ES2281416T3 - Metodos, composiciones y sistemas para la deteccion y monitorizacion del cancer de mama. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia de una célula de cáncer de mama, método que comprende las operaciones de: (a) poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un primer oligonucleótido que se hibrida con un primer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en mamaglobina y lipofilina B; (b) poner dicha muestra biológica en contacto con un segundo oligonucleótido que se hibrida con una segunda secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia polinucleotídica de GABAp (B899P); (c) detectar en dicha muestra biológica una cantidad del oligonucleótido hibridado de las operaciones (a) y (b); y (d) comparar con un valor de corte predeterminado la cantidad de polinucleótido que se hibrida con los oligonucleótidos de las operaciones (a) y (b) y determinar, a partir de dicha comparación, la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
Description
Métodos, composiciones y sistemas para la
detección y monitorización del cáncer de mama.
El presente invento se refiere, en general, al
campo de la diagnosis del cáncer. Más específicamente, el presente
invento se refiere a métodos, composiciones y sistemas para la
detección del cáncer en que se emplean la hibridación y/o
multiplicación de oligonucleótidos para detectar simultáneamente dos
o más polinucleótidos tisularmente específicos en una muestra
biológica de la que se sospecha que contiene células cancerosas.
El cáncer sigue siendo un problema sanitario
significativo en todo el mundo. El fallo de los regímenes
convencionales para el tratamiento del cáncer puede atribuirse
habitualmente, en parte, a un diagnóstico retrasado de la
enfermedad. Aunque se han realizado progresos significativos en el
área del diagnóstico del cáncer, aún existe la necesidad de
metodologías de detección mejoradas que permitan una determinación
precoz, fiable y sensible de la presencia de células
cancerosas.
En los Estados Unidos, el cáncer de mama es el
segundo en mortalidad entre las mujeres, sólo tras el cáncer de
pulmón, afectando a más de 180.000 mujeres cada año y dando lugar a
aproximadamente 40.000-50.000 muertes anuales. Para
las mujeres de América del Norte, la probabilidad de verse afectadas
en su vida por un cáncer de mama es de uno entre ocho.
La gestión de la enfermedad se basa actualmente
en una combinación de un diagnóstico precoz (por medio de
procedimientos rutinarios de exploración de las mamas) y un
tratamiento agresivo, el cual puede incluir uno o más de una
diversidad de tratamientos tales como cirugía, radioterapia,
quimioterapia y terapia hormonal. El curso del tratamiento para un
cáncer de mama particular es a menudo seleccionado basándose en una
diversidad de parámetros de pronóstico, incluyendo el análisis de
marcadores tumorales específicos. Véase, por ejemplo,
Porter-Jordan et al., Breast Cancer
8: 73-100 (1994). Sin embargo, el uso de
marcadores establecidos conduce a menudo a un resultado que es
difícil de interpretar, y la elevada mortalidad observada en los
pacientes con cáncer de mama indica que se necesitan mejoras en el
diagnóstico de la enfermedad.
La reciente introducción, en el tratamiento del
cáncer de mama, de planteamientos inmunoterapéuticos que se dirigen
a Her2/neu ha proporcionado una motivación significativa para
identificar genes específicos de cáncer de mama adicionales como
dianas para anticuerpos terapéuticos y para vacunas contra células
T, así como para el diagnóstico de la enfermedad. Con este fin, se
ha identificado la mamaglobina como uno de los genes más
específicos de mama descubiertos hasta la fecha, expresándose en
aproximadamente el 70-80% de los cánceres de mama.
A causa de su distribución muy tisularmente específica, la detección
de la expresión del gen de la mamaglobina ha sido utilizada para
identificar lesiones micrometastásicas en tejidos de ganglio
linfático y, más recientemente, para detectar células de cáncer de
mama circulantes en la sangre periférica de pacientes con cáncer de
mama y con lesiones primarias y metastásicas conocidas.
La mamaglobina es un producto homólogo de una
uteroglobina de conejo y de la subunidad C3 de la proteína ligante
de esteroides de rata, y es una proteína de bajo peso molecular que
está muy glicosilada [Watson et al., Cancer Res.
56: 860-5 (1996); Watson et al.,
Cancer Res. 59: 3028-3031 (1999);
Watson et al., Oncogene 16:
817-24 (1998)]. Se ha comunicado que la
mamaglobina, por contraste con sus productos homólogos, es
específica de la mama, y se ha descrito su sobreexpresión en
biopsias de tumores de mama (23%) y en tumores de mama primarios y
metastásicos
(\sim 75%), comunicándose la detección de expresión de mRNA de mamaglobina en el 91% de los ganglios linfáticos de los pacientes con cáncer metastásico de mama [Leygue et al., J. Pathol. 189: 28-33 (1999), y Min et al., Cancer Res. 58: 4581-4584 (1998)].
(\sim 75%), comunicándose la detección de expresión de mRNA de mamaglobina en el 91% de los ganglios linfáticos de los pacientes con cáncer metastásico de mama [Leygue et al., J. Pathol. 189: 28-33 (1999), y Min et al., Cancer Res. 58: 4581-4584 (1998)].
Puesto que la expresión del gen de la
mamaglobina no es una característica universal del cáncer de mama,
la detección de este único gen puede resultar insuficiente para
permitir la detección fiable de todos los cánceres de mama. En
consecuencia, lo que se necesita en la técnica es una metodología en
que se emplee la detección de dos o más genes específicos del
cáncer de mama con objeto de mejorar la sensibilidad y la fiabilidad
de la detección de micrometástasis, por ejemplo, en ganglios
linfáticos y médula ósea, y/o para el reconocimiento de células
independientes del anclaje en la circulación periférica.
El presente invento alcanza estos y otros
objetivos relacionados al proporcionar métodos que son útiles para
la identificación de polinucleótidos tisularmente específicos, en
particular polinucleótidos tumoralmente específicos, así como
métodos, composiciones y sistemas para la detección y el control de
células cancerosas en un paciente afectado por la enfermedad.
En un primer aspecto del presente invento, se
proporciona un método para detectar la presencia de una célula de
cáncer de mama, método que comprende las operaciones de:
\newpage
- (a)
- poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un primer oligonucleótido que se hibrida con un primer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en mamaglobina y lipofilina B;
- (b)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un segundo oligonucleótido que se hibrida con una segunda secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia polinucleotídica de GABA\pi (B899P);
- (c)
- detectar en dicha muestra biológica una cantidad del oligonucleótido hibridado de las operaciones (a) y (b); y
- (d)
- comparar con un valor de corte predeterminado la cantidad de polinucleótido que se hibrida con los oligonucleótidos de las operaciones (a) y (b) y determinar, a partir de dicha comparación, la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
Preferiblemente, dicho primer polinucleótido es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76,
o su complemento; y dicho segundo polinucleótido comprende el
polinucleótido expuesto en la ID. SEC. nº 75, o su complemento.
Ventajosamente, el método comprende además:
- (e)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se hibrida con un tercer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7, o su complemento; y
- (f)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un cuarto oligonucleótido que se hibrida con un cuarto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24, o su complemento;
en el que la operación (c)
comprende detectar en dicha muestra biológica una cantidad del
oligonucleótido hibridado de las operaciones (a), (b), (e) y
(f).
Alternativamente, el método comprende
además:
- (e)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se hibrida con un tercer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7, o su complemento;
- (f)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un cuarto oligonucleótido que se hibrida con un cuarto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en el polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 11, o su complemento;
- (g)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un quinto oligonucleótido que se hibrida con un quinto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en las ID. SEC. números 13,15 y 17, o su complemento;
- (h)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un sexto oligonucleótido que se hibrida con un sexto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24, o su complemento;
- (i)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un séptimo oligonucleótido que se hibrida con un séptimo polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 30 o su complemento;
- (j)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un octavo oligonucleótido que se hibrida con un octavo polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 32 o su complemento; y
- (k)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un noveno oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 76 o su complemento;
en el que la operación (c)
comprende detectar en dicha muestra biológica una cantidad del
oligonucleótido hibridado de las operaciones (a), (b), (e), (f),
(g), (h), (i), (j) y
(k).
En un segundo aspecto del presente invento, se
proporciona un método para detectar la presencia de una célula de
cáncer de mama, método que comprende las operaciones de:
- (a)
- poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con una primera pareja de oligonucleótidos, primera pareja que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se hibridan con un primer polinucleótido y con su complemento, respectivamente, y en el que dicho primer polinucleótido comprende mamaglobina o lipofilina B;
- (b)
- poner dicha muestra biológica en contacto con una segunda pareja de oligonucleótidos, segunda pareja que comprende un tercer oligonucleótido y un cuarto oligonucleótidos, en el que dichos oligonucleótidos tercero y cuarto se hibridan con un segundo polinucleótido y con su complemento, respectivamente, y en el que dicho segundo polinucleótido comprende GABA\pi (B899P);
- (c)
- multiplicar dicho primer polinucleótido y dicho segundo polinucleótido; y
- (d)
- detectar dicho primer polinucleótido multiplicado y dicho segundo polinucleótido multiplicado;
en el que la presencia de dicho
primer polinucleótido multiplicado o dicho segundo polinucleótido
multiplicado indica la presencia de una célula de cáncer de mama en
dicho
paciente.
Preferiblemente, dicho primer polinucleótido es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76,
y dicho segundo polinucleótido comprende el polinucleótido expuesto
en la ID. SEC. nº 75. Ventajosamente, el método comprende además
poner dicha muestra biológica en contacto con una tercera pareja de
oligonucleótidos, tercera pareja que comprende un cebador directo y
un cebador inverso que se hibridan con un tercer polinucleótido y su
complemento, respectivamente, tercer polinucleótido que es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7;
en el que la operación (d) comprende además multiplicar dicho
tercer polinucleótido y en el que la operación (e) comprende además
detectar dicho tercer polinucleótido. Más preferiblemente, el
método comprende además poner dicha muestra biológica en contacto
con una cuarta pareja de oligonucleótidos, cuarta pareja que
comprende un cebador directo y un cebador inverso que se hibridan
con un cuarto polinucleótido y su complemento, respectivamente,
cuarto polinucleótido que es seleccionado del grupo que consiste en
los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº
15, ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21,
ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24; en el que la
operación (d) comprende además multiplicar dicho cuarto
polinucleótido y en el que la operación (e) comprende además
detectar dicho cuarto polinucleótido.
Más preferiblemente, dichos oligonucleótidos son
seleccionados del grupo que consiste en los oligonucleótidos
representados en las ID. SEC. números 33-38,
48-51 y 53-62.
Ventajosamente, la operación (e) comprende una
operación seleccionada del grupo que consiste en detectar un
radiomarcador y detectar un fluoróforo.
Preferiblemente, dichos oligonucleótidos son
oligonucleótidos que abarcan intrones.
Ventajosamente, dichos oligonucleótidos que
abarcan intrones son seleccionados del grupo que consiste en los
oligonucleótidos representados en las ID. SEC. números
36-44 y 48-62.
Más preferiblemente, la detección de dicho
polinucleótido primero, segundo, tercero o cuarto multiplicado
comprende poner dicho polinucleótido primero, segundo, tercero o
cuarto multiplicado en contacto con una sonda oligonucleotídica
marcada que se hibrida, bajo condiciones moderadamente rigurosas,
con dicho polinucleótido primero, segundo, tercero o cuarto.
Preferiblemente, dicha sonda oligonucleotídica marcada comprende un
resto detectable seleccionado del grupo que consiste en un
radiomarcador y un fluoróforo.
Preferiblemente, la citada operación de
multiplicación es llevada a cabo mediante una metodología de
multiplicación de polinucleótidos seleccionada del grupo que
consiste en transcripción inversa-reacción en cadena
de la polimerasa (RT-PCR; del inglés,
reverse transcription polymerase chain
reaction), PCR inversa, multiplicación rápida de extremos de
cDNA (RACE; del inglés, rapid amplification of
cDNA ends), reacción en cadena de la ligasa (LCR; del
inglés, ligase chain reaction), replicasa de
Qbeta, multiplicación isotérmica, multiplicación por desplazamiento
de cadenas (SDA; del inglés, strand displacement
amplification), reacción en cadena rodante (RCR; del inglés,
rolling chain reaction), reacción cíclica de
sondas (CPR; del inglés, cyclic probe
reaction), sistemas de multiplicación basados en
transcripción (TAS; del inglés,
transcription-based amplification
systems), multiplicación basada en secuencias de ácido
nucleico (NASBA; del inglés, nucleic acid
sequence based amplification), y replicación
automantenida de secuencias (3SR).
Preferiblemente, los métodos del presente
invento comprenden además una operación de enriquecimiento de dicha
muestra biológica en cuanto a dicha célula cancerosa antes de la
hibridación de dicho(s) cebador(es)
oligonucleotídi-
co(s). Más preferiblemente, dicha operación de enriquecimiento de dicha muestra biológica en cuanto a dicha célula cancerosa es llevada a cabo mediante una metodología seleccionada del grupo que consiste en captura celular y agotamiento celular. Ventajosamente, la captura celular es llevada a cabo por inmunocaptura, inmunocaptura que comprende las operaciones de:
co(s). Más preferiblemente, dicha operación de enriquecimiento de dicha muestra biológica en cuanto a dicha célula cancerosa es llevada a cabo mediante una metodología seleccionada del grupo que consiste en captura celular y agotamiento celular. Ventajosamente, la captura celular es llevada a cabo por inmunocaptura, inmunocaptura que comprende las operaciones de:
- (a)
- hacer que un anticuerpo se adsorba a la superficie de dichas células cancerosas; y
\newpage
- (b)
- separar dichas células cancerosas con anticuerpo adsorbido, del resto de dicha muestra biológica. Preferiblemente, dicho anticuerpo se dirige hacia un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE y TCR\alpha\beta, o es un anticuerpo dirigido hacia un antígeno tumoral de mama.
Más preferiblemente, dicho anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal.
Ventajosamente, el citado anticuerpo está
conjugado con glóbulos magnéticos o está formulado en un complejo
de anticuerpo tetrámero.
Preferiblemente, el agotamiento celular es
llevado a cabo mediante un método que comprende las operaciones
de:
- (a)
- entrecruzar glóbulos rojos y glóbulos blancos; y
- (b)
- fraccionar dichos glóbulos rojos y blancos entrecruzados del resto de dicha muestra biológica.
Ventajosamente, en los métodos del presente
invento, dicha muestra biológica es seleccionada del grupo que
consiste en sangre, suero, ganglio linfático, médula ósea, esputo,
orina y muestra de biopsia tumoral. Preferiblemente, dicha muestra
biológica es seleccionada del grupo que consiste en sangre, un
ganglio linfático y médula ósea. Más preferiblemente, dicho ganglio
linfático es un ganglio linfático centinela.
Más preferiblemente, en los métodos del presente
invento, dicha operación de detección comprende una operación de
fraccionamiento.
En un aspecto más del presente invento, se
proporciona una composición para detectar una célula de cáncer de
mama en una muestra biológica de un paciente, composición que
comprende:
- (a)
- un primer oligonucleótido; y
- (b)
- un segundo oligonucleótido;
en la que dicho primer
oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen una longitud
de al menos 15 nucleótidos y se hibridan específicamente con un
primer polinucleótido o su complemento y con un segundo
polinucleótido o su complemento, respectivamente; en la que dicho
primer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en la
ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76; y en la que dicho
segundo polinucleótido comprende el polinucleótido expuesto en la
ID. SEC. nº
75.
Preferiblemente, la composición comprende además
un tercer y un cuarto oligonucleótidos, tercer y cuarto
oligonucleótidos que se hibridan con un tercer polinucleótido o su
complemento y con un cuarto polinucleótido o su complemento,
respectivamente; en que dicho tercer polinucleótido es seleccionado
del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la
ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7; y en que dicho cuarto
polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15,
ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID.
SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24.
Más preferiblemente, dichos oligonucleótidos son
seleccionados del grupo que consiste en oligonucleótidos como los
descritos en las ID. SEC. números 33-44,
48-62, y 72.
En otro aspecto del presente invento, se
proporciona una composición para detectar una célula de cáncer de
mama en una muestra biológica de un paciente, composición que
comprende:
- (a)
- una primera pareja de oligonucleótidos; y
- (b)
- una segunda pareja de oligonucleótidos;
en que dicha primera pareja de
oligonucleótidos y dicha segunda pareja de oligonucleótidos tienen
una longitud de al menos 10 nucleótidos y se hibridan
específicamente con un primer polinucleótido o su complemento y con
un segundo polinucleótido o su complemento, respectivamente; en que
dicho primer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste
en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76; y en que
dicho segundo polinucleótido comprende el polinucleótido expuesto
en la ID. SEC. nº
75.
Preferiblemente, la composición comprende además
una tercera pareja de oligonucleótidos y una cuarta pareja de
oligonucleótidos, tercera pareja de oligonucleótidos y cuarta pareja
de oligonucleótidos que se hibridan con un tercer polinucleótido o
su complemento y con un cuarto polinucleótido o su complemento,
respectivamente; en que dicho tercer polinucleótido es seleccionado
del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la
ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7; y en que dicho cuarto
polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15,
ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID.
SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24.
Ventajosamente, dichos oligonucleótidos son
seleccionados del grupo que consiste en oligonucleótidos como los
descritos en las ID. SEC. números 33-44,
48-62, y 72.
También se proporciona un sistema para la
detección del cáncer de mama, que incluye las composiciones del
presente invento.
La descripción presente proporciona métodos para
identificar uno o más polinucleótidos tisularmente específicos,
métodos que comprenden las operaciones de: (a) llevar a cabo una
sustracción genética para identificar una colección de
polinucleótidos procedentes de un tejido de interés; (b) llevar a
cabo un análisis, mediante micromatrices de DNA, para identificar
un primer subconjunto de dicha colección de polinucleótidos de
interés, en que cada miembro polinucleotídico de dicho primer
subconjunto está sobreexpresado al menos al doble en dicho tejido
de interés en comparación con un tejido testigo; y (c) llevar a cabo
un análisis cuantitativo, por reacción en cadena de la polimerasa,
sobre polinucleótidos de dicho primer subconjunto para identificar
un segundo subconjunto de polinucleótidos que están sobreexpresados
al menos al doble en comparación con el tejido testigo. Las
sustracciones genéticas preferidas son seleccionadas del grupo que
consiste en representación diferencial y sustracción de cDNA y son
descritas con mayor detalle más adelante.
La descripción presente proporciona métodos para
identificar un subconjunto de polinucleótidos que muestran perfiles
de expresión tisularmente específicos concordantes y/o
complementarios en un tejido de interés. Dichos métodos comprenden
las operaciones de: (a) llevar a cabo un análisis de expresión
seleccionado del grupo que consiste en micromatriz de DNA y PCR
cuantitativa, para identificar un primer polinucleótido que está
sobreexpresado al menos al doble en un tejido de interés en
comparación con un tejido testigo; y (b) llevar a cabo un análisis
de expresión seleccionado del grupo que consiste en micromatriz de
DNA y PCR cuantitativa, para identificar un primer polinucleótido
que está sobreexpresado al menos al doble en un tejido de interés en
comparación con un tejido tes-
tigo.
tigo.
Otras realizaciones de la presente descripción
proporcionan métodos para detectar la presencia de una célula
cancerosa en un paciente. Dichos métodos comprenden las operaciones
de: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) poner la
muestra biológica en contacto con una primera pareja de
oligonucleótidos cuyos miembros se hibridan, bajo condiciones
moderadamente rigurosas, con un primer polinucleótido y su
complemento, respectivamente; (c) poner la muestra biológica en
contacto con una segunda pareja de oligonucleótidos cuyos miembros
se hibridan, bajo condiciones moderadamente rigurosas, con un
segundo polinucleótido y su complemento, respectivamente; primer
polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que no está
relacionada con la del segundo polinucleótido; (d) multiplicar el
primer polinucleótido y el segundo polinucleótido; y (e) detectar
el primer polinucleótido multiplicado y el segundo polinucleótido
multiplicado; en los que la presencia del primer polinucleótido
multiplicado o del segundo polinucleótido multiplicado indica la
presencia de una célula cancerosa en el paciente.
