 5% C02. Les titres neutralisants de chaque sérum ont été calculés d'après la méthode de Kârber. Les titres sont donnés sous la forme de la dilution la plus importante inhibant l'effet cytopathique pour 50 % des cupules.
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Les titres sont exprimés en log10. Le titre minimum ainsi trouvé a été de 0,7 log10 VN50. Chaque sérum a été titré au moins deux fois, de préférence trois fois.
La Figure 9 donne l'ensemble des titres neutralisants obtenus lors des séroneutralisations croisées effectuées entre ces 18 souches FCV et ces 18 sérums.
Il doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention.
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Annexe 1 : SEQ ID NO : 4 atgtgctcaa cctgcgctaa cgtgcttaaa tactatgatt gggatcccca cacaaaattg 60 gttattgacc ccaataaatt cctttctcta ggcttctgcg ataaaccgct tttatgctgc 120 tacccagaac ttctcccaga atttggaaca gtgtgggatt gtgaccaatc ccctctacaa 180 atttaccttg aatctatcct tggtgatgat gaatggagct cgacatttga tgctatcgat 240 cctgttgttc ctcccatgca ttgggacaag gctgggaaaa tcttccagcc tcatcctggt 300 gttctaatgc accacctcat caatgaagtt gcaaaagctt gggatccaaa tctccccatc 360 ttccgattgg aagctgacgg ggattcatcc atcacgaccc ctgagcaagg aacattggtc 420 ggtggtgtta ttgccgagcc cagcgctcaa atggcaactg ctgctgacgc agcaactggc 480 aagagtgttg actcggaatg ggagtctttc ttctcattcc atactagtgt gaattggagt 540 acatctgaaa cccagggaaa gatcctcttt aaacaatctt taggacccct acttaatcct 600 taccttgaac acctttctaa attatacgtt gcttggtctg gatcagtgga tgtaaggttc 660 tctatttctg gctccggtgt cttcgggggg aaattggctg ccattgttgt gcctccaggg 720 gttgaccccg tccagagcac gtcaatgctc cagtatcccc atgtcctctt tgatgctcgc 780 caagttgaac ctgttatatt ttcaatcccc gatttaagga gcactctcta tcacctaatg 840 tctgatactg atactacatc ccttgttatc atggtatata atgatcttat taacccttat 900 gctaatgatt ccaactcttc tgggtgtatt gttaccgttg agaccaaacc tggacctgac 960 ttcaaatttc acctcctgaa accacctgga tcaatgttaa ctcatggctc tattccctct 1020 gacttgattc caaaatcttc atccctttgg attggaaatc gatattggtc tgacataact 1080 gattttgtaa ttcggccaLt cgtgtttcaa gccaatcgtc actttgactt caaccaagaa 1140 acggctggat ggagcacacc aagatttcga cccataacaa taactattag tgaaagtaat 1200 ggatcaaaac tgggaactgg cgtggccaca gattacattg tgcccggcat acctgatggt 1260 tggcctgaca ccacaattgg tgaggaattg acaccagctg gagattactc aatcacaaac 1320 ggtagtggca atgacattgc aacagctaat gcttatgaca gtgctgatgt gatcacaaac 1380 accacaaatt tcagggggat gtacatttgt ggagcactcc agagggcttg gggcgataag 1440 aagatctcaa gtacagcttt cataaccact gctattaagg aaggtaatac gcttaaacca 1500 tcaaatacaa ttgacatgac aaaaattgct gtgtaccagg acactcatgt tggcagggat 1560 gttcaaacat ctgatgatac actggcaatc cttggttaca ctggaattgg tgaacaggca 1620 attggatcta atagggatag tgtggttcgc attagcatgc tgccggaaac tggtgcccgc 1680 ggcgggaatc acccaatttt ctacaaaaat tctattaagt taggatatgt actcaggtca 1740 attgatgtgt tcaactcaca aattctccac acatctagac aactgtccct caatcattac 1800 ttgctaccac ctgactcatt tgctgtttat aggattatag actctaatgg atcttggttt 1860 gatgtaggga ttgatagtga tggtttttcc tttgttggtg tttctagtat ccctaaactt 1920 gagtttcctc tttctgcctc ctacatggga attcagctgg caaagattcg acttgcctct 1980 aacattagga gtactatgac aaaactatga 2010
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Annexe 2 : ID NO : 5 Met Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asp Trp Asp Pro
1 5 10 15 His Thr Lys Leu Val Ile Asp Pro Asn Lys Phe Leu Ser Leu Gly Phe
20 25 30 Cys Asp Lys Pro Leu Leu Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu Phe
