CN1277614A - 乳房珠蛋白,一种乳房特异性乳腺癌分泌蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种纯化和分离的DNA序列及其编码的乳房特异性蛋白质即乳房珠蛋白。同时还公开了一种基于乳腺癌细胞超量表达和乳房珠蛋白分泌来检测乳腺癌的方法。该方法检测和/或定量乳房珠蛋白或编码乳房珠蛋白的mRNA的存在。还公开了对患有乳房珠蛋白超量表达肿瘤的乳腺癌患者的免疫治疗方法。此类方法涉及用乳房珠蛋白诱导抗肿瘤的体液和/或细胞介导免疫应答。

Description

乳房珠蛋白，一种乳房特异性乳腺癌分泌蛋白
发明背景
(1)发明领域
本发明主要涉及乳腺癌病理领域，更具体地说，涉及一段cDNA序列及其编码的用于检测和治疗乳腺癌的乳房特异性蛋白。
(2)相关技术的说明
乳腺癌是最常见的致死性癌症之一。虽然，早期诊断和治疗能降低该疾病的发病率和死亡率，但是乳房X照相术的阳性预测值据估计仅为25％(Hall等，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)327：319-328，1992，在此参考)。所以，最好有一种方法能够比乳房X照相术检测更早检测出癌症，而遗传或生物化学标记可能能够提供这类补充和提高乳房X照相术阳性预测值的方法。(Hayes，Hematol OncolClin N Am 8：485，1994，在此参考)。
乳腺癌的发展伴随着许多遗传改变(参见Porter Jordan，Hematol Oncol Clin NAm 8：73，1994，在此参考)。这类改变包括染色体总体改变和遗传标记的丢失(Devilee等，《生物化学和生物生理学学报》(Biochim Biophys Acta)1198：113，1994；Callahan等，《细胞生物化学杂志增刊》(J Cell Biochem Suppl)17：167，1993，在此参考)。乳腺瘤形成的发展也被证明会导致已鉴定的编码生长因子及其受体(Zajchowski等，《癌症研究》(Cancer Res)48：7041，1988，在此参考)、结构蛋白(Trask等，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci)87：2319，1990，在此参考)、第二信使蛋白(Ohuchi等，《癌症研究》26：2511，1986，在此参考)和转录因子(Harris，《癌症研究进展》(Adv Cancer Res)59：69：1992，在此参考)的基因表达上的质变和量变。这些基因表达上的改变可能潜在地构成发展乳腺癌标记的基础，尽管在患者的活组织检验样品中，对这些基因的改变在乳腺癌病理方面的确切作用还知之不详。
除了提供乳腺癌的遗传或生物化学标记用于早期诊断之外，最好能有一种肿瘤标记能够对预后进行评估，即用于选择和评价治疗的方法和用于导向治疗的方法。虽然已经鉴定出了许多组织标记，但是都不够敏感或缺乏肿瘤特异性，因而不适用于诊断或筛选一般性人群(同上)。所以，一直以来都需要有一种乳腺癌标记例如基因及其表达蛋白，能够特异性和选择性地检测出患者体内乳腺癌的出现和病理发展，并可用于肿瘤特异性免疫治疗。
利用改良差异显示聚合酶链反应技术来分离乳腺癌的差异表达序列标记分离出了几个序列片段，与正常组织对照相比，它们独特地在瘤形成性乳腺上皮组织中表达(Watson和Fleming，《癌症研究》54：4598-4602，1994，在此参考)。这类序列标记之一已被发现并被鉴定为DEST002，由此发现和分离出了新的全长cDNA及其编码的现在被称为乳房珠蛋白(mammaglobin)的蛋白质。该cDNA和蛋白质都是新的。
本发明综述
所以，本发明主要涉及鉴定新的在乳腺癌中表达增加的基因，和由这些基因的mRNA分离cDNA。所以，申请人已经成功地发现了一种新的cDNA及其编码的乳房特异性分泌蛋白即乳房珠蛋白。该cDNA是纯化及分离形式的，其核苷酸序列经鉴定为SEQ ID NO：1，其编码的蛋白，即乳房珠蛋白，是纯化及分离形式的，其氨基酸序列经鉴定为SEQ ID NO：2。
在27％原发性的I期乳腺癌肿瘤中，乳房珠蛋白超量表达。这表明乳房珠蛋白基因的失调多发于乳腺癌的早期。所以，乳房珠蛋白及其cDNA的发现为发展用于检测和治疗人和其它哺乳动物乳房瘤形成性疾病的新方法和新组合物提供了基础。
所以，本发明还涉及检测样品中乳房瘤形成性细胞存在的新方法。在实施方式之一中，编码乳房珠蛋白的cDNA或所述cDNA的衍生物被用于检测样品中乳房珠蛋白mRNA的存在。该方法包括以下步骤：(a)提供含有SEQ ID NO：1序列的聚核苷酸或其衍生物，(b)在一定条件下将核苷酸序列与样品一起孵育，使得该序列能够与来自乳房瘤形成性细胞的mRNA杂交，和(c)检测DNA-RNA杂交复合物的存在。
本发明的另一方面内容提供了用于杂交法检测样品中乳房瘤形成性细胞的试剂盒。该试剂盒包含包装于容器中的含有SEQ ID NO：1序列的聚核苷酸或其衍生物。
在本发明另一实施方式中，样品中乳房珠蛋白的表达是通过检测由样品中乳房珠蛋白mRNA逆转录而成的cDNA来进行的。该方法包括以下步骤：(a)在患者样品中用逆转录法由mRNA生成编码乳房珠蛋白的cDNA，(b)提供两段聚合酶链反应的引物，它们所包含的寡核苷酸位于编码乳房珠蛋白的cDNA的两侧或位于其中，和(c)用聚合酶链反应扩增编码乳房珠蛋白的cDNA。这两段引物包含核苷酸序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
本发明另一实施方式提供了用聚合酶连反应法检测样品中乳房瘤形成性细胞的试剂盒。该试剂盒包含包装于容器中的两段聚合酶链反应引物，它们位于编码乳房珠蛋白的cDNA的两侧或位于其中。这两段引物包含核苷酸序列SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4。
在本发明另一实施例中，样品中由肿瘤细胞表达的乳房珠蛋白是用乳房珠蛋白的特异性抗体来检测的。这种特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还涉及用乳房珠蛋白抗原治疗乳房瘤形成性疾病的组合物和方法，所述抗原能够诱导抗体介导和/或细胞介导(即通过活化T细胞)的免疫应答对抗表达乳房珠蛋白的肿瘤。
本发明组合物实施例之一包含乳房珠蛋白B细胞抗原，它能够激活乳房珠蛋白特异性B细胞。所述B细胞抗原包含乳房珠蛋白特异性B细胞表位和TH表位或可被T辅助细胞识别的决定簇。
本发明另一实施例中，乳房珠蛋白抗原是可被乳房珠蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞识别的乳房珠蛋白TC细胞抗原，它包含结合MHC I类分子的TC细胞表位和结合位点，或抗原限制位(agretope)。
本发明组合物的另一实施例包含B细胞抗原和TC细胞抗原。
治疗乳房珠蛋白表达性肿瘤患者的方法包括过继性免疫疗法，用乳房珠蛋白抗原体外激活自患者分离的乳房珠蛋白特异性淋巴细胞，然后将活化的淋巴细胞返还患者，既而体内激发抗乳房珠蛋白免疫应答，这包括给予患者包含乳房珠蛋白抗原的疫苗。
所以，在本发明的优点中值得一提的是，本发明提供了可作为乳腺癌细胞标记的一段核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；提供了早期检测乳房瘤形成性细胞的方法；提供了能够对乳房X照相术进行补充并提高预测准确性的检测乳腺癌的方法；提供了能够评价预后的方法；提供了治疗中实现导向的标记；以及提供了激发抗肿瘤的细胞和体液免疫的组合物。
附图说明
图1显示分离全长乳房珠蛋白cDNA的方法，包括cDNA末端快速扩增(RACE)聚合酶链反应技术(PCR)，然后亚克隆到载体pGEM7Z和pCEV27中。
图2显示人cDNA序列SEQ ID NO：1(核苷酸编号在上方)及其编码的乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：2(氨基酸编号在下方)，实线表示用RACE PCR方法分离得到的403bp片段(SEQ ID NO：5)，空心线表示206bp的DEST002序列(SEQ ID NO：6)。
图3显示乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白(hMAM)(SEQ ID NO：2)与大鼠前列腺甾体结合蛋自亚基C3(rPSE3)(SEQ ID NO：7)和人克拉拉细胞10KD蛋白质(hCC10)(SEQ ID NO：8)进行的比较，相同的氨基酸以粗体字母和双线标出，结构类似的氨基酸以单线标出；