En alguna realizaciones, la detección de los
polinucleótidos primero y/o segundo multiplicados puede ir precedida
de una operación de fraccionamiento tal como, por ejemplo, una
electroforesis en gel. Alternativa o adicionalmente, la detección
de los polinucleótidos primero y/o segundo multiplicados puede ser
llevada a cabo mediante la hibridación de una sonda
oligonucleotídica marcada que se hibrida específicamente, bajo
condiciones moderadamente rigurosas, con el polinucleótido primero
o segundo. La marcación de oligonucleótidos puede ser llevada a cabo
al incorporar un nucleótido radiomarcado o al incorporar un
marcador fluorescente.
En ciertas realizaciones preferidas, la muestra
biológica puede ser enriquecida en células de un tipo tisular
específico antes de las operaciones de detección. El enriquecimiento
puede ser llevado a cabo mediante una metodología seleccionada del
grupo que consiste en captura celular y agotamiento celular. Los
métodos de captura celular ejemplares incluyen la inmunocaptura y
comprenden las operaciones de: (a) hacer que un anticuerpo se
adsorba a la superficie de células tisularmente específicas de dicha
muestra biológica; y (b) separar las células tisularmente
específicas con anticuerpo adsorbido, del resto de la muestra
biológica. Se puede llevar a cabo un agotamiento celular ejemplar
mediante el entrecruzamiento de glóbulos rojos y glóbulos blancos,
seguido de una subsiguiente operación de fraccionamiento para
separar las células entrecruzadas.
Realizaciones alternativas de la presente
descripción proporcionan métodos para determinar la presencia o
ausencia de un cáncer en un paciente, que comprenden las operaciones
de: (a) poner una muestra biológica, obtenida del paciente, en
contacto con un oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
que codifica una proteína de tumor de mama; (b) detectar en la
muestra un nivel de un polinucleótido (tal como, por ejemplo, mRNA)
que se hibrida con el oligonucleótido; y (c) comparar con un valor
de corte predeterminado el nivel de polinucleótido que se hibrida
con el oligonucleótido y determinar, a partir de la comparación, la
presencia o ausencia de un cáncer en el paciente. En ciertas
realizaciones, la cantidad de mRNA es detectada mediante una
reacción en cadena de la polimerasa utilizando, por ejemplo, al
menos un cebador oligonucleotídico que se hibrida con un
polinucleótido que codifica un polipéptido como el anteriormente
indicado, o con un complemento de dicho polinucleótido. En otra
realizaciones, la cantidad de mRNA es detectada utilizando una
técnica de hibridación, empleando una sonda oligonucleotídica que
se hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido como
el anteriormente indicado, o con un complemento de dicho
polinucleótido.
En aspectos relacionados, se describen métodos
para controlar el progreso de un cáncer en un paciente, que
comprenden las operaciones de: (a) poner una muestra biológica,
obtenida de un paciente, en contacto con un oligonucleótido que se
hibrida con un polinucleótido que codifica una proteína de tumor de
mama; (b) detectar en la muestra una cantidad de un polinucleótido
que se hibrida con el oligonucleótido; (c) repetir las operaciones
(a) y (b) usando una muestra biológica obtenida del paciente en un
momento posterior; y (d) comparar la cantidad del polinucleótido
detectado en la operación (c) con la cantidad detectada en la
operación (b) y controlar, a partir de la comparación, el progreso
del cáncer en el paciente.
Ciertas realizaciones de la presente descripción
prevén que la operación de multiplicación de dicho primer
polinucleótido y dicho segundo polinucleótido se lleve a cabo
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En ciertas realizaciones, la célula cancerosa
que se va a detectar puede ser seleccionada del grupo que consiste
en cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, linfoma,
leucemia, melanoma, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de
riñón, cáncer de vejiga, cáncer pancreático y cáncer endometrial.
Aún otra realizaciones del presente invento prevén que la muestra
biológica sea seleccionada del grupo que consiste en sangre, un
ganglio linfático y médula ósea. El ganglio linfático puede ser un
ganglio linfático centinela.
En realizaciones específicas de la presente
descripción, se prevé que el primer polinucleótido sea seleccionado
del grupo que consiste en mamaglobina, lipofilina B, GABA\pi
(B899P), B726P, B511S, B533S, B305D y B311D. En otras realizaciones
se prevé que el segundo polinucleótido sea seleccionado del grupo
que consiste en mamaglobina, lipofilina B, GABA\pi (B899P),
B726P, B511S, B533S, B305D y B311D.
Realizaciones alternativas del presente invento
proporcionan métodos para detectar la presencia o ausencia de un
cáncer en un paciente, que comprenden las operaciones de: (a) poner
una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un
primer oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
seleccionado del grupo que consiste en mamaglobina y lipofilina B;
(b) poner la muestra biológica en contacto con un segundo
oligonucleótido que se hibrida con una secuencia polinucleotídica
seleccionada del grupo que consiste en GABA\pi (B899P); (c)
detectar en la muestra una cantidad de un polinucleótido que se
hibrida con al menos uno de los oligonucleótidos; y (d) comparar
con un valor de corte predeterminado la cantidad de polinucleótido
que se hibrida con el oligonucleótido y determinar, a partir de la
comparación, la presencia o ausencia de un cáncer en el
paciente.
De acuerdo con ciertas realizaciones, los
oligonucleótidos pueden ser seleccionados entre los aquí descritos,
tales como los presentados en las ID. SEC. números
33-72. En otra realizaciones, la cantidad de
polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido es determinada
utilizando una reacción en cadena de la polimerasa.
Alternativamente, la cantidad de polinucleótido que se hibrida con
el oligonucleótido puede ser determinada utilizando un ensayo de
hibridación.
Aún otra realizaciones del presente invento
proporcionan métodos para determinar la presencia o ausencia de una
célula cancerosa en un paciente, que comprenden las operaciones de:
(a) poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en
contacto con un primer oligonucleótido que se hibrida con un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 73 e ID. SEC. nº 74,
o su complemento; (b) poner la muestra biológica en contacto con un
segundo oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
representado en la ID. SEC. nº 75 o su complemento; (c) poner la
muestra biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se
hibrida con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en
los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº
3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7, o su complemento;
(d) poner la muestra biológica en contacto con un cuarto
oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido seleccionado
del grupo que consiste en el polinucleótido representado en la ID.
SEC. nº 11 o su complemento; (e) poner la muestra biológica en
contacto con un quinto oligonucleótido que se hibrida con un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en las ID. SEC. números 13, 15 y 17,
o su complemento; (f) poner la muestra biológica en contacto con un
sexto oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21,
ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24, o su complemento;
(g) poner la muestra biológica en contacto con un séptimo
oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido representado
en la ID. SEC. nº 30 o su complemento; (h) poner la muestra
biológica en contacto con un octavo oligonucleótido que se hibrida
con un polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 32 o su
complemento; (i) poner la muestra biológica en contacto con un
noveno oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
representado en la ID. SEC. nº 76 o su complemento; (j) detectar en
la muestra un oligonucleótido hibridado de cualquiera de las
operaciones (a) a (i); y (j) comparar con un valor de corte
predeterminado la cantidad de polinucleótido que se hibrida con el
oligonucleótido, en que la presencia de un oligonucleótido hibridado
en cualquiera de las operaciones (a) a (i) en una cantidad superior
al valor de corte predeterminado indica la presencia de una célula
cancerosa en la muestra biológica de dicho paciente.
Otras realizaciones relacionadas del presente
invento proporcionan métodos para determinar la presencia o
ausencia de una célula cancerosa en un paciente, que comprenden las
operaciones de: (a) poner una muestra biológica, obtenida de un
paciente, en contacto con un primer oligonucleótido y un segundo
oligonucleótido, en que dichos oligonucleótidos primero y segundo
se hibridan bajo condiciones moderadamente rigurosas con unos
polinucleótidos primero y segundo seleccionados del grupo que
consiste en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº 75, ID.
SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº
7, ID. SEC. nº 11, ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23, ID. SEC. nº 24, ID. SEC. nº 30, ID. SEC. nº 32 e ID.
SEC. nº 76, y en que dicho primer polinucleótido no está
estructuralmente relacionado con dicho segundo polinucleótido; (b)
detectar en la muestra dichos oligonucleótidos primero y segundo
híbridados; y (c) comparar con un valor de corte predeterminado la
cantidad de polinucleótido que se hibrida con el oligonucleótido, en
que la presencia de un primer oligonucleótido hibridado o un
segundo oligonucleótido hibridado en una cantidad superior al valor
de corte predeterminado indica la presencia de una célula cancerosa
en la muestra biológica de dicho paciente.
Otras realizaciones relacionadas de la
descripción presente proporcionan métodos para determinar la
presencia o ausencia de una célula cancerosa en un paciente, que
comprenden las operaciones de: (a) poner una muestra biológica,
obtenida de un paciente, en contacto con un primer oligonucleótido y
un segundo oligonucleótido, en que dichos oligonucleótidos primero
y segundo se hibridan bajo condiciones moderadamente rigurosas con
unos polinucleótidos primero y segundo que son dos polinucleótidos
tisularmente específicos del cáncer que se va a detectar, y en que
dicho primer polinucleótido no está estructuralmente relacionado con
dicho segundo polinucleótido; (b) detectar en la muestra dichos
oligonucleótidos primero y segundo híbridados; y (c) comparar con
un valor de corte predeterminado la cantidad de polinucleótido que
se hibrida con el oligonucleótido, en que la presencia de un primer
oligonucleótido hibridado o un segundo oligonucleótido hibridado en
una cantidad superior al valor de corte predeterminado indica la
presencia de una célula cancerosa en la muestra biológica de dicho
paciente.
En otros aspectos relacionados, el presente
invento proporciona además composiciones útiles en los métodos aquí
descritos. Las composiciones ejemplares comprenden dos o más pares
de cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales se hibrida
específicamente con un polinucleótido distinto. Los cebadores
oligonucleotídicos ejemplares adecuados para las composiciones del
presente invento son aquí descritos mediante las ID. SEC. números
33-71. Los polinucleótidos ejemplares adecuados para
las composiciones del presente invento se describen en la ID. SEC.
nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº 75, ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3,
ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 11, ID.
SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC.
nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23, ID. SEC. nº
24, ID. SEC. nº 30, ID. SEC. nº 32 e ID. SEC nº 76.
El presente invento también proporciona sistemas
que son adecuados para llevar a cabo los métodos de detección del
presente invento. Los sistemas ejemplares comprenden pares de
cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales se hibrida
específicamente con un polinucleótido distinto. En ciertas
realizaciones, los sistemas acordes con el presente invento pueden
también comprender una ácido nucleico polimerasa y un tampón
adecuado. Los cebadores oligonucleotídicos ejemplares adecuados
para los sistemas del presente invento se describen aquí mediante
las ID. SEC. números 33-71. Los polinucleótidos
ejemplares adecuados para los sistemas del presente invento se
describen en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº 75, ID.
SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº
7, ID. SEC. nº 11, ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23, ID. SEC. nº 24, ID. SEC. nº 30, ID. SEC. nº 32 e ID.
SEC nº 76.
Estos y otros aspectos del presente invento se
harán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada
y los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra los perfiles de expresión
de mRNA para B311D, B533S y B726P, según se determinan usando una
PCR cuantitativa (Taqman™). Abreviaturas: B.T. ("Breast
Tumor"): tumor de mama; B.M. ("Bone Marrow"): médula ósea;
B.R. ("Breast Reduction"): reducción de mama.
La Figura 2 muestra la relación de la expresión
de B533S con la fase patológica del tumor. Se analizaron, mediante
PCR en tiempo real, tejidos de mama normal (8), trastornos benignos
de mama (3), y fase I (5), fase II (6), fase III (7), fase IV (3) y
metástasis (1 ganglio linfático y 3 efusiones pleurales) de tumores
de mama. Los datos se expresan como copias medias/ng de
\beta-actina para cada grupo analizado, y la línea
es la línea de tendencia calculada.
Las Figuras 3A y 3B muestran la complementación
génica de B305D (forma C), B726P, GABA\pi y mamaglobina en
metastásis y tumores primarios, respectivamente. Los cortes para
cada uno de los genes fueron 6,57, 1,65, 4,58 y 3,56 copias/ng de
\beta-actina basándose en la media de los tejidos
normales negativos más 3 desviaciones estándares.
La Figura 4 muestra la secuencia de cDNA de
longitud completa para la mamaglobina.
La Figura 5 muestra la determinada secuencia de
cDNA del marco de lectura abierto que codifica un polipéptido
recombinante de mamaglobina expresado en E. coli.
La Figura 6 muestra la secuencia de cDNA de
longitud completa para GABA\pi.
La Figura 7 muestra los niveles de expresión de
mRNA para mamaglobina, GABA\pi, B305D (forma C) y B726P en
muestras normales y de tumor de mama, determinados usando una PCR en
tiempo real y el sistema de detección SYBR. Abreviaturas: BT: tumor
de mama; BR: reducción de mama; A. PBMC ("Activated peripheral
blood mononuclear cells"): células mononucleares de sangre
periférica activadas; R. PBMC: PBMC en reposo; T. Gland ("thyroid
gland"): glándula tiroides; S. Cord ("spinal cord"): médula
espinal; A. Gland ("adrenal gland"): glándula suprarrenal; B.
Marrow: médula ósea; S. Muscle ("skeletal muscle"): músculo
esquelético.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra
una comparación entre los ensayos múltiples para lípofilina B sola
y para lipofilina
B-B899P-B305D-C-B726P,
realizados sobre un grupo de muestras de tumor de mama.
Abreviaturas: BT: tumor de mama; BR: reducción de mama; SCID
("severe combined immunodeficiency"): inmunodeficiencia
combinada grave.
La Figura 9 es un gel que muestra la longitud de
banda única de cuatro productos de multiplicación de genes
tumorales de interés (mamaglobina, B305D, B899P, B726P), analizada
mediante un ensayo de PCR múltiple en tiempo real.
La Figura 10 muestra una comparación de un
ensayo múltiple en que se usan cebadores que abarcan zonas límite
intrón-exón (grupo inferior) y en que se usan
cebadores no optimizados (grupo superior), para detectar células de
cáncer de mama en un grupo de tejidos de ganglio linfático.
La ID. SEC. nº 1 es la determinada secuencia de
cDNA para una primera variante de corte y empalme de la isoforma A
de B305D.
La ID. SEC. nº 2 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 1.
La ID. SEC. nº 3 es la determinada secuencia de
cDNA para una segunda variante de corte y empalme de la isoforma A
de B305D.
La ID. SEC. nº 4 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 3.
Las ID. SEC. números 5-7 son las
determinadas secuencias de cDNA para tres variantes de corte y
empalme de la isoforma C de B305D.
Las ID. SEC. números 8-10 son
las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ID.
SEC. números 5-7, respectivamente.
La ID. SEC. nº 11 es la determinada secuencia de
cDNA para B311D.
La ID. SEC. nº 12 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 11.
La ID. SEC. nº 13 es la determinada secuencia de
cDNA de una primera variante de corte y empalme de B726P.
La ID. SEC. nº 14 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 13.
La ID. SEC. nº 15 es la determinada secuencia de
cDNA de una segunda variante de corte y empalme de B726P.
La ID. SEC. nº 16 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 15.
La ID. SEC. nº 17 es la determinada secuencia de
cDNA de una tercera variante de corte y empalme de B726P.
La ID. SEC. nº 18 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 17.
Las ID. SEC. números 19-24 son
las determinadas secuencias de cDNA de otras variantes de corte y
empalme de B726P.
Las ID. SEC. números 25-29 son
las secuencias de aminoácidos codificadas por las ID. SEC. números
19-24, respectivamente.
La ID. SEC. nº 30 es la determinada secuencia de
cDNA para B511S.
La ID. SEC. nº 31 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la ID. SEC. nº 30.
La ID. SEC. nº 32 es la determinada secuencia de
cDNA para B533S.
La ID. SEC. nº 33 es la secuencia de DNA del
cebador directo de lipofilina B.
La ID. SEC. nº 34 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de lipofilina B.
La ID. SEC. nº 35 es la secuencia de DNA de la
sonda para lipofilina B.
La ID. SEC. nº 36 es la secuencia de DNA del
cebador directo de GABA (B899P).
La ID. SEC. nº 37 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de GABA (B899P).
La ID. SEC. nº 38 es la secuencia de DNA de la
sonda para GABA (B899P).
La ID. SEC. nº 39 es la secuencia de DNA del
cebador directo de B305D (forma C).
La ID. SEC. nº 40 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de B305D (forma C).
La ID. SEC. nº 41 es la secuencia de DNA de la
sonda para B305D (forma C).
La ID. SEC. nº 42 es la secuencia de DNA del
cebador directo de B726P.
La ID. SEC. nº 43 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de B726P.
La ID. SEC. nº 44 es la secuencia de DNA de la
sonda para B726P.
La ID. SEC. nº 45 es la secuencia de DNA del
cebador directo de actina.
La ID. SEC. nº 46 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de actina.
La ID. SEC. nº 47 es la secuencia de DNA de la
sonda para actina.
La ID. SEC. nº 48 es la secuencia de DNA del
cebador directo de mamaglobina.
La ID. SEC. nº 49 es la secuencia de DNA del
cebador inverso de mamaglobina.
La ID. SEC. nº 50 es la secuencia de DNA de la
sonda para mamaglobina.
La ID. SEC. nº 51 es la secuencia de DNA de un
segundo cebador inverso de GABA (B899P).
La ID. SEC. nº 52 es la secuencia de DNA de un
segundo cebador directo de B726P.
La ID. SEC. nº 53 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de GABA B899P-INT.
La ID. SEC. nº 54 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de GABA B899P-INT.
La ID. SEC. nº 55 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para GABA B899P-INT.
La ID. SEC. nº 56 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de B305D-INT.
La ID. SEC. nº 57 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de B305D-INT.
La ID. SEC. nº 58 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para B305D-INT.
La ID. SEC. nº 59 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de B726-INT.
La ID. SEC. nº 60 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de B726-INT.
La ID. SEC. nº 61 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para B726-INT.
La ID. SEC. nº 62 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para GABA B899P.
La ID. SEC. nº 63 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de B311D.
La ID. SEC. nº 64 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de B311D.
La ID. SEC. nº 65 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para B311D.
La ID. SEC. nº 66 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de B533S.
La ID. SEC. nº 67 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de B533S.
La ID. SEC. nº 68 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para B533S.
La ID. SEC. nº 69 es la secuencia de DNA de un
cebador directo de B511S.
La ID. SEC. nº 70 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de B511S.
La ID. SEC. nº 71 es la secuencia de DNA de una
sonda Taqman para B511S.
La ID. SEC. nº 72 es la secuencia de DNA de un
cebador inverso de GABA\pi.
La ID. SEC. nº 73 es la secuencia de cDNA de
longitud completa para mamaglobina.
La ID. SEC. nº 74 es la determinada secuencia de
cDNA del marco de lectura abierto que codifica un polipéptido
recombinante de mamaglobina expresado en E. coli.
La ID. SEC. nº 75 es la secuencia de cDNA de
longitud completa para GABA\pi.
La ID. SEC. nº 76 es la secuencia de cDNA de
longitud completa para lipofilina B.
La ID. SEC. nº 77 es la secuencia de aminoácidos
codificada por la secuencia de ID. SEC. nº 76.
Como se indicó anteriormente, el presente
invento se dirige, en general, a métodos que son adecuados para la
identificación de polinucleótidos tisularmente específicos, así como
a métodos, composiciones y sistemas que son adecuados para el
diagnóstico y el control del cáncer de mama.