35 40 45 Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gln Ser Pro Leu Gln Ile Tyr Leu Glu
50 55 60 Ser Ile Leu Gly Asp Asp Glu Trp Ser Ser Thr Phe Asp Ala Ile Asp
65 70 75 80 Pro Val Val Pro Pro Met His Trp Asp Lys Ala Gly Lys Ile Phe Gln
85 90 95 Pro His Pro Gly Val Leu Met His His Leu Ile Asn Glu Val Ala Lys
Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro Ile Phe Arg Leu Glu Ala Asp Gly Asp
115 120 125
Ser Ser Ile Thr Thr Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val Gly Gly Val Ile
130 135 140
Ala Glu Pro Ser Ala Gln Met Ala Thr Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ser Phe Phe Ser Phe His Thr Ser
165 170 175
Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile Leu Phe Lys Gln
180 185 190
Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His Leu Ser Lys Leu
195 200 205
Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Val Asp Val Arg Phe Ser Ile Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Val Phe Gly- Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val Val Pro Pro Gly
225 230 235 240
Val Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr Pro His Val Leu
245 250 255
Phe Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Ser Ile Pro Asp Leu
260 265 270
Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu
275 280 285
Val Ile Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser
290 295 300
Asn Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp
305 310 315 320
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Annexe 2 (suite) Phe Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly
325 330 335 Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp Ile Gly
340 345 350 Asn Arg Tyr Trp. Ser Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Arg Pro Phe Val
355 - 360 365 Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp
370 375 380 Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ser Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Ser Lys Leu Gly Thr Gly Val Ala Thr Asp Tyr Ile Val Pro Gly
405 410 415 Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Gly Glu Glu Leu Thr Pro
420 425 430 Ala Gly Asp Tyr Ser Ile Thr Asn Gly Ser Gly Asn Asp Ile Ala Thr
435 440 445 Ala Asn Ala Tyr Asp Ser Ala Asp Val Ile Thr Asn Thr Thr Asn Phe
450 455 460 Arg Gly Met Tyr Ile Cys Gly Ala Leu Gln Arg Ala Trp Gly Asp Lys
465 470 475 480
Lys Ile Ser Ser Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Ile Lys Glu Gly Asn
485 490 495
Thr Leu Lys Pro Ser Asn Thr Ile Asp Met Thr Lys Ile Ala Val Tyr
500 505 510
Gln Asp Thr His Val Gly Arg Asp Val Gln Thr Ser Asp Asp Thr Leu
515 520 525
Ala Ile Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Gln Ala Ile Gly Ser Asn
530 535 540
Arg Asp Ser Val Val Arg Ile Ser Met Leu Pro Glu Thr Gly Ala Arg
545 550 555 560
Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Ser Ile Lys Leu Gly Tyr
565 570 575
Val Leu Arg Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile Leu His Thr Ser
580 585 590
Arg Gln Leu Ser Leu Asn His Tyr Leu Leu Pro Pro Asp Ser Phe Ala
595 600 605
Val Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe Asp Val Gly Ile
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Ser Ile Pro Lys Leu
625 630 635 640
Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln Leu Ala Lys Ile
645 650 655
Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Thr Met Thr Lys Leu
660 665
<Desc/Clms Page number 33>