图4显示(A)编码乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白(hMAM)的人cDNA序列与乳房瘤形成性组织、正常乳房组织和其它成人组织表达的mRNA杂交的Northern印迹分析；和(B)来自乳房瘤形成性组织、正常乳房组织和其它成人组织的RT/PCR扩增的组织样品的分析；
图5显示乳房特异性cDNA序列在体外兔网织红细胞裂解物分析系统中的翻译；
图6显示与编码乳房珠蛋白的cDNA的Northern印迹杂交分析，在肿瘤2410中，在来自其它8位患者中3位的肿瘤中(以粗体表示)，以及在正常乳房组织(以斜体表示)中(较少)检测到了mRNA，并进行了两份肿瘤组织和同患者正常组织中乳房珠蛋白mRNA表达的比较(右侧的四泳道)；
图7显示免疫肽不存在(-)和存在(+)时，乳房珠蛋白C末端(SEQ ID NO：14)的多克隆抗体对来自MDA-MB-415乳房肿瘤细胞的条件培养基(S)和细胞裂解物(C)的Western印迹分析，分析显示在细胞培养基和裂解物中分别发现了乳房珠蛋白的前体和分泌形式；
图8显示抑制糖基化的衣霉素不存在(-)和存在(+)时，用抗乳房珠蛋白多克隆抗体对来自MDA-MB-415乳房肿瘤细胞的条件培养基(S)和细胞裂解物(C)的Western印迹分析，分析显示，在N糖基化受到抑制的细胞裂解物和培养基中没能检测到乳房珠蛋白；
图9显示人乳房肿瘤细胞裂解物的Western印迹分析，分析显示，用抗乳房珠蛋白多克隆抗体和山羊抗兔抗体检测乳房珠蛋白前体，并由酶联化学发光剂显现；
图10显示抗乳房珠蛋白多克隆抗体对孕期及产后人乳房分泌液的Western印迹分析，显示在增殖乳腺中检测到了分泌的乳房珠蛋白；
图11A以彩色显示患者样品的乳腺癌细胞石蜡固定切片的免疫组织化学染色，采用抗乳房珠蛋白多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体和底物DAB，表达乳房蛋白的细胞被染成了棕色；
图11B以黑白显示患者样品的乳腺癌细胞石蜡固定切片的免疫组织化学染色，采用抗乳房珠蛋白多克隆抗体，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，和底物DAB，表达乳房蛋白的细胞被染成了棕色。
优选实施方式的说明
本发明内容之一是cDNA SEQ ID NO：1的鉴定与测序，它编码经鉴定为SEQID NO：2(图2)的乳房特异性分泌蛋白即乳房珠蛋白。如后文所述，乳房珠蛋白的全长cDNA由肿瘤细胞的mRNA逆转录分离得到，利用PCR技术扩增，然后亚克隆在表达载体中。此外，对该cDNA编码的蛋白质即乳房珠蛋白进行了鉴定与描述。
用匿名序列标记DEST002证明，此前未知但经本发明鉴定为乳房珠蛋白的相应基因产物在乳腺癌肿瘤细胞系MDA-MB-415中特别丰富。为了分离全长的乳房珠蛋白cDNA，用RACE PCR逆转录该细胞系的mRNA(Edwards等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)19：5227-32，1991，在此参考)。该技术的基础是单链寡聚脱氧核糖核苷酸与单链cDNA的3’末端的连接。图1图示了用于分离乳房珠蛋白cDNA的这一方法。
由该技术分离的403bp片段的序列信息(SEQ ID NO：5)(图2)，结合在我们以往研究中由相应的DEST序列获得的序列信息(DEST002，SEQ ID NO：6)(Waston和Fleming，同上)，推导出了全长503bp的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。在503bp的cDNA内有一个279bp开放读码框，它编码一个预计分子量为10.5kD的93个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)(图2)。该开放读码框的起首甲硫氨酸含于一段近乎完全的Kozak共有序列中(Kozak，《细胞》(Cell)22：7-8，1980，在此参考)。该序列的60bp上游不包含其它框内甲硫氨酸或翻译终点。cDNA的3’端非翻译序列共163bp并包含一个聚腺苷酸化信号即AATAAA，位于原DEST002序列起始位点上游12bp。以上数据表明分离出的是全长乳房珠蛋白cDNA。所编码多肽的前19个残基可能是一段疏水肽信号序列，残基53-55和68-70是共有的N糖基化位点，这说明乳房珠蛋白是分泌糖蛋白。
利用BLAST算法(Benson等，Nucl.Acid.Res.21，2963-2965，1993；Atschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)在基因库(Genbank)中查找与乳房珠蛋白cDNA相似的DNA序列没有发现明显同源的DNA序列。这样，可以认为乳房珠蛋白cDNA是一段新的、迄今未知的DNA序列。
在其它多肽中查找与乳房珠蛋白相关的序列发现在乳房珠蛋白和其它多肽间存在氨基酸序列同源性。乳房珠蛋白与大鼠前列腺甾体结合蛋白(前列腺蛋白)亚基C3(rPSC3)(图3)(SEQ ID NO：7)具有42％的氨基酸一致性(包括保守性取代则为58％)。大鼠前列腺甾体结合蛋白是大鼠前列腺中的一种主要分泌蛋白，是由两个不同的二聚体亚基：C3/C1和C3/C2(Parker等，Ann N Y Acad Sci 348：115-124；Parker等，《甾体生物化学杂志》(J Steroid Biochem)20：67-71，1984，在此参考)构成的四聚体蛋白。C1、C2和C3基因都编码约6kD的分泌蛋白，并认为这是基因重复的结果，但虽然C1和C2具有很高的同源性，它们与C3却大不相同。所以，乳房珠蛋白与C1和C2蛋白不具有序列同源性。
如上所述，前列腺甾体结合蛋白(前列腺蛋白)是大鼠前列腺中的一种主要分泌蛋白，而且其表达受雄激素甾体调控(Parker等，Ann N Y Acad Sci 438：115-124；Parker等，《甾体生物化学杂志》(J Steroid Biochem)20：67-71，1984，在此参考)。据报道，有另一种蛋白即人雌二醇氮芥结合蛋白(hEMBP)在人前列腺、人乳腺癌和人恶性黑素瘤中表达(Bjork等，《癌症研究》(Cancer Res.)42：1935-1942，1982；Bjork等，《抗癌研究》(Anticancer Res)11：1173-82，1991，在此参考)。人雌二醇氮芥结合蛋白与大鼠的雌二醇氮芥结合蛋白在免疫化学上相似，后者据估计与大鼠甾体结合蛋白即前列腺蛋白相同。如上所述，乳房珠蛋白表现出与前列腺蛋白C3亚基具有42％的氨基酸序列一致性和包括保守性取代的58％同源性。所以，乳房珠蛋白可能在一定程度上与hEMBP相关。但是，虽然在前列腺中同时检测到了前列腺蛋白和hEMBP，但该组织中完全没有乳房珠蛋白mRNA。因此，乳房珠蛋白即不是与hEMBP相同的蛋白也不是其亚基，而且，由于还没有确定hEMBP的序列，所以还不知道乳房珠蛋白与hEMBP的某些片段或亚基是否具有任何相似性。
虽然最近的报道证明与SV40 T抗原融合的rPSC3启动子在转基因鼠中既造成前列腺癌又造成乳腺癌(Maroulakou等，《美国科学院院报》91：11236-11240，1994；Sandmoller等，《癌基因》(Oncogene)9：2805-2815，1994，在此参考)，但尚不清楚该蛋白的确切生物学功能。此外，虽然假定大鼠的前列腺甾体结合蛋白与人EMBP相关，但是不曾对与rPSC3对应的人多肽或人基因进行过鉴定。所以，乳房珠蛋白及编码乳房珠蛋白的cDNA代表着迄今未知的新序列。
人工将BLAST分值较低的其它序列与乳房珠蛋白和rPSC3序列对齐，我们发现了与人克拉拉细胞10kD蛋白(hCC10)(SEQ ID NO：8)(Peri等，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest)92：2099-2109，1993，在此参考)(图3)，以及与兔和小鼠子宫珠蛋白的其它同源性(Miele等，《内分泌综述》(Endocrine Rev)8：474-90，1987；Cato和Beato，《抗癌研究》5：65-72，1985；Miele等，《内分泌学研究杂志》(J.Endocrinol.Invest.)17：679-692，1994，在此参考)。根据种的不同，这些同源性为26％全同或包括保守性取代的40％同源。尤其是，许多氨基酸在各种蛋白质中完全保守，其中包括已知在子宫珠蛋白亚基间二硫键形成中起一定作用的Cys-3和Cys-69(见后文)。这些同源性表明乳房珠蛋白是由上皮细胞分泌的一个蛋白质小家族中的一个新成员(Miele等，1994，同上)。
