ES2259605T3 - Vacuna de adn pvc. - Google Patents

Vacuna de adn pvc.

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ES2259605T3
ES2259605T3 ES00935220T ES00935220T ES2259605T3 ES 2259605 T3 ES2259605 T3 ES 2259605T3 ES 00935220 T ES00935220 T ES 00935220T ES 00935220 T ES00935220 T ES 00935220T ES 2259605 T3 ES2259605 T3 ES 2259605T3
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Jean-Christophe Francis Audonnet
Michel Bublot
Jennifer Maria Perez
Catherine Elisabeth Charreyre
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Abstract

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Description

Vacuna de ADN PVC.
La presente invención hace referencia a las construcciones de plásmidos que codifican y expresan inmunógenos de circovirus porcino (PCV para CircoVirus Porcino) responsables del síndrome de PMWS (síndrome de pérdida multisistémica porcina o el síndrome de pérdida multisistémica post-destete), a los procedimientos de vacunación y a las vacunas de ADN, así como a los procedimientos de producción y de formulación de estas vacunas.
El PCV se detectó originalmente como un contaminante no citopatogénico en líneas celulares de riñón de cerdo PK/15. Este virus se clasificó entre los Circoviridae junto con el virus de la anemia del pollo (CAV para Virus de la Anemia del Pollo) y el virus PBFDV (Virus de la enfermedad de pico y plumas de los psitácidos). Estos son virus pequeños sin envoltura (de 15 a 24 nm) cuya característica común es contener un genoma en la forma de un ADN circular de cadena única de 1,76 a 2,31 Kb. En primer lugar se pensó que este genoma codificaba un polipéptido de aproximadamente 30 KDa (Todd y otros, Arch. Virol., 1991, 117:129-135). Trabajos recientes han demostrado sin embargo una transcripción más compleja (Meehan B.M. y otros, J. Gen. Virol., 1997, 78:221-227). Además, no se conocen homologías significativas en la secuencia nucleotídica o en determinantes antigénicos comunes entre las tres especies de circovirus conocidos.
El PCV derivado de células PK/15 no se considera patogénico. Su secuencia se conoce gracias a B.M. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1997 (78) 221-227. Recientemente algunos autores han pensado que cepas de PCV podrían ser patogénicas y asociarse con el síndrome de PMWS (G.P.S. Nayar y otros, Can. Vet. J., 1997, 38:385-387 y Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997:499-501). Nayar y otros, han detectado ADN de PCV en cerdos que tienen el síndrome de PMWS utilizando técnicas de PCR.
Los anticuerpos mono y policlonales dirigidos contra los circovirus hallados en cerdos con síntomas del síndrome de PMWS son capaces de demostrar diferencias entre estos circovirus y los circovirus porcinos aislados del cultivo de células PK-15 (Allan G.M. y otros, Vet. Microbiol., 1999, 66:115-123).
El síndrome de PMWS detectado en Canadá, Estados Unidos de América y Francia se caracteriza clínicamente por una pérdida gradual de peso y por manifestaciones como la taquipnea, dispnea y la ictericia. Desde el punto de vista patológico, se manifiesta mediante infiltraciones linfocíticas o granulomatosas, linfoadenopatías y, más raramente, por hepatitis y nefritis linfocítica o granulomatosa (Clark E.G., Proc. Am. Assoc, Swine Prac. 1997:499-501; La Semaine Vétérinaire No. 26, suplemento de La Semaine Vétérinaire 1996 (834) ; La Semaine Vétérinaire 1997 (857) :54 ; G.P.S. Nayer y otros, Can. Vet. J., 1997, 38:385-387).
Estos circovirus obtenidos de Norte-América y de Europa están muy estrechamente relacionados, con un nivel de identidad de más del 96% en su secuencia nucleotídica, mientras que el nivel de identidad es inferior al 80% cuando se comparan las secuencias nucleotídicas de estos circovirus con las de los porcinos aislados de células PK-15. Por consiguiente, se han propuesto dos subgrupos virales, PCV-2 para los circovirus asociados con el síndrome de PMWS y el PCV-1 para los circovirus aislados de células PK-15 (Meehan B.M. y otros, J. Gen. Virol., 1998, 79:2171-2179; solicitud de patente internacional WO-A-9918214). En la solicitud de patente internacional WO 99729871, se utiliza un ácido nucleico que codifica un ORF1 de PCV2 en la vacunación.
El solicitante ha hallado que las construcciones plasmídicas que codifican y expresan los inmunógenos de PCV-2 pueden utilizarse para inmunizar cerdos contra el síndrome de PMWS.
Los inmunógenos del PCV-2 se pueden utilizar combinados con inmunógenos de PCV-1 para inmunizar también estos animales contra PCV-2.
El objetivo de la presente invención se refiere a las construcciones que codifican y expresan un inmunógeno de PCV-2, concretamente marcos de lectura abierta (ORFs) 1 y/o 2 para PCV-2 (ORF significa marca de lectura abierto).
La reivindicación 1 de la solicitud aporta la solución al problema indicado por la presente solicitud.
Es evidente que la invención abarca automáticamente los plásmidos que codifican y expresan secuencias nucleotídicas equivalentes, es decir las secuencias que cambian la funcionalidad o la especificidad de la cepa (es decir la cepa de tipo 2) del gen considerado o los del polipéptido codificado por dicho gen. Las secuencias que difieran por la degeneración del código, estarán, desde luego, incluidas.
Las secuencias de PCV-2 utilizadas en estos ejemplos se derivan de Meehan y otros, supra (Strain Imp.1010; nucleótidos 398-1342 del ORF1; los nucleótidos 1381-314 del ORF2; y los correspondientes respectivamente al ORF4 y ORF13 en la patente americana US 09/161.092 del 25 de septiembre de 1998 y a COL4 y COL13 en la solicitud de patente internacional WO-A-9918214). Otras cepas de PCV-2 y sus secuencias se han publicado en la solicitud de patente internacional WO-A-9918214 y se han denominado Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 e Imp1011-48121, así como en A.L. Hamel y otros, J. virol. Junio de 1998, vol. 72, 6:5262-5267 (GenBanK aF027217) y en I. Morozov y otros, J. Clinical Microb. Septiembre de 1998, vol. 36, 9:2535.-2541, así como el GenBank AF086834, AF086835 y AF086836, y proporciona acceso a las secuencias ORF equivalentes.
La invención también abarca las secuencias equivalentes en el sentido de que son capaces de hibridarse con la secuencia nucleotídica del gen considerado en condiciones de alta astringencia. Entre las secuencias equivalentes, se pueden mencionar los fragmentos de genes que conservan la inmunogenicidad de la secuencia completa.
La homología del genoma completo de los tipos 1 y 2 es a aproximadamente del 75%. Para el ORF1, es de aproximadamente el 86%, y para el ORF2, aproximadamente del 66%. Por el contrario, las homologías entre los genomas y entre los ORFs dentro del tipo 2 están generalmente por encima del 95%.