Annexe 3 : ID NO : 6 atgtgctcaa cctgcgctaa cgtgcttaaa tactatgatt gggatcccca ctttagattg 60 attattaacc ccaacaaatl LcLLLccgLt ggcttctgtg ataatcctct tatgtgttgt 120 tatcccgaat tactccctga atltggaact gtgtgggact gtgatcagtc accaclccaa 180 atttatctag agtccatcct tggtgatgac gaatgggctt ccacttacga agcagttgac 240 ccagtggtgc caccaatgca ttgggatagt gctggaaaga tctttcagcc acatcctggt 300 gtattgatgc accatctgat Lggtgaagtt gctaaggcct gggaLccaaa cttaccactc 360 tttcgtctgg aagcggatga tggatctgtg accacgcctg aacaaggaac actggttggt 420 ggagtcattg ctgagcctaa tgcccaaatg LcagctgLtg ctgacgLggc cacLggcaaa 480 agtgttgact ctgagtggga agcaLtcttc tctLtccaca ccagtglcaa ttggagcaca 540 tctgaaaccc aagggaaaat ccttttlaaa caatcLcLag gLccccLacL taacccLLac 600 cttactcalc tcgcaaaact ttatgttgca LggLctggtL cLaLLgaggL tagattttca 660 atttctggat ctggtgtcLL tggtggaaaa ctggctgcta ttgttgtgcc acccgggatc 720 gatcccgLgc aaagcacalc aatgtlgcag Lacccccatg ttctgtttga tgctcgtcaa 780
Figure img00330001

gLtaaaccLg LLatctLcac tatccctgaL Ctgagaaata gtcLatatca ccLtatgLct: 840 gacactgata ctacatctct tgtcattatg atatacaalg atctcattaa tccctatgct 900 aatgatlcta actcatctgg atgcattgtt actgtggaga caaaacctgg ccccgaLLtc 960 aaatttcacc LcLtgaaacc gccLgggLct atgtLaacLc aLgggtcaat, Lccatccgac 1020 ctlatcccaa aatcttcttc LcLLtggatt ggcaaccgac actggtctga LaLaactgat 1080 tttgtcatca aaccttttgt tLLccaggct aatcgacaLL LtgacLLcaa tcaagagact 1140 gcaggctgga gcactcccag atttagaccc ataaccatca cagtttctga gaagggagga 1200 tcaaaattgg gtattggtgL Lgcaactgac LcLaLtgLcc ctggcaLacc agacggclgg 1260 ccggaLacca ccattccaga aaaactlacc ccagcagglg actatgcaat cacaaatggg 1320 ggaaacaatg acaLcaccac tgctgcggac tatgaLgggg caagLataaL caaaaacaat 1380 acaaattLca agggLaLgLa tatttgtggt gcLLtgcaaa gagcLLgggg Lgacaagaaa 1440 aLLLcaaaca ctgccLLtat cactaccgca atcagagagg gtaactcaat aaaaccatct 1500 aatgtaattg acaLgacaaa actLgccgLL LatcaagaLg ctcatgttgg tgcagaactt 1560 caaacctctg acatcacctL agcaatcclt ggttataccg ggattggtga agaagcLata 1620 ggcctggaLa gggacaaagt ggtgcgtatt agcatacLtc cagaaactgg Lgctcgtggc 1680 ggaaatcacc ctattttcta tatgaacaaa atlaaatlag gttatgttat Lagatcaata 1740 gatgtggcaa actcccaaat tttacataca tctaggcaat tatcacLcaa Laattatcta 1800 ctggctcctg actcctttgc agtttacaga aLtattgatL ctggcggctc ttggtttgat 1860 attggtattg atagtgatgg tttttctttt gttggtgtat cLcaaaLLgg aaaattggag 1920 tttccacLaa ctgcctccta catgggaatt caattggcaa agattcgact tgcclcaaac 1980 attaggagLg gaatggttaa aatatga 2007
<Desc/Clms Page number 34>
Annexe 4 : SEQ ID NO : 7 Met Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asp Trp Asp Pro 1 5 10 15 His Phe Arg Leu Ile Ile Asn Pro Asn Lys Phe Leu Ser Val Gly Phe
20 25 30 Cys Asp Asn Pro Leu Met Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu Phe
35 40 45 Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gln Ser Pro Leu Gln Ile Tyr Leu Glu
50 55 60 Ser Ile Leu Gly Asp Asp Glu Trp Ala Ser Thr Tyr Glu Ala Val Asp
65 70 75 80 Pro Val Val Pro Pro Met His Trp Asp Ser Ala Gly Lys Ile Phe Gln
85 90 95 Pro His Pro Gly Val Leu Met His His Leu Ile Gly Glu Val Ala Lys
100 105 110 Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro Leu Phe Arg Leu Glu Ala Asp Asp Gly
115 120 125 Ser Val Thr Thr Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val Gly Gly Val Ile Ala
130 135 140 Glu Pro Asn Ala Gln Met Ser Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160 Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe His Thr Ser Val
165 170 175 Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile Leu Phe Lys Gln Ser
180 185 190 Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Thr His Leu Ala Lys Leu Tyr