Ciertas realizaciones del presente invento
proporcionan métodos, composiciones y sistemas para la detección de
una célula de cáncer de mama en una muestra biológica. Estos métodos
comprenden la operación de detectar uno o más polinucleótidos
tisularmente específicos en una muestra biológica de un paciente, la
sobreexpresión de los cuales indica la presencia de una célula
cancerosa en la muestra biológica del paciente. En consecuencia, el
presente invento también proporciona métodos que son adecuados para
la identificación de polinucleótidos tisularmente específicos. Con
las frases "polinucleótidos tisularmente específicos" y
"polinucleótidos tumoralmente específicos", como se usan aquí,
se quieren incluir todos los polinucleótidos que están
sobreexpresados al menos al doble en comparación con uno o más
tejidos testigo. Como se discute más adelante con mayor detalle, la
sobreexpresión de un polinucleótido dado puede ser evaluada, por
ejemplo, mediante metodologías de micromatriz y/o de reacción
cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real
(Real-time PCR™).
Los métodos ejemplares para detectar
polinucleótidos tisularmente específicos pueden comprender las
operaciones de: (a) llevar a cabo una sustracción genética para
identificar una colección de polinucleótidos procedentes de un
tejido de interés; (b) llevar a cabo un análisis, mediante
micromatrices de DNA, para identificar un primer subconjunto de
dicha colección de polinucleótidos de interés, en que cada miembro
polinucleotídico de dicho primer subconjunto está sobreexpresado al
menos al doble en dicho tejido de interés en comparación con un
tejido testigo; y (c) llevar a cabo un análisis, por reacción
cuantitativa en cadena de la polimerasa, sobre polinucleótidos de
dicho primer subconjunto para identificar un segundo subconjunto de
polinucleótidos que están sobreexpresados al menos al doble en
comparación con dicho tejido testigo.
Como se usa aquí, el término
"polinucleótido" se refiere generalmente a moléculas de DNA o
RNA. Los polinucleótidos pueden ser polinucleótidos presentes en la
naturaleza, como los hallados normalmente en una muestra biológica
tal como sangre, suero, ganglio linfático, médula ósea, esputo,
orina y muestras de biopsias tumorales. Alternativamente, los
polinucleótidos pueden ser obtenidos sintéticamente mediante, por
ejemplo, una reacción de polimerización de ácido nucleico. Como
será reconocido por el técnico experto, los polinucleótidos pueden
ser de cadena sencilla (codificantes o antisentido) o de doble
cadena, y pueden ser moléculas de DNA (genómico, cDNA o sintético)
o de RNA. Las moléculas de RNA incluyen moléculas de HnRNA, que
contienen intrones y corresponden a una molécula de DNA en un modo
uno a uno, y moléculas de mRNA, que no contienen intrones. Pueden
estar presentes, aunque no es necesario, secuencias codificantes o
no codificantes adicionales en un polinucleótido del presente
invento, y un polinucleótido puede estar unido, aunque no es
necesario, a otras moléculas y/o materiales de
soporte.
soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una
secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica una
proteína tumoral, tal como una proteína de tumor de mama, o una
porción de la misma) o pueden comprender una variante, o un
equivalente biológico o antigénico funcional de dicha secuencia. Las
variantes polinucleotídicas pueden contener una o más
sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones, como se
describe más adelante. El término "variantes" también abarca
genes homólogos de origen xenogénico.
Cuando se comparan secuencias polinucleotídicas
o polipeptídicas, se dice que dos secuencias son "idénticas"
si las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de las dos secuencias
son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia, como
se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias son
llevadas típicamente a cabo comparando las secuencias sobre una
ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales
con similitud de secuencia. Como se usa aquí, una "ventana de
comparación" se refiere a un segmento de al menos
aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a
aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en la que una
secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del
mismo número de posiciones contiguas una vez que las dos secuencias
están óptimamente alineadas.
La alineación óptima de secuencias para
comparación puede ser llevada a cabo utilizando el programa Megalign
de la serie Lasergene de software para bioinformática (DNASTAR,
Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.), usando los parámetros
predeterminados. Este programa incluye varios esquemas de alineación
descritos en las referencias siguientes: M. O. Dayhoff (1978), "A
model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting
distant relationships", en Atlas of Protein Sequence and
Structure, compilado por M. O. Dayhoff, National Biomedical
Research Foundation, Washington, Distrito de Columbia, EE.UU.,
Volumen 5, Suplemento 3, páginas 345-358; J. Hein
(1990), "Unified Approach to Alignment and Phylogenes", páginas
626-645, Methods in Enzymology, Volumen 183,
Academic Press, Inc., San Diego, California, EE.UU.; D. G. Higgins y
P. M. Sharp (1989), CABIOS 5: 151-153; E. W.
Myers y W. Muller (1988), CABIOS 4: 11-17; E.
D. Robinson (1971), Comb. Theor. 11: 105; N. Santou y M. Nes
(1987), Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; P. H. A.
Sneath y R. R. Sokal (1973), Numerical Taxonomy - The Principles
and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San
Francisco, California, EE.UU.; W. J. Wilbur y D. J. Lipman (1983),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730.
Alternativamente, la alineación óptima de
secuencias para comparación puede ser llevada a cabo mediante el
algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981), Add APL.
Math, 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de
identidades de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:
443, mediante la búsqueda de métodos de similitudes de Pearson y
Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante
aplicaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST,
FASTA y TFASTA del Winconsin Genetics Software Package, Genetics
Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
EE.UU.), o mediante inspección.
Un ejemplo preferido de los algoritmos que son
adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias
y de similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0,
que son descritos por Altschul et al. (1977), Nucl. Acids
Res. 25: 3389-3402, y Altschul et al.
(1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410,
respectivamente. Se pueden utilizar BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo,
con los parámetros aquí descritos, para determinar el porcentaje de
identidad de secuencias para los polinucleótidos y polipéptidos del
invento. El software para llevar a cabo análisis BLAST está
públicamente disponible a través del National Center for
Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, pueden
calcularse puntuaciones acumuladas usando, para secuencias
nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un
par de restos equivalentes; siempre > 0) y N (puntuación de
penalización para restos no equivalentes; siempre < 0). Para
secuencias de aminoácidos, se puede usar una matriz de puntuación
para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos
de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de
alineación acumulada baja de su máximo valor alcanzado en la
cantidad X; la puntuación acumulada llega a cero o menos a causa de
la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación
negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los
parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad
y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias
nucleotídicas) utiliza como parámetros predeterminados una longitud
de palabra (W) de 11 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de
puntuación BLOSUM62 [véase Henikoff y Henikoff (1989), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915] usa alineaciones (B) de 50,
expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas
cadenas.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad
de secuencias" es determinado comparando dos secuencias
óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos
20 posiciones, en que la porción de la secuencia polinucleotídica o
polipeptídica de la ventana de comparación puede comprender
adiciones o supresiones (es decir, huecos) de 20 por ciento o
menos, normalmente de 5 a 15 por ciento, o de 10 a 12 por ciento, en
comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden
adiciones ni supresiones) para una alineación óptima de las dos
secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de
posiciones en que se presentan bases de ácido nucleico idénticas o
restos de aminoácido idénticos en ambas secuencias para obtener el
número de posiciones equiparadas, dividiendo el número de
posiciones equiparadas por el número total de posiciones en la
secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana), y
multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de
identidad de secuencias.
Por lo tanto, el presente invento abarca
secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas que tienen una
identidad sustancial con respecto a las secuencias aquí descritas,
por ejemplo, aquellas que comprenden al menos un 50% de identidad
de secuencia, preferiblemente al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia
en comparación con una secuencia polinucleotídica o polipeptídica
de este invento, al usar los métodos aquí descritos (por ejemplo, un
análisis BLAST usando parámetros estándares, como se describe más
adelante). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores
pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la
correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos
secuencias nucleotídicas, teniendo en cuenta la degeneración
codónica, la similitud de aminoácidos, la posición de marcos de
lectura, y simi-
lares.
lares.
En realizaciones adicionales, el presente
invento proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados que
comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia
idénticos a, o complementarios de, una o más de las secuencias aquí
descritas. Por ejemplo, mediante este invento se proporcionan
polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30,
40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ó 1000 o más nucleótidos
contiguos de una o más de las secuencias aquí descritas, así como
todas las longitudes intermedias entre ellas. Se entenderá
fácilmente que, en este contexto, "longitudes intermedias"
significa cualquier longitud entre los valores indicados, tal como
16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51,
52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.;
incluyendo todos los números enteros entre 200 y 500; entre 500 y
1000, y similares.
Los polinucleótidos del presente invento, o sus
fragmentos, independientemente de la longitud de la propia
secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de
DNA, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios
adicionales para enzimas de restricción, sitios de clonación
múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, por lo que su
longitud global puede variar considerablemente. Por lo tanto, se
considera que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de
casi cualquier longitud, longitud total que está preferiblemente
limitada por la facilidad de preparación y por el uso en el previsto
protocolo de DNA recombinante. Por ejemplo, se considera que
segmentos de DNA ilustrativos con longitudes totales de
aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000,
aproximadamente 2000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500,
aproximadamente 200, aproximadamente 100, o aproximadamente 50
pares de bases, y similares (incluyendo todas las longitudes
intermedias), son útiles en muchas aplicaciones de este invento.
En otras realizaciones, el presente invento se
dirige a polinucleótidos que son capaces de hibridarse bajo
condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia
polinucleotídica aquí proporcionada, o un fragmento de la misma, o
una secuencia complementaria de la misma. Las técnicas de
hibridación son bien conocidas en el campo de la biología
molecular. Con fines de ilustración, las condiciones moderadamente
rigurosas adecuadas para analizar la hibridación de un
polinucleótido de este invento con otros polinucleótidos incluyen
prelavado en una disolución de SSC 5X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH
de 8,0); hibridación a 50ºC-65ºC, SSC 5X, durante
la noche; y luego lavado dos veces a 65ºC durante 20 minutos con
cada uno de SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contienen SDS al 0,1%.
Además, quienes tienen una experiencia normal en
la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del
código genético, hay muchas secuencias nucleotídicas que codifican
un polipéptido como el aquí descrito. Algunos de estos
polinucleótidos poseen una homología mínima con respecto a la
secuencia nucleotídica de cualquier gen nativo. No obstante, el
presente invento considera específicamente los polinucleótidos que
varían a causa de diferencias en la utilización de codones. Además,
los alelos de los genes que comprenden las secuencias
polinucleotídicas aquí proporcionadas están dentro del alcance del
presente invento. Los alelos son genes endógenos que están
alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como
supresiones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El mRNA y
la proteína resultantes pueden tener, aunque no es necesario, una
estructura o función alterada. Los alelos pueden ser identificados
utilizando técnicas estándares (tales como hibridación,
multiplicación y/o comparación de secuencias con bases de
datos).
Los polinucleótidos que son adecuados para
detección de acuerdo con los métodos del presente invento pueden
ser identificados, como se describe más adelante con mayor detalle,
explorando una micromatriz de cDNAs en cuanto a la expresión
tisular y/o tumoralmente asociada (por ejemplo, expresión que es al
menos dos veces mayor en un tejido tumoral que en un tejido normal,
según se determina utilizando un ensayo representativo aquí
proporcionado). Dichas exploraciones pueden ser llevadas a cabo, por
ejemplo, utilizando una micromatriz Synteni (Palo Alto, California,
EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante [y
esencialmente del modo descrito por Schena et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93: 10.614-10.619 (1996), y
Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
2150-2155 (1997)].
La micromatriz es un método eficaz para evaluar
grandes números de genes pero, a causa de su sensibilidad limitada,
puede que no determine precisamente la distribución tisular absoluta
de los genes de baja abundancia o puede que infraestime el grado de
sobreexpresión de los genes más abundantes a causa de una saturación
de la señal. Para los genes que presentaban sobreexpresión mediante
la perfiladura de la expresión en micromatriz, se llevó a cabo un
análisis adicional usando una transcripción inversa (RT; del inglés,
reverse transcription)-PCR
cuantitativa basada en detección con sondas Taqman™, que comprende
un mayor intervalo dinámico de sensibilidades. Con este fin, se
utilizaron varios grupos diferentes de tejidos normales y tumorales,
metástasis distantes y líneas celulares.
Los polinucleótidos adecuados de acuerdo con el
presente invento pueden ser adicionalmente caracterizados o,
alternativamente, originalmente identificados empleando una
metodología de PCR cuantitativa, tal como, por ejemplo, la
metodología de PCR en tiempo real. Mediante esta metodología,
muestras tisulares y/o tumorales, tales como, por ejemplo, muestras
de tumores metastásicos, pueden ser analizadas junto a la
correspondiente muestra de tejido normal y/o un grupo de muestras
de tejidos normales no relacionados.
La PCR en tiempo real (véanse Gibson et
al., Genome Research 6: 995-1001, 1996;
Heid et al., Genome Research 6:
986-994, 1996) es una técnica que permite evaluar el
nivel de acumulación de productos de PCR durante la multiplicación.
Esta técnica permite la evaluación cuantitativa de niveles de mRNA
en múltiples muestras. En resumen, se extrae mRNA del tejido
tumoral y el normal y se prepara cDNA usando técnicas
estándares.
La PCR en tiempo real puede ser llevada a cabo,
por ejemplo, en un sistema para detección de secuencias ABI7700
Prism o GeneAmp® 5700 (PE Biosystems, Foster City, California,
EE.UU.). El sistema 7700 utiliza un cebador directo y un cebador
inverso en combinación con una sonda específica que tiene un
colorante informador fluorescente 5' en un extremo y un colorante
sofocador 3' en el otro extremo (Taqman™). Cuando la PCR en tiempo
real es llevada a cabo usando DNA polimerasa Taq con actividad
nucleasa 5'-3', la sonda es escindida y comienza a
emitir fluorescencia, lo que permite que la reacción sea controlada
por el aumento de fluorescencia (tiempo real). El sistema 5700
utiliza SYBR® Green, un colorante fluorescente que sólo se une a DNA
de doble cadena, y los mismos cebadores directo e inverso que el
instrumento 7700. Los cebadores de apareamiento y las sondas
fluorescentes pueden diseñarse de acuerdo con el programa Primer
Express (PE Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). Las
concentraciones óptimas de cebadores y sondas son inicialmente
determinadas por quienes tienen una experiencia normal en la
técnica. Los cebadores y sondas testigo (por ejemplo,
\beta-actina) pueden obtenerse comercialmente de,
por ejemplo, Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City,
California, EE.UU.).
Para cuantificar la cantidad de RNA específico
en una muestra, se genera una curva patrón utilizando un plásmido
que contiene el gen de interés. Se generan curvas patrón utilizando
los valores de Ct determinados en la PCR en tiempo real, que están
relacionados con la concentración inicial de cDNA utilizada en el
ensayo. Bastan generalmente diluciones de patrón que varíen de 10 a
10^{6} copias del gen de interés. Además, se genera una curva
patrón para la secuencia testigo. Esto permite la estandarización
del contenido inicial de RNA de una muestra tisular con respecto a
la cantidad en el testigo, con fines comparativos.
De acuerdo con lo anterior, y como se describe
más adelante, el presente invento proporciona los ilustrativos
polinucleótidos específicos de tumor y/o tejido de mama:
mamaglobina, lipofilina B, GABA\pi (B899P), B726P, B511S, B533S,
B305D y B311D, que tienen las secuencias expuestas en las ID. SEC.
números 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17,
19-24, 30, 32 y 73-76, y los
polipéptidos ilustrativos codificados por ellos, que tienen las
secuencias de aminoácidos expuestas en las ID. SEC. números 2, 4,
8-10, 12, 14, 16, 18, 25-29 y 31 y
77, que pueden emplearse adecuadamente en la detección del cáncer,
más específicamente del cáncer de mama.
Los métodos aquí descritos también permitirán la
identificación de polinucleótidos adicionales y/o alternativos que
sean adecuados para la detección de una gran variedad de cánceres,
incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de próstata, cáncer de
mama, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de
cabeza y cuello, linfoma, leucemia, melanoma, cáncer de hígado,
cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer
pancreático y cáncer endometrial.
En general, se puede detectar una célula
cancerosa en un paciente basándose en la presencia de uno o más
polinucleótidos en células de una muestra biológica (por ejemplo,
sangre, ganglios linfáticos, médula ósea, sueros, esputo, orina y o
biopsias tumorales) obtenida del paciente. En otras palabras, dichos
polinucleótidos pueden ser utilizados como marcadores para indicar
la presencia o ausencia de un cáncer, tal como, por ejemplo, el
cáncer de mama
Como aquí se discute con mayor detalle, el
presente invento alcanza estos y otros objetivos relacionados al
proporcionar una metodología para la detección simultánea de más de
un polinucleótido, la presencia del cual es diagnóstica de la
presencia de células cancerosas en una muestra biológica. Cada una
de las diversas metodologías para detección de cáncer aquí
descritas tienen en común una operación de hibridación de uno o más
cebadores y/o sondas oligonucleotídicos, la hibridación de los
cuales es demostrativa de la presencia de un polinucleótido tumoral
y/o tisularmente específico. Dependiendo de la aplicación concreta
considerada, puede preferirse emplear uno o más oligonucleótidos
que abarcan intrones, que sean inoperantes frente a polinucleótidos
de DNA genómico, y, por lo tanto, estos oligonucleótidos son
eficaces para reducir y/o eliminar sustancialmente la detección de
DNA genómico en la muestra biológica.
También se describen aquí métodos para potenciar
la sensibilidad de estas metodologías de detección al someter las
muestras biológicas que se van a analizar a una o más metodologías
de captura celular y/o agotamiento celular.
En ciertas realizaciones del presente invento,
la presencia de una célula cancerosa en un paciente puede ser
determinada empleando las operaciones siguientes: (a) obtener una
muestra biológica de dicho paciente; (b) poner dicha muestra
biológica en contacto con un primer oligonucleótido que se hibrida
con un primer polinucleótido, primer polinucleótido que es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 73 e ID. SEC. nº 74; (c) poner
dicha muestra biológica en contacto con un segundo oligonucleótido
que se hibrida con un segundo polinucleótido seleccionado del grupo
que consiste en las ID. SEC. números 1, 3, 5-7, 11,
13, 15, 17, 19-24, 30, 32 y 75; (d) detectar en
dicha muestra una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con
al menos uno de los oligonucleótidos; y (e) comparar con un valor de
corte predeterminado la cantidad del polinucleótido que se hibrida
con dicho oligonucleótido y determinar, a partir de la comparación,
la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
Realizaciones alternativas del presente invento
proporcionan métodos mediante los cuales se determina la presencia
de una célula cancerosa en un paciente, empleando las operaciones
de: (a) obtener una muestra biológica de dicho paciente; (b) poner
dicha muestra biológica en contacto con un primer oligonucleótido
que se hibrida con un primer polinucleótido, primer polinucleótido
que se representa en la ID. SEC. nº 76; (c) poner dicha muestra
biológica en contacto con un segundo oligonucleótido que se hibrida
con un segundo polinucleótido seleccionado del grupo que consiste
en las ID. SEC. números 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17,
19-24, 30, 32 y 75; (d) detectar en dicha muestra
una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con al menos uno de
los oligonucleótidos; y (e) comparar con un valor de corte
predeterminado la cantidad del polinucleótido que se hibrida con
dicho oligonucleótido y determinar, a partir de la comparación, la
presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
Otras realizaciones del presente invento
proporcionan métodos para determinar la presencia o ausencia de un
cáncer en un paciente. Dichos métodos comprenden las operaciones de:
(a) obtener una muestra biológica de dicho paciente; (b) poner
dicha muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un
primer oligonucleótido que se hibrida con una secuencia
polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74
e ID. SEC. nº 76; (c) poner dicha muestra biológica en contacto con
un segundo oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido como
el representado en la ID. SEC. nº 75; (d) poner dicha muestra
biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se hibrida
con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e
ID. SEC. nº 7; (e) poner dicha muestra biológica en contacto con un
cuarto oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24; (f) detectar en dicha muestra biológica
una cantidad de un polinucleótido que se hibrida con al menos uno
de dichos oligonucleótidos; y (g) comparar con un valor de corte
predeterminado la cantidad del polinucleótido que se hibrida con el
oligonucleótido y determinar, a partir de la comparación, la
presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
Para permitir la hibridación bajo las
condiciones de ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotídicos
deberían comprender una secuencia oligonucleotídica que tuviera al
menos aproximadamente 60%, preferiblemente al menos aproximadamente
75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, de
identidad con respecto a una porción de un polinucleótido que
codifica una proteína de tumor de mama y que tiene al menos 10
nucleótidos, y preferiblemente al menos 20 nucleótidos, de
longitud. Preferiblemente, los cebadores oligonucleotídicos se
hibridan bajo condiciones moderadamente rigurosas con un
polinucleótido que codifica un polipéptido aquí descrito, como se
definió anteriormente. Los cebadores oligonucleotídicos que pueden
ser útilmente empleados en los métodos diagnósticos aquí descritos
tienen preferiblemente una longitud de al menos
10-40 nucleótidos. En una realización preferida, los
cebadores oligonucleotídicos comprenden al menos 10 nucleótidos
contiguos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos,
de una molécula de DNA que tiene una secuencia expuesta en las ID.
