CN1289674C - Dna疫苗-pcv - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫原性制剂或疫苗,它们一方面包含编码和表达来源于PCV的基因(特别是选自PCV-2的ORF1、PCV-2的ORF2、PCV-1的ORF1以及PCV-1的ORF2)的质粒,另一方面包含能够增强针对所说基因表达产物之免疫反应的元件,其可以是carbomer,猪细胞因子(如GM-CSF)或下式的阳离子脂:其中R1是一个具有12至18个碳原子的饱和的或不饱和的线性脂肪族基团,R2是另一个包含2至3个碳原子的脂肪族基团,并且X是羟基或氨基。阳离子脂可以是DMRIE,与DOPE可能连接。
Description
本发明涉及编码和表达猪circovirus免疫原(猪CircoVirus的PCV)质粒构建体,猪circovirus免疫原与PMWS综合症(猪全身消瘦综合症或断奶后全身消瘦综合症)有关,也涉及免疫接种的方法和DNA疫苗,还涉及生产和制备这些疫苗的方法。本文引用的所有文件,以及本文引用的文件中引用的所有文件本文一并参考。
PCV最初作为猪肾细胞系PK/15中非细胞病原性污染物检测,这种病毒与鸡贫血症病毒(鸡贫血症病毒CAV)和PBFDV病毒(Pscittacine Beak和羽毛疾病病毒)一起分在Circoviridae中。这些是小的非包膜病毒(15至24nm),其共同特征是含有一种1.76至2.31千碱基对(kb)的环形单链DNA形式的基因组。开始认为这一基因组编码大约30kDa多肽(Todd等,Arch.Virol.,1991,117:129-135)。然而最近的工作显示存在更复杂的转录(Meehan B.M.等,J.Gen.Virol.,1997,78:221-227)。此外,在三种已知的circoviruses中,已知在核苷酸序列或共同抗原决定簇中没有明显的同源性。
来源于PK/15细胞的PCV被认为不是致病性的。从B.M.Meehan等J.Gen.Virol.1997(78)221-227已知其序列。仅在最近一些作者认为PCV毒株可能是病原性的,并且与PMWS综合症有关(G.P.S.Nayar等,Can.Vet.J.,1997,38:385-387和Clark E.G.,Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997:499-501)。Nayar等利用PCR技术在患有PMWS综合症的猪中已检测到PCV DNA。
针对具有PMWS综合症症状的猪中所发现的circoviruse的单克隆和多克隆抗体能够说明这些circoviruses和从PK-15细胞培养物分离的猪circoviruses之间的区别(Allan G.M.等Vet Microbiol.,1999,66:115-123)。
在加拿大,美国和法国所发现的PMWS综合症以重量逐渐丧失和以例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸表现为临床特征。根据病理观点,它由淋巴细胞或肉芽肿渗入,淋巴结病,少数情况下由肝炎和淋巴细胞或肉芽肿肾炎证明(Clark E.G.,Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997:499-501;La Semaine Veter inaire No.26,La Semaine Veter inaire 1996(834)增刊;La Semaine Veter inaire 1997(857)54;G.P.S.Nayer等,Can.Vet.J.,1997,38:385-387)。
从北美和欧洲获得的这些circoviruses非常近缘相关,它们的核苷酸序列具有96%的等同程度,而当这些circoviruses的核苷酸序列与从PK-15细胞分离的猪circoviruses比较时,等同性程度不到80%。因此,有人提出了两个病毒子群,PCV-1用于与PMWS综合症相关的circoviruses,PCV-2用于从PMWS细胞分离的circoviruses(Meehan B.M.等,J.Gen.Virol.,1998,79:2171_2179;WO-A9918214)
申请人已发现编码和表达PCV-2免疫原的质粒构建体可以用来针对PMWS综合症免疫猪。
PCV-2免疫原可以与PCV-1免疫原结合使用,也可针对PCV-2免疫这些动物。
根据不太优选的方式,PCV-1免疫原可以单独地使用。
本发明的主体是编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原,特别是PCV-1的开放读框(ORFs)1和/或2,PVC-2的ORFs 1和/或2(ORF意思是开放读框)的质粒构建体。
不言而喻,本发明自动覆盖编码和表达等同核苷酸序列的质粒,所说的等同核苷酸序列是这样的序列:既非改变所考虑的基因或这一基因编码的多肽的功能性,也非改变它们的毒株特异性(即1型毒株和2型毒株)。当然会包括因密码子简并性产生的不同的序列。
用于实施例的PCV-2序列来源于Meehan等,同上(毒株Imp.1010 ORF1核苷酸398-1342;ORF2核苷酸1381-314;分别符合1998年9月25日的US 09/161,092中的ORF4和ORF13和WO-A-9918214中的COL4和COL13)。其它PCV-2毒株和它们的序列在以下文献中已出版:WO-A-9918214(称为Imp1008,Imp999,Imp1011-48285和Imp1011-48121);A.L.Hamel等J.Virol.June 1998,vol72,6:5262-5267(GenBankAF027217);I.Norozov等J.ClinicalMicrob.Sept.1998 vol.36,9:2535-2541;以及GenEank AF086834,AF086835和AF086836,并且给出等同的ORF序列索取号。
本发明也覆盖了这种意义上的等价序列,它们在高严格条件下能够与所考虑的基因的核苷酸序列杂交。在所说的等价序列中,也可以是所提到的基因的保留完整序列免疫原性的片段。
1型和2型之间全基因组的同源性约75%。对于ORF1,大约86%,对于ORF2,大约66%。相反,基因组之间和2型内ORFs之间的同源性一般高于95%。