Según la presente invención, también son secuencias equivalentes al ORF1, aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 88%, y en particular al 90%, preferentemente al 92% o al 95% con el ORF1 de la cepa Imp1010, y para el ORF2, aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 80%, y en particular al 85%, preferentemente al 90% o al 95% con el ORF2 de la cepa Imp1010.
El ORF1 y el ORF2, según Meehan 1998, tienen el potencial para codificar proteínas con pesos moleculares pronosticados de 37,7 KD y 27,8 KD, respectivamente. El ORF3 y el ORF4 (según Meehan y otros, 1998, corresponden con el ORF7 y ORF10, respectivamente, en la solicitud de patente internacional WO-A-9918214) tienen el potencial para codificar proteínas con pesos moleculares pronosticados de 11,9 y 6,5 Kda, respectivamente. La secuencia de estos ORFs está también disponible en el GenBank como AF 055392. También se pueden incorporar en plásmidos y ser utilizados de acuerdo con la invención o en combinación, por ejemplo, con el ORF1 y/o el ORF2.
Los otros ORFs 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 descritos en la solicitud de patente americana US 09/161.092 del 25 de septiembre de 1998 (COLs 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12, en la patente internacional WO-A-9918214), pueden utilizarse en las condiciones descritas en la presente, combinados entre sí o junto con los ORFs 1 y 2 tal como se define en la presente.
Esto también comprende la utilización de secuencias equivalentes en el sentido descrito anteriormente, en particular los ORFs derivados de diversas cepas de PCV-2 citadas en la presente. Por homología, se puede precisar que son equivalentes aquellas secuencias que proceden de una cepa de PCV con un ORF2 y/o un ORF1 que tiene una homología tal como se definió anteriormente con el ORF correspondiente de la cepa 01010. Para el ORF3, según Meehan, se puede también decir que la homología ha de ser, por ejemplo, igual o superior al 80%, preferentemente al 85%, más preferentemente al 90% o 95% con el ORF3 de la cepa Imp1010. Para el ORF4, de acuerdo con Meehan 1998, puede ser igual o superior al 86%, preferentemente al 90%, más preferentemente al 95% con el ORF4 de la cepa Imp1010.
A partir de la secuencia nucleotídica genómica, por ejemplo, la descrita en la solicitud de patente internacional WO-A-99 18214, en un procedimiento de rutina se determina los ORFs mediante la utilización de un programa estándar, tal como el MacVector®. Además, el alineamiento de los genomas con los de la cepa 1010 y la comparación con los ORFs de la cepa 1010 permite a un experto en la materia determinar fácilmente los ORFs en el genoma de otra cepa (por ejemplo, los descritos en la solicitud de patente internacional WO-A-99 18214). Utilizando un programa o realizando un alineamiento no se requiere de una experimentación excesiva y se proporciona un acceso directo a los ORFs equivalentes.
El término plásmido se utiliza en la presente para abarcar cualquier unidad de transcripción de ADN en la forma de una secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia PCV a expresar y los elementos necesarios para su expresión in vivo. La forma de plásmido circular, superenrollada o de otra forma, es la preferible. La forma lineal también se incluye dentro del alcance de la invención.
La materia de la presente invención se refiere preferiblemente a plásmidos denominados pJP109 (que contienen el gen de ORF2 de PCV-2, Figura 1), pJP111 (que contiene el gen de ORF1 de PCV-2, Figura 2), pJP120 (que contiene el gen de ORF2 de PCV-1, Figura 3), y el pJP121 (que contiene el gen de ORF1 de PCV-1, Figura 4).
Cada plásmido comprende un promotor capaz de asegurar, en las células huésped, la expresión del gen insertado bajo su control. Se trata en general de un promotor eucariótico fuerte y, en particular, de un promotor temprano del citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, u opcionalmente de otro origen, tal como rata o cobaya. Más generalmente, el promotor es de origen viral o celular. Como un promotor viral distinto al CMV-IE, puede mencionarse el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del Sarcoma de Rous. También se puede utilizar un promotor procedente del virus de donde procede el gen, por ejemplo, el promotor específico para el gen. Como promotor celular, se puede mencionar el promotor de un gen del citosqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina, o alternativamente el promotor de actina. Cuando en el mismo plásmido están presentes varios genes, éstos pueden hallarse en la misma unidad de transcripción o en dos unidades distintas.
Los plásmidos también pueden comprender otros elementos de regulación de la transcripción tal como, por ejemplo, las secuencias estabilizadoras del tipo intrón, preferentemente el intrón II del gen de la \beta-globina de conejo (van Ooyen y otros; Science, 1979, 206:337-344), secuencia señal de la proteína codificada por el gen del activador del plasminógeno tisular (tPA; Montgomery y otros, Cell Mol Biol. 1997, 43:285-292), y la señal de poliadenilación (poliA), en particular el gen de la hormona de crecimiento bovina 
\hbox{(bGH) (US-A-5, 122, 458)
o el gen de la  \beta -globina de conejo.}
La materia de la presente invención incluye también preparaciones inmunogénicas y vacunas de ADN que comprenden al menos un plásmido según la invención, que codifican y expresan uno de los inmunógenos de PCV-1 o PCV-2, preferentemente uno de los ORFs mencionados anteriormente, además de un vehículo o diluyente aceptable veterinariamente, con opcionalmente, además, un adyuvante aceptable veterinariamente.
La materia de la presente invención incluye más particularmente preparaciones inmunogénicas y vacunas que contienen al menos un plásmido que codifica y expresa uno de los inmunógenos de PCV-2, que se formula con un adyuvante, el cual es un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternaria de fórmula
R_{1} --- O --- CH_{2} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}
H --- CH_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{N}{\uelm{\para}{CH _{3} }}
^{+} --- R_{2} --- X
en donde, R1 es un radical alifático lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que comprende de 2 a 3 átomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o un grupo amino.
Preferentemente, es DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis (tetradeciloxi)-1-propanamonio; solicitud de patente internacional WO-A-9634109), y acoplado preferentemente con un lípido neutral, por ejemplo, preferentemente DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina), para formar DMRIE-DOPE. Preferentemente, la mezcla plasmídica con el adyuvante se realiza inmediatamente antes de su utilización y, preferentemente, antes de su administración al animal. La mezcla producida de esta manera permite la formación de un complejo, por ejemplo durante un periodo de tiempo de entre 10 a 60 minutos, en particular del orden de 30 minutos.
Cuando el DOPE está presente, la proporción molar DMRIE:DOPE se halla preferentemente entre 95:5 y 5:95, más preferentemente en 1:1.
La proporción de pesos del adyuvante del plásmido:DMRIE o DMRIE:DOPE puede variar desde 50:1 a 1:10, preferentemente desde 10:1 a 1:5 y más preferentemente desde 1:1 a 1:2.