SEC. números 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17,
19-24, 30, 32 y 73-76. Las técnicas
tanto para ensayos basados en PCR como para ensayos de hibridación
son bien conocidas en este campo técnico (véanse, por ejemplo,
Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51: 263, 1987; PCR Technology, compilado por Erlich,
Stockton Press, New York, EE.UU.,
1989).
1989).
El presente invento también proporciona métodos
basados en multiplicación, para detectar la presencia de una célula
cancerosa en un paciente. Los métodos ejemplares comprenden las
operaciones de (a) obtener una muestra biológica de un paciente;
(b) poner la muestra biológica en contacto con una primera pareja de
oligonucleótidos, primera pareja que comprende un primer
oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en que el primer
oligonucleótido y el segundo oligonucleótido se hibridan con un
primer polinucleótido y su complemento, respectivamente; (c) poner
la muestra biológica en contacto con una segunda pareja de
oligonucleótidos, segunda pareja que comprende un tercer
oligonucleótido y un cuarto oligonucleótido, en que los
oligonucleótidos tercero y cuarto se hibridan con un segundo
polinucleótido y su complemento, respectivamente, y en que el primer
polinucleótido tiene una secuencia nucleotídica que no está
relacionada con la del segundo polinucleótido; (d) multiplicar el
primer polinucleótido y el segundo polinucleótido; y (e) detectar
el primer polinucleótido multiplicado y el segundo polinucleótido
multiplicado; en los que la presencia del primer polinucleótido
multiplicado o del segundo polinucleótido multiplicado indica la
presencia de una célula cancerosa en el paciente.
Los métodos de acuerdo con el presente invento
son adecuados para identificar polinucleótidos obtenidos de una
gran variedad de muestras biológicas, tales como, por ejemplo,
sangre, suero, ganglio linfático, médula ósea, esputo, orina y
muestra de biopsia tumoral. En ciertas realizaciones preferidas, la
muestra biológica es sangre, un ganglio linfático o médula ósea. En
otras realizaciones del presente invento, el ganglio linfático
puede ser un ganglio linfático centinela.
Resultará evidente que los presentes métodos
pueden ser empleados en la detección de una gran variedad de
cánceres. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a,
cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, linfoma,
leucemia, melanoma, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de
riñón, cáncer de vejiga, cáncer pancreático y cáncer
endometrial.
Ciertas realizaciones ejemplares del presente
invento proporcionan métodos en que los polinucleótidos que se van
a detectar son seleccionados del grupo que consiste en mamaglobina,
lipofilina B, GABA\pi (B899P), B726P, B511S, B533S, B305D y
B311D. Alternativa y/o adicionalmente, los polinucleótidos que se
van a detectar pueden ser seleccionados del grupo que consiste en
los representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº
75, ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID.
SEC. nº 7, ID. SEC. nº 11, ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC.
nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº
22, ID. SEC. nº 23, ID. SEC. nº 24, ID. SEC. nº 30, ID. SEC. nº 32 e
ID. SEC. nº 76.
Las sondas y/o cebadores oligonucleotídicos
ejemplares adecuados que pueden utilizarse de acuerdo con los
métodos del presente invento se describen aquí mediante las ID. SEC.
números 33-35 y 63-72. En ciertas
realizaciones preferidas en que se elimina la detección de fondo de
DNA genómico, los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos que
abarcan intrones. Los oligonucleótidos ejemplares que abarcan
intrones, adecuados para la detección de diversos polinucleótidos
aquí descritos, se representan en las ID. SEC. números
36-62.
Dependiendo de la aplicación concreta
considerada, el técnico puede preferir detectar los polinucleótidos
tisular y/o tumoralmente específicos detectando un radiomarcador y
detectando un fluoróforo. Más específicamente, la sonda y/o el
cebador oligonucleotídicos pueden comprender un resto detectable tal
como, por ejemplo, un radiomarcador y/o un fluoróforo.
Alternativa o adicionalmente, los métodos del
presente invento pueden comprender también una operación de
fraccionamiento antes de la detección de los polinucleótidos tisular
y/o tumoralmente específicos, tal como, por ejemplo, una
electroforesis en gel.
En otra realizaciones, los métodos aquí
descritos pueden ser utilizados para controlar el progreso del
cáncer. Mediante estas realizaciones, se pueden llevar a cabo a lo
largo del tiempo ensayos como los proporcionados para el
diagnóstico de un cáncer y se puede evaluar el cambio del nivel de
polipéptido(s) o polinucleótido(s)
reactivo(s). Por ejemplo, los ensayos pueden ser llevados a
cabo cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses
a 1 año y, más adelante, pueden ser llevados a cabo cuando sea
necesario. En general, un cáncer progresa en aquellos pacientes en
que el nivel del polipéptido o polinucleótido detectado aumenta con
el tiempo. Por contraste, el cáncer no progresa cuando el nivel del
polipéptido o polinucleótido reactivo permanece constante o
disminuye con el
tiempo.
tiempo.
Ciertos ensayos diagnósticos in vivo
pueden ser llevados directamente a cabo sobre un tumor. Uno de tales
ensayos implica poner células tumorales en contacto con un agente
ligante. El agente ligante unido puede ser luego detectado directa
o indirectamente por medio de un grupo informador. Dichos agentes
ligantes pueden ser también usados en aplicaciones histológicas.
Alternativamente, se pueden usar sondas polinucleotídicas en tales
aplicaciones.
Como se indicó anteriormente, para mejorar la
sensibilidad, se pueden analizar múltiples marcadores proteicos de
tumor de mama en una muestra dada. Resultará evidente que, en un
solo ensayo, pueden combinarse agentes ligantes específicos para
diferentes proteínas aquí proporcionadas. Además, se pueden usar
concurrentemente múltiples cebadores o sondas. La selección de
marcadores proteicos de tumores puede basarse en experimentos
rutinarios para determinar combinaciones que den lugar a una
sensibilidad óptima. Además, o alternativamente, los ensayos para
proteínas tumorales aquí proporcionados se pueden combinar con
ensayos para otros antígenos tumorales conocidos.
En otros aspectos del presente invento, se
pueden usar tecnologías de captura celular antes de la detección
polinucleotídica, para mejorar la sensibilidad de las diversas
metodologías de detección aquí descritas.
Se pueden utilizar metodologías de
enriquecimiento celular ejemplares en que se emplean glóbulos
inmunomagnéticos que están revestidos con anticuerpos monoclonales
específicos para marcadores de la superficie celular, o complejos
de anticuerpos tetrámeros, para primero enriquecer una muestra en
células cancerosas o seleccionar positivamente células cancerosas
de una muestra. Se pueden utilizar diversos sistemas comercialmente
asequibles, incluyendo Dynabeads® Epithelial Enrich (Dynal Biotech,
Oslo, Noruega), StemSep™ (StemCell Technologies, Inc., Vancouver,
British Columbia, Canadá) y RosetteSep (StemCell Technologies). El
técnico experto reconocerá que también se pueden emplear
adecuadamente otras metodologías y sistemas fácilmente asequibles
para enriquecer en, o seleccionar positivamente, poblaciones
celulares deseadas.
Dynabeads® Epithelial Enrich contiene glóbulos
magnéticos revestidos con anticuerpos monoclonales (mAb; del
inglés, monoclonal antibody) específicos para
dos antígenos glicoproteínicos de membrana expresados en tejidos
epiteliales normales y neoplásicos. Se pueden añadir los glóbulos
revestidos a una muestra y luego aplicar la muestra a un imán,
capturándose de este modo las células unidas a los glóbulos. Las
células indeseadas son separadas por lavado, y las células
magnéticamente aisladas son eluidas de los glóbulos y utilizadas en
otros análisis.
Se puede utilizar RosetteSep para enriquecer
celularmente una muestra de sangre de forma directa, y consiste en
un coctel de anticuerpos tetrémeros que se dirigen a una diversidad
de células indeseadas y las enlazan a la glicoforina A de los
glóbulos rojos (RBC; del inglés, red blood
cells) presentes en la muestra, formándose rosetas. Cuando
se realiza una centrifugación sobre Fycoll, se forma un sedimento de
las células diana junto con los RBC libres.
La combinación de anticuerpos en el cóctel de
agotamiento determina qué células serán eliminadas y, en
consecuencia, qué células serán recuperadas. Los anticuerpos que
están disponibles incluyen, pero no se limitan a: CD2, CD3, CD4,
CD5, o la CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24,
CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO,
CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE y
TCR\alpha\beta. Además, se contempla en el presente invento que
puedan desarrollarse mABs específicos para antígenos de tumor de
mama y utilizarse de un modo similar. Por ejemplo, mABs que se unen
a antígenos tumoralmente específicos de la superficie celular
pueden ser conjugados con glóbulos magnéticos, o formulados en un
complejo de anticuerpos tetrámeros, y utilizados para enriquecer
una muestra en células metastásicas de tumor de mama o seleccionar
positivamente células metastásicas de tumor de mama de una
muestra.
Una vez que una muestra ha sido enriquecida o
positivamente seleccionada, las células pueden ser adicionalmente
analizadas. Por ejemplo, se pueden lisar las células y aislar el
RNA. El RNA puede ser luego sometido a un análisis mediante
RT-PCR usando cebadores múltiples específicos de
tumor de mama en un ensayo de PCR en tiempo real como el aquí
descrito.
En otro aspecto del presente invento, se pueden
utilizar tecnologías de captura celular junto con PCR en tiempo
real para obtener una herramienta más sensible para la detección de
células metastásicas que expresan antígenos de tumor de mama. Es
deseable la detección de células de cáncer de mama en muestras de
médula ósea, sangre periférica y muestras obtenidas por aspiración
con aguja pequeña, para el diagnóstico y el pronóstico de pacientes
con cáncer de mama.
Como se indicó anteriormente y como se describe
aquí con mayor detalle, en ciertos métodos, composiciones y
sistemas de acuerdo con el presente invento se utilizan dos o más
parejas de cebadores oligonucleotídicos para la detección del
cáncer. La capacidad de dichas sondas de ácido nucleico para
hibridarse específicamente con una secuencia de interés permitirá
que sean utilizadas para detectar la presencia de secuencias
complementarias en una muestra biológica.
Alternativamente, en otra realizaciones, las
sondas y/o cebadores del presente invento pueden emplearse para
detección por medio de la hibridación de ácido nucleico. Se
considera que, de por sí, los segmentos de ácido nucleico que
comprenden una región de secuencia de una secuencia contigua de al
menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud que tiene la misma
secuencia que, o es complementaria de, una secuencia contigua de 15
nucleótidos de longitud de un polinucleótido que se va a detectar
serán particularmente útiles. En ciertas realizaciones, también
tendrán utilidad unas secuencias idénticas o complementarias
contiguas más largas, por ejemplo, las de aproximadamente 20, 30,
40, 50, 100, 200, 500 o 1000 (incluyendo todas las longitudes
intermedias), e incluso hasta las secuencias de longitud
completa.
Los cebadores oligonucleotídicos que tienen
regiones de secuencia que consisten en tramos nucleotídicos
contiguos de 10-14, 15-20, 30, 50 o
incluso 100-200 nucleótidos o así (incluyendo
también las longitudes intermedias), idénticas a, o complementarias
de, un polinucleótido que se va a detectar, son particularmente
considerados como cebadores para uso en reacciones de
multiplicación tales como, por ejemplo, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR™). Esto permitiría que un polinucleótido fuera
analizado en diversas muestras biológicas, tales como, por ejemplo,
sangre, ganglios linfáticos y médula ósea.
El uso de un cebador de aproximadamente
15-25 nucleótidos de longitud permite la formación
de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Se
prefieren generalmente las moléculas que tienen secuencias
complementarias contiguas a lo largo de tramos superiores a 15 bases
de longitud, con objeto de aumentar la estabilidad y la
selectividad del híbrido y mejorar por ello la calidad y el grado de
las moléculas híbridas específicas obtenidas. Generalmente se
preferirá diseñar cebadores que tengan tramos génicamente
complementarios de 15 a 25 nucleótidos contiguos, o incluso más
largos cuando sea deseable.
Los cebadores pueden ser seleccionados de
cualquier porción del polinucleótido que se va a detectar. Todo lo
que se necesita es revisar la secuencia, tal como los
polinucleótidos ejemplares expuestos en las ID. SEC. números 1, 3,
5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32,
73-75 (Figuras 3-6, respectivamente)
y 76 (lipofilina B), o cualquier porción continua de la secuencia,
de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud
hasta, e incluyendo, la secuencia de longitud completa, que uno
desea utilizar como cebador. La elección de las secuencias cebadoras
puede venir determinada por diversos factores. Por ejemplo, se
puede querer emplear cebadores dirigidos hacia los extremos de la
secuencia total. Los cebadores ejemplares aquí descritos pueden ser
opcionalmente utilizados por su capacidad para formar
selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios del
polinucleótido entero de interés, tal como el expuesto en las ID.
SEC. números 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17,
19-24, 30, 32, 73-75 (Figuras
3-6, respectivamente) y 76 (lipofilina B).
El presente invento proporciona además la
secuencia nucleotídica de diversos cebadores y sondas
oligonucleotídicos ejemplares, expuestos en las ID. SEC. números
33-71, que se pueden utilizar, como aquí se describe
con mayor detalle, de acuerdo con los métodos del presente invento
para la detección del cáncer.
Los cebadores oligonucleotídicos de acuerdo con
el presente invento pueden ser fácilmente preparados de forma
rutinaria mediante métodos comúnmente asequibles al técnico experto,
incluyendo, por ejemplo, la síntesis directa de los cebadores por
medios químicos, como se lleva habitualmente a la práctica usando un
sintetizador de oligonucleótidos automatizado. Dependiendo de la
aplicación prevista, se deseará típicamente emplear condiciones
variables de hibridación para conseguir grados variables de
selectividad de la sonda hacia la secuencia diana. Para
aplicaciones en que se requiera una elevada selectividad, se deseará
típicamente emplear condiciones relativamente rigurosas para formar
los híbridos; por ejemplo, se seleccionarán condiciones de
concentración de sal relativamente baja y/o temperatura
relativamente elevada, tal como se proporciona mediante una
concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente
0,15 M y temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente
70ºC. Dichas condiciones selectivas toleran poco apareamiento
erróneo, si acaso alguno, entre la sonda y el molde o cadena diana
y serían particularmente adecuadas para aislar secuencias
relacionadas.
Cada una de las realizaciones específicas aquí
esbozadas para la detección del cáncer tiene en común la detección
de un polinucleótido tisular y/o tumoralmente específico a través de
la hibridación de uno o más cebadores y/o sondas
oligonucleotídicos. Dependiendo de factores tales como el número
relativo de células cancerosas presentes en la muestra biológica
y/o el nivel de expresión polinucleotídica en cada célula cancerosa,
puede ser preferible llevar a cabo una operación de multiplicación
antes de llevar a cabo las operaciones de detección. Por ejemplo,
se pueden emplear al menos dos cebadores oligonucleotídicos en un
ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para
multiplicar una porción de un cDNA de tumor de mama procedente de
una muestra biológica, siendo al menos uno de los cebadores
oligonucleotídicos específico para (es decir, se hibrida con) un
polinucleótido que codifica la proteína de tumor de mama. El cDNA
multiplicado puede ser opcionalmente sometido a una operación de
fraccionamiento, tal como, por ejemplo, una electroforesis en
gel.
Se dispone de diversos procedimientos,
dependientes de molde, para multiplicar las secuencias diana de
interés presentes en una muestra. Uno de los métodos de
multiplicación mejor conocidos es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR™), que se describe con detalle en las Patentes de
EE.UU, números 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, cada una de las
cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En resumen,
en la PCR™, se preparan dos secuencias cebadoras que son
complementarias de regiones presentes en cadenas complementarias
opuestas de la secuencia diana. Se añade un exceso de
desoxinucleósido trifosfatos a una mezcla de reacción junto con una
DNA polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa). Si la secuencia diana
está presente en una muestra, los cebadores se unirán a la diana y
la polimerasa causará que los cebadores se extiendan a lo largo de
la secuencia diana mediante la adición de nucleótidos. Elevando y
reduciendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores
extendidos se disociarán de la diana para formar productos de
reacción, los cebadores en exceso se unirán a la diana y al
producto de reacción, y el proceso se repite. Preferiblemente, puede
llevarse a cabo un procedimiento de transcripción inversa y
multiplicación por PCR™ con objeto de cuantificar la cantidad de
mRNA multiplicado. Las metodologías de la reacción en cadena de la
polimerasa son bien conocidas en la técnica.
En una metodología preferida para la
multiplicación de polinucleótidos se emplea la
RT-PCR, en la cual se aplica la PCR junto con la
transcripción inversa. Típicamente, se extrae RNA de una muestra
biológica, tal como sangre, suero, ganglio linfático, médula ósea,
esputo, orina y muestras de biopsias tumorales, y se somete a
transcripción inversa para producir moléculas de cDNA. La
multiplicación por PCR en que se utiliza al menos un cebador
específico genera una molécula de cDNA que puede ser separada y
visualizada usando, por ejemplo, electroforesis en gel. La
multiplicación puede ser llevada a cabo sobre muestras biológicas
extraídas de un paciente y de un individuo que no está afectado por
un cáncer. La reacción de multiplicación puede ser llevada a cabo
sobre diversas diluciones de cDNA que abarquen dos órdenes de
magnitud. Un aumento de expresión del doble o más en varias
diluciones de la muestra de ensayo del paciente en comparación con
las mismas diluciones de la muestra no cancerosa es típicamente
considerado positivo.
Para llevar a cabo la operación de
multiplicación se puede utilizar cualquiera de una diversidad de
sistemas comercialmente asequibles. Una de dichas técnicas de
multiplicación es la PCR inversa (véase Triglia et al.,
Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), en la que se utilizan
enzimas de restricción para generar un fragmento en la región
conocida del gen. El fragmento es luego hecho circular por ligación
intramolecular y es utilizado como molde para PCR con cebadores
divergentes procedentes de la región conocida. En un planteamiento
alternativo, secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden
ser recuperadas por multiplicación con un cebador para una
secuencia conectora y un cebador específico para una región
conocida. Las secuencias multiplicadas son típicamente sometidas a
un segundo ciclo de multiplicación con el mismo cebador conector y
con un segundo cebador específico para la región conocida. En el
documento WO 96/38591 se describe una variación de este
procedimiento, en la que se emplean dos cebadores que inician la
extensión en direcciones opuestas a partir de la secuencia
conocida. Otra de dichas técnicas es conocida como "multiplicación
rápida de extremos de cDNA" o RACE. Esta técnica implica el uso
de un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida con una
región de poliA o una secuencia vector, para identificar secuencias
que son 5' y 3' con respecto a una secuencia conocida. Técnicas
adicionales incluyen la PCR de captura (Lagerstrom et al.,
PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) y la
PCR ambulante ("walking") (Parker et al., Nucl. Acids
Res. 19: 3055-60, 1991). Para obtener una
secuencia de cDNA de longitud completa se pueden emplear también
otros métodos en que se utiliza multiplicación.