根据本发明,以下的序列也是等价的序列,对于ORF1,与毒株Imp1010的ORF1具有等于或大于88%,特别是90%,优选地是92%或95%同源性的那些序列,对于ORF2,与毒株Imp1010的ORF2具有等于或大于80%,特别是85%,优选地是90%或95%同源性的那些序列。
根据Meehan 1998的ORF1和ORF2分别具有编码具37.7kD和27.8kD之预料分子量的蛋白质的潜力。ORF3和ORF4(根据Meehan等1998,分别符合WO-A-9918214中ORF7和ORF10)分别具有编码具11.9和6.5kD之预料分子量的蛋白质的潜力。这些ORFs序列也可以从Genbank AF055392中获得。它们也可以掺入质粒中,并且按照本发明单独或者与例如ORF1和/或ORF2组合使用。
1998年9月25日的US 09/161,092中的其它ORFs1-3和5,6,8-9,11-12(WO-A-9918214中的COLs 1-3和5,6,8-9,11-12),在这里所描述的条件下,可以组合或相互或与这里定义的ORFs1和2一起使用。
以上叙述也是围绕等价序列的使用,特别是来源于本文所引用的各种PCV-2毒株的那些ORFs。
对于同源性,人们可以精确说明那些等同的序列,其来源于具有ORF2和/或ORF1的PCV毒株,与毒株1010相应ORFs具有本文所限定的同源性。对于根据Meehan的ORF3,也可以说,与毒株Imp1010的ORF3具有等于或大于80%,特别是85%,优选地是90%或95%的同源性。对于根据Meehan 1998的ORF4,与毒株Imp1010的ORF4具有等于或大于86%,特别是90%,优选地是95%的同源性。
从基因组核苷酸序列,在WO-A-99 18214中公开的那些序列,采用标准软件,MacVector确定ORFs是常规技术。同时,与毒株1010基因组的序列对比和与毒株1010 ORFs的比较使得本领域技术人员易于确定另一毒株的基因组ORFs(例如在WO-A-99 18214中所公开的那些)。利用软件或进行序列对比不是过度实验,直接给出等价的ORFs。
术语质粒在这里意欲包括多核苷酸序列形式的任何DNA转录单位,包含待表达的PCV序列和其体内表达必需的元件。环形质粒形式,超卷曲的或其它方式的,是优选的。线性形式也包括在本发明的范围之内。
本发明的主题更具体地说是被称为pJP109(包含PCV-2的ORF2基因,图1),pJP111(包含PCV-2的ORF1基因,图2),pJP120(包含PCV-1的ORF2基因,图3)和pJP121(包含PCV-1的ORF1基因,图4)的质粒。
每一质粒包含在其控制下能够确保所插入的基因在宿主细胞中表达的启动子。一般来说它是一个强大的真核启动子,特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE,人或鼠源的,也可以是其它来源的,如大鼠或天竺鼠。更一般地,启动子或是病毒来源的或是细胞来源的。作为病毒的启动子而不是CMV-IE,可以提及的是SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。它也可以是基因所来源的病毒的启动子,例如,对基因特异性的启动子。作为细胞启动子,可以提及的是细胞支架基因启动子,例如结蛋白启动子或肌动蛋白启动子。当几个基因在相同的质粒中存在时,它们可以在相同的转录单位或两个不同的转录单位中提供。
质粒也可以包含其它转录调节元件,例如,内含子型的稳定序列,优选的是兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等科学,1979,206:337-344),由组织纤溶酶原活化基因编码的蛋白质的信号序列(tPA;Montgomery等,Cell.Nol.Biol.1997,43:235-292),以及多聚腺苷酸化信号(polyA),特别是牛生长激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)的或兔β-珠蛋白基因的。
本发明的主题也是免疫原性制剂和DNA疫苗,它们包含至少一种根据本发明的编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原中的一个,优选地是以上提到的ORFs的质粒,以及兽医学上可接受的载体或稀释剂,可以也可以不包含兽医学上可接受的佐剂。
本发明的主题更具体地说是包含至少一种编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原的质粒的免疫原性制剂和疫苗,与佐剂配制的组合物,所说的佐剂特别是含有下式的季铵盐的阳离子脂:
其中R1是一个具有12至18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族基团,R2是另一个包含2至3个碳原子的脂肪族基团,并且X是羟基或氨基。
优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵(WO-A-9634109),最好与中性脂,例如优选的是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)结合,形成DMRIE-DOPE。优选的,与这一佐剂的质粒混合物就在使用之前制成,最好是在施用于动物之前制成。由此产生的混合物使得可以形成复合物,例如在10至60分钟,特别是30分钟时间内。
当DOPE存在时,DMRTE∶DOPE摩尔比例优选的范围是95∶5到5∶95,更优选的是1∶1。
质粒:DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比范围是50∶1到1∶10,优选的是10∶1到1∶5,更优选的是1∶1到1∶2。