Según el modo ventajoso de la invención, es posible utilizar, como adyuvante, un compuesto de adyuvante seleccionado de entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maléico y el derivado de alquenilo. Son preferibles los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulados en particular con éteres de polialquileno de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos son conocidos por el término carbómero (Pharmeuropa vol., 8, No. 2, Junio de 1996). Los expertos en la materia pueden también referirse a la patente americana US-A-2.909.462 (incorporado en la presente como referencias) que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilos reemplazados con grupos radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, los vinilos, los alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los grupos radicales insaturados pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre de Carbopol® (GFGoodrich, Ohio, USA) son particularmente adecuados. Están reticulados con una alil sacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos, se ha de mencionar Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maléico y de un derivado de alquenilo, los EMAs® (Monsanto) son los preferidos como copolímeros de anhídrido maléico y etileno, lineal o reticulado, por ejemplo reticulado con el divinil éter. Se debe mencionar a J. Fields y otros, Nature, 186:778-780, 4 de Junio de 1960 (incorporado en la presente como referencia). Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los EMAs® consisten preferentemente de unidades básicas de la fórmula siguiente:
--- 
\melm{\delm{\para}{COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{1} }}
--- (CH_{2})_{x} --- 
\melm{\delm{\para}{COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{2} }}
--- (CH_{2})_{y} ---
en donde,
- R1 y R2, que son idénticos o distintos, representan H o CH3.
- X = 0 ó 1, preferentemente x = 1
- Y = 1 ó 2, siendo x + y = 2
Para los EMAs®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.
La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente a pH fisiológico, para obtener la solución de adyuvante en la cual se incorporará la vacuna final. Los grupos carboxilo del polímero se hallan parcialmente en la forma COO^{-}.
Para este tipo de adyuvante, es preferible preparar una solución de adyuvante, en particular de carbómero, en agua destilada, preferentemente en presencia de cloruro sódico, estando la solución obtenida a un pH ácido. Esta solución madre se diluye mediante la adición de la cantidad adecuada (con el fin de obtener la concentración final deseada), o una parte esencial de la misma, de agua con NaCl, preferentemente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l), en una o más partes con una neutralización concomitante o posterior (pH 7,3 a 7,4), preferentemente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utilizará para mezclarla con el plásmido, en particular guardada en forma líquida, liofilizada o congelada.
La concentración del polímero en la composición de vacuna final estará entre el 0,01% y el 2% p/v, más preferentemente del 0,06% al 1% p/v, más preferentemente del 0,1% al 0,6% p/v.
En una realización específica, la preparación inmunogénica o de la vacuna comprende un plásmido o una mezcla de plásmidos que codifican y expresan el ORF1 y ORF2 de PCV-2.
La invención también proporciona la combinación de la vacuna contra el circovirus porcino con una vacuna contra otros patógenos del cerdo, en particular aquellos que pueden asociarse con el síndrome de PMWS. A modo de ejemplo, se puede citar: el virus de la enfermedad de Aujeszky, el virus de la gripe porcina, PRRS, parvovirus porcino, virus del cólera porcino, Actinobacillus pleuropneumoniae.
La materia de la presente invención es por tanto mezclas de plásmidos que contienen al menos un plásmido según la invención y al menos otro plásmido que codifica y expresa un inmunógeno porcino, seleccionado por ejemplo, de entre el grupo que consiste las glicoproteínas gB y gD del virus de la enfermedad de Aujeszky (virus de la pseudorrabia o PRV), la hemaglutinina y la nucleoproteína del virus de la gripe porcina H1N1, la hemaglutinina y la nucleoproteína del virus de la gripe porcina H3N2, los genes del ORF5 y ORF3 del virus PRRS de las cepas Lelystad y USA, la proteína VP2 del parvovirus porcino, las proteínas E1 y E2 del virus del cólera porcino (HCV), los genes eliminados apxI, apxII y apxIII de Actinobacillus pleuropneumoniae (véanse por ejemplo los plásmidos de la solicitud de la patente internacional WO-A-9803658).
Estas mezclas de plásmidos se realizan en un vehículo o diluyente aceptable veterinariamente, con opcionalmente, además, un adyuvante aceptable veterinariamente, tal como se describió anteriormente, formando así las preparaciones inmunogénicas o las vacunas de ADN multivalentes. Estas preparaciones o vacunas multivalentes pueden además formularse ventajosamente con un lípido catiónico, tal como se describió anteriormente, en particular el DMRIE, y preferentemente acoplado con un lípido neutro, DOPE, para formar el DMRIE-DOPE.
Las preparaciones o las vacunas mono o multivalentes de ADN según la invención, formuladas o con un adyuvante, tal y como se describió anteriormente, también pueden complementarse de forma ventajosa con una citocina, preferentemente de origen porcino, en particular GM-CSF porcino. Esta adición de GM-CSF porcino (factor estimulante de la formación de colonias de macrófagos y granulocitos; Clark S.C. y otros, Science 1987, 230:1229; Grant S.M. y otros, Drugs, 1992, 53:516) puede llevarse a cabo en particular mediante la incorporación en la preparación o en la vacuna de proteína GM-CSF porcina o de un plásmido que codifica y expresa el gen de GM-CSF porcino (Inamaru S. y Takamatsu H. Immunol. Cell. Biol., 1995, 73:474-476). Preferentemente, el gen de GM-CSF porcino se inserta en un plásmido diferente de los que codifican los inmunógenos de PCV u otros inmunógenos porcinos.
En particular, el plásmido que codifica y expresa el GM-CSF porcino puede ser el plásmido pJP058 (Figura 5).
Las preparaciones inmunogénicas y las vacunas mono o multivalentes de ADN según la invención también pueden combinarse con al menos una vacuna convencional (virus vivos atenuados, inactivados o una subunidad) o la vacuna recombinante (vector viral) dirigido contra al menos un patógeno porcino distinto o idéntico. La invención proporciona en particular la combinación con vacunas convencionales (virus vivos atenuados, inactivados o una subunidad) con un adyuvante. Para las vacunas de virus inactivados o de subunidades, se debe mencionar aquellas que contienen en particular gel de alúmina solo o mezclado con saponina como adyuvante, o las que se formulan en la forma de una emulsión aceite en agua.
La materia de la presente invención es también una vacuna para utilizar en un procedimiento de inmunización que permite inducir una respuesta inmune hacia los circovirus en los cerdos según la invención. Los procedimientos de inmunización y vacunación comprenden la administración de una de las preparaciones o de una de las vacunas mono o multivalentes de ADN, tal y como se describió anteriormente. Estos procedimientos de inmunización y vacunación comprenden la administración de una o más dosis sucesivas de estas preparaciones o vacunas de ADN. Las preparaciones y las vacunas de ADN pueden administrarse, en el contexto de este procedimiento de inmunización o de vacunación, mediante diversas vías de administración propuestas en la técnica anterior para la vacunación de polinucleótidos, en particular las vías intramusculares e intradérmicas, y mediante técnicas de administración conocidas, en particular inyecciones con una jeringa y aguja, mediante chorro de líquido (Furth y otros, Analytical Bioch., 1992, 205:365-368) o mediante proyección de partículas de oro recubiertas con ADN (Tang y otros, Nature, 1992, 356:152-154).