Otro método para multiplicación es la reacción
en cadena de la ligasa (LCR), descrita en la Publicación de
Solicitud de Patente Europea nº 320.308 (específicamente incorporada
aquí por referencia en su totalidad). En LCR, se preparan dos
parejas de sondas complementarias y, en presencia de la secuencia
diana, cada pareja se unirá a cadenas complementarias opuestas de
la diana de modo que queden apoyadas. En presencia de una ligasa,
las dos parejas de sondas se unirán para formar una sola unidad.
Mediante termociclación, como en la PCR™, las unidades ligadas
unidas se disocian de la diana y sirven luego como "secuencias
diana" para la ligación de parejas de sondas en exceso. En la
Patente de EE.UU. nº 4.883.750, incorporada aquí por referencia en
su totalidad, se describe un método alternativo de multiplicación
similar a la LCR, para unir parejas de sondas a una secuencia
diana.
También se puede utilizar la replicasa de Qbeta,
descrita en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional
PCT nº PCT/US87/00880, incorporada aquí por referencia en su
totalidad, como aún otro método de multiplicación en el presente
invento. En este método, una secuencia replicativa de RNA que tiene
una región complementaria de la de una diana es añadida a una
muestra en presencia de una RNA polimerasa. La polimerasa copiará la
secuencia replicactiva, que puede ser luego detectada.
Un método de multiplicación isotérmica, en que
se utilizan endonucleasas de restricción y ligasas para lograr la
multiplicación de moléculas diana que contienen nucleótido
5'-[\alpha-tio]trifosfatos en una cadena de
un sitio de restricción (Walker et al., 1992, incorporado
aquí por referencia en su totalidad), puede ser también útil en la
multiplicación de ácidos nucleicos en el presente invento.
La multiplicación por desplazamiento de cadenas
(SDA) es otro método para llevar a cabo la multiplicación
isotérmica de ácidos nucleicos, que implica múltiples ciclos de
desplazamiento y síntesis de cadenas, es decir, traslado de cortes.
Un método similar llamado reacción en cadena con reparación (RCR;
del inglés, repair chain reaction) es otro
método de multiplicación que puede ser útil en el presente invento e
implica la hibridación de varias sondas a lo largo de una región
específica para multiplicación, seguida de una reacción de
reparación en que sólo están presentes dos de las cuatro bases. Las
otras dos bases pueden ser añadidas como derivados biotinilados
para una sencilla detección. Un planteamiento similar se utiliza en
la SDA.
También se pueden detectar secuencias usando una
reacción cíclica de sondas (CPR). En la CPR, una sonda que tiene
unas secuencias 3' y 5' de DNA no diana y una secuencia interna o
"central" del RNA específico de la proteína diana es hibridada
con DNA que está presente en una muestra. Tras la hibridación, la
mezcla de reacción es tratada con RNasa H, y los productos de la
sonda son identificados como productos distintivos al generarse una
señal que es liberada después de la digestión. El molde original se
hibrida con otra sonda de ciclación y se repite la reacción. De
este modo, la CPR implica multiplicar una señal generada mediante la
hibridación de una sonda con un ácido nucleico expresado,
específico de un gen diana.
En la Solicitud de Patente de Gran Bretaña nº
2.202.328 y en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional
PCT nº PCT/US89/01025 se describen aún otros métodos de
multiplicación que pueden ser útiles de acuerdo con el presente
invento. En la primera solicitud, se utilizan cebadores
"modificados" en una síntesis de tipo PCR, dependiente de
molde y enzima. Los cebadores pueden ser modificados mediante
marcación con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un
resto detector (por ejemplo, una enzima). En la segunda solicitud,
se añade un exceso de sondas marcadas a una muestra. En presencia
de la secuencia diana, la sonda se une y es escindida
catalíticamente. Después de la escisión, la secuencia diana es
liberada intacta para resultar unida por la sonda en exceso. La
escisión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia
diana.
Otros procedimientos para la multiplicación de
ácido nucleico incluyen sistemas de multiplicación basados en
transcripción (TAS) (Kwoh et al., 1989; Publicación de
Solicitud de Patente Internacional PCT nº WO 88/10315), incluyendo
la multiplicación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) y
la 3SR. En la NASBA, los ácidos nucleicos pueden ser preparados
para multiplicación mediante extracción estándar con
fenol/cloroformo, desnaturalización térmica de una muestra,
tratamiento con tampón de lisis y columnas para minicentrifugas para
aislamiento de DNA y RNA, o extracción de RNA con cloruro de
guanidinio. Éstas técnicas de multiplicación implican hibridar un
cebador que tiene secuencias específicas de la secuencia diana.
Después de la polimerización, los híbridos de DNA/RNA son digeridos
con RNasa H mientras que las moléculas de DNA de doble cadena son de
nuevo térmicamente desnaturalizadas. En cualquier caso, el DNA de
cadena sencilla es hecho totalmente de cadena doble mediante la
adición de un segundo cebador específico para la diana, seguida de
polimerización. Las moléculas de DNA de cadena doble son luego
múltiplemente transcritas por una polimerasa tal como T7 o SP6. En
una reacción cíclica isotérmica, los RNAs son inversamente
transcritos a DNA y son transcritos una vez más con una polimerasa
tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, sean truncados o sean
completos, indican secuencias específicas de la diana.
En la Publicación de Solicitud de Patente
Europea nº 329.822, incorporada aquí por referencia en su totalidad,
se describe un procedimiento para multiplicación de ácido nucleico
que implica sintetizar cíclicamente RNA de cadena sencilla (ssRNA;
del inglés, single-stranded RNA), ssDNA y DNA de
cadena doble (dsDNA; del inglés, double-stranded
DNA), que pueden ser utilizados de acuerdo con el presente invento.
El ssRNA es un primer molde para un primer oligonucleótido cebador,
que es alargado mediante una transcriptasa inversa (DNA polimerasa
dependiente de RNA). El RNA es luego separado del dúplex DNA:RNA
resultante por la acción de ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa
específica para RNA en un dúplex con DNA o RNA). El ssDNA resultante
es un segundo molde para un segundo cebador, que también incluye
las secuencias de un promotor de RNA polimerasa (ejemplificado por
la RNA polimerasa de T7) 5' en cuanto a su homología con a su molde.
Este cebador es luego extendido por DNA polimerasa [ejemplificada
por el fragmento grande ("Klenow") de la DNA polimerasa I de
E. coli], resultando en forma de molécula de DNA de doble
cadena (dsDNA) que tiene una secuencia idéntica a la del RNA
original entre los cebadores y que tiene además una secuencia
promotora en un extremo. Esta secuencia promotora puede ser
utilizada por la RNA polimerasa apropiada para crear muchas copias
RNA del DNA. Estas copias pueden volver a entrar luego en el ciclo,
lo que conduce a una multiplicación muy rápida. Con la elección
apropiada de las enzimas, esta multiplicación puede realizarse
isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo. A causa de
la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia de partida puede
ser escogida para que esté en forma de DNA o RNA.
En la Publicación de Solicitud de Patente
Internacional PCT nº WO 89/06700 se describe un esquema de
multiplicación de secuencias de ácido nucleico basado en la
hibridación de una secuencia promotora/cebadora con un DNA de
cadena sencilla (ssDNA) diana, seguida de la transcripción de muchas
copias RNA de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir,
no se producen nuevos moldes a partir de los transcritos de RNA
resultantes. Otros métodos de multiplicación incluyen "RACE"
(Frohman, 1990) y "PCR de un lado" (Ohara, 1989), que son bien
conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica.
El presente invento proporciona además sistemas
para uso en cualquiera de los métodos diagnósticos anteriores.
Dichos sistemas comprenden típicamente dos o más componentes
necesarios para llevar a cabo un ensayo diagnóstico. Los
componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o
equipos. Por ejemplo un recipiente de un sistema puede contener un
anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, que se une
específicamente a una proteína de tumor de mama. Dichos anticuerpos
o fragmentos pueden ser proporcionados fijados a un material de
soporte, como se describió anteriormente. Uno o más recipientes
adicionales pueden contener elementos, tales como reactivos o
tampones, para ser utilizados en el ensayo. Dichos sistemas pueden
contener también, o alternativamente, un reactivo de detección como
el anteriormente descrito que contiene un grupo informador adecuado
para la detección directa o indirecta de la unión del
anticuerpo.
El presente invento también proporciona sistemas
que son adecuados para llevar a cabo los métodos de detección del
presente invento. Los sistemas ejemplares comprenden pares de
cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales se hibrida
específicamente con un polinucleótido distinto. En ciertas
realizaciones, los sistemas de acuerdo con el presente invento
pueden comprender también una ácido nucleico polimerasa y un tampón
adecuado. Los cebadores oligonucleotídicos ejemplares adecuados
para los sistemas del presente invento son aquí descritos mediante
las ID. SEC. números 33-71. Los polinucleótidos
ejemplares adecuados para los sistemas del presente invento se
describen en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº 75, ID.
SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº
7, ID. SEC. nº 11, ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23, ID. SEC. nº 24, ID. SEC. nº 30 e ID. SEC. nº 32 y la
lipofilina B.
Alternativamente, se puede diseñar un sistema
para detectar, en una muestra biológica, el nivel de mRNA que
codifica una proteína de tumor de mama. Dichos sistemas comprenden
generalmente al menos una sonda o cebador oligonucleotídico, como
se describió anteriormente, que se hibrida con un polinucleótido que
codifica una proteína de tumor de mama. Dicho oligonucleótido puede
ser utilizado, por ejemplo, en una PCR o en un ensayo de
hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes
en dichos sistemas incluyen un segundo oligonucleótido y/o un
recipiente o reactivo diagnóstico para facilitar la detección de un
polinucleótido que codifica una proteína de tumor de mama.
En otros aspectos relacionados, el presente
invento proporciona además composiciones útiles en los métodos
aquí descritos. Las composiciones ejemplares comprenden dos o más
pares de cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales se
hibrida específicamente con un polinucleótido distinto. Los
cebadores oligonucleotídicos ejemplares adecuados para las
composiciones del presente invento son aquí descritos mediante las
ID. SEC. números 33-71. Los polinucleótidos
ejemplares adecuados para las composiciones del presente invento se
describen en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74, ID. SEC. nº 75, ID.
SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº
7, ID. SEC. nº 11, ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23, ID. SEC. nº 24, ID. SEC. nº 30 e ID. SEC. nº 32 y la
lipofilina B.
Los ejemplos siguientes se presentan a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Este ejemplo describe el uso de la
representación diferencial para el enriquecimiento en
polinucleótidos que están sobreexpresados en tejidos tumorales de
mama.
La representación diferencial fue llevada a cabo
del modo descrito en la bibliografía [véase, por ejemplo, P. Liang
et al., Science 257: 967-971 (1993)]
con las modificaciones siguientes: (a) los productos de
multiplicación por PCR fueron visualizados en geles teñidos con
plata, (b) se usaron pares genéticamente equiparados de tejidos
para eliminar la variación polimórfica y (c) se utilizaron dos
diluciones diferentes de cDNA como molde para eliminar los efectos
relativos a la dilución [véase E. Mou et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 199; 564-569 (1994)].
En este ejemplo se describe la preparación de un
banco de sustracción de cDNA de tumor de mama, enriquecido en
cuanto a polinucleótidos específicos de tumor de mama.
La sustracción de bancos de cDNA fue llevada a
cabo del modo descrito [véase T. Hara et al., Blood
84; 189-199 (1994)] con cierta modificación. El
banco de tumor de mama (trazador; "tracer" en inglés,) que se
realizó a partir de una colección de tres tumores de mama fue
sustraído con un banco de mama normal (conductor; "driver" en
inglés) para identificar genes específicos de tumor de mama. En
sustracciones más recientes se utilizaban 6-10
tejidos normales como conductor para sustraer más eficazmente los
genes comunes, haciendo hincapié en tejidos esenciales junto con un
tejido "inmunológico" (por ejemplo, bazo, ganglio linfático o
PBMC), para facilitar la separación de cDNAs procedentes de
infiltración linfocitaria en tumores. El banco de cDNA sustraído,
específico de tumor de mama, fue generado del modo siguiente: el
banco de cDNA conductor fue digerido con EcoRI, NotI y SfuI (SfuI
escinde el vector), y rellenado con fragmento Klenow de DNA
polimerasa. Después de una extracción con
fenol-cloroformo y una precipitación con etanol, el
DNA fue marcado con biotina Photoprobe y disuelto en H_{2}O. El
banco de cDNA trazador fue digerido con BamHI y XhoI, sometido a
extracción con fenol-cloroformo, hecho pasar a
través de columnas Chromaspin-400, precipitado con
etanol, y mezclado con el DNA conductor para una hibridación a 68ºC
durante 20 horas [hibridación larga (LH; del inglés, long
hybridization)]. La mezcla de reacción fue luego sometida a
tratamiento con estreptavidina seguido de extracción con
fenol/cloroformo un total de cuatro veces. El DNA sustraído fue
precipitado y fue sometido de nuevo a una hibridación a 68ºC durante
2 horas con DNA conductor [hibridación corta (SH; del inglés,
short hybridization)]. Después de la separación del
DNA de doble cadena biotinilado, se ligó el cDNA sustraído en el
sitio BamHI/XhoI de pBCSK^{+} resistente a cloranfenicol y se
transformaron con él células E. coli DH10B ElectroMax
mediante electroporación para generar el banco de cDNA sustraído.
Para clonar los genes específicos de tumor de mama menos abundantes,
se repitió la sustracción del banco de cDNA sustrayendo el banco de
cDNA trazador con el banco de cDNA conductor más abundantes cDNAs
procedentes de sustracciones primarias. Esto dio lugar al
agotamiento de estas secuencias abundantes y a la generación de
bancos de sustracción que contenían secuencias menos abundantes.
Para analizar el banco de cDNA sustraído, se
preparó DNA plasmídico a partir de 100-200 clones
independientes que fueron escogidos aleatoriamente del banco
sustraído, y se caracterizó por secuenciación de DNA. El cDNA
determinado y las secuencias de aminoácidos esperadas para los cDNAs
aislados fueron comparados con secuencias conocidas usando las más
recientes bases de datos Genbank y EST humana.
En este ejemplo se describe la sustracción por
PCR para enriquecimiento en cuanto a polinucleótidos específicos de
tumor de mama.
La sustracción por PCR fue llevada esencialmente
a cabo del modo descrito en la bibliografía; véanse L. Diatchenko
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:
6025-6030 (1996), y G. P. Yang et al.,
Nucleic Acids Res. 27: 1517-23 (1999). En
resumen, este tipo de sustracción actúa por ligación de dos
adaptadores diferentes a diferentes partes alícuotas de una muestra
de cDNA comprobador (tumor de mama) digerida con enzimas de
restricción, seguida del mezclamiento separado de los comprobadores
("tester" en inglés) con conductor en exceso (sin adaptadores).
Esta primera hibridación da lugar a la normalización del cDNA
específico comprobador de cadena sencilla a causa de la cinética de
segundo orden de la hibridación. Luego se mezclan estas mezclas
separadas de reacción de hibridación, sin desnaturalización, y se
lleva a cabo una segunda hibridación que produce las moléculas
diana, fragmentos de cDNA de doble cadena que contienen ambos
adaptadores diferentes. Se llevaron a cabo dos ciclos de PCR, lo
que dio lugar a la multiplicación exponencial de las moléculas de la
población diana (cDNAs específicos comprobadores normalizados),
mientras que otros fragmentos quedaron sin multiplicar o sólo fueron
multiplicados de modo lineal. Las sustracciones llevadas a cabo
incluían una colección de tumores de mama sustraídos con una
colección de mama normal, y una colección de tumores de mama
sustraídos con una colección de tejidos normales que incluían PBMC,
cerebro, páncreas, hígado, intestino delgado, estómago, corazón y
riñón.
Antes de la síntesis de cDNA, el RNA fue tratado
con DNasa I (Ambion) en presencia de RNasina (Promega Biotech,
Madison, Wisconsin, EE.UU.) para eliminar la contaminación por DNA.
El cDNA para uso en los grupos tisulares para PCR en tiempo real
fue preparado usando 25 \mul de cebador Oligo dT
(Boehringer-Mannheim) con transcriptasa inversa
Superscript II (Gibco BRL, Bethesda, Maryland, EE.UU.).
El aislamiento y la caracterización de los
antígenos B511S y B533S específicos de mama se describen en la
Solicitud de Patente de EE.UU. número 09/346.327, presentada el 2 de
julio de 1999, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en
su totalidad. La determinada secuencia de cDNA para B511S se
proporciona en la ID. SEC. nº 30, proporcionándose la
correspondiente secuencia de aminoácidos en la ID. SEC. nº 31. La
determinada secuencia de cDNA para B533S se proporciona en la ID.
SEC. nº 32. El aislamiento y la caracterización del antígeno B726P
específico de mama se describen en las Solicitudes de Patente de
EE.UU. números 09/285.480, presentada el 2 de Abril de 1999, y
09/433.826, presentada el 3 de Noviembre de 1999.
Las determinadas secuencias de cDNA para
variantes de corte y empalme de B726P se proporcionan en las ID.
SEC. números 13, 15, 17 y 19-24, proporcionándose
las correspondientes secuencias de aminoácidos en las ID. SEC.
números 14, 16, 18 y 25-29.
El aislamiento y la caracterización de las
formas A y C del antígeno B305D específico de mama se han descrito
en la Solicitud de Patente de EE.UU. nº 09/429.755, presentada el 28
de Octubre de 1999. Las determinadas secuencias de cDNA para las
isoformas A y C de B305D se proporcionan en las ID. SEC. números 1,
3 y 5-7, proporcionándose las correspondientes
secuencias de aminoácidos en las ID. SEC. números 2, 4 y
8-10.
El aislamiento y la caracterización del antígeno
B311D específico de mama se han descrito en la Solicitud de Patente
de EE.UU. nº 09/289.198, presentada el 9 de Abril de 1999.
La determinada secuencia de cDNA para B311D se
proporciona en la ID. SEC. nº 11, proporcionándose la
correspondiente secuencia de aminoácidos en la ID. SEC. nº 12.
Las secuencias de cDNA para la mamaglobina se
proporcionan en las Figuras 4 y 5, proporcionándose la secuencia de
cDNA para GABA\pi en la Figuras 6, y se describen en las ID. SEC.
números 73-75, respectivamente.
El aislamiento y la caracterización del antígeno
lipofilina B específico de mama se han descrito en la Solicitud de
Patente de EE.UU. nº 09/780.842, presentada el 8 de Febrero de 2001.
La determinada secuencia de cDNA para lípofilina B se proporciona
en la ID. SEC. nº 76, proporcionándose la correspondiente secuencia
de aminoácidos en la ID. SEC. nº 77. En la Solicitud 09/780.842
también se describen las secuencias de nucleótidos de diversas
variantes de secuencia de la lípofilina B.
En este ejemplo se describe el uso de análisis
en micromatriz para identificar polinucleótidos que están
sobreexpresados al menos al doble en muestras de tejido tumoral de
mama en comparación con muestras de tejido normal de mama.