hCC10基因是兔和小鼠子宫珠蛋白基因的人同源基因(Peri等，《临床研究杂志》92：2099-2109，1993，在此参考)。子宫珠蛋白最初被认为是特征性存在于兔子宫中的一种分泌蛋白，但此后被发现也存在于包括肺、乳房和前列腺在内的其它上皮器官中。与大鼠前列腺蛋白不同，子宫珠蛋白是通过保守性残基Cys-2和Cys-69处的二硫键偶合而成的一种均二聚体蛋白(Miele等，1994，同上)。虽然子宫珠蛋白基因的转录是由甾体类激素调控的，但是蛋白质本身与孕酮或其它甾体类激素结合的能力还不确定，而且其确切的生物功能也未知(Miele等，1994，同上)。
乳房珠蛋白的表达仅限于在乳腺中。这与以下结果即rPSC3在大鼠前列腺中表达(Parker等，Ann N Y Acad Sci 438：115-1124，1984)，和hCC10/子宫珠蛋白在包括肺、子宫、前列腺和乳房在内的许多组织中表达(Miele等，1987，同上；Cato和Beato，同上；Miele等，1994，同上)相反。由于乳房珠蛋白与以上蛋白质之间的序列同源性，我们确定其表达方式是组织特异性的。500bp的乳房珠蛋白信使mRNA在肿瘤样品2410(原序列标记即从该组织中分离)中很容易被检测到，但在正常的人乳腺组织中则少得多(图4)。在无限繁殖的乳腺上皮细胞系B5-589中不能检测到乳房珠蛋白mRNA。在表达子宫珠蛋白的人子宫和肺中也未检测到乳房珠蛋白的表达。
利用RT/PCR扩增在肿瘤2410和正常乳腺组织中都检测到了乳房珠蛋白mRNA，而在其它15种受检组织中则没有，其中包括通常表达rPSC3和子宫珠蛋白的组织(肺、子宫、前列腺)、激素应答性和甾体生成性组织(卵巢、睾丸、胎盘)和其它分泌性上皮器官(结肠)(图4B)。所以，乳房珠蛋白mRNA的表达具有乳房组织相对特异性。
根据这一研究，乳房珠蛋白是一种相对乳房特异性蛋白质。另外两种已知在乳腺癌中超量表达的基因是erb-B和细胞周期蛋白D(Jardines等，《病理生物学》(Pathobiology)61：268-282，1994；Keyomars和Pardee，《美国科学院院报》90：1112-1116，1993，在此参考)。与erb-B或细胞周期蛋白D的超量表达不同，乳房珠蛋白的超量表达可能反映乳房上皮细胞的一种更特殊的改变而不是一般性的生长能力或有丝分裂速度的提高。因此，乳房珠蛋白基因失调的发生对于肿瘤的治疗应答和临床过程来说具有更特殊的重要性。
在一步RT/PCR检测的灵敏度水平上，在正常淋巴结或外周淋巴细胞中不能检测到乳房珠蛋白的表达。这表明外周淋巴结中的乳房珠蛋白转录产物分析，与其它上皮特异性基因一样，可用于检测隐匿的乳腺癌转移(Schoenfeld等，《癌症研究》54：2986-90，在此参考)。
为了证明乳房珠蛋白cDNA编码一种可翻译蛋白，将cDNA克隆用在一体外翻译系统中。图5显示得自用乳房珠蛋白cNDA处理的兔网织红细胞裂解物产生的蛋白质产物。用乳房珠蛋白cNDA生成了一种约6kD的蛋白质。表观分子量低于理论翻译开放读码框得出的预计值，但是在兔和人的子宫珠蛋白翻译产物中也经常发现是这样。
虽然我们在一种肿瘤样品(即2410)中发现了乳房珠蛋白的超量表达，但还不清楚这种超量表达在其它乳腺癌中的出现频率。所以，我们用乳房珠蛋白cDNA探针进行的Northern印迹杂交对一组15种不同组织学类型的I期原发乳腺癌进行了检查。因为环境影响(例如病人的激素状态)可能造成表达的潜在改变，我们又试图将肿瘤样品直接与同患者的正常乳房组织样品对照，虽然这在许多病例中无法做到。如图6所示，在正常乳房组织和肿瘤2410中也检测到了500bp的乳房珠蛋白mRNA。还在其它三种肿瘤中检测了乳房珠蛋白，其中两种(B015和B022)证明在同患者的正常组织中表达很少或不表达。总体上，被检的15种肿瘤中有4种(27％)超量表达乳房珠蛋白mRNA。以上数据表明乳房珠蛋白的超量表达并不仅限于一种肿瘤样品，实际上它在原发乳腺癌中相当常见。而且，所有被检肿瘤都是I期的这一事实表明这种失调在乳腺癌的发展进程中出现得相当早。
因为申请人认为乳房珠蛋白是一种分泌蛋白，所以预计可以在肿瘤超量表达该基因产物的患者血清中测得其存在。这样的话，乳房珠蛋白很可能成为临床用前列腺特异性抗原(PSA)和其它实体肿瘤的标记，用于治疗乳腺癌患者(“诊断病理学中的肿瘤标记”《临床实验室医学》(Tumor markers in diagnosic pathology，ClinLab Med10：1-250，1990，在此参考)。
我们通过在数种原发乳腺癌中检测乳房珠蛋白的表达确定了在乳腺癌肿瘤总群体中作为肿瘤标记的乳房珠蛋白的普遍性。虽然该研究中检查的样品数量较小，但是27％的被检肿瘤超量表达乳房珠蛋白mRNA。该百分比相当于其它遗传改变例如erb-B扩增和p53突变的普遍性(Slamon等，《科学》(Sci.)244：707-712，1989；Thor等，J Nat’l Cancer Inst 84：845-855，1992，在此参考)。而且，因为我们将分析限定在I期肿瘤，所以乳房珠蛋白的超量表达实际上比这一肿瘤亚组中的其它已知遗传改变更具有普遍性(Alllerd等，J Nat’l Cancer Inst 85：200-206，1993，在此参考)。
确定乳房珠蛋白作为乳腺癌标记为本发明另一方面内容，即检测患者体内存在乳腺癌的方法，提供了基础。“检测”在本文有关检测乳腺癌疾病的内容中包括确定患者体内是否存在乳腺癌，区别乳腺癌与其它疾病，估计预后即疾病的可能结果和恢复的前景，对疾病状态或疾病复发的监测，确定适合患者的优选治疗方案和抗肿瘤治疗的导向。
检测乳腺癌的方法包括聚核苷酸与乳腺癌细胞mRNA杂交。聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或其衍生物。某核苷酸序列的衍生物指该衍生核苷酸序列与其源序列基本相同，即衍生后的序列与其源序列具有充分的序列互补性因而能够在源序列与乳腺癌细胞mRNA杂交的相同严谨性条件下与乳腺癌细胞mRNA杂交。衍生核苷酸序列不一定在生理意义上来自某核苷酸序列，而可以用例如化学合成或DNA复制或逆转录或转录等方法产生。
为了在乳腺癌的检测系统中检测编码乳房珠蛋白的mRNA，需由患者获取一份样品。样品可以是组织活检样品或血液、血浆、血清等。可以处理样品以抽提其中的核酸。对得到的核酸进行凝胶电泳或其它分子筛技术。
检测包括将核酸尤其是样品的mRNA与探针DNA序列接触，以形成杂交双链。“探针”指这样的结构，它由一段聚核苷酸序列构成，该序列因为探针序列与靶区域内一段序列的互补性而与靶序列形成杂交结构。
通常使用标记过的探针来检测形成的双链。或者，探针可以是非标记的，但因直接或间接地与标记过的配体特异性结合而可被检测。用于标记探针和配体的合适标记物和方法是本领域已知的，其中包括例如可用已知方法(例如缺口平移或激酶法)掺入的放射性标记、生物素、荧光基团、化学发光基团(例如dioxetanes，尤其是触发后的dioxetanes)、酶、抗体等。
在使用编码乳房珠蛋白的cDNA或其衍生物作为探针时，可使用高严谨性条件防止假阳性。在使用衍生自乳房珠蛋白的序列时可以使用低严谨性条件。杂交的严谨性取决于杂交和洗涤过程中许多因素，包括温度、离子强度、时间和甲酰胺的浓度。以上因素在例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Mannual，第2版，1989)中有所论述。
为了提高检测样品中编码乳房珠蛋白的mRNA的灵敏度，可以使用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)技术来扩增自编码乳房珠蛋白的mRNA转录得到的cDNA。RT/PCR方法在本领域是众所周知的(参见例如Watson和Fleming，同上)。RT/PCR可以如下进行。用例如标准异硫氰酸胍法分离细胞总RNA并逆转录总RNA。逆转录法涉及利用逆转录酶和3’未端引物以RNA为模板合成DNA。通常，引物包含寡聚(dT)序列。然后用PCR和乳房珠蛋白特异性引物扩增由此生成的cDNA(Belyavsky等，《核酸研究》17：2919-2932，1989；Krug和Berger，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，Academic Press，N.Y.第152卷，pp.316-325，1987，在此参考)。
用两段与待扩增DNA节段两侧互补的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应。上游和下游引物一般长20至30碱基对，并与两侧区域杂交以便复制该核苷酸序列。选择与待扩增cDNA链基本互补的引物。所以，引物不一定反映模板的确切序列，但其互补性必须足以选择性地与待扩增链杂交。