Los procedimientos no sólo permiten la administración a cerdos adultos, sino también a hembras jóvenes y gestantes; en el último caso, esto permite, en particular, la transferencia de una inmunidad pasiva a los recién nacidos (anticuerpos maternos). Preferentemente, los cerdos hembras se inoculan antes de su cría; y/o antes de la copulación, y/o durante la gestación. Ventajosamente, se realiza al menos una inoculación antes de la copulación y preferentemente se prosigue por una inoculación a realizar durante la gestación, por ejemplo, aproximadamente en la mitad de la gestación (aproximadamente 6-8 semanas de gestación) y/o al término de la gestación (aproximadamente 11-13 semanas de gestación). De este modo, una pauta ventajosa es una inoculación antes de la copulación y un refuerzo de inoculación durante la gestación. A partir de este instante, puede realizarse una reinoculación antes de cada copulación y/o durante la gestación a aproximadamente la mitad de la gestación y/o al término de la gestación. Preferentemente, las reinoculaciones se realizan durante la gestación.
Los cochinillos, tales como los cochinillos de hembras vacunadas (por ejemplo, inoculadas tal y como se ha descrito anteriormente en la presente), se inoculan durante las primeras semanas de vida, por ejemplo, se inoculan durante la primera y/o segunda y/o tercera y/o cuarta y/o quinta semana de vida. Preferentemente, los cochinillos se inoculan en primer lugar durante la primera semana de vida o durante la tercera semana de vida (por ejemplo, durante el destete). De forma ventajosa, dichos cochinillos se refuerzan de dos a cuatro semanas más tarde.
La cantidad de ADN utilizado en las vacunas según la presente invención está entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 2000 \mug, y preferentemente entre aproximadamente 50 \mug y 1000 \mug. Los expertos en la materia tienen la competencia necesaria para definir con precisión la dosis efectiva de ADN a utilizar para cada protocolo de inmunización o vacunación.
Los volúmenes de las dosis pueden hallarse entre 0,5 y 5 ml, preferentemente entre 2 y 3 ml.
Un procedimiento preferido de inmunización o de vacunación consiste en la administración de vacunas de ADN por vía intramuscular.
La invención se describirá a continuación con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realizaciones sin intención limitante, y teniendo en cuenta las siguientes figuras, en las que:
Figura 1: plásmido pJP109
Figura 2: plásmido pJP111
Figura 3: plásmido pJP120
Figura 4: plásmido pJP121
Figura 5: plásmido pJP058
Listado de secuencias SEC ID:
SEC ID Nº1: oligonucleótido JP779
SEC ID Nº2: oligonucleótido JP780
SEC ID Nº3: oligonucleótido JP781
SEC ID Nº4: oligonucleótido JP782
SEC ID Nº5: oligonucleótido JP783
SEC ID Nº6: oligonucleótido JP784
SEC ID Nº7: oligonucleótido JP785
SEC ID Nº8: oligonucleótido JP786
SEC ID Nº9: oligonucleótido RG972
SEC ID Nº10: oligonucleótido RG973
Ejemplos
Las cepas de PCV-2 útiles para la clonación de los ORFs son, por ejemplo, las cepas depositadas en el ECACC y que tienen los números de acceso V97100219 (Imp1008), V97100218 (Imp1010) y V97100217 (Imp999) (depositadas el 2 de Octubre de 1997), V98011608 (Imp1011-48285) y V98011609 (Imp1011-48121) (depositadas el 16 de Enero de 1998).
Estos ejemplos se han realizado utilizando la cepa Imp1010. El experto en la materia es capaz de adaptar el proceso a otras cepas PCV-2.
Ejemplo 1 Construcciones del plásmido pJP109
El plásmido pGEM7Z-Imp1010 Stoon-EcoRI Nº 14 que contiene el genoma del virus PCV-2 en la forma de un fragmento EcoRI (B. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1998, 79:2171-2179) se digirió con EcoRI con el fin de aislar, después de una electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de EcoRI-EcoRI de 1768 pares de bases (pb). Este fragmento se unió él mismo.
Se amplificó el gen del ORF2 de la cepa 1010-Stoon del virus PCV-2 (B. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1998, 79:2171-2179; Nº de acceso del GenBank AF055392) utilizando la plantilla que consistía en el fragmento EcoRI-EcoRI autounido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los oligonucleótidos siguientes:
JP779 (SEC ID NO 1) (35 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5' CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
y JP780 (SEC ID NO 2) (36 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TACTACTACAGATCTTTAAGTGGGGGGTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
con el fin de generar un fragmento de PCR de 730 pb. Este fragmento se digirió con SalI y BglII con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII. Este fragmento se unió a continuación con el plásmido pVR1012 (Hartikka J. y otros, Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217), digerido anteriormente con SalI y BglII, para proporcionar el plásmido pJP109 (5567 pb) (Figura 1).
Ejemplo 2 Construcción del plásmido pJP111
Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa con el plásmido pGEM7Z-Imp1010-Stoon (véase el Ejemplo 1) (B. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1998, 79, 2171-2179), y los oligonucleótidos siguientes:
JP781 (SEC ID NO 3) (35 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'- CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
y JP782 (SEC ID NO 4) (36 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
con el fin de generar un fragmento de PCR de 970 pb que contiene el gen de ORF1 del virus PCV-2. Este fragmento se digirió con SalI y BglII con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 955 pb. Este fragmento se unió a continuación con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para proporcionar el plásmido pJP111 (5810 pb) (Figura 2).
Ejemplo 3 Construcción del plásmido pJP120 (PCV-1 ORF2)
Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa con el plásmido pPCV1 (B. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1997, 78:221-227), y los oligonucleótidos siguientes:
JP783 (SEC ID NO 5) (35 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'- CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG-3'
\newpage
y JP784 (SEC ID NO 6) (40 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
con el fin de generar un fragmento de PCR de 730 pb que contiene el gen del ORF2 del virus PCV-1 (cepa PK-15, nº de acceso para la secuencia del GenBank Nº U49186). Este fragmento se digirió con SalI y BglII con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 715 pb. Este fragmento se unió a continuación con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para proporcionar el plásmido pJP120 (5565 pb) (Figura 3).
Ejemplo 4 Construcción del plásmido pJP121 (ORF1 de PCV-1)
El plásmido pPCV1 que contiene el genoma del virus PCV1 en la forma de un fragmento PstI (B. Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1997, 78:221-227) se digirió con PstI con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción PstI-PstI de 1759 pb. Este fragmento se unió a sí mismo.