La expresión de mRNA de los polinucleótidos de
interés fue llevada a cabo del modo siguiente. Se preparó cDNA para
los diferentes genes del modo anteriormente descrito y se dispuso
matricialmente en un portaobjetos de vídeo (Incyte, Palo Alto,
California, EE.UU.). El cDNA matricialmente dispuesto fue luego
hibridado con una mezcla 1:1 de cDNAs de primera cadena marcados
con el colorante fluorescente Cy3 o Cy5, obtenidos de RNA poliA+ de
tumores de mama, mama normal y tejidos normales y otros tumores,
como describen D. Shalon et al., Genome Res 6:
639-45 (1996). Típicamente, se fijaron Cy3 (Sonda 1)
a cDNAs de tumores de mama y Cy5 (Sonda 2) a tejido normal de mama
o a otros tejidos normales. Se dejó que ambas sondas compitieran con
los cDNAs génicamente específicos inmovilizados del chip, y se
realizó un lavado y luego una exploración en cuanto a la intensidad
de la fluorescencia individual de Cy3 y Cy5 para determinar el grado
de hibridación. Los datos fueron analizados usando el software
GEMTOOLS (Incyte, Palo Alto, California, EE.UU.), lo que permitía
que los patrones de sobreexpresión de los tumores de mama fueran
comparados con los de tejidos normales mediante las relaciones
Cy3/Cy5. La intensidad de la fluorescencia estaba también
relacionada con el nivel de expresión de los genes individuales.
Los análisis en micromatriz de DNA fueron
utilizados esencialmente como una herramienta de exploración para
determinar la especificidad tisular/tumoral de cDNAs recuperados de
la representación diferencial, el banco de cDNA y las sustracciones
por PCR, antes de un análisis más riguroso mediante
RT-PCR cuantitativa, transferencia Northern e
inmunohistoquímica. El análisis en micromatriz fue llevado a cabo
sobre dos microchips. Se evaluó un total de 3603 moldes de cDNA
sustraído y 197 moldes de representación diferencial, para
identificar 40 candidatos para un ulterior análisis por PCR
cuantitativa. Entre estos candidatos, se eligieron varios basándose
en unos favorables perfiles de especificidad tisular, incluyendo
B305D, B311D, B726P, B511S y B533S, lo que indicaba sus perfiles de
sobreexpresión en tumores de mama y/o mama normal frente a otros
tejidos normales. Resultó evidente que la expresión de estos genes
mostraba un elevado grado de especificidad para tumores de mama y/o
tejido de mama. Además, estos genes tienen perfiles de expresión
complementarios en muchos casos.
Los dos genes específicos de mama conocidos,
mamaglobina y subunidad \pi del receptor tipo A de
\gamma-aminobutirato (GABA\pi) fueron también
sometidos al análisis en micromatriz. Se ha descrito previamente que
la expresión de mRNA de mamaglobina está suprarregulada en el
tejido de mama proliferante, incluyendo los tumores de mama; véanse
Watson et al., Cancer Res. 56: 860-5
(1996); Watson et al., Cancer Res. 59:
3028-3031 (1999); Watson et al., Oncogene
16: 817-24 (1998).
Los niveles de mRNA de GABA\pi estaban
sobreexpresados en los tumores de mama. Estudios previos habían
demostrado su sobreexpresión en el útero y, en cierto grado, en la
próstata y el pulmón [Hedblom et al., J. Biol. Chem.
272: 15.346-15.350 (1997)] pero ningún estudio
previo había indicado niveles elevados en tumores de mama.
En este ejemplo se describe el uso de la PCR
cuantitativa en tiempo real para confirmar la identificación, por
micromatrices, de polinucleótidos que están sobreexpresados al menos
al doble en muestras de tejido tumoral de mama en comparación con
muestras de tejido normal de mama.
La especificidad tumoral y/o tisular de los
polinucleótidos identificados mediante los análisis en micromatriz
aquí descritos en el Ejemplo 5 fue confirmada mediante análisis por
PCR cuantitativa. Se analizaron metástasis de mama, tumores de
mama, trastornos benignos de mama y tejido normal de mama junto con
otros tejidos normales y tumores en una PCR cuantitativa (tiempo
real). Esto fue llevado a cabo en un sistema para detección de
secuencias ABI 7700 Prism o GeneAmp® 5700 (PE Biosystems, Foster
City, California, EE.UU.). El sistema 7700 utiliza un cebador
directo y un cebador inverso en combinación con una sonda específica
diseñada para que se hibride con una secuencia entre los cebadores
directo e inverso. Esta sonda fue conjugada en el extremo 5' con un
colorante informador fluorescente y en el otro extremo 3' con un
colorante sofocador (Taqman™). Durante la PCR, la DNA polimerasa
Taq, con su actividad nucleasa 5'-3', escindió la
sonda, que comenzó a emitir fluorescencia, lo que permitió que la
reacción fuera controlada por el aumento de fluorescencia (tiempo
real); véase Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 7276-7280 (1991). El sistema 5700 utilizaba
SYBR® Green, un colorante fluorescente que sólo se une a DNA de
doble cadena [Schneeberger et al., PCR Methods Appl.
4: 234-8 (1995)], y los mismos cebadores
directo e inverso que el instrumento 7700. No se necesitó sonda
alguna. Se diseñaron cebadores de apareamiento y sondas
fluorescentes para cada uno de los genes de acuerdo con el programa
Primer Express (PE Biosystems, Foster City, California,
EE.UU.).
Las concentraciones usadas en la PCR
cuantitativa para los cebadores directos para mamaglobina,
GABA\pi, la forma C de B305D, B311D, B511S, B533S y B726P fueron
900, 900, 300, 900, 900, 300 y 300 nM, respectivamente. Para los
cebadores inversos, fueron 300, 900, 900, 900, 300, 900 y 900 nM,
respectivamente. Los cebadores y las sondas así producidos fueron
usados en el programa de termociclación universal de la PCR en
tiempo real, y fueron titulados para determinar las concentraciones
óptimas usando un planteamiento de tablero de ajedrez. En este
procedimiento de optimización se usó una colección de cDNA de
tumores diana. La reacción se llevó a cabo en volúmenes de 25
\mul. La concentración final de sonda fue 160 nM en todos los
casos. La concentración de dATP, dCTP y dGTP fue 0,2 mM, y la de
dUTP fue 0,4 mM. Se utilizaron 0,625 unidades y 0,25 unidades de
AmpliTaq Gold y AmpErase UNG (PE Biosystems, Foster City,
California, EE.UU.) por reacción. La concentración final de
MgCl_{2} fue 5 mM. Se añadieron cantidades mínimas de glicerol,
gelatina y Tween 20 (Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri, EE.UU.)
para estabilizar la reacción. Cada mezcla de reacción contenía 2
\mul de molde diluido. El cDNA de las reacciones de RT, preparado
del modo anterior, fue diluido 1:10 para el gen de interés y 1:100
para la \beta-actina. Se usaron cebadores y sondas
para \beta-actina (PE Biosystems, Foster City,
California, EE.UU.) de una manera similar para cuantificar la
presencia de \beta-actina en las muestras. En el
caso del ensayo con SYBR® Green, la mezcla de reacción (25 \mul)
incluía 2,5 \mul de tampón para SYBR® Green, 2 \mul de molde de
cDNA y 2,5 \mul de cada uno de los cebadores directo e inverso
para el gen de interés. Esta mezcla también contenía MgCl_{2} 3
mM, 0,25 unidades de AmpErase UNG, 0,625 unidades de AmpliTaq Gold,
glicerol al 0,08%, gelatina al 0,05%, Tween 20 al 0,0001% y mezcla
de dNTPs 1 mM. En ambos sistemas, se llevaron a cabo 40 ciclos de
multiplicación.
Con objeto de cuantificar la cantidad de cDNA
específico (y, por lo tanto, el mRNA inicial) en la muestra, se
generó una curva patrón para cada experimento utilizando el plásmido
que contiene el gen de interés. Se generaron curvas patrón
utilizando los valores de Ct determinados en la PCR en tiempo real,
que estaban relacionados con la concentración inicial de cDNA
utilizada en el ensayo. Para este fin, se utilizaron diluciones de
patrón que variaban de 20 a 2 x 10^{6} copias del gen de interés.
Además, se generó una curva patrón para el gen doméstico (necesario
para la integridad celular) de \beta-actina, que
variaba de 200 fg a 2000 pg, para permitir la normalización con
respecto a una cantidad
constante de \beta-actina. Esto permitía la evaluación de los niveles de sobreexpresión vistos con cada uno de los genes.
constante de \beta-actina. Esto permitía la evaluación de los niveles de sobreexpresión vistos con cada uno de los genes.
Los genes B311D, B533S y B726P fueron evaluados
en una PCR cuantitativa como la anteriormente descrita, sobre dos
grupos diferentes que consistían en: (a) tumor de mama, mama normal
y tejidos normales; y (b) metástasis de tumores de mama
(esencialmente ganglios linfáticos), usando los cebadores y las
sondas anteriormente mostrados en la Tabla 1. Los datos para el
grupo (a) se muestran en la Figura 1 para los tres genes. Los tres
genes mostraron idénticos perfiles de expresión en tejido de mama.
Sin embargo, el nivel relativo de expresión génica fue muy
diferente en cada caso. En general, B311D se expresaba con niveles
menores que B533S y ambos menos que B726P, pero los tres estaban
limitados a tejido de mama. De este modo, la PCR cuantitativa
confirmó que había una expresión diferencial entre tejido normal de
mama y tumores de mama para los tres genes y que aproximadamente el
50% de los tumores de mama sobreexpresaban estos genes. Cuando se
analizaron sobre un grupo de metástasis distantes derivadas de
cánceres de mama, los tres genes reaccionaban con 14 de 21
metástasis y presentaban perfiles similares. Los tres genes también
presentaban niveles crecientes de expresión en función de la fase
patológica del tumor, como se muestra para B533S en la Figura 2.
La mamaglobina es un producto homólogo de una
uteroglobina de conejo y de la subunidad C3 de la proteína ligante
de esteroides de rata, y es una proteína de bajo peso molecular que
está muy glicosilada. Se ha comunicado que la mamaglobina, por
contraste con sus productos homólogos, es específica de la mama, y
se ha descrito su sobreexpresión en biopsias de tumores de mama
(23%) y en tumores de mama primarios y metastásicos (\sim 75%),
comunicándose la detección de expresión de mRNA de mamaglobina en el
91% de los ganglios linfáticos de pacientes con cáncer metastásico
de mama. Sin embargo, un análisis más riguroso de la expresión
génica de mamaglobina mediante micromatriz y PCR cuantitativa del
modo anteriormente descrito [grupos (a) y (b) y un grupo de otros
tumores y tejidos normales y tumores de mama adicionales], mostró
niveles significativos de expresión en piel y glándula salival con
niveles mucho menores en esófago y tráquea, como se muestra a
continuación en la Tabla 2.
El gen B511S específico de mama, aunque tiene un
diferente perfil de reactividad sobre tumores de mama y tejido
normal de mama con respecto a la mamaglobina, reaccionaba con el
mismo subconjunto de tejidos normales con que lo hacía la
mamaglobina. Un análisis PSORT de B511S indica que tiene un marco de
lectura abierto (ORF; del inglés, open reading
frame) de 90 aminoácidos y que es una proteína secretada,
como es el caso de la mamaglobina. No hay evidencia de que B511S
tenga un dominio trasmembranal pero puede contener una secuencia
señal escindible. La mamaglobina detectó 14 de 24 tumores
metastásicos distantes de mama y 31 de 42 tumores de mama, y
presentaba una sobreexpresión 10 veces mayor en tumores y
metástasis en comparación con el tejido normal de mama. Hubo una
sobreexpresión al menos 300 veces mayor en tejido normal de mama
frente a otros tumores y tejidos normales negativos analizados, que
eran esencialmente negativos en cuanto a la expresión de
mamaglobina. B511S detectó 33 de 42 tumores de mama y 14 de 24
metástasis distantes, mientras que se prevé que una combinación de
B511S y mamaglobina detectaría 38 de 42 tumores de mama y 17 de 24
lesiones metastásicas (véase la Tabla 2 anterior). Los niveles
cuantitativos de expresión de B511S y mamaglobina estaban también en
intervalos similares, en concordancia con los perfiles de
micromatriz observados para estos dos genes. En la Tabla 3 se
muestran otros genes que fueron aditivos con la mamaglobina.
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Se mostró que B305D está muy sobreexpresado en
tumores de mama, tumores de próstata, tejido normal de próstata y
testículo en comparación con tejidos normales, incluyendo el tejido
normal de mama. Se han identificado diferentes variantes de corte y
empalme de B305D, siendo las formas A y C las más abundantes aunque
todas las formas analizadas tienen perfiles tisulares similares en
la PCR cuantitativa. Las formas A y C contienen ORFs de 320 y 385
aminoácidos, respectivamente. Por PSORT, se prevé que B305D es una
proteína de membrana de Tipo II que comprende una serie de
repeticiones de anquirina. Un gen conocido del que se mostró que era
complementario de B305D en tumores de mama era GABA\pi. Este gen
es un miembro de la familia de receptores GABA_{A} y codifica una
proteína que tiene 30-40% de homología de
aminoácidos con respecto a otros miembros de la familia y, mediante
un análisis por transferencia Northern, se ha mostrado que está
sobreexpresado en el pulmón, el timo y la próstata en niveles bajos
y muy sobreexpresado en el útero. No se ha descrito previamente su
expresión en tejido de mama. Esto contrasta con otros receptores
GABA_{A} que tienen una apreciable expresión en tejidos
neuronales. La perfiladura de expresión tisular de este gen mostró
que está sobreexpresado en tumores de mama en una relación inversa
con el gen B305D (Tabla 3). GABA\pi detectó 15 de 25 tumores y 6
de 21 metástasis incluyendo 4 tumores y 5 metástasis errados por la
mamaglobina. Por contraste, B305D detectó 13 de 25 tumores de mama
y 8 de 21 metástasis, incluyendo de nuevo 3 tumores y 2 metástasis
errados por la mamaglobina. Se prevé que una combinación de justo
B305D y GABA\pi identificaría 22 de 25 tumores de mama y 14 de 21
metástasis. La combinación de B305D y GABA\pi con mamaglobina
para detectar metástasis de mama se muestra en la Tabla 3 anterior
y en las Figuras 3A y 3B. Esta combinación detectó 20 de 21
metástasis de mama así como 25 de 25 tumores de mama, que fueron
evaluados en los mismos grupos para los tres genes. La única
metástasis de mama que resultó negativa para estos tres genes fue
intensamente positiva para B726P (Figuras 3A y 3B).
Para evaluar la presencia de células tumorales
circulantes, se empleó un método de inmunocaptura (captura celular)
para realizar primero un enriquecimiento en cuanto a células
epiteliales antes del análisis por RT-PCR. Para
este fin, se usaron glóbulos de poliestireno inmunomagnéticos
revestidos con anticuerpos monoclonales específicos hacia dos
glicoproteínas de la superficie de las células epiteliales. Dicho
procedimiento de enriquecimiento aumentó la sensibilidad de
detección (\sim 100 veces) en comparación con el aislamiento
directo de RNA poliA+, como se muestra en la Tabla 4.
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Se introdujeron células positivas para
mamaglobina (MB415) en diversas concentraciones en sangre completa
y luego se extrajeron usando enriquecimiento de células epiteliales
o aislamiento directo de sangre. Utilizando procedimientos de
enriquecimiento, se halló que el mRNA de mamaglobina era detectable
en niveles mucho menores que cuando se utilizaba el aislamiento
directo. Muestras de sangre completa de pacientes con cáncer
metastásico de mama fueron posteriormente tratadas con los glóbulos
inmunomagnéticos. Luego se aisló RNA poliA+, y se preparó cDNA y se
sometió a PCR cuantitativa usando dos cebadores génicamente
específicos (Tabla 1) y una sonda fluorescente (Taqman™). Como se
observó en los tejidos de cáncer de mama, también se vio
complementación en la detección de células tumorales circulantes
derivadas de cánceres de mama. Una vez más, la PCR de mamaglobina
permitió detectar células tumorales circulantes en un elevado
porcentaje de las muestras sanguíneas, aunque en niveles bajos,
procedentes de pacientes con cáncer metastásico de mama (20 de 32)
cuando se compararon con las muestras de sangre normal (Tabla 5),
pero varios de los otros genes analizados hasta la fecha aumentaban
más este índice de detección. Estos incluían B726P, B305D, B311D,
B533S y GABA\pi. El nivel de detección de mamaglobina en muestras
sanguíneas de pacientes con cáncer metastásico de mama es mayor que
el previamente descrito (62% frente a 49%), a pesar de analizarse
volúmenes de sangre más pequeños, probablemente a causa del uso de
un enriquecimiento específico de marcadores epiteliales en este
estudio. Una combinación de todos los genes analizados indica que
27 de 32 muestras eran positivas para uno o más de estos genes.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En otros estudios, se emplearon cebadores
específicos para mamaglobina, GABA\pi, B305D (forma C) y B726P y
sondas Taqman específicas en diferentes combinaciones para analizar
sus perfiles combinados de expresión de mRNA en muestras de
metástasis de mama (met M.) y tumor de mama (tumor M.) usando PCR en
tiempo real. En la Tabla 1 se muestran los cebadores directo e
inverso y las sondas empleados para mamaglobina, B305D (forma C) y
B726P. En la Tabla 1 se muestran el cebador directo y la sonda
empleados para GABA\pi, siendo el cebador inverso el siguiente:
TTCAAATATAAGTGAAGAAAAAATTAGTAGATCAA (ID. SEC. nº 51). Como se
muestra a continuación en la Tabla 6, se halló que una combinación
de mamaglobina, GABA\pi, B305D (forma C) y B726P detectaba 22 de
22 muestras de tumor de mama, viéndose un aumento de expresión en 5
muestras (indicado mediante ++).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El aumento de señales de mensaje mediante la
adición de cebadores específicos fue adicionalmente demostrado en
un experimento en una sola placa en que se empleaban las cuatro
muestras tumorales: met M. 316A, met M. 317A, tumor M. 81D y tumor
M. 209A.
La expresión de una combinación de mamaglobina,
GABA\pi, B305D (forma C) y B726P en un grupo de muestras de tumor
de mama y tejido normal fue también detectada utilizando PCR en
tiempo real con un sistema de detección basado en SYBR Green, en
lugar del procedimiento con sondas Taqman. Los resultados obtenidos
al utilizar este sistema se muestran en la Figura 7.
Los conocidos genes evaluados en este estudio
fueron mamaglobina y subunidad \pi del receptor tipo A de
\gamma-aminobutirato (GABA\pi). Con objeto de
identificar nuevos genes que estuvieran sobreexpresados en el
cáncer de mama se usó aquí una versión mejorada de la técnica
RT-PCR con representación diferencial (DDPCR; del
inglés, differential display PCR) [Liang et
al., Science 257; 967-971 (1.993); Mou
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199;
564-569 (1994)], métodos de extracción de bancos de
cDNA [Hara et al., Blood 84; 189-199
(1994)] y sustracción por PCR [Diatchenko et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93: 6025-6030 (1996); Yang
et al., Nucleic Acids Res. 27: 1517-23
(1999)].
La representación diferencial dio lugar a la
recuperación de dos fragmentos de cDNA denominados B305D y B311D
[Houghton et al., Cancer Res. 40: Extracto nº 217,
32-33 (1999)]. B511S y B533S son dos fragmentos de
cDNA aislados al usar el procedimiento de sustracción de bancos de
cDNA (manuscrito en preparación), mientras que el fragmento B726P
de cDNA procedía de sustracción por PCR [Jiang et al.,
Proceedings of the Amer. Assoc. Cancer Res. 40: Extracto nº
216, 32 (1999); Xu et al., Proceedings of the Amer. Assoc.
Cancer Res. 40: Extracto nº 2115, 319 (1999); y Molesh et
al., Proceedings of Amer. Assoc. Cancer Res. 11: Extracto
nº 4330, 681 (2000)].