在脱氧核苷三磷酸或核苷酸类似物存在下由DNA聚合酶催化聚合反应，自引物生成双链DNA分子。然后用变性方法例如物理法、化学法或酶法来分开双链。一般使用物理变性，即通常将核酸加热至约80℃至105℃，保温约1至10分钟。按要求的循环次数重复该过程。
扩增后，用溴乙锭染色来检测PCR产物(Sambrook等，1989，同上)。
在本发明另一实施方式中，乳房珠蛋白cDNA序列或其衍生物可用来描述乳腺癌患者样品中乳房珠蛋白基因的各种改变(即基因重排、基因扩增或基因缺失)。由此提供了一种方法，没有完整mRNA的患者样品也可以籍此检查基因结构的改变。
在本技术用途之一中，乳房珠蛋白或其衍生物与分离自患者肿瘤、正常组织或淋巴细胞并经一种或多种限制性内切酶消化的基因组DNA杂交。该测定法利用本领域熟知的Southern印迹检测患者或患者的乳房肿瘤是否具有乳房珠蛋白基因的缺失、重排或扩增。检测以上改变可以为预测预后和为患者的治疗方法提供重要信息。
在本技术用途之二中，可使用一对或多对以乳房珠蛋白cDNA序列或其衍生物为基础的寡核苷酸引物在聚合酶链反应中扩增患者样品的乳房珠蛋白基因节段。对生成的PCR产物的分析显示乳房珠蛋白的某一特殊节段是否已缺失或重排。这类信息对预后和患者的治疗是有用的。
检测乳腺癌的其它方法包括检测患者样品中是否存在乳房珠蛋白多肽的前体和/或分泌形式。本领域已知的各种蛋白质检测方法均可使用。这些方法包括但不限于免疫扩散法、免疫电泳法、免疫化学法、配体结合试验、免疫组织化学技术、凝集和补体试验(例如参见《基础及临床免疫》(Basic and Clinical Immunology)Sites和Terr编辑，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.pp.217-262，1991，在此参考)。较好的是配体结合免疫试验，包括令抗体与乳房珠蛋白的一个或多个表位反应，并竞争性替代标记过的乳房珠蛋白或其衍生物。
在此，“乳房珠蛋白多肽”包括天然乳房珠蛋白及其衍生物和片段，其中包括天然乳房珠蛋白的非糖基化和糖基化的前体形式和糖基化分泌形式。天然的意思是肽可以从天然来源(例如正常或病患生物体)中分离得到而且未经人为改变。
乳房珠蛋白衍生物指与天然乳房珠蛋白某部分基本相同的至少10氨基酸节段构成的多肽。基本相同的节段以具有20个氨基酸为佳，至少50个更好，至少75个则最好。两条多肽基本相同即，用BLAST等排序程序进行最佳排序时，两序列具有至少80％序列一致性，至少95％更好，至少99％则最好。较好的是，不相同的残基位置是因保守性氨基酸取代所致。
保守性氨基酸取代指具有类似侧链的残基之间的相互取代。例如，具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷胺酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。较好的保守性氨基酸取代是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷胺酰胺。
衍生的乳房珠蛋白多肽宜与对天然乳房珠蛋白或其片段具有特异性的抗乳房珠蛋白抗体，单克隆抗体或多克隆抗体交叉反应。
在此，“片段”和“肽”指这样的乳房珠蛋白肽，其氨基酸序列与根据全长乳房珠蛋白cDNA(例如SEQ ID NO.1)或其衍生物推定的氨基酸序列相同，但氨基末端和/或羧基末端缺失。通常，乳房珠蛋白片段或肽至少长3个氨基酸。较好的是，乳房珠蛋白片段或肽至少长6个氨基酸残基，至少长12个残基更好，约25个残基还要好，至少50个以上残基则最好。
各种竞争性和非竞争性蛋白质结合免疫试验是本领域熟知的。用于此类试验的抗体可以是非标记的，例如在凝集测试中，或者是多种试验中所用的标记过的抗体。可使用的标记包括用在放射性免疫试验(RIA)、酶法免疫试验例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫试验等中的放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂、酶的底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染料等。
可用任何一种本领域已知的方法产生含B细胞表位的乳房珠蛋白的多克隆或单克隆抗体以用于免疫试验。在此，“B细胞表位”指乳房珠蛋白多肽的抗原决定簇。B细胞表位可以包含3个氨基酸，它们具有该表位独有的空间构象。一个B细胞表位通常具有至少5个这样的氨基酸。检测氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，其中包括例如x光晶体图学和2二维核磁共振。
制备某蛋白质的抗体的方法之一是选择和制备该蛋白质全部或部分的氨基酸序列，化学合成该序列并将其注射入合适动物体内，通常是兔或小鼠。
制备乳房珠蛋白多肽的方法包括但不限于化学合成、重组DNA技术或从生物样品中分离。例如，可以用经典Merrifeld法即固相肽合成法(Merrifeld，《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)85：2149，1963，在此参考)或快速自动多重肽合成系统(DuPont Company，Wilmington，DE)上的FMOC方法(Caprino和Han，《有机化学杂志》(J Org Chem)37：3404，1972，在此参考)来化学合成包含表位的肽。
将抗原注射入膝后淋巴结来免疫兔，然后以两周为间隔腹膜内注射抗原来加强免疫，由此制备多克隆抗体。放出动物的血，以纯化的乳房珠蛋白进行血清分析，一般用ELISA。
单克隆抗体可以按照Milstein和Kohler的方法来制备，即将免疫小鼠的脾细胞与连续复制的肿瘤细胞例如骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞融合(Milstein和Kohler，《自然》(Nature)256：495-497，1975；Gulfre和Milstein，《酶学方法：免疫化学技术》73：1-46，Langone和Banatis编，Academic Press，1981，在此参考)。然后将由此形成的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆，用ELISA或RIA检测上清液中有无抗体产生。
如此制得的乳房珠蛋白的多克隆或单克隆抗体可用来由表达乳房珠蛋白的细胞分离和纯化乳房珠蛋白的前体和分泌形式。例如，如后文所述，产生了一种多克隆抗体，它抗根据乳房珠蛋白cDNA推定的16个C末端氨基酸(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe，SEQ ID NO.14)，它结合乳房珠蛋白的前体和分泌形式，而且结合在体外翻译系统中合成的乳房珠蛋白。可用本领域的常规技术例如亲和性层析，用抗乳房珠蛋白抗体分离乳房珠蛋白。
抗体识别并特异性结合肿瘤细胞表达的靶抗原的独特能力提供了一种治疗癌症的方法(参见LoBuglio和Saleh，Am J Med Sci 304：214-224，1992；Bagshawe，AdvPharmacol 24：99-121，1993)。所以，本发明的另一方面内容提供了预防和治疗动物乳腺癌的方法，其基础是使用在乳腺癌细胞中超量表达的乳房珠蛋白的抗体。
乳房珠蛋白特异性抗体，不论是单克隆还是多克隆的，都可以用本领域的已知技术来制备。例如，可用杂交瘤技术产生鼠或人单克隆抗体。或者，可给予动物乳房珠蛋白，或乳房珠蛋白活性的其衍生物或片段，或抗独特型抗体或其片段，以诱导B细胞产生能识别乳房珠蛋白表达细胞的抗体。
由此产生的抗体或其片段用一种或多种瘤细胞裂解物质例如放射性核素、毒素或细胞毒性药物标记，并给予怀疑患有乳腺癌的患者。标记过的抗体与乳腺癌细胞超量表达的乳房珠蛋白结合，导致癌细胞死亡。
本领域已知的多种瘤细胞裂解性物质中都可以用于产生这样的标记抗体。例如，可以将植物和细菌毒素与抗体偶联来制备免疫毒素。这类毒素包括例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和假单孢菌属外毒素A。还可以制备化学治疗药物与抗体连接的药物-抗体结合物。适合这类用途的化学治疗药物包括例如tomoxifen、阿霉素、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、长春花生物碱和丝裂霉素。此外，可以制备放射性核素与抗体稳定连接的放射性免疫结合物。适用于制备放射性免疫结合物的放射性核素包括例如，β发射体例如131I、188Re、186Re、67Cu、90Y和47Sc；α发射体例如211At、212Bi和212Pb；俄歇电子发射体例如125I和77Br；和可裂变核素例如10B。