Se amplificó el gen del ORF1 de la cepa PK-15 del virus PCV-1 (Meehan y otros, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227; No. de acceso de la secuencia en el GenBank, U49186), utilizando la plantilla que consiste en el fragmento PstI-PstI autounido, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los oligonucleótidos siguientes:
JP785 (SEC ID NO 7) (35 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'-CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
y JP786 (SEC ID NO 8) (36 mer):
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
con el fin de generar un fragmento de PCR de 965 pb que contiene el gen del ORF1 del virus PCV-1 (cepa PK-15). Este fragmento se digirió con SalI y BglII con el fin de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglIi de 946 pb. Este fragmento se unió a continuación con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para proporcionar el plásmido pJP121 (5804 pb) (Figura 4).
Ejemplo 5 Construcción del plásmido pJP058 (que expresa GM-CSF porcino)
Se recolectó sangre de cerdo de la vena yugular en un tubo con EDTA. Las células mononucleares se recogieron mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll y a continuación se cultivaron in vitro en medio RPMI 1640 (Gibco-BRL) y se estimularon mediante adición de concanavalina A (Sigma)a una concentración final de aproximadamente 5 \mug/ml en el medio de cultivo. Al cabo de 72 horas de estimulación, los linfoblastos se recogieron y se extrajo el ARN total de estas células con el equipo de extracción "MicroScale Total RNA Separator Kit" (Clontech) según las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa, con ayuda del equipo "1st strand cADN Synthesis Kit" (Perkin Elmer), seguido por una reacción en cadena de la polimerasa con el ARN total extraído de estos linfoblastos porcinos con los siguientes oligonucleótidos:
RG972 (33 MER): (SEC ID NO. 9)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
y RG973 (34 mer): (SEC ID NO. 10)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
con el fin de generar un fragmento de PCR de aproximadamente 450 pb. Este fragmento se digirió con NotI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de NotI-Not-I 450 pb. Este fragmento se unió a continuación con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1), se digirió preferentemente con NotI y se desfosforiló, para obtener el plásmido pJP058 (5405 pb) (Figura 5). La secuencia del gen pGM-CSF clonado en el plásmido pJP058 se analizó y se halló que era idéntica a la disponible en la base de datos del GenBank (nº de acceso D21074).
Ejemplo 6 Producción de los plásmidos purificados para la vacunación de los cerdos
Se transformaron bacterias Escherichia coli K12 (cepas DH10B o SCS1) con los plásmidos pJP109, pJP111, pJP058, pJP120 y pJP121 de los Ejemplos 1 a 5 supra. Los cinco clones transformados obtenidos respectivamente con estos cinco plásmidos se cultivaron separadamente, con agitación a +37ºC en medio Luria-Broth (LB). Los cultivos bacterianos se recogieron al final de la fase de crecimiento exponencial y se extrajeron los plásmidos de acuerdo con la técnica de lisis alcalina. Los plásmidos extraídos se purificaron a continuación en un gradiente de cloruro de cesio según la técnica descrita por Sambrook y otros, (Molecular Biology: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Después de la última extracción del bromuro de etidio y precipitación con etanol absoluto, se resuspendieron los plásmidos purificados en solución tampón TE (Tris 1 mM/EDTA, pH 8,0) para obtener soluciones madre que contienen 2 mg de plásmido por ml. Estas soluciones madre se guardaron a -20ºC hasta su uso.
Ejemplo 7 Control de la expresión de los ORFs 1 y 2 del virus PCV-2
Para controlar los productos de la expresión de los genes del ORF2 de PCV-2 y ORF-1 de PCV-2, clonados respectivamente en los plásmidos pJP109 y pJP111, estos plásmidos se transfectaron en células CHO-K1 (Ovario de hámster chino) (ATCC Nº CCL-61) con el equipo de transfección de Lipofectamina Plus® (Gibco-BRL, Catálogo# 10964-013), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 48 h después de la transfección, las células transfectadas se lavaron y se fijaron con una solución de acetona glacial al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron cinco anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas de ORF1 de PCV-2 (F199 1D3GA y F210 7G5GD) y las de ORF2 (F190 4C7CF, F190 2B1BC y F190 3A8BC) como anticuerpos primarios. Se utilizó un conjugado IgG anti-ratón, marcado con Cy3, para revelar el marcaje específico. Se observó fluorescencia específica para PCV-2 con 3 monoclonales de ORF2 de PCV-2 en las células transfectadas con el plásmido pJP109, pero no en las transfectadas con el plásmido pJP111. Por el contrario, se observó fluorescencia específica de PCV-2 con los dos monoclonales de ORF1 de PCV-2 en las células transfectadas con el plásmido pJP111, pero no con las transfectadas con el plásmido pJP109. No se detectó fluorescencia con los monoclonales de pCV-2 en las células CHO transfectadas con el plásmido pVR1012 solo o en las células CHO no transfectadas.
Se obtuvo el mismo resultado de expresión con un suero policlonal específico para el virus PCV-2. En este caso, se utilizó un conjugado IgG anti-cerdo marcado con fluoresceína para detectar la fluorescencia específica. No se detectó fluorescencia con este suero policlonal en las células CHO transfectadas con el plásmido pVR1012 solo o en las células CHO no transfectadas.
Ejemplo 8 Vacunación de los cerdos con el ADN desnudo 8.1. Cochinillos de 1 día de vida
Los grupos de cochinillos obtenidos por cesárea el día D0 del protocolo se colocaron en una unidad aislada. Estos cochinillos se vacunaron a los 2 días de vida por vía intramuscular con diversas soluciones de vacunas del plásmido. Las soluciones de vacunas se prepararon mediante dilución de las soluciones madre en solución salina fisiológica estéril (NaCl 0,9%).
Los cochinillos se vacunaron con:
el plásmido pJP109 solo o,
con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP111 o,
con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP058 o,
con la mezcla de plásmidos pJP109, pJP111 y pJP058.
Las soluciones de vacunas contienen 500 \mug de cada plásmido. Volumen: las soluciones de vacuna se inyectaron por vía intramuscular en un volumen total de 2 ml. En la práctica, según la edad de los cochinillos en la vacunación (1-2 días), se administra 1 inyección de 1 ml en cada lado del cuello (=2 x 1 ml).
Se administraron 2 inyecciones de vacunas en un intervalo de 2 semanas, es decir los días D2 y D14 del protocolo.
Se administró un estímulo el día D21 del protocolo mediante administración oronasal de una suspensión viral de una cepa de PCV-2 virulenta. Se monitorizó la aparición de signos clínicos específicos del síndrome de pérdida multisistémica después del destete en los cochinillos durante 3 semanas. Los signos que se analizaron fueron.
Temperatura rectal: medida diariamente durante los primeros 14 días, luego dos medidas durante la tercera semana después del estímulo.
Peso: los cochinillos se pesaron justo antes del estímulo y luego una vez por semana durante las 3 semanas después del estímulo.
Recogida de muestras de sangre para analizar la viremia y los anticuerpos: se tomaron muestras de sangre en los días D2, D14, D21, D28, D35 y D42.