Tres de los nuevos genes, B311D, B533S y B726P,
mostraban idénticos perfiles de expresión en tejido de mama
mediante análisis por PCR cuantitativa. Estos genes fueron evaluados
por PCR cuantitativa sobre dos grupos diferentes que consistían en
(a) tumor de mama, tejido normal de mama y tejidos normales, y (b)
metástasis de tumor de mama (principalmente ganglios linfáticos).
En la Tabla 1 se muestran los cebadores y las sondas utilizados.
Los datos para el grupo (a) se muestran en la Figura 2 para los tres
genes. Globalmente, los perfiles de expresión son comparables y
están en el mismo orden de clasificación; sin embargo, los niveles
de expresión son considerablemente diferentes. En general, B311D se
expresaba con niveles menores que B533S y ambos con niveles menores
que B726P, pero los tres estaban limitados a tejido de mama. Se
utilizaron las tres secuencias para buscar en la base de datos
Genbank. Tanto la secuencia de B311D como la de B533S contienen
diferentes secuencias repetitivas y no se ha identificado un ORF
para ninguno de ellos. B726P es un gen nuevo, con corte y empalme
de mRNA que produce varios supuestos ORFs diferentes.
La PCR cuantitativa confirmó que había una
expresión diferencial de mRNA entre el tejido normal de mama y los
tumores de mama, sobreexpresándose estos genes en aproximadamente el
50% de los tumores de mama. Cuando se analizaron en un grupo de
metástasis distantes derivadas de cánceres de mama, los tres genes
reaccionaban con 14 de 21 metástasis y presentaban perfiles
similares (datos no mostrados). Resulta interesante que, cuando se
analizaron en un grupo de cánceres de próstata, los tres genes
identificaron los mismos 3 de 24 tumores de próstata pero con
niveles de expresión mucho menores que en la mama. Este grupo de
genes presentaba niveles crecientes de expresión en función de la
fase patológica del tumor, como se muestra para B533S.
Un análisis más riguroso de la expresión génica
de mamaglobina mediante micromatriz y PCR cuantitativa mostró
niveles significativos de expresión en piel y glándula salival y
niveles mucho menores en esófago y tráquea. B511S tenía un perfil
de reactividad ligeramente diferente en tumores de mama y tejido
normal de mama cuando se comparaba con mamaglobina, aunque
reaccionaba igual que la mamaglobina con un subconjunto similar de
tejidos normales. La mamaglobina detectó 14 de 24 tumores
metastásicos distantes de mama y 31 de 42 tumores de mama, y
presentaba una sobreexpresión 10 veces mayor en tumores y metástasis
en comparación con el tejido normal de mama. Hubo una
sobreexpresión de mamaglobina al menos 300 veces mayor en tejido
normal de mama frente a otros tumores y tejidos normales negativos
analizados. B511S detectó 33 de 42 tumores de mama y 14 de 24
metástasis distantes. Se prevé que una combinación de B511S y
mamaglobina detecte 38 de 42 tumores de mama y 17 de 24 lesiones
metastásicas. Los niveles cuantitativos de expresión de B511S y de
mamaglobina estaban también en intervalos similares, en
concordancia con los perfiles de micromatriz observados para estos
dos genes.
Ciertos genes complementaban el perfil de
expresión de la mamaglobina; es decir, se mostró que se expresaban
en tumores en que no lo hacía la mamaglobina. B305D estaba muy
sobreexpresado en tumores de mama, tumores de próstata, tejido
normal de próstata y testículo en comparación con los tejidos
normales, incluyendo el tejido normal de mama. Se identificaron
diferentes variantes de corte y empalme de B305D, siendo las formas
A y C las más abundantes. Todas las formas analizadas tenían
perfiles tisulares similares en la PCR cuantitativa. Las formas A y
C contienen ORFs de 320 y 385 aminoácidos, respectivamente. Un gen
conocido del que se mostró que era complementario de B305D, en
tumores de mama, era GABA\pi. Este perfil de expresión tisular
contrasta con el de otros receptores GABA_{A} que tienen
típicamente una apreciable expresión en tejidos neuronales. Una
observación adicional fue que la perfiladura de expresión tisular de
este gen mostraba que está sobreexpresado en tumores de mama en una
relación inversa con el gen B305D (Tabla 3). GABA\pi detectó 15 de
25 tumores y 6 de 21 metástasis incluyendo 4 tumores y 5 metástasis
errados por la mamaglobina. Por contraste, B305D detectó 13 de 25
tumores de mama y 8 de 21 metástasis, incluyendo de nuevo 3 tumores
y 2 metástasis errados por la mamaglobina. Se prevé que una
combinación de justo B305D y GABA\pi identifique 22 de 25 tumores
de mama y 14 de 21 metástasis. Esta combinación detectó 20 de las
21 metástasis de mama así como 25 de 25 tumores de mama, que fueron
evaluados en los mismos grupos para los tres genes. La única
metástasis de mama que resultó negativa para estos tres genes fue
intensamente positiva para
B726P.
B726P.
El uso de análisis en micromatriz seguido de PCR
cuantitativa proporcionó una metodología para determinar
precisamente la expresión de genes de cáncer de mama tanto en
tejidos de mama (tumorales y normales) como en tejidos normales, y
para evaluar su potencial diagnóstico y terapéutico. Utilizando
estas técnicas se evaluaron cinco genes nuevos y dos genes
conocidos. Tres de estos genes, B311D, B533S y B726P, presentaban
una expresión de mRNA concordante, y, colectivamente, los datos son
coherentes con una expresión coordinada de estos tres loci a nivel
de control de la transcripción. Los tres genes mostraban una
expresión diferencial en tumores de mama frente a tejido normal de
mama, y parecía que el nivel de sobreexpresión estaba relacionado
con la fase patológica del tumor. En el caso de la mamaglobina, se
halló expresión en otros tejidos además de en tejido de mama. Se
vio expresión en piel, en glándula salival y, en un grado mucho
menor, en tráquea.
La expresión de GABA\pi en tumores de mama fue
también una observación nueva. Aunque la expresión de varios genes
complementaba la vista con mamaglobina, se añadían dos genes en
particular, B305D y GABA\pi, a la sensibilidad diagnóstica de la
detección de mamaglobina. Una combinación de estos tres genes
permitió la detección de 45 (97,8%) de los 46 tumores de mama y
metástasis evaluados. La inclusión de B726P permitió la detección
de los 25 tumores de mama y las 21 metástasis distantes.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se describe la sensibilidad
potenciada que se alcanza mediante el uso de la metodología de
captura celular por inmunocaptura para el enriquecimiento en células
de cáncer de mama circulantes.
Para evaluar la presencia de células tumorales
circulantes se adoptó un método de inmunocaptura para realizar
primero un enriquecimiento en células epiteliales antes del análisis
por RT-PCR. Se enriquecieron muestras sanguíneas en
cuanto a células epiteliales con un método de separación por
glóbulos inmunomagnéticos (Dynal A.S, Oslo, Noruega), utilizando
glóbulos magnéticos revestidos con anticuerpos monoclonales
específicos para antígenos glicopolipeptídicos de la superficie de
células epiteliales humanas [Por ejemplo, F. Momburg et al.,
Cancer Res. 41: 2883-91 (1997); B. Naume et
al., Journal of Hemotherapy 6: 103-113
(1997); B. Naume et al., Int. J. Cancer 78:
556-60 (1998); V. M. Martin et al., Exp.
Hematol. 26: 252-64 (1998); M. Hildebrandt
et al., Exp. Hematol. 25: 57-65
(1997); M. C. Eaton et al., Biotechniques 22:
100-5 (1997); y B. Brandt et al., Clin. Exp.
Metastases 14: 399-408 (1996), describen
adecuados antígenos de superficie celular ejemplares. Se lisaron
las células aisladas de este modo y se separaron los glóbulos
magnéticos. El lisado fue luego procesado para el aislamiento de
mRNA poliA+ usando glóbulos magnéticos (Dynabeads) revestidos con
Oligo(dT)_{25}. Después de un lavado de los
glóbulos en el tampón del sistema, las muestras de glóbulo/RNA
poliA+ fueron finalmente suspendidas en Tris-HCl 10
mM, pH de 8, y sometidas a transcripción inversa. El RNA fue luego
sometido a PCR en tiempo real usando sondas y cebadores génicamente
específicos con condiciones de reacción como las anteriormente
esbozadas. El contenido de \beta-actina fue
también determinado y utilizado para la normalización. Se
consideraron positivas las muestras con copias del gen de
interés/ng de \beta-actina superiores a la media
de las muestras normales + 3 desviaciones estándares. La PCR en
tiempo real sobre muestras sanguíneas fue llevada exclusivamente a
cabo utilizando el procedimiento Taqman™ pero ampliando a 50
ciclos.
Se halló que el mRNA de mamaglobina obtenido al
usar procedimientos de enriquecimiento era detectable en niveles
mucho menores que cuando se utilizaba el aislamiento directo.
Posteriormente, se trataron muestras de sangre completa de
pacientes con cáncer metastásico de mama con los glóbulos
inmunomagnéticos, y luego se aisló RNA poliA+, y se preparó cDNA y
se sometió a PCR cuantitativa usando dos cebadores génicamente
específicos para mamaglobina y una sonda fluorescente (Taqman™).
Como se observó en los tejidos de cáncer de mama, también se vio
complementación en la detección de células tumorales circulantes
derivadas de cánceres de mama. Una vez más, la PCR de mamaglobina
permitió detectar células tumorales circulantes en un elevado
porcentaje de sangres, aunque en niveles bajos, procedentes de
pacientes con cáncer metastásico de mama (20 de 32) cuando se
compararon con las muestras de sangre normal. Varios de los otros
genes analizados hasta la fecha podrían aumentar más este índice de
detección. Estos incluyen B726P, B305D, B311D, B533S y GABA\pi.
Una combinación de todos los genes analizados indica que 27 de 32
muestras eran positivas en uno o más de estos genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se establecieron ensayos adicionales por PCR
múltiple en tiempo real con objeto de detectar simultáneamente la
expresión de cuatro genes específicos de cáncer de mama: lípofilina
B, Gaba (B899P), B305D-C y B726P. Por contraste con
los procedimientos de detección que se basan en un análisis de
expresión de genes específicos de cáncer de mama individuales, este
ensayo múltiple permitía detectar todas las muestras de tumor de
mama ensayadas.
Este ensayo múltiple fue diseñado para detectar
la expresión de lípofilina B en lugar de la de mamaglobina. A causa
de sus perfiles de expresión similares, la lípofilina B puede
sustituir a la mamaglobina en este ensayo de PCR múltiple para la
detección del cáncer de mama. El ensayo fue llevado a cabo del modo
siguiente: se utilizaron cebadores específicos de lípofilina B,
B899P (Gaba), B305D y B726P y sondas Taqman específicas, para
analizar su perfil combinado de expresión de mRNA en tumores de
mama. A continuación se muestran los cebadores y las sondas:
- Lipofilina B:
- Cebador directo (ID. SEC. nº 33): 5' TGCCCCTCCGGAAGCT. Cebador inverso (ID. SEC. nº 34): 5' CGTTTCTGAAGGGACATCTGATC. Sonda (ID. SEC. nº 35) (FAM-5' - 3'-TAMRA): TTGCAGCCAAGTTAGGAGTGAAGAGATGCA.
- GABA (B899P):
- Cebador directo (ID. SEC. nº 36): 5' AAGCCTCAGAGTCCTTCCAGTATG. Cebador inverso (ID. SEC. nº 37): 5' TTCAAATATAAGTGAAGAAAAAATTAGTAGATCAA. Sonda (ID. SEC. nº 38) (FAM-5' - 3'-TAMRA): AATCCATTGTATCTTAGAACCGAGGGATTTG TTTAGA.
- B305D (forma C):
- Cebador directo (ID. SEC. nº 39): 5' AAAGCAGATGGTGGTTGAGGTT. Cebador inverso (ID. SEC. nº 40): 5' CCTGAGACCAAATGGCTTCTTC. Sonda (ID. SEC. nº 41) (FAM-5' - 3'-TAMRA) ATTCCATGCCGGCTGCTTCTTCTG.
- B726P:
- Cebador directo (ID. SEC. nº 42): 5' TCTGGTTTTCTCATTCTTTATTCATTTATT. Cebador inverso (ID. SEC. nº 43): 5' TGCCAAGGAGCGGATTATCT. Sonda (ID. SEC. nº 44) (FAM-5' - 3'-TAMRA): CAACCACGTGACAAACACTGGAATTACAGG.
- Actina:
- Cebador directo (ID. SEC. nº 45): 5' ACTGGAACGGTGAAGGTGACA. Cebador inverso (ID. SEC. nº 46): 5' CGGCCACATTGTGAACTTTG. Sonda (ID. SEC. nº 47): (FAM-5' - 3'-TAMRA): CAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de ensayo fueron:
En un volumen final de 25 \mul: Tampón A 1x,
MgCl_{2} 5mM, dCTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dUTP 0,4 mM, dGTP 0,2 mM,
0,01 U/\mul de AmpErase UNG, 0,025 U/\mul de TaqGold, glicerol
al 8% (volumen/volumen), gelatina al 0,05% (volumen/volumen),
Tween20 al 0,01% (volumen/volumen), 4 picomoles de cada sonda Taqman
génicamente específica (lipofilina B + Gaba + B305D + B726P), y
cDNA molde (que se origina a partir de 0,02 \mug de RNA poliA+):
100 nM de B726P-F + B726P-R, 300 nM
de Gaba-R y 50 nM de de lipofilina
B-F + lipofilina B-R +
B305D-R + Gaba-R.
Se detectó expresión de lipofilina B en 14 de 27
muestras de tumor de mama. Sin embargo, el ensayo múltiple para
lipofilina B, B899P, B305D-C y B726P permitió
detectar una señal de expresión en 27 de 27 tumores, con un nivel
de detección superior a 10 copias de mRNA/1000 pg de actina en la
mayoría de las muestras y superior a 100 copias de mRNA/1000 pg de
actina en 5 de las 27 muestras ensayadas (Figura 8).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de PCR múltiple en tiempo real
anteriormente descrito fue utilizado para detectar simultáneamente
la expresión de mamaglobina (o lipofilina B), Gaba (B899P),
B305D-C y B726P. De acuerdo con este ejemplo, se
optimizaron las condiciones de ensayo y las secuencias cebadoras
para conseguir la multiplicación paralela de cuatro productos de
PCR con diferentes longitudes. Las muestras positivas de este ensayo
pueden ser adicionalmente caracterizadas por electroforesis en gel,
y el(los) gen(es) de interés expresado(s)
puede(n) ser determinado(s) de acuerdo con
el(los) tamaño(s) del(de los)
amplicón(es) detectado(s).
Se utilizaron cebadores específicos para
mamaglobina (o lipofilina B), Gaba (B899P), B305D y B726P y sondas
Taqman específicas, para detectar simultáneamente su expresión. A
continuación se muestran los cebadores y sondas usados en este
ejemplo.
- Mamaglobina:
- Cebador directo (ID. SEC. nº 48): 5' TGCCATAGATGAATTGAAGGAATG. Cebador inverso (ID. SEC. nº 49): 5' TGTCATATATTAATTGCATAAACACCTCA. Sonda (ID. SEC. nº 50): (FAM-5' - 3'-TAMRA): TCTTAACCAAACGGATGAAAC-TCTGAGCAATG.
- GABA (B899P):
- Cebador directo (ID. SEC. nº 36): 5' AAGCCTCAGAGTCCTTCCAGTATG. Cebador inverso (ID. SEC. nº 51): 5'' ATCATTGAAAATTCAAATATAAGT-GAAG. Sonda (ID. SEC. nº 38) (FAM-5' - 3'-TAMRA): AATCCATTGTATCTTAGAACCGAGGGATTTGTTTAGA.
- B305D (forma C):
- Cebador directo (ID. SEC. nº 39): 5' AAAGCAGATGGTGGTTG-AGGTT. Cebador inverso (ID. SEC. nº 40): 5' CCTGAGACCAAATGGCTTCTTC. Sonda (ID. SEC. nº 41): (FAM-5' - 3'-TAMRA): ATTCCATGCCGGCTGCTTCTTCTG.
- B726P:
- Cebador directo (ID. SEC. nº 52): 5' GTAGTTGTGCATTGAAATAATTATCATTAT. Cebador inverso (ID. SEC. nº 43): 5' TGCCAAGGAGCGGATTATCT. Sonda (ID. SEC. nº 44) (FAM-5' - 3'-TAMRA): CAACCACGTGACAAACACTGGAATTACAGG.
Se optimizaron las posiciones de los cebadores y
las condiciones de ensayo para conseguir la multiplicación paralela
de cuatro productos de PCR con diferentes tamaños. Las condiciones
de ensayo fueron:
En un volumen final de 25 \mul: Tampón A 1x,
MgCl_{2} 5mM, dCTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dUTP 0,4 mM, dGTP 0,2 mM,
0,01 U/\mul de AmpErase UNG, 0,0375 U/\mul de TaqGold, glicerol
al 8% (volumen/volumen), gelatina al 0,05% (volumen/volumen),
Tween20 al 0,01% (volumen/volumen), 4 picomoles de cada sonda Taqman
génicamente específica (mamaglobina + Gaba + B305D + B726P), y cDNA
molde (que se origina a partir de 0,02 \mug de RNA poliA+): 300
nM de Gaba-R + Gaba-F, 100 nM de
mamaglobina-F+R; B726P-F+R y 50 nM
de B305D-F+R.
\vskip1.000000\baselineskip
50º durante 2': x 1; 95º durante 10': x 1; y 95º
durante 15''/60º durante 1'/68º durante 1': x 50.
Puesto que, en el ensayo múltiple, cada conjunto
de cebadores da lugar a una banda de longitud única, las señales de
expresión de los cuatro genes de interés pueden ser medidas
individualmente mediante análisis en gel de agarosa (véase la
Figura 9), o la señal de expresión combinada de los cuatro genes
puede ser medida en tiempo real en un sistema para detección de
secuencias ABI 7700 Prism (PE Biosystems, Foster City, California,
EE.UU.). También se puede detectar la expresión de lipofilina B en
lugar de la de mamaglobina. Aunque aquí se han descrito cebadores
específicos, se podrían utilizar diferentes secuencias cebadoras,
diferente sonda o marcación de sonda y diferentes sistemas de
detección para llevar este ensayo múltiple a cabo. Por ejemplo, se
podría incorporar un segundo colorante informador fluorogénico para
la detección paralela de un gen de referencia por PCR en tiempo
real, o, por ejemplo, se podría utilizar un sistema de detección con
SYBR Green en lugar del procedimiento con sonda
Taqman.
Taqman.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de PCR múltiple en tiempo real aquí
descrito permite detectar simultáneamente la expresión de
mamaglobina, Gaba (B899P), B305D-C y B726P. El
nivel de expresión combinado de estos genes es medido en tiempo real
en un sistema para detección de secuencias ABI 7700 Prism (PE
Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). Los genes
individualmente expresados pueden ser también identificados mediante
electroforesis en gel a causa de los diferentes tamaños de
amplicón. Con objeto de utilizar este ensayo con muestras
procedentes de RNAs no tratados con DNasa (por ejemplo, cDNA de
ganglio linfático) y evitar el tratamiento de muestras de RNA
pequeño (por ejemplo, muestras de sangre y aspiraciones de tumores
y ganglios linfáticos) con DNasa, se han diseñado pares de
cebadores que abarcan intrones para excluir la multiplicación de DNA
genómico y, por lo tanto, eliminar señales positivas inespecíficas
y falsas. La falsa señal positiva es causada por la contaminación de
muestras de cDNA con DNA genómico. El ensayo múltiple optimizado
aquí descrito excluye la multiplicación de DNA genómico y permite
la detección específica de la expresión de genes diana sin la
necesidad del tratamiento previo de las muestras de RNA con DNasa.