195 200 205 Val Ala Trp Ser Gly Ser Ile Glu Val Arg Phe Ser Ile Ser Gly Ser
210 215 220 Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val Val Pro Pro Gly Ile 225 230 235 240 Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr Pro His Val Leu Phe
245 250 255 Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Thr Ile Pro Asp Leu Arg
260 265 270 Asn Ser Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu Val
275 280 285
Ile Met Ile Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser Asn
290 295 300
Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp Phe
305 310 315 320
Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly Ser
325 330 335
<Desc/Clms Page number 35>
Annexe 4 (suite) Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp Ile Gly Asn
340 345 350 Arg His Trp Ser Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Lys Pro Phe Val Phe
355 360 365 Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp Ser
370 375 380 Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Thr Ile Thr Val Ser Glu Lys Gly Gly 385 390 395 400 Ser Lys Leu Gly Ile Gly Val Ala Thr Asp Ser Ile Val Pro Gly Ile
405 410 415 Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala
420 425 430 Gly Asp Tyr Ala Ile Thr Asn Gly Gly Asn Asn Asp Ile Thr Thr Ala
435 440 445 Ala Asp Tyr Asp Gly Ala Ser Ile Ile Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys
450 455 460
Gly Met Tyr Ile Cys Gly Ala Leu Gln Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys
465 470 475 480
Ile Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Ile Arg Glu Gly Asn Ser
485 490 495
Ile Lys Pro Ser Asn Val Ile Asp Met Thr Lys Leu Ala Val Tyr Gln
500 505 510
Asp Ala His Val Gly Ala Glu Leu Gln Thr Ser Asp Ile Thr Leu Ala
515 520 525
Ile Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Glu Ala Ile Gly Leu Asp Arg
530 535 540
Asp Lys Val Val Arg Ile Ser Ile Leu Pro Glu Thr Gly Ala Arg Gly
545 550 555 560
Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Met Asn Lys Ile Lys Leu Gly Tyr Val
565 570 575
Ile Arg Ser Ile Asp Val Ala Asn Ser Gln Ile Leu His Thr Ser Arg
580 585 590
Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Ala Pro Asp Ser Phe Ala Val
595 600 605
Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Gly Gly Ser Trp Phe Asp Ile Gly Ile Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Gln Ile Gly Lys Leu Glu
625 630 635 640
Phe Pro Leu Thr Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln Leu Ala Lys Ile Arg
645 650 655
Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Gly Met Val Lys Ile
660 665
<Desc/Clms Page number 36>
Revendications 1. Fragment d'ADN comprenant la s quence nucl otidique repr sent e la SEQ ID NO: 6 ou un fragment de cette s quence codant pour un peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activit immunog ne de la prot ine cod e par la s quence compl te.
2. Fragment selon la revendication 1, comprenant la s quence nucl otidique repr sent e la SEQ ID NO: 6 et des l ments de r gulation de sa transcription.
3. Fragment d'acide nucl ique codant pour la prot ine de capside repr sent e la SEQ ID NO : 7 ou un fragment immunologiquement actif de cette prot ine.
4. Vecteur d'expression in vivo ou in vitro comprenant un fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2.
5. Vecteur d'expression in vivo selon la revendication 4, caract ris en ce qu'il est choisi dans le groupe constitu des poxvirus, ad novirus et herp svirus.