根据另一个本发明的有利的方式,可能的是利用作为佐剂的佐剂化合物,其选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物。特别是与糖的或多元醇的聚链烯基醚连接的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物是优选的。这些混合物被称作carbomer(Pharmeuropa vol.8,No.2,June 1996)。本领域技术人员也可以参考US-A-2,909,462(本文一并参考),该文献描述了与聚羟基化的化合物交联的这样的丙烯酸聚合物,所说的化合物具有至少3个羟基,优选地不多于8个羟基,至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选的的基团是那些包含2至4个碳原子的基团,例如乙烯基,丙烯基和其它烯键不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其它取代基,如甲基。以名称Carbopol(GF Goodrich,俄亥俄,美国)出售的产品特别适当。它们与丙烯基蔗糖或者与丙烯基季戊四醇交联,在它们中,可以提到的是Carbopol974P,934P和971P。
在顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物中,EMAs(Monsanto)是优选的,它是顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物,线性或交联的,例如与二乙烯基醚交联的,可以参见J.Fields等,自然,186:778-780,4 June 1960(本文一并参考)。从它们的结构的观点看,丙烯酸或甲基丙烯酸和EMAs的聚合物优选地含有下式的基本单位:
其中
-R1和R2,相同或不同,代表氢或甲基。
-X=0或1,优选的X=1
-Y=1或2,当X+Y=2时
对于EMAs,X=0,Y=2。对carbomers,X=Y=1。
这些聚合物在水中的分解形成酸性溶液,其会被中和,优选的是至生理pH,以给出佐剂溶液,实际的疫苗将掺入其中。聚合物的羧基部分以COO-形式。
对于这种类型的佐剂,较好的是制备佐剂,特别是carbomer在蒸馏水中的溶液,优选的是氯化钠存在下,所获得的溶液在酸性pH下。通过添加至所需的数量稀释该储备溶液(由此获得所需的最终浓度)或其溶解有氯化钠的水,优选的是生理盐水(NaCl 9g/l)的实质性部分,具有伴随的或后续中和(pH 7.3至7.4),优选的是用氢氧化钠中和的一个或多个部分。当其与质粒混合时,就使用这种在生理pH下的溶液,特别是以冷冻干燥,液体或冻结形式贮存。
在最终疫苗组合物中的聚合物浓度将是0.01%至2%w/v,特别是0.06至1%w/v,优选的是0.1至0.6%w/v。
在一特定的实施方案中,免疫原性或疫苗制剂包含一种质粒或编码和表达PCV-20RF1和ORF2的质粒的混合物。
本发明也提供了将针对猪circoyirus的免疫接种和针对其它猪病原体的免疫接种联合的方法,所说的病原体特别是可能与PMWS综合症相关的那些。举例来说,可以指出:奥耶斯基氏病毒,猪流感病毒,PRRS,猪细小病毒,猪霍乱病毒,大叶性肝炎的线杆菌。
因此,本发明的主题是含有至少一种按照本发明的质粒和至少另一种编码和表达猪免疫原的质粒的质粒混合物,所说的免疫原选自,例如,奥耶斯基氏病毒(假狂犬病毒或PRV)的糖蛋白gB和gD,猪流感病毒H1N1的血细胞凝集素和核蛋白,猪流感病毒H3N2的血细胞凝集素和核蛋白,Lelystad与美国毒株的PRRS病毒的ORF5和ORF3基因,猪细小病毒的VP2蛋白质,猪霍乱病毒(HCV)的E1和E2蛋白质,从大叶性肝炎的线杆菌缺失的apxI,apxII以及apxIII基因(参见例如WO-A-9803658的质粒)。
这些质粒混合物夹带在兽医学上可接受载体或稀释剂,可有可无的前面描述的兽医学上可接受的佐剂中,由此形成免疫原性制剂或多价DNA疫苗。这些免疫原性制剂或多价DNA疫苗用以上描述的阳离子脂(特别是DMRIE,最好是与中性脂,DOPE结合,形成DMRIE-DOPE)配制可以特别有利。
所配制的或者用以上描述的佐剂配制的根据本发明的制剂或单价或多价DNA疫苗用细胞因子(优选的是猪来源的,特别是猪GM-CSF)补充也可以是有利的。这种猪GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;Clark S.C.等科学1987,230:1229;Grant S.TA.等药物,1992,53:516)的添加可以通过掺入到制剂中或者掺入到疫苗中实现,可以是猪GN-CSF蛋白质,也可以是编码和表达猪GN-CSF基因的质粒(Inumaru S.和TakamatsuH.免疫细胞生物学,1995,73:474-476)。
尤其是,编码和表达猪GM-CSF的质粒可以是质粒pJP058(图5)。
根据本发明的免疫原性制剂和多价或多价DNA疫苗也可以与针对至少一种不同的或相同的猪病原体的至少一种常规的疫苗(减毒的活疫苗,灭活的疫苗或亚单位疫苗)或重组疫苗(病毒载体)组合使用。本发明特别提供了与含佐剂的常规疫苗(减毒的活疫苗,灭活的疫苗或亚单位疫苗)组合的方法。对于灭活的疫苗或亚单位疫苗,
可以提到特别包含单独的氧化铝凝胶或与作为佐剂的皂角甙混合的那些,或者以水包油乳剂形式配制的那些。
本发明的主题也是免疫方法,其使得可能在猪中针对按照本发明的circoviruses诱导免疫反应。其主题具体地说是在猪中有效的免疫接种的方法。这些免疫和免疫接种的方法包括施用以上描述的制剂的一种或者单价或多价DNA疫苗的一种。这些免疫和免疫接种的方法包括施用一个或多个这些制剂或DNA疫苗的后续剂量。在这种免疫或免疫接种方法的上下文中,可以通过现有技术中提出的用于多核苷酸免疫接种的各种施用路线施用所说的制剂和DNA疫苗。特别是肌内和真皮内路线,并且借助已知的施用技术,特别是施用有针的注射器进行液体推注式的注射(Furth等,分析生物化学,1992,205:365-368)或者通过涂布有一层DNA的金微粒投射注射(Tang等,自然,1992,356:152-154)。
这种方法不仅使得可以施用到成年猪,而且也可以施用到幼年和怀孕猪;在后一种情况下,其使得可以将被动免疫赋予新生猪(母性的抗体)。优选的,雌性猪在饲养前和/或出栏前和/或在妊娠期间接种。有利地,在出栏之前至少接种一次,在妊娠期间(例如在妊娠中期,在妊娠的约6-8周)和/或在妊娠的最后(妊娠的约11-13周)完成后续接种是优选的。这样,一种有利的用药办法是在出栏之前接种,妊娠期间加强接种。此后,在每一次出栏前和/或在约妊娠中期和/或在妊娠的最后再接种。优选的,在妊娠期间再接种。
小猪(piglet),例如免疫接种过的雌性猪(如按照本文的讨论接种的)来源的小猪在出生后的头几周接种,例如,在出生后的第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五周。优选的,小猪在出生后的第一周或出生后的第三周内接种(例如,在断奶时)。有利地,这样的接种在两到四周进行加强。