相当比例的乳房肿瘤表达乳房珠蛋白，这一发现是本发明另一项内容的基础，这项内容包括用乳房珠蛋白抗原激活乳房珠蛋白特异性B和/或T淋巴细胞(TC)。所以，本发明提供了乳房珠蛋白B细胞抗原和T细胞抗原；包含至少一种乳房珠蛋白B细胞抗原和TC乳房珠蛋白抗原的疫苗，用于诱导抗乳房珠蛋白的抗体和/或细胞介导的免疫应答。还提供了治疗患有乳房珠蛋白超量表达肿瘤的乳腺癌患者的方法。本发明方法之一包括给予患者已激活的乳房珠蛋白特异性淋巴细胞。另一方法包括给予患者乳房珠蛋白特异性疫苗。
在此，“乳房珠蛋白抗原”包括天然乳房珠蛋白多肽及其衍生物和片段，它们包含被乳房珠蛋白特异性B细胞或TC细胞识别的B细胞或TC细胞表位。
乳房珠蛋白B细胞抗原包含乳房珠蛋白特异性B细胞表位和TH细胞表位。“B细胞表位”表示被B细胞上抗乳房珠蛋白的免疫球蛋白受体识别的各种抗原，半抗原，表位或抗原决定簇，而且，它能够在给予动物时在TH细胞协助下诱导产生抗体。B细胞表位包含至少4个氨基酸的氨基酸序列。较好的是，B细胞表位长至少6至25个氨基酸，约15至22个氨基酸更好。B细胞表位所含的氨基酸序列可与天然乳房珠蛋白片段中的连续氨基酸序列相同或基本相同。或者，B细胞表位所含的氨基酸序列与一段不连续氨基酸序列完全或基本相同，该序列代表乳房珠蛋白的组装构型决定簇。
“TH细胞表位”指通过结合MHC II类分子被T辅助细胞识别的各种抗原决定簇。T辅助细胞的激活包括乳房珠蛋白特异性休眠B细胞分化成高亲和性IgG分泌细胞，即诱导继发性抗体应答。含B和TH细胞决定簇的免疫原性肽的制备，以及用它们经T细胞协助产生更高效价的特异性抗体产生B细胞，这些都是本领域已知的，参见Cheronis等，美国专利5,573,916，Denton等，Cancer Letters 70：143-150(1993)，Borras-Cuesta等，Eur.J.Immunol.17，1213-1215(1987)和Good等，Science 235：1059-1062(1987)。TH细胞表位可包含乳房珠蛋白或一种异源蛋白的氨基酸序列。例如，Denton等诱导了对粘蛋白的抗体应答，粘蛋白是分泌性上皮细胞内表达的糖蛋白，它与乳腺癌和其它癌症相关，该应答是用含B细胞决定簇的合成肽接种小鼠来诱导的，所述的决定簇来自MUC-1粘蛋白的核心并与已知T辅助细胞决定簇，流感血凝集素A/X-31的111-120序列连接。TH细胞表位包含约6至20个氨基酸残基，以约8至18个残基为佳，9至15个残基更好。
乳房珠蛋白TC细胞抗原包含TC细胞表位和MHC I类限制位。“TC细胞表位”表示在被抗原提呈细胞表面的MHC I类分子呈递时，被乳房珠蛋白特异性TC细胞识别的各种抗原，表位和抗原决定簇。“MHC I类限制位”指被MHC I分子识别，使得乳房珠蛋白抗原被抗原提呈细胞(APC)表面的MHC I分子呈递给乳房珠蛋白特异性TC细胞的各种氨基酸序列。TC细胞表位和MHC I类限制位包含在约6至11氨基酸的一段氨基酸序列内，它与天然乳房珠蛋白某片段的氨基酸序列相同或基本相同。较好的是，所述序列长8个或9个氨基酸。
鉴定某蛋白抗原的B和TC细胞表位是本领域已知技术。例如，分离的乳房珠蛋白特异性B细胞或乳房珠蛋白特异性TC细胞应答覆盖分泌乳房珠蛋白的重叠性合成肽的能力可用标准免疫生物学技术来测定。被鉴定为具有抗原性的肽然后可每次修改一个或几个氨基酸以优化它们激活乳房珠蛋白特异性B细胞或T细胞的能力。
还可以用市售表位测绘试剂盒来测绘B细胞表位，这包括C末端与聚乙烯多针支持物(例如Cambridge Research Biochemicals)结合的随机肽的筛选。
或者，可以检索推定的乳房珠蛋白氨基酸序列，查找与已知MHC I类或II类结合基序相符的序列。参见，Hill等，Nature 360：434(1992)，Pamer等，Nature360：852(1992)和Hammer等，J.Exp.Med.176：1007(1992)和Falk等，Nature351：290-296(1991)。例如，可被乳房肿瘤特异性CTL识别的抗原性肽可通过检索乳房珠蛋白氨基酸序列内HLA-A2-结合性肽来鉴定，参见Peoples等，Proc.Natl.Acad.Sci.92：432-436(1995)。如果患者表达HLA-A2(约50％的高加索人表达HLA-A2)，则宜选择HLA-A2作为抗原提呈分子。可以合成预测的HLA-A2结合肽，并将合成肽加到T2细胞系上，检测它是否具有抗原性。T2细胞系是T细胞/B细胞融合产物，在抗原提呈上有缺陷，因此可在T2细胞表面的HLA-A2分子上加载外源HLA-A2结合肽(Henderson等，Science 255：1264-1266(1992))。然后进行标准细胞毒试验，即将加载了肽的T2细胞与乳房特异性CTL一起培养，该CTL来自从乳房珠蛋白表达性乳房肿瘤分离得到的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，参见Peoples等，p.432-433和Toso等，Cancer Research 56：16-20(1996)。
含TC细胞表位的抗原性乳房珠蛋白肽还可以用酸洗脱肿瘤细胞表面HLA I类分子呈递的内源肽来鉴定。(参见Peoples等，同上，p.433)。洗脱的肽可用各种本领域已知技术来分离，包括HPLC。将不同的肽流份加给T2细胞，加载后的T2细胞与乳房肿瘤特异性CTL一起培养，用标准免疫生物学技术来确定哪种肽可被CTL识别。
本发明乳房珠蛋白抗原的用途之一是过继性免疫治疗。这种疗法包括用乳房珠蛋白抗原体外激活和扩增乳房珠蛋白表达性肿瘤患者的生产抗乳房珠蛋白抗体的B细胞和/或乳房珠蛋白特异性细胞毒T细胞(CTL)。该方法还可以用包含乳房珠蛋白B细胞和TC细胞抗原的组合物来进行。然后，将被激活的淋巴细胞返还给接受过继性免疫治疗的患者。
本发明的乳房珠蛋白抗原还可用做乳房珠蛋白特异性疫苗的成分。所述疫苗包含免疫原性激发量的乳房珠蛋白抗原。在此，免疫激发量表示抗原的量能够在接受者体内激发所需的应答，以缓解或治疗乳腺癌。这一量可用标准方法凭经验确定，这是本领域众所周知的，无需复杂的实验。
抗原可用在各种疫苗制剂中诱导所需类型免疫应答(例如抗体和/或细胞介导的应答)。此类制剂是本领域所已知的。参见，例如，A.Lanzavecchia，Science260：937-944(1993)和Raychandhuri的美国专利5,585,103。用于激发免疫应答的疫苗制剂的例子包含药学上认可的佐剂，例如铝盐；鲨烯乳液或鲨烯和胞壁酰二肽；脂质体；和包含稳定性除垢剂，胶团形成剂和可生物降解和生物相容性油(Raychandhur，同上)。
乳房珠蛋白特异性疫苗还可以包含带有乳房珠蛋白抗原的运载细胞。较好的是，运载细胞是用自身专职性抗原提呈细胞(APC)(例如巨嗜细胞，树突细胞或激活的B细胞或T细胞)制备的。参见Lanzavecchia，同上，p.937。专职性APC表达配体B7，它结合T细胞上的CD28或CTLA4，传递非抗原特异性共刺激信号即信号2，防止T细胞失能或灭活。因此，疫苗还含有IL-2或其它共刺激信号，以对抗无能诱导(Lauzavecchia，同上，p938)。
另一种乳房珠蛋白特异性疫苗制剂包含一种重组载体，该载体含有编码表达乳房珠蛋白的核苷酸序列。用感染性因子激发细胞毒T淋巴细胞是已知技术(Raychandhur，同上)。已经有了使用牛痘，脊髓灰质炎，腺病毒和逆转录病毒，以及例如李斯特和BCG等细菌的嵌合载体。例如，已知一种金丝雀痘病毒载体，ALVAC，诱导抗所编码的异源基因产物的强烈的细胞免疫应答(Taylor等，Virology 187：321-328(1991))。此外，表达MAGE-1基因编码的MZ2-E人黑素瘤排异抗原的重组ALVAC能够体外激发来自乳房肿瘤表达性MAGE-1 mRNA的TIL细胞群中的MAGE-1 CTL活性。(Toso等，同上)。在另一种方法，Weiner等的美国专利5593972中，编码免疫蛋白目标抗原的重组载体被直接体内(例如给予肌肉细胞)给予患者或体外给予患者的细胞，并辅以协助细胞吸收DNA的药物。
如何配制适合获得所需免疫应答的疫苗，本领域技术人员是不难确定的。例如，欲诱导体内产生抗乳房珠蛋白抗体，乳房珠蛋白特异性疫苗需包含至少一种乳房珠蛋白B细胞抗原，所述抗原包含B细胞表位和TH细胞表位。TH细胞表位最好与疫苗接受者的MHC II类单倍型相匹配。或者，可以使用无所谓HLA型而被人群普遍识别的TH细胞表位，例如破伤风类毒素的“通用”T细胞表位。(Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19：2237(1989))。较好的是，疫苗包含多个乳房珠蛋白B细胞抗原，和被不同HLA型的MHC II类分子识别的TH表位。