6. Vecteur d'expression in vivo selon la revendication 4, caract ris en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
7. Vecteur d'expression in vivo selon l'une quelconque des revendications 4 6, caract ris en ce qu'il comprend en outre un fragment d'ADN comprenant tout ou partie de la s quence nucl otidique repr sent e la SEQ ID NO : 4.
8. Fragment d'ADN comprenant tout ou partie de la s quence nucl otidique repr sent e la SEQ ID NO : 4 ou un fragment de cette s quence codant pour un peptide ou polypeptide conservant substantiellement l'activit immunog ne de la prot ine cod e par la s quence compl te.

Claims (13)

  1. 9. Fragment selon la revendication 8, comprenant la séquence nucléotidique représentée à la SEQ ID NO: 4 et des éléments de régulation de sa transcription.
  2. 10. Fragment d'acide nucléique codant pour la protéine de capside représentée à la SEQ ID NO : 5 ou un fragment immunologiquement actif de cette protéine.
  3. 11. Vecteur d'expression in vivo selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un fragment d'ADN selon la revendication 9.
  4. 12. Vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléotidique d'un immunogène, ou fragment immunologiquement actif, d'un autre pathogène félin.
  5. 13. Vecteur d'expression selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'autre pathogène félin est choisi dans le groupe consistant en le virus de la rhinotrachéite féline (nommé aussi herpèsvirus félin, FHV), le virus de la leucémie féline (FeLV), les parvovirus félins (FPV), le virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de la rage, Chlamydia.
  6. 14. Préparation immunogène ou vaccin contre la calicivirose féline, comprenant un vecteur d'expression in vivo dans lequel est insérée une séquence d'ADNc type FCV, qui code pour un peptide ou polypeptide capable d'induire in vivo chez l'espèce féline, en particulier chez le chat, des anticorps capables de séroneutraliser au moins 13 souches FCV parmi celles d'un panel constitué des 18 souches FCV suivantes : RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7, RMI9, A2, F1, G1, G3, F3031, H3-2, H1-4, 431,388b, 337 et J5, préférentiellement au moins 14 desdites 18 souches, et de manière encore plus préférée au moins 15 desdites 18 souches.
    <Desc/Clms Page number 38>
    15. Préparation immunogène ou vaccin selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'expression in vivo selon l'une des revendications 4 à 7 et 11, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant.
  7. 16. Préparation immunogène ou vaccin contre la calicivirose féline, caractérisé en ce qu'il comprend deux vecteurs d'expression in vivo, dans le premier est inséré un fragment d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, et dans le second un fragment d'acide nucléique selon larevendication 8 ou 9, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant.
  8. 17. Préparation immunogène ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, contre la calicivirose féline et contre au moins un autre pathogène félin, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un deuxième vecteur d'expression in vivo dans lequel est insérée une séquence codant pour un immunogène.
  9. 18. Préparation immunogène ou vaccin multivalent contre la calicivirose féline et contre au moins un autre pathogène félin, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'expression in vivo selon l'une des revendications 12 ou 13, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant.
  10. 19. Préparation immunogène ou vaccin multivalent selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un autre vecteur d'expression in vivo dans lequel est insérée une séquence nucléotidique codant pour un immunogène, ou un fragment immunologiquement actif, d'un autre pathogène félin, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant.
    <Desc/Clms Page number 39>
  11. 20. Préparation immunogène ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'un au moins des vecteurs d'expression in vivo est un plasmide et que l'adjuvant est un lipide cationique contenant un sel d'ammonium quaternaire, le DMRIE, de préférence couplé avec un lipide neutre, le DOPE pour former le DMRIE-DOPE.
  12. 21. Préparation immunogène ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'un au moins des vecteurs d'expression in vivo est un poxvirus, de préférence un canarypox, et que l'adjuvant est un polymère de l'acide acrylique ou méthacrylique, de préférence un carbomère.
  13. 22. Préparation immunogène ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un vecteur plasmidique d'expression in vivo dans lequel est inséré le gène codant pour le GM-CSF félin.
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