用于根据本发明的疫苗的DNA的数量在约10μg和约2000μg之间,优选的约50μg和大约1000μg之间。本领域技术人员有能力精确限定用于每一免疫或免疫接种方案的DNA的有效剂量。
剂量体积可以在0.5和5ml之间,优选的在2和3ml之间。
免疫和免疫接种的优选方法包括通过肌内路线施用根据本发明的DNA疫苗。
现在将参照附图,借助非限制性例证性实施方案详细的描述本发明。在附图中:
图1:质粒pJP109
图2:质粒pJP111
图3:质粒pJP120
图4:质粒pJP121
图5:质粒pJP058
序列表SEQ ID
SEQ ID NO:1:寡核苷酸JP779
SEQ ID NO:2:寡核苷酸JP780
SEQ ID NO:3:寡核苷酸JP781
SEQ ID NO:4:寡核苷酸JP782
SEQ ID NO:5:寡核苷酸JP783
SEQ ID NO:6:寡核苷酸JP784
SEQ ID NO:7:寡核苷酸JP785
SEQ ID NO:8:寡核苷酸JP786
SEQ ID NO:9:寡核苷酸RG972
SEQ ID NO:10:寡核苷酸RG973
实施例
对克隆ORFs有用的PCV-2毒株是例证性毒株,保藏在ECACC,具有以下保藏号:V97100219(Imp1008),V97100218(Imp1010)和V97100217(Imp 999)(其于1997年10月2日保藏),V98011608(Imp1011-48285)和V98011609(Imp1011-48121)(其于1998年1月16日保藏)。
这些实施例采用毒株Imp1010构建。本领域技术人员可以将该过程用于其它PCV-2毒株。
实施例1
构建质粒pJP109
用EcoRI消化含有EcoRI片段形式的PCV-2病毒基因组的质粒pGEM7Z-Imp1010 Stoon-EcoRI No.14(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.792171-2179),以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离1768碱基对(bp)的EcoRI-EcoRI片段。这一片段是自连接的。
用由自连接的EcoRI-EcoRI片段组成的的模板,以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-2病毒株1010-Stoon的ORF2基因(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179;GenBank序列登记号AF055392):
Jp779(SEQ ID NO 1)(35聚体):
5’CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3’
JP780(SEQ ID NO 2)(36聚体):
5’TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3’
以产生730bp PCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离715bp SalI-BglII限制片段。将该片段事先用SalI和BglII消化,然后与质粒pVR1012(Hartikka J.等,人类基因治疗,1996.7.1205-1217)连接,给出质粒pJ 109(5567pb)(图1)。
实施例2:
构建质粒pJP111
使用质粒pGem7Z-Imp1010-Stoon(参见实施例1)(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179)和下列寡核苷酸进行聚合酶链反应:
Jp781(SEQ ID NO 3)(35聚体):
5’CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3’
JP782(SEQ ID NO 4)(36聚体):
5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3’
以产生含有PCV-2病毒ORF1基因的970bp PCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离955bp SalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,以便给出质粒pJP111(5810bp)(图2)。
实施例3:
构建质粒pJP120(PCV-1 ORF2)
使用质粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997.78.221-227)和下列寡核苷酸进行聚合酶链反应:
JP783(SEQ ID NO 5)(35聚体):
5’CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3’
JP784(SEQ ID NO 6)(40聚体):
5’TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3’
以产生含有PCV-1病毒ORF2基因的730bp PCR片段(PK-15毒株,GenBank登记号U49186)。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离715bp SalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,以便给出质粒pJP120(5565bp)(图3)。
实施例4:构建质粒pJP121(PCV-1ORF1)
用PstI消化含有PstI片段形式的PCV-1病毒基因组的质粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997,78,221-227),以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离1759碱基对(bp)的PstI-PstI片段。这一片段是自连接的。