乳房珠蛋白特异性疫苗的另一实施例诱导细胞介导的应答，并包含至少一种能够激活乳房珠蛋白特异性TC细胞的乳房珠蛋白TC抗原。较好的是，疫苗包含多个TC细胞抗原。
还可将乳房珠蛋白特异性疫苗配制成既诱导抗体应答又诱导细胞介导的应答。这类实施例包括乳房珠蛋白B细胞和TC细胞抗原两者。
乳房珠蛋白表达性肿瘤患者可通过给予免疫刺激量的本发明乳房珠蛋白特异性疫苗来治疗。可用各种已知的标准技术来给予疫苗。其中包括但不限于静脉内，腹膜内，肌内，皮下或乳房内注射。
在后文实施例部分描述了本发明较好的实施方式。根据在此公开的内容对说明书进行研究或实施本发明后，本发明权利要求范围内的其它实施方式对本领域技术人员来说是显而易见的。应该仅将说明书和实施例看作是说明性的，而本发明的范围和精神则由实施例后的权利要求来限定。
在后文实施例中，细胞系由美国典型培养物保藏中心提供，培养在添加10％胎牛血清的Dulbecco极限必需培养基中。组织活检样品由人类合作组织网(HumanCooperative Tissue Network)(LiVolsi等，《癌症》71：1391-1394，1993，在此参考)提供。
                               实施例1
该实施例说明乳房珠蛋白cDNA的分离。
用标准异氰酸胍法(Belyavsky等，同上)分离细胞系MDA-MB415的细胞总RNA。用Amplifinder试剂盒(Clonetech)并按照制造商的方案将该RNA用于RACEPCR过程。
以标准反应方式合成第一链cDNA，在20μl的反应体积中包含1μg RNA，10μM特异性乳房珠蛋白引物D2R(5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’)(SEQ IDNO：4)，4μl的5×RT缓冲液(250mM TrisCl pH8.3，375mM Kcl，15mM MgCl2)，2μl100mM DTT，1μl 10mM dNTP和200单位SuperscriptTM II逆转录酶(Gibco/BRL)。反应在45℃进行1小时，95℃保温5分钟终止反应。RNA用400μM NaOH在65℃水解30分钟，然后用400μM乙酸中和。
然后在反应中加入3体积6M NaI和10μl处理过的玻璃珠。玻璃珠用80％乙醇洗涤3次，将核酸从玻璃珠上洗脱到45μl水中。然后沉淀核酸，再重悬在10μl水中。用T4 RNA连接酶在27℃反应20小时，将纯化后的第一链cDNA与制造商提供的锚定寡核苷酸(SEQ ID NO：9，5’-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCTGGA ACC TTC AGA GG-3’)连接。取连接反应物的十分之一进行PCR扩增，在50μl反应体积中包含1μM制造商的锚定引物(SEQ ID NO：10，5’-CTG GTT CGGCCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-3’)，1μM乳房珠蛋白特异性引物D2Rb(SEQ ID NO：11，5’-AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C-3’)，200μMdNTP，5单位VentTM DNA聚合酶和1×聚合酶缓冲液(10mM KCl，20mM TrisCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100)。反应在94℃温育2分钟，然后在94℃温育45秒，50℃1分钟，72℃90秒，共40轮循环。
两段下游乳房珠蛋白特异性嵌套寡核苷酸是D2R(SEQ ID NO：4)和D2Rb(SEQID NO：11)。使用的上游乳房珠蛋白特异性调控寡核苷酸也是按照制造商的建议，即D2F(5’-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3’)(SEQ ID NO：12)。全部PCR扩增反应都用VentTM DNA聚合酶(New England Biolabs)进行。扩增后的RACE产物用EcoRI消化，然后连接到质粒载体pGEM7Z(Promega)的EcoRI和SmaI位置。
全部测序都用Taq DNA聚合酶热循环测序试剂盒按照制造商(Promega)的方案进行。所用程序大致如下所述。
用10pmol 32P-γATP(3,000Ci/mmol和10mCi/ml)末端标记10pmol序列特异性寡核苷酸，用T4聚核苷酸激酶在10μl体积中在37℃反应30分钟。在17μl制造商提供的测序缓冲液中进行聚合反应，其中包含100ng质粒模板，1.5pmol标记过的测序引物，和5单位测序级Taq聚合酶。将该反应物均分到一组4支反应试管中，其中含有制造商提供的脱氧核苷酸和双脱氧-A，C，G或T的混合物。将这一组4支试管在95℃温育2分钟，94℃45秒，45℃30秒，然后在72℃1分钟，如此循环30次。反应完全后，在每一试管中加入80％甲酰胺/溴酚蓝染料3μl。样品加热至70℃2分钟，然后上样在6％丙烯酰胺/7.5M脲测序凝胶上，在60W恒压电泳2至4小时。干燥凝胶，然后与Kodak XAR5 X光胶片接触2至24小时。
由此得到的序列是图2中实线表示的403bp片段(SEQ ID NO：5)。在早期的工作中分离了DEST002标记序列(Watson和Fleming，同上)。该序列是图2中空心线所示的206bp片段(SEQ ID NO：6)。将这两段序列的信息合并，推导出了全长503bp的乳房珠蛋白cDNA(图2)。
                             实施例2
该实施例证明乳房珠蛋白的表达限于乳腺肿瘤细胞，在正常乳腺细胞中则较少。
用标准异氰酸胍法分离细胞总RNA样品，并用无RNA酶的DNA酶(Promega)处理。为了进行PT/PCR，用寡聚dT21(SEQ ID NO：13)和Superscript II逆转录酶(Gibco/BRL)按照制造商的程序逆转录1μg所述总RNA。
200ng dT21(SEQ ID NO：13)和1μg总RNA在10μl体积中在65℃温育5分钟。样品在冰上冷却，并在其中加入4μl 5×RT缓冲液(250mM TrisCl pH8.3，375mMKCl，15mM MgCl2)，2μl 10mM DTT，1μl 10mM dNTP和200单位SuperscriptTM II逆转录酶(Gibco/BRL)。反应在45℃进行1小时，然后在95℃温育5分钟终止反应。
每份RT反应物取十分之一进行PCR分析，使用乳房珠蛋白特异性引物D2R(5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’)(SEQ ID NO：4)和d2102(5’-CAGCGG CTT CTT TGA TCC TTG-3’)(SEQ ID NO：3)，在标准反应条件下循环40次：94℃×30秒/55℃×1分钟/72℃×1分钟。
为了进行Northern分析，用全长乳房珠蛋白cDNA探针按照先前所述(Watson和Fleming，同上)分析20μg总RNA。用溴乙锭染色估计每份RNA样品的完整性和均等载量。
如图4A所示，在肿瘤样品2410中(原DEST即由该组织中分离得到)轻易检测到了500bp的乳房珠蛋白信使，在正常人乳房组织中少得多，在无限繁殖的乳腺上皮细胞系B5-589中或人肺、胎盘、子宫和卵巢中则没有(图4A)。在用RT/PCR分析扩增后，在15份受检组织中仍然没有测到乳房珠蛋白的表达(图4B)。在这些反应物中检测到了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)信使(图4B)和EGF受体信使(未显示)，这表明无表达并不是由于RNA的降解或其它次要原因。所以，乳房珠蛋白mRNA的表达具有相对的乳房组织特异性。
                              实施例3
该实施例证明乳房珠蛋白cDNA编码一段可翻译核苷酸序列，该序列可产生具有正确预计分子量的蛋白质产物。使用TNTTM兔网织红细胞翻译试剂盒，用T7 RNA聚合酶(Promega)和35S-甲硫氨酸(＞1000Ci/mmol；10mCi/ml，Amersham)按照制造商的程序进行体外翻译。
在25μl TNTTM兔网织红细胞裂解物中加入2μl制造商制备的反应缓冲液、T7RNA聚合酶、20μM除甲硫氨酸之外氨基酸的混合物、40μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmol和10mCi/ml)、40单位核糖核酸酶抑制剂、1μg乳房珠蛋白/pGEM7质粒和用足量DEPC处理过的水，使得最终反应体积达50μl。该反应混合物在30℃温育60分钟。取5μl该反应混合物转移到20μl SDS凝胶缓冲液中，煮沸2分钟，然后上样在17.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