Autopsia: el día D42 se sacrificaron los cochinillos supervivientes y se realizó la autopsia para buscar lesiones anatomopatológicas y realizar preparaciones histológicas del hígado, nódulos linfáticos, bazo, riñones y timo para buscar lesiones en dichos tejidos.
8.2. Cochinillos de 5-7 semanas de edad
Cochinillos de 5-7 semanas de edad, que ya no tenían anticuerpos maternos específicos para el virus PCV-2 se vacunaron por vía intramuscular:
con el plásmido pJP109 solo,
o con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP111
o con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP058
o con la mezcla de plásmidos pJP109, pJP111 y pJP058
las dosis de vacuna fueron las mismas que las indicadas en el Ejemplo 8.1 (500 \mug por plásmido). Las soluciones de vacuna se inyectaron por vía intramuscular en un volumen de 2 ml (una administración única de 2 ml, en los músculos del cuello).
Se realizaron dos vacunaciones en un intervalo de 21 días, (D0 y D21). Se realizó un estímulo a los 14 días después de la última vacunación (D35) mediante administración intramuscular de una suspensión viral de una cepa de PCV-2 virulenta.
Los cochinillos se monitorizaron durante 8 semanas para la aparición de signos clínicos específicos del síndrome de pérdida multisistémica después del destete. La monitorización clínica de los cochinillos después del estímulo fue idéntica a la descrita en el Ejemplo 8.1, excepto que la duración total de la observación fue esta vez de 8 semanas.
Ejemplo 9 Vacunación de cochinillos con el ADN formulado con DMRIE-DOPE
Es posible utilizar, en lugar de la solución de ADN plasmídico desnudo descrita en el Ejemplo 8, soluciones de ADN plasmídico formuladas con DMRIE-DOPE. Se prepara una solución de ADN (que contiene uno o más plásmidos según el Ejemplo 6) a 1 mg/ml en NaCl al 0,9%. Se prepara una solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM tomando un liofilizado de DMRIE-DOPE en un volumen adecuado de agua destilada estéril.
La formación de complejos de ADN plasmídico-lípido catiónico se logra diluyendo a partes iguales la solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM con la solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl al 0,9%. La solución de ADN se introduce gradualmente con ayuda de una jeringa montada con una aguja de 26G, por la pared del vial que contiene la solución del lípido catiónico para evitar la formación de espuma. Se realiza una ligera agitación tan pronto como las dos soluciones se han mezclado. Por último, se obtiene una composición que comprende DMRIE-DOPE 0,375 mM y 500 \mug/ml de ADN.
Es deseable que todas las soluciones a utilizar estén a temperatura ambiente para todas las operaciones descritas anteriormente. La formación del complejo ADN/DMRIE-DOPE se realiza a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la inmunización de los cochinillos.
Los cochinillos se vacunan a continuación a las condiciones descritas en los Ejemplos 8.1 y 8.2.
Ejemplo 10 Vacunación de cochinillos y resultados
1^{er} experimento
Se colocaron en aisladores grupos de 3 ó 4 cochinillos obtenidos por cesárea el día 0. Éstos se vacunaron el día 2 con el plásmido pJP109 solo o con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP111 y con una solución fisiológica para el grupo control. Cada plásmido se diluyó en una solución fisiológica estéril (NaCl^{al} 0,9%) a 250 \mug/\mul de concentración final. Se inyectó un volumen de 2 ml por vía intramuscular en dos puntos de 1 ml (1 punto en cada lado del cuello). Se administró una segunda inyección de vacuna o placebo el día 14. La vacunación con ADN fue bien tolerada por los cochinillos y no se observaron efectos adversos a la vacunación. Los cochinillos se estimularon el día 21 mediante administración oronasal de la suspensión viral de PCV-2, 1 ml en cada ventana de la nariz. Después del estímulo, se pesaron los cochinillos una vez por semana. Se registraron las temperaturas rectales los días 17, 21, 22, 24, 27, 29, 31, 34, 37, 41, 44. En el día 44, se recogieron hisopos fecales de cada cochinillo para la liberación de PCV-2. El virus se detectó y se cuantificó mediante PCR cuantitativa. El día 45, se realizaron las necropsias y se tomaron muestras del tejido para aislar los virus.
Síntomas clínicos
No existen diferencias significativas en el promedio de ganancias de peso corporal o de las temperaturas corporales entre los grupos.
Lesiones en la necropsia
El único hallazgo importante en los cochinillos al término fue la linfoadenopatía bronquial. Las lesiones se valoraron de acuerdo con el criterio siguiente.
0 = aumento no visible de los nódulos linfáticos
1 = aumento ligero de los nódulos linfáticos, restringido a los nódulos linfáticos bronquiales
2 = aumento moderado de los nódulos linfáticos, restringido a los nódulos linfáticos bronquiales.
3 = aumento severo de los nódulos linfáticos, extendido a los nódulos linfáticos prescapsulares submandibulares bronquiales e inguinales.
std es una abreviación de la desviación estándar
N es el número de animales en cada grupo
\vskip1.000000\baselineskip
Grupos Valoración de la linfoadenopatía
media std N
pJP109 1,2 1,3 4
pJP109 + pJP111 2,0 1,7 3
controles 3,0 0,0 3
N= número de cochinillos en cada grupo 
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó una reducción de las lesiones de los nódulos linfáticos en 3 de 4 cochinillos inmunizados con pJP109 y en 1 de 3 cochinillos inmunizados con la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP111. Esta diferencia no es significativa (p>0,05) debido al valor elevado de las desviaciones estándares (std).
Carga viral en los tejidos de los nódulos linfáticos
Se realizó un reaislamiento cuantitativo de los virus sobre homogenados de tejido preparados a partir de los nódulos linfáticos bronquiales y mesentéricos.
Los resultados presentados corresponden a los títulos virales en los homogenados de tejido después de la transformación en log_{10}.
\newpage
Títulos de PCV-2
Grupos NL bronquiales \hskip0,7cm NL mesentéricos
media std media std N
pJP109 0,9 0,8 0,9 0,8 4
pJP109+pJP111 0,7 0,6 0,2 0,2 3
Controles 2,0 1,1 1,8 1,1 4
Los nódulos linfáticos bronquiales parecen contener los virus más infecciosos. Se observó una reducción de la carga viral en los nódulos linfáticos bronquiales y mesentéricos de los cochinillos inmunizados con el plásmido pJP109 o con la mezcla de plásmidos pJP109+pJP111. Esta reducción es siginificativa (p\leq0,05) para la mezcla de plásmidos.
Excreción viral
Se analizaron los hisopos fecales después del estímulo para la liberación de PCV-2 mediante PCR basado en la amplificación del orf2 de PCV-2. Cada ensayo se realizó por triplicado en 2 ml de muestra. Los controles no vacunados fueron negativos para PCV-2 antes del estímulo y positivos después del estímulo, lo cual confirmó la validez del ensayo de PCR.