Además, con estos conjuntos de cebadores se podría verificar la
correspondencia genómica y la posición del límite
intrón-exón.
Se utilizaron cebadores específicos para
mamaglobina, Gaba (B899P), B305D y B726P y sondas Taqman
específicas, para detectar simultáneamente su expresión (Tabla 7).
Se optimizaron las posiciones de los cebadores (que abarcan zonas
límite intrón-exón) para detectar exclusivamente
cDNA y excluir el DNA genómico de la multiplicación. La identidad
del(de los) gen(es) expresado(s) se determinó
por electroforesis en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se optimizaron las posiciones de los cebadores y
las condiciones de ensayo para conseguir la multiplicación paralela
de los cuatro productos de PCR. Las condiciones de ensayo fueron las
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
En un volumen final de 25 \mul: Tampón A 1x,
MgCl_{2} 5mM, dCTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dUTP 0,4 mM, dGTP 0,2 mM,
0,01 U/\mul de AmpErase UNG, glicerol al 8% (volumen/volumen),
gelatina al 0,05% (volumen/volumen), Tween20 al 0,01%
(volumen/volumen), 4 picomoles de cada sonda Taqman génicamente
específica (mamaglobina + B899P-INT +
B305D-INT + B726P-INT), y cDNA molde
(que se origina a partir de 0,02 \mug de RNA poliA+): 300 nM de
B305D-INT-F;
B899P-INT-F, 100 nM de
mamaglobina-F+R;
B726P-INT-F+R, 50 nM de
B899P-INT-R;
B305D-INT-R.
\vskip1.000000\baselineskip
1 ciclo a 50ºC durante 2 minutos, 1 ciclo a 95ºC
durante 10 minutos, 50 ciclos de 95ºC durante 1 minuto y 68ºC
durante 1 minuto.
La Figura 10 muestra una comparación entre el
ensayo múltiple en que se usan cebadores que abarcan límites
intrón-exón (grupo inferior) y el ensayo múltiple en
que se usan cebadores no optimizados (grupo superior), para
detectar células de cáncer de mama en un grupo de tejidos de ganglio
linfático. Este experimento muestra que usando los cebadores que
abarcan intrones-exones del presente invento se
consigue la reducción del fondo que resulta de la contaminación de
las muestras por DNA genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
La graduación de ganglios linfáticos es
importante para determinar la quimioterapia y la terapia hormonal
adyuvante apropiadas. Por contraste con la disección axilar
convencional, la biopsia del ganglio linfático centinela es un
planteamiento menos invasivo para la graduación de la mínima
enfermedad residual. La biopsia del ganglio linfático centinela
(SLNB; del inglés, sentinel lymph node
biopsy) tiene el potencial para mejorar la detección de
metástasis y proporcionar valores de pronóstico que conduzcan a una
terapia con una mínima morbosidad asociada con la disección
completa de ganglios linfáticos. La SLNB ocasiona el mapeo de uno o
los dos ganglios linfáticos que esencialmente drenan el tumor y
que, por lo tanto, muy probablemente contienen la enfermedad
metastásica (los ganglios centinela). El análisis patológico
rutinario de los ganglios linfáticos da lugar a un elevado índice
de falsos negativos: un tercio de las mujeres con ganglios
linfáticos patológicamente negativos desarrollan una enfermedad
recurrente (Bland: The Breast; Saunders, 1991). Una técnica de
detección más sensible para células tumorales sería la
RT-PCR, pero su aplicación se encuentra limitada por
la falta de marcadores específicos individuales. El ensayo con
múltiples marcadores anteriormente descrito aumenta la probabilidad
de detección de cáncer en la población sin producir falsos
resultados positivos a partir de ganglios linfáticos normales.
Como se mencionó anteriormente, las vías
linfáticas aferentes de un tumor primario drenan en un solo
ganglio, el ganglio linfático centinela, antes de que tenga lugar
el drenaje en la cuenca linfática regional. Los ganglios linfáticos
centinela son localizados con colorantes y/o coloides radiomarcados
inyectados en la zona de la lesión primaria, y la biopsia del
ganglio linfático centinela permite el examen patológico en cuanto a
depósitos micrometastásicos y la graduación de la axila, y, por lo
tanto, puede evitar una disección axilar innecesaria. Las
micrometástasis ganglionares pueden ser localizadas con tinción
(hematoxilina o eosina) o por análisis inmunohistoquímico para
proteínas citoqueratínicas. Las técnicas de tinción
inmunocitoquímicas pueden producir frecuentemente falsos resultados
negativos al saltarse pequeños focos metastásicos a causa de un
fraccionamiento inadecuado del ganglio. La inmunohistoquímica puede
dar lugar a falsos resultados positivos a causa de una ilógica
expresión de citoqueratinas (células reticuloendoteliales), o a
falsos resultados negativos cuando se usa el anticuerpo
Ber-Ep4, cuyo antígeno correspondiente no se expresa
en todas las células tumorales.
El ensayo múltiple aquí descrito podría
proporcionar una herramienta de detección más sensible para ganglios
linfáticos centinela positivos. Además, es deseable la detección de
células de cáncer de mama en muestras de médula ósea, sangre
periférica y muestras obtenidas por aspiración con aguja pequeña,
para el diagnóstico y el pronóstico de pacientes con cáncer de
mama.
Utilizando el aquí descrito ensayo de PCR
múltiple que abarca límites intrón-exón, se
analizaron veintidós muestras de ganglios linfáticos metastásicos
además de 15 muestras también previamente analizadas y mostradas en
la Figura 3A. Los resultados de este análisis se resumen en la Tabla
8. También se analizaron veintisiete tumores primarios, y los
resultados se muestran en la Tabla 9. Veinte muestras de ganglios
linfáticos normales analizadas usando este ensayo resultaron todas
negativas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
A partir de lo precedente se apreciará que,
aunque se han descrito aquí realizaciones específicas del invento
con fines de ilustración, pueden hacerse diversas modificaciones sin
desviarse del alcance del invento. En consecuencia, el invento no
está limitado salvo por las reivindicaciones adjuntas.
<110> Corixa Corporation
\hskip1cmHoughton, Raymond L.
\hskip1cmDillon, Davin C.
\hskip1cmMolesh, David A.
\hskip1cmXu, Jiangchun
\hskip1cmZehentner, Barbara
\hskip1cmPersing, David H.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS, COMPOSICIONES Y SISTEMAS
PARA LA DETECCIÓN Y EL CONTROL DEL CÁNCER DE MAMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 210121.513PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-04-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, Versión
3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1852
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2000
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2040
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 800
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1665
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1128)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1337
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 650
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (310)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (429)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (522)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (148)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> incierto
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ser humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcccctccg gaagct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtttctgaa gggacatctg atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcagccaa gttaggagtg aagagatgca
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcctcaga gtccttccag tatg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcaaatata agtgaagaaa aaattagtag atcaa
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatccattgt atcttagaac cgagggattt gtttaga
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcagatg gtggttgagg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgagacca aatggcttct tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattccatgcc ggctgcttct tctg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctggttttc tcattcttta ttcatttatt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccaaggag cggattatct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccacgtg acaaacactg gaattacagg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskipactggaacgg tgaaggtgac a
\hfill21
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<223> Cebador de PCR
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<400> 46
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<220>
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\hfill23
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<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> Cebador de PCR
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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<220>
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de PCR
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\hfill30
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<400> 64
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<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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<400> 65
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 22
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
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<400> 67
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\hfill24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacattccag ttttacccaa atgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcagaagac tcaagctgat tcc
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcagggac acactctacc attcggga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaatataagt gaagaaaaaa attagtagat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 75
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 463
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 76
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<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
Claims (35)
1. Un método para detectar la presencia de una
célula de cáncer de mama, método que comprende las operaciones
de:
- (a)
- poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con un primer oligonucleótido que se hibrida con un primer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en mamaglobina y lipofilina B;
- (b)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un segundo oligonucleótido que se hibrida con una segunda secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia polinucleotídica de GABA\pi (B899P);
- (c)
- detectar en dicha muestra biológica una cantidad del oligonucleótido hibridado de las operaciones (a) y (b); y
- (d)
- comparar con un valor de corte predeterminado la cantidad de polinucleótido que se hibrida con los oligonucleótidos de las operaciones (a) y (b) y determinar, a partir de dicha comparación, la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente.
2. El método de la Reivindicación 1, en el que
dicho primer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste
en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC.
nº 74 e ID. SEC. nº 76, o su complemento; y en el que dicho segundo
polinucleótido comprende el polinucleótido expuesto en la ID. SEC.
nº 75, o su complemento.
3. El método de la Reivindicación 2, que
comprende además:
- (e)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se hibrida con un tercer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7, o su complemento; y
- (f)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un cuarto oligonucleótido que se hibrida con un cuarto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24, o su complemento;
en el que la operación (c)
comprende detectar en dicha muestra biológica una cantidad del
oligonucleótido hibridado de las operaciones (a), (b), (e) y
(f).
4. El método de la Reivindicación 2, que
comprende además:
- (e)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un tercer oligonucleótido que se hibrida con un tercer polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7, o su complemento;
- (f)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un cuarto oligonucleótido que se hibrida con un cuarto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en el polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 11, o su complemento;
- (g)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un quinto oligonucleótido que se hibrida con un quinto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en las ID. SEC. números 13,15 y 17, o su complemento;
- (h)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un sexto oligonucleótido que se hibrida con un sexto polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24, o su complemento;
- (i)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un séptimo oligonucleótido que se hibrida con un séptimo polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 30 o su complemento;
- (j)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un octavo oligonucleótido que se hibrida con un octavo polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 32 o su complemento; y
- (k)
- poner dicha muestra biológica en contacto con un noveno oligonucleótido que se hibrida con un polinucleótido representado en la ID. SEC. nº 76 o su complemento;
en el que la operación (c)
comprende detectar en dicha muestra biológica una cantidad del
oligonucleótido hibridado de las operaciones (a), (b), (e), (f),
(g), (h), (i), (j) y
(k).
5. Un método para detectar la presencia de una
célula de cáncer de mama, método que comprende las operaciones
de:
- (a)
- poner una muestra biológica, obtenida de un paciente, en contacto con una primera pareja de oligonucleótidos, primera pareja que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido se hibridan con un primer polinucleótido y con su complemento, respectivamente, y en el que dicho primer polinucleótido comprende mamaglobina o lipofilina B;
- (b)
- poner dicha muestra biológica en contacto con una segunda pareja de oligonucleótidos, segunda pareja que comprende un tercer oligonucleótido y un cuarto oligonucleótido, en el que dichos oligonucleótidos tercero y cuarto se hibridan con un segundo polinucleótido y con su complemento, respectivamente, y en el que dicho segundo polinucleótido comprende GABA\pi (B899P);
- (c)
- multiplicar dicho primer polinucleótido y dicho segundo polinucleótido; y
- (d)
- detectar dicho primer polinucleótido multiplicado y dicho segundo polinucleótido multiplicado;
en el que la presencia de dicho
primer polinucleótido multiplicado o dicho segundo polinucleótido
multiplicado indica la presencia de una célula de cáncer de mama en
dicho
paciente.
6. El método de la Reivindicación 5, en el que
dicho primer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste
en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC.
nº 74 e ID. SEC. nº 76, y en el que dicho segundo polinucleótido
comprende el polinucleótido expuesto en la ID. SEC. nº 75.
7. El método de la Reivindicación 6, que
comprende además poner dicha muestra biológica en contacto con una
tercera pareja de oligonucleótidos, tercera pareja que comprende un
cebador directo y un cebador inverso que se hibridan con un tercer
polinucleótido y su complemento, respectivamente, en el que dicho
tercer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e
ID. SEC. nº 7; en el que la operación (d) comprende además
multiplicar dicho tercer polinucleótido; y en el que la operación
(e) comprende además detectar dicho tercer polinucleótido.
8. El método de la Reivindicación 7, que
comprende además poner dicha muestra biológica en contacto con una
cuarta pareja de oligonucleótidos, cuarta pareja que comprende un
cebador directo y un cebador inverso que se hibridan con un cuarto
polinucleótido y su complemento, respectivamente, en el que dicho
cuarto polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en los
polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15,
ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID.
SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24; en el que la operación
(d) comprende además multiplicar dicho cuarto polinucleótido; y en
el que la operación (e) comprende además detectar dicho cuarto
polinucleótido.
9. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 1-8, en el que dicha muestra
biológica es seleccionada del grupo que consiste en sangre, suero,
ganglio linfático, médula ósea, esputo, orina y muestra de biopsia
tumoral.
10. El método de la Reivindicación 9, en el que
dicha muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste en
sangre, un ganglio linfático y médula ósea.
11. El método de la Reivindicación 9, en el que
dicho ganglio linfático es un ganglio linfático centinela.
12. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 5-8, en el que dichos
oligonucleótidos son seleccionados del grupo que consiste en los
oligonucleótidos representados en las ID. SEC. números
33-38, 48-51 y
53-62.
13. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 5-8, en el que la operación (e)
comprende una operación seleccionada del grupo que consiste en
detectar un radiomarcador y detectar un fluoróforo.
14. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 1-8, en el que dicha operación de
detección comprende una operación de fraccionamiento.
15. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 5-8, en el que dichos
oligonucleótidos son oligonucleótidos que abarcan intrones.
16. El método de la Reivindicación 15, en el que
dichos oligonucleótidos que abarcan intrones son seleccionados del
grupo que consiste en los oligonucleótidos representados en las ID.
SEC. números 36-44 y 48-62.
17. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 5-8, en el que la detección de
dicho polinucleótido primero, segundo, tercero o cuarto
multiplicado comprende poner dicho polinucleótido primero, segundo,
tercero o cuarto multiplicado en contacto con una sonda
oligonucleotídica marcada que se hibrida, bajo condiciones
moderadamente rigurosas, con dicho polinucleótido primero, segundo,
tercero o cuarto.
18. El método de la Reivindicación 17, en el que
dicha sonda oligonucleotídica marcada comprende un resto detectable
seleccionado del grupo que consiste en un radiomarcador y un
fluoróforo.
19. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 1-8, que comprende además una
operación de enriquecimiento de dicha muestra biológica en cuanto a
dicha célula cancerosa antes de la hibridación de dicho(s)
cebador(es) oligonucleotídico(s).
20. El método de la Reivindicación
1-8, en el que dicha operación de enriquecimiento de
dicha muestra biológica en cuanto a dicha célula cancerosa es
llevada a cabo mediante una metodología seleccionada del grupo que
consiste en captura celular y agotamiento celular.
21. El método de la Reivindicación 20, en el que
la captura celular es llevada a cabo mediante inmunocaptura,
inmunocaptura que comprende las operaciones de:
- (a)
- hacer que un anticuerpo se adsorba a la superficie de dichas células cancerosas; y
- (b)
- separar dichas células cancerosas con anticuerpo adsorbido, del resto de dicha muestra biológica.
22. El método de la Reivindicación 21, en el que
dicho anticuerpo se dirige hacia un antígeno seleccionado del grupo
que consiste en CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15,
CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41,
CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR,
IgE y TCR\alpha\beta.
23. El método de la Reivindicación 21, en el que
dicho anticuerpo se dirige hacia un antígeno tumoral de mama.
24. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 21-23, en el que dicho anticuerpo
es un anticuerpo monoclonal.
25. El método de la Reivindicación 21, en el que
dicho anticuerpo está conjugado con glóbulos magnéticos.
26. El método de la Reivindicación 21, en el que
dicho anticuerpo está formulado en un complejo de anticuerpo
tetrámero.
27. El método de la Reivindicación 21, en el que
el agotamiento celular es llevado a cabo mediante un método que
comprende las operaciones de:
- (a)
- entrecruzar glóbulos rojos y glóbulos blancos; y
- (b)
- fraccionar dichos glóbulos rojos y blancos entrecruzados del resto de dicha muestra biológica.
28. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 5-8, en el que dicha operación de
multiplicación es llevada a cabo mediante una metodología de
multiplicación de polinucleótidos seleccionada del grupo que
consiste en transcripción inversa-reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR), PCR inversa,
multiplicación rápida de extremos de cDNA (RACE), reacción en
cadena de la ligasa (LCR), replicasa de Qbeta, multiplicación
isotérmica, multiplicación por desplazamiento de cadenas (SDA),
reacción en cadena rodante (RCR), reacción cíclica de sondas (CPR),
sistemas de multiplicación basados en transcripción (TAS),
multiplicación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) y
replicación automantenida de secuencias (3SR).
29. Una composición para detectar una célula de
cáncer de mama en una muestra biológica de un paciente, composición
que comprende:
- (a)
- un primer oligonucleótido; y
- (b)
- un segundo oligonucleótido;
en la que dicho primer
oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido tienen una longitud
de al menos 15 nucleótidos y se hibridan específicamente con un
primer polinucleótido o su complemento y con un segundo
polinucleótido o su complemento, respectivamente; en la que dicho
primer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste en la
ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76; y en la que dicho
segundo polinucleótido comprende el polinucleótido expuesto en la
ID. SEC. nº
75.
30. La composición de la Reivindicación 29, que
comprende además un tercer y un cuarto oligonucleótidos, tercer y
cuarto oligonucleótidos que se hibridan con un tercer polinucleótido
o su complemento y con un cuarto polinucleótido o su complemento,
respectivamente; en la que dicho tercer polinucleótido es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6 e ID. SEC. nº 7; y
en la que dicho cuarto polinucleótido es seleccionado del grupo que
consiste en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 13,
ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17, ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID.
SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID. SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24.
31. La composición de la Reivindicación 30 o la
Reivindicación 31, en la que dichos oligonucleótidos son
seleccionados del grupo que consiste en oligonucleótidos como los
descritos en las ID. SEC. números 33-44,
48-62, y 72.
32. Una composición para detectar una célula de
cáncer de mama en una muestra biológica de un paciente, composición
que comprende:
- (a)
- una primera pareja de oligonucleótidos; y
- (b)
- una segunda pareja de oligonucleótidos;
en la que dicha primera pareja de
oligonucleótidos y dicha segunda pareja de oligonucleótidos tienen
una longitud de al menos 10 nucleótidos y se hibridan
específicamente con un primer polinucleótido o su complemento y con
un segundo polinucleótido o su complemento, respectivamente; en la
que dicho primer polinucleótido es seleccionado del grupo que
consiste en la ID. SEC. nº 73, ID. SEC. nº 74 e ID. SEC. nº 76; y en
la que dicho segundo polinucleótido comprende el polinucleótido
expuesto en la ID. SEC. nº
75.
33. La composición de la Reivindicación 32, que
comprende además una tercera pareja de oligonucleótidos y una
cuarta pareja de oligonucleótidos, tercera pareja de
oligonucleótidos y cuarta pareja de oligonucleótidos que se
hibridan con un tercer polinucleótido o su complemento y con un
cuarto polinucleótido o su complemento, respectivamente; en la que
dicho tercer polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste
en los polinucleótidos representados en la ID. SEC. nº 5, ID. SEC.
nº 6 e ID. SEC. nº 7; y en la que dicho cuarto polinucleótido es
seleccionado del grupo que consiste en los polinucleótidos
representados en la ID. SEC. nº 13, ID. SEC. nº 15, ID. SEC. nº 17,
ID. SEC. nº 19, ID. SEC. nº 20, ID. SEC. nº 21, ID. SEC. nº 22, ID.
SEC. nº 23 e ID. SEC. nº 24.
34. La composición de la Reivindicación 32 o la
Reivindicación 33, en la que dichos oligonucleótidos son
seleccionados del grupo que consiste en oligonucleótidos como los
descritos en las ID. SEC. números 33-44,
48-62, y 72.
35. Un sistema para la detección del cáncer de
mama, que incluye la composición de cualquiera de las
Reivindicaciones 29 a 34.
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