用乳房珠蛋白cDNA处理的兔网织红细胞产生一种60kD的蛋白质，而不用cDNA处理的则不产生任何蛋白质产物。
                             实施例4
该实施例证明乳房珠蛋白在原发乳腺癌中超量表达的普遍性。
为了确定乳房珠蛋白在乳腺癌中超量表达的频率，我们以乳房珠蛋白cDNA为探针用Northern印迹杂交检查了一组15种不同组织学类型的I期乳腺癌。还用两个患者的同患者正常乳房组织样品进行了比较(图6)。500bp的乳房珠蛋白mRNA被发现存在于正常乳房组织和肿瘤2410和其它3种肿瘤中，其中2种在同患者正常组织中只有极少量的表达或不表达(BO15对BO16；BO22对BO23)(图6)。总之，15种被检肿瘤中4种(27％)超量表达乳房珠蛋白mRNA。
以上数据表明乳房珠蛋白的超量表达并不仅限于一种肿瘤样品，实际上它在原发乳房肿瘤中相当常见。而且，全部被检肿瘤都是I期这一事实表明在乳房肿瘤形成进程中，这种失调发生得相当早。
                              实施例5
以下实施例说明用抗乳房珠蛋白多克隆抗体来检测乳房珠蛋白。
将对应于根据乳房珠蛋白cDNA推导的16个C末端氨基酸(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe，SEQ ID NO：14)的肽与匙孔血蓝蛋白偶联，然后与Freund佐剂一起给兔注射，由此制备抗乳房珠蛋白多克隆抗体。接种后的兔以3周为间隔进行增强免疫，然后在第12周放血，并在乳房肿瘤细胞系MDA-MB-415和MCF-7的无血清条件培养基中测定血清检测乳房珠蛋白的能力。已知MDA-MB-415是超量表达乳房珠蛋白信使的细胞系，而MCF-7是不产生可检知乳房珠蛋白mRNA的细胞系。
培养24小时后收获条件培养基，在还原条件下(即在含二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇的缓冲液中沸煮样品以还原二硫键)在12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上重新分离，然后印迹到Nytran滤膜上，以上述C末端肽的抗体作为该检测中的主抗体，按照标准Western印迹法进行分析。在主抗体结合之后，洗涤印迹，加入次抗体(山羊抗兔)。利用酶联化学发光(ECL Western印迹检测试剂，Amersham，Arlington Heights，IL)显影乳房珠蛋白-抗体复合物。
MDA-MB-415细胞系的条件培养基中，抗乳房珠蛋白多克隆抗体检测到一条表观分子量约21kD的条带(数据未显示)。在MCF-7细胞系的条件培养基中则没有测到这一条带(数据未显示)。所以，与mRNA数据一致，MDA-MB-415细胞分泌乳房珠蛋白而MCF-7细胞不分泌。
分泌到MDA-MB-415细胞系培养基中的乳房珠蛋白的表观分子量高于根据推定氨基酸序列SEQ ID NO.2计算的分子量10.5kDa。因为几乎所有的分泌蛋白都是糖基化的，所以用抗乳房珠蛋白多克隆抗体分析MDA-MB-415细胞的细胞质，看是否能检测到分泌乳房珠蛋白的任何前体形式。
MDA-MB-415细胞在无血清培养基中生长24小时，收集培养基，离心，收集上清液。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤附着细胞，用1X的Laemmli样品缓冲液(2％SDS，10％甘油，100mM DTT，60mM Tris，pH6.8，0.001％溴酚蓝)裂解。裂解混合物煮沸5分钟，然后10,000g离心5分钟以沉淀细胞碎片。将细胞裂解物转移到新的试管内，如下所述进行Western印迹分析。
培养物上清液和细胞裂解物进行还原性(即在含(DTT和BME的缓冲液中沸煮样品)在12％SDS丙烯酰胺凝胶电泳，用标准技术印迹到PVDE膜上。分别在用于产生抗体的竞争性肽存在和不存在的情况下，用C-末端肽的多克隆抗体作为探针检测印迹。
如前所述显影乳房珠蛋白-抗体复合物。参见图7，没有竞争性肽(-)时，条件培养基(S)有一条代表乳房珠蛋白分泌蛋白的21kD条带。细胞裂解物(C)显示一条约14kD的主条带和几条更高分子量的条带，包括一条21kD的。在竞争性肽存在下(+)进行Western印迹分析时，未看到乳房珠蛋白的分泌形式和胞内形式，这说明，这些蛋白包含合成抗体所针对的肽。
只在细胞裂解物中检测到的14kD条带可能代表着乳房珠蛋白的前体形式或未加工形式。因为乳房珠蛋白的推定氨基酸序列SEQ ID NO.2具有相同的N糖基化位点，残基53-55和残基68-70处的Asn-X-Thr，观察到的21kD的分泌形式可能代表着蛋白质的一定程度糖基化形式。
通过在存在和不存在衣霉素时培养MDA-MB-415细胞来检验这一假设，衣霉素是一种抑制真核细胞蛋白N糖基化的药物。两份相同的培养物之一加以1μg/ml衣霉素，两种培养物都培养过夜。如上进行测试和对照培养物培养基和细胞裂解物的制备与Western印迹。
如图8所示，衣霉素处理(+)培养基(S)无法测到分泌的乳房珠蛋白，说明分泌的乳房珠蛋白是糖基化的。出人意料的是，在衣霉素处理的MDA-MB-415细胞裂解物中也没有测到乳房珠蛋白的细胞质形式(14kD)(右泳道)。我们假设衣霉素抑制早期糖基化导致乳房珠蛋白前体形式不稳定而降解，以此解释衣霉素处理细胞的细胞质中为何没有测到14kD蛋白。
在人原发乳房肿瘤样品的细胞裂解物中，乳房珠蛋白C末端肽的多克隆抗体也检测到了乳房珠蛋白的14kD前体形式。如图19所示，乳房珠蛋白的前体形式存在于肿瘤样品BO23中，同患者正常乳房组织样品(BO22)中则没有。有趣的是，表达乳房珠蛋白转录产物的有些肿瘤样品(即087R，014，75A和2410)用Western印迹分析时无法测到乳房珠蛋白。对以上现象的假设之一是，乳房珠蛋白的表达在转录水平和翻译水平上受到差异调控，而这种差异调控是由肿瘤的发展阶段所决定的。
抗乳房珠蛋白多克隆抗体还被用来在增殖期乳腺的乳房分泌物中检测分泌的乳房珠蛋白。在第一和第三个三月期，生育时，以及产后第3、14和21天时，人工收集孕妇的初乳和成熟乳(500μl样品)。用等体积的2X Laemmli缓冲液(4％SDS，20％甘油，200mM DTT，120mM Tris，pH6.8，0.002％溴酚蓝)稀释样品。稀释后的样品煮沸5分钟，然后4℃，10,000g离心5分钟，沉淀出细胞碎片。将变性后的样品转移到新试管内，在进行前述Western印迹分析前保存于-20℃。
如图10所示，抗体在孕期采集的乳房分泌物样品中检测到了21kD的分泌乳房珠蛋白，这一时期的乳房上皮细胞高度增殖。但是，哺乳开始时，即乳房上皮细胞的分化阶段，乳房珠蛋白水平在产后3天明显下降，并在产后14天消失。以上结果说明，分泌的乳房珠蛋白与增殖期的乳房上皮细胞相关，这一发现与在人乳房肿瘤中检测到分泌的乳房珠蛋白是一致的。
用免疫组织化学染色石蜡固定的乳腺癌患者切片，乳房肿瘤细胞也表现出抗体与乳房珠蛋白肽的反应(图11)。免疫组织化学染色即：用乳房珠蛋白肽的抗体作为主抗体，以3，3’二氨基苯四氢氯(DAB)为底物，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体检测乳房珠蛋白-抗体复合物。表达乳房珠蛋白的细胞被染成棕色。
根据以上结果，我们认为乳房珠蛋白是一种分泌蛋白，刚合成的乳房珠蛋白是前体蛋白，翻译后修饰作用，例如N糖基化，在提高了其分泌前表观分子量；乳房珠蛋白前体形式的稳定性取决于N糖基化作用；乳房珠蛋白是由增殖性乳房肿瘤细胞分泌的。乳房珠蛋白检测可以乳房珠蛋白为乳腺癌标记用于癌症诊断，评价乳房肿瘤的恶化，监测自身骨髓/干细胞移植物是否被肿瘤细胞污染，通过抗体介导的复合物进行导向乳房肿瘤细胞的治疗性干扰。纯化和分离的乳房珠蛋白多肽可用于产生抗乳房肿瘤抗体，以及用于开发其他肿瘤特异性免疫疗法。
综上所述，可以看到本发明具有许多优点，而且还获得了其它的优良效果。
由于在本发明范围之内，以上方法和组合物可以有多种修改形式，所以说明书和附图中所有内容都只是说明性的，而不是限定性的。
                          序列表(1)一般信息：
(i)申请人：WASHINGTON UNIVERSITY
(ii)发明名称：乳房珠蛋白，一种乳房特异性乳腺癌分泌蛋白
(iii)序列数目：14
(iv)通信地址：
    (A)收信人：HOWELL & HAFERKAMP，L.C.