用由自连接的PstI-PstI片段组成的的模板,以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-1病毒株PK-15(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997,78,221-227;GenBank序列登记号U49186):
JF785(SEQ ID NO 7)(35聚体):
5’CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3’
JP786(SEQ ID NO 8)(36聚体):
5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3’
以产生包含PCV-1病毒(毒株PK-15)的ORF1基因的965bp PCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离946bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,给出质粒pJP121(5804bp)(图4)
实施例5:
构建质粒pJP058(表达猪GM-CSF)
通过从颈静脉,用含有EDTA的管子收集猪血液。经Ficol1梯度离心收获单核化的(mononucleated)细胞,然后在RPMI 1640培养基(Gibco-BRL)上体外培养,通过添加伴刀豆球蛋白A(Sigma)在培养基中的终浓度5μg/ml刺激。在刺激72小时之后,收获成淋巴细胞,用抽提试剂盒″小量总RNA分离试剂盒″(Clontech),按照制造商推荐的办法抽提这些细胞的总RNA。借助“第1链cDNA合成试剂盒”(Perkin Elmer),进行反转录反应,接着采用下列寡核苷酸,对从这些猪成淋巴细胞抽提的RNA进行聚合酶链反应:
RG972(33聚体)(SEQ ID NO:9)
5’TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3’
RG973(34聚体)(SEQ ID NO:10)
5’TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3’
以产生约450碱基对(bp)的片段。将这一片段以NotI消化以便琼脂糖凝胶电泳后分离450bp NotI-NotI片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,优选地是以NotI消化并去磷酸化,给出质粒pJP058(5405bp)(图5)。检查克隆进质粒pJP058的pGM-CSF基因的序列,发现与GenBank数据库中(登记号D21074)获得序列相同。
实施例6:
产生免疫接种猪的纯化的质粒
用以上实施例1到5的质粒pJP109,pJP111,pJP058,pJP120和pJP121转化大肠杆菌K12细菌(菌株DH10B或SCS1)。然后分开在Luria-Broth(LE)培养基中振荡培养(37℃)用这五种质粒分别获得的五种转化的克隆。在指数阶段的末期收获细菌培养物。根据碱性溶胞技术提取质粒。然后根据由Sambrook等描述的技术(分子生物学:实验室手册,第2版,1989,冷泉港实验室,冷泉港,NY)在氯化铯梯度上纯化所提取的质粒。在溴化乙锭最终抽提和在无水乙醇存在下沉淀后,将纯化的质粒重悬于TE缓冲液(1mM Tris/EDTA pH 8.0)中,以获得含每毫升2毫克质粒的贮存液。使用前将该贮存液贮存在-20℃下。
实施例7:
控制PCV-2病毒ORFs1和2的表达
为了控制分别克隆进质粒pJP109和pJP111的PCV-2ORF2与PCV-2ORF1基因表达的产物,按照制造商推荐的使用方法,采用LipofectaminePlus 转染试剂盒(Gibco-BRL,目录:10964-013)将这些质粒转染进CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞(ATCC号CCL-61)。转染后48小时,洗涤转染的细胞,在室温以95%的冰丙酮溶液固定3分钟。将对PCV-2ORF1蛋白质(F199 1D3GA和F210 7G5GD)与ORF2蛋白质(F190 4C7C,F190 2B1BC和F190 3A8BC)特异性的五种单克隆抗体用作第一抗体。以Cy3标记的抗小鼠IgG缀合物用来揭示特定标记。采用质粒pJP109转染的细胞中的3种PCV-2 ORF2单克隆观察到一种PCV-2特定荧光,而用质粒pJP111转染的没有。相反采用质粒pJP111转染的细胞中的2种PCV-2 ORF1单克隆观察到一种PCV-2特定荧光,而用质粒pJP109转染的没有。采用以质粒pVR1012单独转染的CHO细胞或未转染的CHO细胞中的PCV-2单克隆检测不到任何荧光。
采用对PCV-2病毒特异性的多克隆血清观察到相同的表达结果。在这种情况下,荧光标记的抗-猪IgG缀合物用于检测特定荧光。采用以质粒pVR1012单独转染的CHO细胞或未转染的CHO细胞中的这种多克隆血清检测不到任何荧光。
实施例8:
用裸DNA免疫接种猪
8.11天龄小猪
通过D0天剖腹产方案获得的几组小猪置于分开的单位中,用各种质粒疫苗溶液经肌内路线在2天时接种这些小猪。经用无菌生理盐水(0.9%NaCl)稀释贮存液制备疫苗溶液。
小猪用单独的质粒pJP109或质粒pJP109与pJP111的混合物或质粒pJP109与pJP058的混合物或质粒pJP109,pJP111和pJP058的混合物接种。
疫苗溶液含有每一质粒500μg。
体积:疫苗溶液经肌内路线以2ml总体积注射疫苗溶液。在实施中,给定接种小猪的年龄(1-2天),在颈两侧的每一边给予1毫升的一次注射(=2×1ml)。
两次疫苗注射在两周间隔进行,这就是说在方案的D2天和D14天进行。
在方案的D21天用口鼻施用毒性PCV-2毒株病毒悬液进行激发。然后监测小猪三周,观察小猪断奶后全身消瘦综合症的特定临床征候的出现。观测的的症候是:
直肠温度:头14天每日测量,然后,在激发后的第三周测量两次。
重量:就在激发之前称量小猪,在激发后的3周期间每周称量一次。试验病毒血症和抗体之血样的收集:在D2,D14,D21,D28,D35和D42天采集血样。
尸体解剖:在D42天,温和地处死存活的小猪,进行尸体解剖,以研究病理解剖学损伤,并从肝脏,淋巴结,脾,肾以及胸腺进行组织学制备,以研究在这些组织中的损伤。
8.2.5-7周大猪崽