Los valores se expresaron como log_{10} (número de moléculas de ADN de PCV-2 en 2 \mul de muestra).
Log_{10} del número de moléculas de ADN de PCV-2
Grupos media std N
pJP109 3,3 0,3 4
pJP109+pJP111 2,9 0,7 3
Controles 3,6 0,6 4
Las diferencias entre los grupos no son significativas (P>0,05).
2º Experimento
Se inmunizaron cochinillos de 14 días de vida (8 por grupo) con 2 administraciones de la mezcla de plásmidos pJP109 y pJP111 formulada con DMRIE DOPE el día 0 y 20. Para cada administración, se inyectaron 2 ml por vía intramuscular en la parte del cuello por debajo de la oreja. La composición de la vacuna fue de 250 \mug para cada plásmido/ml de solución fisiológica (NaCl al 0,9%) y DMRIE DOPE 0,375 mM.
Para el grupo de control, los cochinillos se inyectaron con solución fisiológica.
El día 32, se estimularon los cochinillos por vía oronasal introduciendo 5 ml de suspensión viral de PCV-2 a un título de 105,8 TCID50/ml con una jeringa en cada una de las ventanas nasales.
Los cochinillos se monitorizaron para la aparición de síntomas clínicos, postración, vómitos, dispnea, tos, anorexia e hipertermia (temperatura rectal registrada cada día durante 28 días después del estímulo), crecimiento más lento (los cochinillos se pesaron los días 32, 40, 46, 53, 60). Los síntomas se valoraron según el criterio siguiente: Anexo 1 (la valoración para cochinillo es igual a la suma de los valores correspondientes a los distintos días de observación).
Las necropsias se realizaron el día 60 y las lesiones se valoraron de acuerdo con el criterio siguiente: Anexo 2 (la valoración para un cochinillo es igual a la suma de los valores correspondientes a cada órgano analizado).
Se tomaron muestras de tejido, en particular de los nódulos linfáticos.
Se tomaron muestras rectales con hisopos los días 32, 39, 42, 46, 53, 56, 60 para el seguimiento de la excreción viral.
Síntomas clínicos
Se observó una reducción significativa de los síntomas clínicos en el grupo de cochinillos inmunizados comparados con los controles. En el grupo de control, un animal murió con síntomas de PMWS y ninguno en el grupo vacunado.
\newpage
Valoraciones clínicas
Grupos media std N
Vacunados 13,5 7,1 8
Controles 29,3 15,6 8
(p<0,01 test de Kruskal-Wallis)
Se observó una reducción significativa de la duración de la hipertermia después del estímulo en el grupo de cochinillos inmunizados (p\leq0,05).
Duración (días) de la temperatura rectal \geq40ºC
Grupos media std N
Vacunados 1,9 2,0 8
Controles 8,4 3,9 8
La ganancia de peso diario después del estímulo no fue significativamente distinta entre los grupos vacunados y los control.
Lesiones en la Necropsia
Se observó una reducción significativa de las lesiones en los cochinillos inmunizados comparados con los controles en particular para la linfoadenopatía (p\leq0,05).
Lesiones globales y valoraciones de linfoadenopatía
Grupos media std N
Lesiones globales
Vacunados 7,6 3,3 8
Controles 13,1 7,5 8
Valoraciones de nódulos linfáticos
Vacunados 3,1 2,7 8
Controles 5,7 2,9 8
Carga viral en los tejidos de nódulos linfáticos
La carga viral en los nódulos linfáticos mesentéricos y mediastinos se determinó mediante inmunoquímica.
Se utilizaron los siguientes criterios para las valoraciones:
0 = ausencia de fluorescencia
1 = algún foco de fluorescencia en algunas preparaciones de órganos
2 = aproximadamente 1 foco por disparo
3 = órgano completamente fluorescente
Se observó una reducción significativa de la carga viral en los grupos inmunizados (p\leq0,05).
Grupos NL mesentéricos \hskip0,7cm NL mediastino N
media std media std
Vacunados 0,5 0,6 1,3 0,2 8
Controles 1,8 0,8 2,0 0,8 8
Excreción viral
Los hisopos rectales se valoraron mediante PCR para la liberación de PCV-2. Los resultados se valoraron de acuerdo con el criterio siguiente:
0= ausencia de PCV-2
1 = presencia de PCV-2
En el grupo inmunizado, el 38% de cochinillos frente al 88% en el grupo de control excretaron PCV-2 en las heces. La duración de la excreción viral se redujo significativamente en el grupo vacunado comparada con los controles.
Duración promedio de la excreción viral (días)
Grupos media std N
Vacunados 1,2 2,1 8
Controles 11,4 6,3 8 
\vskip1.000000\baselineskip
Anexo 1
Valoraciones de los signos clínicos
signos
valoración
Postración
0 no, 1 sí, 2 no puede levantarse
vómitos
0 no, 1, sí
disnea
0 no, 1 moderada, 2 elevada
tos
0 no, 1 sí
anorexia
0 no, 1 sí
hipertermia
0 no, 1\geq40ºC, 2\geq41ºC
crecimiento
0 no, 1 DWG semana x \leqDWG semana x-1 y > 100 g por día, 2 DWG de la semana \leq 100 g por día
muerte
0 no, x valor del día anterior a la muerte para un día, la valoración es la suma de los valores de cada signo.
DWG = ganancia diaria de peso
\vskip1.000000\baselineskip
Anexo 2
Valoraciones para las lesiones macroscópicas
piel (color) normal 0
blanca 1
amarilla 2
corpulencia normal 0
delgada 1
muy delgada 2
caquexia 3
moco normal 0
blanco 1
amarillo 2
(Continuación)
Conjuntivo Normal 0
subcutáneo Brillante 1
Amarilla 2
Ganglios (gg) Normal 0
I grandes y/o congestivos 1
> I grandes y/o congestivos 2
> I muy grandes 3
Fluido torácico Normal 0
Brillante 1
visible 2
corazón Normal 0
lesión 1
pulmones Normal 0
Lesión \leq4 1
Lesión >4 \leq6 2
Lesión >6 3
pleura Normal 0
lesión 1
ascitis Normal 0
Brillante 1
visible 2
peritoneo Normal 0
lesión 1
Estómago Normal 0
Lesión 1
úlcera 2
Intestino delgado Normal 0
lesión 1
Intestino grueso Normal 0
lesión 1
Placas de Peyers Normal 0
Visibles en 1 parte del intestino 1
Visibles en 2 partes del intestino 2
Muy importantes 3
hígado Normal 0
lesión 1
riñón Normal 0
lesión 1
vejiga Normal 0
lesión 1
<110> MERIAL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna de ADN - PCV
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Vacuna de ADN - PCV
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Número del documento
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Fecha de depósito del documento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcatcatg tcgacatgac gtatccssgg aggcg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactactaca gatctttagg gtttaagtgg ggggtc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcatcatg tcgacatgcc cagcaagaag aatgg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\newpage
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactactaca gatcttcagt aattatttc atagg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcatcatg tcgacatgac gtggccaagg aggcg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactactaca gatctttatt tatttagagg gtcttttagg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcatcatg tcgacatgcc aagcaagaaa agcgg 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
tactactaca gatcttcagt aatttatttt atatgg 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
tatgcggccg ctacgtatca cttctgggct ggtt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (10)

1. Preparación inmunogénica o vacuna que comprende al menos un plásmido que codifica y expresa un gen seleccionado del grupo que consiste en el ORF1 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV-2) y ORF2 de PCV-2, en donde dicho ORF1 y ORF2, corresponden respectivamente a los nucleótidos 398-1342 y 1381-314 en la secuencia nucleotídica del GenBank AF055392; y, como adyuvante, un lípido catiónico de fórmula:
R_{1} --- O --- CH_{2} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{OR _{1} }}
H --- CH_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{N}{\uelm{\para}{CH _{3} }}
^{+} --- R_{2} --- X
en donde, R1 es un radical alifático lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que comprende 2 ó 3 átomos de carbono y X es un grupo hidroxilo o amino.
2. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 1, en la cual el lípido catiónico es N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio (DMRIE).
3. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 2, en la cual el DMRIE está acoplado con un lípido neutro.
4. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 2, en la cual el DMRIE está acoplado con dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE).
5. Preparación inmunogénica o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende una citocina porcina.
6. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 5, en la cual la citocina porcina es GM-CSF.
7. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 5 ó 6, que comprende un plásmido que codifica y expresa la citocina porcina.
8. Preparación inmunogénica o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además comprende un plásmido que codifica y expresa otro inmunógeno porcino.
9. Preparación inmunogénica o vacuna según la reivindicación 4, que comprende dicho plásmido o una mezcla de plásmidos y el DMRIE-DOPE en la mezcla o para mezclar inmediatamente antes de su uso.
10. Preparación inmunogénica o vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un plásmido o una mezcla de plásmidos que codifican y expresan el ORF1 y/u ORF2 de una cepa de PCV-2 depositada en el ECACC con el número de acceso V97100219, V97100218, V97100217, V98011608 o V98011609.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2804028B1 (fr) * 2000-01-21 2004-06-04 Merial Sas Vaccins adn ameliores pour animaux de rente
EP1379671B1 (en) * 2001-03-27 2009-05-06 University of Saskatchewan Methods to culture circovirus
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
DE602004013331T2 (de) * 2003-07-24 2009-07-16 Merial Ltd. Vakzin-formulierungen mit einer öl-in-wasser-emulsion
CA2545886A1 (en) 2003-11-13 2005-06-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods of characterizing infectious bursal disease virus
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
HUE033621T2 (en) * 2004-12-30 2017-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc PCV2 immunogenic compositions and methods for preparing such compositions
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
CN1328373C (zh) * 2005-04-07 2007-07-25 南京农业大学 猪ⅱ型圆环病毒重组腺病毒
MX356667B (es) 2005-12-29 2018-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para reducir los sintomas clinicos en cerdos.
KR101436794B1 (ko) 2005-12-29 2014-09-04 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 다가 ｐｃｖ2 면역원성 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
WO2008073464A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
DK2094872T4 (da) * 2006-12-15 2020-05-18 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Behandling af anti-PCV2-antistofseropositive svin med PCV2-antigen
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
CN101932336B (zh) * 2007-12-31 2014-07-09 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒
WO2009126356A2 (en) * 2008-01-23 2009-10-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
WO2009103037A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
CN107213461B (zh) * 2009-09-10 2022-03-15 勃林格殷格翰动物保健美国公司 包含含有皂苷的佐剂的新疫苗制剂
TWI508974B (zh) 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
CN104302316A (zh) * 2012-05-17 2015-01-21 佐蒂斯有限责任公司 在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的有效疫苗接种
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
CN105579060B (zh) 2013-09-25 2021-03-16 硕腾服务有限责任公司 Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法
CA2924228C (en) 2013-10-02 2024-01-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
CN105251000B (zh) * 2014-09-30 2018-12-14 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
EP3294876A1 (en) 2015-05-14 2018-03-21 Merial, Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
KR102602018B1 (ko) 2016-12-14 2023-11-15 조에티스 서비시즈 엘엘씨 젖떼기 전, 유럽의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (prrs) 균주 바이러스에 대한 효과적인 백신접종
BR112020025211A2 (pt) * 2018-06-11 2021-03-09 Ceva Sante Animale Vacinação contra circovírus suíno
CN116157147A (zh) 2020-07-24 2023-05-23 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 组合猪疫苗

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946787A (en) * 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5545412A (en) 1985-01-07 1996-08-13 Syntex (U.S.A.) Inc. N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
ES2052685T3 (es) * 1987-03-17 1994-07-16 Akzo Nv Metodo para producir un adyuvante libre.
US5106733A (en) 1987-06-25 1992-04-21 Immunex Corporation Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP1026253B2 (en) 1989-03-21 2012-12-19 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1992005255A1 (en) 1990-09-13 1992-04-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Ovine cytokine genes
MX9304089A (es) 1992-07-08 1994-01-31 Schering Corp Uso de gm-csf como una vacuna adyuvante.
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
JPH09500013A (ja) 1993-06-01 1997-01-07 ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド カチオン性脂質による遺伝子免疫
ATE301201T1 (de) * 1993-06-07 2005-08-15 Vical Inc Für die gentherapie verwendbare plasmide
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
WO1995024929A2 (en) * 1994-03-15 1995-09-21 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5719131A (en) 1994-12-09 1998-02-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
WO1996034109A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Vical Incorporated Single-vial formulations of dna/lipid complexes
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6019980A (en) 1995-06-07 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
WO1998017799A1 (en) * 1996-10-23 1998-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
AU1987197A (en) 1997-03-10 1998-09-29 Heather Lynn Davis Gene delivery to mucosal epithelium for immunization or therapeutic purpose
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6165493A (en) * 1997-10-22 2000-12-26 New York Blood Center, Inc. "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections"
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
DK1037909T3 (da) 1997-12-11 2007-10-08 Univ Saskatchewan Postweaning multisystemisk wasting-syndromvirus (PMWS) fra svin
ES2276481T3 (es) * 1997-12-12 2007-06-16 The University Of Western Ontario Peptido apoep1.b novedoso, composiciones y sus usos.
US6287856B1 (en) * 1998-03-13 2001-09-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
AU1131200A (en) 1998-10-23 2000-05-15 Heska Corporation Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats
EP1057891A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-06 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek Use of the BNM3 transcriptional activator to control plant embryogenesis and regeneration processes
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
CA2376523A1 (en) 2000-12-21
AU775375C (en) 2005-02-24
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DK1185659T3 (da) 2006-07-10
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