    (B)街道：7733 FORSYTH BOULEVARD，SUITE 1400
    (C)城市：ST.LOUIS
    (D)州：MISSOURI
    (E)国家：USA
    (F)邮编：63105-1817
(v)计算机可读形式：
    (A)记录介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patentln Release #1.0，1.25版
(vi)本申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：HENDERSON，MELODIE W.
    (B)登记号：37,848
    (C)参考/案卷号：6029-6443
(ix)通讯信息：
    (A)电话：(314)727-5188
    (B)传真：(314)727-6092(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：503碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：mRNA的cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC            60ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT           120GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT           180GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT           240GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT           300ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG           360GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATTGCTGCAA ACCACACCTT           420CTCTTTCTTA TGTCTTTTTA CTACAAACTA CAAGACAATT GTTGAAACCT GCTATACATG           480TTTATTTTAA TAAATTGATG GCA   503(2)  SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：93氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys1                5                   10                  15Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr
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 50                  5                   60Cys Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe65                   70                  75                  80Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe
             85                  90(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CAGCGGCTTC CTTGATCCTT G                21(2)  SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATAAGAAAGA GAAGGTGTGG              20(2)  SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：403碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA to mRNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC            60ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT           120GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT           180GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT           240GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT           300ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG           360GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATT                             403(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：206碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：mRNA的cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TTTATGCAAT TAATATATGA CAGCAGTCTT TGTGATTTAT TTTAACTTTC TGCAAGACCT            60TTGGCTCACA GAACTGCAGG GTATGGTGAG AAACCAACTA CGGATTGCTG CAAACCACAC           120CTTCTCTTTC TTATGTCTTT TTACTACAAA CTACAAGACA ATTGTTGAAA CCTGCTATAC           180ATGTTTATTT TAATAAATTG ATGGCA                                                206(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：95氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Met Lys Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Val Thr Ile Pro Ile Cys Cys1               5                   10                  15Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Cys Ser Ile Leu Asp Glu Val Ile Arg Gly
        20                  25                  30Thr Ile Asn Ser Thr Val Thr Leu His Asp Tyr Met Lys Leu Val Lys
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            85                  90                  95(2)  SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：91氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Val Thr Leu Ala Leu Cys Cys1               5                   10                  15Ser Ser Ala Ser Ala Glu Ile Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val Ile Glu
        20                  25                  30Thr Leu Leu Met Asp Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu
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50                  55                  60Leu Val Asp Thr Leu Pro Gln Lys Pro Arg Glu Ser Ile Ile Lys Leu65                  70                  75                  80Met Glu Lys Ile Ala Gln Ser Ser Leu Cys Asn
            85                      90(2)  SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：35碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG              35(2)  SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：38碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1O：CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG    38(2)  SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：AATCCGTAGT TGGTTTCTCA CC    22(2)  SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CTTTCTGCAA GACCTTTGGC              20(2)  SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA to mRNA
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T              21(2)  SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：16氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Glu Val Phe Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe1               5                   10                  15
权利要求书
按照条约第19条的修改
1.一种乳房珠蛋白特异性疫苗，它包含免疫原性有效量的至少一种乳房珠蛋白抗原，所述的乳房珠蛋白抗原具有至少6个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
2.根据权利要求1所述的疫苗，所述的乳房珠蛋白抗原位于运载细胞上。
3.根据权利要求1所述的疫苗，它还包含药学上认可的佐剂。
4.根据权利要求1所述的疫苗，它包含乳房珠蛋白B细胞抗原与乳房珠蛋白TC细胞抗原的混合物。
5.一种乳房珠蛋白特异性疫苗，它包含重组载体，该重组载体包含编码乳房珠蛋白B细胞抗原和/或乳房珠蛋白TC细胞抗原表达的核苷酸序列。
6.一种治疗乳房珠蛋白表达性肿瘤患者的方法，它包括给予患者包含免疫原性有效量乳房珠蛋白抗原的乳房珠蛋白特异性疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，所述抗原位于运载细胞上。
8.根据权利要求5所述的方法，其中的疫苗还包含药学上认可的佐剂。
9.根据权利要求5所述的方法，所述的乳房珠蛋白抗原含有的氨基酸序列由重组载体内的核苷酸序列编码表达。
10.一种治疗乳房珠蛋白表达性乳腺肿瘤患者的方法，它包括：
从肿瘤中分离乳房珠蛋白特异性淋巴细胞；
用至少一种乳房珠蛋白抗原激活淋巴细胞；和
将被激活的淋巴细胞返还给患者。
11.一种分离和纯化的多肽，它包含至少一种乳房珠蛋白抗原，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少6个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸，所述的乳房珠蛋白抗原被天然乳房珠蛋白分泌多肽的B细胞和/或Tc细胞识别，所述的分泌多肽是糖基化的，由SEQ ID NO.2的氨基酸20-93构成。
12.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少12个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
13.根据权利要求12所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少25个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
14.根据权利要求13所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是糖基化的，由SEQ ID NO.2的氨基酸20-93构成。
15.根据权利要求13所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是糖基化的，由SEQ ID NO.2构成。
16.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是乳房珠蛋白B细胞抗原，该抗原能体外诱导乳腺癌患者B细胞的激活和扩增。
17.根据权利要求16所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白B细胞抗原包含异源蛋白的TH细胞表位。
18.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是乳房珠蛋白TC细胞抗原，该抗原能体外诱导乳腺癌患者TC细胞的激活和扩增。
19.根据权利要求18所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白TC细胞抗原包含8个或9个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
20.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，它包含乳房珠蛋白B细胞抗原和乳房珠蛋白TC细胞抗原。

Claims (20)

1.一种乳房珠蛋白特异性疫苗，它包含免疫原性有效量的至少一种乳房珠蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗，所述的乳房珠蛋白抗原位于运载细胞上。
3.根据权利要求1所述的疫苗，它还包含药学上认可的佐剂。
4.根据权利要求1所述的疫苗，它包含乳房珠蛋白B细胞抗原与乳房珠蛋白TC细胞抗原的混合物。
5.一种乳房珠蛋白特异性疫苗，它包含重组载体，该重组载体包含编码乳房珠蛋白B细胞抗原和/或乳房珠蛋白TC细胞抗原表达的核苷酸序列。
6.一种治疗乳房珠蛋白表达性肿瘤患者的方法，它包括给予患者包含免疫原性有效量乳房珠蛋白抗原的乳房珠蛋白特异性疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，所述抗原位于运载细胞上。
8.根据权利要求5所述的方法，其中的疫苗还包含药学上认可的佐剂。
9.根据权利要求5所述的方法，所述的乳房珠蛋白抗原含有的氨基酸序列由重组载体内的核苷酸序列编码表达。
10.一种治疗乳房珠蛋白表达性乳腺肿瘤患者的方法，它包括：
从肿瘤中分离乳房珠蛋白特异性淋巴细胞；
用至少一种乳房珠蛋白抗原激活淋巴细胞；和
将被激活的淋巴细胞返还给患者。
11.一种分离和纯化的多肽，它包含至少一种乳房珠蛋白抗原，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少6个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸，所述的乳房珠蛋白抗原被天然乳房珠蛋白分泌多肽的B细胞和/或TC细胞识别，所述的分泌多肽是糖基化的，由SEQ ID NO.2的氨基酸20-93构成。
12.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少12个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
13.根据权利要求12所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原包含至少25个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
14.根据权利要求13所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是糖基化的，由SEQ ID NO.2的氨基酸20-93构成。
15.根据权利要求13所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是糖基化的，由SEQ ID NO.2构成。
16.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是乳房珠蛋白B细胞抗原，该抗原能体外诱导乳腺癌患者B细胞的激活和扩增。
17.根据权利要求16所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白B细胞抗原包含异源蛋白的TH细胞表位。
18.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白抗原是乳房珠蛋白TC细胞抗原，该抗原能体外诱导乳腺癌患者TC细胞的激活和扩增。
19.根据权利要求18所述的分离和纯化的多肽，所述的乳房珠蛋白TC细胞抗原包含8个或9个SEQ ID NO.2中的连续氨基酸。
20.根据权利要求11所述的分离和纯化的多肽，它包含乳房珠蛋白B细胞抗原和乳房珠蛋白TC细胞抗原。
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