不再具有对PCV-2病毒特异性的母性抗体的5-7周大猪崽经肌内路线接种单独质粒pJP109,或者质粒pJP109与pJP111的混合物,或者质粒pJP109与pJP058的混合物或者质粒pJP109,pJP111和pJP058的混合物。
接种剂量与实施例8.1中所指出的那些相同(每个质粒500μg)。以2ml体积经肌内路线注射疫苗溶液(一次施用2ml到颈肌肉)。
两次免疫接种间隔21天。通过肌内施用毒性PCV-2毒株的病毒悬液,在最后一次接种后的14天(D35)进行激发。
监测小猪八周,观察小猪断奶后全身消瘦综合症的特定临床征候的出现。激发后小猪的临床监测与实施例8.1中描述的相同,只是总的观察期是8周这一时间。
实施例9:
用以DMRIE-DOPE配制的DNA免疫接种小猪
替代实施例8中所描述的裸质粒DNA溶液,使用以DMRIE-DOPE配制的质粒DNA的溶液是可能的。用0.9%NaCl制备1mg/ml的DNA溶液(含有根据实施例6的一种或多种质粒)。通过将DMRIE-DOPE的冻干物吸收进合适体积的无菌蒸馏水中制备0.75mM DMRIE-DQPE溶液。
通过用0.9%NaCl中的1mg/ml DNA溶液等份稀释0.75mM DMRIE-DOPE溶液达到形成质粒DNA-阳离子脂复合物。借助装有26G针的注射器,沿着包含阳离子脂溶液的药瓶的壁,慢慢引入DNA溶液,避免形成泡沫。两种溶液混合,迅速轻轻振荡。最终获得包含0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml DNA的组合物。
对在以上描述的所有操作,在室温下使用溶液是合乎需要的。在免疫猪之前30分钟,在室温下形成DNA/DMRIE-DOPE复合物。
然后根据实施例8.1和8.2中描述的条件接种猪。
实施例10:
小猪的免疫接种和结果
第一实验
剖腹产来源的3或4头小猪的组在第0天置于分开的装置中,第2天小猪用pJP109单独,或用pJB109和pJP111质粒混合物,或者生理溶液(用于对照组)免疫接种。每一质粒用无菌生理盐水溶液(0,9%NaCl)稀释至250μg/μl终浓度。以1毫升的两点经肌内路线注射2毫升体积(颈的每边1点)。在第14天进行疫苗或对照剂的第二次注射。用DNA的免疫接种小猪耐受良好,没有发现对免疫接种的不良反应。经口鼻施用(每一鼻孔1ml)PCV-2病毒悬液在第21天激发小猪。激发小猪后,一周称量一次。在第17,21,22,24,27,29,31,34,37,41,44天记录直肠温度。第44天,收集各小猪的直肠洗涤物(为PCV-2流出)。经定量PCR检测和定量病毒。第45天完成尸体剖检,并采集病毒分离物的组织样品。
●临床症状:
在各组中,平均体重增加和平均体温没有明显不同。
●尸体剖检损伤:
最终在猪中观察到的唯一重大发现是支气管淋巴结病。按照下列标准给损伤计分:
0=没有可见的淋巴结增大
1=轻微淋巴结增大,限于支气管淋巴结
2=中度淋巴结增大,限于支气管淋巴结
3=严重淋巴结增大,扩展至支气管下颌肩胛骨前和腹股沟淋巴结
std是标准偏差的缩写
N是在每一组中动物的数量。
组 淋巴结病计分
平均值 std N
pJP109 1.2 1.3 4
pJP109+pJP111 2.0 1.7 3
对照 3.0 0.0 3
N=每一组中小猪的数量
在以pJP109免疫的4个小猪的3个中,在以pJP109和pJP111质粒混合物免疫的3个小猪的1个中观察到淋巴结损伤的降低。因为标准偏差(std)的高数值,这种差异是不明显的(P>0.05)。
●淋巴结组织中病毒载量:
在从支气管和肠系膜淋巴结制备的组织匀浆上进行定量病毒再分离。
在log10转化之后,所给出的数据相应于组织匀浆中的病毒滴度。
PCV-2滴度
组 支气管LN 肠系膜LN
平均值 Std 平均值 Std N
pJP109 0.9 0.8 0.9 0.8 4
pJP109+ 0.7 0.6 0.2 0.2 3
pJP111
对照 2.0 1.1 1.8 1.1 4
支气管淋巴结似乎包含最大感染性的病毒。在以pJP109或pJP109+pJP111质粒混合物免疫的小猪的支气管和肠系膜淋巴结中,观察到病毒载量的降低。对质粒混合物,这种降低是明显的(P≤0.05)。
●病毒的排泄:
经基于PCV-2ORF2扩增的PCR就PCV-2评估后激发粪便擦棒。每一次试验用2毫升样品的三次重复完成。未接种的对照激发前为PCV-2阴性,激发后为阳性,证实PCR试验的有效性。
测定值以log10(2μl样品中PCV-2DNA的分子数量)表示。
log10PCV-2DNA分子数量
组 平均值 std N
pJP109 3.3 0.3 4
pJP109+pJP111 2.9 0.7 3
对照 3.6 0.6 4
组之间的差异不明显。
第2实验
14天龄的常规小猪在第0天和第20天两次用由DMRIE DOPE配制的pJP109和pJP111质粒混合物免疫。对每一次施用,经肌内路线在耳后颈侧面注射2毫升。疫苗组合物是每毫升生理溶液(0,9%NaCl)250μg各种质粒和0.375mM DMRIE DOPE。
对对照组小猪注射生理溶液。
第32天,小猪经口鼻路线激发,在每个鼻孔中用注射器引入5毫升每毫升滴度105.8TCID50的PCV-2病毒悬液。
监测小猪的临床症状,虚脱,呕吐,气促,咳嗽,厌食以及过热(在激发后28天期间内每天记录直肠温度),减慢生长(在第32,40,46,53,60天称量小猪)。按照下列标准记录症状:附录1(每一小猪的得分等于相应于不同观察天数得分的总和)。
第60天,进行尸体剖检,按照下列标准进行损伤计分:附录2(每一小猪的得分等于相应于各观察器官得分的总和)。
收集组织样品,特别是淋巴结。
在病毒排泄后第32,39,42,46,49,53,56,60天,收集直肠擦棒。
●临床症状:
与对照比较,在免疫小猪组中观察到临床症状的明显减弱。在对照组中,一头小猪死于PMWS,而在接种组中没有。
临床得分
组 平均值 std N
接种组 13.5 7.1 8
对照组 29.3 15.6 8
(P<0.01 Kruskal-Wallis检验)
在免疫小猪组观察到后激发过热延续时间明显缩短(P<0.05)。
直肠温度≥40℃的天数
组 平均值 std N
接种组 1.9 2.0 8
对照组 8.4 3.9 8
在接种组和对照组之间,激发后每日重量增长没有明显区别。
●尸体剖检损伤:
与对照组比较,在免疫小猪中观察到损伤明显降低,特别是淋巴结病(P≤0.05)。
综合损伤和淋巴结病得分
组 平均值 std N
综合损伤
接种组 7.6 3.3 8
对照组 13.1 7.5 8
淋巴结得分
接种组 3.1 2.7 8
对照组 5.7 2.9 8
●淋巴结组织中病毒载量:
通过免疫化学确定肠系膜和纵隔淋巴结中的病毒载量。
下列标准用于计分
-0=缺乏荧光
-1=在某些器官切片上有一些荧光点
-2=每次拍摄一个荧光点
-3=全部荧光器官
在免疫组中观察到病毒载量的明显降低(P≤0.05)。
病毒载量
组 肠系膜LN 纵隔LN N
平均值 std 平均值 std -
接种组 0.5 0.6 1.3 0.2 8
对照组 1.8 0.8 2.0 0.8 8
●病毒排泄:
经PCR估测粪便擦棒的PCV-2排泄。按照下列标准计量结果:
0=没有PCV-2
1=存在PCV-2
在免疫小组中,38%的小猪在粪便中排泄PCV-2,对照组中为88%排泄。与对照组比较,在接种组中病毒排泄的期限明显缩短。
病毒排泄平均期限(天)
组 平均值 std N
接种组 1.2 2.1 8
对照 11.4 6.3 8
应该清楚,由权利要求书限定的本发明不受以上说明书所提出的特定实施方案的限制,并且包括不偏离本发明范围和精神的各种变化的情况。
附录1:临床症候得分
症候 | 得分 |
虚脱 | 0无,1有,2不能确定 |
呕吐 | 0无,1有 |
呼吸困难 | 0无,1中度,2重度 |
咳嗽 | 0无,1有 |
厌食 | 0无,1有 |
过热 | 0无,1≥40℃,2≥41℃ |
生长 | 0无,1周DWGx≤周DWGx-1并且>100克/天 |
2周DWG≤100克/天 | |
死亡 | 0无,x死亡前一天的得分 |
对一天而言,得分是每次症候得分的总和
附录2:目视损伤得分
皮肤 | 正常 | 0 |
(颜色)肥胖粘液sub.cut.conjonctif神经节(gg)胸液心脏肺胸膜 | 白色黄色正常瘦非常瘦恶病质性正常白色黄色正常发亮黄色正常I大的和或充血>I大的和或充血>I非常大正常发亮可见正常损伤正常损伤≤4损伤>4≤6损伤>6正常损伤 | 120123012012012301201012301 |
腹水腹膜胃小肠大肠派伊尔氏淋巴集结肝肾膀胱 | 正常发亮可见正常可见正常损伤溃疡正常损伤正常损伤正常在小肠的1部分可见在小肠的2部分可见非常明显正常损伤正常损伤正常损伤 | 0120101201010123010101 |
序列表
<110>MERIAL
<120>DNA疫苗-PCV
<130>DNA疫苗PCV
<140>numéro brevet
<141>date dépót brevet
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>35
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>1
catcatcatg tcgacatgac gtatccaagg aggcg 35
<210>2
<211>36
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>2
tactactaca gatctttagg gtttaagtgg ggggtc 36
<210>3
<211>35
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>3
catcatcatg tcgacatgcc cagcaagaag aatgg 35
<210>4
<211>36
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>4
tactactaca gatcttcagt aatttatttc atatgg 36
<210>5
<211>35
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>5
catcatcatg tcgacatgac gtggccaagg aggcg 35
<210>6
<211>40
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>6
tactactaca gatctttatt tatttagagg gtcttttagg 40
<210>7
<211>35
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>7
catcatcatg tcgacatgcc aagcaagaaa agcgg 35
<210>8
<211>36
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>8
tactactaca gatcttcagt aatttatttt atatgg 36
<210>9
<211>33
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>9
tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 33
<210>10
<211>34
<212>ADN
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:寡核苷酸
<400>10
tatgcggccg ctacgtatca cttctgggct ggtt 34
Claims (47)
2.一种免疫原性制剂,其包含至少一种编码和在猪宿主中体内表达选自猪环状病毒II型(PCV-2)的开放读框(ORF)1和PCV-2的ORF2的分离核酸分子的质粒和包含卡波姆的佐剂。
3.根据权利要求1的免疫原性制剂,其中阳离子脂是(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵(DMRIE)。
4.根据权利要求3的免疫原性制剂,其中DMRIE与中性脂结合。
5.根据权利要求4的免疫原性制剂,其中DMRIE与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)结合。
6.根据权利要求1-5中任一项的免疫原性制剂,其进一步包含猪细胞因子或编码和表达猪细胞因子的质粒。
7.根据权利要求6的免疫原性制剂,其中猪细胞因子是GM-CSF。
8.根据权利要求1或2的免疫原性制剂,其进一步包含编码和表达来自除PCV-2外的猪病原体的免疫原的质粒。
9.根据权利要求1-4中任一项的免疫原性制剂,其中该制剂包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF1的质粒。
10.根据权利要求1-4中任一项的免疫原性制剂,其中该制剂包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF2的质粒。
11.根据权利要求1-4中任一项的免疫原性制剂,其中该制剂包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF1和ORF2的质粒。
12.根据权利要求1-4中任一项的免疫原性制剂,其中该制剂包括至少两种质粒,其中一种为包含和表达PCV-2的ORF1的质粒,另一种为包含和表达PCV-2的ORF2的质粒。
13.根据权利要求5的免疫原性制剂,其中DMRIE∶DOPE的摩尔比范围是95∶5至5∶95。
14.根据权利要求13的免疫原性制剂,其中DMRIE∶DOPE的摩尔比是1∶1。
15.根据权利要求3的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是50∶1至1∶10。
16.根据权利要求3的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是10∶1至1∶5。
17.根据权利要求3的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是1∶1至1∶2。
18.根据权利要求5的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是50∶1至1∶10。
19.根据权利要求5的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是10∶1至1∶5。
20.根据权利要求5的免疫原性制剂,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是1∶1至1∶2。
21.根据权利要求6的免疫原性制剂,其中该制剂包含编码和表达猪细胞因子GM-CSF的质粒。
22.权利要求1-4任一项的免疫原性制剂在制备用于在猪宿主内引起针对猪环状病毒的免疫原性应答的药物中的用途。
23.至少一种编码和表达PCV-2的ORF1或PCV-2的ORF2的质粒在制备用于增强猪宿主对多肽的宿主免疫应答的药物中的用途,其中所述多肽是由猪环状病毒II型(PCV-2)的开放读框(ORF)1或PCV-2的ORF2编码的多肽,其中所述质粒与由包含下式的阳离子脂的佐剂复合,
其中R1是具有12至18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族基团,R2是包含2至3个碳原子的脂肪族基团,并且X是羟基或氨基。
24.至少一种编码和表达PCV-2的ORF1或PCV-2的ORF2的质粒和包含卡波姆的佐剂在制备用于增强猪宿主对多肽的宿主免疫应答的药物中的用途,其中所述多肽是由猪环状病毒II型(PCV-2)的开放读框(ORF)1或PCV-2的ORF2编码的多肽。
25.权利要求23的用途,其中阳离子脂是(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵(DMRIE)。
26.权利要求25的用途,其中DMRIE与中性脂结合。
27.权利要求26的用途,其中DMRIE与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)结合。
28.权利要求23或24中任一项的用途,其中所述药物进一步包含猪细胞因子或编码和表达猪细胞因子的质粒。
29.权利要求28的用途,其中猪细胞因子是GM-CSF。
30.根据权利要求23或24的用途,其中所述药物进一步包含编码和表达来自除PCV-2以外的猪病原体的免疫原的质粒。
31.根据权利要求23或24任一项的用途,其中所述药物包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF1的质粒。
32.根据权利要求23或24任一项的用途,其中所述药物包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF2的质粒。
33.根据权利要求23或24任一项的用途,其中所述药物包括至少一种包含和表达PCV-2的ORF1和ORF2的质粒。
34.根据权利要求23或24任一项的用途,其中所述药物包括至少两种质粒,其中一种为包含和表达PCV-2的ORF1的质粒,另一种为包含和表达PCV-2的ORF2的质粒。
35.权利要求27的用途,其中DMRIE∶DOPE的摩尔比范围是95∶5至5∶95。
36.权利要求27的用途,其中DMRIE∶DOPE的摩尔比是1∶1。
37.权利要求25的用途,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是50∶1至1∶10。
38.权利要求25的用途,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是10∶1至1∶5。
39.权利要求25的用途,其中质粒∶DMRIE的重量比范围是1∶1至1∶2。
40.权利要求27的用途,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是50∶1至1∶10。
41.权利要求27的用途,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是10∶1至1∶5。
42.权利要求27的用途,其中质粒∶DMRIE-DOPE的重量比范围是1∶1至1∶2。
43.权利要求28的用途,其中所述药物包含编码和表达猪细胞因子GM-CSF的质粒。
44.权利要求23或24的用途,其中所述药物被配制为用于肌内给药的形式。
45.权利要求23或24的用途,其中所述药物被配制为用于真皮内给药的形式。
46.权利要求22的用途,其中所述药物被配制为用于肌内给药的形式。
47.权利要求22的用途,其中所述药物被配制为用于真皮内给药的形式。
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